知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6464087
(24)【登録日】2019年1月11日
(45)【発行日】2019年2月6日
(54)【発明の名称】ポリロタキサン、及び医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/724 20060101AFI20190128BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20190128BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20190128BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20190128BHJP
【ＦＩ】
A61K31/724
A61K47/60
A61P43/00 105
A61P3/06
【請求項の数】6
【全頁数】41
(21)【出願番号】特願2015-532848(P2015-532848)
(86)(22)【出願日】2014年8月18日
(86)【国際出願番号】JP2014071553
(87)【国際公開番号】WO2015025815
(87)【国際公開日】20150226
【審査請求日】2017年8月16日
(31)【優先権主張番号】特願2013-172994(P2013-172994)
(32)【優先日】2013年8月23日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504179255
【氏名又は名称】国立大学法人 東京医科歯科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106297
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 克博
(72)【発明者】
【氏名】田村 篤志
(72)【発明者】
【氏名】由井 伸彦
【審査官】
原口 美和
(56)【参考文献】
【文献】
特表２００９−５１８４１８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開昭６２−２６５２３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Collins, C.J.，Synthesis, characterization, and evaluation of pluronic-based β-cyclodextrin polyrotaxanes for mobi，Biochemistry，２０１３年 ４月 ５日，Vol.52, No.19，pp.3242-3253，全文
【文献】
Yui, N.，Functional Cyclodextrin Polyrotaxanes for Drug Delivery，Adv. Polym. Sci.，２００９年，Vol.222，pp.55-77，「5 Designing Cytocleavable Polyrotaxanesfor Intracellular Gene Delivery」欄
【文献】
Liu, B., Proc Natl Acad Sci U S A, 2009.02.17, Vol.106, No.7, pp.2377-2382
【文献】
Tamura, A., Sci Rep, 2013.07.22, Vol.3, article no.2252
【文献】
Yamashita, A., J Control Release, 2008.07.17, Vol.131, pp.137-144
【文献】
Ishibasi, S., J Clin Neurosci, 2009.04.01, Vol.16, pp.954-959
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３１／７２４
Ａ６１Ｋ ４７／６０
Ａ６１Ｐ ３／０６
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンを含有し、
前記複数の環状分子が、β−シクロデキストリンであり、
前記β−シクロデキストリンの一級ヒドロキシル基がカルバミン酸エステルを介して置
換基で修飾されてなり、
前記置換基が、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシエトキシエチル基、及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチル基から選択されるいずれかであることを特徴とするライソゾーム病の治療または予防に用いるための医薬組成物。
前記複数の環状分子が、β−シクロデキストリンであり、
前記β−シクロデキストリンの一級ヒドロキシル基がカルバミン酸エステルを介して置
換基で修飾されてなり、
前記置換基が、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシエトキシエチル基、及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチル基から選択されるいずれかであることを特徴とするライソゾーム病の治療または予防に用いるための医薬組成物。
【請求項2】
細胞内分解性結合が、アセタール結合、ジスルフィド結合、及びエステル結合から選択されるいずれかである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
線状分子が、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、ポリプロピレングリコール、及びポリエチレングリコールのいずれかである請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
ライソゾーム病が、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ファーバー病、ウォルマン病、及びファブリー病から選択されるいずれかである請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンであって、
前記線状分子は、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールの順に重合した共重合体であり、前記複数の環状分子がβ−シクロデキストリンであり、
前記β−シクロデキストリンの一級ヒドロキシル基がカルバミン酸エステルを介して置換基で修飾されてなり、
前記置換基が、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシエトキシエチル基、及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチル基から選択されるいずれかであることを特徴とするポリロタキサン。
前記線状分子は、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールの順に重合した共重合体であり、前記複数の環状分子がβ−シクロデキストリンであり、
前記β−シクロデキストリンの一級ヒドロキシル基がカルバミン酸エステルを介して置換基で修飾されてなり、
前記置換基が、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシエトキシエチル基、及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチル基から選択されるいずれかであることを特徴とするポリロタキサン。
【請求項6】
細胞内分解性結合が、アセタール結合、ジスルフィド結合、及びエステル結合から選択されるいずれかである請求項５に記載のポリロタキサン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ポリロタキサンを含有する脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患に対する医薬組成物、及び新規ポリロタキサンに関する。【背景技術】
【0002】
リソソーム中の分解酵素、あるいは膜輸送タンパク質の遺伝的な欠損乃至変異により、リソソーム内に脂質、糖質、コレステロールなどの蓄積が起こる疾患を総称してライソゾーム病と呼ぶ。日本では約３０種類のライソゾーム病が特定疾患として指定されており、有効な治療法が少ないことが知られている。例えば、前記ライソゾーム病の１つであるニーマン・ピック病Ｃ型（以下、「ＮＰＣ病」と称することがある。）は、膜タンパク質であるＮＰＣ１の変異によりリソソームにコレステロール、脂質が蓄積する。前記ＮＰＣ病は、幼児期より発症し、進行性の神経障害、肝脾腫等の症状を示し、１０歳前後で死亡する症例の多い難治性代謝疾患である。
【0003】
近年、前記ＮＰＣ病に対する治療薬として、シクロデキストリンの利用が期待されている。シクロデキストリンは環状の糖類であり、糖の繰り返し数に応じてα−シクロデキストリン（繰り返し数６）、β−シクロデキストリン（繰り返し数７）、γ−シクロデキストリン（繰り返し数８）と命名されている。各シクロデキストリンは空洞部に様々な化合物を包接することが知られており、特にβ−シクロデキストリンはコレステロールの包接能に優れることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。近年、ヒドロキシプロピル基で修飾されたβ−シクロデキストリン（以下、「ＨＰ−β−ＣＤ」と称することがある）をＮＰＣ病患者由来細胞に対して作用させることで細胞内コレステロール量が減少することが明らかとなっている。さらに、Ｎｐｃ１欠損マウス（Ｎｐｃ１−／−マウス）に対しＨＰ−β−ＣＤを投与することで、各組織のコレステロール蓄積量を減少させ、生存期間を延長することが見出されている（例えば、非特許文献２参照）。以上より、β−シクロデキストリンは細胞内に蓄積したコレステロールを減少させることが可能であることから、新たなＮＰＣ病治療薬として注目されている。特に米国では人道的使用が許可されており、２０１２年より前記ＮＰＣ病治療のフェーズＩ試験が開始されていることから非常に期待度の高い薬剤であると考えられる。【0004】
一方、シクロデキストリン（以下、「ＣＤ」と称することがある）は、分子量が１，０００程度の低分子であるため、血中半減期が数十分間程度と短く、投与後速やかに腎排泄されてしまうという問題や、細胞膜透過性が低いという問題がある（例えば、非特許文献３参照）。このため、十分な治療効果を得るためには、高濃度のＣＤ（前記Ｎｐｃ１欠損マウスに対する投与量は４，０００ｍｇ／ｋｇ）を頻回投与する必要がある（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、高濃度のＣＤは、溶血活性や組織障害性を示すため、高濃度での使用は正常組織の障害といった副作用が懸念される（例えば、非特許文献４参照）。そのため、ヒトに対して非侵襲的に十分な治療効果を得ることは困難だと考えられる。【0005】
したがって、安全性が高く、優れたコレステロール除去作用を有し、ニーマン・ピック病Ｃ型を含むライソゾーム病に対する高い治療効果又は予防効果を有する医薬組成物の速やかな開発が強く求められているのが現状である。【0006】
また、前記ライソゾーム病は、脂質等の代謝異常だけではなく、細胞のタンパク質分解機能であるオートファジーに異常があることも近年明らかになりつつある（例えば、非特許文献５参照）。オートファジーは細胞内で不要となったタンパク質やミトコンドリア等のオルガネラをリソソームで分解するが、オートファジーの機能異常は細胞内への不要タンパク質の蓄積をもたらす。オートファジーの機能障害がライソゾーム病の病態と関連しているという指摘もされている。特に、ＮＰＣ病では、細胞質中にオートファゴソームの蓄積を生じることが示されている（例えば、非特許文献６参照）。このようなオートファゴソームの蓄積は、本来オートリソソームで分解される不要タンパク質やオルガネラが細胞質中に蓄積することを示唆している。また、オートファジーによるタンパク質分解に異常がある他の疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患が知られている（例えば、非特許文献７参照）。
【0007】
したがって、ライソゾーム病を含む、オートファジー機能異常に起因する疾患に対する高い治療効果又は予防効果を有する医薬組成物の速やかな開発も強く求められているのが現状である。【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｍ． Ｅ． Ｂｒｅｗｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ａｄｖ. ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５９（７）， ６４５−６６６ （２００７）
【非特許文献2】Ｂ． Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０６（７）， ２３７７−２３８２ （２００９）
【非特許文献3】Ｈ． Ｗ． Ｆｒｉｊｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ７（１２）， １２４８−１２５２ （１９９０）
【非特許文献4】Ｔ． Ｉｒｉｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ. Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８６（２）， １４７−１６２ （１９９７）
【非特許文献5】Ａ． Ｐ． Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ８（５）， ７１９−７３０ （２０１２）
【非特許文献6】Ｓ． Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １６（７）， ９５４−９５９ （２００９）
【非特許文献7】Ａ． Ｍ． Ｃｕｅｒｖｏ Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４（２）， ７０−７７ （２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、安全性が高く、優れたコレステロール除去作用及び優れたオートリソソームの形成亢進作用の少なくともいずれかを有し、脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患に対する高い治療効果又は予防効果を有する医薬組成物、及び前記医薬組成物に好適に用いることができるポリロタキサンを提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】
【0010】
前記課題を解決するための手段としては、以下のとおりである。即ち、＜１＞ 複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンを含有することを特徴とする脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患に対する医薬組成物である。
＜２＞ 複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンであって、
前記線状分子は、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールの順に重合した共重合体であり、前記複数の環状分子がβ−シクロデキストリンであることを特徴とするポリロタキサンである。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、前記従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、安全性が高く、優れたコレステロール除去作用及び優れたオートリソソームの形成亢進作用の少なくともいずれかを有し、脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患に対する高い治療効果又は予防効果を有する医薬組成物、及び前記医薬組成物に好適に用いることができるポリロタキサンを提供することができる。【図面の簡単な説明】
【0012】
【図17D】図１７Ｄは、試験例９のＮＨＤＦ、ＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞、ファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞、及びＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞のウエスタンブロットの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
（医薬組成物）本発明の医薬組成物は、脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患に対する医薬組成物である。
本発明の医薬組成物は、ポリロタキサンを少なくとも含み、必要に応じてさらにその他の成分を含む。
【0014】
＜ポリロタキサン＞前記ポリロタキサンは、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ポリロタキサンは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ポリロタキサンの数平均分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２万〜１０万程度とすることが好ましい。
【0015】
−線状分子−前記線状分子は、複数の環状分子を貫通し、両端部に細胞内分解性結合を有し、該細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基と結合する。
前記線状分子としては、複数の環状分子の空洞を貫通し、その状態を保持することができ、かつ、両端部に細胞内分解性結合を有するものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0016】
前記線状分子の両端部以外の構成としては、公知のポリロタキサンの構成を適宜選択することができ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、ポリメチルビニルエーテル、ポリエチレンイミン、ポリアミノ酸などが挙げられる。前記線状分子の両端部以外の構成の分子量としては、特に制限はなく、目的とするポリロタキサンの分子量や、貫通させる環状分子の数に応じて適宜選択することができる。
これらは、化学合成したものを用いてもよいし、市販品を用いてもよい。
【0017】
前記線状分子の両端部以外の構成は、後述する環状分子との組合せに応じて適宜選択することが好ましく、例えば、前記環状分子がα−シクロデキストリンの場合には、ポリエチレングリコールとすることが好ましく、前記環状分子がβ−シクロデキストリンの場合には、ポリプロピレングリコール、若しくはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体とすることが好ましい。前記ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体では、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールの順に重合した共重合体であることが好ましい。
前記ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体におけるポリエチレングリコール部分の数平均分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５００〜１０，０００とすることができる。また、前記ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体におけるポリプロピレングリコール部分の数平均分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５００〜５，０００とすることができる。
前記ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体の具体例としては、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）などが挙げられる。
【0018】
−−細胞内分解性結合−−前記細胞内分解性結合としては、細胞内で分解される結合であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセタール結合、ケタール結合、ジスルフィド結合、エステル結合、オルトエステル結合、ビニルエーテル結合、ヒドラジド結合、アミド結合などが挙げられる。これらの中でも、細胞内での選択的な分解に優れる点で、アセタール結合、ケタール結合、ジスルフィド結合、エステル結合、オルトエステル結合、ビニルエーテル結合、ヒドラジド結合が好ましく、ジスルフィド結合がより好ましい。
これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0019】
前記線状分子に前記細胞内分解性結合を形成する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ７６ （２００１） １１−２５」、「Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００３， ４， １４２６−１４３２」、「Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０１１， ２７（２）， ６１２−６１７」、「Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ２０１３， ５２， ７３００−７３０５」、「Ｊ． Ｍａｔｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｂ， ２０１３， １， ３５３５−３５４４」、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ３４， ２４８０−２４９１ （２０１３）」、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ３， ２２５２ （２０１３）」などに記載の方法と同様の方法が挙げられる。【0020】
−環状分子−前記環状分子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シクロデキストリン、クラウンエーテル、サイクロフラクタン、カリックスアレンなどが挙げられる。これらの中でも、コレステロールの包接能に優れる点で、シクロデキストリンが好ましい。
これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0021】
前記シクロデキストリンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンが挙げられる。これらの中でも、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンが好ましく、コレステロールの包接能により優れる点で、β−シクロデキストリンがより好ましい。【0022】
前記ポリロタキサン１分子あたりの前記環状分子の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、平均５個〜２００個が好ましい。【0023】
前記環状分子は、置換基で修飾されていてもよいし、修飾されていなくてもよいが、前記ポリロタキサンの水溶性を高めるために、置換基で修飾されていることが好ましい。前記修飾される位置としては、前記ポリロタキサンの水溶性を高めることができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、シクロデキストリンの場合には、ヒドロキシル基が修飾されることが好ましい。
【0024】
前記置換基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、ヒドロキシエトキシエチル基、メチル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル基（「ＤＭＡＥ」基と称することもある）、カルボキシル基、一級アミノ基、若しくはポリエチレングリコールなどの水溶性高分子やペプチド分子などが挙げられる。これらの中でも、ポリロタキサンの細胞内への取込み効率を高めることができる点で、ＤＭＡＥ基が好ましい。前記ヒドロキシル基の修飾は、前記置換基で直接修飾されていてもよいし、リンカーを介して修飾されていてもよい。
前記リンカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カルバミン酸エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−）、カルボネート結合（−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−）、エーテル結合（−Ｏ−）などが挙げられる。
【0025】
前記ポリロタキサン１分子あたりの前記置換基の修飾数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、平均１０個〜４００個が好ましい。【0026】
前記環状分子を前記線状分子により貫通させる方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。前記環状分子を修飾する方法としても、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【0027】
−嵩高い置換基−前記嵩高い置換基としては、前記線状分子の両末端をキャップして前記複数の環状分子の脱離を防止することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アミノ酸若しくはその誘導体、オリゴペプチド、蛍光分子などが挙げられる。これらの中でも、Ｎ−トリチルグリシンが、生理条件下における加水分解耐性の点で、好ましい。
【0028】
前記嵩高い置換基を前記線状分子に結合させる方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。【0029】
前記医薬組成物におけるポリロタキサンは、本発明のポリロタキサンであることが好ましい。本発明のポリロタキサンは、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンであって、前記線状分子は、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールの順に重合した共重合体であり、前記複数の環状分子がβ−シクロデキストリンである。
本発明のポリロタキサンにおける環状分子、線状分子、該線状分子における細胞内分解性結合、嵩高い置換基は、前記医薬組成物のポリロタキサンの項目の記載と同様とすることができ、好ましい態様も同様である。
【0030】
本発明のポリロタキサンのより好ましい態様としては、下記構造式（１）で表されるポリロタキサン、下記構造式（２）で表されるポリロタキサン、下記構造式（４）で表されるポリロタキサン、下記構造式（５）で表されるポリロタキサン、下記構造式（６）で表されるポリロタキサンが挙げられる。【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【0031】
前記構造式（１）、（２）、（４）、（５）、又は（６）で表されるポリロタキサンの線状分子は、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールの順に重合した共重合体であり、環状分子は、β−シクロデキストリンであり、嵩高い置換基は、Ｎ−トリチルグリシンである。前記構造式（１）、（５）、及び（６）で表されるポリロタキサンの線状分子における細胞内分解性結合は、ジスルフィド結合であり、前記構造式（２）で表されるポリロタキサンの線状分子における細胞内分解性結合は、アセタール結合であり、前記構造式（４）で表されるポリロタキサンの線状分子における細胞内分解性結合は、エステル結合である。
【0032】
前記構造式（１）、（２）、（４）、（５）、及び（６）中、「ｍ」はポリプロピレングリコールの繰返し単位（以下、「モノマー」と称することがある）の数を示し（構造式（１）、（２）、（４）、（５）、及び（６）では、括弧内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載している）、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位（モノマー）の数を示す。また、前記構造式（１）、（２）、及び（４）中、β−ＣＤは下記式（Ａ）で表され、該構造式（１）、（２）、及び（４）中では１個のみ記載している。また、前記構造式（５）中、β−ＣＤは下記式（Ｂ）で表され、該構造式（５）中では１個のみ記載している。また、前記構造式（６）中、β−ＣＤは下記式（Ｃ）で表され、該構造式（６）中では１個のみ記載している。また、下記式（Ａ）では、β−シクロデキストリンの一級ヒドロキシル基が、カルバミン酸エステル（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）を介してヒドロキシエチル基で修飾されており、下記式（Ｂ）では、β−シクロデキストリンの一級ヒドロキシル基が、カルバミン酸エステル（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）を介してＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチル基で修飾されており、下記式（Ｃ）では、β−シクロデキストリンの一級ヒドロキシル基が、カルバミン酸エステル（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）を介してヒドロキシエトキシエチル基で修飾されている。なお、下記式（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）では、前記修飾がｘ個（ｘ＝１〜７）の場合を示している。
【化6】
【化7】
【化8】
【0033】
前記構造式（１）、（２）、（４）、（５）、及び（６）で表されるポリロタキサンにおける線状分子の数平均分子量は、ポリエチレングリコール部分が、それぞれ１，１００であり、ポリプロピレングリコール部分が、４，２００である。前記構造式（１）で表されるポリロタキサンにおける環状分子の貫通数は、ポリロタキサン１分子あたり平均１２．９個である。
前記構造式（２）で表されるポリロタキサンにおける環状分子の貫通数は、ポリロタキサン１分子あたり平均１２．９個である。
前記構造式（４）で表されるポリロタキサンにおける環状分子の貫通数は、ポリロタキサン１分子あたり平均１１．７個である。
前記構造式（５）で表されるポリロタキサンにおける環状分子の貫通数は、ポリロタキサン１分子あたり平均１２．９個である。
前記構造式（６）で表されるポリロタキサンにおける環状分子の貫通数は、ポリロタキサン１分子あたり平均１６．１個である。
前記構造式（１）で表されるポリロタキサンにおける前記ヒドロキシエチル基の修飾数は、ポリロタキサン１分子あたり平均５３．４個である。
前記構造式（２）で表されるポリロタキサンにおける前記ヒドロキシエチル基の修飾数は、ポリロタキサン１分子あたり平均６６．９個である。
前記構造式（４）で表されるポリロタキサンにおける前記ヒドロキシエチル基の修飾数は、ポリロタキサン１分子あたり平均６５．９個である。
前記構造式（５）で表されるポリロタキサンにおける前記Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル基の修飾数は、ポリロタキサン１分子あたり平均６５．３個である。
前記構造式（６）で表されるポリロタキサンにおける前記ヒドロキシエトキシエチル基の修飾数は、ポリロタキサン１分子あたり平均６４．７個である。
【0034】
前記構造式（１）で表されるポリロタキサンは、後述する製造例１の方法で好適に製造することができ、前記構造式（２）で表されるポリロタキサンは、後述する製造例２の方法で好適に製造することができ、前記構造式（４）で表されるポリロタキサンは、後述する製造例３の方法で好適に製造することができ、前記構造式（５）で表されるポリロタキサンは、後述する製造例４の方法で好適に製造することができ、前記構造式（６）で表されるポリロタキサンは、後述する製造例５の方法で好適に製造することができる。【0035】
製造されたポリロタキサンが、前記構造式（１）、（２）、（４）、（５）、又は（６）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、プロトン核磁気共鳴分光法により確認することができる。前記構造式（１）で表されるポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートは、図１に示されるとおりであり、前記構造式（２）で表されるポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートは、図２に示されるとおりであり、前記構造式（４）で表されるポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートは、図４に示されるとおりであり、前記構造式（５）で表されるポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートは、図５に示されるとおりであり、前記構造式（６）で表されるポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートは、図６に示されるとおりである。
なお、前記分析方法による測定値には、多少の誤差が生じることがあるが、当業者であれば、前記ポリロタキサンが前記構造式（１）、（２）、（４）、（５）、又は（６）で表される構造を有することは容易に同定することが可能である。
【0036】
本発明の医薬組成物における前記ポリロタキサンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記医薬組成物は、前記ポリロタキサンそのものであってもよい。【0037】
＜脂質代謝異常及びオートファジー機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患＞前記脂質代謝異常及びオートファジー機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患は、脂質代謝異常のみに起因する疾患であってもよいし、オートファジー機能異常のみに起因する疾患であってもよいし、両者に起因する疾患であってもよい。
【0038】
＜＜脂質代謝異常に起因する疾患＞＞前記脂質代謝異常に起因する疾患としては、例えば、ライソゾーム病が挙げられる。なお、前記ライソゾーム病は、オートファゴソームの蓄積を生じる、オートファジー機能異常に起因する疾患でもある。
【0039】
−ライソゾーム病−前記ライソゾーム病の具体例としては、ゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ病）、ニーマン・ピック病Ａ型（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ病Ａ型）、ニーマン・ピック病Ｂ型（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ病Ｂ型）、ニーマン・ピック病Ｃ型（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ病Ｃ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス（「Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ Ｓａｎｄｈｏｆｆ ＡＢ型」と称することもある。）、クラッベ病（Ｋｒａｂｂｅ病）、異染性白質変性症、マルチプルサルタファーゼ欠損症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｕｌｆａｔｅｓｅ欠損症）、ファーバー病（Ｆａｒｂｅｒ病）、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型（「ハンター病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＩＩＩ型（「サンフィリポ病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＩＶ型、ムコ多糖症ＶＩ型（「マロトー・ラミー病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＶＩＩ型（「スライ病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＩＸ型（「Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ欠損症」と称することもある。）、シアリドーシス、ガラクトシアリドーシス、Ｉ−ｃｅｌｌ病／ムコリピドーシスＩＩＩ型、α−マンノシドーシス、β−マンノシドーシス、フコシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、シンドラー／神崎病（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ／神崎病）、ウォルマン病（Ｗｏｌｍａｎ病）、ダノン病（Ｄａｎｏｎ病）、遊離シアル酸蓄積症、セロイドリポフスチノーシス、ファブリー病が挙げられる。
【0040】
前記オートファジー機能異常に起因する疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などが挙げられる。これらは、オートファゴソームの蓄積を生じる疾患である。【0041】
本発明の医薬組成物は、ライソゾーム病に好適に用いることができ、中でも、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ファーバー病、ウォルマン病、ファブリー病に好適に用いることができ、ニーマン・ピック病Ｃ型により好適に用いることができる。【0042】
＜その他の成分＞前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤形等に応じて適宜選択することができる。
本発明の医薬組成物における前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0043】
＜剤形＞本発明の医薬組成物の剤形としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、吸入散剤などが挙げられる。
【0044】
前記注射剤としては、例えば、前記ポリロタキサンに、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【0045】
＜投与＞本発明の医薬組成物の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬組成物の剤形、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。例えば、局所投与としては、脳室内投与などが挙げられる。
【0046】
本発明の医薬組成物の投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられる。【0047】
本発明の医薬組成物の投与量としては、特に制限はなく、投与形態や、投与対象の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。【0048】
本発明の医薬組成物の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。また、本発明の医薬組成物の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
【0049】
本発明の医薬組成物に含まれるポリロタキサンは、細胞内で分解されるまでは、環状分子の空洞部を線状分子が占めているため、溶血や疎水性生体分子の非特異的な包接は示さないと考えられ、より安全性が高いと考えられる。また、前記ポリロタキサンは、細胞内に到達すると、末端の細胞内分解性結合が切断され、多数の環状分子が徐々に放出されコレステロールの除去剤として作用する。そのため、コレステロールの除去作用と、該作用の持続化が期待される。
さらに、前記ポリロタキサン骨格は、数平均分子量が２万〜１０万程度の高分子量であるため、例えば、静脈投与後の腎排泄を受けにくく、血中半減期がシクロデキストリン単独よりも長くなると考えられる。そのため、投与量、投与回数の低減に繋がると考えられる。
また、本発明の医薬組成物に含まれるポリロタキサンは、細胞毒性が低く、また、低濃度でコレステロールを除去することができる。
また、本発明の医薬組成物に含まれるポリロタキサンは、優れたオートリソソームの形成亢進作用を有する。
【0050】
本発明の医薬組成物に含まれるポリロタキサン、及び本発明のポリロタキサンは、細胞内のコレステロール除去剤、オートリソソームの形成亢進剤としても用いることができる。【0051】
（予防又は治療方法）前記医薬組成物は、個体に投与することにより、細胞内におけるコレステロールの除去若しくはオートリソソームの形成を亢進し、脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患を予防又は治療することができる。したがって、本発明は、個体に、前記医薬組成物を投与することを特徴とする脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患を予防又は治療するための方法にも関する。
【実施例】
【0052】
以下に製造例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの製造例及び試験例に何ら限定されるものではない。【0053】
（製造例１：ポリロタキサン−１の製造）線状分子として、プルロニックＰ１２３（シグマ−アルドリッチ社製；ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」と称することがある。）とポリプロピレングリコール（以下、「ＰＰＧ」と称することがある。）とが、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの順に重合した共重合体；ＰＰＧ部分の数平均分子量は、４，２００、ＰＥＧ部分の数平均分子量は、１，１００×２）を用い、以下のようにして、両末端にシスタミンを結合した。
前記プルロニックＰ１２３を２０ｇ、１，１’−カルボニルジイミダゾール（シグマ−アルドリッチ社製）を１０．２ｇ量り取り、ナス型フラスコへ加えた。テトラヒドロフラン（関東化学社製）を２６７ｍＬ加え溶解し、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量１，０００の透析膜（スペクトラ社製）へ加え、テトラヒドロフランに対し透析をすることで未反応物を除去した。ロータリーエバポレーターで濃縮することで両末端にカルボニルイミダゾールを有するプルロニックＰ１２３（以下、「Ｐ１２３−ＣＩ」と称することがある。）を２０ｇ得た。
前記Ｐ１２３−ＣＩを９ｇ量り取り、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを８ｍＬに溶解した。脱塩したシスタミン（和光純薬社製）を２ｇ量り取りナス型フラスコへ加え、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを７２ｍＬ加え溶解した。Ｐ１２３―ＣＩ溶液をナス型フラスコへ滴下して加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量１，０００の透析膜へ加え、メタノール（関東化学社製）に対し透析をすることで未反応物を除去した。ロータリーエバポレーターで濃縮することで両末端にシスタミンを有するプルロニックＰ１２３（以下、「Ｐ１２３−ＳＳ−ＮＨ２」と称することがある。）を４．９５ｇ得た。
【0054】
前記Ｐ１２３−ＳＳ−ＮＨ２と、β−シクロデキストリン（以下、「β−ＣＤ」と称することがある。）を用い、以下のようにして、擬ポリロタキサンを調製した。前記β−ＣＤを１２ｇ量り取り広口瓶に加え、リン酸緩衝溶液６００ｍＬに溶解した。前記Ｐ１２３−ＳＳ−ＮＨ２を１ｇ量り取り少量の超純水に溶解した。Ｐ１２３−ＳＳ−ＮＨ２水溶液をβ−ＣＤ溶液に加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。回収した固体を凍結乾燥することで擬ポリロタキサンを得た。
【0055】
前記擬ポリロタキサンの両端部を、以下のようにしてＮ−トリチルグリシン（シグマ−アルドリッチ社製）でキャッピングすることにより、複数のβ−ＣＤを貫通させた線状分子の両端部に細胞内で分解されるジスルフィド結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサン（以下、「ＰＲＸ」と称することがある。）を得た。Ｎ−トリチルグリシンを１．６４ｇ、４−（４，６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）−４−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｙｄｒａｔｅ（和光純薬社製）を１．６３ｇ量り取りスクリュー管に加え、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド １１．２ｍＬ、メタノール ４４．８ｍＬの混合溶媒に溶解した。得られた擬ポリロタキサンに対し、この溶液を加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。メタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、超純水の順で得られた沈殿物を洗浄し、未反応物を除去した。回収した固体を凍結乾燥することで末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサンを６９７．２ｍｇ得た。
【0056】
前記ポリロタキサンのβ−ＣＤにヒドロキシエチル（以下、「ＨＥ」）基を以下のようにして導入し、水溶性のポリロタキサン−１（以下、「ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子あたりのβ−ＣＤの平均貫通数は１２．９個；ＨＥ基の修飾数は平均５３．４個。）。前記末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサンを２５０ｍｇ量り取り、ジメチルスルホキシド１０ｍＬに溶解した。１，１’―カルボニルジイミダゾールを２３５ｍｇ加え、室温で２４時間撹拌した。その後、反応溶液に２−アミノエタノールを４３９μＬ加え、室温でさらに２４時間撹拌した。反応後、分画分子量３，５００の透析膜（スペクトラ社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応物を除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでヒドロキシエチル基を導入した、末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサン（ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ）を２３１．５ｍｇ得た。
【0057】
前記ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸについて、重ジメチルスルホキシド（シグマ−アルドリッチ社製）中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図１に示す。前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸが下記構造式（１）で表される構造を有することが確認された。なお、下記構造式（１）中、「ｍ」はポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示し（構造式（１）では、括弧内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載している）、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す。また、下記構造式（１）中、β−ＣＤは下記式（Ａ）で表され、該構造式（１）中では１個のみ記載している。また、下記式（Ａ）では、前記ヒドロキシエチル基の修飾がｘ個（ｘ＝１〜７）の場合を示している。
【化9】
【化10】
【0058】
（製造例２：ポリロタキサン−２の製造）線状分子として、前記プルロニックＰ１２３を用い、以下のようにして、両末端にアセタール結合を形成させた。
製造例１と同様に合成したＰ１２３−ＣＩを８．１４ｇ量り取り、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを１０ｍＬに溶解した。３，９−ビス（３−アミノプロピル）−２，４，８，１０−テトラオキサスピロ［５．５］ウンデカンを６．８１ｇ量り取りナス型フラスコへ加え、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを１００ｍＬ加え溶解した。Ｐ１２３―ＣＩ溶液をナス型フラスコへ滴下して加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量１，０００の透析膜へ加え、メタノールに対し透析をすることで未反応物を除去した。ロータリーエバポレーターで濃縮することで両末端に環状アセタール結合を有するＰ１２３（以下、「Ｐ１２３−ａｃｅ−ＮＨ２」と称することがある。）を７．０ｇ得た。
【0059】
前記Ｐ１２３−ａｃｅ−ＮＨ２を用いた以外は、製造例１と同様にして、擬ポリロタキサンを調製した。前記擬ポリロタキサンの両端部を、製造例１と同様にしてＮ−トリチルグリシンでキャッピングすることにより、複数のβ−ＣＤを貫通させた線状分子の両端部に細胞内で分解されるアセタール結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンを得た。
前記ポリロタキサンのβ−ＣＤに、製造例１と同様にしてＨＥ基を導入し、水溶性のポリロタキサン−２（以下、「ＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子あたりのβ−ＣＤの貫通数は平均１２．９個、ＨＥ基の修飾数は平均６６．９個。）。
【0060】
前記ＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸについて、重ジメチルスルホキシド（シグマ−アルドリッチ社製）中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図２に示す。前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸが下記構造式（２）で表される構造を有することが確認された。なお、下記構造式（２）中、「ｍ」はポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示し（構造式（２）では、括弧内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載している）、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す。また、下記構造式（２）中、β−ＣＤは前記式（Ａ）で表され、該構造式（２）中では１個のみ記載している。また、前記式（Ａ）では、前記ヒドロキシエチル基の修飾がｘ個（ｘ＝１〜７）の場合を示している。
【化11】
【0061】
（比較製造例１：ポリロタキサン−３の製造）線状分子として、前記プルロニックＰ１２３を用い、以下のようにして、細胞内分解性結合を有さない線状分子を調製した。
製造例１と同様に合成したＰ１２３−ＣＩを９ｇ量り取り、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを８ｍＬ加え溶解した。エチレンジアミン（和光純薬社製）を１．６５ｇ量り取りナス型フラスコへ加え、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを８０ｍＬ加え溶解した。Ｐ１２３―ＣＩ溶液をナス型フラスコへ滴下して加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量１，０００の透析膜へ加え、メタノールに対し透析をすることで未反応物を除去した。ロータリーエバポレーターで濃縮することで両末端に一級アミノ基を有するＰ１２３（以下、「Ｐ１２３−ＮＨ２」と称することがある。）を５．８５ｇ得た。
【0062】
前記Ｐ１２３−ＮＨ２を用いた以外は、製造例１と同様にして、擬ポリロタキサンを調製した。前記擬ポリロタキサンの両端部を、製造例１と同様にしてＮ−トリチルグリシンでキャッピングすることにより、複数のβ−ＣＤを貫通させた細胞内分解性結合を有さない線状分子の両端部に嵩高い置換基を有するポリロタキサンを得た。
前記ポリロタキサンのβ−ＣＤに、製造例１と同様にしてＨＥ基を導入し、水溶性のポリロタキサン−３（以下、「ＨＥ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子あたりのβ−ＣＤの貫通数は平均１１．３個、ＨＥ基の修飾数は平均６５．３個。）。
【0063】
前記ＨＥ−ＰＲＸについて、重ジメチルスルホキシド（シグマ−アルドリッチ社製）中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図３に示す。前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＨＥ−ＰＲＸが下記構造式（３）で表される構造を有することが確認された。なお、下記構造式（３）中、「ｍ」はポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示し（構造式（３）では、カッコ内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載している）、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す。また、下記構造式（３）中、β−ＣＤは前記式（Ａ）で表され、該構造式（３）中では１個のみ記載している。また、前記式（Ａ）では、前記ヒドロキシエチル基の修飾がｘ個（ｘ＝１〜７）の場合を示している。
【化12】
【0064】
（製造例３：ポリロタキサン−４の製造）線状分子として、前記プルロニックＰ１２３を用い、以下のようにして、両末端にエステル結合を形成させた。
前記プルロニックＰ１２３を１０ｇナス型フラスコに量り取り、テトラヒドロフランを１３３ｍＬ加え溶解した。前記溶液にトリエチルアミン（和光純薬社製）を３．３ｍＬ加えた。その後、氷冷下で塩化アクリロイル（和光純薬社製）を１．２８ｍＬ加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量１，０００の透析膜へ加え、メタノールに対し透析をすることで未反応物を除去した。ロータリーエバポレーターで濃縮することで両末端にアクリロイル基を有するプルロニックＰ１２３を６．１２ｇ得た。
前記両末端にアクリロイル基を有するプルロニックＰ１２３を５．０ｇ、システアミン塩酸塩を１．２ｇナス型フラスコに量り取り、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを４０ｍＬ加え溶解し、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量１，０００の透析膜へ加え、メタノールに対し透析をすることで未反応物を除去した。ロータリーエバポレーターで濃縮することで両末端にエステル結合を介して一級アミノ基を有するプルロニックＰ１２３（以下、「Ｐ１２３−ＣＯＯ−ＮＨ２」と称することがある。）を２．５４ｇ得た。
【0065】
前記Ｐ１２３−ＣＯＯ−ＮＨ２を用いた以外は、製造例１と同様にして、擬ポリロタキサンを調製した。前記擬ポリロタキサンの両端部を、製造例１と同様にしてＮ−トリチルグリシンでキャッピングすることにより、複数のβ−ＣＤを貫通させた線状分子の両端部に細胞内で分解されるエステル結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンを得た。
前記ポリロタキサンのβ−ＣＤに、製造例１と同様にしてＨＥ基を導入し、水溶性のポリロタキサン−２（以下、「ＨＥ−ＣＯＯ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子あたりのβ−ＣＤの貫通数は平均１１．７個、ＨＥ基の修飾数は平均６５．９個。）。
【0066】
前記ＨＥ−ＣＯＯ−ＰＲＸについて、重ジメチルスルホキシド（シグマ−アルドリッチ社製）中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図４に示す。前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＨＥ−ＣＯＯ−ＰＲＸが下記構造式（４）で表される構造を有することが確認された。なお、下記構造式（４）中、「ｍ」はポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示し（構造式（４）では、括弧内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載している）、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す。また、下記構造式（４）中、β−ＣＤは前記式（Ａ）で表され、該構造式（４）中では１個のみ記載している。また、前記式（Ａ）では、前記ヒドロキシエチル基の修飾がｘ個（ｘ＝１〜７）の場合を示している。
【化13】
【0067】
（製造例４：ポリロタキサン−５の製造）製造例１と同様にして調製した、末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサンのβ−ＣＤにＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（以下、「ＤＭＡＥ」）基を以下のようにして導入し、水溶性のポリロタキサン−５（以下、「ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子あたりのβ−ＣＤの平均貫通数は１２．９個；ＤＭＡＥ基の修飾数は平均６５．３個。）。
前記末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサンを１２５ｍｇ量り取り、ジメチルスルホキシド５ｍＬに溶解した。１，１’―カルボニルジイミダゾールを１１７ｍｇ加え、室温で２４時間撹拌した。その後、反応溶液にＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアミン（和光純薬社製）を２３７μＬ加え、室温でさらに２４時間撹拌した。反応後、分画分子量３，５００の透析膜（スペクトラ社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応物を除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチル基を導入した、末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサン（ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸ）を１０４．７ｍｇ得た。
【0068】
前記ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸについて、重ジメチルスルホキシド（シグマ−アルドリッチ社製）中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図５に示す。前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸが下記構造式（５）で表される構造を有することが確認された。なお、下記構造式（５）中、「ｍ」はポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示し（構造式（５）では、括弧内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載している）、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す。また、下記構造式（５）中、β−ＣＤは下記式（Ｂ）で表され、該構造式（５）中では１個のみ記載している。また、下記式（Ｂ）では、前記Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル基の修飾がｘ個（ｘ＝１〜７）の場合を示している。
【化14】
【化15】
【0069】
（製造例５：ポリロタキサン−６の製造）製造例１と同様にして調製した、末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサンのβ−ＣＤにヒドロキシエトキシエチル（以下、「ＨＥＥ」）基を以下のようにして導入し、水溶性のポリロタキサン−６（以下、「ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子あたりのβ−ＣＤの平均貫通数は１６．１個；ＨＥＥ基の修飾数は平均６４．７個。）。
前記末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサンを２００ｍｇ量り取り、ジメチルスルホキシド１５ｍＬに溶解した。１，１’―カルボニルジイミダゾールを２０３ｍｇ加え、室温で２４時間撹拌した。その後、反応溶液に２−（２−アミノエトキシ）エタノール（東京化成工業社製）を６２４μＬ加え、室温でさらに２４時間撹拌した。反応後、分画分子量３，５００の透析膜（スペクトラ社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応物を除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでヒドロキシエトキシエチル基を導入した、末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサン（ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸ）を２３７．６ｍｇ得た。
【0070】
前記ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸについて、重ジメチルスルホキシド（シグマ−アルドリッチ社製）中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図６に示す。前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸが下記構造式（６）で表される構造を有することが確認された。なお、下記構造式（６）中、「ｍ」はポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示し（構造式（６）では、括弧内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載している）、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す。また、下記構造式（６）中、β−ＣＤは下記式（Ｃ）で表され、該構造式（６）中では１個のみ記載している。また、下記式（Ｃ）では、前記ヒドロキシエトキシエチル基の修飾がｘ個（ｘ＝１〜７）の場合を示している。
【化16】
【化17】
【0071】
（試験例１：溶血試験）リン酸緩衝食塩水（以下、「ＰＢＳ」と称することがある。）２００μＬ中で、ラット赤血球（興人バイオより入手、細胞数１×１０８個）と各濃度（シクロデキストリンの濃度として）の以下の試料とを３７℃で２時間接触させた。遠心分離により赤血球を沈殿させ、上清を１００μＬ回収し、９６ウエルプレート（ＢＤファルコン社製）に加えた。上清の５４４ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーＡＲＶＯ−ＭＸ（パーキンエルマー社製）で測定した。０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク社製）と接触した際の上清の吸光度を溶血率１００％として、以下のようにして溶血率（％）を算出した。結果を図７に示す。
＜試料＞
（１） ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ（製造例１で作製）
（２） ＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸ（製造例２で作製）
（３） ＨＥ−ＰＲＸ（比較製造例１で作製）
（４） ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（以下、「ＨＰ−β−ＣＤ」と称することがある。；下記構造式（７）で表される化合物；シグマ−アルドリッチ社製；製品番号３３２６０７；構造式（７）では、前記ヒドロキシプロピル基の修飾がｘ個（ｘ＝１〜７）の場合を示している。）
【化18】
【化19】
溶血率（％）＝｛（試料と接触した際の上清の吸光度）／（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と接触した際の上清の吸光度）｝×１００
【0072】
図７中、「●」は「ＤＭ−β−ＣＤ」の結果を示し、「■」は「ＨＰ−β−ＣＤ」の結果を示し、「△」は「ＨＥ−ＰＲＸ」の結果を示し、「◇」は「ＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸ」の結果を示し、「▽」は「ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ」の結果を示す。図７の結果から、シクロデキストリンであるＨＰ−β−ＣＤ、及びＤＭ−β−ＣＤは溶血を示したのに対し、ポリロタキサンであるＨＥ−ＰＲＸ、ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ、及びＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸはいずれもシクロデキストリン濃度換算で２０ｍＭの高濃度でも溶血を示さないことが明らかとなった。
これは、ポリロタキサンでは、シクロデキストリンの空洞部をポリマー鎖が占めているため、疎水性空洞部に由来した膜障害性を示さないと推測される。
この結果から、ポリロタキサンは、溶血の観点から、シクロデキストリンよりも安全であると考えられる。
【0073】
（試験例２：コレステロールの集積）健常者由来皮膚繊維芽細胞（以下、「ＮＨＤＦ」」、又は「ＮＨＤＦ細胞」と称する。Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手；番号ＧＭ０５６５９）、ニーマン・ピック病Ｃ型患者由来皮膚繊維芽細胞（以下、「ＮＰＣ１」、又は「ＮＰＣ１細胞」と称する。Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手；番号ＧＭ０３１２３）を用い、以下のようにして細胞内のコレステロールの集積を調べた。
前記ＮＰＣ１を２４ウエルプレートに播種し（細胞数：２．５×１０４個／ウエル）、３７℃で２４時間培養後、下記試料をシクロデキストリン濃度に換算して１００μＭ添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。
前記培養後、４％ パラホルムアルデヒド溶液で細胞を固定し、１００μｇ／ｍＬに調製したフィリピン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）のＰＢＳ溶液を加え４５分間室温で静置した。ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点レーザー走査顕微鏡ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０ｉ（オリンパス社製）でコレステロールの局在を観察した。また、細胞内のコレステロールの集積量の定量を行った。
前記細胞内のコレステロールの集積量の定量は、以下のようにして行った。
細胞溶解液を用い、前記培養後の細胞を溶解させた細胞溶解液を調製し、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）でコレステロールの定量を行い、ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で総タンパク質量を定量した。細胞内の総コレステロール量は、総コレステロール量（ｎｍｏｌ）／総タンパク質量（ｍｇ）で表記した。
なお、比較として、前記ＮＨＤＦを用い、試料を投与しなかった場合、及び前記ＮＰＣ１を用い、試料を投与しなかった場合についても同様にして試験した。
＜試料＞
（１） ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ（製造例１で作製）
（２） ＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸ（製造例２で作製）
（３） ＨＥ−ＰＲＸ（比較製造例１で作製）
（４） ＨＰ−β−ＣＤ（シグマ−アルドリッチ社製）
（５） ＤＭ−β−ＣＤ（シグマ−アルドリッチ社製）
【0074】
共焦点顕微鏡による細胞内コレステロールの観察結果を図８Ａ〜図８Ｇに示し、細胞内のコレステロールの集積量の定量結果を図９に示す。図８Ａは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合の結果を示し、図８Ｂは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ−β−ＣＤを添加した場合の結果を示し、図８Ｃは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＤＭ−β−ＣＤを添加した場合の結果を示し、図８Ｄは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸを添加した場合の結果を示し、図８Ｅは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸを添加した場合の結果を示し、図８Ｆは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥ−ＰＲＸを添加した場合の結果を示し、図８Ｇは、細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合の結果を示す。各画像において、白色で示された部分がコレステロールを表す。各試料の添加量はシクロデキストリン濃度換算で１００μＭである。
図９では、左側から順に、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合（試料未添加）」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ−β−ＣＤを添加した場合（ＨＰ−β−ＣＤ添加）」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＤＭ−β−ＣＤを添加した場合（ＤＭ−β−ＣＤ添加）」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸを添加した場合（ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ添加）」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸを添加した場合（ＨＥ−ａｓｅ−ＰＲＸ添加）」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥ−ＰＲＸを添加した場合（ＨＥ−ＰＲＸ添加）」、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合（試料未添加）」の結果を示す。各試料の添加量はシクロデキストリン濃度換算で１００μＭである。
【0075】
図８Ａ〜図８Ｇの結果から、前記ＮＨＤＦ細胞に比べ、前記ＮＰＣ１細胞では多量のコレステロールが細胞内に沈着している様子が認められた。前記ＮＰＣ１細胞に対し、前記ＤＭ−β−ＣＤを作用させると蛍光強度が減少し、コレステロールの排泄が促進されたと予想される。
一方、細胞内分解性結合を有するＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ、及びＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸで処理した場合には、前記ＮＨＤＦ細胞と同程度まで蛍光強度が減少し、前記ＤＭ−β−ＣＤ、及び現在臨床試験中の前記ＨＰ−β−ＣＤよりも非常に優れたコレステロール除去作用が示された。
なお、細胞内分解性結合を有さないＨＥ−ＰＲＸを用いた場合の蛍光強度は、細胞内分解性結合を有するＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ、及びＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸで処理した場合よりも高く、コレステロール除去作用が劣っていた。
【0076】
図９の結果から、現在臨床試験中のＨＰ−β−ＣＤは、本試験濃度ではコレステロールの除去率は僅かであったが、既存の試薬中で最もコレステロール包接能の高いＤＭ−β−ＣＤではＨＰ−β−ＣＤよりもコレステロールを除去できたことが明らかとなった。一方、細胞内分解性結合を有するＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸ、又はＤＭＡＥ−ａｃｅ−ＰＲＸで処理したＮＰＣ１細胞では、前記ＨＰ−β−ＣＤ、及びＤＭ−β−ＣＤよりもコレステロールを除去することができ、また、細胞内分解性結合を有さない前記ＨＥ−ＰＲＸよりもコレステロールが除去されており、非常に高い効果を示すことが明らかとなった。
【0077】
以上の結果から、細胞内分解性結合を有するＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ、及びＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸで処理したＮＰＣ１細胞ではコレステロールの蓄積が大幅に減少していることが明らかとなった。これは、細胞内でのジスルフィド結合、あるいはアセタール結合の切断によりシクロデキストリンが細胞内で放出されたことで、細胞内のコレステロールが除去されたためと考えられる。したがって、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンは、低侵襲的かつ疾患細胞からのコレステロールの除去効果に優れ、ニーマン・ピック病Ｃ型を含むライソゾーム病の治療薬として用いうることが示された。
【0078】
（試験例３：細胞毒性の評価）ＮＰＣ１を用い、以下のようにしてポリロタキサン、シクロデキストリン誘導体の細胞毒性を調べた。
前記ＮＰＣ１細胞を９６ウエルプレートに播種し（細胞数：１×１０４個／ウエル）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ社製）中で、２４時間、３７℃で培養した。培地を９０μＬのダルベッコ改変イーグル培地に交換後、下記試料をシクロデキストリン濃度に換算して０．１ｍＭから２０ｍＭの濃度範囲で１０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。その後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁堂社製）を１０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で１時間静置した。
Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。試料の代わりにリン酸緩衝溶液を添加した細胞の吸光度を細胞生存率１００％として、以下のようにして細胞生存率（％）を算出した。結果を図１０に示す。
＜試料＞
（１） ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ（製造例１で作製）
（２） ＨＥ−ＰＲＸ（比較製造例１で作製）
（３） ＨＰ−β−ＣＤ（シグマ−アルドリッチ社製）
（４） ＤＭ−β−ＣＤ（シグマ−アルドリッチ社製）
＜細胞生存率の算出方法＞
細胞生存率（％）＝｛（試料を添加し、培養した細胞の吸光度）／（リン酸緩衝溶液を添加し、培養した細胞の吸光度）｝×１００
【0079】
図１０中、「●」は「ＤＭ−β−ＣＤ」の結果を示し、「■」は「ＨＰ−β−ＣＤ」の結果を示し、「△」は「ＨＥ−ＰＲＸ」の結果を示し、「▽」は「ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ」の結果を示す。図１０の結果から、シクロデキストリン誘導体であるＨＰ−β−ＣＤ、及びＤＭ−β−ＣＤは細胞生存率の低下を示したのに対し、ポリロタキサンであるＨＥ−ＰＲＸ、及びＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸではいずれもシクロデキストリン濃度換算で２０ｍＭの高濃度でも細胞生存率の低下を示さないことが明らかとなった。
これは、ポリロタキサンでは、シクロデキストリンの空洞部をポリマー鎖が占めているため、細胞に対する膜障害性を示さないためであると推測される。
この結果から、ポリロタキサンは、細胞毒性の観点から、シクロデキストリンよりも安全であると考えられる。
【0080】
（試験例４：共焦点顕微鏡による局在観察）＜試料の調製＞
ＮＰＣ１と接触した際のポリロタキサン、シクロデキストリン誘導体の局在を明らかとするために、試料として用いるフルオレセインイソチオシアネートエチレンジアミン（ＦＩＴＣ―ＥＤＡ）で修飾したＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ（以下、「ＦＩＴＣ標識ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ」と称する）、ＨＰ−β−ＣＤ（以下、「ＦＩＴＣ標識ＨＰ−β−ＣＤ」と称する）を以下のようにして調製した。
【0081】
−ＦＩＴＣ標識ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸの調製−製造例１で調製したＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ ３０ｍｇを３ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。１，１’―カルボニルジイミダゾールを４．８３ｍｇ加え、室温で２４時間撹拌した。ＦＩＴＣ−ＥＤＡ（既報に従い合成。参考文献：Ｎ． Ｖ． Ｎｕｋｏｌｏｖａ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３２（２３）、５４１７−５４２６（２０１１））を２．６７ｍｇ加え、室温でさらに２４時間撹拌した。反応後、分画分子量３，５００の透析膜（スペクトラ社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応のＦＩＴＣ−ＥＤＡを除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでＦＩＴＣ標識ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸを１３．２ｍｇ得た。ＦＩＴＣの修飾数は紫外−可視分光光度計を用いて４９４ｎｍの吸光度より算出し、ポリロタキサン中のβ−ＣＤ 一分子に対し、０．０４分子のＦＩＴＣが修飾されていることを確認した。
【0082】
−ＦＩＴＣ標識ＨＰ−β−ＣＤの調製−ＨＰ−β−ＣＤ（シグマ−アルドリッチ社製） ２００ｍｇを１０ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。１，１’―カルボニルジイミダゾールを６６．６ｍｇ加え、室温で２４時間撹拌した。ＦＩＴＣ−ＥＤＡを６１．６ｍｇ加え、室温でさらに２４時間撹拌した。反応後、分画分子量１，０００の透析膜（スペクトラ社製）へ加え、超純水に対し１０日間透析をすることで未反応のＦＩＴＣ−ＥＤＡを除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでＦＩＴＣを修飾したＨＰ−β−ＣＤ（ＦＩＴＣ−ＨＰ−β−ＣＤ）を１６．９ｍｇ得た。ＦＩＴＣの修飾数は上記と同様に行った。未修飾ＨＰ−β−ＣＤとＦＩＴＣ−ＨＰ−β−ＣＤを混合し、ＨＰ−β−ＣＤ 一分子に対するＦＩＴＣ修飾数が０．０４分子となるよう調整した。
【0083】
＜局在観察＞ＮＰＣ１を３５ｍｍガラスボトムディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）に播種し（細胞数：１×１０４個／ディッシュ）、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中で、２４時間、３７℃で培養した。培地を９００μＬのダルベッコ改変イーグル培地に交換後、シクロデキストリン濃度に換算して５ｍＭに調整した前記試料を１００μＬずつ各ディッシュに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。
その後、リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液を１ｍＬ加え、室温で１５分間静置し、細胞を固定した。
リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄後、０．１％Ｔｒｉｒｏｎ Ｘ−１００を１ｍＬ加え、室温で１０分間静置し、細胞膜の透過処理を行った。
リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄後、１％ ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液で希釈したマウスモノクローナル抗ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ ａｎｔｉｇｅｎ １（ＥＥＡ１）抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、マウスモノクローナル抗ＣＤ６３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、マウスモノクローナル抗ｌｙｓｏｓｏｍａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＬＡＭＰ１）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）をそれぞれのディッシュに加え、室温で１時間静置した。
その後、リン酸緩衝溶液で３回洗浄し、１％ ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液で希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ溶液を加え、室温で３０分静置した。その後、リン酸緩衝溶液で３回洗浄した。
顕微鏡観察はＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０ｉ（オリンパス社製）で行った。
【0084】
蛍光顕微鏡観察により、ＦＩＴＣ標識ＨＰ−β−ＣＤ、ＦＩＴＣ標識ＨＥ−ＰＲＸの局在位置を詳細に求めるため、初期エンドソーム、後期エンドソーム、及びリソソームをＥＥＡ１、ＣＤ６３、及びＬＡＭＰ１で免疫染色した結果を図１１Ａ〜図１１Ｆに示す。【0085】
また、ＦｌｕｏＶｉｅｗ Ｖｉｅｗｅｒ（オリンパス社製）を用い、ＥＥＡ１、ＣＤ６３、又はＬＡＭＰ１陽性小胞に対するＦＩＴＣ標識ＨＰ−β−ＣＤ、ＦＩＴＣ標識ＨＥ−ＰＲＸの共局在率を図１１Ａ〜図１１Ｆの画像より計算した結果を図１２に示す。前記計算は、細胞２０個に対し、ＥＥＡ１、ＣＤ６３、又はＬＡＭＰ１陽性小胞に対する共局在率を求め、平均値と標準誤差とを計算した。【0086】
図１１Ａ〜図１２の結果から、ＦＩＴＣ標識ＨＰ−β−ＣＤは、初期エンドソーム（ＥＥＡ１陽性小胞）、後期エンドソーム（ＣＤ６３陽性小胞）、及びリソソーム（ＬＡＭＰ１陽性小胞）における局在は少なく、大部分は細胞膜近傍に局在している様子が観察された。これは、β−ＣＤの空洞部が細胞膜中の脂質、コレステロールと相互作用するためであると予想される。この結果は、β−ＣＤが細胞膜と強く相互作用し、膜障害性、溶血を示すといった上述の結果と一致する。また、ＦＩＴＣ標識ＨＥ−ＰＲＸは、後期エンドソーム（ＣＤ６３陽性小胞）、又はリソソーム（ＬＡＭＰ１陽性小胞）に局在していた。ポリロタキサンは、エンドサイトーシスにより細胞内へと取り込まれ、後期エンドソーム、リソソームに到達したと考えられる。ポリロタキサンは、β−ＣＤの空洞部が高分子鎖で占有されているため細胞膜との作用がなく、結果としてエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれると予想される。
以上の結果より、ＦＩＴＣ標識ＨＰ−β−ＣＤとＦＩＴＣ標識ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸとでは、細胞に対する局在、作用箇所が大きく異なることが明らかとなった。
【0087】
（試験例５：コレステロール除去作用）ポリロタキサン、シクロデキストリン誘導体によるＮＰＣ１からのコレステロール除去作用をより詳細に検討した。
ＮＰＣ１を２４ウエルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種し（細胞数：２．５×１０４個／ディッシュ）、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中で、２４時間、３７℃で培養した。培地を２７０μＬのダルベッコ改変イーグル培地に交換後、シクロデキストリン濃度に換算して０．０１ｍＭ〜１００ｍＭに調整した下記試料を３０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。
その後、リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ社製）を各ウエルに添加し細胞を剥離させた。細胞を１．５ｍＬチューブに集め、リン酸緩衝溶液で２回洗浄した。その後、細胞溶解液（５０ｍＭリン酸緩衝溶液、５００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭコール酸、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む）を各チューブに加え細胞を溶解した。
各細胞溶解液に対し、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）により総コレステロールの定量を行い、またｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により総タンパク質量を定量した。細胞内の総コレステロール量は、総コレステロール量（ｎｍｏｌ）／総タンパク質量（ｍｇ）で表記した。
なお、比較として、前記ＮＨＤＦを用い、試料を投与しなかった場合、及び前記ＮＰＣ１を用い、試料を投与しなかった場合についても同様にして試験した。
＜試料＞
（１） ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ（製造例１で作製）
（２） ＨＥ−ＰＲＸ（比較製造例１で作製）
（３） ＨＰ−β−ＣＤ（シグマ−アルドリッチ社製）
（４） ＤＭ−β−ＣＤ（シグマ−アルドリッチ社製）
【0088】
結果を図１３に示す。図１３中、「●」は「ＤＭ−β−ＣＤ」の結果を示し、「■」は「ＨＰ−β−ＣＤ」の結果を示し、「△」は「ＨＥ−ＰＲＸ」の結果を示し、「▽」は「ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ」の結果を示す。コレステロール蓄積量に対する用量反応曲線より半数効果濃度（ＥＤ５０）を求めた結果、ＨＰ−β−ＣＤ、ＤＭ−β−ＣＤ、ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸのＥＤ５０は、それぞれ２．５９ｍＭ、０．２３ｍＭ、０．０２４ｍＭであった。
以上の結果より、細胞内分解性結合を有するＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸは既存のβ−ＣＤ誘導体と比較して１０分の１から１００分の１の濃度でＮＰＣ１からのコレステロール除去が可能であることが明らかとなった。また、非分解性のＨＥ−ＰＲＸは、本実験濃度域では有意なコレステロール減少は示さなかった。
本結果は、細胞内におけるポリロタキサン中の分解性結合の切断と、それに伴うβ−ＣＤの放出が低濃度でのコレステロール除去に結実したと考えられる。
【0089】
（試験例６：コレステロール除去作用）試料として、下記試料を用いた以外は、試験例５と同様にして試験を行い、ポリロタキサン中の分解性結合の種類がＮＰＣ１からのコレステロール除去作用に与える影響を検討した。
＜試料＞
（１） ＨＥ−ＰＲＸ（比較製造例１で作製）
（２） ＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸ（製造例２で作製）
（３） ＨＥ−ＣＯＯ−ＰＲＸ（製造例３で作製）
（４） ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ（製造例１で作製）
【0090】
結果を図１４に示す。図１４中、「△」は「ＨＥ−ＰＲＸ」の結果を示し、「□」は「ＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸ」の結果を示し、「○」は「ＨＥ−ＣＯＯ−ＰＲＸ」の結果を示し、「▽」は「ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ」の結果を示す。コレステロール蓄積量に対する用量反応曲線よりＥＤ５０を求めた結果、ＨＥ−ａｃｅ−ＰＲＸ、ＨＥ−ＣＯＯ−ＰＲＸ、ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸのＥＤ５０は、それぞれ０．１３ｍＭ、０．４９ｍＭ、０．０２４ｍＭであった。
以上の結果より、細胞内分解性結合を有するポリロタキサンはいずれもＮＰＣ１からのコレステロール除去が可能であることが明らかとなった。特にジスルフィド結合を有するポリロタキサンはコレステロール除去作用が高いことが明らかとなった。このようなポリロタキサン中の分解性結合種によるコレステロール除去作用の差異は、細胞内における分解性結合の分解効率に関係していると考えられる。
【0091】
（試験例７−１：コレステロール除去作用）試料として、下記資料を用いた以外は、試験例５と同様にして試験を行い、ポリロタキサンのシクロデキストリンに導入された官能基の種類がＮＰＣ１からのコレステロール除去作用に与える影響を検討した。
＜試料＞
（１） ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ（製造例１で作製）
（２） ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸ（製造例４で作製）
【0092】
結果を図１５Ａに示す。図１５Ａ中、「▽」は「ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ」の結果を示し、「●」は「ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸ」の結果を示す。コレステロール蓄積量に対する用量反応曲線よりＥＤ５０を求めた結果、ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ、ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸのＥＤ５０は、それぞれ０．０２６ｍＭ、０．００２８ｍＭであった。
以上の結果より、ポリロタキサンによるＮＰＣ１からのコレステロール除去には、ポリロタキサンに修飾する官能基が影響することが明らかとなった。本結果は、細胞内へのポリロタキサンの取り込み量が変化するためであると予想される。特に静電荷を有するＤＭＡＥ基を導入したポリロタキサンは細胞膜と静電的に強く相互作用し、効率的に細胞内へと取り込まれると考えられる。
【0093】
（試験例７−２：細胞への取込み量）各ポリロタキサンの細胞への取込み量を以下のようにして、フローサイトメトリーにより求めた。
【0094】
＜試料の調製＞ポリロタキサンの細胞への取込み量を調べるために、試料として用いるＦＩＴＣ標識ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸ、フルオレセインイソチオシアネートエチレンジアミン（ＦＩＴＣ―ＥＤＡ）で修飾したＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸ（以下、「ＦＩＴＣ標識ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸ」と称する）を以下のようにして調製した。
【0095】
−ＦＩＴＣ標識ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸの調製−試験例４と同様にして調製した。
【0096】
−ＦＩＴＣ標識ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸの調製−製造例４で調製したＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸ ３０ｍｇを５ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。１，１’―カルボニルジイミダゾールを０．７６ｍｇ加え、室温で２４時間撹拌した。ＦＩＴＣ−ＥＤＡを４．２ｍｇ加え、室温でさらに２４時間撹拌した。反応後、分画分子量３，５００の透析膜（スペクトラ社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応のＦＩＴＣ−ＥＤＡを除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでＦＩＴＣ標識ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸを２７．５ｍｇ得た。ＦＩＴＣの修飾数は紫外−可視分光光度計を用いて４９４ｎｍの吸光度より算出した。未標識ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸとＦＩＴＣ−ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸを混合し、ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸ上のβ−ＣＤ 一分子に対するＦＩＴＣ修飾数が０．０４分子となるよう調整した。
【0097】
＜フローサイトメトリー＞ＮＰＣ１を２４ウエルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種し（細胞数：１×１０５個／ディッシュ）、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中で、２４時間、３７℃で培養した。培地を２７０μＬのダルベッコ改変イーグル培地に交換後、シクロデキストリン濃度に換算して０．２５ｍＭに調整した下記試料を３０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。
その後、リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ社製）を各ウエルに添加し細胞を剥離させた。細胞を１．５ｍＬチューブに集め、リン酸緩衝溶液で２回洗浄した。その後、０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液を加え、３５μｍセルストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）により濾過した。
細胞の蛍光強度をＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により求めた。細胞１０，０００個を数え、その平均値を図１５Ｂに示す。
【0098】
フローサイトメトリーによりＦＩＴＣ標識ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸとＦＩＴＣ標識ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸとの細胞内への取込み量を比較した結果、ＦＩＴＣ標識ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸは、ＦＩＴＣ標識ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸの２２．６倍高い蛍光強度を示した（図１５Ｂ、図１５Ｂ中、ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸはＦＩＴＣ標識ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸの結果を示し、ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸは、ＦＩＴＣ標識ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸの結果を示す）。本結果より、ＤＭＡＥ−ＳＳ−ＰＲＸは効率的に細胞に取り込まれるため、ＨＥ−ＳＳ−ＰＲＸよりも低濃度でＮＰＣ１からのコレステロール除去が可能であると考えられる。【0099】
（試験例８：免疫染色によるオートファゴソームの観察）前記ＮＰＣ１を３５ｍｍガラスボトムディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）に播種し（細胞数：１．５×１０４個／ディッシュ）、３７℃、５％ ＣＯ２環境下で１日間培養後、下記試料を添加し、さらに２４時間培養した。
前記培養後、４％ パラホルムアルデヒド溶液（Ｗａｋｏ社製）で１０分間処理することで細胞を固定し、５０μｇ／ｍＬ ジギトニン溶液（東京化成工業社製）で５分間処理することで細胞膜の透過処理を行い、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で３０分間処理することでブロッキングを行った。
次いで、Ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ＬＣ３抗体（ＭＢＬ社製）を１％ ＢＳＡ溶液で１：２００の希釈率で混合したもので、４℃で１日間処理した。細胞をＰＢＳで洗浄後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ａｂｃａｍ社製）（１％ ＢＳＡ溶液で１，０００分の１に希釈）で３０分間染色した。細胞をＰＢＳで洗浄後、ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ−１０ｉ（オリンパス社製）で観察を行った。
なお、比較として、前記ＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合、及び前記ＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合についても同様にして試験した。
＜試料＞
（１） ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸ（製造例５で作製、添加量は、シクロデキストリン濃度に換算して０．０１ｍＭ〜１ｍＭ）
（２） ＨＰ−β−ＣＤ（シグマ−アルドリッチ社製、添加量は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ）
【0100】
細胞のＬＣ３染色画像を図１６Ａ〜図１６Ｄに示し、細胞内ＬＣ３陽性小胞数の定量結果を図１６Ｅに示す。図１６Ａは、細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合の結果を示し、図１６Ｂは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合の結果を示し、図１６Ｃは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ−β−ＣＤを添加（添加量：１０ｍＭ）した場合の結果を示し、図１６Ｄは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸを添加（添加量：ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸ上のβ−ＣＤ濃度が１ｍＭとなるように添加）した場合の結果を示す。
図１６Ｅでは、左側から順に、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ−β−ＣＤを添加（添加量：１０ｍＭ）した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸを添加（添加量：ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸ上のβ−ＣＤ濃度が１ｍＭとなるように添加）した場合」の結果を示す。
【0101】
ＬＣ３染色画像より細胞内のＬＣ３陽性小胞数を定量した結果、図１６Ｅに示されるように、ＮＨＤＦ（正常細胞）と比較してＮＰＣ１では、基底状態のＬＣ３陽性小胞数が有意に多いことが確認された。また、ＨＰ−β−ＣＤを作用させたＮＰＣ１ではＬＣ３陽性小胞数がさらに増加した。一方、ジスルフィド結合を有するポリロタキサン（ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸ）を作用させたＮＰＣ１ではＬＣ３陽性小胞数が正常細胞と同程度まで減少することが明らかとなった。【0102】
（試験例９：ＬＣ３及びｐ６２の発現評価）下記細胞におけるＬＣ３及びｐ６２の発現をウエスタンブロットにより、以下のようにして評価した。
＜細胞＞
（１） ＮＰＣ１細胞
（２） ＮＨＤＦ細胞
（３） ＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手；番号ＧＭ１８４５５）
（４） ファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手；番号ＧＭ００１０７）
（５） ＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手；番号ＧＭ０３５８９）
【0103】
前記細胞を１２ウエルプレート（Ｎｕｎｃ社製）に播種し（細胞数：１×１０５個／ウエル）、３７℃、５％ ＣＯ２環境下で１日間培養後、下記試料を添加し、さらに２４時間培養した。前記培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、１％ プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク社製）、１％ ホスファターゼインヒビターカクテル（ナカライテスク社製）を含むＲＩＰＡバッファー（Ｗａｋｏ社製）を１５０μＬ加え、３０分間振盪し細胞を溶解した。前記細胞溶解液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を回収した。
前記上清１０μＬと、Ｌａｅｍｍｌｉ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ社製） ２．５μＬとを混合し、１２％アクリルアミドゲルに加えた。その後、１５０Ｖで４５分間電気泳動を行った。その後、トランスブロット Ｔｕｒｂｏ ブロッティングシステム（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏｒａｄ社製）に転写した。その後、５％スキムミルク溶液（Ｗａｋｏ社製）で１時間ブロッキングを行った。
ブロッキング処理の後、オートファジーの指標である抗ＬＣ３抗体（ＭＢＬ社製）、選択的オートファジー基質である抗ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１抗体（ＭＢＬ社製）、抗β−ａｃｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１％スキムミルク溶液で希釈したもので、ＰＶＤＦ膜を４℃で１日間処理した。
ＰＢＳで３回洗浄後、１％スキムミルク溶液で希釈したＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧでＰＶＤＦ膜を室温で１時間処理した。
ＰＢＳで３回洗浄後、Ｐｉｅｒｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅで処理し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ５００システム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）でＰＶＤＦ膜の撮影を行った。
なお、比較として、前記ＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合、前記ＮＨＤＦを用い、試料の代わりにＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１（以下、「Ｂａｆ Ａ」と称する）を添加した場合、前記ＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合、前記ＮＰＣ１を用い、試料の代わりにＢａｆ Ａを添加した場合についても同様にして試験した。
＜試料＞
（１） ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸ（製造例５で作製、添加量は、ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸ上のβ−ＣＤ濃度に換算して０．０１ｍＭ〜１ｍＭ）
（２） ＨＰ−β−ＣＤ（シグマ−アルドリッチ社製、添加量は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ）
【0104】
ＮＨＤＦ及びＮＰＣ１のウエスタンブロットの結果を図１７Ａに示し、ＮＨＤＦ及びＮＰＣ１におけるＬＣ３−ＩＩの相対発現量を図１７Ｂに示し、ＮＨＤＦ及びＮＰＣ１におけるｐ６２の相対発現量を図１７Ｃに示す。また、ＮＨＤＦ、ＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞、ファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞、及びＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞のウエスタンブロットの結果を図１７Ｄに示し、ＮＨＤＦ、ＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞、ファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞、及びＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞におけるＬＣ３−ＩＩの相対発現量を図１７Ｅに示す。
なお、前記各相対発現量は、ウエスタンブロットのバンド強度から求めたものである。
【0105】
図１７Ａ、図１７Ｂ、及び図１７Ｃでは、左側から順に、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料の代わりにＢａｆ Ａを添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料の代わりにＢａｆ Ａを添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ−β−ＣＤを０．１ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ−β−ＣＤを１ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ−β−ＣＤを１０ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸを０．０１ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸを０．１ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸを１ｍＭ添加した場合」の結果を示す。【0106】
図１７Ｄ、及び図１７Ｅでは、左側から順に、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＰ−β−ＣＤを１０ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸを１ｍＭ添加した場合」、「細胞としてファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＰ−β−ＣＤを１０ｍＭ添加した場合」、「細胞としてファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸを１ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＰ−β−ＣＤを１０ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸを１ｍＭ添加した場合」の結果を示す。【0107】
図１７Ａ〜図１７Ｃの結果から、リソソーム内の低ｐＨを中和しオートファジー形成不全を起こすことが知られているＢａｆ Ａを添加することにより、ＬＣ３、ｐ６２の顕著な増加が認められた。また、ＨＰ−β−ＣＤを添加した場合には、濃度依存的にＬＣ３−ＩＩの発現量が顕著に増加し、１０ｍＭの濃度ではｐ６２の有意な増加も認められた。一方、ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸ（細胞内分解性結合を有するポリロタキサン）を添加した場合には、ＬＣ３−ＩＩ、ｐ６２の発現量の増加は起こらなかった。また、バンド強度より相対発現量を求めると、濃度依存的にＬＣ３−ＩＩの発現量は減少した。
【0108】
また、図１７Ｄ及び図１７Ｅの結果から、オートリソソームの形成不全が認められているＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞、ファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞、及びＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞においても、ＨＰ−β−ＣＤの添加はＬＣ３−ＩＩの増加をもたらし、ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸの添加はＬＣ３−ＩＩを減少させていた。ＨＰ−β−ＣＤ、ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸの細胞内ＬＣ３−ＩＩ量の増減に対する効果は細胞種によらず普遍的であり、ＨＰ−β−ＣＤが細胞内にＬＣ３−ＩＩの蓄積をもたらすのに対してＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸはＬＣ３−ＩＩの蓄積を解消していた。
【0109】
以上の結果より、ＨＰ−β−ＣＤはオートリソソームの形成を阻害し、反対に細胞内分解性結合を有するポリロタキサンはオートリソソームの形成を促進していることが予想された。【0110】
（試験例１０：オートリソソーム形成の観察）ＥＧＦＰが酸性下で消光することを利用し、酸性下でも励起−蛍光が可能なｍＲＦＰを、ＥＧＦＰを介してＬＣ３と結合することで、それぞれの蛍光画像よりオートファゴソーム、オートリソソームの形成を評価した（Ｓ． Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ３， ４５２−２６０ （２００７））。具体的には、以下のようにして行った。
【0111】
前記ＮＰＣ１を３５ｍｍガラスボトムディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）に播種し（細胞数：１．５×１０４個／ディッシュ）、３７℃、５％ ＣＯ２環境下で１日間培養した。ｍＲＦＰ−ＥＧＦＰ−ＬＣ３を直列に結合したｐｔｆＬＣ３プラスミドＤＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ社より購入；番号２１０７４）２５０ｎｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ライフテクノロジーズ社製）で希釈し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（ライフテクノロジーズ社製）を加え５分間静置した。
前記プラスミド含有溶液を前記細胞培養液中に添加し、２４時間培養した。培養液を交換後、下記試料を添加し、さらに２４時間培養した。
前記培養後、４％ パラホルムアルデヒド溶液（Ｗａｋｏ社製）で１０分間処理することで細胞を固定した。ＰＢＳで洗浄後。ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ−１０ｉ（オリンパス社製）で観察を行った。
なお、比較として、前記ＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合、及び前記ＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合についても同様にして試験した。
＜試料＞
（１） ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸ（製造例５で作製、添加量は、シクロデキストリン濃度に換算して１ｍＭ）
（２） ＨＰ−β−ＣＤ（シグマ−アルドリッチ社製、添加量は、１０ｍＭ）
【0112】
各細胞中のｐｔｆＬＣ３の発現を蛍光顕微鏡で観察した結果を図１８Ａに示し、オートファゴソーム数及びオートリソソーム数の画像解析結果を図１８Ｂに示す。【0113】
図１８Ａでは、左側から順に、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ−β−ＣＤを添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸを添加した場合」の結果を示し、上段は「ＧＦＰ」に由来する蛍光画像を示し、下段は「ｍＲＦＰ」に由来する蛍光画像を示す。【0114】
図１８Ｂでは、左側から順に、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ−β−ＣＤを添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸを添加した場合」の結果を示し、各項目における左側は、オートファゴソーム数、右側は、オートリソソーム数を解析した結果を示す。【0115】
図１８Ａ及び図１８Ｂの結果から、未処理の正常繊維芽細胞と比較して、未処理のＮＰＣ１細胞ではオートファゴソーム数の増加とオートリソソーム数の減少が認められた。ＨＰ−β−ＣＤで処理したＮＰＣ１細胞では、オートリソソーム数に変化はないものの、オートファゴソーム数の増加が認められた。
一方、ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸで処理したＮＰＣ１細胞では、正常細胞とほぼ同程度のオートファゴソーム、オートリソソームが観察され、細胞内分解性結合を有するポリロタキサンの添加により、ＮＰＣ１細胞におけるオートリソソームの形成不全を解消できることが明らかとなった。
【0116】
（試験例１１：オートファゴソームとリソソームとの融合の観察）オートリソソームの形成をより詳細に調べるために、プラスミドＤＮＡにより一過的に発現させたｍＲＦＰ−ＬＣ３、及びリソソーム特異的膜タンパク質であるＬＡＭＰ１の局在を、以下のようにして観察した。
【0117】
前記ＮＰＣ１を３５ｍｍガラスボトムディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）に播種し（細胞数：１．５×１０４個／ディッシュ）、３７℃、５％ ＣＯ２環境下で１日間培養した。ｍＲＦＰ−ＬＣ３発現プラスミドＤＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ社より購入；番号２１０７５）２５０ｎｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ライフテクノロジーズ社製）で希釈し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（ライフテクノロジーズ社製）を加え５分間静置した。
前記プラスミド含有溶液を前記細胞培養液中に添加し、２４時間培養した。培養液を交換後、下記試料を添加し、さらに２４時間培養した。
前記培養後、４％ パラホルムアルデヒド溶液（Ｗａｋｏ社製）で１０分間処理することで細胞を固定し、５０μｇ／ｍＬ ジギトニン溶液（東京化成工業社製）で５分間処理することで細胞膜の透過処理を行い、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で３０分間処理することでブロッキングを行った。
次いで、Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ＬＡＭＰ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）を１％ ＢＳＡ溶液で１：２００の希釈率で混合したもので、４℃で１日間処理した。細胞をＰＢＳで洗浄後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ａｂｃａｍ社製）（１％ ＢＳＡ溶液で１，０００分の１に希釈）で３０分間染色した。細胞をＰＢＳで洗浄後、ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ−１０ｉ（オリンパス社製）で観察を行い、ｍＲＦＰ−ＬＣ３とＬＡＭＰ１との共局在率を評価した。
なお、比較として、前記ＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合、及び前記ＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合についても同様にして試験した。
＜試料＞
（１） ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸ（製造例５で作製、添加量は、シクロデキストリン濃度に換算して１ｍＭ）
（２） ＨＰ−β−ＣＤ（シグマ−アルドリッチ社製、添加量は、１０ｍＭ）
【0118】
各細胞中のｍＲＦＰ−ＬＣ３及びＬＡＭＰ１の発現を観察した結果を図１９Ａに示し、ｍＲＦＰ−ＬＣ３とＬＡＭＰ１との共局在率を求めた結果を図１９Ｂに示す。【0119】
図１９Ａでは、左側から順に、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ−β−ＣＤを添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸを添加した場合」の結果を示し、上段は「ｍＲＦＰ−ＬＣ３」の発現を観察した結果を示し、下段は内在性「ＬＡＭＰ１」の局在を観察した結果を示す。【0120】
図１９Ｂでは、左側から順に、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ−β−ＣＤを添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸを添加した場合」の結果を示す。図１９Ｂにおける縦軸は、細胞におけるｍＲＦＰ−ＬＣ３とＬＡＭＰ１との共局在率を示す。【0121】
図１９Ａ及び図１９Ｂの結果から、未処理の正常繊維芽細胞と比較して、未処理のＮＰＣ１細胞ではｍＲＦＰ−ＬＣ３とＬＡＭＰ１との共局在率が低く、オートリソソームの形成が生じにくいことが示唆された。また、ＨＰ−β−ＣＤで処理したＮＰＣ１細胞では、未処理のＮＰＣ１細胞と同様にｍＲＦＰ−ＬＣ３とＬＡＭＰ１との共局在率が低かった。
一方、ＨＥＥ−ＳＳ−ＰＲＸで処理したＮＰＣ１細胞では、ｍＲＦＰ−ＬＣ３とＬＡＭＰ１との共局在率が正常細胞とほぼ同程度まで上昇し、オートリソソーム形成の亢進が示唆された。
【0122】
試験例８〜１１の結果から、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンは、オートリソソームの形成を亢進する作用を示すことが見出された。そのため、本発明のポリロタキサンは、オートリソソームの形成不全によりオートファジー機能が阻害された疾患に対する医薬品としての応用が期待される。【0123】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。＜１＞ 複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンを含有することを特徴とする脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患に対する医薬組成物である。
＜２＞ 脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患が、ライソゾーム病である前記＜１＞に記載の医薬組成物である。
＜３＞ 環状分子が、シクロデキストリンである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の医薬組成物である。
＜４＞ 細胞内分解性結合が、アセタール結合、ケタール結合、ジスルフィド結合、エステル結合、オルトエステル結合、ビニルエーテル結合、及びヒドラジド結合から選択されるいずれかである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の医薬組成物である。
＜５＞ 線状分子が、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、ポリプロピレングリコール、及びポリエチレングリコールのいずれかである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の医薬組成物である。
＜６＞ ライソゾーム病が、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ファーバー病、ウォルマン病、及びファブリー病から選択されるいずれかである前記＜２＞から＜５＞のいずれかに記載の医薬組成物である。
＜７＞ ライソゾーム病が、ニーマン・ピック病Ｃ型、ＧＭ１ガングリオシドーシス、及びファブリー病から選択されるいずれかである前記＜２＞から＜６＞のいずれかに記載の医薬組成物である。
＜８＞ 複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンであって、
前記線状分子は、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールの順に重合した共重合体であり、
前記複数の環状分子がβ−シクロデキストリンであることを特徴とするポリロタキサンである。
＜９＞ 細胞内分解性結合が、アセタール結合、ケタール結合、ジスルフィド結合、エステル結合、オルトエステル結合、ビニルエーテル結合、及びヒドラジド結合から選択されるいずれかである前記＜８＞に記載のポリロタキサンである。
＜１０＞ 脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患を予防又は治療するための方法であって、個体に、前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを特徴とする方法である。
＜１１＞ 前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の医薬組成物の脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患を予防又は治療するための使用。
＜１２＞ 脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患を予防又は治療するための医薬品製造のための前記＜８＞または＜９＞のポリロタキサンの使用。
【産業上の利用可能性】
【0124】
本発明の医薬組成物は、ポリロタキサン構造を有することにより、溶血を回避することができるため従来のシクロデキストリン単体より安全性が高いだけでなく、細胞内選択的にシクロデキストリンを放出することで高いコレステロール除去作用を有する。また、本発明の医薬組成物は、優れたオートリソソームの形成亢進作用を有する。これらの作用により、高い治療効果又は予防効果を有し、かつ副作用の少ない優れた医薬組成物として利用可能である。また、本発明の医薬組成物は、ポリロタキサン構造を有しており、シクロデキストリンよりも高分子量化されているため、血中半減期の延長による薬効の持続性、投与量や投与回数の低減も期待される。