特許 6462684 カルシウム指示遺伝子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6462684

(24)【登録日】2019年1月11日

(45)【発行日】2019年1月30日

(54)【発明の名称】カルシウム指示遺伝子

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20190121BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20190121BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20190121BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20190121BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20190121BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20190121BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20190121BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20190121BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20190121BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20190121BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/62 ZZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A01K67/027

   C07K19/00

   C07K14/47

   C07K14/435

   C12Q1/02

【請求項の数】14

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2016-527634(P2016-527634)

(86)(22)【出願日】2015年6月8日

(86)【国際出願番号】JP2015002869

(87)【国際公開番号】WO2015190083

(87)【国際公開日】20151217

【審査請求日】2016年11月17日

(31)【優先権主張番号】特願2014-120828(P2014-120828)

(32)【優先日】2014年6月11日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】503360115

【氏名又は名称】国立研究開発法人科学技術振興機構

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(72)【発明者】

【氏名】尾藤 晴彦

(72)【発明者】

【氏名】井上 昌俊

(72)【発明者】

【氏名】竹内 敦也

(72)【発明者】

【氏名】中井 淳一

(72)【発明者】

【氏名】大倉 正道

【審査官】 西村 亜希子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１４−００１１６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第００／０７１５６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Nature Methods，２０１４年１１月２４日，Vol.12，pp.64-70

【文献】 PLOS ONE，２０１２年，Vol.7, Issue 12，e51286

【文献】 PNAS，２００６年，Vol.103，pp.4753-4758

【文献】 Nature，２０１３年，Vol.499，Pages 295-302

【文献】 Nature structural biology，２００１年，Vol.8, No.12，Pages 1069-1073

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／

Ｃ１２Ｑ １／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列（ｃｋｋａｐ配列）をコードするヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの５’末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列（ＣａＭ配列）をコードするヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの３’末端側に結合されているＤＮＡであり、
ｃｋｋａｐ配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列である、ＤＮＡ。

【請求項2】

ｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチドと蛍光タンパクをコードするヌクレオチド、及び、蛍光タンパクをコードするヌクレオチドとＣａＭ配列をコードするヌクレオチドが、アミノ酸リンカーをコードするヌクレオチドを介してそれぞれ結合されている、請求項１記載のＤＮＡ。

【請求項3】

蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの５’末端にｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチドが、３’末端側にＣａＭ配列をコードするヌクレオチドが結合されており、
ｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチドと蛍光タンパクをコードするヌクレオチドがアミノ酸リンカーＡをコードするヌクレオチドを介して結合されており、かつ、
蛍光タンパクをコードするヌクレオチドとＣａＭ配列をコードするヌクレオチドがアミノ酸リンカーＢをコードするヌクレオチドを介して結合されており、
アミノ酸リンカーＡ及びアミノ酸リンカーＢの組み合わせが、アミノ酸リンカーＡ（−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−）・アミノ酸リンカーＢ（−Ｔｈｒ−Ａｒｇ）である、請求項２記載のＤＮＡ。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡを含むベクター。

【請求項5】

カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列（ｃｋｋａｐ配列）をコードするヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの５’末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列（ＣａＭ配列）をコードするヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの３’末端側に結合されているカルシウム指示遺伝子が導入された形質転換細胞であり、
ｃｋｋａｐ配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列である、形質転換細胞。

【請求項6】

カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列（ｃｋｋａｐ配列）をコードするヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの５’末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列（ＣａＭ配列）をコードするヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの３’末端側に結合されているカルシウム指示遺伝子が導入された、ヒトを除くトランスジェニック動物であり、
ｃｋｋａｐ配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列である、トランスジェニック動物。

【請求項7】

カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列（ｃｋｋａｐ配列）が蛍光タンパクのＮ末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列（ＣａＭ配列）が前記蛍光タンパクのＣ末端側に結合されているタンパクであり、
ｃｋｋａｐ配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列である、タンパク。

【請求項8】

ｃｋｋａｐ配列と蛍光タンパク、及び、蛍光タンパクとＣａＭ配列が、アミノ酸リンカーを介してそれぞれ結合されている、請求項７記載のタンパク。

【請求項9】

蛍光タンパクのＮ末端にｃｋｋａｐ配列が、Ｃ末端側にＣａＭ配列が結合されており、
ｃｋｋａｐ配列と蛍光タンパクがアミノ酸リンカーＡを介して結合されており、かつ、
蛍光タンパクとＣａＭ配列がアミノ酸リンカーＢを介して結合されており、
アミノ酸リンカーＡ及びアミノ酸リンカーＢの組み合わせが、アミノ酸リンカーＡ（−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−）・アミノ酸リンカーＢ（−Ｔｈｒ−Ａｒｇ）である、請求項８記載のタンパク。

【請求項10】

細胞内で発現されたカルシウム指示タンパクから放射される蛍光を検出する手順を含む、細胞の活動電位の測定方法であって、
前記カルシウム指示タンパクは、カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列（ｃｋｋａｐ配列）が蛍光タンパクのＮ末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列（ＣａＭ配列）が前記蛍光タンパクのＣ末端側に結合されている、カルシウム指示タンパクであり、
ｃｋｋａｐ配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする方法。

【請求項11】

細胞内で発現されたカルシウム指示タンパクから放射される蛍光を検出する手順を含む、細胞内カルシウムイオンのイメージング方法であって、
前記カルシウム指示タンパクは、カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列（ｃｋｋａｐ配列）が蛍光タンパクのＮ末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列（ＣａＭ配列）が前記蛍光タンパクのＣ末端側に結合されている、カルシウム指示タンパクであり、
ｃｋｋａｐ配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする方法。

【請求項12】

カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列（ｃｋｋａｐ配列）をコードするヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの５’末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列（ＣａＭ配列）をコードするヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの３’末端側に結合されている、カルシウム指示遺伝子であり、
ｃｋｋａｐ配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列である、カルシウム指示遺伝子を前記細胞に導入する手順を含む、請求項１０記載の細胞活動電位の測定方法又は請求項１１記載の細胞内カルシウムイオンのイメージング方法。

【請求項13】

細胞の活動電位の測定及び／又は細胞内カルシウムイオンのイメージングのためのカルシウム指示試薬であって、
カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列（ｃｋｋａｐ配列）をコードするヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの５’末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列（ＣａＭ配列）をコードするヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの３’末端側に結合されているＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターを含む、試薬であり、
ｃｋｋａｐ配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列である、試薬。

【請求項14】

前記細胞が神経細胞である、請求項１３記載の試薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、カルシウム指示遺伝子に関する。より詳しくは、カルシウムセンサーとして機能する蛍光タンパクであって、蛍光特性及びカルシウム反応性に優れた蛍光カルシウム指示タンパクに関する。

【背景技術】

【0002】

カルシウムは、筋肉の収縮、神経興奮性やホルモン分泌、酵素活性の変化などの各種の細胞機能の調節因子として、生体機能の維持および調節に不可欠な役割を担っている。生体内（細胞外及び細胞内）のカルシウム濃度を測定するため、従来、カルシウムセンサー（カルシウムインディケーター）と称されるタンパクが用いられている。

【0003】

近年、脳高次機能の本質である認知活動を細胞レベル及び細胞内ドメインレベルで解析するため、神経活動に伴うカルシウム濃度の変化を超高速でイメージングする技術が必要とされており、優れたカルシウム反応性を備える蛍光カルシウムセンサーの開発が望まれている。

【0004】

カルシウムセンサーとして機能するタンパクとして、蛍光タンパクにカルモジュリンの部分配列とミオシン軽鎖キナーゼの部分配列を結合したカルシウム指示タンパクが知られている。このカルシウム指示タンパクは、カルシウムがカルモジュリンの部分配列に結合するとタンパクの立体構造が変化し、蛍光タンパク（ＧＦＰ又はＲＦＰ）の発する蛍光強度が変化することを利用している。例えば、非特許文献１には、蛍光タンパクとしてｍＡｐｐｌｅを用いたカルシウム指示タンパク（Ｒ−ＧＥＣＯ１）が記載されている。また、特許文献１には、Ｒ−ＧＥＣＯ１を改良して作成され、Ｒ−ＧＥＣＯ１よりも大きな蛍光強度変化を示すＲ−ＣａＭＰ１．０１と、Ｒ−ＣａＭＰ１．０１を改良して作成され、Ｒ−ＣａＭＰ１．０１よりもさらに大きな蛍光強度変化を示し、細胞内の局在性が改善されたＲ−ＣａＭＰ１．０７が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０１４−１１６１号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１，３３３，１８８８−１８９１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、従来のカルシウム指示タンパクよりもさらに蛍光特性及びカルシウム反応性に優れるカルシウム指示タンパクを提供することを主な目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］〜［２３］を提供する。

【0009】

［１］カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列（以下「ｃｋｋａｐ配列」）をコードするヌクレオチド及びカルモジュリンのカルシウム結合配列（以下「ＣａＭ配列」）をコードするヌクレオチドの一方のヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの５’末端側に、他方のヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの３’末端側に結合されているＤＮＡ。
［２］蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの５’末端にｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチドが、３’末端側にＣａＭ配列をコードするヌクレオチドが結合されている、［１］のＤＮＡ。
［３］ｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１〜３に示される塩基配列のいずれか一つである、［１］又は［２］のＤＮＡ。
［４］ｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチドと蛍光タンパクをコードするヌクレオチド、及び、蛍光タンパクをコードするヌクレオチドとＣａＭ配列をコードするヌクレオチドが、アミノ酸リンカーをコードするヌクレオチドを介してそれぞれ結合されている、［１］〜［３］のいずれかのＤＮＡ。
［５］蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの５’末端にｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチドが、３’末端側にＣａＭ配列をコードするヌクレオチドが結合されており、
ｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチドと蛍光タンパクをコードするヌクレオチドがアミノ酸リンカーＡをコードするヌクレオチドを介して結合されており、かつ、
蛍光タンパクをコードするヌクレオチドとＣａＭ配列をコードするヌクレオチドがアミノ酸リンカーＢをコードするヌクレオチドを介して結合されており、
アミノ酸リンカーＡ及びアミノ酸リンカーＢの組み合わせが、アミノ酸リンカーＡ（−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−）・アミノ酸リンカーＢ（−Ｔｈｒ−Ａｒｇ）である、［４］のＤＮＡ。
［６］ＣａＭ配列をコードするヌクレオチドの塩基配列が、配列番号７又は８に示される塩基配列である、［１］〜［５］のいずれかのＤＮＡ。
［７］［１］〜［６］のいずれかのＤＮＡを含むベクター。

【0010】

［８］ｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチド及びＣａＭ配列をコードするヌクレオチドの一方のヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの５’末端側に、他方のヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの３’末端側に結合されているカルシウム指示遺伝子が導入された形質転換細胞。
［９］ｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチド及びＣａＭ配列をコードするヌクレオチドの一方のヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの５’末端側に、他方のヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの３’末端側に結合されているカルシウム指示遺伝子が導入された、ヒトを除くトランスジェニック動物。
［１０］前記カルシウム指示遺伝子において、蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの５’末端にｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチドが、３’末端側にＣａＭ配列をコードするヌクレオチドが結合されている、［８］の細胞又は［９］のトランスジェニック動物。
［１１］ｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１〜３に示される塩基配列のいずれか一つである、［８］の細胞又は［９］のトランスジェニック動物。
［１２］ＣａＭ配列をコードするヌクレオチドの塩基配列が、配列番号７又は８に示される塩基配列である、［８］の細胞又は［９］のトランスジェニック動物。

【0011】

［１３］ｃｋｋａｐ配列及びＣａＭ配列の一方が蛍光タンパクのＮ末端側に、他方が前記蛍光タンパクのＣ末端側に結合されているタンパク。
［１４］前記蛍光タンパクのＮ末端側にｃｋｋａｐ配列が、Ｃ末端側にＣａＭ配列が結合されている、［１３］のタンパク。
［１５］ｃｋｋａｐ配列が、配列番号４〜６，１５〜１９に示されるアミノ酸配列のいずれか一つである、［１３］又は［１４］のタンパク。
［１６］ＣａＭ配列が、配列番号９又は１０に示されるアミノ酸配列である、［１３］〜［１５］のいずれかのタンパク。
［１７］ｃｋｋａｐ配列と蛍光タンパク、及び、蛍光タンパクとＣａＭ配列が、アミノ酸リンカーを介してそれぞれ結合されている、［１３］〜［１６］のいずれかのタンパク。
［１８］蛍光タンパクのＮ末端にｃｋｋａｐ配列が、Ｃ末端側にＣａＭ配列が結合されており、
ｃｋｋａｐ配列と蛍光タンパクがアミノ酸リンカーＡを介して結合されており、かつ、
蛍光タンパクとＣａＭ配列がアミノ酸リンカーＢを介して結合されており、
アミノ酸リンカーＡ及びアミノ酸リンカーＢの組み合わせが、アミノ酸リンカーＡ（−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−）・アミノ酸リンカーＢ（−Ｔｈｒ−Ａｒｇ）である、［１７］のタンパク。

【0012】

［１９］細胞内で発現されたカルシウム指示タンパクから放射される蛍光を検出する手順を含む、細胞の活動電位の測定方法であって、
前記カルシウム指示タンパクは、ｃｋｋａｐ配列及びＣａＭ配列の一方が蛍光タンパクのＮ末端側に、他方が前記蛍光タンパクのＣ末端側に結合されている、カルシウム指示タンパクであることを特徴とする方法。
［２０］細胞内で発現されたカルシウム指示タンパクから放射される蛍光を検出する手順を含む、細胞内カルシウムイオンのイメージング方法であって、
前記カルシウム指示タンパクは、ｃｋｋａｐ配列及びＣａＭ配列の一方が蛍光タンパクのアミノ酸配列のＮ末端側に、他方が前記蛍光タンパクのＣ末端側に結合されている、カルシウム指示タンパクであることを特徴とする方法。
［２１］ｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチド及びＣａＭ配列をコードするヌクレオチドの一方のヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの５’末端側に、他方のヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの３’末端側に結合されている、カルシウム指示遺伝子を前記細胞に導入する手順を含む、［１９］の細胞活動電位の測定方法又は［２０］の細胞内カルシウムイオンのイメージング方法。

【0013】

［２２］細胞の活動電位の測定及び／又は細胞内カルシウムイオンのイメージングのためのカルシウム指示試薬であって、
ｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチド及びＣａＭ配列をコードするヌクレオチドの一方のヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの５’末端側に、他方のヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの３’末端側に結合されているＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターを含む、試薬。
［２３］前記細胞が神経細胞である、［２２］の試薬。

【発明の効果】

【0014】

本発明により、蛍光特性及びカルシウム反応性に優れるカルシウム指示タンパクが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】本発明に係るカルシウム指示タンパクＲ−ＣａＭＰ２と公知技術に係るカルシウム指示タンパクＲ−ＣａＭＰ１．０７の構造を示す図である。

【図2-1】本発明に係るカルシウム指示タンパクのｃｋｋａｐ配列のアミノ酸配列の一例を示す図である。

【図2-2】本発明に係るカルシウム指示タンパクのｃｋｋａｐ配列のアミノ酸配列の他の一例を示す図である。

【図3】Ｒ−ＣａＭＰ１．０７、Ｒ−ＣａＭＰ２、及びＲ−ＧＥＣＯ２ＬのＣａ²⁺滴定曲線を示す図である。曲線は、ヒルの式に従ってフィッティングをした。

【図4】Ｒ−ＣａＭＰ１．０７、Ｒ−ＣａＭＰ２、及びＲ−ＧＥＣＯ２Ｌのin vitroでのベースラインの蛍光強度とダイナミックレンジ（Fmax/Fmin）を示す図である。

【図5】ＥＧＦＰとＲ−ＣａＭＰ２（Ａ）またはＲ−ＧＥＣＯ２Ｌ（Ｂ）を発現する海馬培養神経細胞を示す図である。スケールバー：１０μｍ。

【図6】海馬培養神経細胞のシナプス終末から記録されたフィールド刺激による単一活動電位に応答した蛍光変化を示す図である。

【図7】海馬培養神経細胞の細胞体から記録された、ＭＮＩ−ｇｌｕｔａｍａｔｅの単一ＵＶアンケージングパルスに応答した蛍光変化を示す図である。

【図8】単一活動電位で誘導されるシナプス終末のＣａ²⁺イメージングにおいて、１試行（灰色）及びＲ−ＣａＭＰ１．０７、Ｒ−ＣａＭＰ２、Ｒ−ＧＥＣＯ２Ｌの各試行の平均応答のトレースを示す図である。

【図9】単一活動電位で誘導されるシナプス終末のＣａ²⁺イメージングにおける、単一活動電位の振幅、ＳＮＲ、立ち上がり時間、減衰時定数を示す図である。

【図10】海馬培養神経細胞の細胞体において、グルタミン酸アンケージングの単一パルスに対する１回の試行（n=9）及び各試行の平均応答のトレースを示す図である。ＡはＲ−ＣａＭＰ１．０７の結果、ＢはＲ−ＣａＭＰ２の結果を示す。

【図11】海馬培養神経細胞の細胞体において、単一パルスのグルタミン酸アンケージングに対する振幅、ＳＮＲ、立ち上がり時間、減衰時定数を示す図である。

【図12】急性スライスにおけるバレル野２／３層錐体細胞の活動電位（n=10細胞）に対するＲ−ＣａＭＰ２の蛍光変化（ΔＦ／Ｆ）を、Ｒ−ＣａＭＰ１．０７との比較で示す図である。

【図13-1】急性スライス単一活動電位によって誘発されるＣａ²⁺応答の振幅、ＳＮＲ、立ち上がり時間、減衰時定数を示す図である。

【図13-2】急性スライスにおけるバレル野２／３層錐体細胞の活動電位（n=10細胞）に対するＲ−ＣａＭＰ２＿ＬＬＡの蛍光変化（ΔＦ／Ｆ）を、Ｒ−ＣａＭＰ２との比較で示す図である。

【図14】急性スライスにおけるバレル野２／３層錐体細胞において、２０Ｈｚで１、２、４及び８発のスパイクに応答する際のＲ−ＣａＭＰ１．０７及びＲ−ＣａＭＰ２発現神経細胞の代表的なトレース（上図）と平均の性能（下図）を示す図である。

【図15-1】急性スライスにおけるバレル野２／３層錐体細胞において、５発のスパイクに固定して、異なる周波数で刺激した際のＲ−ＣａＭＰ２の１回の試行での応答を示す図である（Ｂ）。（Ａ）は比較のためのＲ−ＣａＭＰ１．０７の結果を示す。

【図15-2】急性スライスにおけるバレル野２／３層錐体細胞において、５発のスパイクに固定して、異なる周波数で刺激した際のＲ−ＣａＭＰ２＿ＬＬＡの１回の試行での応答を示す図である。

【図16】エアパフひげ刺激によるＣａ²⁺変動をin vivoイメージングにより複数の神経細胞で記録した結果を示す図である。

【図17】in vivoでのＲ−ＣａＭＰ２発現新皮質神経細胞のＣａ²⁺変動（上段）と活動電位（下段）の同時記録の代表的トレースを示す図である。各バーストのスパイク数をトレースの下に示す。スケールバー：５μｍ。

【図18】in vivoの新皮質神経細胞において、２００ミリ秒のビン内の活動電位数で誘導されるＣａ²⁺変動の振幅、ＳＮＲ、時間積分値（1、2、3、4、5発の活動電位はn=254、115、45、26、13イベントを検出した。n=7匹のマウスから9細胞）を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

【0017】

１．カルシウム指示遺伝子及びカルシウム指示タンパク
本発明に係るカルシウム指示遺伝子及びカルシウム指示タンパクについて、実施例に記載の「Ｒ−ＣａＭＰ２」及び「Ｒ−ＧＥＣＯ２Ｌ」等を例として説明する。

【0018】

本発明に係るカルシウム指示タンパクは、蛍光タンパクのアミノ酸配列、カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）のカルモジュリン結合配列（以下「ｃｋｋａｐ配列」）のアミノ酸配列、及びカルモジュリンのカルシウム結合配列（以下「ＣａＭ配列」）のアミノ酸配列を含んでなる。同様に、本発明に係るカルシウム指示遺伝子は、蛍光タンパクをコードするヌクレオチド、ｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチド、及びＣａＭ配列をコードするヌクレオチドを含んでいる。

【0019】

また、本発明に係るカルシウム指示タンパクは、ｃｋｋａｐ配列と蛍光タンパクを結合するアミノ酸リンカー、及び蛍光タンパクとＣａＭ配列とを結合するアミノ酸リンカーを有していてもよい。同様に、本発明に係るカルシウム指示遺伝子は、ｃｋｋａｐ配列と蛍光タンパクを結合するアミノ酸リンカーをコードするヌクレオチド、及び蛍光タンパクとＣａＭ配列とを結合するアミノ酸リンカーをコードするヌクレオチドを有していてもよい。

【0020】

図１に、本発明に係るカルシウム指示タンパク（あるいはカルシウム指示遺伝子）の構造の一例を示す。図上段は、特許文献１に記載される従来のカルシウム指示タンパクであるＲ−ＣａＭＰ１．０７の構造、下段は本発明に係るカルシウム指示タンパクであるＲ−ＣａＭＰ２の構造を示す。図中、「ｃｋｋａｐ−ＷＬ」はｃｋｋａｐ配列の好適な一例を示す。また、「ｃｐＡｐｐｌｅ」は赤色蛍光タンパクを表す。

【0021】

本発明に係るＲ−ＣａＭＰ２は、蛍光タンパクのアミノ酸配列ｃｐＡｐｐｌｅのＮ末端側にｃｋｋａｐ配列が、Ｃ末端側にＣａＭ配列が結合されている。同様に、Ｒ−ＣａＭＰ２遺伝子においては、蛍光タンパクをコードするヌクレオチドｃｐＡｐｐｌｅの５’末端にｃｋｋａｐ配列をコードするヌクレオチドが、３’末端側にＣａＭ配列をコードするヌクレオチドが結合されている。この構造は、従来のＲ−ＣａＭＰ１．０７の構造において「Ｍ１３」で示されるミオシン軽鎖キナーゼのカルモジュリン結合配列をｃｋｋａｐ配列に置換した構造に相当する。また、本発明に係るＲ−ＧＥＣＯ２Ｌは、非特許文献１に記載される従来のカルシウム指示タンパクであるＲ−ＧＥＣＯ１のＭ１３配列をｃｋｋａｐ配列に置換した構造を有する。Ｒ−ＣａＭＰ２及びＲ−ＧＥＣＯ２Ｌの全長アミノ酸配列を配列番号１１及び配列番号１３に、Ｒ−ＣａＭＰ２及びＲ−ＧＥＣＯ２Ｌをコードするヌクレオチドの全長塩基配列を配列番号１２及び配列番号１４にそれぞれ示す。

【0022】

本発明に係るＲ−ＣａＭＰ２は、特許文献１に記載のＲ−ＣａＭＰ１．０７と同様に、Ｎ末端側及びＣ末端側にそれぞれ付加配列を有していてもよい。図中、「ＭＧＳ」で示される付加配列（３７アミノ酸残基）は、タンパクを精製する際に用いられるタグ配列である。また、「Ｆ２Ａ」で示される付加配列（２１アミノ酸残基）は、タンパクを細胞内において細胞質に局在させるために機能する。

【0023】

本発明に係るカルシウム指示タンパクは、ＣａＭ配列にカルシウムが結合し、さらにカルシウム結合ＣａＭ配列にｃｋｋａｐ配列が結合することで、立体構造を変化させる。本発明に係るカルシウム指示タンパクは、カルシウム存在下で立体構造を変化させることで、蛍光タンパクの立体構造変化とそれに伴う蛍光特性変化をもたらし、カルシウムセンサーとして機能する。実施例に記載する通り、本発明に係るＲ−ＣａＭＰ２及びＲ−ＧＥＣＯ２Ｌ等は、カルシウム結合ＣａＭ配列に対する結合ドメインとしてｃｋｋａｐ配列を有することにより、同結合ドメインとしてＭ１３配列を有するＲ−ＣａＭＰ１．０７及びＲ−ＧＥＣＯ１等の従来のカルシウム指示タンパクに比して優れた蛍光特性及びカルシウム反応性を発揮する。より具体的には、Ｒ−ＣａＭＰ２及びＲ−ＧＥＣＯ２Ｌ等は、カルシウム存在下と非存在下との間での蛍光強度の変化量（ダイナミックレンジ）がより大きく、カルシウムとの結合と解離に伴う蛍光特性の変化速度もより大きい点で、従来のカルシウム指示タンパクに比して優位な特性を備える。

【0024】

Ｒ−ＣａＭＰ２のアミノ酸配列を配列番号１１に示す。配列番号１１に示すアミノ酸配列のうち、１〜３７番目がＭＧＳ配列、３８〜６３番目がｃｋｋａｐ配列（ｃｋｋａｐ−ＷＬ）、６６〜３０７番目がｃｐＡｐｐｌｅ配列、３１０〜４５６番目がＣａＭ配列、４７２〜４９２番目がＦ２Ａ配列である。ＭＧＳ配列、ｃｋｋａｐ配列、ｃｐＡｐｐｌｅ配列、ＣａＭ配列及びＦ２Ａ配列は、リンカーによって隣接する配列と結合されていてよい。リンカーは、カルシウム指示タンパクの機能が維持される限りにおいて特に限定されない。

【0025】

Ｒ−ＣａＭＰ２の好適なリンカー構造は、ｃｋｋａｐ配列と蛍光タンパクを結合するアミノ酸リンカーＡが「−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−」であり、蛍光タンパクとＣａＭ配列を結合するアミノ酸リンカーＢが「−Ｔｈｒ−Ａｒｇ」である。

【0026】

本発明に係るカルシウム指示タンパクにおける好適なアミノ酸リンカーＡ，Ｂの組み合せは、上記の「−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−」及び「−Ｔｈｒ−Ａｒｇ」の組み合せである。

【0027】

これらのリンカー構造を採用することにより、カルシウム存在下での蛍光強度が高く、ダイナミックレンジが大きいカルシウム指示タンパクを得ることができる。

【0028】

また、Ｒ−ＧＥＣＯ２Ｌのアミノ酸配列を配列番号１３に示す。配列番号１３に示すアミノ酸配列のうち、１〜３番目がＭＧＳ配列、４〜２９番目がｃｋｋａｐ配列（ｃｋｋａｐ−ＷＬ）、３２〜２７３番目がｃｐＡｐｐｌｅ配列、２７６〜４２２番目がＣａＭ配列である。ＭＧＳ配列、ｃｋｋａｐ配列、ｃｐＡｐｐｌｅ配列及びＣａＭ配列は、リンカーによって隣接する配列と結合されていてよい。

【0029】

［ｃｋｋａｐ配列］
本発明に係るカルシウム指示タンパクのｃｋｋａｐ配列は、カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）のカルモジュリン結合配列である。ＣａＭＫＫのカルモジュリン結合配列には、αサブユニットとβサブユニットが存在するが、本発明のｃｋｋａｐ配列は、αサブユニット由来の配列（アミノ酸配列を配列番号４、当該アミノ酸配列をコードするヌクレオチドを配列番号１に示す）であっても、βサブユニット由来の配列（アミノ酸配列を配列番号５、当該アミノ酸配列をコードするヌクレオチドを配列番号２に示す）であってもよい。なお、これらの配列は、ラットのＣａＭＫＫ由来のものであるが、ｃｋｋａｐ配列の由来は、カルシウムが結合したＣａＭ配列に対する結合性を有する限り、任意の生物種であってよい。

【0030】

さらに、ｃｋｋａｐ配列は、カルシウムが結合したＣａＭ配列に対する結合性を有する限り、配列番号４又は５に記載のアミノ酸配列中の１個又は数個（好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列であってもよい。このようなｃｋｋａｐ配列として、上記ｃｋｋａｐ−ＷＬ（アミノ酸配列を配列番号６、当該アミノ酸配列をコードするヌクレオチドを配列番号３に示す）が挙げられる。また、ｃｋｋａｐ配列として、ｃｋｋａｐ−ＷＬのアミノ酸配列をさらに改変したアミノ酸配列（ｃｋｋａｐ−ＷＬ２〜６）も採用できる。ｃｋｋａｐ配列のアミノ酸配列は、カルシウム指示タンパクの蛍光特性及びカルシウム反応性を高める観点から、配列番号６，１５〜１９に示す配列が好ましく、配列番号１５〜１９に示す配列が最も好ましい。配列番号６，１５〜１９に示す配列からｃｋｋａｐ配列のアミノ酸配列を適宜選択することにより、カルシウム指示タンパクの蛍光特性やカルシウム反応性を所望の程度に設定することもできる。実施例に記載のＲ−ＣａＭＰ２及びＲ−ＧＥＣＯ２Ｌは、ｃｋｋａｐ配列として、ｃｋｋａｐ−ＷＬを含む。また、Ｒ−ＣａＭＰ２＿ＬＬＡは、ｃｋｋａｐ配列としてｃｋｋａｐ−ＷＬ５を含む。図２-１に、αサブユニット由来のｃｋｋａｐ配列（ｃｋｋａｐα）とβサブユニット由来のｃｋｋａｐ配列（ｃｋｋａｐβ）及びｃｋｋａｐ−ＷＬのアミノ酸配列を示す。図２-２に、ｃｋｋａｐ−ＷＬ２〜６のアミノ酸配列を示す。

【0031】

なお、ｃｋｋａｐ配列は、ＣａＭＫＫのカルモジュリン結合配列のみからなるものに限られないものとする。すなわち、ｃｋｋａｐ配列は、ＣａＭＫＫのアミノ酸配列のうち、カルモジュリン結合配列以外のアミノ酸配列を含んでいてもよく、例えばカルモジュリン結合配列のＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸を数残基〜数十残基含んでいてもよいものとする。

【0032】

［ＣａＭ配列］
本発明に係るカルシウム指示タンパクのＣａＭ配列は、カルモジュリンのカルシウム結合配列である。ＣａＭ配列には、配列番号９又は配列番号１０に示すアミノ酸配列を用いることができる。配列番号９に示すアミノ酸配列はＲ−ＣａＭＰ２が備えるＣａＭ配列であり、配列番号１０に示すアミノ酸配列はＲ−ＧＥＣＯ２Ｌが備えるＣａＭ配列である。これらのＣａＭ配列は、ラットカルモジュリンの２番目から１４８番目のアミノ酸配列に由来し、該アミノ酸配列に４残基又は５残基のアミノ酸置換を導入したアミノ酸配列である。Ｒ−ＣａＭＰ２のＣａＭ配列をコードするヌクレオチドの塩基配列を配列番号７に、Ｒ−ＧＥＣＯ２ＬのＣａＭ配列をコードするヌクレオチドの塩基配列を配列番号８に示す。なお、ＣａＭ配列の由来は、カルシウムに対する結合性を有し、カルシウムが結合した状態でｃｋｋａｐ配列と結合し得る限り、任意の生物種であってよい。

【0033】

さらに、ＣａＭ配列も、カルシウムに対する結合性を有し、カルシウムが結合した状態でｃｋｋａｐ配列と結合し得る限り、配列番号９又は１０に記載のアミノ酸配列中の１個又は数個（好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列であってもよい。なお、ＣａＭ配列は、カルモジュリンのカルシウム結合配列のみからなるものに限られないものとする。すなわち、ＣａＭ配列は、カルモジュリンのカルシウム結合配列のうち、カルシウム結合配列以外のアミノ酸配列を含んでいてもよく、例えばカルシウム結合配列のＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸を数残基〜数十残基含んでいてもよいものとする。

【0034】

［蛍光タンパク］
本発明に係るカルシウム指示タンパクの蛍光タンパクには、特に限定されないが、青色蛍光タンパク（例えばＢＦＰなど）、緑色蛍光タンパク（例えばＥＧＦＰなど）、黄色蛍光タンパク（例えばＶｅｎｕｓなど）及び赤色蛍光タンパクが用いられる。特に赤色蛍光タンパクが好適に用いられ、例えばｍＡｐｐｌｅ又はその改変体が用いられる。光刺激で細胞機能を操作し、同時に蛍光カルシウムイメージングで細胞機能を測定するためにカルシウム指示タンパクを用いる場合、蛍光タンパクが赤色蛍光タンパクであれば、その励起波長が細胞機能操作を目的として汎用される光刺激プローブＣｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２の励起波長と重複しないため好ましい。

【0035】

ｍＡｐｐｌｅの改変体とは、蛍光特性に影響を及ぼすアミノ酸残基の近傍でｍＡｐｐｌｅのアミノ酸配列を切断して該蛋白質の構造を改変し、さらに特定部位のアミノ酸残基を置換したものである。ｍＡｐｐｌｅの改変体の具体例は、特許文献１に記載されている。

【0036】

図１では、本発明に係るカルシウム指示タンパク（あるいはカルシウム指示遺伝子）において、ｃｋｋａｐ配列、蛍光タンパク及びＣａＭ配列が、この順序でＮ末端側（あるいは５’末端側）からＣ末端側（あるいは３’末端側）に配列する例を説明した。本発明に係るカルシウム指示タンパクにおいて、ｃｋｋａｐ配列、蛍光タンパク及びＣａＭ配列の配列順序は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、ＣａＭ配列、蛍光タンパク及びｃｋｋａｐ配列であってもよいものとする。

【0037】

本発明に係るカルシウム指示タンパクは、カルシウムと結合することで立体構造が変化し、該立体構造の変化がカルシウム指示タンパクに含まれる蛍光タンパクの立体構造に影響を与えることで、蛍光タンパクの蛍光特性を可逆的に変化させる。ここで、蛍光特性とは、蛍光強度、蛍光波長、蛍光強度比、吸光度、吸光波長などの蛍光特性を指す。本発明では蛍光特性の一例として、蛍光強度を使用する。蛍光特性の変化が蛍光強度の変化である場合、蛍光の変化量ΔＦ／Ｆが、好ましくは、少なくとも０．３以上変化すること、より好ましくは０．６以上変化することをいう。

【0038】

本発明におけるカルシウム指示タンパクは、ｃｋｋａｐ配列を備えることにより、従来のカルシウム指示タンパクに比べ、カルシウムとの結合時に、より大きな蛍光特性の変化を引き起こすことを特徴とする。ここでより大きな蛍光特性変化とは、蛍光特性の変化が蛍光強度の変化である場合、蛍光の変化量ΔＦ／Ｆが、従来のカルシウムセンサーよりも大きく、好ましくは３倍以上増強されることをいう。

【0039】

２．ベクター、形質転換細胞及びトランスジェニック動物
本発明に係るカルシウム指示遺伝子は、公知の遺伝子工学的手法を用いて作成できる。例えば、ｃｋｋａｐ配列、蛍光タンパク及びＣａＭ配列等の配列をコードするヌクレオチドをそれぞれＰＣＲにより増幅し、増幅断片を繋ぎ合わせることにより本発明に係るカルシウム指示遺伝子を作成できる。

【0040】

得られたカルシウム指示遺伝子は、プラスミドやウイルス等の公知のベクターに組込むことができる。カルシウム指示遺伝子を搭載したベクターを所望の細胞に導入することにより、カルシウム指示タンパクを発現する形質転換細胞を得られる。カルシウム指示遺伝子を搭載したベクターあるいはカルシウム指示遺伝子そのものは、後述する細胞の活動電位の測定又は細胞内カルシウムイオンのイメージングのための試薬の一部となり得る。

【0041】

また、公知の遺伝子工学的手法を用いて、カルシウム指示遺伝子が導入されたトランスジェニック動物を作成できる。カルシウム指示遺伝子を哺乳動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中にカルシウム指示遺伝子が導入された個体を選別することによってトランスジェニック動物を作成できる。この際、組織特異的プロモーターの制御下にカルシウム指示遺伝子を組み込んで導入することによって、例えば脳神経細胞のみでカルシウム指示タンパクを発現するトランスジェニック動物を得ることもできる。

【0042】

３．細胞の活動電位の測定方法及び細胞内カルシウムイオンのイメージング方法
本発明に係るカルシウム指示タンパクは、細胞内カルシウム濃度変化を高感度に検知することができ、細胞の活動電位の測定及び細胞内カルシウムのイメージングのために好適に利用できる。細胞は、特に限定されないが、神経細胞が好ましい一例である。

【0043】

例えば、本発明に係るカルシウム指示遺伝子を搭載したベクターを測定対象とする細胞に導入してカルシウム指示タンパクを発現させる。あるいは、測定対象とする細胞でカルシウム指示タンパクを発現するトランスジェニック動物を作成する。そして、蛍光顕微鏡もしくは多光子顕微鏡等により、カルシウム指示タンパクに含まれる蛍光タンパクの励起波長に応じた波長の励起光を測定対象細胞に照射し、カルシウム指示タンパクから放射される蛍光を検出する。蛍光強度の変化を経時的に取得することで細胞の活動電位を測定することが可能であり、蛍光強度の変化をリアルタイムに画像化処理することで細胞内カルシウムのイメージングが可能となる。

【0044】

本発明に係るカルシウム指示タンパクを用いた細胞活動電位の測定方法及び細胞内カルシウムイオンイメージング方法は、細胞活動電位及び細胞内カルシウムイオン濃度に影響を及ぼす物質をスクリーニングするために応用できる。例えば、被検物質を処置した細胞あるいは被検物質を個体レベル、組織レベル又は細胞レベルで投与した動物を用いて、細胞内の細胞活動電位等を記録する。そして、記録された細胞活動電位を、被検物質を処置しないで同様に取得された細胞活動電位等と比較し、被検物質が細胞活動電位等に与える影響の有無を判定し、細胞活動電位等の亢進又は抑制に機能する物質を選択する。被検物質には、合成又は天然の各種化合物、ペプチドやタンパク、及びＤＮＡやＲＮＡなどの核酸などであってよく、核酸を用いる場合には遺伝子導入によって該核酸がコードする遺伝子を細胞に発現させた上で細胞活動電位等の変化を記録する。

【実施例】

【0045】

１．材料と方法
［Ｒ−ＣａＭＰ２，Ｒ−ＧＥＣＯ２Ｌ］
文献（PLoS One, 2012, 7, e39933）記載の手法に従って、Ｒ−ＣａＭＰ１．０７発現コンストラクトを構築した。Ｒ−ＧＥＣＯ１は、Ａｄｄｇｅｎｅ（http://www.addgene.org/）を通して得た。Ｒ−ＧＥＣＯ１は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Clontech）由来のｐＣＭＶベクターからサブクローニングした。

【0046】

Ｒ−ＣａＭＰ１．０７及びＲ−ＧＥＣＯ１のＭ１３配列をラットＣａＭＫＫαのＶａｌ４３８‐Ｐｈｅ４６３に相当するＣａ²⁺／カルモジュリン結合配列（ｃｋｋａｐ配列）に置換し、Ｒ−ＣａＭＰ２及びＲ−ＧＥＣＯ２Ｌを作成した（図１参照）。ｃｋｋａｐ配列には、ＣａＭＫＫαの配列（ｃｋｋａｐα、配列番号４）とＣａＭＫＫβの配列（ｃｋｋａｐβ、配列番号５）とのハイブリッド配列（ｃｋｋａｐ−ＷＬ、配列番号６）を部位特異的変異法により作成して用いた（図２-１参照）。ＣａＭ配列には、文献（Nature, 2013, 499, 295-300、J. Biol. Chem., 2009, 284, 6455-6464）記載のアミノ酸置換を導入した（配列番号８，９）。Ｒ−ＣａＭＰ２及びＲ−ＧＥＣＯ２Ｌは、ｐＣＡＧベクターにサブクローニングした。

【0047】

［Ｒ−ＣａＭＰ２＿ＬＬＡ］
Ｒ−ＣａＭＰ２のｃｋｋａｐ配列（ｃｋｋａｐ−ＷＬ）を部位特異的変異法により改変し、ｃｋｋａｐ配列をｃｋｋａｐ−ＷＬ５（図２-２参照）とするＲ−ＣａＭＰ２＿ＬＬＡを作成した。

【0048】

［Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣａ²⁺蛍光測定］
作成したカルシウム指示タンパクをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現させて、Ｃａ²⁺フリーのバッファー（20 mM MOPS (pH 7.5), 100 mM potassium chloride, 1 mM DTT, 1×Protease Inhibitor Cocktail (Complete, EDTA free, Roche)）にて細胞を回収した。回収後、超音波破砕を行い、遠心して上清を取りライセートとした。このライセートをスクリーニングやIn vitroの性能評価に用いた。

【0049】

In vitroの蛍光測定は、室温にてプレートリーダー（Fusion α、Perkin Elmer）と96ウェルプレートを用いて行った。ダイナミックレンジはＦｍａｘ／Ｆｍｉｎとして計算した。Ｆｍａｘは０．３ ｍＭ Ｃａ²⁺の条件下においてＣａ²⁺飽和状態の時の蛍光強度を、Ｆｍｉｎは１５ｍＭ ＥＧＴＡ存在下でのゼロＣａ²⁺の時の蛍光強度を測定した。Ｃａ²⁺適定曲線は、市販のキット（Ca²⁺ Calibration Kit #1、Invitrogen）を用いて、１０ ｍＭのＫ₂Ｈ₂ＥＧＴＡとＣａ₂ＥＧＴＡの混合液により定量した。Ｋｄ値及びＨｉｌｌ係数は、解析ソフトウェア（Origin Pro 7.5、Origin Lab）を用いてカーブフィットを行って算出した。

【0050】

［海馬培養神経細胞におけるＣａ²⁺イメージング］
文献（Cell, 1996, 87, 1203-1214、Cell Rep., 2013, 3, 978-987）記載の手法に従って、海馬分散培養を行った。海馬培養神経細胞は生後当日のＳＤラット（日本SLC）の海馬（CA1/CA3領域）から取った。培養後１０〜１１日目で、ＣＭＶプロモーターのカルシウム指示タンパクをコードする遺伝子をリポフェクションにより神経細胞に導入した。遺伝子導入２〜３日後、フィールド電気刺激によって引き起こされるＣａ²⁺イメージングをＴｙｒｏｄｅ溶液（129 mM NaCl, 5 mM KCl, 30 mM glucose, 25 mM HEPES-NaOH [pH 7.4], 1 mM MgCl₂ and 3 mM CaCl₂）を用いて行った。自発発火を防ぐために、Ｔｙｒｏｄｅ溶液には、１０ μＭ ＣＮＱＸ （Tocris Bioscience）及び５０ μＭ Ｄ−ＡＰ５（Tocris Bioscience）を加えた。

【0051】

シナプス終末（軸索起始部から100 μm以上離れてかつ、軸索の直径が3倍以上大きい部位）のイメージングを、倒立顕微鏡（IX81, Olympus）とＥＭ−ＣＣＤ（C9100-12またはC9100-13, 浜松ホトニクス）を用いて行った。神経細胞は、ステージＣＯ₂インキュベーター中で３７℃に維持した。神経細胞は、フィールド電気刺激（50 mA、1 msecの電流パルス）を用いて刺激した。この刺激条件は、パルス刺激装置（Master-8、A.M.P.I.）を用いて、確実に細胞体のスパイクを誘導するのに十分であった。

【0052】

ＵＶグルタミン酸アンケージングでは、神経細胞を０．４ ｍＭのＭＮＩ−グルタミン酸（Tocris Bioscience）と１μＭのＴＴＸで処置した、Ｍｇ²⁺を含まないＴｙｒｏｄｅ溶液中でイメージングを行った。ＭＮＩ−グルタミン酸のＵＶアンケージングは、ＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳソフトウェアプラットフォーム（浜松ホトニクス）上で動作する紫外線光分解システム（浜松ホトニクス）と、該システムにより制御された３５５ｎｍのＵＶナノ秒パルスレーザー（(Polaris II, New Wave Research）を用いて誘導した（Cell Rep., 2013, 3, 978-987）。

【0053】

［子宮内電気穿孔法］
子宮内電気穿孔法は、文献（J. Neurosci., 2009, 29, 13720-13729）記載の方法に従った。胎生１４．５日目のＩＣＲマウス（SLC日本）の側脳室に、麻酔下で、精製したプラスミド溶液約１．０ μｌを注入し、５回の電気パルス（45 V、1 Hz、50ミリ秒の持続時間を5回）をエレクトロポレーター（BTX）により与えた。カルシウム指示タンパクを発現するマウスまたは細胞を可視化するために、体積のコントロールとしてＥＧＦＰを共発現させた。生後４〜７週間後のマウスを、急性スライス標本またはin vivoイメージングに供した。

【0054】

［急性脳スライスにおけるＣａ²⁺イメージングとホールセル記録の同時測定］
文献（Eur. J. Neurosci., 2014, 39, 1720-1728）記載の手法に従って、急性脳スライス実験を行った。４〜７週齢のマウスをＣＯ₂で深く麻酔し、断頭した。カルシウム指示タンパクは、ＣＡＧプロモーター下で、あるいは、ＴＲＥ−ｔｉｇｈｔプロモーターとＴｅｔ３Ｇ（Clontech及びTet-Systems）を用いたテトラサイクリン誘導発現系を用いて、発現させた。

【0055】

全脳を迅速に除去し、氷冷した人工脳脊髄液（ACSF）（125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH₂PO₄, 26 mM NaHCO₃, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 25 mM glucose, bubbled with 95% O₂ and 5% CO₂）中に浸した。体性感覚野（厚さ250 μm）の急性冠状脳スライスは、ミクロトーム（VT1200S, Leica）を使用して切断した。脳スライスを記録チャンバーに移動する前に３０℃で酸素飽和ＡＣＳＦ中に３０分間培養し、続いて室温に維持した。

【0056】

脳切片を、二光子顕微鏡ステージ上に液浸型記録チャンバーに装着し、バレル野の第４層を明視野によって同定した。ホールセルパッチクランプ記録は、バレル野の第２／３錐体細胞で行った。記録中、記録チャンバーは連続的に３０℃の酸素飽和ＡＣＳＦで灌流した。パッチピペットは、垂直プラー（PC-10、成茂）を使用して、ホウケイ酸ガラスキャピラリーから引き出し、細胞内液（133 mM K-MeSO₃, 7.4 mM KCl, 10 mM HEPES, 3 mM Na₂ATP, 0.3 mM Na₂GTP, 0.3 mM MgCl₂）が満たされたときに５〜８ Ｍオームの抵抗を有した。ホールセル電流固定記録は、ＥＰＣ１０増幅器（Heka）を用いて行った。すべての電気生理学的データは、１０ ｋＨｚでフィルターし、２０ ｋＨｚでデジタル化した。

【0057】

［Ｉｎ ｖｉｖｏイメージングのための頭蓋骨手術］
In vivoイメージングのために、マウス（4〜7週齢）にウレタン（1.5〜1.8mg/ g）を腹腔内投与し麻酔した。加熱パッド（FHC, Bowdoin）を用いて体温を３７℃に維持した。瞬間接着剤と歯科用セメントを用いて、右バレル野の上の頭蓋骨にステンレス製のヘッドプレートを接着した（ブレグマから3.0〜3.5 mm横、1.5 mm後部）。円形の開頭（直径1.8〜2.0 mm）を作製し、硬膜を慎重に取り除いた。開頭を溶液（150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 1.5% agarose, pH 7.3）で満たした。露出された脳の動きを抑制するために、ガラスカバースリップをアガロース上に置いた後、マウスを二光子顕微鏡の動物用ステージに移した。

【0058】

［Ｉｎ ｖｉｖｏ ２光子Ｃａ２⁺イメージング］
カルシウム指示タンパク発現神経細胞のin vivo Ｃａ²⁺イメージングは右バレル野の第２／３層（軟膜から約150〜300 μm下部）で実施した。カルシウム指示タンパクの発現は、ＣＡＧプロモーターによって行った。ＣＡＧプロモーターによる永続的なカルシウム指示タンパクの発現は、測定可能な神経細胞毒性を引き起こさなかった。

【0059】

感覚刺激は、短いエアパフ（40〜45 psiで50 ms）を用いて対側のひげに与えた。神経細胞集団の自発的および感覚誘発活動は、３分間、２５６×１９２画素（サンプリングレート= 2.3 Hz）の分解能で取得した。単一神経細胞におけるＣａ²⁺変動の高速撮像のために、高速ラインスキャン（サンプリングレート= 650〜700 Hz）は、皮質ニューロンの細胞体で行った。樹状突起イメージングのために、可能な限り１焦点面に多くの目に見えるスパインと樹状突起が入るように選択した。イメージングは、２２秒、２３２×６４ピクセルの解像度（サンプリングレート= 4.3 Hz）で取得した。

【0060】

［Ｃａ²⁺イメージング及びｉｎ ｖｉｖｏ ｌｏｏｓｅ−ｓｅａｌ ｃｅｌｌ ａｔｔａｃｈｅｄ電気記録法の同時測定］
in vivoでのセルアタッチ記録は、蛍光物質（Alexa488、50 μM）を含むACSFで満たされたガラス電極（5-7M オーム）を用いて行った。カルシウム指示タンパクを発現させたバレル野の神経細胞に、２光子ターゲットのパッチ法（Neuron, 2003, 39, 911-918）を適用した。セルアタッチ成立から約１０分後、スパイク記録と高速ラインスキャンのＣａ²⁺イメージング（サンプリングレート=675 Hz）の同時測定を細胞体にて実施した。電気生理学的データは、クランプモードでＥＰＣ１０増幅器（HEKA）を用いて増幅した。１０ｋＨｚでフィルターをかけて、２０ｋＨｚでデジタル化した。さらにオフラインで１００Ｈｚのハイパスフィルターをかけた。スパイクの検出は、ＭＡＴＬＡＢを使用して、閾値処理することにより自動的に計数した。

【0061】

以上に説明した材料と方法については、本願優先日後に公表された文献（Nature Method, 2015, Vol.12, No.1, p.64-70）も参照できる。

【0062】

２．結果
Ｒ−ＣａＭＰ２とＲ−ＧＥＣＯ２Ｌは、Ｋｄ値が１００ｎＭ以下であった（図３参照）。また、Ｒ−ＣａＭＰ２とＲ−ＧＥＣＯ２Ｌは、Ｃａ²⁺非存在下の基底蛍光値（Baseline Fluorescence）においてはＲ−ＣａＭＰ１．０７に比べて同等ないし２倍以内に留まり、ダイナミックレンジにおいてはＲ−ＣａＭＰ１．０７には劣るものの５倍以上であった。（図４参照）。

【0063】

Ｒ−ＣａＭＰ２とＲ−ＧＥＣＯ２Ｌを初代海馬培養神経細胞に発現させた。また、赤色指示薬の蛍光スペクトルと分離するＥＧＦＰを体積のコントロールとして発現させた。Ｒ−ＣａＭＰ２は特徴的な核外の局在を示した（図５Ａ）。一方、Ｒ−ＧＥＣＯ２Ｌは細胞質だけでなく核内にも局在を示した（図５Ｂ）。さらに、Ｒ−ＣａＭＰ２及びＲ−ＧＥＣＯ２Ｌは、樹状突起、軸索及びシナプス終末において一様な分布を示した。

【0064】

フィールド電気刺激による単一活動電位（1AP）（図６）及び細胞体近傍へのＵＶパルスレーザーによる単一のナノ秒パルスによるＭＮＩ−ｇｌｕｔａｍａｔｅのアンケイジング（図７）は、顕著なＣａ²⁺変動を引き起こし、単一指数関数でフィットできた。

【0065】

Ｒ−ＣａＭＰ２及びＲ−ＧＥＣＯ２Ｌは、in vitroにおいて既存の蛍光カルシウム指示タンパクよりもずっと高いＣａ²⁺親和性を示した（表１）。加えて、Ｒ−ＣａＭＰ２及びＲ−ＧＥＣＯ２Ｌは、生きた神経細胞において、Ｒ−ＧＥＣＯ１及びＲ−ＣａＭＰ１．０７よりも早いキネティクスを有した（図８〜１１）。さらに、Ｒ−ＣａＭＰ２のΔＦ／Ｆの振幅応答はＲ−ＣａＭＰ１．０７より３倍以上大きく、Ｒ−ＧＥＣＯ２Ｌ（図８，９）より大きかった。

【0066】

【表1】

※ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，２０１２，７，ｅ５１２８６参照。

【0067】

【表2】

【0068】

Ｒ−ＣａＭＰ２及びＲ−ＧＥＣＯ２Ｌは、１近くのヒル係数を有する（表１）。これはＯＧＢ−１（J. Neurosci., 2008, 7399-7411）のような化学合成されたカルシウム指示薬のヒル係数とほぼ同じである。このことは、既存の蛍光カルシウム指示タンパクの多くが、ヒル係数２以上（表１）であることと明確に異なる。

【0069】

脳組織中のＲ−ＣａＭＰ２の有用性を検証するために、子宮内電気穿孔法（J. Neurosci., 2009, 29, 13720-13729）にてバレル野第２／３層の神経細胞にＲ−ＣａＭＰ２を導入し、成体マウスにおいて急性スライスを作成した。チタンサファイアレーザーで励起し、Ｒ−ＣａＭＰ２発現神経細胞の細胞体および近位樹状突起において、ホールセルパッチクランプと組み合わせて高速（７００Ｈｚ近傍）の２光子ラインスキャンでＣａ²⁺イメージングを行った。Ｒ−ＣａＭＰ２＿ＬＬＡについても同様の実験を行った。

【0070】

初代海馬培養神経細胞の結果と同様に、単一の脱分極電流注入によるΔＦ／Ｆ応答振幅は、Ｒ−ＣａＭＰ１．０７発現神経細胞よりＲ−ＣａＭＰ２発現神経細胞の方が有意に大きかった（図１２、１３）。信号対雑音比（SNR：signal to noise ratio）（最大4.0倍大きい）、立ち上がり時間（最大２.６倍早い）、減衰時定数（最大3.4倍早い）において、Ｒ−ＣａＭＰ２は、Ｒ−ＣａＭＰ１．０７に比して数倍の改善を示した（図１３-１）。Ｒ−ＣａＭＰ２＿ＬＬＡは、Ｒ−ＣａＭＰ２に比してさらに早い立ち上がり時間を示した（図１３-２）。なお、ＧＣａＭＰ６ｓ，ＧＣａＭＰ６ｆは、Ｍ１３配列を用いたカルシウムセンサーである。

【0071】

Ｒ−ＣａＭＰ２は、これらの改善されたパラメータと一致して、最大４パルスに対する電流注入の連続パルスまでΔＦ／Ｆ振幅およびＳＮＲの改善を示した（図１４）。また、２０〜４０Ｈｚの連続した活動電位までは単一の試行でも判別することができた（図１５-１、Ｂ）。同じ実験条件下で、Ｒ−ＣａＭＰ１．０７発現神経細胞から記録したＣａ²⁺シグナルは、よりベースラインのノイズが大きく、また立ち上がり時間が遅く、５Ｈｚの周波数のパルスまでしか活動電位を判別できなかった（図１５-１、Ａ）。Ｒ−ＣａＭＰ２＿ＬＬＡは、Ｒ−ＣａＭＰ２に比してさらに高周波数の刺激に追従し、５０Ｈｚまでの分解能を有した（図１５-２）。

【0072】

麻酔下の頭固定マウスのバレル野第２／３層の神経細胞におけるin vivoでのＣａ²⁺イメージングを行った。第２／３層錐体神経細胞の約３０〜６０％を標識した条件下では、自発的なＣａ²⁺スパイクを確実に記録できた（図１６）。触覚情報の表現はまばらな神経細胞にコードされている（Neuron, 2010, 67, 1048-1061、Neuron, 2013, 78, 28-48、Trends Neurosci., 2012, 35, 345-355）。これと一致して、ひげへのエアパフ刺激は限られた細胞でしかＣａ²⁺変動が生じなかった。また、Ｒ−ＣａＭＰ２ベースのＣａ²⁺変動に刺激相関活性を示すアクティブ神経細胞は、連続的なエアパフ刺激の際に誘発反応を起こした。つまり、バレル野での感覚刺激に応答するアクティブな神経細胞を同定することができた。

【0073】

in vivoでの記録の解像度を確認するために、ｌｏｏｓｅ−ｓｅａｌ ｃｅｌｌ ａｔｔａｃｈｅｄ電気記録法と同時に、高速ラインスキャンのＣａ²⁺イメージングを行った（図１７）。自発的な活動電位は、５パルスまでＳＮＲ、振幅、振幅の時間積分のぞれぞれの応答において、線形に近い増加を示した（図１８）。以上より、Ｒ−ＣａＭＰ２はin vivoにおける単一の活動電位に伴うＣａ²⁺変動の立ち上がりと減衰時間のキネティクスが、これまでに報告されているＧＣａＭＰ６ｆ（Nature, 2013, 499, 295-300）またはｆａｓｔ−ＧＣａＭＰ（Nat. Commun., 2013, 4, 2170）といった早いキネティクスを持つ緑色蛍光カルシウム指示タンパクと同程度であることが明らかになった。

【配列表フリーテキスト】

【0074】

配列番号１：ＣａＭＫＫのαサブユニットに由来するｃｋｋａｐ配列（
ｃｋｋａｐα）をコードするヌクレオチドの塩基配列。
配列番号２：ＣａＭＫＫのβサブユニットに由来するｃｋｋａｐ配列（ｃｋｋａｐβ）をコードするヌクレオチドの塩基配列。
配列番号３：ｃｋｋａｐ−ＷＬをコードするヌクレオチドの塩基配列。
配列番号４：ＣａＭＫＫのαサブユニットに由来するｃｋｋａｐ配列（
ｃｋｋａｐα）のアミノ酸配列。
配列番号５：ＣａＭＫＫのβサブユニットに由来するｃｋｋａｐ配列（ｃｋｋａｐβ）のアミノ酸配列。
配列番号６：ｃｋｋａｐ−ＷＬのアミノ酸配列。
配列番号７：Ｒ−ＣａＭＰ２のＣａＭ配列をコードするヌクレオチドの塩基配列。
配列番号８：Ｒ−ＧＥＣＯ２ＬのＣａＭ配列をコードするヌクレオチドの塩基配列。
配列番号９：Ｒ−ＣａＭＰ２のＣａＭ配列のアミノ酸配列。
配列番号１０：Ｒ−ＧＥＣＯ２ＬのＣａＭ配列のアミノ酸配列。
配列番号１１：Ｒ−ＣａＭＰ２のアミノ酸配列。
配列番号１２：Ｒ−ＣａＭＰ２をコードするヌクレオチドの塩基配列。
配列番号１３：Ｒ−ＧＥＣＯ２Ｌのアミノ酸配列。
配列番号１４：Ｒ−ＧＥＣＯ２Ｌをコードするヌクレオチドの塩基配列。
配列番号１５：ｃｋｋａｐ−ＷＬ２のアミノ酸配列。
配列番号１６：ｃｋｋａｐ−ＷＬ３のアミノ酸配列。
配列番号１７：ｃｋｋａｐ−ＷＬ４のアミノ酸配列。
配列番号１８：ｃｋｋａｐ−ＷＬ５のアミノ酸配列。
配列番号１９：ｃｋｋａｐ−ＷＬ６のアミノ酸配列。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]