特許6469574 | 知財ポータル「IP Force」

知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」

▶ ダブリュー・アール・グレース・アンド・カンパニー−コーンの特許一覧

特許6469574官能化粒状保持体ならびにその製造法及び使用法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

目に優しい文字サイズ小中大 PDF Top

< >

1
2
3
4
5

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6469574

(24)【登録日】2019年1月25日

(45)【発行日】2019年2月13日

(54)【発明の名称】官能化粒状保持体ならびにその製造法及び使用法

(51)【国際特許分類】

B01J 20/281 20060101AFI20190204BHJP

B01J 20/286 20060101ALI20190204BHJP

B01J 20/30 20060101ALI20190204BHJP

B01J 39/17 20170101ALI20190204BHJP

B01J 39/20 20060101ALI20190204BHJP

B01J 39/26 20060101ALI20190204BHJP

B01J 41/14 20060101ALI20190204BHJP

B01J 41/20 20060101ALI20190204BHJP

B01D 15/08 20060101ALI20190204BHJP

C08F 292/00 20060101ALI20190204BHJP

【ＦＩ】

B01J20/26 L

B01J20/281 X

B01J20/286

B01J20/30

B01J39/17

B01J39/20

B01J39/26

B01J41/14

B01J41/20

B01D15/08

C08F292/00

【請求項の数】15

【全頁数】43

(21)【出願番号】特願2015-532127(P2015-532127)

(86)(22)【出願日】2013年9月16日

(65)【公表番号】特表2015-531312(P2015-531312A)

(43)【公表日】2015年11月2日

(86)【国際出願番号】US2013059995

(87)【国際公開番号】WO2014043644

(87)【国際公開日】20140320

【審査請求日】2016年9月16日

(31)【優先権主張番号】61/702,174

(32)【優先日】2012年9月17日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】590001706

【氏名又は名称】ダブリュー・アール・グレース・アンド・カンパニー−コーン

【氏名又は名称原語表記】ＷＲＧＲＡＣＥ＆ＣＯ−ＣＯＮＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100104374

【弁理士】

【氏名又は名称】野矢宏彰

(72)【発明者】

【氏名】グー，フオン

【審査官】木原啓一郎

(56)【参考文献】

【文献】特開昭６３−００１４４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００８／００７１００３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１５−５３５９２９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｂ０１Ｊ２０／００−２０／３４

Ｂ０１Ｄ１５／００−１５／４２

Ｂ０１Ｊ３９／００−４９／９０

Ｃ０８Ｆ２５１／００−２８３／００；２８３／０２−２８９／００；２９１／００−２９７／０８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

官能化粒状保持体であって、
粒子表面を有する粒子と；そして
前記粒子表面と結合しておりかつ前記粒子表面から伸びている、別個の２組の複数の官能基の組合せ
とを含み、前記官能基の組合せは、
（ｉ）前記粒子表面に共有結合している第一の組の複数の官能基であって、その第一の組の複数の官能基を介して前記粒子表面上で一つ又は複数のモノマーを重合するために十分な第一の組の複数の官能基と、ここで前記第一の複数の官能基は、アリル基、アクリル基、若しくはこれらの組合せ、又は式：

【化1】

の官能基を含む、そして（ii）前記粒子表面の湿潤性を増大するために十分な少なくとも１つの親水性官能基を含む第二の組の複数の官能基、ここで第二の組の官能基は、ヒドロキシル基、ジオール基、オキシエチレン基、ポリエチレン基、カルボン酸基、アミン基、アミド基、又はそれらの基のいずれかの組合せを含む、
とを含む官能化粒状保持体。

【請求項2】

前記粒子がシリカ粒子を含む、請求項１に記載の官能化粒状保持体。

【請求項3】

前記第一の組の複数の官能基が不飽和結合を含む、請求項１に記載の官能化粒状保持体。

【請求項4】

前記第二の組の複数の官能基がジオール基を含む、請求項１または２に記載の官能化粒状保持体。

【請求項5】

前記第一の組の複数の官能基の少なくとも一部が、一つ又は複数のモノマー、及び任意に
一つ又は複数のスペーサーモノマー
と重合して、前記粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。

【請求項6】

一つ又は複数のスペーサーモノマーが使用される場合、ポリマー鎖が、下記式：

【化2】

［式中、
Ｒ^１は、Ｈ又はＣＨ_３であり；
Ｒ’及びＲ”は、それぞれ独立にＨ又はＣＨ_３であり；
Ｙは、

【化3】

【請求項7】

重合が、ポリマーの鎖長又は分子量を低減する連鎖移動剤を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。

【請求項8】

官能化粒状保持体の製造法であって、
粒子の粒子表面を、前記粒子表面に結合しておりかつ前記粒子表面から伸びている別個の２組の複数の官能基の組合せが得られるように処理することを含み、前記官能基の組合せは、
（ｉ）前記粒子表面に共有結合している第一の組の複数の官能基であって、その第一の組の複数の官能基を介して前記粒子表面上で一つ又は複数のモノマーを重合するために十分な第一の組の複数の官能基と、ここで前記第一の複数の官能基は、アリル基、アクリル基、若しくはこれらの組合せ、又は式：

【化4】

の官能基を含む、そして（ii）前記粒子表面の湿潤性を増大するために十分な第二の組の複数の官能基、ここで第二の組の複数の官能基は、ヒドロキシル基、ジオール基、オキシエチレン基、ポリエチレン基、カルボン酸基、アミン基、アミド基、又はそれらの基のいずれかの組合せを含む
とを含む方法。

【請求項9】

第一の組の複数の官能基の少なくとも一部を重合させることをさらに含み、前記重合工程は、第一の組の複数の官能基を一つ又は複数のモノマーと、任意に一つ又は複数のスペーサーモノマーの存在下で反応させて、粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成させることを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

クロマトグラフィー装置に使用するのに適切なクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジであって、前記クロマトグラフィー用カラム又はカートリッジは請求項１〜７のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体を含有するクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。

【請求項11】

前記第一の組の複数の官能基の少なくとも一部が、一つ又は複数のモノマー及び一つ又は複数のスペーサーモノマーと重合して、前記粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成する、請求項１０に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。

【請求項12】

ポリマー鎖が、下記式：

【化5】

［式中、
Ｒ^１は、Ｈ又はＣＨ_３であり；
Ｒ’及びＲ”は、それぞれ独立にＨ又はＣＨ_３であり；
Ｙは、

【化6】

【請求項13】

請求項１０〜１２のいずれかに記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジの製造法であって、前記方法は、
１．管状構造の第一の端部を密封し；
２．管状構造のカラム空洞に、請求項１〜７のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体又は請求項８又は９に記載の方法によって形成された官能化粒状保持体を少なくとも部分的に充填し；
３．管状構造のカラム空洞に第一のバッファー溶液を少なくとも部分的に充填して官能化粒状保持体をカプセル化し；そして、任意に
４．管状構造の反対端を密封する
ことを含む方法。

【請求項14】

請求項１〜７のいずれかに記載の官能化粒状保持体を含有するクロマトグラフィーカラム又はカートリッジハウジング。

【請求項15】

少なくとも一つの生体分子を含有するサンプルの分離法であって、前記方法は、
少なくとも一つの生体分子を含有するサンプルを、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ又は請求項１３に記載の方法で製造されたクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ内の官能化粒状保持体と接触させる工程を含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

[0001]本発明は、一般的に、液体クロマトグラフィーカラムのようなクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジに使用するのに適切な官能化粒状保持体に関する。本発明はさらに、官能化粒状保持体を含有するクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ、官能化粒状保持体の製造法、及び官能化粒状保持体の例えばクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジの担体としての使用法にも関する。

【背景技術】

【0002】

[0002]陽イオン及び陰イオン交換クロマトグラフィー材料は知られている。陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、典型的には、スルホン酸基（例えばＳ強陽イオン交換）及び／又はカルボン酸メチル基（例えばＣＭ弱陽イオン交換）のような表面結合陰イオン基を持つ担体を含有している。陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、典型的には、第四アンモニウム（例えばＱ強陰イオン交換）及び／又はジエチルアミノエチル（例えばＤＥＡＥ弱陰イオン交換）のような表面結合陽イオン基を持つ担体を含有している。

【0003】

[0003]タンパク質精製のような分離プロセスでは、これらの生体分子が極めて高分子量（Ｍ_ｗ）であることを考えると、高Ｍ_ｗ生体分子の担体表面への拡散は非常に限られる。この問題に対処するために、“テンタクル（触毛）”の概念が開発され、非常に有用であることが分かり、広く応用されている。“テンタクル”概念では、グラフトポリマー鎖を含むテンタクルが担体の表面にグラフト（接ぎ木）されている。グラフトポリマー鎖は、ポリマー末端から担体表面へと接続されるイオン基の反復単位を含有している。これらのポリマー鎖は自由に回転できるので、生体分子を担体表面上に拡散させなくてもタンパク質分子とポリマー固定相との間で相互作用を可能とし、高いタンパク質担持が可能となる。

【0004】

[0004]テンタクルコーティング概念に関与する最も一般的な化学は、“グラフト・フロム(graft from)”概念を利用している。そのような化学では、ラジカル重合が担体粒子の表面から開始される。陽イオン交換担体の場合、Ｃｅ（IV）塩（例えば、Ｅ．Ｍｅｒｃｋによる米国特許第５，４５３，１８６号）を利用すれば、表面ジオール基（例えば、重合の前に結合エポキシ基の加水分解を通じて製造）のためのレドックス化学が可能となり、表面ラジカルが生成する。これが２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）のようなスルホン酸含有モノマーを重合する。この化学は、かなりの有害廃棄物を生成するので環境に優しくない。

【0005】

[0005]陽イオン及び／又は陰イオン交換クロマトグラフィー担体として使用するのに適切な費用効果の高い担体、ならびにそのような費用効果の高い担体を含有するクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ（１回使用及び／又は使い捨てのクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジを含む）を開発するための努力が続けられている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許第５，４５３，１８６号

【発明の概要】

【0007】

[0006]本発明は、陽イオン及び／又は陰イオン交換クロマトグラフィー材料として使用するのに適切な、費用効果の高い担体に向けられる。開示された担体は、本明細書中では“官能化粒状保持体”と呼ぶが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用カラム及び高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）のようなクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジに使用するのに適している。

【0008】

[0007]本発明の一態様において、官能化粒状保持体は、粒子表面を有する粒子と、その粒子表面から伸びる官能基の組合せとを含み、前記官能基の組合せは、（ｉ）第一の組の官能基であって、その第一の組の官能基を介して粒子表面上での一つ又は複数のモノマーの重合を可能にする第一の組の官能基と、そして（ii）粒子表面の湿潤性を増大する第二の組の官能基とを含む。本発明の例示的態様において、粒子は、シリカ又はシリカゲル粒子（一つ又は複数）のような無機金属酸化物粒子（一つ又は複数）を含む。

【0009】

[0008]本発明の別の態様において、官能化粒状保持体は、粒子表面を有する粒子と、その粒子表面から伸びる官能基の組合せとを含み、前記官能基の組合せは、（ｉ）粒子表面から伸びる少なくとも一つのポリマーに結合された粒子表面上の第一の組の官能基と、そして（ii）粒子表面の湿潤性を増大する第二の組の官能基とを含む。

【0010】

[0009]本発明のさらなる態様において、官能化粒状保持体は、粒子表面及び少なくとも１５０Åのメジアン細孔径を有する粒子と、その粒子表面から伸びる第一の組の官能基とを含み、粒子表面上の前記第一の組の官能基は、粒子表面から伸びる少なくとも一つのポリマーに結合されている。別の態様において、官能化粒状保持体は、前記粒子表面の湿潤性を増大する第二の組の官能基を含む。

【0011】

[0010]本発明はさらに、クロマトグラフィー装置で使用するのに適切なクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジにも向けられ、そのクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジは、本明細書中に開示された本発明の官能化粒状保持体を含有する。本発明の例示的態様において、クロマトグラフィー用カラム又はカートリッジは、カラム容積を有するカラム構造と、カラム構造のカラム容積内に配置された官能化粒状保持体とを含み、その官能化粒状保持体は複数の粒子を含み、その複数の粒子のうちの一つ又は複数の粒子は、粒子表面を有する粒子と、その粒子表面から伸びる官能基の組合せとを含み、前記官能基の組合せは、（ｉ）第一の組の官能基であって、その第一の組の官能基を介して粒子表面上での一つ又は複数のモノマーの重合を可能にする第一の組の官能基と、そして（ii）粒子表面の湿潤性を増大する第二の組の官能基とを含む。

【0012】

[0011]本発明はなお更に、本明細書中に開示されたクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジを含むクロマトグラフィー装置にも向けられる。一つの例示的態様において、本発明のクロマトグラフィー装置は、官能化粒状保持体を含有するクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジを含み、その官能化粒状保持体は複数の粒子を含み、その複数の粒子のうちの一つ又は複数の粒子は、粒子表面を有する粒子と、その粒子表面から伸びる官能基の組合せとを含み、前記官能基の組合せは、（ｉ）第一の組の官能基であって、その第一の組の官能基を介して粒子表面上での一つ又は複数のモノマーの重合を可能にする第一の組の官能基と、そして（ii）粒子表面の湿潤性を増大する第二の組の官能基とを含む。

【0013】

[0012]本発明は、官能化粒状保持体の製造法にも向けられる。一つの例示的態様において、官能化粒状保持体の製造法は、粒子の粒子表面を、粒子表面から伸びる官能基の組合せが得られるように処理することを含み、前記官能基の組合せは、（ｉ）第一の組の官能基であって、その第一の組の官能基を介して粒子表面上での一つ又は複数のモノマーの重合を可能にする第一の組の官能基と、そして（ii）粒子表面の湿潤性を増大する第二の組の官能基とを含む。例えば、一部の態様において、処理工程は、粒子表面を、（ｉ）第一の組の官能基からの官能基を含む少なくとも一つのシラン、及び（ii）第二の組の官能基からの官能基を含む少なくとも一つのシランに暴露することを含みうる。

【0014】

[0013]本発明はなお更に、官能化粒状保持体を含有するクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジの製造法にも向けられる。一つの例示的態様において、クロマトグラフィー用カラム又はカートリッジの製造法は、（１）管状構造の第一の端部を密封し；（２）管状構造のカラム空洞に本発明の官能化粒状保持体を少なくとも部分的に充填し；（３）管状構造のカラム空洞に官能化粒状保持体のスラリーを少なくとも部分的に充填し；そして（４）管状構造の反対端を密封することを含む。得られたクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジは、クロマトグラフィー装置に組み込まれ、サンプルの分離に利用することができる。

【0015】

[0014]本発明は、所与のサンプル中の一つ又は複数の標的分子（例えば一つ又は複数の生体分子）の存在を検出するための、官能化粒状保持体、カラム又はカートリッジ、及び装置の使用法にも向けられる。一つの例示的態様において、標的分子の分離法は、少なくとも一つの標的分子（例えばタンパク質又はペプチドのような生体分子）を含有している可能性のある混合物を分離することを含み、その方法は、少なくとも一つの標的分子（例えばタンパク質又はペプチドのような生体分子）を含有しているサンプルを、本明細書中に開示された本発明の官能化粒状保持体と接触させることを含む。例えば、開示されたサンプルの分離法は、抗体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、非ペプチジル化合物、オリゴヌクレオチド、それらの誘導体、それらの類似体、又はそれらのいずれかの組合せを含む少なくとも一つの生体分子の存在を単離するために使用できる。

【0016】

[0015]本発明のこれら及びその他の特徴及び利点は、以下の、開示された態様の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲を検討すれば明らかになるであろう。
[0016]本発明を添付の図面を参照しながらさらに説明する。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】[0017]図１は、本発明の例示的なクロマトグラフィー装置の図を示す。

【図2】[0018]図２は、本発明のクロマトグラフィー担体の例示的態様の反応スキームを示す。

【図3】[0019]図３は、本発明のクロマトグラフィー担体の例示的態様の反応スキームを示す。

【図4】[0020]図４は、本発明のクロマトグラフィー担体の例示的態様の反応スキームを示す。

【図5】[0021]図５は、本発明のクロマトグラフィー担体の例示的態様の反応スキームを示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

[0022]本発明は、液体クロマトグラフィー（例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はフラッシュ）のようなクロマトグラフィーのカラム又はカートリッジに使用するのに適切な官能化粒状保持体に向けられる。本発明はさらに、官能化粒状保持体を含むクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジにも向けられる。本発明はなお更に、官能化粒状保持体及びクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジの製造法、ならびに一つ又は複数の標的分子を含有している可能性のある、複合混合物（例えば生物成分を含有する混合物）を含むサンプルを分析するための官能化粒状保持体及びクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジの使用法にも向けられる。

【0019】

[0023]本明細書及び添付のクレームにおいて、単数形の“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、文脈上明白に他の意味に解釈すべき場合を除いて、複数形の指示対象も含むことに注意せねばならない。従って、例えば、“一つの酸化物(an oxide)”への言及は複数のそのような酸化物を含み、“酸化物(oxide)”への言及は一つ又は複数の酸化物及び当業者に公知のそれらの等価物を含む等々。開示の態様の説明において使用される、例えば組成物中の成分の量、濃度、体積、プロセス温度、プロセス時間、回収率又は収率、流速、及び同様の値、ならびにそれらの範囲を修飾している“約(about)”は、例えば、典型的な測定及び取扱い手順を通じて、これらの手順における故意でない誤りを通じて、方法を実施するために使用される成分の違いを通じて、及び同様の近似考慮を通じて発生しうる数量の変動を意味する。“約(about)”という用語は、特定の初期濃度又は混合物を有する製剤（配合物）の老化（熟成）が原因で異なる量、及び特定の初期濃度又は混合物を有する製剤（配合物）の混合又は加工が原因で異なる量も包含する。“約(about)”という用語によって修飾されているか否かにかかわらず、本明細書に添付されたクレームは、これらの量の等価物を含む。

【0020】

[0024]本明細書において、“生体分子”という用語は、生体によって産生される何らかの分子、例えば、タンパク質、多糖類、脂質、及び核酸のような大分子、ならびに一次代謝産物、二次代謝産物、及び天然産物のような小分子を意味する。生体分子の例は、細胞及び細胞残屑；タンパク質及びペプチド；ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸；内毒素；ウィルス；ワクチンなどである。生体分子のその他の例は、ＷＯ２００２／０７４７９１及び米国特許第５，４５１，６６０号に列挙されているものなどである。

【0021】

[0025]本明細書において、“無機酸化物”は、無機成分が陽イオンで酸化物が陰イオンである二元酸素化合物と定義される。無機材料は金属を含み、メタロイドも含みうる。金属は、周期表でホウ素からポロニウムへと引かれた対角線の左側にある元素を含む。メタロイド又は半金属は、この線の右側にある元素を含む。無機酸化物の例は、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニアなど、及びそれらの混合物を含む。

【0022】

[0026]本明細書において、“粒子”は、無機材料、有機材料、又は無機材料（例えば、金属、半金属、及びそれらの合金；無機酸化物を含むセラミックなど）と有機材料（例えば有機ポリマー）の組合せ、例えば本質的に不均質又は均質である複合材料で構成される粒子を含む。例えば、不均質複合材料は、材料の単なる混合物、層状材料、コアシェルなどを含む。均質複合材料の例は、合金、有機−無機ポリマーのハイブリッド材料などを含む。粒子は、チェーン形、ロッド形又はラス（木摺）形を含む様々な対称、非対称又は不規則形でよい。粒子は非晶質又は結晶構造などを含む様々な構造を有しうる。粒子は、異なる組成、サイズ、形状又は物理的構造を含む粒子の混合物を含んでいても、又は表面処理が異なる以外は同じであってもよい。粒子の多孔率(porosity)は、粒子内の多孔率であっても、又は小粒子が凝集して大粒子を形成している場合、粒子間の多孔率であってもよい。一つの例示的態様において、粒子は、無機酸化物、硫化物、水酸化物、炭酸塩、ケイ酸塩、リン酸塩などの無機材料で構成されるが、好ましくは無機酸化物である。これはいずれかの公知法によって形成できる。例えば、コロイド粒子を形成する場合のような溶液重合、溶融粒子を形成する場合のような連続火炎加水分解、ゲル化粒子を形成する場合のようなゲル化、沈殿、噴霧、型取り、ゾル−ゲルなどであるが、これらに限定されない。

【0023】

[0027]本明細書において、“官能化”という用語は、粒子表面（粒子の外側部分の表面領域及び／又は内部細孔の表面領域を含む）の少なくとも一部の選択性を変更するために、官能性化合物との反応によって表面修飾されている粒子を意味する。官能化表面は、結合相（共有結合又はイオン結合）、被覆表面（例えば逆相Ｃ１８結合）、クラッド表面（例えばＥＰ６におけるような炭素クラッド）、重合表面（例えばイオン交換）、固有表面（例えば無機／有機ハイブリッド材料）などを形成するために使用できる。例えば、無機粒子をオクタデシルトリクロロシランと反応させると、シランの無機表面への共有結合によって“逆相”が形成される（例えば、Ｃ４、Ｃ８、Ｃ１８など）。別の例では、無機粒子をアミノプロピルトリメトキシシランと反応させた後、アミノ基を四級化すると“陰イオン交換相”が形成される。第三の例では、結合相は、無機粒子をアミノプロピルトリメトキシシランと反応させた後、酸塩化物でアミドを形成させることによって形成できる。他の結合相は、ジオール、シアノ、陽イオン、アフィニティー、キラル、アミノ、Ｃ１８、親水性相互作用（ＨＩＬＩＣ）、疎水性相互作用（ＨＩＣ）、混合モード、サイズ排除などを含む。結合相又は官能化表面の一部として、米国特許第４，８９５，８０６号に示されているように、リガンドを使用すれば標的分子又は生体分子（例えばリゲート）との特異的相互作用を提供することもできる。

【0024】

[0028]本明細書において、“平均分子量”という用語は、各ポリマー鎖における反復単位数が異なるために分子量分布を有するポリマーの分子量のモル質量平均を意味すると定義される。この値は、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）分析を用いて測定される。

【0025】

[0029]本明細書において、“クロマトグラフィー”という用語は、移動相に溶解させた混合物を、カラム又はカートリッジ又はその他の容器内に収容された固定相（すなわちクロマトグラフィー担体）に通し、標的分子を混合物中の他の分子から分離し、それを単離することを可能にするプロセスを意味する。使用されるクロマトグラフィーの種類に応じて、標的分子は固定相上に吸着されうるが望まざる成分は装置を通過するか、又はその逆である。“液体クロマトグラフィー”という用語は、液体が移動相として使用され、固体又は固体保持体上の液体が固定相として使用されるクロマトグラフィーの形態である。“フラッシュクロマトグラフィー”という用語は、陽圧下（例えば最大３００ｐｓｉ）で実施される液体クロマトグラフィーを意味する。“高速液体クロマトグラフィー”（ＨＰＬＣ）という用語は、高陽圧下（例えば最大５０００ｐｓｉ）で実施される液体クロマトグラフィーを意味する。“分取クロマトグラフィー”という用語は、標的化合物又は分子の単離及び精製のためのＨＰＬＣを意味する。“高速タンパク質液体クロマトグラフィー”（ＦＰＬＣ）という用語は、生体分子の分離に有用なＨＰＬＣの形態である。

【0026】

[0030]本明細書において、“不純物”という用語は、無機粒子中に存在する、その無機物以外の物質を意味する。
[0031]本明細書において、無機粒子に適用される“不規則”という用語は、粒子ごとの粒子形状が一様でなく（すなわちランダムな粒子形状）、アスペクト比が１．０より大きいことを意味する。

【0027】

[0032]本明細書において、“ハウジング”という用語は、クロマトグラフィーで使用する固定相を保持するための容器又はコンテナを意味し、カートリッジ、カラム、管、デバイス、ベッド、バッグなどを含む。

【0028】

[0033]本明細書において、“固定相”又は“クロマトグラフィー担体”又は“クロマトグラフィー保持体”という用語は、サンプル混合物中の異なる成分に対して異なる親和性を示す材料を意味し、標的分子を一つ又は複数のその他の分子の混合物から分離するためにクロマトグラフィーで使用される。固定相は、有機及び無機材料、又はそれらのハイブリッドを含み、本明細書中に定義の通り、官能化された粒子、モノリス、膜、コーティングなどの形態でありうる。

【0029】

[0034]本発明の一態様において、官能化粒状保持体は、粒子表面を有する粒子と、その粒子表面から伸びる官能基の組合せとを含み、前記官能基の組合せは、（ｉ）第一の組の官能基であって、粒子表面上での一つ又は複数のモノマーの重合を、その第一の組の官能基と前記一つ又は複数のモノマーとの間に共有結合を形成することによって可能にする第一の組の官能基と、そして（ii）粒子表面の湿潤性を増大する第二の組の官能基とを含む。本発明の例示的態様において、粒子は、シリカ又はシリカゲル粒子（一つ又は複数）のような無機金属酸化物粒子（一つ又は複数）を含む。

【0030】

[0035]本発明の別の態様において、官能化粒状保持体は、粒子表面を有する粒子と、その粒子表面から伸びる官能基の組合せとを含み、前記官能基の組合せは、（ｉ）粒子表面から伸びる少なくとも一つのポリマーに結合された粒子表面上の第一の組の官能基と、そして（ii）粒子表面の湿潤性を増大する第二の組の官能基とを含む。

【0031】

[0036]本発明のさらなる態様において、官能化粒状保持体は、粒子表面及び少なくとも１５０Åのメジアン細孔径を有する粒子と、その粒子表面から伸びる第一の組の官能基とを含み、粒子表面上の前記第一の組の官能基は、粒子表面から伸びる少なくとも一つのポリマーに結合されている。別の態様において、官能化粒状保持体は、前記粒子表面の湿潤性を増大する第二の組の官能基を含む。

【0032】

[0037]一つの例示的態様において、官能化粒状保持体の第二の官能基は、一つ又は複数のモノマー又は粒子表面に結合されうる。別の態様において、第一の組の官能基は、不飽和結合、例えばビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基、又はそれらの基のいずれかの組合せを含む。別の態様において、第二の組の官能基は、少なくとも一つの親水性有機基、例えばヒドロキシル基、ジオール基、オキシエチレン基、ポリエチレン基、カルボン酸基、アミン基、アミド基、又はそれらの基のいずれかの組合せを含む。さらなる態様において、第一の組の官能基はビニル基を含み、第二の組の官能基はジオール基を含む。別の態様において、第一及び第二の組の官能基は、アゾ基及びカルボン酸基を含む分子の一部であってもよい。さらなる態様において、粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成させるために、前記第一の組の官能基の少なくとも一部を一つ又は複数のモノマー及び一つ又は複数のスペーサーモノマーと重合させる。スペーサーモノマーは、一つ又は複数のモノマーを相互に分離するので、ポリマー上の官能基の配向に役立ちうる。一つ又は複数のモノマーは陰イオ性又は陽イオン性モノマーを含みうる。一つ又は複数のモノマーが陰イオン性モノマーである態様において、そのモノマーは２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸でよく、任意の一つ又は複数のスペーサーモノマーはメチレンビスアクリルアミドでよい。一つ又は複数のモノマーが陽イオン性モノマーである態様において、その一つ又は複数のモノマーは３−アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド又はメチルアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリドなどでよく、任意の一つ又は複数のスペーサーモノマーはジアリルジメチルアンモニウムクロリドなどでよい。別の態様において、重合は、ポリマーの鎖長又は分子量を低減する連鎖移動剤を含む。連鎖移動剤は、硫黄基、チオールカルボニル基、チオールエステル基、チオールカーボネート基及びそれらの組合せなどでありうる。別の態様において、ポリマー鎖は、下記式：

【0033】

【化1】

【0034】

［式中、
Ｒ^１は、Ｈ又はＣＨ_３であり；
Ｒ’及びＲ”は、それぞれ独立にＨ又はＣＨ_３であり；
Ｙは、

【0035】

【化2】

【0036】

【0037】

[0038]本発明はさらに、イオン交換カラムに使用するのに適切な硬質保持体にも向けられる。例えば、図１に示されている例示的硬質保持体１５１のようなものである。本発明の硬質保持体、好ましくは無機保持体は、下記の成分の一つ又は複数を含む。

【0038】

[0039]本発明で使用するのに適切な無機保持体は、クロマトグラフィー担体として市販されている製品を含む。無機保持体は、当該技術分野で公知の方法を用いて製造できる。無機支持体は、無機支持体の表面に適用された一つ又は複数の追加成分を保持する役割を果たす。一般に、無機支持体は、無機酸化物、さらに適切には無機金属酸化物、ケイ酸塩又はアルミノケイ酸塩、又は制御された制御された多孔質ガラス（controlled pore glass）である。無機金属酸化物がより望ましい。本発明で使用するのに適切な無機酸化物は、典型的には、他の化学官能基と結合できる又は反応できる遊離ヒドロキシル基を有する。望ましくは、無機酸化物は、固体無機酸化物１平方ナノメートルあたり約１〜約１０個のヒドロキシル基を有する。

【0039】

[0040]適切な無機酸化物は、クロマトグラフィー用のシリカ又はシリカゲルなどのシリカ、アルミナ、シリカ−アルミナ、ジルコニア、ジルコン酸塩、多孔性ガラス又はチタニアなどであるが、これらに限定されない。本発明の一つの所望の態様において、無機金属酸化物はシリカ、さらに望ましくはクロマトグラフィー用のシリカ又はシリカゲルである。ＷＯ９８／３１４６１（この開示内容は引用によってその全文を本明細書に援用する）に開示されているケイ質酸化物被覆磁性粒子のような磁気応答性無機酸化物も本発明に使用できる。混合無機酸化物、例えばシリカとアルミナの共ゲル又は共沈物も使用できる。

【0040】

[0041]固体無機酸化物は、粒子状、繊維状、板状、又はそれらの組合せの物理的形状でありうる。望ましくは、固体無機酸化物は、実質的に球形の粒状体又は粒子の物理的形状である。物理的形状にかかわらず、固体無機酸化物は、約１５０マイクロメートル（μｍ）までの最長寸法（すなわち、長さ、幅又は直径）を有する。固体無機金属酸化物が実質的に球形の複数の粒子を含む場合、その複数の粒子は望ましくは約１μｍから約１２０μｍの範囲のメジアン粒径を有する。本発明の一つの所望の態様において、固体無機金属酸化物は、実質的に球形を有する複数のシリカ又はシリカゲル粒子を含み、その複数のシリカ又はシリカゲル粒子は、約１０μｍ〜約１３０μｍ、又は約２０μｍ〜約１２０μｍの範囲のメジアン粒径を有する。

【0041】

[0042]本発明には様々な市販の固体無機酸化物が使用できる。適切な固体無機酸化物は、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ＆Ｃｏ．社（メリーランド州コロンビア）から、ＤＡＶＩＳＩＬ（登録商標）の商品名で市販されているシリカ粒子（これは、約３００Å〜約３０００Å、望ましくは約５００Å〜約１５００Åのメジアン細孔径を有する不規則形）、又は球状(spheroidal)で約３００Åのメジアン細孔径を有するＶＹＤＡＣ（登録商標）シリカなどであるが、これらに限定されない。本発明の一つの所望の態様においては、球状で約３００Åの初期メジアン細孔径を有するＶＹＤＡＣ（登録商標）シリカが、メジアン細孔径を約８００Åに増大する修正をされた後に使用される。有機材料は、アガロースゲル、ポリスチレンジビニルベンゼン（ＰＳＤＶＢ）樹脂、ポリ（メチルメタクリレート）樹脂などである。ハイブリッド材料は、ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．社製Ｘｔｅｒｒａ（登録商標）のような、ゾル−ゲル法によって製造されるエチレン架橋シリカハイブリッド粒子などである。

【0042】

[0043]上記無機保持体の表面は、無機支持体への、非標的分子の非特異的、非選択的結合及び／又は吸着（すなわち、標的分子以外の材料の非特異的結合）及びリガンド特異的標的分子の非特異的、非選択的結合及び／又は吸着（すなわち、一つ又は複数のリガンドによって提供される反応部位以外の反応部位への標的分子（すなわちリゲート）の非特異的結合）を低減するために、処理又は修飾（すなわち官能化）される。得られた修飾保持体表面は、（ｉ）無機表面上に比較的不活性なＲ基が存在するため、非標的分子（すなわち標的分子以外の材料）に対して低親和性である、及び（ii）無機支持体表面の一つ又は複数のリガンド（下記）に直接又はリンカーを通じて選択的に結合するための反応部位の量が制御されているといった性質を備えている。一つ又は複数のリガンドに選択的に結合するための反応部位の量は、無機保持体表面に結合されている一つ又は複数のリガンドへの、一つ又は複数の目的分子の選択的で制御された結合をもたらす。

【0043】

[0044]本発明はさらに、上記官能化粒状保持体の製造法にも向けられる。別の態様において、本発明は、粒子の粒子表面を、粒子表面から伸びる官能基の組合せが得られるように処理することによって官能化粒状保持体を製造する方法を含み、前記官能基の組合せは、（ｉ）第一の組の官能基であって、その第一の組の官能基を介して粒子表面上での一つ又は複数のモノマーの重合を可能にする第一の組の官能基と、そして（ii）粒子表面の湿潤性を増大する第二の組の官能基とを含む。別の態様において、処理工程は、粒子表面を、（ｉ）第一の組の官能基からの官能基を有する少なくとも一つのシラン、及び（ii）第二の組の官能基からの官能基を有する少なくとも一つのシランに暴露することを含む。別の態様において、処理工程は、第一の組の官能基又は第二の組の官能基の少なくとも一つを粒子表面に結合し、その後に重合が行われる。一つの例示的態様において、官能化粒状保持体の第二の官能基は、一つ又は複数のモノマー又は粒子表面に結合されうる。別の態様において、第一の組の官能基は、不飽和結合、例えばビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基、又はそれらの基のいずれかの組合せを含む。別の態様において、第二の組の官能基は、少なくとも一つの親水性有機基、例えばヒドロキシル基、ジオール基、オキシエチレン基、ポリエチレン基、カルボン酸基、アミン基、アミド基、又はそれらの基のいずれかの組合せを含む。さらなる態様において、第一の組の官能基はビニル基を含み、第二の組の官能基はジオール基を含む。別の態様において、第一及び第二の組の官能基は、アゾ基及びカルボン酸基を含む分子の一部であってもよい。別の例示的態様において、粒子表面はさらに、重合の前に第四アンモニウム塩（例えばテトラメチルアンモニウムクロリド）又は第四アンモニウム陽イオン（例えばテトラメチルアンモニウム陽イオン）で処理される。これはその後洗浄によって粒子表面から除去される。さらなる態様において、前記第一の組の官能基の少なくとも一部は、粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成させるために、一つ又は複数のモノマー及び一つ又は複数のスペーサーモノマーと重合される。一つ又は複数のモノマーは、陰イオン性又は陽イオン性モノマーを含みうる。一つ又は複数のモノマーが陰イオン性モノマーである態様において、そのモノマーは２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸でよく、任意の一つ又は複数のスペーサーモノマーはメチレンビスアクリルアミドでよい。一つ又は複数のモノマーが陽イオン性モノマーである態様において、その一つ又は複数のモノマーは３−アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド又はメチルアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリドなどでよく、任意の一つ又は複数のスペーサーモノマーはジアリルジメチルアンモニウムクロリドなどでよい。別の態様において、重合は、ポリマーの鎖長又は分子量を低減する連鎖移動剤を含み、連鎖移動剤は、硫黄基、チオールカルボニル基、チオールエステル基、チオールカーボネート基及びそれらの組合せなどでありうる。別の態様において、ポリマー鎖は、下記式：

【0044】

【化3】

【0045】

［式中、
Ｒ^１は、Ｈ又はＣＨ_３であり；
Ｒ’及びＲ”は、それぞれ独立にＨ又はＣＨ_３であり；
Ｙは、

【0046】

【化4】

【0047】

【0048】

[0045]別の例示的態様において、粒子表面はさらに、重合後、何らかの非結合ポリマー又はモノマーがあればそれを除去するために、５ｗｔ％塩化ナトリウム溶液のような塩溶液に粒子表面を暴露することによって処理される。

【0049】

[0046]本発明の別の例示的態様において、処理工程後の粒子表面上の炭素含量は、７０℃で一晩乾燥後、粒子の全重量を基にして、約３．５％以下、又は約３．０重量％以下、又は約２．５重量％以下、又は約２．０重量％以下、又は約１．５重量％以下である。本発明のさらなる例示的態様において、重合工程後の粒子表面上の炭素含量は、７０℃で一晩乾燥後、粒子の全重量を基にして、少なくとも約３．５重量％、又は少なくとも約４．０重量％、又は少なくとも約４．５重量％、又は少なくとも約５．０重量％、又は少なくとも約５．５重量％である。本発明によるさらなる例示的態様において、重合工程後の粒子表面上の炭素含量を処理工程後の粒子表面上の炭素含量と比較した比は、少なくとも約１．５、又は少なくとも約２．０、又は少なくとも約２．５、又は少なくとも約３．０、又は少なくとも約３．５、又は少なくとも約４．０である。

【0050】

[0047]本発明は、図１に示されている例示的イオン交換カラムのような、一つ又は複数の下記構成要素を含むイオン交換カラムに向けられる。本明細書において、“イオン交換カラム”という用語は、陰イオン又は陽イオン交換カラムのようなイオン交換カラムを含む、一つ又は複数の下記構成要素を有するカラムを含む。

【0051】

[0048]本発明のイオン交換カラムは、所望の寸法、カラム容積、及び構造的団結性を有するカラム構造を含む。典型的には、カラム構造は管状構造を含み、管状構造の両端に着脱式の端部キャップを有する。端部キャップは、材料が管状構造から望まざる漏出をするのを防止するために、管状構造に対して漏れ防止の封止を形成する。本発明の例示的イオン交換カラム１００を図１に示す。

【0052】

[0049]図１に、本発明の例示的クロマトグラフィーカラム１００の図を提供する。図１に示されているように、例示的クロマトグラフィーカラム１００は、カラムハウジング１５０；カラムハウジング１５０内に配置された担体ベッド空間１５１を含む。望ましくは、担体１５１は、少なくとも１０オングストローム（Å）のメジアン細孔径を有する多孔性無機粒子を含む。図１にさらに示されているように、カラムハウジング１５０は、典型的には、管状ハウジング部材１５６、第一の管状ハウジング部材端部キャップ１５２、端部キャップ１５２の反対側に第二の管状ハウジング部材端部キャップ１５３、カラム入口１５４、及びカラム出口１５５を含む。カラム１００には、カラム入口１５４からスラリー状の多孔性無機粒子を充填でき、カラム入口は、内部に通路を有する中央孔１５７、及びノズル１５８を含む。ベッド空間内へのスラリーの分配及びさらには充填までも容易にする様々なノズルが使用できる。フィルター１５９が端部キャップ１５２、１５３の内面にそれぞれ配置され、管状部材１５６と共にベッド空間１５１を規定する働きのほか、ベッド空間１５１からの粒状担体の漏出を防止する役割も果たす。分配チャネル１６０は、第一の端部キャップ１５２及び／又は第二の端部キャップ１５３の面を横断して配置され、フィルター１５９と流体連結されている。流体分配チャネル１６０は、液体の放射状分配を促進するための働きをする。単純な形態では、分配チャネル１６０は、第一及び／又は第二の端部キャップ１５２及び１５３の面に少なくとも一つの円周方向及び／又は放射状の溝を含む。溝は、入口１５４のノズル１５８から放出される液体の周方向及び／又は放射状分配が実行できるように配置される。カラムを使い捨てカラムとして使用する場合、広範囲のカラム容積、典型的には０．１〜２０００リットル、及び０．１〜１００リットルの範囲のカラム容積が可能であることは理解されるであろう。ＵＳ２００８／００１７５７９も参照（その全主題は引用によって本明細書に援用する）。

【0053】

[0050]カラムハウジング１５０は様々な材料から形成できる。典型的には、カラムハウジング１５０は、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料を含み、望ましくはポリマー材料を含む。カラムハウジング１５０を形成するための適切なポリマー材料は、ポリオレフィンを含む成形可能なプラスチックのようないずれかの合成又は半合成有機固体などであるが、これらに限定されない。

【0054】

[0051]カラムハウジング１５０は、慣用の熱成形技術を用いて形成できる。例えば、カラムハウジング１５０の管状ハウジング部材１５６、第一の管状ハウジング部材端部キャップ１５２、及び第二の管状ハウジング部材端部キャップ１５３は、それぞれ独立に成形工程を通じて形成できる。一部の態様では、カラムハウジング１５０の管状ハウジング部材１５６と、（ｉ）第一の管状ハウジング部材端部キャップ１５２及び（ii）第二の管状ハウジング部材端部キャップ１５３の一つは、単一成形工程を通じて形成される（すなわち、端部キャップの一つは管状ハウジング部材１５６の一つの端部に一体形成される）。

【0055】

[0052]管状構造１５０は様々な材料から製造でき、管状構造１５０内の比較的高速（高性能）に耐えられるような壁構造を有する。望ましくは、管状構造１５０は、最大約６０００ｐｓｉ（４００バール）、さらに望ましくは約１５ｐｓｉ（１バール）〜約４５００ｐｓｉ（３００バール）の定圧に耐えられる構造的完全性を有する。管状構造１５０を形成するための適切な材料は、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）及びポリプロピレンのようなポリマー；ステンレススチールのような金属；及びガラスのような無機材料などであるが、これらに限定されない。本発明の一つの所望の態様において、管状構造１５０は、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、又はポリカプロラクトンを含む。

【0056】

[0053]管状構造１５０の寸法は、粒子のサイズ及び形状、流量、注入量、必要なプレートの数など（これらに限定されない）といったいくつかの要因に応じて変動しうる。典型的には、管状構造１５０は、円形断面、約２ｍｍ〜約５０００ｍｍ範囲の外径、約１ｍｍ〜約４０００ｍｍの範囲の内径、及び約２ｍｍ〜約５０００ｍｍ範囲の全長を有する。

【0057】

[0054]管状構造１５０と共に使用するための端部キャップ１５２及び１５３は、典型的にはＰＥＥＫから形成され、管状構造１５０の端部に対して漏れ防止の封止を形成するような寸法を有する。

【0058】

[0055]円形断面を有する管状構造が望ましいが、他の断面を有する管状構造も本発明の範囲内であることに注意すべきである。様々な管状構造の適切な断面形状は、正方形、長方形、三角形、楕円形、五角形及び六角形の断面形状などであるが、これらに限定されない。

【0059】

[0056]本発明のクロマトグラフィー用カラム及びカートリッジは、下記の工程を用いて製造できる。
（１）管状構造の第一の端部を密封し；
（２）管状構造のカラム空洞に、上記の硬質保持体のいずれかのような硬質保持体を少なくとも部分的に充填し；
（３）管状構造のカラム空洞に第一のバッファー溶液を少なくとも部分的に充填して硬質保持体をカプセル化し；そして、任意に、
（４）管状構造の反対端（すなわち第二の端部）を密封する。
イオン交換カラムは将来の使用に備えて保管しても、又はその後上記の装置構成要素の一つ又はすべてを含む装置に接続してもよい。

【0060】

[0057]本発明はなお更に、一つ又は複数の目的分子を含有している可能性のあるサンプルを分離する方法にも向けられる。本発明の一つの例示的態様において、方法は、（ａ）硬質保持体を含有するイオン交換カラムにサンプルを導入する工程を含み、ここで硬質保持体は複数の無機金属酸化物粒子を含み、各粒子は（ｉ）金属酸化物支持体；（ii）無機支持体への、非標的分子材料の非特異的結合（すなわち標的分子以外の材料の非特異的結合）及びリガンド特異的標的分子の非特異的結合（すなわち一つ又は複数のリガンドによって提供される反応部位以外の反応部位への標的分子の非特異的結合）を低減する修飾された支持体表面；及び（iii）無機支持体に結合された一つ又は複数のリガンドを含む。

【0061】

[0058]さらなる態様において、本発明は混合物から標的分子を単離する方法を提供し、該方法は、ａ）標的分子を含有する混合物をイオン交換クロマトグラフィーマトリックスと接触させ、ここでマトリックスは、１）１５０Åより大きく６０００Å未満のメジアン細孔径と、２０マイクロメートルより大きい平均粒径を有するシリカ粒子を含む固体保持体、及び２）固体保持体に連結された、標的分子に対して特異性を有するイオン交換リガンドを含み；そしてｂ）標的分子をイオン交換クロマトグラフィーマトリックスから溶出することを含む。

【0062】

[0059]さらにその他の態様において、本発明は混合物から標的分子を単離する方法を提供し、該方法は、ａ）標的分子を含有する混合物をクロマトグラフィーマトリックスと接触させ、ここでイオン交換クロマトグラフィーマトリックスは、カラムなどのハウジング内に収容され、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスを充填されたカラムは少なくとも４００ｃｍ／時の最大流量を有し、マトリックスは、１）シリカ粒子、及び２）標的分子に対して特異性を有するイオン交換リガンドを含み、標的分子に対するマトリックスの動的容量は１０％破過時で少なくとも４５ｇ／リットルであり；そして任意に、ｂ）標的分子をイオン交換クロマトグラフィーマトリックスから溶出することを含む。

【0063】

[0060]さらにその他の態様において、本発明は混合物から標的分子を単離するためのシステムを提供し、該システムは、ａ）イオン交換クロマトグラフィーマトリックス、ここでマトリックスは、１）１５０Åより大きく６０００Å未満の細孔径と２０マイクロメートルより大きく１２０マイクロメートル未満のメジアン粒径を有するシリカ粒子、及び２）固体保持体に連結された、標的分子に対して特異性を有するイオン交換リガンドを含む固体保持体を含み；そしてｂ）イオン交換クロマトグラフィーマトリックスを収容するためのハウジングを含む。

【0064】

[0061]さらなる態様において、本発明は混合物から標的分子を単離するためのシステムを提供し、該システムは、ａ）イオン交換クロマトグラフィーマトリックスを含み、ここでイオン交換クロマトグラフィーマトリックスは、カラムなどのハウジング内に収容され、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスを充填されたカラムは少なくとも４００ｃｍ／時の最大流量を有し、マトリックスは、１）シリカ粒子、及び２）標的分子に対して特異性を有するイオン交換リガンドを含み、標的分子に対するマトリックスの動的容量は少なくとも４５ｇ／リットルである。システムは、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスからの標的分子の溶出を検出するための手段を含んでいてもよい。

【0065】

[0062]他の態様において、本発明は、１５０Åより大きく６０００Å未満のメジアン細孔径と２０マイクロメートルより大きく１２０マイクロメートル未満のメジアン粒径を有するシリカ粒子を含むイオン交換クロマトグラフィーマトリックスを含む容器と、少なくとも一つの容器を提供する。

【0066】

[0063]さらなる態様において、本発明は、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスと、ここでイオン交換クロマトグラフィーマトリックスは、カラムなどのハウジング内に収容され、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスを充填されたカラムは少なくとも４００ｃｍ／時の最大流量を有し、マトリックスは、１）シリカ粒子、及び２）標的分子に対して特異性を有するイオン交換リガンドを含み、標的分子に対するマトリックスの動的容量は少なくとも４５ｇ／リットルである；そして少なくとも一つの容器とを含む装置を提供する。

【0067】

[0064]サンプルの分離法は、（ａ）サンプルを硬質保持体及びその上のリガンドと接触させ；（ｂ）硬質保持体を濯いで、リガンドと結合しなかった何らかのサンプル成分を洗い流し；（ｃ）溶離液をイオン交換カラムに導入して溶離液が硬質保持体上のリガンドに結合した一つ又は複数の分子と接触するようにし；（ｄ）溶離液を硬質保持体と一定時間接触させておいて、一つ又は複数の分子を含有する可能性のある溶離液サンプルが形成されるようにし；そして（ｅ）カラムの内容物を分離して、サンプル中に一つ又は複数の分子が存在することを調べる工程を含みうる。

【0068】

[0065]この態様において、イオン交換カラムがイオン交換カラムと流体連結されている溶離液サンプルの分離法は、下記工程の一つ又は複数をさらに含みうる。
（１）約２００バールまでのカラム圧に耐えることができる硬質保持体含有イオン交換カラムにサンプルを導入する、ここで硬質保持体は、それに結合された一つ又は複数のリガンドを有し、一つ又は複数のリガンドは一つ又は複数の分子に選択的に結合できる；
（２）サンプルを硬質保持体及びその上のリガンドと接触させる；
（３）硬質保持体を濯いで、一つ又は複数の標的分子以外の何らかのサンプル成分を洗い流す；
（４）溶離液をイオン交換カラムに導入して溶離液が硬質保持体上のリガンドに結合した一つ又は複数の標的分子と接触するようにする；そして
（５）溶離液サンプルを形成させるために溶離液を硬質保持体と一定時間接触させておく。典型的には、溶離液は、約１分〜約４時間の範囲の時間、硬質保持体と接触させておく。

【0069】

[0066]以上のように本発明を記載してきたが、以下の実施例によってさらに説明する。これらの実施例は、決して本発明の範囲に制限を課すものと見なされてはならない。それどころか、様々なその他の態様、修正、及びその等価物のための手段となりうることは明らかに理解されるはずである。そうしたその他の態様、修正、及びその等価物は、本明細書中の記載を読めば、当業者には本発明の精神及び／又は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく分かるであろう。

【実施例】

【0070】

[0067]以下の実施例で、イオン交換を含む官能化表面を有するクロマトグラフィー担体を製造するための本発明による方法を記載するが、他の表面官能化も使用できる。実施例中に示される本発明の一態様は、多孔性無機担体をベースとするイオン交換材料に関する。これは二つの主な工程からなる方法によって製造された。すなわち、（１）粗孔シリカに二つのシラン：（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン及び３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレートを結合して初期結合中間体を形成し；そして（２）初期結合シリカ中間体の存在下、アゾ開始剤を用いてイオン性モノマーを溶液重合し、強陰イオン交換担体（Ｑ−シリカ）又は強陽イオン交換担体（Ｓ−シリカ）のいずれかを製造した。

【0071】

[0068]実施例に示されている本発明の別の態様はＱ−シリカの製造法であり、そこで利用されたモノマーは、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、少量のジアリルジメチルアンモニウムクロリド溶液であり、開始剤は２，２'−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド（Ｖ−５０開始剤）であった。

【0072】

[0069]実施例に示されている本発明の別の態様はＳ−シリカの製造法である。この方法は、初期結合中間体をテトラメチルアンモニウムクロリド溶液で洗浄する追加の工程を含むが、これは重合を補助するために追加される。この重合の態様において、モノマーは２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）であり、開始剤は４，４'−アゾビス（シアノ吉草酸）（Ｖ−５０１開始剤）である。この重合は、連鎖移動剤（ＣＴＡ）、例えばＳ，Ｓ’−ビス（α、α’−ジメチル−α”−酢酸）−トリチオカーボネート（ＡＢＣＲＧｍｂＨＫＧ社より入手できる）を使用する。ＣＴＡの機能は、重合の鎖長を制御すること及び細孔の何らかの閉塞を削減する手助けをすることである（図２参照）。この方法は本質的にリビングラジカル重合法の一種である可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合である。

【0073】

[0070]これらの方法によって多くの異なる種類の多孔性粒子を官能化した。一部の実施例ではシリカゲルを利用した。これは、７５ミクロンの粒径と２５０、５００、８００、１０００Åのメジアン細孔径を有するシリカゲルであった。シリカゲルは下記手順を用いて製造された。１９０ｇの１９％硫酸溶液を、オーバーヘッド撹拌機を備え、５℃に冷却された反応器に装入した。別に、２６３ｇのケイ酸ナトリウム溶液（２２．９％ＳｉＯ_２）も５℃に冷却した。その後、ケイ酸ナトリウム溶液を、全量のケイ酸塩が１５分で添加されるような速度で硫酸溶液にポンプを通して加えた。添加中、温度は５℃に維持された。添加完了後、反応器を室温に温め、撹拌せずに内容物をゲル化させた。ゲル化後、ゲル塊を小片に切断し、水中に浸漬して、反応中に形成された硫酸ナトリウムを除去した。材料中に残留している硫酸ナトリウムのレベルを定期的にチェックしながら、洗浄水を排水して新鮮水をゲルに加えた。レベルが１％を下回ったら、ゲルを水中に懸濁させ、液体のｐＨをｐＨ＝９．７に調整し、溶液を６７℃に加熱した。温度を２０時間２０分維持した。加熱時間終了後、ゲルをろ過により回収し、１６０℃のオーブン中でゲルの水分含量が約５重量％未満になるまで乾燥させた。このようにして得られたシリカゲルは、３２５ｍ^２／ｇの窒素ＢＥＴ表面積及び１．２４ｃｃ／ｇの窒素細孔容積を有していた。円筒形の細孔と仮定し、等式：細孔径（オングストローム）＝４００００×ＰＶ／ＳＡを用いると、この材料は１５３オングストロームの細孔径を示す。その後、ＡＣＭを用いてゲルを所望の粒径（７５ミクロン）に粉砕した後、３００℃のオートクレーブ中で所望の細孔径が達成されるまで熱水処理する。

【0074】

[0071]実施例中で報告されている粒径は、ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＬｔｄ．社製のＭａｌｖｅｒｎＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ２０００を用い、ＡＳＴＭＢ８２２−１０に従って、光散乱により測定された。細孔径分布は、ＭｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏｒｐ．社製のＡｕｔｏｐｏｒｅＩＶ９５２０を用いて水銀圧入により、及び同じくＭｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏｒｐ．社製のＴｒｉｓｔａｒ３０００を用いて窒素ＢＥＴにより測定される。本明細書中で参照されている細孔容積は、１０，０００Ａ以下の細孔への水銀圧入を表す。ＢＥＴ表面積は窒素吸着分析からも得られる。炭素及び硫黄含量の元素分析は、ＬＥＣＯＣｏｒｐ．社製のＬＥＣＯＣａｒｂｏｎａｎｄＳｕｌｆｕｒＡｎａｌｙｚｅｒＳＣ−６３２を用いて実施された。平均分子量は、ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．社製のＲＩ及び粘度測定検出付きＧＰＣＶ２０００を用い、ＧＰＣ分析により決定された。シリカの純度は、ＳｈｉｍａｄｚｕＣｏｒｐ．社製のＩＣＰＥ−９０００を用い、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）によって測定された。

【0075】

[0072]実施例１１〜２４のサンプルの分子量は下記の手順を用いて決定された。０．５グラムの表面官能化シリカサンプルを５０ｍｌの遠心管に量り取り、１０ｍｌの脱イオン水を加え、次いで２．２ミリリットルの４８％フッ化水素酸を加え、徹底的に混合後、サンプルを３０分間放置した。その後、ホウ酸３．５グラムを加えて遊離フッ化物を封鎖し、サンプルをリストアクションシェーカー(wrist action shaker)に６０分間入れて置いた。遠心分離し、真空下０．２μｍフィルターを通してろ過した後、透明上清を分析のために回収した。上清をＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．社製のＲＩ及び粘度測定検出付きＧＰＣＶ２０００を用い（ウルトラヒドロゲルガードカラム(Ultrahydrogel guard column)と１２０、２５０、及び１０００カラムを含む）、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）分析に付した。上記の溶液を、ＲＩ検出器を備えたＷａｔｅｒｓＨＰＬＣシステムを用い、移動相の１％硝酸カリウム水溶液中に注入した。溶液の分子量は、ポリエチレングリコール及びポリエチレンオキシドを較正標準として用いることによって決定した。上記ポリマーの分子量は約２００〜３００ＫＤ未満であった。

【0076】

[0073]Ｑの静的結合試験は、ＢＳＡ（バッファー中２５ｍｇ／ｍｌの濃度）を用い、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌバッファーによりｐＨ８．０で実施した。結合／洗浄バッファーはｐＨ８．０の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌで、溶出バッファーはｐＨ８．０の５０ｍＭ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ＭＮａＣｌであった。乾燥シリカサンプルをバイアルに量り取り、次に結合バッファー中のタンパク質溶液を加えた。一晩吸着後、サンプルを遠心分離し、上清を分離／廃棄した。シリカサンプルを、遠心分離と分離により洗浄バッファーで３回洗浄した。洗浄工程後、溶出バッファーを加え、溶出を２回繰り返した。合わせた溶出液について、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．社製のＧｅｎｅｓｙｓ１０ＳＢｉｏＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用い、２８０ｕｍでＵＶ／Ｖｉｓ吸収を測定した。

【0077】

[0074]Ｓの静的結合試験は、ニワトリ卵白リゾチーム又はウシガンマグロブリン（バッファー中２５ｍｇ／ｍｌの濃度）を用い、５０ｍＭＨＯＡｃ／ＮａＯＡｃバッファーによりｐＨ４．０で実施した。結合／洗浄バッファーはｐＨ４．０の５０ｍＭＨＯＡｃ／ＮａＯＡｃで、溶出バッファーはｐＨ４．０の５０ｍＭＨＯＡｃ／ＮａＯＡｃ中１ＭＮａＣｌであった。乾燥シリカサンプルをバイアルに量り取り、次に結合バッファー中のタンパク質溶液を加えた。一晩吸着後、サンプルを遠心分離し、上清を分離／廃棄した。シリカサンプルを、遠心分離と分離により洗浄バッファーで３回洗浄した。洗浄工程後、溶出バッファーを加え、溶出を２回繰り返した。合わせた溶出液について、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．社製のＧｅｎｅｓｙｓ１０ＳＢｉｏＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用い、２８０ｕｍでＵＶ／Ｖｉｓ吸収を測定した。

【0078】

[0075]動的結合試験は、直径０．６６ｃｍのＯｍｎｉガラスカラムを用いて実施した。２ｍｌのカラムの場合、カラム長はほぼ５．８ｃｍであった。シリカサンプルをＤＩ水で洗浄した後、ＡｋｔａＦＰＬＣを用い、約４０００ｃｍ／ｈの線速度でカラムにスラリー充填した。Ｑの破過曲線について、ｐＨ８．０の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中ＢＳＡタンパク質（又は、Ｓについては、ｐＨ４．０の５０ｍＭＨＯＡｃ／ＮａＯＡｃバッファー中リゾチーム又はガンマグロブリン）を、Ａｋｔａを用い、約５００又は１０００ｃｍ／ｈでカラムに通液した。２８０ｎｍにおけるＵＶ−ＶｉｓシグナルをＧｅｎｅｒａｌＥｌｅｃｔｒｉｃ社製ＵＶ９００を用いて測定し、クロマトグラムをＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌで記録及びプロットした。動的結合容量（Dynamic Binding Capacities, ＤＢＣ）は、下記の等式を用いて５％破過点で算出した。

【0079】

【数1】

【0080】

[0076]結果は以下の表に示した。
[0077]図２に、Ｑ−シリカ及びＳ−シリカ材料を製造するための一般的な合成経路を示す。

【0081】

実施例１〜１０
[0078]初期結合多孔性シリカ粒子のサンプルは、粒子を、処理剤１（ビニルシラン）、すなわち３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート、及び／又は処理剤２（エポキシシラン）、すなわち（３−グリシドオキシプロピル）−トリメトキシシランで処理することによって製造した。ビニル及びエポキシシランを予備混合した。丸底フラスコに多孔性粒子を装入し、一定量の処理剤ミックスをフラスコに加えた。混合物を一晩回転させた。シリカの１／１０の量（重量による）の０．５Ｍ硫酸を加えた。混合物を室温で１時間回転させ、次に７０℃に１時間加熱した。フラスコを放冷した後、シリカを１Ｍ硫酸に３０分浸漬し、次いでろ過した。それを次にＤＩ水で５回洗浄し、ろ過し、７０℃で一晩乾燥させた。得られたサンプルを、元素分析（ＬＥＣＯ）にかけてシリカ上の炭素のパーセンテージを求め、それぞれ実施例１〜１０と標識した。これらの実施例の結果を以下の表１に示す。

【0082】

【表1】

【0083】

[0079]実施例３以外は、等量の２種類のシランをこれらの官能化に使用した。得られた炭素の量は、一般に、使用されたシランの総量に比例していた。実施例３では乾式結合にビニルシランのみが使用された。表１に示されているように、結合工程後の清浄かつ乾燥シリカサンプルの元素分析によって測定された炭素の量は、表面官能化後の表面官能基の量を決定するための指標として使用された。

【0084】

実施例１１〜２４
[0080]実施例１１〜２８に強陰イオン交換材料の製造法を記載する（表２）。これらの実施例では、実施例１〜１０の初期結合シリカを、第一のモノマー、すなわち（３−アクリルアミドプロピル）−トリメチルアンモニウムクロリド（７５％水溶液）；代替モノマー１、すなわち［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド（５０％水溶液）；代替モノマー２、すなわち［２−（アクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド（８０％水溶液）；第二のモノマー、すなわちジアリルジメチルアンモニウムクロリド（６５％水溶液）；Ｖ−５０開始剤；及び追加の脱イオン水（ＤＩＷ）を用いて表面処理した。

【0085】

[0081] 三つ口丸底フラスコに、気密嵌合されたオーバーヘッド機械撹拌機、窒素ガスの入口と出口、及び熱電対フィードバック付き加熱マントルを備え付けた。シリカと、開始剤以外の全試薬をまずフラスコに装入した。システムに窒素を２０分間通気した。次いで開始剤を導入した。窒素をさらに２０分間通気した後、フラスコを徐々に６５℃に加熱する。混合物をオーバーヘッド撹拌しながら６５℃に２時間維持し、その後室温に冷却した。混合物をビーカー中の５％ＮａＣｌ溶液中に注いだ。フラスコをＤＩ水で濯ぎ、フラスコ内部の残留シリカを完全に取り出した。混合物をオーバーヘッド撹拌機で数分間撹拌後、ろ過し、５％ＮａＣｌで３回、そしてＤＩ水で３回、繰り返し洗浄した。サンプルは、少量のシリカを９０℃で一晩乾燥させてから炭素含量の元素分析に付した以外は風乾させた。上記サンプルについて結合容量を計算した。得られたサンプルを実施例１１〜２４と標識した。これらの実施例の分析結果と結合容量を以下の表２に示す。

【0086】

【表2】

【0087】

[0082]試薬比は、反応に使用された試薬の量の重量比である。表２において、使用されたすべてのモノマーは水溶液なので、実際の量は濃度を掛け算して補正される。例えば、実施例１１では、試薬の量は、シリカ＝１０ｇ、モノマー＝６．６ｇ、第二のモノマー＝０．６ｇ、開始剤＝０．０４５ｇ、ＤＩ水＝６５ｇなので、比は、１０：（６．６×０．７５）：（０．６×０．６５）：０．０４５：６５＝１：０．５：０．０４：０．００４５：６．５と計算される。Ｃ％［初期結合］は、元素分析によって測定された初期結合工程後の乾燥シリカサンプル上の炭素の量である。Ｃ％［最終］は、元素分析によって測定された精製乾燥シリカサンプル上の炭素の量である。Ｃ［ポリ］＝Ｃ％［最終］−Ｃ％［初期結合］は、シリカ表面上のポリマー基によって寄与された炭素の量である。Ｃ［ポリ］／Ｃ［初期結合］比は二つの炭素数の割り算であり、ポリマーによって寄与された炭素を初期結合によって寄与された炭素と比べた尺度である。理論に拘束されるつもりはないが、比が高いほど表面上の鎖の数が少ない長鎖ポリマーを示しており、これは、より高いタンパク質結合のためには、表面上に鎖の多い短鎖を示す低い比よりも好適である。長鎖の方が結合ポリマーに対してより柔軟性を提供するからである。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をサンプルのすべての結合試験のモデルタンパク質として使用した。高い結合値ほど好適である。表２中、（Ｓ）は、ＢＳＡの修飾シリカへの結合が静的モードで測定された静的結合（ＳＢＣ）を表す（測定の手順については以下を参照）。（Ｄ）は、ＢＳＡの修飾シリカへの結合が動的フローモードで測定された動的結合（ＤＢＣ）を表す（測定の手順については以下を参照）。ｎ／ｍは測定されなかったことを意味することに注意する。

【0088】

[0083]表２から分かるように、実施例１３以外、全サンプルとも容認できる結合結果を提供した。実施例１３では、ポリマーのシリカ表面への結合はなかった。実施例１４及び１５では、第二のモノマー、ジアリルジメチルアンモニウムクロリドが一般に高いＢＳＡタンパク質結合を提供した。実施例１６では、Ｃ％［ポリマー］／Ｃ％［初期結合］の比が増大し、ＢＳＡの結合が改良された。実施例１７、１８及び２０では代替モノマーを試験した。代替モノマー１は、第一のモノマーのサンプル（実施例１９）よりわずかに高いＢＳＡ結合を示したが、代替モノマー２は、第一のモノマーよりずっと低いタンパク質結合しか示さなかった。実施例２１では、サンプルは８００Åの細孔径／サイズを有するシリカを用いて製造され、これが最も高いＢＳＡタンパク質結合をもたらした。実施例２２は２３よりも高いＢＳＡ結合を示したが、これは実施例２２の方が高い炭素数比を有していたためである。実施例２４では低いタンパク質結合しか得られなかった。

【0089】

実施例２５〜２８
[0084]実施例２５〜２８に強陰イオン交換材料の別の製造法を示す。実施例２５〜２８（表３）の初期結合サンプルのための一般的方法手順は次の通りであった。回転蒸発器上の乾燥１Ｌ丸底フラスコ中で、５０ｇの乾燥シリカを０．６ｇのビニルシラン及び０．６ｇのエポキシシランと周囲温度で一晩（１６時間）混合し、次いでシリカを１Ｌビーカーに移して５００ｍｌの１Ｍ硫酸に１時間浸漬した。ろ過及び５×５００ＤＩ水による洗浄で初期結合シリカサンプルを得、これを７０℃で一晩乾燥させた。

【0090】

実施例２５〜２７
[0085]実施例２５〜２７の重合法手順は次の通りであった。実施例１１〜２４で使用された方法と同様に、前工程からの乾燥シリカ３０ｇを表３に従ってモノマー、開始剤及び水と混合した。実施例２５〜２７の最終生成物の分析結果及び結合容量測定及び計算も表３に示した。

【0091】

実施例２８
[0086]実施例２８の重合法手順は次の通りであった。２５０ｍｌビーカーに、表３の実施例２８に記載されている量の試薬を混合した。すべてが水に溶解するように撹拌する。この溶液を、３０ｇの初期結合シリカ（０．７６％炭素）を含有する２５０ｍｌエーレンマイヤーフラスコに注ぎ入れた。窒素ガスをフラスコに３０分間通気した後（シリカと水溶液をよく混合させるためにフラスコを時々振盪した）、ガス管を素早く除去し、フラスコの頂部をテープで密封した。水浴を用いてフラスコを徐々に６５℃に加熱し（〜３０分間）、温度を６５℃に２時間維持した。次いで混合物を室温に冷却した。混合物を１Ｌビーカー中の４００〜５００ｍｌの１０％ＮａＣｌ溶液中に注ぎ入れ、フラスコ内部の残留シリカを完全に取り出すために多少のＤＩ水で濯いだ。シリカをスパチュラで数分間撹拌した後、放置して粒子を沈降させた。上部の液相上清をデカントして廃棄し、残留シリカを５００ｍｌの５％ＮａＣｌ溶液と混合した。次に、シリカサンプルを３×５００ｍｌの５％ＮａＣｌ溶液、さらに３×５００ｍｌのＤＩ水で洗浄した。各洗浄ごとに真空下でろ過した。最終サンプルは、少量のサンプルを炭素含量の元素分析のために９０℃で乾燥させた以外は風乾させた。

【0092】

【表3】

【0093】

[0087]実施例２９〜３８に強陽イオン交換材料Ｓの製造法を示す（図２参照）。
実施例２９〜３４
[0088]ビニル及びエポキシシラン（それぞれ２．５ｇ）を２０ｍｌのシンチレーションバイアル中に予備混合した。２Ｌの丸底フラスコに２００グラムのＤ１０００シリカを装入し、一定量の処理剤ミックスを良く混合しながらフラスコに滴下添加した。フラスコ中の混合物を回転蒸発器内で一晩回転させた。２０ｍｌの０．５Ｍ硫酸を加えた。混合物を室温で１時間回転させた後、７０℃に１時間加熱した。フラスコを放冷した後、シリカを５００ｍｌの１Ｍ硫酸に３０分間浸漬し、次いでろ過した。それを次にＤＩ水で５回洗浄し、ろ過した。１００ｇのテトラメチルアンモニウムクロリドを１０００ｍｌのメタノール中に溶解し、シリカをこの溶液中に１時間浸漬した後、シリカをろ過し、３×５００ｍｌのメタノールで洗浄した。シリカを７０℃で一晩乾燥させた。サンプルを元素分析（ＬＥＣＯ）に付し、シリカ上の炭素のパーセンテージを決定した。サンプルは、１００ｇのサンプルあたり０．７９ｇの炭素を含有していることが分かった（０．７９％）。表４に記録されている実施例２９〜３４のすべての初期結合は上記のようにして製造された。

【0094】

[0089]５００ｍｌ三つ口丸底フラスコに、気密嵌合されたオーバーヘッド機械撹拌機、窒素ガスの入口と出口、及び熱電対フィードバック付き加熱マントルを備え付けた。初期結合されテトラメチルアンモニウムクロリドで処理されたシリカ（３０ｇ）、及び３７．５ｇのＡＭＰＳ、少量のＣＴＡ及び２００ｍｌのＤＩ水をまずフラスコに装入した。システムに窒素を２０分間通気した。次いで０．１５ｇのＶ５０１開始剤を導入した。窒素をさらに２０分間通気した後、フラスコを徐々に６５℃に加熱する。混合物をオーバーヘッド撹拌しながら６５℃に２時間維持し、次いでさらに２時間８０℃にした。フラスコを室温に放冷した。混合物をビーカー中の６００ｍｌの５％ＮａＣｌ溶液中に注いだ。フラスコをＤＩ水で濯ぎ、フラスコ内部の残留シリカを完全に取り出した。混合物をオーバーヘッド撹拌機で数分間撹拌後、ろ過し、５００ｍｌの５％ＮａＣｌで３回、そして５００ｍｌのＤＩ水で３回、繰り返し洗浄した。サンプルは、少量のシリカを９０℃で一晩乾燥させてから炭素及び硫黄含量の元素分析に付した以外は風乾させた。

【0095】

【表4】

【0096】

[0090]実施例２９〜３４では、ニワトリ卵白リゾチーム（Ｍ_ｗ約１７ｋＤ）及びウシガンマグロブリン（Ｍ_ｗ約１４０ｋＤ）タンパク質を陽イオン交換材料の静的結合容量（ＳＢＣ）試験に使用した。試験手順は、上記実施例１１〜２４のＱ−シリカに対するＢＳＡの場合と同様であったが、ただし、異なるタンパク質を使用し（同じく２５ｍｇ／ｍｌ濃度）、結合及び洗浄バッファーはｐＨ４．０の５０ｍＭＨＯＡｃ／ＮａＯＡｃであった。溶出バッファーはｐＨ４．０の５０ｍＭＨＯＡｃ／ＮａＯＡｃ中１ＭＮａＣｌであった。

【0097】

[0091]Ｑ−シリカとは異なり、ＡＭＰＳの重合は少量の連鎖移動剤（ＣＴＡ）、例えばＳ’−ビス（α，α’−ジメチル−α”−酢酸）−トリチオカーボネートの使用を必要とすることが分かった。ＣＴＡなしでは、タンパク質のシリカサンプルへの結合はずっと少なかった。表４から分かるように、ＣＴＡの量は、ポリマーの量（炭素及び硫黄含量から判断）だけでなく、サンプルの静的結合容量にも顕著な影響を及ぼしていた。ＣＴＡの量が多いと、少量のポリマー結合、低いリゾチーム結合をもたらしたが、ずっと大きいサイズのタンパク質であるグロブリンに対しては高結合をもたらした。ＣＴＡがなければ、リゾチームの場合もグロブリンの場合も著しく少ない結合量しか達成されなかった。

【0098】

実施例３５及び３６
[0092]実施例３５及び３６では、重合で使用されるＣＴＡの量に対するポリマーのサイズについて示す（シリカ使用せず）。三つ口丸底フラスコに、３７．５ｇ（１８１ｍｍｏｌ）のＡＭＰＳ、１．４ｇ（１８．１ｍｍｏｌ）のメタクリル酸、０．２ｇ（実施例３６では１ｇ）のＣＴＡ、及び２００ｍｌのＤＩ水を装入した。重合は上記と同様に実施した（シリカなし）。重合後、サンプルをＧＣＰ分析に付し、製造されたポリマーの分子量を決定した。実施例３５のＭ_ｗは８７４７１で、実施例３６のＭ_ｗは２０６７８であることが分かった。

【0099】

実施例３７
[0093]この実施例では強陽イオン交換相を製造するための代替法を提示する。この方法は熱的に不安定なアゾ基のほか親水性カルボン酸基も含有する官能基の化学結合を含む。図３に示されているように、アゾ開始剤をまずアミノプロピルトリメトキシシランと結合させた後、官能基をシリカと結合させる。重合はモノマーの存在下で熱により進行する。

【0100】

[0094]Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１１．５ｇを３５０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、溶液を氷浴で約５℃に冷却した。この溶液に、７．７８ｇの４，４’−アゾビス（シアノ吉草酸）（Ｖ−５０１開始剤）を加え、次いで１０ｇのアミノプロピルトリメトキシシランを加えた。混合物を冷温で３時間撹拌した後、さらに２時間で室温に温まらせた。反応後、未溶解の固体（大部分は尿素副産物）をろ過除去し、ろ液に１００ｇの実施例７の未処理シリカ（８００Å）を混合した。混合物を１Ｌの丸底フラスコに装入し、回転蒸発器上、室温で一晩回転させ、次いでろ過し、４×４００ｍｌのメタノールで洗浄した。固体を室温で一晩風乾させた。少量のサンプルを元素分析に付し、サンプルについて２．０３％という炭素数が得られた。

【0101】

[0095]３０ｇの上記シリカを２００ｍｌの水中で４０ｇのＡＭＰＳモノマーと混合した。水性混合物中に窒素を３０分間通気した後、三つ口丸底フラスコを窒素下で撹拌しながら６５℃に２時間加熱した。反応後、混合物をろ過し、３×５００ｍｌの５％ＮａＣｌ、次いで３×５００ｍｌのＤＩ水で洗浄した。サンプルの乾燥後、乾燥サンプルの元素分析から、炭素数４．２３％、硫黄数１．１７％が示された。ＢＳＡタンパク質の静的結合（ｐＨ４．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを使用）により、このサンプルのＢＳＡ結合容量は１５０ｍｇ／ｍｌであることが示された。

【0102】

実施例３８
[0096]この実施例では、異なる反応の組を使用して強陽イオン交換材料を製造した。図４に示されているように、シリカゲルをまずアミノプロピルトリメトキシシランと結合させた後、修飾シリカをＤＭＦ中でカップリング触媒作用（ＤＣＣ）を用いてアゾ開始剤と結合させ、次いでＡＭＰＳモノマーの存在下、高温で重合させた。

【0103】

[0097]Ｄ１０００（平均粒径７５μｍ、平均細孔径１０００Å）、２００ｇを、実施例１〜１０と同様の手順を用いて、まず２０ｇのアミノプロピルトリメトキシシランと結合させた。一晩回転した後、シリカを６００ｍｌの０．１ＭＨＣｌに浸漬し、その後ろ過した。１ＬのＤＩ水による３回の洗浄を実施し、各工程ごとに真空下でろ過した。シリカろ過ケーキを７０℃で一晩乾燥させ、乾燥シリカの炭素の量は０．８０％と決定された。

【0104】

[0098]上記の乾燥シリカ３５ｇを、１００ｍｌの乾燥ＤＭＦ溶媒中１．９２ｇのＤＣＣ、２．２４ｇのＶ−５０１アゾ開始剤、及び０．８ｇのトリエチルアミンの溶液と混合した。混合物を５００ｍｌの丸底フラスコに入れ、回転蒸発器上、室温で４時間回転させた。得られた混合物をろ過し、２×２００ｍｌのＤＭＦ、そして２×１５０ｍｌのアセトンで洗浄した。サンプルをオーブン中で乾燥させて元素分析をしたところ、炭素含量１．７４％が示された。残りのシリカはドラフト内にて室温で６時間乾燥させた。

【0105】

[0099]３４ｇの上記シリカを２００ｇのＤＩ水中で４０ｇのＡＭＰＳモノマーと混合した。システムを窒素で２０分間フラッシュ洗浄した後、撹拌しながら６５℃に加熱し、この温度に２時間維持した。その後、混合物を室温に冷却し、３×５００ｍｌの５％ＮａＣｌ、次いで３×５００ｍｌのＤＩ水で洗浄した。サンプルの乾燥後、乾燥サンプルの元素分析から、炭素数５．４７％、硫黄数１．６９％、及びｐＨ７．０（５０ｍｍｏｌリン酸塩バッファー）におけるゾチームタンパク質の静的結合（５％破過）１２５ｍｇ／ｍｌが示された。

【0106】

実施例３９及び４０
[0100]実施例３９及び４０では、エポキシ多孔性樹脂（ポリメタクリレートポリマー樹脂）粒子を使用した（図５参照）。粒子（５０μｍ又は１００μｍの平均粒径）はエポキシ基を有していて、これは水性媒体中で加水分解されてジオール基になるので、Ｑポリマーの重合で修飾に必要なのはビニル基のみである。従って、１００ｇの粒子を、４００ｍｌのＮＭＰ中、室温で１時間、次いで６０℃で１時間、４０ｍｌのアリルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で処理した。冷却後、サンプルをろ過し、３×５００ｍｌのＤＩ水、次いで５００ｍｌのメタノールで洗浄し、一晩風乾させた。３０ｇの上記修飾樹脂の重合は実施例１１に記載の手順を用いて実施した。表５から分かるように、どちらの実施例も容認できるＢＳＡタンパク質の静的結合を提供した。

【0107】

【表5】

【0108】

[0101]本発明を限られた数の態様に関して記載してきたが、これらの特定の態様は、本明細書において別段に記載され特許請求されている本発明の範囲を制限することを意図したものではない。当業者には、本明細書中の例示的態様を検討すれば、更なる修正、等価物、及び変形が可能であることは明白であろう。実施例中ならびに本明細書の残りの部分において、すべての部及びパーセンテージは、特に明記されない限り重量による。さらに、本明細書又は特許請求の範囲に列挙されている、特定の一連の性質、測定単位、条件、物理的状態又はパーセンテージを表すような何らかの数値範囲は、文字通り、そのように列挙された何らかの範囲内のいずれかの数値のサブセットも含め、そのような範囲内に入るあらゆる数字を引用又はその他によって本明細書中に明示的に取り込むことを意図している。例えば、下限Ｒ_Ｌ及び上限Ｒ_Ｕを有する数値範囲が開示される場合はいつでも、その範囲内に入る任意の数値Ｒも具体的に開示される。特に、その範囲内の下記数値Ｒが具体的に開示される。すなわち、Ｒ＝Ｒ_Ｌ＋ｋ（Ｒ_Ｕ−Ｒ_Ｌ）、ここでｋは、１％ずつ増加する１％〜１００％の範囲の変数、例えば、ｋは１％、２％、３％、４％、５％．．．５０％、５１％、５２％．．．９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。さらに、上で計算されたような、Ｒの任意の二つの数値によって表される何らかの数値範囲も具体的に開示される。本明細書中に示され記載されたものに加えて、当業者には本発明の何らかの修正が上記の説明及び添付の図面から明らかになるであろう。そのような修正も、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。本明細書中で引用されたすべての文献は、参照によってそれらの全文を本明細書に援用する。

【符号の説明】

【0109】

１００クロマトグラフィーカラム（イオン交換カラム）
１５０カラムハウジング
１５１担体ベッド空間
１５２第一の端部キャップ
１５３第二の端部キャップ
１５４カラム入口
１５５カラム出口
１５６管状ハウジング部材
１５７セントラルボア
１５８ノズル
１５９フィルター
１６０分配チャネル
［発明の態様］
［１］
官能化粒状保持体であって、
粒子表面を有する粒子と；そして
その粒子表面から伸びる官能基の組合せ
とを含み、前記官能基の組合せは、（ｉ）第一の組の官能基であって、その第一の組の官能基を介して粒子表面上での一つ又は複数のモノマーの重合を可能にする第一の組の官能基と、そして（ii）前記粒子表面の湿潤性を増大する第二の組の官能基とを含む官能化粒状保持体。
［２］
前記第二の官能基が、前記一つ又は複数のモノマー又は粒子表面に結合されている、１に記載の官能化粒状保持体。
［３］
前記粒子が無機粒子を含む、１又は２に記載の官能化粒状保持体。
［４］
前記粒子がシリカ粒子を含む、１〜３のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［５］
前記粒子が、メジアン粒子寸法による測定で、約１μｍ〜約１２０μｍの範囲の粒径を有する、１〜４のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［６］
前記粒子が、メジアン粒子寸法による測定で、約１０μｍ〜約１２０μｍの範囲の粒径、及び少なくとも１５０Åのメジアン細孔径を有する多孔性粒子を含む、１〜５のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［７］
前記第一の組の官能基が不飽和結合を含む、１〜６のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［８］
前記第一の組の官能基が、ビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基、又はそれらのうちのいずれかの組合せを含む、１〜７のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［９］
前記第二の組の官能基が少なくとも一つの親水性有機基を含む、１〜８のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［１０］
前記第二の組の官能基が、ヒドロキシル基、ジオール基、オキシエチレン基、ポリエチレン基、カルボン酸基、アミン基、アミド基、又はそれらのうちのいずれかの組合せを含む、１〜８のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［１１］
前記粒子表面上の炭素含量が、粒状保持体の重量の約３．５ｗｔ％以下である、１〜１０のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［１２］
前記第一の組の官能基がビニル基を含み、前記第二の組の官能基がジオール基を含む、１〜１１のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［１３］
前記第一及び第二の組の官能基が、アゾ基及びカルボン酸基を含む分子の一部である、１〜１１のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［１４］
前記粒子表面が、重合前に、第四アンモニウム塩又はその第四アンモニウム陽イオンでさらに処理される、１〜１３のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［１５］
前記粒子表面が、重合前に、テトラメチルアンモニウムクロリドを含む第四アンモニウム陽イオン又はテトラメチルアンモニウム陽イオンでさらに処理される、１〜１３のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［１６］
前記第一の組の官能基の少なくとも一部が、一つ又は複数のモノマー及び任意に、一つ又は複数のスペーサーモノマーと重合して、前記粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成する、１〜１５のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［１７］
前記第一の組の官能基の少なくとも一部が、一つ又は複数のモノマー及び一つ又は複数のスペーサーモノマーと重合して、前記粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成する、１〜１５のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［１８］
ポリマー鎖が、下記式：

【化5】

［式中、
Ｒ^１は、Ｈ又はＣＨ_３であり；
Ｒ’及びＲ”は、それぞれ独立にＨ又はＣＨ_３であり；
Ｙは、

【化6】

であり；
Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立に、
（ａ）Ｃ_１−１０−アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１−１０−アルキル、シクロアルキル、Ｃ_１−１０−アルキル−シクロアルキル又はＣ_１−１０−アルキルフェニル、
（ｂ）アミノ、モノ−又はジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、カルボキシル、又はスルホニルのそれぞれによって一置換又は多置換された、（ａ）の中の上記基の一つ、
（ｃ）５〜１０個のＣ原子を有する環状又は二環式ラジカル、ここで一つ又は複数のＣＨ又はＣＨ_２基は、（ｉ）Ｎ又はＮＨ、（ii）Ｎ又はＮＨ及びＳ、又は（iii）Ｎ又はＮＨ及びＯによって置換されている、又は
（ｄ）Ｒ^２又はＲ^３の一つはＨである；
であり、Ｒ^２及びＲ^３は、二つのラジカルとも酸性又は塩基性であるか、又はラジカルの一つが中性で一つが酸性又は塩基性であるように互いに調整され；そして
Ｒ^４は、Ｃ_１−１０−アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１−１０−アルキル、シクロアルキル又はＣ_１−１０−アルキル−シクロアルキル、又はＣ_１−１０−シクロアルキルフェニルであり、それぞれ、アミノ、モノ−又はジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、カルボキシル、又はスルホニルのそれぞれによって一置換又は多置換されており；そして
ｎは２〜１０００である］の同一又は異なる反復単位を含む、１７に記載の官能化粒状保持体。
［１９］
前記第一の組の官能基の少なくとも一部が、一つ又は複数のモノマー及び任意に、一つ又は複数のスペーサーモノマーと重合して、前記粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成し、前記一つ又は複数のモノマーは少なくとも一つの陰イオン性モノマーを含む、１〜１５のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［２０］
前記第一の組の官能基の少なくとも一部が、一つ又は複数のモノマー及び任意に、一つ又は複数のスペーサーモノマーと重合して、前記粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成し、前記一つ又は複数のモノマーは２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸を含み、前記任意の一つ又は複数のスペーサーモノマーはメチレンビスアクリルアミドを含む、１〜１５のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［２１］
重合が、ポリマーの鎖長又は分子量を低減する連鎖移動剤を含む、１〜２０のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［２２］
重合が、硫黄基、チオールカルボニル基、チオールエステル基、チオールカーボネート基及びそれらの組合せを含む連鎖移動剤を含む、１〜２０のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［２３］
前記第一の組の官能基の少なくとも一部が、一つ又は複数のモノマー及び任意に、一つ又は複数のスペーサーモノマーと重合して、前記粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成し、前記一つ又は複数のモノマーは少なくとも一つの陽イオン性モノマーを含む、１〜９及び１２〜１３のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［２４］
前記第一の組の官能基の少なくとも一部が、一つ又は複数のモノマー及び任意に、一つ又は複数のスペーサーモノマーと重合して、前記粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成し、前記一つ又は複数のモノマーは３−アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド又はメチルアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリドを含み、前記任意の一つ又は複数のスペーサーモノマーはジアリルジメチルアンモニウムクロリドを含む、１〜９、１２〜１３及び１６のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体。
［２５］
クロマトグラフィー装置に使用するのに適切なクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジであって、前記クロマトグラフィー用カラム又はカートリッジは１〜２３のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体を含有するクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［２６］
前記クロマトグラフィー用カラム又はカートリッジが、入口端及び出口端を有する管状の形状を含み、前記管状の形状はポリマー材料から形成される、２４に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［２７］
前記クロマトグラフィー用カラム又はカートリッジが、１回使用の使い捨てカラム又はカートリッジを含む、２４〜２６のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［２８］
２４〜２６のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジを含むクロマトグラフィー装置。
［２９］
サンプルの分離法であって、前記方法は、
サンプルを１〜２３のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体と接触させる工程を含む方法。
［３０］
少なくとも一つの生体分子を含有するサンプルの分離法であって、前記方法は、少なくとも一つの生体分子を含有するサンプルを１〜２３のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体と接触させる工程を含む方法。
［３１］
少なくとも一つの生体分子が、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、非ペプチジル化合物、炭水化物、オリゴヌクレオチド、それらの誘導体、それらの類似体、又はそれらのうちのいずれかの組合せを含む、３０に記載の方法。
［３２］
官能化粒状保持体の製造法であって、
粒子の粒子表面を、粒子表面から伸びる官能基の組合せが得られるように処理することを含み、前記官能基の組合せは、（ｉ）第一の組の官能基であって、その第一の組の官能基を介して粒子表面上での一つ又は複数のモノマーの重合を可能にする第一の組の官能基と、そして（ii）粒子表面の湿潤性を増大する第二の組の官能基とを含む方法。
［３３］
前記処理工程が、粒子表面を、（ｉ）第一の組の官能基からの官能基を含む少なくとも一つのシラン、及び（ii）第二の組の官能基からの官能基を含む少なくとも一つのシランに暴露することを含む、３２に記載の方法。
［３４］
前記処理工程が、前記第一の組の官能基又は第二の組の官能基の少なくとも一つを粒子表面に結合し、その後に前記重合が行われる、３２に記載の方法。
［３５］
前記処理工程後の前記粒子表面上の炭素含量が約３．５％以下である、３２に記載の方法。
［３６］
前記重合工程後の前記粒子表面上の炭素含量が、粒子の全重量を基にして少なくとも約４．０重量％である、３２に記載の方法。
［３７］
重合工程後の前記粒子表面上の炭素含量を処理工程後の前記粒子表面上の炭素含量と比較した比が少なくとも約２である、３２に記載の方法。
［３８］
第一の組の官能基が不飽和炭素を含む、３２又は３３に記載の方法。
［３９］
前記第一の組の官能基が、ビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基、又はそれらのうちのいずれかの組合せを含む、３２〜３８のいずれか１項に記載の方法。
［４０］
第二の組の官能基が少なくとも一つの親水性有機基を含む、３２〜３９のいずれか１項に記載の方法。
［４１］
前記第二の組の官能基が、ヒドロキシル基、ジオール基、オキシエチレン基、ポリエチレン基、カルボン酸基、アミン基、アミド基、又はそれらのうちのいずれかの組合せを含む、３２〜４０のいずれか１項に記載の方法。
［４２］
第一の組の官能基がビニル基を含み、第二の組の官能基がジオール基を含む、３２〜４１のいずれか１項に記載の方法。
［４３］
粒子表面が、重合前に、第四アンモニウム塩又はその第四アンモニウム陽イオンでさらに処理される、３２〜４２のいずれか１項に記載の方法。
［４４］
粒子表面が、重合前に、テトラメチルアンモニウムクロリドを含む第四アンモニウム陽イオン又はテトラメチルアンモニウム陽イオンでさらに処理される、３２〜４３のいずれか１項に記載の方法。
［４５］
粒子が無機粒子を含む、３２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
［４６］
粒子がシリカ粒子を含む、３２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
［４７］
粒子が、メジアン粒子寸法による測定で、約１ミクロン（μｍ）〜約１２０μｍの範囲の粒径を有する、３２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
［４８］
粒子が、メジアン粒子寸法による測定で、約１０ミクロン（μｍ）〜約１２０μｍの範囲の粒径、及び少なくとも１５０Åのメジアン細孔径を有する多孔性粒子を含む、３２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
［４９］
第一の組の官能基の少なくとも一部を重合させることをさらに含む、３２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
［５０］
第一の組の官能基の少なくとも一部を重合させることをさらに含み、前記重合工程は、第一の組の官能基を一つ又は複数のモノマーと、任意に、一つ又は複数のスペーサーモノマーの存在下で反応させて、粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成させることを含む、３２〜４９のいずれか１項に記載の方法。
［５１］
第一の組の官能基の少なくとも一部を重合させることをさらに含み、前記重合工程は、第一の組の官能基を一つ又は複数のモノマーと、一つ又は複数のスペーサーモノマーの存在下で反応させて、粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成させることを含む、３２〜５０のいずれか１項に記載の方法。
［５２］
第一の組の官能基の少なくとも一部を重合させることをさらに含み、前記重合工程は、第一の組の官能基を一つ又は複数のモノマーと、任意に、一つ又は複数のスペーサーモノマーの存在下で反応させて、粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成させることを含み、前記一つ又は複数のモノマーは少なくとも一つの陰イオン性モノマーを含む、３２〜５０のいずれか１項に記載の方法。
［５３］
第一の組の官能基の少なくとも一部を重合させることをさらに含み、前記重合工程は、第一の組の官能基を一つ又は複数のモノマーと、任意に、一つ又は複数のスペーサーモノマーの存在下で反応させて、粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成させることを含み、前記一つ又は複数のモノマーは２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸を含み、前記任意の一つ又は複数のスペーサーモノマーはメチレンビスアクリルアミドを含む、３２〜５０のいずれか１項に記載の方法。
［５４］
第一の組の官能基の少なくとも一部を重合させることをさらに含み、前記重合工程は、第一の組の官能基を一つ又は複数のモノマーと、任意に一つ又は複数のスペーサーモノマーの存在下で反応させて、粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成させることを含み、前記一つ又は複数のモノマーは少なくとも一つの陽イオン性モノマーを含む、３２〜５０のいずれか１項に記載の方法。
［５５］
第一の組の官能基の少なくとも一部を重合させることをさらに含み、前記重合工程は、第一の組の官能基を一つ又は複数のモノマーと、任意に、一つ又は複数のスペーサーモノマーの存在下で反応させて、粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成させることを含み、前記一つ又は複数のモノマーは３−アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリドを含み、前記任意の一つ又は複数のスペーサーモノマーはジアリルジメチルアンモニウムクロリドを含む、３２〜５０及び５４のいずれか１項に記載の方法。
［５６］
第四アンモニウム塩又は第四アンモニウム陽イオンを粒子表面から除去することをさらに含む、４３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
［５７］
非結合ポリマー又はモノマーを粒子表面から除去することをさらに含み、前記除去工程は粒子表面を塩溶液に暴露することを含む、３２〜５６のいずれか１項に記載の方法。
［５８］
非結合ポリマー又はモノマーを粒子表面から除去することをさらに含み、前記除去工程は粒子表面を前記重合工程後に塩溶液に暴露することを含む、３２〜５７のいずれか１項に記載の方法。
［５９］
非結合ポリマー又はモノマーを粒子表面から除去することをさらに含み、前記除去工程は粒子表面を５ｗｔ％塩化ナトリウム溶液を含む塩溶液に暴露することを含む、３２〜５８のいずれか１項に記載の方法。
［６０］
２４〜２８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジの製造法であって、前記方法は、
（１）管状構造の第一の端部を密封し；
（２）管状構造のカラム空洞に、１〜２３のいずれか１項に記載の官能化粒状保持体又は３２〜５９のいずれか１項に記載の方法によって形成された官能化粒状保持体を少なくとも部分的に充填し；
（３）管状構造のカラム空洞に第一のバッファー溶液を少なくとも部分的に充填して官能化粒状保持体をカプセル化し；そして、任意に
（４）管状構造の反対端を密封する
ことを含む方法。
［６１］
２４〜２８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ、又は６０に記載の方法で製造されたクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジを用いてサンプルを分離する方法。
［６２］
少なくとも一つの生体分子を含有するサンプルの分離法であって、前記方法は、
少なくとも一つの生体分子を含有するサンプルを、２４〜２８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ又は６０に記載の方法で製造されたクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ内の官能化粒状保持体と接触させる工程を含む方法。
［６３］
少なくとも一つの生体分子を含有するサンプルの分離法であって、前記方法は、
少なくとも一つの生体分子を含有するサンプルを、２４〜２８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ又は６０に記載の方法で製造されたクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ内の官能化粒状保持体と接触させる工程を含み、前記少なくとも一つの生体分子は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、非ペプチジル化合物、ポリエンマクロライド、テルペン、アルカロイド、炭水化物、オリゴヌクレオチド、それらの誘導体、それらの類似体、又はそれらのうちのいずれかの組合せを含む方法。
［６４］
官能化粒状保持体を収容するクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジであって、前記官能化粒状保持体は、
粒子表面を有する粒子と；そして
その粒子表面から伸びる官能基の組合せとを含み、前記官能基の組合せは、（ｉ）粒子表面から伸びる少なくとも一つのポリマーに結合された粒子表面上の第一の組の官能基と、そして（ii）前記粒子表面の湿潤性を増大する第二の組の官能基とを含むクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［６５］
前記第二の官能基が、前記一つ又は複数のモノマー又は粒子表面に結合されている、６４に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［６６］
前記粒子が無機粒子を含む、６４又は６５に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［６７］
前記粒子がシリカ粒子を含む、６４〜６６のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［６８］
前記粒子が、メジアン粒子寸法による測定で、約１μｍ〜約１２０μｍの範囲の粒径を有する、６４〜６７のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［６９］
前記粒子が、メジアン粒子寸法による測定で、約１０μｍ〜約１２０μｍの範囲の粒径、及び少なくとも１５０Åのメジアン細孔径を有する多孔性粒子を含む、６４〜６８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［７０］
前記第一の組の官能基が不飽和結合を含む、６４〜６９のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［７１］
前記第一の組の官能基が、ビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基、又はそれらのうちのいずれかの組合せを含む、６４〜７０のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［７２］
前記第二の組の官能基が少なくとも一つの親水性有機基を含む、６４〜７１のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［７３］
前記第二の組の官能基が、ヒドロキシル基、ジオール基、オキシエチレン基、ポリエチレン基、カルボン酸基、アミン基、アミド基、又はそれらのうちのいずれかの組合せを含む、６４〜７２のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［７４］
前記粒子表面上の炭素含量が、粒状保持体の重量の約２．０ｗｔ％以下である、６４〜７３のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［７５］
前記第一の組の官能基がビニル基を含み、前記第二の組の官能基がジオール基を含む、６４〜７４のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［７６］
前記第一及び第二の組の官能基が、アゾ基及びカルボン酸基を含む分子の一部である、６４〜７５のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［７７］
前記粒子表面が、第四アンモニウム塩又はその第四アンモニウム陽イオンでさらに処理される、６４〜７６のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［７８］
前記粒子表面が、テトラメチルアンモニウムクロリドを含む第四アンモニウム陽イオン又はテトラメチルアンモニウム陽イオンでさらに処理される、６４〜７７のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［７９］
前記第一の組の官能基の少なくとも一部が、一つ又は複数のモノマー及び任意に、一つ又は複数のスペーサーモノマーと重合して、前記粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成する、６４〜７８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［８０］
前記第一の組の官能基の少なくとも一部が、一つ又は複数のモノマー及び一つ又は複数のスペーサーモノマーと重合して、前記粒子表面から伸びるポリマー鎖を形成する、６４〜７９のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー用カラム又はカートリッジ。
［８１］
ポリマー鎖が、下記式：

【化7】