特許 6464081 フローサイトメトリーを用いたＲＮＡ測定によるＴ細胞活性化のための迅速アッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6464081

(24)【登録日】2019年1月11日

(45)【発行日】2019年2月6日

(54)【発明の名称】フローサイトメトリーを用いたＲＮＡ測定によるＴ細胞活性化のための迅速アッセイ

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6813 20180101AFI20190128BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20190128BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20190128BHJP

   G01N 33/58 20060101ALI20190128BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6813 ZZNA

   G01N33/483 C

   G01N33/53 M

   G01N33/58 A

【請求項の数】26

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2015-520420(P2015-520420)

(86)(22)【出願日】2013年6月26日

(65)【公表番号】特表2015-522284(P2015-522284A)

(43)【公表日】2015年8月6日

(86)【国際出願番号】US2013047774

(87)【国際公開番号】WO2014004609

(87)【国際公開日】20140103

【審査請求日】2016年6月20日

(31)【優先権主張番号】61/665,231

(32)【優先日】2012年6月27日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/784,802

(32)【優先日】2013年3月14日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510144959

【氏名又は名称】ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー

(74)【代理人】

【識別番号】110000671

【氏名又は名称】八田国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ブッシュキン，ユーリ

(72)【発明者】

【氏名】ジェナーロ，マリア ローラ

(72)【発明者】

【氏名】ティアギ，サンジャイ

(72)【発明者】

【氏名】パイン，リチャード

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００９／００８１６８８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１０−００４７５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５３９７０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５３５３２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５２４３９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０３７９３７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／００６８８１４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開平１０−２３４３８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５０００５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 欧州特許出願公開第０２１８６８２７（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 Lymphokine and Cytokine Research，１９９２年，Vol.11, No.1，p.65-71

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）Ｔ細胞を含む細胞の集団を含むサンプルを提供し、
（ｂ）前記Ｔ細胞の特異的受容体に結合し、および遺伝子発現を開始する少なくとも１つの化合物を用いて前記細胞をインキュベートすることにより、直ちにまたは培養後に、ｅｘ ｖｉｖｏで前記Ｔ細胞内での遺伝子発現を誘導し、
（ｃ）前記細胞を固定および透過処理し、
（ｄ）蛍光標識したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブのセットを用いて前記Ｔ細胞によって発現された少なくとも１つのＲＮＡ分子のコピーを標識し（この際、前記プローブは前記ＲＮＡ分子と相補的な配列を有し）、および非結合プローブを洗い流し、
（ｅ）蛍光強度ゲーティングにより分類された１つ以上の蛍光測定値である発現現象を有する細胞をフローサイトメトリー（ＦＣ）により検出すること
を含む個々のＴ細胞内で発現した少なくとも１つのＲＮＡ分子のコピーを検出することにより、Ｔ細胞活性化を分析するための方法。

【請求項2】

誘導するステップが、前記細胞集団中に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）により、または人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）により、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達および下流の遺伝子発現を刺激することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＡＰＣまたはａＡＰＣ誘導による刺激が、３０分から７２時間の間の時間である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

誘導するステップが、少なくとも１つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて共刺激することを含む、請求項２または３に記載の方法。

【請求項5】

誘導するステップが、前記ａＡＰＣに結合された少なくとも１つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて共刺激することを含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記化合物が微生物由来である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記化合物がペプチドまたはペプチドの混合物を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子と結合するペプチドまたはペプチドの混合物が前記ＡＰＣまたはａＡＰＣに加えられる、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記ペプチドまたはペプチド混合物が１〜２０μｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記少なくとも１つのＲＮＡ分子がサイトカイン遺伝子によってコードされた、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記遺伝子がＩＬ−２、ＴＮＦα、またはＩＦＮγをコードする、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記少なくとも１つの化合物が結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の免疫原性ペプチドである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記プローブのセットが同じ蛍光部分でそれぞれ単独で標識された２０〜６０のプローブを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記細胞集団がヒトＰＢＭＣから得られたＴ細胞であり、前記少なくとも１つのＲＮＡ分子がサイトカイン遺伝子によってコードされ、前記細胞集団中の細胞がＴＣＲと相互作用する１つ以上のペプチド負荷ＭＨＣ分子を伴うａＡＰＣにより誘導され、および前記プローブのセットが同じ蛍光部分でそれぞれ単独で標識された２０〜６０のプローブを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

蛍光活性化細胞の分取により、発現現象を有する少なくとも１つの検出された細胞が発現現象を有しない細胞から分離される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

遺伝子発現が前記分離される細胞内で測定される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

遺伝子発現測定がＲＴ−ＰＣＲまたは前記細胞内のＲＮＡのトランスクリプトーム解析により実現される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記誘導するステップが微生物産物または合成化合物を用いてＴｏｌｌ様受容体シグナル伝達および下流の遺伝子発現を刺激するステップを含み、前記微生物産物が脂質、グリカン、糖脂質、硫脂質、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、または核酸である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

刺激が３０分から７２時間の間の時間である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記化合物がサイトカインである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記サイトカインがＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、およびＴＮＦαからなる群から選択されるものである、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

１つを超える化合物または刺激物が提供される、請求項１または１８に記載の方法。

【請求項23】

異なる刺激が異なる時間に提供される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

（ａ）Ｔ細胞を含む細胞の集団を含むサンプルを提供し、
（ｂ）前記細胞を固定および透過処理し、
（ｃ）同一の蛍光成分でそれぞれ単独に標識された２０〜６０の蛍光標識したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブのセットを用いて前記Ｔ細胞によって発現された少なくとも１つのＲＮＡ分子のコピーを標識し（この際、前記プローブは前記ＲＮＡ分子と相補的な配列を有し）、および非結合プローブを洗い流し、
（ｄ）蛍光強度ゲーティングにより分類された１つ以上の蛍光測定値である発現現象を有する細胞をフローサイトメトリーにより検出すること
を含む個々のＴ細胞内で発現した少なくとも１つのＲＮＡ分子のコピーを検出することにより、Ｔ細胞活性化を分析するための方法。

【請求項25】

前記受容体がＴｏｌｌ様受容体、ＮＯＤ受容体およびＮＯＤ様受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、ポリペプチドホルモン受容体、サイトカイン受容体、Ｂ細胞受容体、ならびにＴ細胞受容体からなる群から選択される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記集団がＰＢＭＣ、リンパ球、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｔヘルパー１またはＴｈ１細胞）、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｔヘルパー２またはＴｈ２細胞）、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、各種身体臓器の内皮および上皮を含む細胞、ならびに神経系の細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項１〜１３、１５〜２５のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１２年６月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／６６５，２３１号、および２０１３年３月１４日に出願された米国特許仮出願第６１／７８４，８０２号に対する優先権を主張する。本出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

（政府の権利）
本明細書に開示されている本発明は、少なくとも部分的に、アメリカ国立衛生研究所からの助成金ＡＩ０４５７６１号、ＡＩ１０６０３６号、ＭＨ０７９１９７号、およびＨＬ１０６７８８号による政府の援助によってなされたものであった。米国政府は、本発明にある一定の権利を有する。

【0003】

本発明は、個々の細胞内の遺伝子発現を迅速に検出する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

多くの病状はＴ細胞媒介免疫応答を誘発する。これらには癌、自己免疫、移植、および、例えば結核（ＴＢ）を含む感染症が含まれる。これらすべての状態において、Ｔ細胞の活性化は、共通点としてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と特異的な抗原（Ａｇ）との相互作用が関与するが、この相互作用の機能的結果は多様である。どのＴ細胞内においても、ＴＣＲシグナル伝達カスケードは、Ａｇの物理的な性質、Ａｇの提示、ＴＣＲのレパートリー、およびＡｇ誘導活性化の強度に応じて、異なる組の遺伝子の発現を刺激しうる。細胞の活性化、増殖、および分化過程での誘導されたこれらの遺伝子発現パターンの違いは、最終的にクローン的に増殖したエフェクター細胞の間での機能的不均一性に寄与しうる。細胞間多様性の追加要素はＴ細胞のホメオスタシスにおいて起きる。Ａｇが除かれるとき、増殖した大部分のエフェクター細胞はアポトーシスによって死ぬが、ごく一部の細胞は長寿命のメモリー細胞として生き残る。Ａｇに再び曝露して起きる応答は、上に列挙した要因に支配され、さらに前分化過程に影響される。その結果、遭遇した各Ａｇについて、免疫応答は同じＡｇ特異性を共有する機能的に特異なＴ細胞のサブセット（例えばエフェクター細胞対セントラルメモリー細胞対エフェクターメモリー細胞）を発生させる。免疫病理学的症状の自然経過においてはいつでも、これらの異なるサブセットの相対的な提示は多様であり；これらが疾患過程を決定または反映しうる。慢性ウイルス感染およびＴＢの研究で例証されているように、Ｔ細胞サブセットはｉｎ ｖｉｖｏでのＡｇおよび病原体負荷と相関し、これらの重要なサブセットの定量分析は診断法および防御免疫測定に有望である。治療の成果は特定の免疫病理症状の進展に関連するため、Ｔ細胞サブセットの明確な変化は治療中にも見られるはずである。（自然または治療媒介での）進展状態のこのようなサインは、アンサンブル測定では見逃され、単一のＴ細胞レベルでしか検出できない。個々のＴ細胞の特性は、Ａｇ刺激に対するこれらの応答によってしか完全には明らかにできない。

【0005】

現在、血液ベースの臨床イムノアッセイでは一般的に非感染性および感染性の病態の存在は認識することができるが、病態の進行は明らかにできないことがある。対照的に、末梢血中のＡｇ特異的な免疫細胞の単細胞機能解析によって、感染および疾患の進展に関連する複合的に交差する免疫病理状態は解明されるはずである。このような解析は、予後診断能力を進展させ、効果的な介入を促進するのに役に立つであろう。説得力のある例が、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）による感染によって提供されている。現在の方法では、ＴＢは患者が患者の接触者に既に感染を伝播させた後で診断される。無症候性感染自体の診断については未だ医療行為が保証されない。（感染性となる前に）安定した潜伏感染（ＬＴＢＩ）と初期の活性疾患とを識別できる能力が大いに必要とされている。既存の免疫診断アッセイはこのニーズに応えることができないが、これは感染状態間で異なることが知られているＡｇ特異的な機能性Ｔ細胞サブセットを区別するよう適合されていないためである。さらに、これらのアッセイではマイコバクテリア性Ａｇの段階特異的な発現を反映しうる応答を評価することができない。

【0006】

結核感染の顕著な特徴は、大勢の人々がこの病原菌に無症候性に感染したことである（２０億人）。易感染性がない状態では、潜在的に感染した人の９０〜９５％は活性のあるＴＢを発症しない。しかし、保菌者のサイズから、結核感染は依然として年間で９．４百万の活性ＴＢの新たな症例を引き起こし、１．７百万人が死亡する原因となっている。活性疾患に進行する際、症候性および感染性になる前に感染した人を特定して治療することができれば、感染の伝播は大幅に減少するであろう。桿菌数が非常に少ないため、初期の活性疾患の間に結核菌または桿菌の産物を検出することは非常に難しい。標準的な活性ＴＢの微生物学的診断は、既に呼吸器の分泌物に結核菌を有することで感染性である人を検出する。

【0007】

アンサンブル測定に基づく方法は、単に細胞媒介免疫応答の複雑さを明らかにするよう適合されておらず、病期および進展に関連するまれなまたは過渡的な細胞状態を明らかにすることができない。単一Ｔ細胞解析にとって最も一般的なイムノアッセイフォーマットは、酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）法および定量的フローサイトメトリー（ＦＣ）解析である。市販のＥＬＩＳＰＯＴ試験（Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ（英国）製）では、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が、血液サンプルからまず単離され、洗浄および計数される。次いで、所定の数（２５０，０００など）のＰＢＭＣおよび結核特異的Ａｇがインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）抗体をプレコートしたプレートウェルに添加され、一晩（１６〜２０時間）インキュベートされる。活性化Ｔ細胞から放出されるＩＦＮγはウェル内で捕捉される。次いで、発色酵素が結合した二次抗体（Ａｂ）と共にインキュベーションされ、その後ウェルは洗浄され、発色基質が加えられる。Ｔ細胞によってＩＦＮγが分泌された箇所に、サイトカイン放出細胞の周囲に色のついた環状という特徴的な外観を有するスポットが生じる。最後に、肉眼またはプレートリーダーを用いてスポットが計数される。ＥＬＩＳＰＯＴは高感度である（その検出限界はＰＢＭＣにおいて１０／１０^６である）。しかし、いくつかの理由により、機能性Ｔ細胞サブセットの間で所望の識別ができない。第１に、一般的に複数の標的を同時に検出するのに適していない。第２に、フォーマットが解析する細胞数に制限がある（例えば、前述の市販のＴ−ＳＰＯＴ．ＴＢ試験では２５０，０００細胞／ウェル）。従来のＦＣは多重パラメータ機能を有している。全血またはＰＢＭＣ中の細胞は、特異的Ａｇ（例えば結核特異的ペプチドまたはタンパク質）、およびブレフェルジンまたはモネンシンのような細胞外分泌阻害剤を用いて６時間以上インキュベーションすることにより刺激される。次いで、透過処理したＴ細胞は、フルオロフォア標識抗サイトカインＡｂ（例えばＦＩＴＣ結合抗ＩＦＮγ）を用いて染色され、ＦＣにより解析される。Ａｂによるタンパク質染色は、特に細胞内タンパク質の場合において、従来のＦＣの汎用性を低下させる。さらに、アッセイは内在性抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＴ細胞の長時間の刺激を必要とするプロトコルにより制限され、これにより所要時間が長くなり、臨床的有用性が低下する。

【0008】

個々の細胞のサイトカイン解析のための既存の方法は、少量の末梢血サンプル中に存在する低頻度のＴ細胞集団を迅速に識別する能力に欠ける。市販のＥＬＩＳＰＯＴ試験では、ＴＢとＬＴＢＩが区別できない。さらに、（活性ＴＢの微生物学的証拠がない）無症候の個人における陽性結果は、再活性化のリスクにとって情報価値がない。したがって、結核感染の存在を正確に反映する一方で、陽性結果は治療介入の指標と見なされない。このため、特に低資源・高負担で人口の大部分が感染している国々（南アフリカの地域では最大８０％）においては、試験の認容性が低下する。さらに、米国のような低負担・高資源な国々においてさえも、再活性化リスクの指標なしで推奨される場合は、ＬＴＢＩ治療の副作用によりその治療が拒否されることがしばしばある。明らかに、現在の免疫診断の限界は、世界中で極めて大きな公衆衛生上の影響を及ぼしている。

【0009】

したがって、個々の細胞内の遺伝子発現を迅速に検出する方法に関して、満たされていないニーズがある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、個々の細胞内の各種ＲＮＡ分子を検出するための新規の迅速な方法に関する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

したがって、本発明の１つの側面では、個々の細胞内で発現された少なくとも１つのＲＮＡ分子のコピーを検出するための方法が提供される。方法は、（ａ）リガンドまたは刺激分子が結合すると遺伝子発現につながるシグナルカスケードを開始することができる特異的受容体を発現する細胞の集団（例えば少なくとも１００または少なくとも１０，０００細胞）を含むサンプルを提供するステップと；（ｂ）特異的受容体に結合するか、またはシグナル伝達を開始して遺伝子発現を開始する、少なくとも１つの化合物、例えば、（結核菌などの）微生物由来のペプチドまたはペプチド混合物を用いて細胞をインキュベートすることにより、直ちにまたは培養後にｅｘ ｖｉｖｏで細胞内での遺伝子発現を誘導するステップと；（ｃ）細胞を固定および透過処理するステップと；（ｄ）蛍光標識したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブセットを用いて、細胞によって発現した少なくとも１つのＲＮＡ分子のコピーを標識し、かつ非結合プローブを洗い流すステップと；および（ｅ）蛍光強度ゲーティングにより分類された１つ以上の蛍光測定値である発現現象を有する細胞をフローサイトメトリー（ＦＣ）により検出するステップを含む。

【0012】

上述の方法は、個々の細胞内の各種ＲＮＡ分子を検出するために用いることができる。特に、本方法はＩＬ−２、ＴＮＦα、またはＩＦＮγなどのサイトカイン遺伝子によってコードされたＲＮＡ分子を検出するために用いることができる。

【0013】

本方法において、誘導ステップは、細胞集団中に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）または人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達および下流の遺伝子発現の刺激を含むことができる。誘導は、３０分から６時間の間で実施することができる。いずれの場合でも、誘導ステップは、少なくとも１つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて共刺激するステップも含むことができる。モノクローナル抗体は、ａＡＰＣまたはＡＰＣに結合または付加させることができる。

【0014】

本方法の１つの実施形態では、細胞集団はヒトＰＢＭＣから得られたＴ細胞の集団でもよい。その場合、少なくとも１つのＲＮＡ分子はサイトカイン遺伝子によってコードされたものにすることができる。また、細胞集団中の細胞は、ＴＣＲと相互作用する１つ以上のペプチド負荷ＭＨＣ分子を伴うＡＰＣまたはａＡＰＣにより誘導することができる。

【0015】

本方法において、化合物または刺激分子は、結核菌由来の免疫原性ペプチドなど、微生物由来でもよい。１つの例では、化合物はＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子と結合するようなペプチドまたはペプチド混合物を含むことができる。これらのペプチドまたはペプチド混合物は、様々な濃度（例えば１〜２０μｇ／ｍｌの間）で前述のＡＰＣまたはａＡＰＣに加えることができる。

【0016】

上記の方法において、誘導ステップは、刺激物を用いたこのような受容体を含む細胞内でのＴｏｌｌ様受容体シグナル伝達および下流の遺伝子発現の刺激を含むことができ、この刺激物の例にはサイトカイン、微生物産物、または合成化合物が含まれる。微生物産物の例には、脂質、グリカン、糖脂質、硫脂質、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、または核酸（例えばＲＮＡもしくはＤＮＡ）が含まれる。刺激は、３０分から７２時間の間（例えば３０分から６時間、６時間から２４時間、２４時間から７２時間）で実施することができる。刺激物は、１〜２０μｇ／ｍｌの間（例えば１〜１００ｎｇ／ｍｌまたは１００〜１０００ｎｇ／ｍｌ）の濃度で存在することができる。化合物または刺激物は、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＴＮＦαなどのサイトカイン、またはＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５またはＴＮＦα以外のサイトカインでもよい。本方法において、１つを超える化合物または刺激物は、同時にまたは別々に提供することができる。

【0017】

本方法のステップ（ｄ）において、プローブセットは同じ蛍光成分でそれぞれ単独で標識された２０〜６０のプローブを含むことができる。

【0018】

別の実施形態では、発現現象を有する検出された細胞は、発現現象を有しない細胞から（例えば蛍光活性化細胞分取により）分離することができる。分離された細胞は、１つの細胞のみ、または１つを超える細胞（例えば１０、１００、１０００、１０，０００または１００，０００細胞）を含むことができる。次いで、遺伝子発現は、分離された細胞内で、例えばＲＴ−ＰＣＲまたは細胞内のＲＮＡのトランスクリプトーム解析により、測定することができる。

【0019】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細が、以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】実施例２に記載のＦＣ読み取り値の蛍光強度に対する前方散乱チャネルＡ（ＦＳＣ−Ａ）のグラフである。

【図2】実施例７に記載のサンプルのＦＣ検出から得られた１セットの４つの頻度プロットである。

【図3】実施例８に記載のサンプルのＦＣ検出から得られた１セットの６つの頻度プロットである。

【図4】実施例９に記載のサンプルのＦＣ検出から得られた１セットの３つの頻度プロットである。

【図5】実施例１０に記載のサンプルのＦＣ検出から得られた１セットの１２の頻度プロットである。

【図6A】実施例１１に記載のｍＲＮＡプローブセットを用いてプローブ検査したサンプルのＦＣ検出から得られた１セットの２８の頻度プロットである。

【図6B】実施例１１に記載のｍＡｂを用いてプローブ検査したサンプルのＦＣ検出から得られた１セットの１６の頻度プロットである。

【図7A】実施例１２に記載の、サイトカイン陽性およびサイトカイン陰性の集団として細胞を区別するための追加ゲーティング前（左枠）および後（右枠）の、緑色蛍光タンパク質用プローブを用いてプローブ検査したサンプルのＦＣ検出から得られた１セットの２つの頻度プロットである。

【図7B】実施例１２に記載の、サイトカイン陽性およびサイトカイン陰性の集団として細胞を区別するための追加ゲーティング前（左枠）および後（右枠）の、４つのｍＲＮＡプローブセットを用いて同時にプローブ検査したサンプルのＦＣ検出から得られた１セットの２つの頻度プロットである。

【図8A】実施例１２に記載の分取した（＋／−）細胞集団中の２つの遺伝子の増幅の閾値サイクルを示す表である。

【図8B】実施例１２に記載の増幅により得られた増幅産物の電気泳動ゲルを示す写真である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本発明は、タンパク質をコードするＲＮＡ転写物（例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびプレｍＲＮＡ）ならびにタンパク質をコードしないＲＮＡ転写物を含む１つ以上の遺伝子の発現を測定および評価するための方法を開示する。

【0022】

本明細書に開示されているように、本方法は様々な誘導に応答して遺伝子発現が変化する細胞内のＲＮＡ転写物を評価するために用いることができる。誘導は、自然発生でもよく、またはＴＣＲを含む（ただしこれに限定されない）細胞受容体の任意の既知リガンドによって刺激されてもよく、また原則的に、任意の受容体またはリガンド（例えばＴｏｌｌ受容体様またはケモカインの受容体およびこれらのリガンド）またはシグナル伝達カスケードを開始する化合物が関与してもよく、特定の遺伝子（例えばＩＬ−２、ＴＮＦα、またはＩＦＮγなどの少なくとも１つのサイトカイン遺伝子）の転写合成および発現をもたらしてもよい。

【0023】

ある実施形態において、誘導は、特異的受容体を結合してそれにより遺伝子発現を開始する１つまたは複数の化合物（例えばＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ分子に結合したペプチドまたはペプチド混合物）による刺激である。１つまたは複数の化合物は微生物由来でもよく、例えば結核菌由来の免疫原性ペプチドである刺激分子でもよい。遺伝子発現の誘導、例えばＴ細胞受容体シグナル伝達および下流の遺伝子発現の刺激は、調査する細胞集団中に存在するＡＰＣによってもよい。あるいは、刺激は人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）によってもよい。ＭＨＣクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子に結合するペプチドまたはペプチドの混合物は、ＴＣＲと相互作用するペプチド負荷ＭＨＣ分子を産生するために、好ましくは１〜２０μｇ／ｍｌの範囲の濃度でＡＰＣまたはａＡＰＣに加えられてもよい。本発明の方法の特定の実施形態は、ＡＰＣまたはａＡＰＣに加えて、少なくとも１つのモノクローナル抗体を用いる共刺激を含む。ａＡＰＣを用いるとき、ｍＡｂはａＡＰＣに結合されてもよい。

【0024】

本発明の方法により、細胞集団の構成における変化ならびに感染性または非感染性疾患の進展および付随する病態進行の間に起こる機能の測定を、迅速かつ高感度で実施することができる。これらの測定により、造血および非造血起源の新生および／または悪性細胞、ならびに自己免疫疾患に関与する細胞の特性を特徴付けることができる。

【0025】

本方法は、疾患状態を処置する治療における応答の監視においても用いることができる。感染症については、抗生物質療法に応答する免疫制御は、病原菌（例えば結核菌）の根絶における進展と、機能性Ｔ細胞サブセットの抗原ペプチドに対する応答などの刺激に対する細胞応答の変化とを相関させることによって、確認することができる。

【0026】

本発明の方法は概して、リガンド／刺激分子結合によりシグナル伝達カスケードを開始させることができる特異的受容体を発現する実質的にすべての細胞、哺乳類（ヒトを含むがこれに限定されない）および下等真核生物に適用できる。これらの方法は、細菌の集団および多細胞生物に適用することができる。特定の好ましい実施形態は、ヒト細胞を含むがこれに限定されない動物細胞に対して本発明の方法を適用するものである。適切な源は、まれな現象の検出および／または統計解析のために十分な細胞数を提供する。ある実施形態において、その数はわずか１０００細胞またはさらに１００細胞である。多くの実施形態において、例えば細胞がＴ細胞である場合、少なくとも１０，０００細胞を提供する源が好ましい。より好ましくは、本源は少なくとも１００，０００細胞または少なくとも１００万細胞を提供する。適切な源には、血液サンプルおよび組織サンプル、例えば生検サンプルが含まれる。組織サンプルは個々の細胞に分離されなければならず、すなわち脱凝集した組織が処理のために必要である。

【0027】

前述のように、本発明の方法には、５日を超えず好ましくはさらに短い、例えば４、３、２、もしくは１日、または１６、１２、１０、８、６、もしくは４時間の迅速な誘導が含まれる。好ましい誘導時間は３０分から８時間、好ましくは３０分から６時間、より好ましくは３０分から４時間、さらにより好ましくは３０分から２時間である。

【0028】

本発明の方法には、イオン流束によって誘導される活性化および機能的影響（イオノフォアおよび／もしくはマイトジェンによって引き起こされ、またはケモカイン受容体、ポリペプチドホルモン受容体、サイトカイン受容体、Ｂ細胞受容体、もしくはＴＣＲを含む、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＯＤ受容体、ＮＯＤ様受容体、ならびにＧタンパク質共役型受容体を含むパターン認識受容体を含むがこれに限定されない細胞表面または細胞内受容体を通じたシグナル伝達によって引き起こされるが、これらに限定されない）に基づいて、免疫および非免疫細胞内の１つ以上の遺伝子の発現を迅速に測定するステップが含まれる。本発明に記載の方法は、多様な感染性および非感染性の病態に対する医療を進歩させると考えられる。好ましい実施形態は、単離されたＰＢＭＣ、Ｔ細胞内、または（単離されたＰＢＭＣではなく）全血サンプル中のいずれか、およびさらに以下に示す他のタイプの細胞内の個々のリンパ球内の１つ以上のサイトカインについて、ｍＲＮＡおよびプレｍＲＮＡの両方を含むＲＮＡの発現を検出するステップを含む。本発明に記載の方法は、例えばＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαを産生するＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｔヘルパー１またはＴｈ１細胞）；ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３を産生するＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｔヘルパー２またはＴｈ２細胞）；（ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１αおよび他のケモカイン）を産生するＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに他の特殊なＴ細胞サブセット（Ｔｈ１７およびＴｒｅｇ細胞を含むがこれらに限定されない）、または他のリンパ球サブセット（ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞を含むがこれらに限定されない）、マクロファージおよび樹状細胞の亜集団、各種身体臓器の内皮および上皮を含む細胞、または神経系の細胞（ニューロンおよびグリアを含むがこれらに限定されない）、ならびにサイトカイン、ケモカイン、およびこれらの細胞によって産生される機能分子（例えば表２を参照）のプレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの解析に適用される。

【0029】

本発明に記載の特定の方法は、ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞の刺激または特異的な分子相互作用の誘導を含み、活性マーカーの発現および細胞機能の調節をもたらす。刺激は、直ちに実施されても、または培地内で培養した後の細胞に対して実施されてもよい。刺激は、自然刺激でもよく、すなわち培養物中で単に細胞をインキュベートしてもよい。好ましくは、刺激は、特異的受容体／リガンドをトリガーしてシグナル伝達カスケードを誘導する１つ以上の化合物と共に培地中で細胞をインキュベートすることにより促進されてもよい。これらの化合物は、合成でもまたは微生物（細菌、ウイルス、および菌類を含むがこれらに限定されない）由来でもよく、例えばリポ多糖、リポアラビノマンナン、ペプチドグリカン、細菌起源のミコール酸、またはエプスタイン・バーウイルスもしくはサイトメガロウイルスを含むがこれらに限定されないウイルス起源のタンパク質（例えばそれぞれタンパク質ｅｂｖＩＬ−１０、ｃｍｖＩＬ−１０およびＵＬ１４６）、あるいは真菌（例えばクリプトコッカス関連およびコウジカビ関連）のガラクトキシロマンナンおよびガラクトマンナンならびに可溶性の抗原；ポリペプチドホルモン、例えば血小板由来の増殖因子またはＶＥＧＦ；サイトカイン；ならびに抗原ペプチドを含む抗原でもよい。刺激の好ましい方法は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ；下記参照）を用いる。

【0030】

本発明に記載の方法は、１つのバイオマーカーサイン、好ましくは複数のバイオマーカーサイン、すなわち無傷細胞内でｉｎ ｓｉｔｕでｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡを特に含む１つ以上のＲＮＡを有する、特に活性化された細胞を含む個々の細胞の検出をさらに含む。

【0031】

本発明に記載の好ましい方法は、固定および透過処理された細胞で、蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブのセットを利用して非結合プローブを洗い流し、ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡ分子を含む発現ＲＮＡ分子を標識することによって、個々の細胞（例えば活性化Ｔ細胞）内での誘導された遺伝子発現（例えばサイトカイン、最も好ましくは複数のサイトカイン）を検出するステップを含む。各ＲＮＡ標的に対して複数の蛍光標識を提供する複数の核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いることによって、単分子感度が得られる。これらのプローブは、同族のｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡにハイブリダイズされたときに、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって蛍光を発するために標識された特定のフルオロフォアまたはプローブを用いて多重的に標識された少数のプローブでもよい。本発明の好ましい方法は、単一の蛍光色素でそれぞれ標識され、標的配列に同時に結合する、より多くの、例えば１０〜１００、より好ましくは２０〜６０、さらにより好ましくは３０〜５０、例えば約５０の、より短いオリゴヌクレオチドプローブを利用する。多数の標識を各ＲＮＡ分子に付けると、細胞は、ＦＣ法によって検出することができるバックグラウンドを上回る十分な蛍光を発するようになる。

【0032】

さらに、本発明に記載の方法は、１つまたは複数の標的ＲＮＡを発現する個々の細胞のＦＣによる検出および解析を含む。本発明の特定の好ましい方法は、所望の細胞内でＡＰＣまたはａＡＰＣ刺激により誘導されたサイトカイン遺伝子のＲＮＡ発現産物を含む細胞を検出するために、定量的ＦＣを使用するステップを含む。

【0033】

ＦＣは、細胞の単一ファイルを作成する流体力学的絞り込みのための流体システムを含む。次いで、単細胞は１つまたは複数の波長での蛍光発光を調べることができる。ＦＣは、臨床病理の実験室においては当たり前の手法である。例えば、ＦＣによるイムノフェノタイピングは、各種血液系腫瘍の診断および進行度診断において重要なツールである。極めて重要なＦＣステップは、１つ以上の蛍光部分（例えばフルオロフォア）を用いて細胞を標識するステップ、標識された細胞をフローサイトメーターに導入するステップ、蛍光部分の励起波長で発光するレーザーなどの励起光源を各細胞に照射するステップ、および用いられている各蛍光部分に特異的な発光波長を区別するフィルターおよびミラーを用いて発せられた蛍光を検出するステップであり、それによって、励起および発光に基づき、各細胞に結合した各蛍光部分の存在、および好ましくは量を明らかにするデータを取得する。

【0034】

本明細書に開示されているように、複数の単独標識蛍光ハイブリダイゼーションプローブの利用によりＲＮＡを発現する細胞を検出するために、ＦＣは用いることができる。最も好ましい実施形態は、内在性ＡＰＣまたはより好ましくはａＡＰＣのいずれかによる結核菌Ａｇの提示によって刺激された、単離されたＰＢＭＣのＴ細胞分画中におけるサイトカイン遺伝子から発現したＲＮＡ（ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡ）の検出である。複数のサイトカインに対するＲＮＡは、各ＲＮＡ種に特異的で、検出される各ＲＮＡ種を異なる蛍光部分（例えば異なるフルオロフォア）で標識したプローブを使用することにより検出することができる。

【0035】

本発明の方法において、ＦＣは（わずか１０，０００細胞から１００万細胞を超える）細胞の集団に対して実施される。データは１つ以上の現象について取得される。現象は１つの細胞に対する１セットの測定値である。各現象のデータは、ユーザー定義ウィンドウ（例えば、強度レベルＸと強度レベルＹの間のフルオロフォアＡに対するシグナル、またはフルオロフォアＡに対するシグナル）に分類される。ＦＣ読み取り値の分類はゲーティングと呼ばれるプロセスであり、したがって、現象は、通常、ある一定の閾値を上回るように、またはある特定の許容限界値で制限されて、ゲーティングまたは選別される。次いで、結果は、ある一定のウィンドウ内の細胞の絶対数として、または好ましくは１つ以上のウィンドウ内の細胞の割合、すなわち頻度として表すことができる。例えば、疾患状態の解析において、結果は、１０％の細胞がｍＲＮＡ ＡおよびｍＲＮＡ Ｂについて陽性で、７％の細胞がｍＲＮＡ ＢおよびｍＲＮＡ Ｃについて陽性で、２％の細胞がｍＲＮＡ Ａ、ｍＲＮＡ ＢおよびｍＲＮＡ Ｃの３つすべてについて陽性であってもよい。１０，０００細胞が解析される場合、最低の可能な陽性結果は、ある一定の現象が１０，０００細胞のなかで１回発生したというものである。一方、１００万細胞が解析される場合、最低の可能な陽性結果は、ある一定の現象が１００万細胞のなかで１回発生したというものである。

【0036】

ＦＣの結果の解析は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を含んでもよいが、これは分散を分析するための統計モデルの集合であり、一般に、全分散を真の偶然誤差による成分と平均値間の差による成分とに分けることによって、グループの平均値または変数の間で有意差を試験する。

【0037】

本発明は、前述の方法を実施するための試薬キットについても開示する。本発明に記載のキットは、少なくとも１つの刺激化合物、例えば、試験される疾患状態に特徴的な応答として１つ以上のサイトカインの発現を刺激するタンパク質またはペプチド、またはこのようなペプチドを負荷し後述のように共刺激分子を保有するａＡＰＣ、およびｍＲＮＡもしくはプレｍＲＮＡ中に存在する単一の配列にそれぞれ特異的にハイブリダイズする１つ以上のセットのオリゴヌクレオチドプローブ（好ましくはここで各セットはそれぞれ１６〜２０塩基のオリゴヌクレオチドを２０〜６０含み、各オリゴヌクレオチドは単一のフルオロフォアで標識されている）を含む。前記キットは、ｍＲＮＡ特異的プローブ以外に、細胞タンパク質または関心のある標的に結合しているフルオロフォアでタグ付けされた化学プローブを認識するフルオロフォア結合Ａｂ、解析される細胞の固定および透過処理のための試薬、包含されたプローブと細胞とのハイブリダイゼーションのための試薬、および過剰なハイブリダイズされていないプローブまたは他の非結合標識プローブを除去するための洗浄液などのハイブリダイゼーション後の処理のための試薬をさらに含んでもよい。

【0038】

好ましい実施形態において、本発明の方法は、細胞集団中に存在するＡＰＣまたは合成ビーズ（本明細書においてａＡＰＣと呼ぶ）によるＴＣＲシグナル伝達および下流の遺伝子発現の刺激を含む。合成ビーズは、機械的な担体、すなわちタンパク質（ＭＨＣおよび／または共刺激受容体およびリガンド）が化学結合、静電結合、または他の任意のタイプの結合によって結合できるプラットホームとしての役目を果たす。したがって、例えば、ａＡＰＣの機械的な担体、すなわちプラットホームとしての役目を果たすために、必要に応じて化学修飾または誘導体化を施したまたは施していない任意のプラスチック表面を用いることができる。

【0039】

ＡＰＣは、ＭＨＣ分子と結合し（またはＭＨＣ分子によって内因的に処理および提示され）、次いでＴＣＲを刺激することができるよう、添加したペプチド（またはタンパク質）と相互作用（または反応）する。ａＡＰＣはＭＨＣ分子に結合した添加ペプチドと相互作用し、これによりこれらのペプチド負荷ａＡＰＣはＴＣＲを刺激することができる。したがって、ａＡＰＣは、ＣＤ２８および／またはＣＤ４９ｄなどのＴ細胞上で発現された共刺激受容体と相互作用する１つ以上の抗体または他のタイプのリガンド存在下又は非存在下で、ＴＣＲと相互作用するペプチド負荷ＭＨＣ分子の１つ以上のクラスを保有する。特定の好ましい実施形態において、刺激性ペプチドは、結核菌由来の免疫原である。ＴＣＲを刺激するステップは、適切なペプチドを負荷し、また、いくつかの実施形態においては、シグナル伝達を増強する共刺激受容体上の標的に結合する抗体、ペプチド、各種炭水化物含有および脂質含有分子などの共刺激タンパク質または機能的等価物を負荷するＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子を含むＴＣＲ発現細胞の、ＡＰＣまたはａＡＰＣを用いたインキュベーションを含み、Ｔ細胞の活性化を引き起こす。

【0040】

機能的に異なるＴ細胞サブセットは、現在の検出限界に近い頻度で（一般に０．０１〜０．１％）しばしば発現する。したがって、それらの検出には、まれなＴ細胞サブセットでも直接検出できるように、または特定の分析方法の検出限界を上回る数まで増殖するように、強力なＴＣＲ刺激および高感度の検出方法が必要である。本発明の方法は、細胞集団中に存在するＡＰＣによる、あるいはａＡＰＣ（（ｉ）適切なペプチドを負荷したＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子、および、特定の好ましい実施形態においては（ｉｉ）別のシグナルを提供する共刺激タンパク質（抗ＣＤ２８および／または抗ＣＤ４９ｄモノクローナル抗体）（Ｏｅｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９（５）：６１９−２４］）を含む合成ビーズベースのプラットホーム）による効果的なＴＣＲ刺激を誘導するステップを含む。実質的に任意のＭＨＣ対立遺伝子をビーズプラットホームに付着でき、および任意の共刺激シグナルは、自然発生するまたは化学的に定義されるいずれかのビーズ付着特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）または共受容体リガンドとして提供することができる。優れた刺激特性に加えて、ａＡＰＣは非常に安定している：最終的な細胞サイズのａＡＰＣは、結合した合成ペプチドの有無にかかわらず、凍結乾燥形態で保存安定性に優れ、容易に運ぶことができる。

【0041】

本発明の方法において、刺激のための手順は一般に、被験者から所望の細胞を得るステップ、培地内で細胞をインキュベートするステップ、および３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、またはさらに長い期間（例えば１、２、３、４または５日）などの様々な時間で、培養された細胞を刺激するために化合物を加えるステップを含む。細胞は、固形組織の生検により、または気管支肺胞洗浄など、関心のある部位からの液体中の細胞の吸引により得ることができ、あるいは細胞の源は末梢血でもよい。所望の細胞は、これらの細胞を溶解し、溶解した細胞の残分（remnant）から無処置の所望の細胞を分離することによって、または特定の細胞の特性に基づいて不必要な細胞から所望の細胞を分離することによって、不必要な細胞から分離した後に培養してもよい。例えば、血液由来のＰＢＭＣは、培地内でのインキュベート前に、赤血球（ＲＢＣ）の溶解後、または細胞密度に基づくフィコールによる遠沈による回収およびフィコールの除去の後のいずれかで培養してもよい。刺激は、検出される応答を生じるのに十分な量の上述の刺激化合物（細菌、真菌、またはウイルスの産物、あるいは宿主タンパク質またはペプチドなど）を加え、応答を生じるのに十分な時間だけインキュベートすることにより実現することができる。応答は、培養され、刺激された細胞による、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの合成でもよい。応答は、与えられた刺激物に対する所望の細胞の応答に特徴的なサインとして解釈されてもよい。

【0042】

結核感染のサインを得るために、例えば、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１ベースのａＡＰＣは、Ｒｖ１８８６ｃ、Ｒｖ３８７４およびＲｖ３８７５などの既知のＡｇ由来のヒトＨＬＡ−Ａ−０２０１ＭＨＣクラスＩタンパク質に結合することが知られているＨＬＡ−Ａ^＊０２０１エピトープ（ペプチド）を負荷することができ、また、Ａ２ベースのＡｇ負荷ａＡＰＣは、ＣＤ８＋Ｔエフェクターを検出するために、標準的な培養条件下、１：１の比率でＰＢＭＣと混合することができる。ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４ベースのａＡＰＣも同様に負荷して、ＣＤ４＋Ｔエフェクターの検出のために用いることができる。

【0043】

１つ以上の特異的なＲＮＡのコピーを含む細胞を検出するために、各ＲＮＡについて、１セットの複数の蛍光標識したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを利用することができる。オリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの混合物でもよい。これらは、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、および非天然ヌクレオチド間結合を含んでもよい。各プローブは、複数の蛍光部分、例えばフルオロフォア、量子ドット、または他の蛍光部分の複数のコピーで標識されてもよい。例えば、国際公開第１９９７／０１４８１６号には、標的あたり５つのプローブを利用した、一段階のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるβ−アクチンおよびγ−アクチンｍＲＮＡの検出が記載されており、プローブは、１０ヌクレオチドおきに１つのフルオロフォア（フルオレセインまたはＣｙ３）、すなわちプローブあたり５つのフルオロフォアで標識した約５０ヌクレオチド長の一本鎖ＤＮＡである。本発明の好ましい方法は、単一の蛍光色素を用いてそれぞれ標識され、標的配列に同時に結合する、より多くの、例えば１０〜１００、より好ましくは２０〜６０、さらにより好ましくは３０〜５０、例えば約５０の、より短いオリゴヌクレオチドプローブを利用する。多数の標識を各ＲＮＡ分子に付けると、細胞は、ＦＣ法によって検出することができるバックグラウンドを上回る十分な蛍光を発するようになる。ほとんどの実施形態において、各プローブセットは単一の蛍光部分を有するようになり、また、各蛍光部分は、検出可能な程度に他の存在する蛍光部分と区別可能になる。しかし、各細胞が第１のＲＮＡまたは第２のＲＮＡを発現するか否かを検出しようとする場合、両方のプローブセットを同じ蛍光部分で標識することができる。

【0044】

バックグラウンド蛍光は、ＦＣを利用する本発明の方法に対し、細胞内の輝点として個々のＲＮＡを顕微鏡により可視化する顕微鏡的ｓｍＦＩＳＨ法とは異なる問題を引き起こす。本発明の方法では、バックグラウンド低減技術を用いてもよい。このような技術の１つは、標的ＲＮＡ上に隣接して整列するプローブ間でＦＲＥＴを利用するものである。例えば、第１プローブおよび第２プローブの３’末端に（知られている適切なＦＲＥＴ距離内で）隣接する第１プローブの５’末端と隣接して整列する第２プローブを考えると、第１プローブの５’末端にＦＲＥＴドナーを、また、第２プローブの３’末端にＦＲＥＴアクセプターを加えてもよい。この組み合わせでは、細胞はドナーフルオロフォア（例えばフルオレセイン）の吸収波長で励起されるが、シグナルはアクセプターフルオロフォア（例えばＴｅｘａｓ Ｒｅｄ）の発光波長で検出される。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄフルオロフォアは直接励起されないため、ハイブリダイズされていないプローブ、または誤ってハイブリダイズされたプローブは、蛍光を発しない。別の技術は、Ｒｅｓｏｎｓｅｎｓｅプローブを用いたプロービングにおいて実施されるように、二本鎖ＤＮＡ色素とプローブセットのフルオロフォアとの間でＦＲＥＴを利用するものである。この場合、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮなどのｄｓＤＮＡ色素が含まれ（ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮはフルオレセインと非常に似た吸収波長および発光波長を有する）、また、プローブセットはＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮからの発光を受けるフルオロフォア（例えばＴＭＲ）で標識される。この組み合わせでは、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮの吸収波長で細胞を励起することができるが、フルオロフォアの発光波長で発光を検出する。フルオロフォアは直接励起されないため、ハイブリダイズされていないプローブは蛍光を発しない。

【0045】

ＲＮＡのすべての領域は、プローブの標的として役目を果たすことができるが、このようなプローブの選定においては、いくつかの要素が考慮されるべきである。好ましくは、標的領域は細胞内でゲノムの他の領域から発現されるべきでなく、またより好ましくは、標的領域はゲノム中の他の場所に存在すべきでない。これは、所望の標的の配列を、検討されている生物の発現遺伝子および全ゲノム配列を一覧にしているデータベースと照合することによって確実にすることができる。潜在的にバックグラウンドを発生させる配列のこの「フィルトレーション（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」は、「ｒｅｐｅａｔ ｍａｓｋｅｒ」などの公開されているコンピュータープログラムを用いて実施することができる。プローブは、標的と直接隣接する領域から選択することができ、または隣接するプローブ間にいくらかのスペースがあってもよい。プローブの長さはハイブリダイゼーションの厳密性に応じて変化してもよい。

【0046】

下に示す通り、実施例１では、単細胞内での遺伝子発現の特徴的なサインの区別における誘導およびプロービングが実証されている。

【0047】

さらに具体的には、アッセイを実施して、照射された結核菌で刺激された分化ＴＨＰ−１細胞を試験した。細胞を、２４時間刺激した後に４％パラホルムアルデヒドで２０分間インキュベーションして固定し、次いで２つのｍＲＮＡ標的についてプローブでハイブリダイズした。１つはＴＮＦαであり、活性化Ｔ細胞およびマクロファージの解析に重要な標的である。もう１つはＡＣＳＬ１（脂質代謝遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０５００７３．１）であり、同様に刺激物によって誘導されることが予想される。ＴＮＦαに特異的なプローブセット（Ｅｎｓｅｍｂｌ配列ＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３７６１２２）は、それぞれ約２０ヌクレオチド長で、かつテトラメチルローダミンフルオロフォアで末端標識した４８のプローブを含んでいた。ＡＣＳＬ１に特異的なプローブセットは、それぞれ約２０ヌクレオチド長で、かつ光学的に区別可能なフルオロフォア、すなわちＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５９６で標識された４８のプローブを含んでいた。

【0048】

実施例１については、発現ＲＮＡ産物は、Ｒａｊ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７２：３６５−３８６およびＲａｊ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５：８７７−８７９に記載の既知の顕微鏡技術、すなわちｓｍＦＩＳＨを用いて検出した。この技術は、個々のＲＮＡ分子にセットされたプローブのハイブリダイゼーションの目印としての蛍光点の検出を含む。実施例１において、両方のｍＲＮＡに対応する点を検出した。ＴＮＦαおよびＡＣＳＬ１の画像は、細胞の同じセットの各チャネルの合成三次元積層（merged 3-D stack）であった。解釈には、参考文献に記載されているように、ｍＲＮＡの個々の分子に対応する回折限界スポットを明らかにするコンピュータープログラムを用いた画像処理、細胞のＤＩＣ画像へのその回折限界スポットの重ね合わせ、およびｍＲＮＡ分子の数の細胞毎の計数値の取得が含まれていた。細胞間で各遺伝子の転写物の数に大きなばらつきが観察されたが、これは、哺乳類細胞においてｍＲＮＡ合成が非常に確率的であるという以前の観察と一致する。結果（連続して解析した５０の細胞で計数された点の合計に基づく刺激および無刺激の細胞におけるＴＮＦαの平均の点の数）では、単細胞の測定がアンサンブル測定よりもはるかに情報価値があることが示された。

【0049】

本発明の方法のためのＦＣデータ取得は、従来のＦＣ技術により実施することができる。光は、前方散乱チャネル（ＦＳＣ）および側方散乱チャネル（ＳＳＣ）の両方において検出することができる。データは、密度プロットおよび等高線図のいずれか、またはその両方で提示することができる。不必要な粒子（例えば細片）による結果を排除しながら関心のある細胞を可視化するために、ＦＣゲーティングが用いられる。ゲートおよびウィンドウ、または領域は、陽性の現象がウィンドウ内に現れるように、従来の方法で決定される。真陽性の現象を偽陽性の現象から識別するためのゲーティングを支援するために、陰性対照、すなわち細胞が発現することのできないもののプロービングの使用が役に立つ。原則的に、これはタンパク質のためのＦＣに類似しており、ここではアイソタイプ陰性対照および／または未染色細胞が利用される。

【0050】

ＦＣ検出は、サンプル中の陽性の現象の数、例えば、１０，０００細胞中に１つの陽性の現象（１／１０，０００）、１００，０００細胞中に３つの陽性の現象（３／１００，０００）、または１００万細胞中に２つの陽性の現象（２／１０^６）を明らかにする。現象の頻度によって、生物学的な状態、例えば疾患状態に関する結論が導かれてもよい。あるいは、組み合わせによって結論が導かれてもよい（例えばサンプル中の１０％の細胞が第１のサイトカイン（サイトカインＡ）について陽性であり、また、第２のサイトカイン（サイトカインＢ）について陽性である）。別の例として、疾患状態は以下の組み合わせによって特徴付けることができる：１０％以上の細胞がサイトカインＡおよびＢについて陽性；７％以上の細胞がサイトカインＢおよび第３のサイトカイン（サイトカインＣ）について陽性；２％以上の細胞が３つのサイトカインすべてについて陽性。

【0051】

本明細書に開示されているように、ＦＣが本発明の方法のための読み取り値として有用であることが実証された。後述の実施例２における実験は、個々の細胞内のＲＮＡ標的にハイブリダイズされたプローブセットによって生成されたシグナルをＦＣによって検出することができるかを試験するために計画された。その例では、レンチウイルスコンストラクトから発現させる細胞培養液内のＨＩＶ ＧＡＧ ｍＲＮＡを検出するステップを説明している。さらに具体的には、２９３Ｔ細胞を、組換えレンチウイルスコンストラクトを一緒に発現させる３つのプラスミドを用いてトランスフェクトし、またＧＡＧ ｍＲＮＡに特異的なプローブを用いてハイブリダイズした。ＦＣの結果は図１に示しており、トランスフェクトされていない細胞から得られた蛍光強度と前方散乱チャネルＡ（ＦＳＣ−Ａ）のグラフが上側、レンチウイルスパッケージングシステムからの３つのプラスミドを用いてトランスフェクトした細胞から得られたグラフが下側である。細胞の両方のセットについて、ＧＡＧ ｍＲＮＡに対するプローブセットを用いてハイブリダイズした。トランスフェクトした細胞の集団は、外れ値のトランスフェクトされていない細胞（すなわち、設定閾値を上回るもの）からのシグナルに見られる強度より１〜２桁高い強度のシグナルを生じた。対照として、ｓｍＦＩＳＨの結果の画像ベースの解析は、約２５％の細胞がコンストラクトを発現していることを示した。同じ集団に対するＦＣ解析により、同じ割合の細胞が蛍光性であることが明らかになった。これらの結果は、ｍＲＮＡ発現がＦＣによって容易に検出されることを実証するものである。さらに、データは、低頻度の強く刺激された（強い蛍光性の）Ｔ細胞を非刺激集団内の外れ値から区別する指針を与えるものである。受信者動作特性（ＲＯＣ）分析によって、最適な閾値を定義することができる。ＲＯＣ分析は、試験開発の当業者に周知である。例えば、Ｚｗｅｉｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（８）：５６１−５７７およびＰｅｐｅ，２００３，Ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｏｘｆｏｒｄを参照されたい。

【0052】

Ｔ細胞活性化の転写サインの検出において難題は２つあり、細胞の小さなサブセットのみが誘導されること、およびこの誘導された細胞はｍＲＮＡのコピーを細胞あたりわずか数個のみ発現することである。実施例７で説明する実験において、本発明者らは、低頻度の応答の高感度検出と、いくつかのｍＲＮＡ標的の同時検出の両方を本発明の方法により実証することができた。刺激、固定された細胞のプロービング、およびＦＣを含むアッセイにより、ＩＬ−２／ＴＮＦαおよびＩＦＮγ／ＴＮＦαサイトカインペアをそれぞれ頻度３．３５％および６．３７％で発現させる細胞が検出される一方で、ＩＬ−２／ＩＦＮγペアを頻度３．４６％で発現させる細胞を検出することができた（図２、右下枠）。単一のサイトカインおよび二重のサイトカイン集団、例えば、ＩＦＮγ（４．７６〜５．４０％）とＩＬ−２／ＩＦＮγ（３．４６％）の比較は、すべてのＩＦＮγ産生株がＩＬ−２を産生できたわけではないことを示唆した。一方、大部分のＩＦＮγ産生株（５．４０％）は、ＩＦＮγ／ＴＮＦα産生集団のサイズ（６．３７％）により示唆される通り、ＴＮＦαも発現したようである。この結果は、ＴＣＲトリガリングおよびレクチン媒介刺激（抗ＣＤ３ ｍＡｂおよびフィトヘマグルチニン）の併用により非特異的に活性化されたＴ細胞の集団に予想される。したがって、本発明に記載のアッセイにより、既知のＴ細胞生物学と一致する結果が得られた。

【0053】

実施例８に示す通り、本発明による方法をｅｘ ｖｉｖｏで刺激された結核菌特異的な細胞の検出に適用した。ＰＢＭＣを、ＥＳＡＴ６由来およびＣＦＰ１０由来ペプチドの混合物（Ｔ−ＳＰＯＴ．ＴＢ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ、英国）を５μｇ／ｍｌで用いて５時間インキュベートした。図３に示す通り、Ａｇ特異的なＴ細胞内でサイトカインｍＲＮＡを発現させる細胞は、この刺激の後、２倍にまで増加した。したがって、抗ＣＤ２８ ｍＡｂによってもたらされる共刺激がない状態でも、アッセイはこのＬＴＢＩドナー中に存在する低頻度の循環している結核菌特異的なＴ細胞を検出した。この結果は、本発明によるアッセイの有用性を実証するものである。

【0054】

実施例９では、実施例８と比較してシグナルを増大させた本発明に記載の方法を説明している。ｍＡｂによるＴＣＲのＣＤ２８共受容体の会合を利用して、Ａｇ特異的なＴ細胞に優位な刺激を与えた。実施例８に示す通り、ＰＢＭＣを、ＥＳＡＴ６由来およびＣＦＰ１０由来ペプチドの混合物（Ｔ−ＳＰＯＴ．ＴＢ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ、英国）を５μｇ／ｍｌで用いて５時間インキュベートしたが、今回は、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ ５３Ｄ１０存在下または非存在下で行った。固定および洗浄した細胞を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、陰性対照）またはＩＦＮγに特異的なＣｙ５標識ＤＮＡプローブを用いてインキュベートし、次いでＦＣにより解析した。サイトカイン産生株の頻度を図４に示す。２倍を超えるＩＦＮγ ｍＲＮＡの発現の増加が、抗ＣＤ２８ ｍＡｂの存在下、ＬＴＢＩドナーのＡｇ特異的なＴ細胞内で起きた。対照ＧＦＰおよびＨＩＶ−１ ＧＡＧプローブを用いた非特異的なハイブリダイゼーションは、ＣＤ２８共刺激によって影響されなかった。実施例９は、シグナルを増幅するための、すなわち同族のＡｇが特異的に会合したＴＣＲに共刺激シグナルを与えることによる特異な方策を示している。さらに、抗ＣＤ２８ ｍＡｂによって媒介された共刺激は対照プローブ（ＧＦＰおよびＨＩＶ−１ ＧＡＧ）の非特異的な結合に影響を与えなかったため、共刺激は特異的なシグナルの強度を増大させてバックグラウンドノイズを上回るようにするために用いることができる。

【0055】

いくつかの方策は、本発明によるアッセイの最適化に特に役立つ。これらは、以下を含む。

【0056】

ｉ）シグナル検出の動態 各ＲＮＡ標的（例えばサイトカインＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαのｍＲＮＡ）に関するｍＲＮＡ分析物の発現の動態は、１つまたは複数の適切な誘導因子（例えば実施例８に記載のＡｇの混合物（例えば５μｇ／ｍｌで存在するＥＳＡＴ６由来およびＣＦＰ１０由来ペプチド（Ｔ−ＳＰＯＴ．ＴＢ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ、英国））を用いて刺激された、与えられた源（例えばＬＴＢＩ＋およびＬＴＢＩ−ドナーの血液サンプルから得られるフィコール分離ＰＢＭＣ）の細胞を用いて決定される。次いで、各サイトカインの発現は、Ａｇ刺激ＰＢＭＣ中で様々な時間（例えば３０分、２、４、８、１２および１６時間）で別々に試験される。特にサイトカインに関して、抗ＣＤ３ ｍＡｂおよびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を用いて非特異的に刺激されたＰＢＭＣは、刺激の陽性対照としての役目を果たす。特異的なＰＢＭＣ応答の解析のためのアッセイにおいて、非特異的な応答を測定するための好ましい方法では、特異的な応答が測定される条件によって影響されないこと、および影響されることが分かっている人を含む集団からのＰＢＭＣを利用および比較する。

【0057】

ｉｉ）用量反応 Ａｇ刺激に対する用量反応は、最適なシグナル検出の時点でＥＳＡＴ６とＣＦＰ１０のペプチド混合物の濃度を変える（１〜２０μｇ／ｍｌ）ことによって（例えば３つのサイトカインそれぞれについて）同様に求めることができる。さらに、任意のドナーからのＰＢＭＣの非特異的な刺激（抗ＣＤ３＋ＰＨＡ）は、様々な濃度を別々におよび組み合わせて試験することによって最適化し、特定のアッセイの標準的な陽性対照を提供することができる。特異的なＰＢＭＣ応答の解析のためのアッセイにおいて、非特異的な応答を測定するための好ましい方法では、特異的な応答が測定される条件によって影響されないおよび影響されることが分かっている人を含む集団からのＰＢＭＣを利用および比較する。

【0058】

ｉｉｉ）シグナル対ノイズ増幅 より非常に強力なフルオロフォアを備えたプローブセットを設計することができる。この目標もいくつかの改善の方策によって実現されるであろう。さらに、プローブ標識法は先に説明の通り変更することができる。ハイブリダイゼーションの厳密性は、シグナル／ノイズ比を向上させるために経験的に最適化することができる。

【0059】

シグナルを増幅するための特異な方策は、実施例９に関連して説明した通り、同族のＡｇが特異的に会合したＴＣＲに共刺激シグナルを与えることによる。共刺激のための条件は、上で概説した通り、本明細書に記述されるアッセイによって、動態および用量反応に対して最適化して、複数のＲＮＡ（例えば、３つのサイトカイン）の頑強な検出を実現することができる。

【0060】

ｉｖ）閾値の決定 特定のアッセイにおいて臨床的に許容される閾値は商業的アッセイ開発の最終時点で決定できるが、ＲＮＡ検出のための閾値の初期評価は最適化されたアッセイの標準化に役立つことができる。研究段階において、ドナーから得られ、かつｅｘ ｖｉｖｏで刺激されたＡｇ特異的なＴ細胞内でのＲＮＡ検出（サイトカインの発現）の閾値を評価することができる。Ａｇ特異的な応答は、無刺激のＰＢＭＣからのシグナルを、最適な時間およびＡｇ用量でＡｇ刺激ＰＢＭＣを用いて得られた値から差し引くことによって計算することができる。各サイトカイン読み取り値について、ＲＯＣ（受信者動作特性）曲線は、様々な切点（ドナーの平均に標準偏差の２倍を加えた値を含む）において感度と特異性の間の妥協点を示すと推定され、また、最適な閾値はＡｇ特異的な応答を特定するために選択される。

【0061】

ｖ）血液量および処理時間の低減 現在、平均で０．８ｍｌの血液に相当する２×１０^６細胞／パラメータ（例えば各サイトカイン）が解析される。ＰＢＭＣ調製におけるフィコール分離の代わりに、全血の赤血球溶解を導入することによって、また、遠心分離の代わりに真空駆動遠沈（vacuum-driven sedimentation）（９６ウェルフォーマット）などの血液処理の改変をさらに加えることによって、サンプル量を少なくし、またアッセイ時間を短縮することができる。予備実験では、シグナルを大幅に損失することなくハイブリダイゼーションの時間を２時間にまで短縮できることが示されている。

【0062】

アッセイ開発は従来の方法により進めることができる。例えば、３つのドナーグループ（活性ＴＢ、ＬＴＢＩ、および非感染の対照）由来のＰＢＭＣは、実施例４に記載の通り、ＥＳＡＴ６およびＣＦＰ１０ペプチドを負荷したＨＬＡ−Ａ２ベースおよびＨＬＡ−ＤＲ４ベースのａＡＰＣを用いて刺激することができる。各アッセイは、解析に４色のＦＣを用いて、表１に示す遺伝子を含むがこれらに限定されないグループから選ばれる刺激（発現特性に基づいて一緒に試験される）に対する応答の４マーカーのパネルを試験することができる。これにより、すべての標的を各ドナーについて評価することが可能になる。初期の試験において選定されたマーカーは、各グループにおいて同様のレベルで発現される遺伝子をまとめるよう選ばれた組み合わせで再試験することができる。統計解析は、実施例４に記載されている通り実施することができる。所望であれば、従来のＡＰＣ刺激によって誘導される標的の発現を測定して、単細胞内の複数の分析物に対する検出感度を改善できるａＡＰＣの能力を確認することもできる。さらに、アッセイは蛍光顕微鏡により試験することもできる。統計解析は、実施例５に記載されている通り実施することができる。

【0063】

実施例１０に記載されている実験では、Ｔ細胞内におけるサイトカインｍＲＮＡ発現の検出に用いられる「ＦＩＳＨ−ｆｌｏｗ」と呼ばれる同じ手法が、初代マクロファージを含むがこれに限定されない他のタイプの細胞においてうまく利用することができることが実証されている。さらに、この実験では、異なる時間に単一の遺伝子の発現を監視することによって、初代マクロファージ内において異なる刺激に対する応答を区別することができることが実証されている。

【0064】

図５に示す結果は、ＧＦＰ陰性対照によって評価されるバックグラウンド発現が、一定のままであったが無視できることを示している（ゲーティングされた細胞の約０．１〜０．２％）。リポ多糖（ＬＰＳ）およびＩＦＮγまたはＮ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−プロピル］−（Ｒ）−システイニル−（リシル）３−リシン（Ｐａｍ_３ＣＳＫ_４）の混合物を用いた処置は、これらの培養されたマクロファージ内で、陽性であるすべての細胞の６〜４２％のレベルまでＴＮＦα転写物の発現を容易に誘導した。ＴＮＦα転写物の頑強な発現が、活性化マクロファージ内で予想され、またＩＦＮγ ｍＲＮＡの中程度（２％未満）の発現とは対照的であった。ＩＦＮγ ｍＲＮＡの発現は、刺激の選択および／または刺激の長さによって影響されなかったため、実際の発現プロファイルではなく、これらの細胞における異常に高いバックグラウンドを反映する可能性がある。ＬＰＳおよびＩＦＮγによって誘導されるＴＮＦα ｍＲＮＡ発現の動態は、Ｐａｍ_３ＣＳＫ_４によって誘導されるものとは異なるように見受けられ、前者の刺激は、持続的で長いｍＲＮＡレベルの上昇につながる。一方、Ｐａｍ_３ＣＳＫ_４による同じｍＲＮＡの刺激は、持続性がはるかに及ばないものであった。

【0065】

実施例１１では、記載したｍＲＮＡに特異的なＦＩＳＨプローブを用いて（図６Ａ）、またはそれらのタンパク質産物を認識するｍＡｂを用いて（図６Ｂ）得られたフローサイトメトリーの結果を比較して、Ｔ細胞活性化のマーカーであるサイトカイン、ケモカイン、およびケモカイン受容体に関する遺伝子発現の経時的なプロファイルの識別を、刺激されたヒトＴ細胞内で実証している。ＦＩＳＨ−Ｆｌｏｗ（図６Ａ）によるサイトカイン産生株の頻度は、非刺激の細胞内でのＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＣＣＬ３、ＣＣＲ７およびｃＦｏｓ ｍＲＮＡの発現が、ゲーティングされる細胞の１％未満で発生しており、無視できる（対照ＧＦＰ、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＣＣＲ７）か、または非常に小さい（ＴＮＦα、ＣＣＬ３、およびｃＦｏｓ）かのいずれかであることを示した。予想外なことに、誘導されたこれらのｍＲＮＡの発現は、刺激の２時間後にピークに達し、次いで１日から３日の時点を通じて低下するようである。このことは、同じ細胞を（１μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡの存在下で）用いて従来のｍＡｂ免疫染色法およびフローサイトメトリーにより得られるパラレルデータとは対照的である。ここで、非刺激の細胞は、陰性対照のアイソタイプマッチ（Ｉｓｏ）ｍＡｂと比べて、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαなどの少なくとも一部のマーカーに対して検出された基礎レベル（１〜３％）のタンパク質発現を明確に示している。さらに、すべての標的は、２時間で誘導され、試験される３日間は高い状態で保持される。したがって、特異な経時的プロファイルはサイトカインに結合するｍＡｂを用いて検出されなかった。実施例１１では、従来のｍＡｂ染色法およびフローサイトメトリーに対して、ＦＩＳＨ−Ｆｌｏｗを用いて優れたプロファイル識別をもたらす動態の違いが実証されており、ＦＩＳＨ−Ｆｌｏｗが活性化検出感度の大幅な向上を提供することを示唆している。

【0066】

任意の細胞タイプの機能性サイン（すなわち、特殊な生物学的機能を遂行できる能力）を完全に定義するためには、活性化細胞と非活性化（非応答）細胞におけるすべての他のｍＲＮＡの発現を知ることが重要であることがある。実施例１２において報告される検討では、ＦＩＳＨ−Ｆｌｏｗにより刺激に応答して１つまたは複数の標的を発現する細胞の標識が可能になること、およびこのような応答物はその遺伝子発現プロファイルを調べる目的で細胞集団全体から単離できることが実証されている。

【0067】

刺激されたヒトＴ細胞は、ＧＦＰに特異的なＲＮＡに相補的なＣｙ５標識ＤＮＡプローブと共にインキュベートして対照としてＦＣにより解析するか、またはＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＣＣＬ３ ｍＲＮＡに対して反応性を有しＣｙ５単独で標識されているＦＩＳＨプローブセットの混合物（表３）と共にインキュベートした。ＧＦＰプローブを用いて得られた結果を図７Ａに示す。プローブ混合物を用いて得られた結果を図７Ｂに示す。リンパ球集団のゲーティング（各図の左枠）の後、保守的な追加ゲーティングを適用して、解析したリンパ球をＩＦＮγ発現細胞（ＩＦＮ＋）と非発現細胞（ＩＦＮ−）とを区別しうる２つの異なる集団（各図の右枠）に分けた。ＧＦＰプローブされた細胞（図７Ａ）のゲーティング設定により２つの集団が定義され、解析したリンパ球すべてのうち、０．１％がＩＦＮ＋集団中、７１．２％がＩＦＮ−集団中であった。ＩＬ−２：ＩＦＮγ：ＴＮＦα：ＣＣＬ３プローブされた細胞（図７Ｂ）では、同じゲーティングを用いて、１０．２％がＩＦＮ＋、３３．７％がＩＦＮ−であった。後者のＦＩＳＨプローブされた細胞（図７Ｂ）は、単離した活性化および非応答細胞に対して遺伝子発現解析を実施するために、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）により陽性および陰性の集団に分けた。分取した細胞集団を解析して、特異的なＦＩＳＨプローブに対するそれらの反応性と一致する特異な遺伝子発現プロファイルを示した。ＩＦＮγと「ハウスキーピング」ＧＡＰＤＨ（対照）の２つの遺伝子によってコードされたｍＲＮＡの発現を選び、本発明のこの態様の実施形態を例証した。分取した細胞集団について、２つの遺伝子のうちの１つに特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。増幅産物の定量的な測定は、増幅反応混合物中にＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ色素を含有させることによって行った。図８Ａに示す結果は、ＩＦＮγ特異的なプライマーが、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＣＣＬ３に対するプローブを用いて識別されたＩＦＮ＋細胞内で、これらのプローブで最小限に標識されたＩＦＮ−細胞内よりも、より多数の標的を検出することを実証するものである。活性化状態によって変化しない対照ＧＡＰＤＨシグナルの増幅は、活性化および非応答細胞内の双方において同様であると予想される。活性化細胞内でＧＡＰＤＨ特異的プライマーに見られるわずかに低減した増幅は、この分取した集団が著しく小さいために、産生できたｍＲＮＡがより少なかったことを反映している。

【0068】

これらの結果（サイズ分析により確認、図８Ｂ）は、遺伝子発現が、細胞の分集団の分取および取得のための当業者に周知の方法、ならびにＲＴ−ＰＣＲまたはトランスクリプトーム解析などの遺伝子発現測定のための方法を適用することによって、本発明のＦＩＳＨ−Ｆｌｏｗプラットホームを用いて識別された細胞の所望の亜集団においてさらに解析されてもよいことを実証するものである。識別および調査することができる亜集団は、１つの細胞、または１つを超える細胞（１０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、またはさらに多い細胞を含むがこれらに限定されない）を含んでもよい。

【実施例】

【0069】

（実施例１）誘導およびプローブセットの実証
この実施例は、ＲＮＡ（この場合、ｍＲＮＡ）を産生する細胞の人工刺激の使用、および発現ＲＮＡにハイブリダイズする単独標識蛍光プローブのセットの使用を実証するものである。

【0070】

この実施例では、ｓｍＦＩＳＨの技術を用いて、プローブに結合したｍＲＮＡの個々の分子に対応する点を可視化した。Ｒａｊ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７２：３６５−３８６およびＲａｊ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５：８７７−８７９を参照されたい。プローブのハイブリダイゼーション条件および細胞の洗浄条件は、これらの参考文献に記載されている。手順は、１つの重要な方法において異なっている。洗浄ステップにおける細胞の損失を避けるため、０．５％ウシ胎児血清を洗浄溶液に含有させた。１セットの核酸プローブ（この場合、ＤＮＡプローブ）を、活性化Ｔ細胞およびマクロファージの解析のために重要な標的であるＴＮＦα ｍＲＮＡのために選定し、さらに、照射された結核菌で刺激された分化ＴＨＰ−１細胞を試験した。さらに含まれていたのは、異なる色のフルオロフォアで標識され、かつＡＣＳＬ１ ｍＲＮＡ（脂質代謝遺伝子）に結合するよう設計された第２のセットのＤＮＡプローブであった。後者の遺伝子も、刺激物によって誘導されることが予想された。ヒトＴＮＦαに特異的なプローブセットは、それぞれ約２０ヌクレオチド長で、かつテトラメチルローダミンフルオロフォアで末端標識した４８のプローブを含んでいた。ヒトＡＣＳＬ１遺伝子に特異的なプローブセットは、それぞれ約２０ヌクレオチド長で、かつ光学的に区別可能なフルオロフォア、すなわちＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５９４で標識された４８のプローブを含んでいた。プローブの配列は、本説明の最後に記載した配列一覧に記載されている（表３）。各セットに一覧にしたプローブは、標的ｍＲＮＡの検出に適しているが、Ｒａｊ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７２：３６５−３８６およびＲａｊ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５：８７７−８７９に記載されている、標的ＲＮＡの異なる領域から選択される代替のプローブも用いることができる。前述の通り、前記細胞内の両方のｍＲＮＡに対応する点を検出した。ＴＮＦα ＲＮＡ分子の数は、誘導なしで細胞あたり０．２４から、刺激後に平均で細胞あたり１４に増加した。

【0071】

（実施例２）遺伝子を発現する細胞を検出するためのＦＣの使用
この実験では、アッセイを実施して、レンチウイルスコンストラクトを発現させる細胞培養液内のＨＩＶ ＧＡＧ ｍＲＮＡを検出した。

【0072】

簡潔には、２９３Ｔ細胞を、組換えレンチウイルスコンストラクトを一緒に発現させる３つのプラスミドを用いてトランスフェクトし、また、ＨＩＶ ｍＲＮＡのＧＡＧ領域に特異的なプローブを用いてハイブリダイズした（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＹ８３５７７１．１）。プローブの配列は、本明細書の最後に記載する（表３）。プローブをハイブリダイズして、Ｒａｊ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７２：３６５−３８６およびＲａｊ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５：８７７−８７９（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の手順にしたがって細胞を洗浄した。再び、洗浄ステップにおける細胞の損失を避けるため、０．５％ウシ胎児血清を洗浄溶液に含有させた。次いで、ＦＣを実施して、コンストラクトを発現させる細胞を検出した。ゲートは、トランスフェクトされていない細胞の蛍光に基づいて確立した。トランスフェクトした細胞のうち、約２５％の細胞が、ゲートにより設定されたレベルよりも強度が高いシグナルによって示されるコンストラクトを発現した。ＦＣの結果は、蛍光強度（「ａ．ｕ．」）と前方散乱（「ＦＳＣ−Ａ」）の２つのグラフを示した図１に示している。上側のグラフ（レンチウイルス−）は、トランスフェクトされていない細胞を示している。下側のグラフ（レンチウイルス＋）は、レンチウイルスパッケージングシステムからの３つのプラスミドを用いてトランスフェクトした細胞を示している。

【0073】

（実施例３）Ｍ−ＴＢ由来ペプチドにより刺激されたサイトカイン遺伝子発現の検出
ＰＢＭＣは、非感染性の無症候性潜伏感染（ＬＴＢＩ）ドナーおよび活性のあるＴＢドナーから得られる。Ｔ細胞は、免疫優性マイコバクテリア性ＡｇのＲｖ３８７５（ＥＳＡＴ６）およびＲｖ３８７４（ＣＦＰ１０）由来のＴ−ＳＰＯＴ．ＴＢ ＩＦＮγ放出アッセイ（ＩＧＲＡ）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ、マサチューセッツ州マールボロ）内で用いられるペプチド混合物を、製造元の指示にしたがって添加することによって活性化される。様々な時間（４〜１２０時間）で、刺激された細胞は固定および透過処理され、次いで、以下で説明する１つ以上のプローブセットを用いてハイブリダイズされる。標的を発現する細胞の頻度を求めるために、細胞は、プローブを標識するために用いられるフルオロフォアの間で区別する利用可能なフィルターセットを個々におよび組み合わせて用いて、ＦＣにより解析される。

【0074】

ＴＮＦαに対するプローブセットは、実施例１において指定したプローブセットである。２つの付加的なプローブセットが、１つはＩＬ−２のために、１つはＩＦＮγのために調製され、それぞれ５０のプローブを有する（Ｅｎｓｅｍｂｌ配列ＩＤは、それぞれＥＮＳＴ０００００２２６７３０およびＥＮＳＴ０００００２２９１３５）。３つのセットすべてのプローブは、直鎖状（ランダムコイル）のオリゴヌクレオチド（１５〜２５ヌクレオチド長）で、単一のフルオロフォアで標識されている。３つのセットに用いられる３つのフルオロフォアは、光学的に区別可能である。これら３つのサイトカイン遺伝子は、Ｔ細胞サブタイプを区別するＴ細胞の活性化および増殖のための既知のマーカーである。標的転写物は十分に長く、それぞれ少なくとも５０のプローブの使用が可能になる。

【0075】

ごく一部（≦０．０１％）の細胞内でマーカーの発現をＦＣにより検出するため、１×１０^６の現象の結果が収集される。ドナーグループ間の差における統計学的有意性を判定するため、非応答性細胞を応答性細胞から分ける閾値はＲＯＣ分析によって求められ（例えばＺｗｅｉｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（８）：５６１−５７７およびＰｅｐｅ，２００３，Ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｏｘｆｏｒｄを参照）、陽性細胞の頻度が判定される。混合モデルＡＮＯＶＡを用いてデータを解析することができる。データは解析に先立ち変換される（例えば対数変換）。ＡＮＯＶＡの仮説を扱うのに単純な変換では不十分な場合は、統計学的手法のノンパラメトリックアナログが適用される。

【0076】

３つのマーカーすべてに関する発現の検出可能な頻度が活性化細胞内で明らかになっている。マーカーの異なる組み合わせを発現する細胞の頻度は疾患のサインである。

【0077】

（実施例４）結核菌特異的エフェクターＴ細胞向けアッセイ
この実施例では、結核菌特異的なエフェクターＴ細胞を検出するためのアッセイについて説明する。

【0078】

ａ．ＣＤ８＋Ｔエフェクターの検出 ＴＢ患者は、対立遺伝子特異的なｍＡｂ ＢＢ７．２および０２２２を用いて免疫染色されたＰＢＭＣのＦＣ検出により、またはＰＣＲ確認によりＨＬＡ分類される。ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１ベースのａＡＰＣは、Ｒｖ１８８６ｃ、Ｒｖ３８７４、およびＲｖ３８７５由来の個々の既知のＨＬＡ−Ａ^＊０２０１エピトープ（ペプチド）を負荷している。

【0079】

これらのペプチドは、結核菌の免疫優性Ａｇ由来である。ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２に分類されたＴＢ患者から単離され、また、Ａ２ベースのＡｇ負荷ａＡＰＣを１：１の比率で用い、標準的な培養条件下で刺激される。あるいは、単離されたＰＢＭＣは、内在性ＡＰＣによるＴ細胞刺激のために、添加されたペプチドと共にインキュベートされる。４〜１２０時間の様々な時間で、細胞は固定および透過処理され、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαについて特異的プローブと共にインキュベートされる。陰性対照には、上記のＡｇ負荷ａＡＰＣで刺激された健康で非感染の（ＩＧＲＡ陰性）ドナーからのＰＢＭＣ、ならびに無関係なメラノーマ特異的Ｍａｒｔ１ペプチド（２６〜３５エピトープ）および分化Ａｇ ｇｐ１００ペプチド（４４〜５９エピトープ）を負荷したａＡＰＣで刺激された陽性ドナーからのＰＢＭＣが含まれる。陽性対照には抗ＣＤ３ ｍＡｂ＋ＰＨＡで非特異的に刺激されたＰＢＭＣが含まれる。

【0080】

ｂ．ＣＤ４＋Ｔエフェクターの検出 まず、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１ベースのａＡＰＣを構築するための上述の手法を用いて、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４ベースのａＡＰＣが作成される。この手法の主要な態様は、生合成の間にクラスＩＩａおよびｂのポリペプチドの対形成を必要とする、ＨＬＡ−ＤＲ４分子の可溶型の発現である。ＭＨＣクラスＩＩ分子の可溶な類似体のサブユニット対形成を容易にするために、ＩｇＧ分子が分子足場として用いられるが、これは二価であり、多種多様なタンパク質ドメインに適応するように容易に改変することができる。改変したａ鎖およびｂ鎖は、デュアルプロモーターのバキュロウイルス発現ベクター内でクローン化される。このベクターに感染した細胞は、約０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌの可溶なＨＬＡ−ＤＲ４−Ｉｇ様物質を分泌する。一般的なクローニングベクターｐＺｉｇを用いて可溶なＭＨＣクラスＩＩのＨＬＡ−ＤＲ４−Ｉｇ複合体を構築するため、ＤＲ４タンパク質のα鎖およびβ鎖のクラスＩＩ細胞外ドメインをコードするＤＮＡは、エンドヌクレアーゼ制限部位を用いてＩｇの重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡに連結される。また、キメラは、改変したｐＡｃＵＷ５１ベクターに順次連結される。分泌されるタンパク質の収量、純度および完全性は、ＨＬＡ−ＤＲ４特異的なｍＡｂ ０２２２ＨＡ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ）を用いた生化学的解析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法）により確認される。精製された可溶なＨＬＡ−ＤＲ４−Ｉｇタンパク質および抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（１：１の比率）は、磁気ビーズ（Ｍ−４５０ Ｅｐｏｘｙ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｄｙｎａｌ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合される。

【0081】

Ｒｖ１８８６ｃ、Ｒｖ３８７４、およびＲｖ３８７５由来で、かつＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４対立遺伝子によって制限される既知のペプチド（表１）は、ＨＬＡ−ＤＲ４ベースのａＡＰＣ上に負荷され、非感染、ＬＴＢＩおよび活性ＴＢのドナー由来のＰＢＭＣを刺激するために用いられる。あるいは、単離されたＰＢＭＣは、内在性ＡＰＣによるＴ細胞刺激のために、加えられたペプチドを用いてインキュベートされる。４〜７２時間の様々な時間の刺激の後、細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦα ｍＲＮＡについてプローブ検査を行い、ＦＣにより解析される。陰性および陽性対照は、ＣＤ８＋Ｔ細胞について上記で説明した通りである。

【0082】

【表1】

【0083】

実施例３に記載されている統計解析の方法がこれらの結果に適用される。この実施例における複数の刺激アプローチも、比較のために混合モデルＡＮＯＶＡを必要とする。

【0084】

前述の試験では、対立遺伝子特異的なＨＬＡクラスＩ拘束性またはクラスＩＩ拘束性ペプチドを用いた刺激に基づいて、ＴＢ患者の血液中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の両方を検出することができる。Ｒｖ１８８６ｃ、Ｒｖ３８７４、およびＲｖ３８７５のＡｇを認識し、かつ少なくとも単一のサイトカイン、ＩＦＮγまたはＴＮＦαを産生することができる活性化エフェクターＴ細胞は、容易に検出可能である。２つのサイトカイン（ＩＬ−２＋ＩＦＮγ＋およびＩＬ−２＋ＴＮＦα＋）の同時産生は、活性ＴＢ患者の血液中においてエフェクターの大部分を占める最終分化したＴ細胞内では頻度が低い。

【0085】

（実施例５）感染段階特異的Ａｇによって誘発される単一のＴ細胞サイトカインプロファイル
活性ＴＢ、ＬＴＢＩ、および非感染のドナーからのＰＢＭＣは、Ｒｖ１８８６ｃ（活性のあるＴＢ段階）ならびにＲｖ１９８６、Ｒｖ２６５９ｃ、およびＲｖ３４０７（ＬＴＢＩ段階）由来のペプチド混合物を負荷したＨＬＡ−Ａ２ベースおよびＨＬＡ−ＤＲ４ベースのａＡＰＣを用いて、様々な時間（４〜１２０時間）で刺激される。あるいは、単離されたＰＢＭＣは、内在性ＡＰＣによるＴ細胞刺激のために加えられたペプチドを用いてインキュベートされる。読み取り値は、３つのセットの約５０の単独標識蛍光プローブおよび発現細胞の数のＦＣ検出を用いた、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαの発現である。疾患状態を区別する可能性のあるＡｇ候補を識別するために、一元配置ＡＮＯＶＡを用い、カットオフ値として大きなｐ値（ｐ＝０．２５）を用いた。選択したＡｇを用い、多重または累積ロジスティック回帰などのロジスティック回帰の一般化を利用して、ドナーグループを区別する応答のモデルを構築する。

【0086】

Ｒｖ１８８６ｃを用いた刺激は、特徴的な感染段階に関連するＴ細胞サイトカインプロファイルをもたらす：ＴＢ患者では単一、二重、および三重の産生株、ＬＴＢＩ患者では大部分がＩＬ−２産生株である。

【0087】

（実施例６）単一のＴ細胞内における感染段階に関連する機能性エフェクターおよびメモリーサインの識別
ＴＣＲ活性化によって誘導可能な機能性マーカーは、主たる機能性Ｔ細胞サブセットを正確に記述できるように、本発明の方法によって測定することができる。このアッセイのために、ＴＣＲの会合後、４〜６時間以内に誘導可能な候補マーカー、および／または成熟段階および既知のＴ細胞サブセットの機能を反映する遺伝子を選定した。エフェクター、エフェクターメモリー、およびセントラルメモリーＴ細胞内で発現する活性化および機能性マーカーの得られるパネル（表２）は、これらの考慮すべき事項を満たす。表２のデータは、Ｍａｋ ＴＷ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ ＭＥ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；２００６．ｐ．３７３−４０１のＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ ＲＭ．Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、およびＭａｋ ＴＷ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ ＭＥ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；２００６．ｐ．４０３−４３２のＤｏｈｅｒｔｙ Ｐ．Ｔ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ならびにこれらの参考文献からまとめたものであった。

【0088】

【表2】

【0089】

ＴＣＲを介した刺激およびＣＤ２８を介した共刺激を与えるための（実施例３または４に記載の）ペプチドを負荷したａＡＰＣの使用、あるいは、内在性ＡＰＣによる刺激のための（実施例３または４に記載の）ペプチドを組み合わせた抗ＣＤ２８ ｍＡｂの使用は、重要なケモカインおよびサイトカイン（ＭＩＰ−１α、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαを含むがこれらに限定されない）ならびに他の共刺激分子（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７を含むがこれらに限定されない）の発現を迅速に増加させ、それがさらに応答性を高める。ポジティブフィードバックは、検出に用いられる時間枠内で応答を増大させ、また多重パラメータの解析におけるＦＣの結果の感度を高める。選択したマーカーの組み合わせは、ドナーグループの末梢血中での個々のエフェクター細胞およびメモリー細胞の再現性のある識別および特徴付け、ならびにそれらの定量分析が可能になるように選ばれる。これらのマーカーは、Ｔ細胞機能性サインとして役目を果たす。識別されるサインが臨床の場で汎用される機器を用いた解析に適するように、４色のＦＣが用いられる。

【0090】

高いドナー再現性が、ＥＳＡＴ６とＣＦＰ１０のペプチドの市販の混合物、およびＨＬＡ−Ａ２ベースまたはＨＬＡ−ＤＲ４ベースのａＡＰＣで刺激されたＰＢＭＣを用いて得られたデータで明らかになっている。このペプチド混合物を用いて得られたデータは、内在性ＡＰＣに基づく従来のＩＧＲＡを用いた場合に非常に正確である。ａＡＰＣによってもたらされる頑強な刺激は、標準的なサイトカイン標的に関して上述の通り、複数の標的の誘導にも適用される。複数のマーカーを発現させる細胞も、従来のＡＰＣ刺激の場合よりも高い頻度で検出される。この実施例の方法により、感染（この場合、ＴＢ感染）の様々な段階で存在する特異なＴ細胞のサインとして役目を果たすマーカーセットの識別が可能になる。

【0091】

（実施例７）刺激したＰＢＭＣ中の２つのサイトカインｍＲＮＡの同時検出
この実施例は、蛍光細胞の非常に小さな集団の検出が可能であることを示している。簡潔には、ＣＦＳＥ標識ＰＭＢＣをＭＩＴＯＴＲＡＣＫＥＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）標識ＰＢＭＣ中に連続的に希釈した。アッセイは０．００１３％の頻度の前者を検出でき、十分な感度を実証するものであることが判明した。

【0092】

ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦα ｍＲＮＡの検出を実証するために、抗ＣＤ３ ｍＡｂおよびこれらの細胞内で様々なサイトカインの発現を誘導することが知られているＰＨＡを用いて、ＴＣＲを介してＰＢＭＣを非特異的に刺激した。刺激後、細胞を固定して、ＩＬ−２とＩＦＮγ、ＩＬ−２とＴＮＦα、さらにＩＦＮγとＴＮＦαに対するプローブセットのペアの組み合わせを用いてプローブ検査した。各ペアのプローブセットの１つをＣｙ５フルオロフォアで標識し、もう１つはＴＭＲフルオロフォアで標識した。具体的には、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３ ｍＡｂ ＯＫＴ３およびＰＨＡ（いずれも１ｍｇ／ｍｌ）で５日間刺激し、次いで４％パラホルムアルデヒドおよび７０％エタノールを用いて固定した。固定および洗浄した細胞を、ＩＬ−２およびＩＦＮγに特異的なＣｙ５標識またはＴＭＲ標識ＲＮＡプローブを用いてインキュベートすることにより標識し、再び洗浄して、２色のＦＣ（ＬＳＲＩＩ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により解析した。結果を図２に示す。図２の４つのプロットは、左上、右上、左下、右下の順に、未染色／偽ハイブリダイズ対照；単一のサイトカイン、ＩＦＮγ−Ｃｙ５標識細胞；単一のサイトカイン、ＩＦＮγ−ＴＭＲ標識細胞；および二重のサイトカイン（ＩＬ−２、Ｃｙ５標識およびＩＦＮγ、ＴＭＲ標識）標識細胞である。ゲーティングは、１つまたは２つのサイトカインを発現させる細胞集団およびそれらの頻度を示している。

【0093】

（実施例８）ｅｘ ｖｉｖｏで刺激された結核菌特異的な細胞内におけるサイトカインｍＲＮＡの検出
この実施例において、ｅｘ ｖｉｖｏで刺激された結核菌特異的な細胞を検出するために本発明に記載の方法を適用した。循環している結核菌特異的な細胞は、通常、潜伏ＴＢ感染（ＬＴＢＩ）の個人に低頻度で存在する。ＬＴＢＩドナーからの血液を得て、結核菌Ａｇ ＥＳＡＴ６およびＣＦＰ１０（Ｔ−ＳＰＯＴ．ＴＢ試験で一般に用いられる）由来のペプチドの混合物を用いて５時間刺激した。ＰＢＭＣを、培地のみで、または５μｇ／ｍｌのＥＳＡＴ６由来およびＣＦＰ１０由来ペプチドの混合物（Ｔ−ＳＰＯＴ．ＴＢ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ、英国）と共に５時間インキュベートした。固定および洗浄した細胞を、陰性対照としてＧＦＰに特異的な、またはＩＬ−２およびＴＮＦαに特異的なＲＮＡと相補的なＣｙ５標識ＤＮＡプローブを用いてインキュベートし、次いでＦＣにより解析した。サイトカイン産生株の頻度を図３に示す。ここで、上段の３つのプロットは、培地のみでインキュベートしたＰＢＭＣの頻度、下段の３つのプロットは、Ａｇ混合物を含む培地でインキュベートしたＰＢＭＣの頻度である。

【0094】

（実施例９）ＬＴＢＩドナーの共刺激されたＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ検出
ＰＢＭＣを、ＥＳＡＴ６由来およびＣＦＰ１０由来ペプチドの混合物（Ｔ−ＳＰＯＴ．ＴＢ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ、英国）を５μｇ／ｍｌで用い、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ ５３Ｄ１０存在下または非存在下で５時間インキュベートした。固定および洗浄した細胞を、ＧＦＰ ｍＲＮＡ（ＧＦＰ、陰性対照）（ＧＦＰ配列はｐＴＲＥｄ２ＥＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を指す）、またはＩＦＮγ ｍＲＮＡに特異的なＣｙ５標識ＤＮＡプローブを用いてインキュベートし、次いでＦＣにより解析した。サイトカイン産生株の頻度を図４に示す。対照ＧＦＰの非特異的な染色は、ＣＤ２８共刺激によって影響されなかった。

【0095】

（実施例１０）活性化マクロファージにおけるサイトカイン誘導
この実施例は、非Ｔ細胞、この場合はプラスチックへの密着により末梢血から得て標準的な条件（１０％ウシ胎児血清および抗生物質を補充したＲＰＭＩ １６４０培地）下で２週間培養したヒトマクロファージの人工刺激の使用を説明するものである。

【0096】

簡潔には、活性化は、リポ多糖（ＬＰＳ）（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）またはＮ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−プロピル］−（Ｒ）−システイニル−（リシル）３−リシン（Ｐａｍ_３ＣＳＫ_４）（１００ｎｇ／ｍｌ）の混合物を４時間または１日間用いて実施した。刺激された初代マクロファージを０．２〜０．３％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ中でプラスチックから取り除き、実施例７に記載されている通り、固定および透過処理し、次いでＩＦＮγおよびＴＮＦα ｍＲＮＡに特異的なＦＩＳＨプローブ（表３）を用いてインキュベートし、フローサイトメトリーにより解析した。実施例８に記載の通り、固定および洗浄した細胞を、ＧＦＰに特異的なＲＮＡと相補的なＣｙ５標識ＤＮＡプローブ（表３）を用いてインキュベートし、陰性対照としてＦＣにより解析した。上述（例えば実施例２に記載）のＦＩＳＨ−ｆｌｏｗ解析によりプローブを用いて検出された細胞の頻度を図５に示しており、図中、上段はＧＦＰプローブを用いた結果、中段はＩＦＮγプローブ、下段はＴＮＦαプローブの結果である。各段の１列目はＬＰＳおよびＩＦＮγを４時間用いた刺激、２列目はＬＰＳおよびＩＦＮγを１日間用いた刺激、３列目はＰａｍ_３ＣＳＫ_４を４時間用いた刺激、４列目はＰａｍ_３ＣＳＫ_４を１日間用いた刺激である。

【0097】

（実施例１１）活性化Ｔ細胞内におけるサイトカインおよび活性化マーカーの発現動態
この実施例では、フィコール勾配により末梢血から得たヒトＴ細胞の、ＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（３５０ｎｇ／ｍｌ）を用いた刺激に応答した、Ｔ細胞活性化のマーカーであるサイトカイン、ケモカイン、およびケモカイン受容体に関する遺伝子発現の経時的なプロファイルの識別を実証している。さらに具体的には、様々な時間（２時間、１日、３日）の刺激後、細胞を実施例７に記載されている通り固定および透過処理し、次いで、記載したｍＲＮＡに特異的なＦＩＳＨプローブ（表３）またはそれらのタンパク質産物を認識するｍＡｂを用いてインキュベートし、続いてフローサイトメトリー解析を行った。上述（例えば、実施例２に記載）のＦＩＳＨ−ｆｌｏｗ解析によりプローブを用いて検出された細胞の頻度を図６Ａに示しており、図中、上段は刺激なしの結果、それに続く段はそれぞれ、２時間、１日間、３日間の刺激後の結果である。各段の１列目はＧＦＰプローブ使用；２列目はＩＬ−２プローブ使用；３列目はＩＦＮγプローブ使用；４列目はＴＮＦαプローブ使用；５列目はＣＣＬ３プローブ使用；６列目はＣＣＲ７プローブ使用；最後の列はｃＦｏｓプローブ使用の結果である。上段はＧＦＰプローブ、中段はＩＦＮγプローブ、下段はＴＮＦαプローブの結果である。ＦＣによりｍＡｂを用いて検出された細胞の頻度を図６Ｂに示しており、図中、上段は刺激なしの結果、それに続く段はそれぞれ、２時間、１日間、３日間の刺激後の結果である。各段の１列目は、陰性対照のアイソタイプマッチ（Ｉｓｏ）ｍＡｂ使用；２列目はＩＬ−２を認識するｍＡｂ使用；３列目はＩＦＮγを認識するｍＡｂ使用；４列目はＴＮＦαを認識するｍＡｂ使用の結果である。

【0098】

（実施例１２）サイトカイン発現および非発現集団への活性化ＦＩＳＨプローブされたＴ細胞の分離および解析
この実施例では、上記のＦＩＳＨ−Ｆｌｏｗにより刺激に応答して１つまたは複数の標的を発現する細胞の標識が可能になること、およびこのような応答物はその遺伝子発現プロファイルを調べる目的で細胞集団全体から分離できることが実証されている。

【0099】

パートＩ：集団への分離
フィコール勾配により末梢血から得られ、かつＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（３５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて全体的に２時間刺激したヒトＴ細胞は、ＧＦＰに特異的なＲＮＡに相補的なＣｙ５標識ＤＮＡプローブを用いてインキュベートして、対照としてＦＣにより解析するか、または、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＣＣＬ３ ｍＲＮＡに対して反応性を有しＣｙ５単独で標識されている、いくつかのＦＩＳＨプローブセットの混合物（表３）を用いてインキュベートした。上述の、例えば実施例２に記載のＦＩＳＨ−Ｆｌｏｗ解析によりプローブを用いて検出された細胞の頻度を図７Ａおよび図７Ｂに示している。ＧＦＰプローブを用いて得られた結果を図７Ａに示す。プローブ混合物を用いて得られた結果を図７Ｂに示す。ＦＳＣおよびＳＳＣに基づくリンパ球集団のゲーティング（各図の左枠）の後、保守的な追加ゲーティングを適用して、解析したリンパ球を２つの特異な集団（各図の右枠）−サイトカイン陽性（ＩＦＮ＋と表す）および陰性（ＩＦＮ−と表す）に分けた。ＧＦＰプローブされた細胞（図７Ａ）のゲーティング設定により２つの集団が定義され、解析したリンパ球すべてのうち、０．１％がＩＦＮ＋、７１．２％がＩＦＮ−であった。ＩＬ−２：ＩＦＮγ：ＴＮＦα：ＣＣＬ３プローブされた（図７Ｂ）集団では、同じゲーティングを用いて、１０．２％がＩＦＮ＋、３３．７％がＩＦＮ−であった。後者のＦＩＳＨプローブされた細胞（図７Ｂ）は、以下で説明する単離したサイトカイン発現および非発現細胞に対して遺伝子発現解析を実施するために、ＦＡＣＳにより陽性および陰性の集団に分けた。この手法は、ＩＦＮ＋およびＩＦＮ−分集団に区別および分取された、ＩＦＮγ特異的なＦＩＳＨプローブのみで標識された刺激されたＴ細胞に対しても成功するものであった。

【0100】

パートＩＩ：ＦＩＳＨプローブされ、活性化および非応答Ｔ細胞集団に分取されたＴ細胞のサイトカイン遺伝子発現解析
調製およびパートＩに記載の別々の集団に分取した活性化および非応答Ｔ細胞を解析し、特異的なＦＩＳＨプローブに対するそれらの反応性と一致する特異な遺伝子発現プロファイルを示した。ＩＦＮγと「ハウスキーピング」ＧＡＰＤＨ（対照）の２つの遺伝子によってコードされたｍＲＮＡの発現を選び、この目標の実現可能性を例証した。標準的な方法により分取した細胞集団から単離したＲＮＡについて、ＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔを用いて、供給業者によって記述されたプロトコルに従い、また、２つの遺伝子のうちの１つに特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ（逆転写と、それに続く、得られるｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応による増幅）を行った。増幅反応のプライマー配列は、以下の通りであった。

【0101】

ＩＦＮγフォワードプライマー：５’ ＧＡＧＣＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＧ（配列ＩＤ番号：３６）
ＩＦＮγリバースプライマー：５’ ＴＴＣＡＴＧＴＡＴＴＧＣＴＴＴＧＣＧＴＴＧＧ（配列ＩＤ番号：３７）
ＧＡＰＤＨフォワードプライマー：５’ ＣＣＡＡＴＡＴＧＡＴＴＣＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣ（配列ＩＤ番号：３８）
ＧＡＰＤＨリバースプライマー：５’ ＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴ（配列ＩＤ番号：３９）
ＲＴインキュベーションおよび９４℃、１５分間の初期変性に続いて、サーマルサイクリングステップは、９４℃で０．５分、５５℃で０．５分、７２℃で１分であった。４０サイクル実施した。増幅産物は、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ色素により検出した。増幅反応の閾値サイクルを図８Ａに示す。増幅結果を検証し、人工産物の可能性を排除するために、確認された増幅産物のサイズを、ＩＦＮγ特異的およびＧＡＰＤＨ特異的プライマーを用いてゲル電気泳動により確認した。結果を図８Ｂに示す。

【0102】

【表3-1】

【0103】

【表3-2】

【0104】

【表3-3】

【0105】

【表3-4】

【0106】

【表3-5】

【0107】

前述の実施例および好ましい実施形態の説明は、特許請求の範囲により定義される本発明を限定するものではなく、例示するものであると見なされるべきである。容易に理解されるように、特許請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく、上に記載の特徴の多数の変形形態および組み合わせを利用することができる。このような変形形態は、本発明の範囲からの逸脱とは見なされず、このような変形形態はすべて、以下の特許請求の範囲内に含まれるものである。本明細書において引用したすべての参考文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]