特許 6463675 上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を予測する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6463675

(24)【登録日】2019年1月11日

(45)【発行日】2019年2月6日

(54)【発明の名称】上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を予測する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20190128BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20190128BHJP

   C07K 14/71 20060101ALI20190128BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190128BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190128BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20190128BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALI20190128BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 NZNA

   G01N33/574 A

   C07K14/71

   A61P43/00 111

   A61P35/00

   A61K45/00

   A61K31/5377

【請求項の数】9

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2015-522950(P2015-522950)

(86)(22)【出願日】2014年6月18日

(86)【国際出願番号】JP2014066100

(87)【国際公開番号】WO2014203918

(87)【国際公開日】20141224

【審査請求日】2017年5月26日

(31)【優先権主張番号】特願2013-128714(P2013-128714)

(32)【優先日】2013年6月19日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】599045903

【氏名又は名称】学校法人 久留米大学

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100062144

【弁理士】

【氏名又は名称】青山 葆

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】東 公一

(72)【発明者】

【氏名】星野 友昭

(72)【発明者】

【氏名】服部 聡

(72)【発明者】

【氏名】伊東 恭悟

(72)【発明者】

【氏名】笹田 哲朗

(72)【発明者】

【氏名】小松 誠和

(72)【発明者】

【氏名】松枝 智子

【審査官】 赤坂 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５３１５２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−３２２２１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０２８０４９３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 東 公一，非小細胞肺癌患者における抗上皮成長因子受容体(EGFR)由来ペプチド抗体の解析，科学研究費補助金研究成果報告書，２００９年，[ 検索日 2014.09.04] ， インターネット<URL http://kaken.nii.ac.jp/pdf/2009/seika/mext/37104/19790571seika.pdf>，ＵＲＬ，http://kaken.nii.ac.jp/pdf/2009/seika/mext/37104/19790571seika.pdf

【文献】 Kawahara A et al.，A diagnostic algorithm using EGFR mutation-specific antibodies for rapid response EGFR-TKI treatment in patients with non-small cell lung cancer，Lung Cancer，２０１２年１０月，78(1)，39-44

【文献】 MAEMONDO, M et al.，Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR，The NEW ENGLAND JOURNAL of MEDICINE，２０１０年 ６月２４日，362(25)，2380-2388

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を予測する方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）患者からＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療前に採取された血液試料における、配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の量を測定する工程；および
（２）測定した抗体量を基準値と比較する工程、
ここで、該抗体量が基準値より高い場合、該患者はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療効果が高いと予測される。

【請求項2】

ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬がゲフィチニブである、請求項１記載の方法。

【請求項3】

患者が非小細胞肺癌患者である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体が結合したビーズまたはプレートを用いて抗体の量を測定する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくは誘導体または前記ペプチド若しくは誘導体が結合したビーズを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を予測するための診断用組成物。

【請求項6】

配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくは誘導体、前記ペプチド若しくは誘導体が結合したビーズ、または前記ペプチド若しくは誘導体が結合したプレートを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を予測するためのキット。

【請求項7】

上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害薬を含む癌治療用組成物であって、請求項１〜４のいずれかに記載の方法によりＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療効果が高いと予測された患者に投与される、組成物。

【請求項8】

ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬がゲフィチニブである、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

患者が非小細胞肺癌患者である、請求項７または８に記載の成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を予測する方法、当該方法に用いられるペプチド、診断用組成物、およびキットに関する。

【背景技術】

【0002】

癌の発生および病態進展において、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）などのチロシンキナーゼの活性化が重要な役割を果たすことが判明し、それらを標的とする分子標的治療薬の研究、開発が進んでいる。特に、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）の登場により、切除不能で従来の化学療法に抵抗性の非小細胞肺癌患者の予後が飛躍的に改善している。しかしながら、その臨床効果は個体間で一定ではなく、最初から治療抵抗性を示す患者が少なからず存在する。

【0003】

非小細胞肺癌患者の国内での年間罹患者数は約９万人（悪性腫瘍の中で第３位）、年間死亡者数は約６万５千人（悪性腫瘍の中で第１位）であり、進行期の非小細胞肺癌患者の約４０％はＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療の対象となるＥＧＦＲ突然変異を有している。現在、ＥＧＦＲ−ＴＫＩであるゲフィチニブの治療効果を予測するためのバイオマーカーとしては、主として、ＥＧＦＲ遺伝子変異の解析が一般的に実施されている（非特許文献１，２、参照により本願明細書の一部となす）。こうした遺伝子変異の解析は、癌患者より採取した組織または細胞診検体を用いて通常行われるが、進行癌患者においては検体が少量しか採取できず、解析が困難な状況もある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Mitsudomi T, et al. Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer harbouring mutations of the epidermal growth factor receptor (WJTOG3405): an open label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 2010;11:121-8.

【非特許文献2】Maemondo M, et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 2010;362:2380-8.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を予測する方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、ゲフィチニブ治療前の非小細胞肺癌患者４２人の血漿を用いて、ＥＧＦＲのアミノ酸配列に由来する２０ｍｅｒからなる６０種類のペプチドに対する抗体（ＩｇＧ）価を測定した。測定した抗体価とゲフィチニブ治療後の患者予後との相関を調べたところ、３種類のペプチド（ＥＧＦＲ４１−６０，ＥＧＦＲ６１−８０，ＥＧＦＲ４８１−５００）が無増悪生存率（ＰＦＳ）と有意に相関した。さらに、３種類のペプチド（ＥＧＦＲ４１−６０，ＥＧＦＲ４８１−５００，ＥＧＦＲ８８１−９００）が全生存率（ＯＳ）と有意に相関した。多変量解析において、これらの抗体価は、他の臨床病理学的因子（年齢、喫煙歴、ＥＧＦＲ遺伝子変異）に関わらず独立した予後規定因子であることが判明した。以上の結果から、本発明を完成した。

【0007】

本発明は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を予測する方法であって、以下の工程：
（１）患者からＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療前に採取された血液試料における、配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の量を測定する工程；および
（２）測定した抗体量を基準値と比較する工程、
ここで、該抗体量が基準値より高い場合、該患者はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療効果が高いと予測される、
を含む方法を提供する。

【0008】

別の態様において、本発明は、配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその誘導体を提供する。

【0009】

別の態様において、本発明は、配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体が結合したビーズまたはプレートを提供する。

【0010】

別の態様において、本発明は、配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、または前記ペプチド若しくは誘導体が結合したビーズを含む、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を予測するための診断用組成物を提供する。

【0011】

別の態様において、本発明は、配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、または前記ペプチド若しくは誘導体が結合したビーズ若しくはプレートを含む、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を予測するためのキットを提供する。

【発明の効果】

【0012】

本発明は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を期待できる患者の選別を可能とし、当該治療薬の奏効率の向上や、不必要な治療による重篤な副作用の防止に寄与する。本発明は、従来の遺伝子変異解析と併用することにより、治療効果予測の精度をさらに高めることができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、ゲフィチニブ治療の開始後におけるＰＦＳおよびＯＳについてのカプラン−マイヤー解析を示す。

【図2】図２は、ＥＧＦＲタンパク質のアミノ酸配列を示す。波線は、ＥＧＦＲ突然変異と相関するペプチドであるｅｇｆｒ＿４８１＿５００、ｅｇｆｒ＿７２１＿７４０、ｅｇｆｒ＿７４１＿７６０、ｅｇｆｒ＿８４１＿８６０、およびｅｇｆｒ＿１００１＿１０２０を表す。囲み線は、生存（ＰＦＳあるいはＯＳ）と相関するペプチドであるｅｇｆｒ＿４１＿６０、ｅｇｆｒ＿６１＿８０、ｅｇｆｒ＿４８１＿５００、ｅｇｆｒ＿８８１＿９００を表す。

【図3】図３は、選択したペプチドに対する抗体価の高値群および低値群における、ＰＦＳおよびＯＳについてのカプラン−マイヤープロットを示す。抗体価の高値群および低値群は、中央値により定義した。

【図4】図４は、ペプチドに対する抗体量と臨床病理学的特徴（実線）または臨床病理学的特徴のみ（破線）を用いた、ＰＦＳおよびＯＳについてのＲＯＣ曲線を示す。ＡおよびＢのペプチド：ＥＧＦＲ４８１−５００、ＥＧＦＲ４１−６０、およびＥＧＦＲ６１−８０；ＣおよびＤのペプチド：ＥＧＦＲ４８１−５００およびＥＧＦＲ４１−６０。

【図5】図５は、ＰＦＳ（Ａ）およびＯＳ（Ｂ）についてのラッソペナルティーを伴うコックス回帰のソリューションパスを示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本明細書において、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）由来ペプチドとは、ＥＧＦＲのアミノ酸配列（配列番号１）の一部からなるペプチドを意味する。本明細書中、「ＥＧＦＲｘ−ｙ」または「ｅｇｆｒ＿ｘ＿ｙ」とは、配列番号１のアミノ酸位置ｘからｙまでのアミノ酸配列からなるペプチドを意味する。例えば、「ＥＧＦＲ４１−６０」または「ｅｇｆｒ＿４１＿６０」とは、配列番号１の４１番目から６０番目のアミノ酸配列からなるペプチドを意味する。本発明の方法は、ＥＧＦＲ４１−６０（LGTFEDHFLSLQRMFNNCEV：配列番号２）ＥＧＦＲ６１−８０（VLGNLEITYVQRNYDLSFLK：配列番号３）、ＥＧＦＲ４８１−５００（FGTSGQKTKIISNRGENSCK：配列番号４）、およびＥＧＦＲ８８１−９００（MALESILHRIYTHQSDVWSY：配列番号５）から選択されるＥＧＦＲ由来ペプチド（すなわち、配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド）に対する抗体の量を測定することを含む。本発明の方法では、２種類以上のペプチドに対する抗体の量を測定してもよい。ある態様において、本発明の方法は、ＥＧＦＲ４１−６０（配列番号２）、ＥＧＦＲ６１−８０（配列番号３）、およびＥＧＦＲ４８１−５００（配列番号４）から選択されるＥＧＦＲ由来ペプチドに対する抗体の量を測定することを含む。別の態様において、本発明の方法は、ＥＧＦＲ４１−６０（配列番号２）、ＥＧＦＲ４８１−５００（配列番号４）、およびＥＧＦＲ８８１−９００（配列番号５）から選択されるＥＧＦＲ由来ペプチド、好ましくはＥＧＦＲ４１−６０（配列番号２）およびＥＧＦＲ４８１−５００（配列番号４）から選択されるＥＧＦＲ由来ペプチドに対する抗体の量を測定することを含む。

【0015】

ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬（以下、ＥＧＦＲ−ＴＫＩとも称する）には、ゲフィチニブおよびエルロチニブが含まれる。好ましくは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬はゲフィチニブである。

【0016】

本発明の方法における患者には、非小細胞肺癌、脳神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、膵臓癌などＥＧＦＲ−ＴＫＩにより治療効果の期待できる癌種の患者が含まれる。好ましくは、患者は、非小細胞肺癌患者である。

【0017】

患者の血液試料は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療を受ける患者から、当該治療前に採取される。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療を受ける患者には、当該治療を受ける予定の患者および当該治療が選択肢として考えられる患者が含まれる。血液試料には、全血、血清および血漿が含まれる。好ましくは、血液試料は血清または血漿であり、より好ましくは血漿である。血液試料は、患者からの採取後、測定まで凍結保存してもよく、必要に応じて試薬等により処理してもよい。血液試料は、当業界にて知られる常套的方法によって調製することができる。

【0018】

抗体量は、当業界に知られるいずれの方法により測定してもよい。測定方法としては、ＥＬＩＳＡ法(Pedersen MK, et al., J Immunol Methods. 2006 Apr 20;311(1-2):198-206. Epub 2006 Mar 6.)、ＲＩＡ法(Maruta T, et al., Immunol Invest. 2006;35(2):137-48.)、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムによる方法（Komatsu N, et al., Scand J Clin Lab Invest 64, 535-546, 2004）が挙げられる。測定する抗ペプチド抗体は、特に限定されないが、通常ＩｇＧである。

【0019】

Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムによる方法は、微量（数マイクロリットル）の血液試料により高感度でハイスループットな解析が可能であるため、本発明に好適である。簡単に説明すると、ＥＧＦＲ由来ペプチドが結合したビーズに対して結合する、患者の血液試料中の抗体を蛍光等によって測定する。例えば、患者より採取した血液試料を必要に応じて希釈し、ＥＧＦＲ由来ペプチドが結合したビーズと共にインキュベートして、血液試料中の抗ペプチド抗体をビーズ上のＥＧＦＲ由来ペプチドに結合させる。次いで、このビーズをビオチン化抗ヒトＩｇＧと共にインキュベートして、ビーズに結合した抗ペプチド抗体に当該抗ヒトＩｇＧを結合させる。さらに、ビーズをストレプトアビジン−ＰＥとインキュベートして、ビーズに結合したＰＥの蛍光強度を測定することにより、抗ペプチド抗体の量を測定することができる。蛍光強度は、マルチプレックスビーズ懸濁アレイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システム）により測定することができる。

【0020】

抗体量の測定には、配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド、またはその誘導体を用いることができる。本明細書において、ペプチドの誘導体とは、１または数個、好ましくは１または２個のアミノ酸残基の欠失、置換、または付加によりそのアミノ酸配列が改変されているが、血液試料中に存在する抗ペプチド抗体に対する反応性を維持するペプチドを意味する。ペプチドおよびその誘導体は、抗体による認識を損なわない範囲で、そのアミノ基やカルボキシル基が修飾されていてもよい。

【0021】

配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその誘導体は、ビーズまたはプレートに結合していてもよい。ペプチドおよび誘導体は、直接ビーズまたはプレートに結合していても、リンカーなどを介して間接的に結合していてもよい。ビーズとしては、例えばポリスチレンビーズおよび磁気ビーズが挙げられる。ビーズの大きさは、特に限定はされないが、例えば、直径が５〜７μｍである。ビーズは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムに使用可能なＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズであってもよい。プレートとしては、ポリスチレン製のプレートが例示される。ウェルの数は、例えば６、２４、９６、および３８４であり、好ましくは９６である。プレートは、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法に慣用されるプレートであってよい。ペプチドまたは誘導体のビーズまたはプレートへの結合は、当業者が適宜実施できる。１つのビーズまたはプレートの１つのウェルに結合しているペプチドまたは誘導体は、１種類であっても、複数種類であってもよい。

【0022】

測定した抗体量は、基準値と比較される。基準値は、例えば、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療開始後一定期間内に疾患の進行した患者群および／または進行しなかった患者群の当該治療前の抗体量に基づき予め決定した値である。あるいは、基準値は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療開始前の患者群における抗体量の中央値であってもよい。

【0023】

本発明において、測定した抗体量が基準値より高い場合、当該患者はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療効果が高いと予測される。また、抗体量が多ければ多いほど、治療効果がより高いと予測することができる。本明細書において、「ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療効果が高い」とは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療により、当該治療を行わなかった場合と比較して、全生存期間または無増悪生存期間が延長されることを意味する。

【0024】

ある態様において、本発明の方法は、ＥＧＦＲ４１−６０（配列番号２）、ＥＧＦＲ６１−８０（配列番号３）、およびＥＧＦＲ４８１−５００（配列番号４）から選択されるＥＧＦＲ由来ペプチドに対する抗体の量を測定することを含み、測定した抗体量が基準値より高い場合、当該患者は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療により、当該治療を行わなかった場合と比較して、無増悪生存期間が延長されると予測される。

【0025】

別の態様において、本発明の方法は、ＥＧＦＲ４１−６０（配列番号２）、ＥＧＦＲ４８１−５００（配列番号４）、およびＥＧＦＲ８８１−９００（配列番号５）から選択されるＥＧＦＲ由来ペプチド、好ましくはＥＧＦＲ４１−６０（配列番号２）およびＥＧＦＲ４８１−５００（配列番号４）から選択されるＥＧＦＲ由来ペプチドに対する抗体の量を測定することを含み、測定した抗体量が基準値より高い場合、当該患者は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療により、当該治療を行わなかった場合と比較して、全生存期間が延長されると予測される。

【0026】

本発明の診断用組成物は、配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体または前記ペプチド若しくは誘導体が結合したビーズを含む。本発明の診断用組成物は、本明細書に記載の、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を予測する方法に従って使用される。本発明の診断用組成物はさらに、適当な担体および緩衝剤、等張化剤などの添加剤を含んでいてもよく、凍結乾燥状態で提供され用時調製されるものであってもよい。本発明の診断用組成物は、本発明の方法に沿った使用説明書ともに提供されてもよい。

【0027】

本発明のキットは、配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、または前記ペプチド若しくは誘導体が結合したビーズ若しくはプレートを含む。本発明のキットは、本明細書に記載の、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を予測する方法に従って使用される。キットは、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、またはＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムによる方法を実施するためのキットである。キットはさらに、ブロッキング液、洗浄液、希釈液、検出用抗体、対照試料、プレート、および本発明の方法に沿った使用説明書などを含んでも良い。

【0028】

本発明に用いられるペプチドおよび誘導体は、抗体による認識を損なわない範囲で、そのアミノ基やカルボキシル基が修飾されていてもよい。本発明に用いるペプチドおよびその誘導体は、通常のペプチド合成方法により製造することができる（Peptide Synthesis, Interscience, New York，1966； The Proteins, Vol2, Academic Press Inc.,New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株）、1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）、1985；医薬品の開発続 第十四巻・ペプチド合成、広川書店、1991）。

【0029】

別の態様において、本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を予測するためのデータを収集する方法であって、以下の工程：
（１）患者からＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療前に採取された血液試料における、配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の量を測定する工程；および
（２）測定した抗体量を基準値と比較する工程、
ここで、該抗体量が基準値より高い場合、該患者はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療効果が高いと予測される、
を含む方法を提供する。

【0030】

別の態様において、本発明は、癌を治療する方法であって、以下の工程：
（１）患者からＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬による治療前に採取された血液試料における、配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の量を測定する工程；
（２）測定した抗体量を基準値と比較する工程；および
（３）該抗体量が基準値より高かった患者をＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬により治療する工程、
を含む方法を提供する。

【0031】

別の態様において、本発明は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を予測するための診断用組成物の製造のための、配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体または前記ペプチド若しくは誘導体が結合したビーズの使用を提供する。

【0032】

別の態様において、本発明は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬の治療効果を予測するためのキットの製造のための、配列番号２〜５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、または前記ペプチド若しくは誘導体が結合したビーズ若しくはプレートの使用を提供する。

【0033】

以下、実施例により本発明をさらに説明するが、如何なる意味においても本発明は以下の実施例により限定されない。

【実施例】

【0034】

１．材料および方法
（１）患者、治療、および試料の回収
本研究では、ゲフィチニブによる治療を受けた４２例の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者を、２００６年１月〜２００８年１２月、単一の施設（日本、久留米市、久留米大学附属病院）においてスクリーニングした。年齢、性別、組織像、喫煙の状態、全身状態（ＰＳ）、病期、および治療法を含めた患者の臨床病理学的特徴の詳細は、臨床経過について知らされていない独立の審査者によるカルテ審査から得た（表１）。進行したＮＳＣＬＣのため、いずれの患者も、毎日１回、経口によりゲフィチニブ（２５０ｍｇ）を投与された。記録した患者の特徴には、性別、年齢、Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）による全身状態（ＰＳ）、腫瘍組織像、喫煙歴、先行の化学療法、およびＥＧＦＲ突然変異の種類が含まれた。腫瘍縮小効果（ｔｕｍｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）を介して調べ、ＲＥＣＩＳＴ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）に従い評価した。縮小効果は、最初の記録から少なくとも４週間（完全奏功または部分奏功の場合）または６週間（疾患安定の場合）後に確認した。ＰＦＳ（無増悪生存期間）は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療の開始日から疾患進行日または最終診療日までを計算した。本研究はまた、ヘルシンキ宣言の条項も遵守する。本研究は、久留米大学の治験審査委員会による承認を受けた。

【0035】

血清または血漿は、ゲフィチニブ治療を受けたＮＳＣＬＣ患者から、ゲフィチニブ治療前に回収した。説明同意文書は、全ての対象から得た。血清または血漿を得たら、使用まで−８０度で凍結した。

【0036】

（２）ＥＧＦＲ突然変異解析
ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異は、エクソン１９（Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ）および２１（Ｌ８５８Ｒ）において、既報のとおりペプチド核酸−ロックト核酸（ＰＮＡ−ＬＮＡ）ＰＣＲクランプ（２２）により調べた。略述すると、ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてパラフィン包埋した組織から精製した。使用したＰＣＲプライマーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．に委託して合成させた。ＰＮＡクランプのプライマーおよびＬＮＡの突然変異体プローブは、それぞれ、ＦＡＳＭＥＣ（日本、神奈川県）およびＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入した。ＰＮＡ−ＬＮＡ ＰＣＲクランプは、ＳＤＳ−７５００ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。

【0037】

（３）ＥＧＦＲ由来ペプチドおよびＥＧＦＲ由来ペプチドに対して反応性のある抗体量の測定
図２に示すように、ＥＧＦＲタンパク質の配列から設計した６０種類の異なる２０ｍｅｒのペプチドを合成し、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ペプチドは、既報のとおり（２３）、ＤＭＳＯにより溶解した。ＥＧＦＲ由来ペプチドに特異的な抗体量は、既報のとおり（２４）、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムを用いるマルチプレックスビーズ懸濁アレイを介して測定した。略述すると、１００μｌの希釈した血漿を、ＥＧＦＲ由来ペプチドが結合したｘＭＡＰビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）と共に、プレートシェーカー上の９６ウェルフィルタープレート（ＭＡＢＶＮ１２５０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）内で、室温で２時間インキュベートした。２時間後、プレートをＴ−ＰＢＳにより洗浄し、１００μｌのビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＢＡ−３０８０；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と共に、プレートシェーカー上で、室温において１時間インキュベートした。洗浄の後、１００μｌのストレプトアビジン−ＰＥをウェルへと添加し、プレートを、プレートシェーカー上で、室温で３０分間インキュベートした。結合したビーズを３回洗浄した後、１００μｌのＰＢＳを各ウェルに添加した。各試料５０μｌずつを用いて、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムでビーズ上の蛍光を検出した。抗体量は、蛍光強度により表し、値は、既報のとおり（２４）、蛍光強度単位（ＦＩＵ）により示した。試料希釈アッセイから得たＦＩＵの線形曲線が５〜１０，０００ＦＩＵであった（データ非提示）ため、カットオフレベルは１０ＦＩＵに設定した。６０種類の異なるペプチドの各々に対して反応性のある抗体の量を測定した。

【0038】

（４）統計学的解析
６０種類の異なるペプチドの各々に対して反応性のある抗体量が突然変異状態と相関するかについて調べた。この目的のため、ウィルコクソン順位和検定を用いて、６０種類のペプチドの各々に対して反応性のある抗体量の中央値を、ＥＧＦＲの突然変異体（ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０およびＬ８５８Ｒ）と野生型とで比較した。ＰＦＳ（無増悪生存期間）は、ゲフィチニブ治療の開始日から疾患進行日までの期間として定義した。ＯＳ（全生存期間）は、ゲフィチニブ治療の開始日から、死因に関わらず死亡日までの期間として定義した。ＰＦＳまたはＯＳを決定できなかった患者は、最終診療日を観察打ち切りとして取り扱った。次に、６０種類の異なるペプチドの各々に対して反応性のある抗体量がＰＦＳまたはＯＳと相関するかについて調べた。説明変数としての各ペプチドに対して反応性のある抗体量、突然変異状態、喫煙の状態、性別、および全身状態と共に、コックスの比例ハザードモデルを適用した。また、６０種類の異なるペプチドの各々に対して反応性のある抗体量が腫瘍縮小効果と関連するかどうかを、ロジスティック回帰を適用することにより調べ、ＣＲ（完全奏功）およびＰＲ（部分奏功）を奏功するとみなした。６０種類のペプチドを用いたため、困難な多重度の問題が生じた。本発明者らは、偽発見率（ＦＤＲ）を５％のレベルに制御する、ＰＦＳ（ＯＳまたは腫瘍縮小効果）と有意に相関するペプチドを同定した。

【0039】

解析結果の説明として、臨床病理学的特徴のみを用いるよりも正確な患者の予後予測に有用なペプチドの同定を試みた。患者数より多いペプチドを用いたため標準的な多変量コックス回帰（多重回帰）を適用することができなかったが、これは本研究における極めて困難な問題であった。影響が大きい観察を回避するため、本発明者らは、各ペプチドに対して反応性のある抗体量をｌｏｇ（ペプチドに対する抗体量＋１）により変換し、ゼロ平均および単位標準偏差へと標準化した。本発明者らは、ラッソ型のペナルティーによるコックス回帰（２５、２６）を適用した。ラッソ法は有用であり、高次元データを解析するのによく用いられるようになりつつある。ラッソ法の注目すべき特徴は、疎らさである。すなわち、ＰＦＳ（ＯＳ）と相関しないペプチドの回帰係数であれば、ゼロとして評価しうる。この特徴に基づき、本発明者らは、患者の予後予測に有用であると期待されるいくつかのペプチドを同定した。選択されたペプチドに対して反応性のある抗体量が患者の予後予測に実際に有用であるかを調べるために、コックス回帰解析および時間依存的ＲＯＣ解析（２７）を適用した。臨床病理学的特徴のみによるコックス回帰ならびに各ペプチドに対して反応性のある抗体量と臨床病理学的特徴の両方によるコックス回帰を介して、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を危険性スコアについて評価した。ブートストラップ法による１０００回の反復についてのＰ値を計算してＡＵＣの同等性を検定することにより、ＡＵＣを比較した。統計学的解析は、Ｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１３ソフトウェアおよびＳＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ ９．３ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）により実施した。

【0040】

２．結果
（１）患者の特徴および生存解析
４２例の患者の臨床学的特徴を、表１に示す。２５例（５９％）の患者が女性であり、２４例（５７％）が非喫煙者であり、全患者の年齢の中央値は６３．５歳（範囲：３８〜８２歳）であった。３８例（９０％）の患者が腺がんを有し、３４例（８０％）は全身状態良好であり（Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐによる評定尺度が０）、１５例の患者（３２％）には第一選択の化学療法としてＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療が施された。ＥＧＦＲ突然変異の種類について述べると、８例の患者がエクソン１９に欠失を有し、１３例の患者がエクソン２１にＬ８５８Ｒミスセンス突然変異を有し、２１例の患者が野生型を有していた。

【0041】

解析の時点において、追跡期間の中央値は、４１８日間（範囲：１６〜１５３２日間）であった。ＰＦＳの中央値は、２０１日間（範囲：１１〜１３７９日間）であり、ＯＳの中央値は、４１８日間（範囲：１６〜１５３２日間）であった。ゲフィチニブ治療の開始後におけるＰＦＳおよびＯＳについてのカプラン−マイヤー解析を、図１に示す。ログランク検定により、ゲフィチニブ治療の結果として、ＥＧＦＲ突然変異を有する患者におけるＰＦＳは、突然変異を有さない患者におけるＰＦＳより有意に延長された（中央値３４７日に対して５４日、Ｐ＝０．００２９）（図１Ａ）が、これら２つの患者群のＯＳの間には有意差が認められない（それぞれ、中央値３１４日に対して１２８日、Ｐ＝０．１０９５）（図１Ｂ）ことが明らかとなった。突然変異を有する患者と野生型の患者との間におけるこのＰＦＳの相違は、いずれの種類のＥＧＦＲ突然変異についても明らかであった（図１Ｃ、Ｄ）。

【0042】

（２）ＥＧＦＲ由来ペプチドに対する抗体量とゲフィチニブによる治療を受けたＮＳＣＬＣ患者におけるＥＧＦＲ突然変異との間の相関
本発明者らはまず、６０種類の異なるペプチドの各々に対して反応性のある抗体が、ＮＳＣＬＣ患者に由来する血漿または血清において、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムによって定量可能であるかを調べた（表３、図３Ａおよび３Ｂ）。各ペプチドに対して反応性のある抗体量がＥＧＦＲ突然変異と相関するかについて解析し、エクソン２１の突然変異を有する患者では、ペプチドｅｇｆｒ＿４８１＿５００、ｅｇｆｒ＿７２１＿７４０、ｅｇｆｒ＿７４１＿７６０に対する抗体量が、エクソン２１の突然変異を有さない患者におけるより有意に高いことを見出した（ｅｇｆｒ＿４８１＿５００についてＰ＝０．０１７；ｅｇｆｒ＿７２１＿７４０についてＰ＝０．０３６；ｅｇｆｒ＿７４１＿７６０についてＰ＝０．００７）。これらの３つのペプチドにおいて、エクソン２１の突然変異を有する患者における抗ペプチド抗体量の中央値は、エクソン２１の突然変異を有さない患者における抗ペプチド抗体量の中央値の約２倍であった（表３）。一方、ｅｇｆｒ＿８４１＿８６０に対する抗体量は、エクソン１９に欠失を有する患者では、欠失を有さない患者より有意に低かった（Ｐ＝０．０４７）。ｅｇｆｒ＿１００１＿１０２０に対する抗体量は、エクソン１９に欠失を有する患者において有意に高かった。その他のペプチドに対して反応性のある抗体量は、ＥＧＦＲ突然変異との相関を有さなかった。

【0043】

（３）ＥＧＦＲ由来ペプチドに対する抗体量とゲフィチニブにより治療したＮＳＣＬＣ患者における生存との間の関係
さらに、抗ペプチド抗体量が、ゲフィチニブによる治療後のＮＳＣＬＣ患者のＰＦＳおよびＯＳと十分に相関するかどうかを調べた。本発明者らは、全ペプチドのうちの多くのｐ値が５％未満であり、コックス回帰において３８種類および３２種類のペプチドのｐ値が５％未満であり、さらにＦＤＲを５％のレベルに制御しても、ＰＦＳについて有意な３５種類のペプチドおよびＯＳについて有意な２０のペプチドが同定されることを見出した（表４）。本発明者らはまた、各ペプチドに対する抗体量が腫瘍縮小効果（ＣＲまたはＰＲ）と相関するかについても調べた。ロジスティック回帰解析により、いずれのペプチドに対する抗体量も腫瘍縮小効果とは相関しないことが示された（データ非提示）。

【0044】

（４）患者の予後予測に有用なペプチドの同定
前述のとおり、多くのペプチドに対する抗体量がＰＦＳおよび／またはＯＳと有意に相関した。多くのペプチドに対する抗体量が、中程度または高度に相関していた（データ非提示）。これにより、比較的少数のペプチドに対する抗体量であっても、患者の予後予測に有用な規則の構築に十分でありうることが示唆された。ラッソペナルティーを伴うコックス回帰から、本発明者らは、ｅｇｆｒ＿４１＿６０、ｅｇｆｒ＿６１＿８０、およびｅｇｆｒ＿４８１＿５００に対する抗体量がＰＦＳに対して比較的大きな効果を及ぼし、ｅｇｆｒ＿４１＿６０、ｅｇｆｒ＿４８１＿５００、およびｅｇｆｒ＿８８１＿９００に対する抗体量がＯＳに対して比較的大きな効果を及ぼすことを見出した（ＰＦＳおよびＯＳについてのソリューションパス（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐａｔｈ）を、それぞれ図５Ａおよび５Ｂに示す）。ＰＦＳについての予測規則を構築するため、ｅｇｆｒ＿４１＿６０、ｅｇｆｒ＿６１＿８０、およびｅｇｆｒ＿４８１＿５００に対する抗体量を用いた。また、ｅｇｆｒ＿４１＿６０に対する抗体量およびｅｇｆｒ＿８８１＿９００に対する抗体量は強く相関していた（スピアマンの順位相関係数は、０．７１であり、Ｐ＜０．００１あった）ため、本発明者らは、ＯＳについてはｅｇｆｒ＿４１＿６０およびｅｇｆｒ＿４８１＿５００に対する抗体量を用いた。表２Ａには、交絡因子となる可能性があるＰＳ、年齢、性別、および喫煙の状態について調整した、ｅｇｆｒ＿４１＿６０、ｅｇｆｒ＿６１＿８０、およびｅｇｆｒ＿４８１＿５００に対する抗体量を用いたＰＦＳについてのコックス回帰の結果を示した。３つのペプチド全てが、臨床病理学的特徴とは独立した有意な予後規定因子であることが見出された（ｅｇｆｒ＿４１＿６０についてはＰ＝０．００１であり、ｅｇｆｒ＿６１＿８０についてはＰ＝０．０２０であり、ｅｇｆｒ＿４８１＿５００についてはＰ＝０．０２８であった）。表２Ｂには、ｅｇｆｒ＿４１＿６０およびｅｇｆｒ＿４８１＿５００に対する抗体量を用いたＯＳについてのコックス回帰の結果を示した。いずれのペプチドに対する抗体量も、臨床病理学的特徴とは独立した有意な予後規定因子であることが見出された（ｅｇｆｒ＿４１＿６０についてはＰ＝０．０１８であり、ｅｇｆｒ＿４８１＿５００についてはＰ＝０．０２７であった）。選択したペプチドに対する抗体量の限界効果を把握するため、図３Ａおよび図３Ｂのそれぞれに、選択したペプチドに対する抗体量の高値群および低値群における、ＰＦＳおよびＯＳについてのカプラン−マイヤープロットを示す（臨床病理学的特徴による影響については調整していない）。また、時間依存的ＲＯＣ解析を用いて、臨床病理学的特徴にペプチドに対する抗体量を追加することにより、患者の予後予測が改善されるかを調べた。図４Ａおよび４Ｂは、ペプチドに対する抗体量と臨床病理学的特徴、および臨床病理学的特徴のみを用いて、表２Ａ（ＰＦＳに関する）および表２Ｂ（ＯＳに関する）に示すコックス回帰により評価した、１年間および２年間の危険性スコアのＲＯＣ曲線を示す。ＲＯＣ曲線は、１年間および２年間のＰＦＳについての診断が実質的に改善されることを示す（ＡＵＣの比較についてＰ＜０．００１）。ＯＳについても、１年間および２年間の時間依存的ＲＯＣ曲線のＡＵＣが、ペプチドに対する抗体量を追加することにより、臨床病理学的特徴のみの場合より有意に大きくなった（Ｐ＜０．００１）（図４Ｃおよび４Ｄ）。したがって、時間依存的ＲＯＣ解析は、臨床病理学的特徴にペプチドに対する抗体量を追加することにより、ＰＦＳとＯＳのいずれについても、より正確な患者の予後予測が可能となることを示した。

【0045】

【表1】

【0046】

【表2A】

【0047】

【表2B】

【0048】

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【表3-6】

【表3-7】

【表3-8】

【表3-9】

【表3-10】

【表3-11】

【表3-12】

【0049】

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【0050】

参考文献
References
1. Parkin DM, Bray FI, Devasa SS. Cancer burden in the year 2000: the global picture. Eur J Cancer 2001;37:4-66.
2. Yarden Y, and Sliwkowski MX. Untagling the ErbB signaling network. Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2: 127-137.
3. Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl Med 2004;350:2129-39.
4. Paez JG, Janne PA, Lee JC, et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science 2004;304:1497-500.
5. Ono M, Kuwano M. Molecular mechanisms of epidermal growth factor receptor activation and response to gefitinib and other EGFR-targeting drugs. Clin Cancer Res 2006;12:7242-51.
6. Maemondo M, Inoue A, Kobayashi K, et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med 2010;362:2380-8.
7. Mitsudomi T, Morita S, Yatabe Y, et al. Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer harbouring mutations of the epidermal growth factor receptor (WJTOG3405): an open label, randomized phase 3 trial. Lancet Oncol 2010;11:121-8.
8. Mok TS, Wu YL, Thongprasert S, et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med 2009;361:947-57.
9. Sasada T, Komatsu N, Suekane S, Yamada A, Noguchi M, Itoh K. Overcoming the hurdles of randomised clinical trials of therapeutic cancer vaccines. Eur J Cancer 2010;46(9): 1514-9.
10. van de Vijver MJ, He YD, van't Veer LJ, et al. A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 2002;347(25): 1999-2009.
11. Bedognetti D, Wang E, Sertoli MR, Marincola FM. Gene-expression profiling in vaccine therapy and immunotherapy for cancer. Expert Rev Vaccines 2010;9(6): 555-65.
12. Bogunovic D, O'Neill DW, Belitskaya-Levy I, et al. Immune profile and mitotic index of metastatic melanoma lesions enhance clinical staging in predicting patient survival. Proc Natl Acad Sci U S A 2009;106(48): 20429-34.
13. Pham MX, Teuteberg JJ, Kfoury AG, et al. Gene-expression profiling for rejection surveillance after cardiac transplantation. N Engl J Med 2010;362(20): 1890-900.
14. Noguchi M, Kakuma T, Uemura H, et al. A randomized phase II trial of personalized peptide vaccine plus low dose estramustine phosphate (EMP) versus standard dose EMP in patients with castration resistant prostate cancer. Cancer Immunol Immunother 2010;59(7): 1001-9.
15. Mine T, Sato Y, Noguchi M, et al. Humoral responses to peptides correlate with overall survival in advanced cancer patients vaccine with peptides based on pre-existing, peptide-specific cellular responses. Clin Cancer Res 2004;10:929-37.
16. Ugurel S, Schrama D, Keller G, et al. Impact of the CCR5 gene polymorphism on the survival of metastatic melanoma patients receiving immunotherapy. Cancer Immunol Immunother 2008;57(5): 685-91.
17. Liu D, O'Day SJ, Yang D, et al. Impact of gene polymorphisms on clinical outcome for stage IV melanoma patients treated with biochemotherapy: an exploratory study. Clin Cancer Res 2005;11(3): 1237-46.
18. Leibovici D, Grossman HB, Dinney CP, et al. Polymorphisms in inflammation genes and bladder cancer: from initiation to recurrence, progression, and survival. J Clin Oncol 2005;23(24): 5746-56.
19. Breunis WB, Tarazona-Santos E, Chen R, Kiley M, Rosenberg SA, Chanock SJ. Influence of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA4) common polymorphisms on outcome in treatment of melanoma patients with CTLA-4 blockade. J Immunother 2008;31(6): 586-90.
20. Yurkovetsky ZR, Kirkwood JM, Edington HD, et al. Multiplex analysis of serum cytokines in melanoma patients treated with interferon-alpha2b. Clin Cancer Res 2007;13(8): 2422-8.
21. Sabatino M, Kim-Schulze S, Panelli MC, et al. Serum vascular endothelial growth factor and fibronectin predict clinical response to high-dose interleukin-2 therapy. J Clin Oncol 2009;27(16): 2645-52.
22. Nagai Y, Miyazawa H, Huqun, et al. Genetic heterogeneity of the epidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer cell lines revealed by a rapid and sensitive detection system, the peptide nucleic acid-locked nucleic acid PCR clamp. Cancer Res 2005;65:7276-82.
23. Harada M, Kobayashi K, Matsueda S, Nakagawa M, Noguchi M,Itho K. Prostate-specific antigen-derived epitopes capable of inducing cellular and humoral responses in HLA-24+ prostate cancer patients. Prostate 2003; 57(2): 152-9.
24. Komatsu N, Shichijo S, Nakagawa M, Itoh K. New multiplexed flow cytometric assay to measure anti-peptide antibody: a novel tool for monitoring immune responses to peptides used for immunization. Scand J Clin Lab Invest 2004; 64: 535-45.
25. Goeman JJ. L1 penalized estimation in the Cox proportional hazards model. Biometrical J 2010; 52: 1 70-84.
26. Everitt BS. An R and S-PLUS Companion to Multivariate Analysis. 2005. Springer-Verlag London Limited.
27. Heagerty PJ, Lumley T, Pepe MS. Time-dependent ROC curves for censored survival data and a diagnostic marker. 2000; 56: 2 337-344.
28. Ogiso H, Ishitani R, Nureki O, et al. Crystal structure of complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains. Cell 2002; 110: 775-787.
29. Garrett PJ, Mckern NM, Lou M, et al. Crystal structure of truncated epidermal growth factor extracellular domain bound to transforming growth factor alpha. Cell 2002; 110: 763-773.
30. Leahy DJ, and Cho HS. Structure of extracellular region of HER3 reveals an interdomain tether. Science 2002; 297: 1330-1333.
31. Lemmon MA. Ligand-induced ErbB receptor dimerization. Exp Cell Res. 2009; 315:638-648.
32. Bose R, Zhang X. The ErbB kinase domain: structural perspectives into kinase activation and inhibition. Exp Cell Res 2009; 315: 649-658.
33. Zhang X, Dureasko J, Shen K, et al. An allosteric mechanism for activation of the kinase domain of epidermal growth factor receptor. Cell 2006; 125: 1137-1149.
34. Talavera A, Friemann R, Gomez-Puerta S, et al. Nimotuzumab, an antitumor antibody that targets the epidermal growth factor receptor, blocks ligand binding while permitting the active receptor conformation. Cancer Res 2009; 69: 5851-9.
35. Li S, Schmitz KR, Jeffrey PD, et al. Structural basis for inhibition of epidermal growth factor receptor by cetuximab. Cancer Cel 2005; 7:301-311.
36. Schmiedel J, Blaukat A, Li S, et al. Matuzumab binding to EGFR prevents the conformational rearrangement required for dimerization. Cancer Cell 2008; 13:365-373.
37. Kimura H, Kasahara K, Kawanishi M, et al.Detection of epidermal growth factor receptor mutations in serum as a predictor of the response to gefitinib in patients with non-small-cell lung cancer. Clin Cancer Res 2006; 12: 3915-21.

【配列表フリーテキスト】

【0051】

配列番号１：ヒトＥＧＦＲ
配列番号２：ＥＧＦＲ由来ペプチド（ＥＧＦＲ４１−６０）
配列番号３：ＥＧＦＲ由来ペプチド（ＥＧＦＲ６１−８０）
配列番号４：ＥＧＦＲ由来ペプチド（ＥＧＦＲ４８１−５００）
配列番号５：ＥＧＦＲ由来ペプチド（ＥＧＦＲ８８１−９００）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]