特許 6469591 血液凝固第ＶＩＩ因子を含有する組成物におけるウイルス不活性化法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6469591

(24)【登録日】2019年1月25日

(45)【発行日】2019年2月13日

(54)【発明の名称】血液凝固第ＶＩＩ因子を含有する組成物におけるウイルス不活性化法

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/04 20060101AFI20190204BHJP

   C12N 15/57 20060101ALI20190204BHJP

   A61K 38/36 20060101ALI20190204BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20190204BHJP

   C07K 14/745 20060101ALN20190204BHJP

   C12N 9/48 20060101ALN20190204BHJP

【ＦＩ】

   C12N7/04ZNA

   C12N15/57

   A61K38/36

   A61P7/04

   !C07K14/745

   !C12N9/48

【請求項の数】10

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2015-555914(P2015-555914)

(86)(22)【出願日】2014年2月3日

(65)【公表番号】特表2016-510216(P2016-510216A)

(43)【公表日】2016年4月7日

(86)【国際出願番号】KR2014000898

(87)【国際公開番号】WO2014119953

(87)【国際公開日】20140807

【審査請求日】2017年2月3日

(31)【優先権主張番号】10-2013-0011472

(32)【優先日】2013年1月31日

(33)【優先権主張国】KR

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】515022445

【氏名又は名称】ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100088694

【弁理士】

【氏名又は名称】弟子丸 健

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(72)【発明者】

【氏名】キム デジン

(72)【発明者】

【氏名】イ ビョンソン

(72)【発明者】

【氏名】キム スンス

(72)【発明者】

【氏名】ファン サンユン

(72)【発明者】

【氏名】チェ イニョン

(72)【発明者】

【氏名】クォン セチャン

【審査官】 上條 肇

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５２８８５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５１８４１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５３７９９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５２５７２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５２９６４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０８２９３１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０２７２５７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２０１３／０５１９００（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 Medical Journal of the Islamic Republic of Iran，２００１年，Vol.15, No.2，pp.103-108

【文献】 SUPEROXIDE DISMUTASE 1, PARTIAL [HOMO SAPIENS]，Database DDBJ/EMBL/GenBank [online], Accessin No. ABL96474, 26-DEC-2006 uploaded, [retrieved on 2017-12-12] ，<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/119710570?sat=14&satkey=3129478>

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００ − ９／９９

Ａ６１Ｋ ３８／００ − ５１／１２

Ｃ０７Ｋ １／００ − １９／００

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を含む組成物に界面活性剤を加える段階を含む、ウイルス不活性化法であって、
前記血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体は、血液凝固第ＶＩＩ因子のＣ-末端に、配列番号３及び６〜１２からなる群より選択される１つのペプチド配列を有するペプチドリンカーが連結された形態である、ウイルス不活性化法。

【請求項2】

前記組成物中における活性化された血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体の含量が、血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体の総量に対して５％未満である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記組成物が液状組成物である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記液状組成物がｐＨ５．０〜８．０である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記組成物が４〜２５℃の温度である、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

前記組成物中の血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体の濃度が、０．０１ｍｇ/ｍＬ〜５．０ｍｇ/ｍＬである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記界面活性剤が、トゥイーン、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポロキサマ１８８、トリトンＸ-１００及びその組み合わせからなる群より選択されるものである、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記界面活性剤は、最終濃度が０．０１〜１．００％（ｗ/ｖ）になるように加える、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記界面活性剤は、最終濃度が０．１〜０．５％（ｗ/ｖ）になるように加える、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を含む組成物に界面活性剤を加えることを含む、血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を含むウイルス不活性化組成物の製造方法であって、
前記血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体は、血液凝固第ＶＩＩ因子のＣ-末端に、配列番号３及び６〜１２からなる群より選択される１つのペプチド配列を有するペプチドリンカーが連結された形態である、製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血液凝固第ＶＩＩ因子を含有する組成物におけるウイルス不活性化法に関するもので、より具体的には、血液凝固第ＶＩＩ因子又はその誘導体を含有する組成物に界面活性剤を加える段階を含むウイルス不活性化法、及び血液凝固第ＶＩＩ因子又はその誘導体を含むウイルスが不活性化された組成物を製造する方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

現在、世界的な血友病患者は１４万人と推定されており、毎年２０％の増加傾向を示している。遺伝的に、１万人に一人の割合で血友病が発症しているが、全患者の約２５％しか診断又は治療を受けていない。前記血友病は病因により大きく２つのタイプに分けられる。一方は、血液凝固第ＶＩＩ因子（第ＶＩＩ因子、ＦａｃＶＩＩ）の欠乏により発病する血友病Ａであり、全血友病患者の８０％を占める。他方は、血液凝固第ＸＩ因子（第ＸＩ因子）の欠乏により発病する血友病Ｂであり、全血友病患者の２０％を占める。このような血友病の治療のために、血液凝固因子を外部から投与する方法が行われているが、このような治療法は、全血友病Ａ患者の１０〜１５％で血液凝固因子に対する抗体が生成され、全血友病Ｂ患者の１〜３％で血液凝固因子に対する抗体が生成されるという問題がある。

【0003】

一方、血友病患者の半分以上を占める血友病Ａの病因であるＦａｃＶＩＩは、主に肝臓で生産される４０６個のアミノ酸からなる酵素であって、１０位のグルタミン酸がγ-カルボキシ化、１４５位と３２２位のアスパラギンがＮ-グリコシル化、及び５２位と６０位のセリンがＯ-グリコシル化されていることを含む。さらに、ＦａｃＶＩＩは、２つのＥＧＦ様ドメイン及び１つのセリンプロテアーゼドメインを有し、１５２位のアルギニンと１５３位のイソロイシン間の開裂によって軽鎖と重鎖からなる二本鎖のＦａｃＶＩＩａが生成され、一本鎖ＦａｃＶＩＩが活性化する。よって、活性型ＦａｃＶＩＩａは、他の血液凝固因子とは異なる補助的な血液凝固機序を通じて作用するため、ＦａｃＶＩＩａの高用量投与でも抗体が生成されない。従って、従来の治療により、ＦａｃＶＩＩに対する抗体を有する患者だけでなく、血友病Ａ患者の治療にも用いることができ、前記問題の解決手段として知られている。

【0004】

しかし、動物細胞を用いたＦａｃＶＩＩ組換え体の生産ではウイルスによる汚染のリスクが高いため、ＦａｃＶＩＩ生産の工程では、潜在的なウイルスの除去工程を含むことが求められている。ウイルスによる汚染を不活性化させる工程を経た組成物では、不活性化以前の初期組成物に比べてＦａｃＶＩＩの力価が低いという問題が頻繁に発生する。

【0005】

このような背景の下、本発明者らは、ＦａｃＶＩＩ又はそのアミノ酸配列を有するＦａｃＶＩＩ誘導体を含む組成物において、ＦａｃＶＩＩの力価を低下させることなく、ウイルスを効果的に不活性化させた組成物を開発するために鋭意努力した。その結果、ＦａｃＶＩＩを含む組成物に界面活性剤を加えた場合、ＦａｃＶＩＩ又はその誘導体の活性に影響を及ぼさず、汚染されたウイルスを不活性化できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】韓国特許公報第10-2013-0037659号

【特許文献2】韓国特許公報第880509号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Urlaub et al., Somat. Cell. Mol. Genet., 12, 555-566, 1986

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的は、血液凝固第ＶＩＩ因子（第ＶＩＩ因子、ＦａｃＶＩＩ）又はその誘導体を含む組成物におけるウイルス不活性化法を提供することである。

【0009】

本発明の他の目的は、血液凝固第ＶＩＩ因子又はその誘導体を含むウイルスが不活性化された組成物の製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

前記目的を達成するための一態様として、本発明は、血液凝固第ＶＩＩ因子（第ＶＩＩ因子、ＦａｃＶＩＩ）又はその誘導体を含む組成物に界面活性剤を加える段階を含む、ウイルス不活性化法を提供する。

【0011】

具体的な一実施態様として、本発明による組成物において活性化された血液凝固第ＶＩＩ因子又はその誘導体の含量は、全血液凝固第ＶＩＩ因子又はその誘導体に対して５％未満である。

【0012】

他の実施態様として、本発明による組成物は液状組成物である。

【0013】

他の実施態様として、本発明による液状組成物はｐＨ５．０〜８．０である。

【0014】

他の実施態様として、本発明による液状組成物はｐＨ５．５である。

【0015】

他の実施態様として、本発明による組成物は４〜２５℃の温度を有する。

【0016】

他の実施態様として、本発明による組成物における血液凝固第ＶＩＩ因子又はその誘導体の濃度は、０．０１ｍｇ/ｍＬ〜５．０ｍｇ/ｍＬである。

【0017】

他の実施態様として、本発明の方法で用いられた界面活性剤は、トゥイーン、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポロキサマ１８８、トリトンＸ-１００、及びその組み合わせからなる群より選択されるものである。

【0018】

他の実施態様として、前記界面活性剤を、最終濃度が０．０１〜１．００％（ｗ/ｖ）になるように本発明の組成物に加えることである。

【0019】

他の実施態様として、前記界面活性剤を、最終濃度が０．１〜０．５％（ｗ/ｖ）になるように本発明の組成物に加えることである。

【0020】

他の実施態様として、本発明の方法で用いた血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体は、血液凝固第ＶＩＩ因子のＣ-末端にペプチドリンカーが連結されることによって製造したものである。

【0021】

他の実施態様として、血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体におけるペプチドリンカーは、Ｃ-末端の最後のアミノ酸残基としてシステインを有するものである。

【0022】

他の実施態様として、血液凝固第ＶＩＩ因子のＣ-末端に連結されたペプチドリンカーが、配列番号３及び６〜１２からなる群より選択される１つのペプチド配列を有するものである。

【0023】

他の実施様態として、本発明は、血液凝固第ＶＩＩ因子又はその誘導体を含有する組成物に界面活性剤を加える段階を含む、血液凝固第ＶＩＩ因子又はその誘導体を含有するウイルス不活性化組成物の製造方法を提供する。

【発明の効果】

【0024】

本発明により提供されたウイルス不活性化法を用いると、ＦａｃＶＩＩ又はＦａｃＶＩＩ誘導体の活性を維持しつつ、ＦａｃＶＩＩ及びそのアミノ酸配列を有する誘導体を含有する溶液中のウイルスを不活性化させることができる。従って、このような方法は、血友病の予防又は治療剤の効果的な生産に広く用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】ＦａｃＶＩＩ誘導体を、ＣＨＯ細胞株を用いて発現させた後、精製し、界面活性剤を用いてウイルスを不活性化する前と不活性化した後において純度を分析した結果を表す電気泳動の画像である。サイズマーカーを基準に左側は、非還元条件下におけるＦａｃＶＩＩ誘導体の純度分析の結果を示し、サイズマーカーを基準に右側は、還元条件下におけるＦａｃＶＩＩ誘導体の純度分析の結果を示す。

【図2】ＦａｃＶＩＩ誘導体を、ＣＨＯ細胞株を用いて発現させた後、精製し、界面活性剤を用いてウイルスを不活性化する前と不活性化した後において活性を分析した結果を表すグラフである。丸（○）は、ウイルス不活性化前のＦａｃＶＩＩ誘導体の活性を示し、四角（□）は、ウイルス不活性化後のＦａｃＶＩＩ誘導体の活性を示す。

【図3】ＦａｃＶＩＩ誘導体を、ＣＨＯ細胞株を用いて発現させた後、精製し、界面活性剤を用いてウイルスを不活性化する前と不活性化した後において純度を分析した結果を表す電気泳動分析の画像である。サイズマーカーを基準に左側の写真は、非還元条件下におけるＦａｃＶＩＩの純度分析の結果を示し、右側の写真は、還元条件下におけるＦａｃＶＩＩの純度分析の結果を示す。図３の点線の四角い部分は、ウイルス不活性化工程により生成されたＦａｃＶＩＩａを表す。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明は、血液凝固第ＶＩＩ因子（第ＶＩＩ因子、ＦａｃＶＩＩ）又はその誘導体を含有する組成物に界面活性剤を加える段階を含むウイルスの不活性化法、又は血液凝固第ＶＩＩ因子又はその誘導体を含有するウイルス不活性化組成物の製造方法に関するものである。

【0027】

本発明における用語「血液凝固第ＶＩＩ因子（第ＶＩＩ因子、ＦａｃＶＩＩ）」とは、プロコンバーチンとも言う、血液凝固に関与する因子の一つであって、大きさは４８ｋＤａで、大きさ１２．８ｋｂの遺伝子によりコードされる。主に、肝臓で生産されるビタミンＫ依存性血漿タンパク質の一つである。第ＶＩＩ因子は、セリンプロテアーゼ前駆体及び平滑筋細胞のような血管外組織、腫瘍組織又は活性化した白血球の表面の組織因子（血液凝固第ＩＩＩ因子）に結合して血液凝固第ＩＸ因子及びＸを活性化することによって、外因性血液凝固の開始を誘導することが知られている。本発明において、ＦａｃＶＩＩは、天然型ＦａｃＶＩＩの正常な活性を保持しつつ、天然型ＦａｃＶＩＩ、天然型ＦａｃＶＩＩの正常な活性を保持する化学的に修飾されたＦａｃＶＩＩ誘導体、及び少なくとも８０％のアミノ酸配列相同性を有し、好ましくは８５％、９０％又は９５％のアミノ酸配列相同性を有し、より好ましくは９８％又は９９％のアミノ酸配列相同性を有する変異体であってもよい。しかし、前記配列相同性は、本発明の方法に適用できるものであれば、これらに限定されるものではない。

【0028】

本発明における用語「血液凝固第ＶＩＩａ因子（第ＶＩＩａ因子、ＦａｃＶＩＩａ）」とは、血液凝固第ＶＩＩ因子の活性型を意味する。ＦａｃＶＩＩの活性において、重鎖の活性部位は、ＦａｃＶＩＩの１５２位のアルギニンと１５３位のイソロイシン間の開裂により露出し、それによって、１つのアミノ酸配列からなるＦａｃＶＩＩから２つのアミノ酸配列（軽鎖及び重鎖）からなる二量体の形態が生成される。この際、１５２位のアルギニン残基と１５３位のイソロイシン残基は、最初に発現したＦａｃＶＩＩポリペプチドにおけるプロセッシングの結果によるシグナルペプチド及びプロペプチド（プレ-プロリーダー配列とも言う）を除いて、ＦａｃＶＩＩ軽鎖の１番目のアミノ酸を１位のアミノ酸として番号づけたものである。活性型ＦａｃＶＩＩａは、他の血液凝固因子とは異なり補助的な血液凝固機序を通じて作用するため、ＦａｃＶＩＩａの高用量投与でも抗体が生産されない。

【0029】

本発明における用語「ＦａｃＶＩＩ誘導体」とは、ＦａｃＶＩＩのＣ-末端にペプチドリンカーが連結されることにより製造されたポリペプチド配列からなる改変されたＦａｃＶＩＩを意味する。前記ＦａｃＶＩＩ誘導体は、ペプチド結合を介してＦａｃＶＩＩのＣ-末端にペプチドリンカーが連結されることにより製造された形態であってもよく、この形態は、融合タンパク質の形態を有する。本発明において、前記ＦａｃＶＩＩ誘導体は、特定の方法によって活性化される際に前述のとおり二量体の形態を有する。

【0030】

本発明における用語「ペプチドリンカー」とは、ＦａｃＶＩＩのＣ-末端に連結されるペプチドであって、血中半減期を延長できる担体を連結する機能を持つ。特に、ペプチドリンカーは、Ｃ-末端にシステインを有するペプチドであってもよい。

【0031】

前記ペプチドリンカーの例としては、ＡＴＫＡＶＣ（配列番号３）、ＧＧＧＧＳＣ（配列番号６）、ＳＯＤ１（配列番号７）の１〜１４９位のアミノ酸配列、変異型ＳＯＤ１（配列番号８）の１〜１４９位のアミノ酸配列、ＳＯＤ１（配列番号９）の１〜９０位のアミノ酸配列、変異型ＳＯＤ１（配列番号１０）の１〜９０位のアミノ酸配列、ＳＯＤ１（配列番号１１）の１〜２５位のアミノ酸配列及び変異型ＳＯＤ１（配列番号１２）の１〜２５位のアミノ酸配列を含んでもよいが、特に、これらに限定されるものではない。

【0032】

さらに、前記ＦａｃＶＩＩ誘導体は、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ-末端にＡＴＫＡＶＣ（配列番号３）が連結されることにより製造されたポリペプチド（配列番号１３）、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ-末端にＧＧＧＧＳＣ（配列番号６）が連結されることにより製造されたポリペプチド（配列番号１４）、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ-末端にＳＯＤ１（配列番号７）の１〜１４９位のアミノ酸配列が連結されることにより製造されたポリペプチド（配列番号１５）、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ-末端に変異型ＳＯＤ１（配列番号８）の１〜１４９位のアミノ酸配列が連結されることにより製造されたポリペプチド（配列番号１６）、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ-末端にＳＯＤ１（配列番号９）の１〜９０位のアミノ酸配列が連結されることにより製造されたポリペプチド（配列番号１７）、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ-末端に変異型ＳＯＤ１（配列番号１０）の１〜９０位のアミノ酸配列が連結されることにより製造されたポリペプチド（配列番号１８）、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ-末端にＳＯＤ１（配列番号１１）の１〜２５位のアミノ酸配列が連結されることにより製造されたポリペプチド（配列番号１９）、ＦａｃＶＩＩ誘導体のＣ-末端に変異型ＳＯＤ１（配列番号１２）の１〜２５位のアミノ酸配列が連結されることにより製造されたポリペプチド（配列番号２０）などであってもよいが、特に、これらに限定されるものではない。さらに、本発明のＦａｃＶＩＩ又はその誘導体と関連して、特許文献１の明細書の全体がその参考資料として含まれる。

【0033】

本発明の一実施態様によれば、前述のＦａｃＶＩＩ又はその誘導体を含み、好ましくは、ＦａｃＶＩＩ又はその誘導体の総量に対して活性化されたＦａｃＶＩＩ又はその誘導体を５％未満の量で含む組成物に界面活性剤を適用する場合、前記組成物中に含まれるウイルスを効果的に不活性化することができ、ＦａｃＶＩＩａにおける工程で生産される不純物を防ぎ、及び前記組成物中に含まれるＦａｃＶＩＩａの力価をウイルス不活性化の前とほとんど同程度にすることができる。

【0034】

本発明における用語「ＦａｃＶＩＩ又はその誘導体を含む組成物」とは、界面活性剤を処理する対象となるＦａｃＶＩＩ又はその誘導体を含む物質を意味する。好ましくは、前記組成物は、液状組成物であってもよい。

【0035】

本発明者らは、ＦａｃＶＩＩ活性化の特徴を考察し、ウイルス不活性化組成物に含まれるＦａｃＶＩＩａの力価を低下させることなく、ＦａｃＶＩＩ又はその誘導体を含む溶液中におけるウイルス不活性化工程を開発した。ＦａｃＶＩＩは、軽鎖と重鎖が相互連結された単鎖構造を持つため、重鎖のＮ-末端は露出しておらず、軽鎖のＮ-末端のみが露出している。ＦａｃＶＩＩがＦａｃＶＩＩａに転換されると、重鎖の活性部位が、ＦａｃＶＩＩの１５２位のアルギニンと１５３位のイソロイシン間の開裂によって露出し、ＦａｃＶＩＩの露出した１５３位のイソロイシンは、重鎖のＮ-末端の１位のアミノ酸になる。軽鎖と重鎖のＮ-末端は、ＦａｃＶＩＩａの活性化に重要であるため、ＦａｃＶＩＩａの活性は、軽鎖又は重鎖のＮ-末端が影響を受ける場合、ＦａｃＶＩＩａの活性は、天然型ＦａｃＶＩＩａに比べて低下することがある。さらに、ＦａｃＶＩＩａが強いセリンプロテアーゼ活性を示すため、ＦａｃＶＩＩａの活性に重要な部位がウイルス不活性化工程中に開裂され、自己開裂型のような不純物が簡単に発生しやすい。

【0036】

従って、本発明者らは、活性型ＦａｃＶＩＩａ又はその誘導体が非活性型ＦａｃＶＩＩ又はその誘導体より高い比率で存在する組成物をウイルス不活性化工程に適用せず、代わりに、非活性型ＦａｃＶＩＩ又はその誘導体が活性型ＦａｃＶＩＩａ又はその誘導体より高い比率で存在する組成物を、ウイルス不活性化工程に適用することで、非活性型ウイルス組成物におけるＦａｃＶＩＩａの不純物及びＦａｃＶＩＩａの力価の低下を予防できることを確認した。

【0037】

従って、ＦａｃＶＩＩを含む組成物に界面活性剤を処理し不活性化させる場合、活性化されていないＦａｃＶＩＩ又はその誘導体が、活性化されたＦａｃＶＩＩ又はその誘導体より高い割合、好ましくは、９５％以上の割合で存在する組成物に界面活性剤を処理することが、ウイルス不活性化の後に組成物の力価を維持させる上で利点である。従って、前記ＦａｃＶＩＩａ又はその誘導体は、組成物中に５％未満の割合で存在することが好ましい。

【0038】

さらに、意図的ではない不活性化によるＦａｃＶＩＩのＦａｃＶＩＩａへの転換を防ぐために、前記組成物をｐＨ８．０以下、好ましくはｐＨ５．０〜８．０、より好ましくはｐＨ５．０〜ｐＨ５．５、及び２５℃以下、好ましくは４〜２５℃、より好ましくは４〜１０℃の温度に維持する。

【0039】

さらに、前記組成物は、ＦａｃＶＩＩ又はその誘導体を０．０１〜５．０ｍｇ/ｍＬの濃度で含んでもよく、０．０１〜１．０ｍｇ/ｍＬの濃度であることが好ましい。

【0040】

ＦａｃＶＩＩ又はその誘導体を含む前記組成物は、ＦａｃＶＩＩ又はその誘導体を生産する細胞、例えば、ＦａｃＶＩＩ又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換された形質転換体又は/及びその培養液から培養上清液を取得し、その後、ろ過又は/及びクロマトグラフィー（アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等）のような一つ以上の精製段階を通じて細胞上清液を精製することによって製造することができる。一方、前記細胞は、ＦａｃＶＩＩ又はその誘導体を生産できるものであれば、特に、特別な種類に限定されない。当業界に公知の適切な細胞を用いてもよく、例えば、動物細胞、植物細胞、原核細胞、昆虫細胞などを用いてもよい。動物細胞が好ましく、その例としては、ＣＨＯ細胞などであるが、特に、これらに限定されるものではない。

【0041】

本発明における用語「ウイルス不活性化」とは、ＦａｃＶＩＩ又はその誘導体を含む組成物におけるウイルス感染力、すなわち、感受性細胞との細胞接触によるウイルスの増殖可能性が除去されたり、弱まることを意味する。本発明において、前記ウイルス不活性化は、界面活性剤の処理により効果的に行われる。

【0042】

本発明における用語「界面活性剤」とは、表面活性剤とも言い、一般的に一つの分子中に疎水基及び親水基を有する両親媒性化合物であって、希釈液中で界面に吸着し表面張力を低下させる物質を意味する。前記界面活性剤は、水溶液がイオン化するか否かによってイオン界面活性剤と非イオン界面活性剤に分けられ、イオン界面活性剤は、水溶液中のイオン性によって界面活性剤の主成分として陰イオンを有する陰イオン界面活性剤、界面活性剤の主成分として陽イオンを有する陽イオン界面活性剤、及び界面活性剤の主成分として陰イオンと陽イオンを両方有する双性イオン界面活性剤に分けられる。前記非イオン界面活性剤は、ポリエチレングリコールなどを含み、前記陰イオン界面活性剤は、石鹸、アルキルベンゼンスルホン酸塩などを含み、前記陽イオン界面活性剤は、高級アミンハロゲン化合物、第四級アンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩などを含み、及び前記双性イオン界面活性剤は、アミノ酸などを含む。一般的に、前記界面活性剤は、洗浄力、乳化力、分散力、浸透力及び泡立て力などの機能を有する。このような特性により、洗浄剤、繊維製品処理剤、乳化剤、浮選剤、セメント用発泡剤、潤滑油添加剤、殺菌剤、色素分散剤などとして広く用いられている。本発明の目的と関連して、前記界面活性剤は、ウイルスを除去するための殺虫剤として用いられており、適切な界面活性剤は、トゥイーン、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポロキサマ１８８、トリトンＸ-１００などを含んでもよく、好ましくはトリトンＸ-１００であるが、特に、これらに限定されるものではない。

【0043】

ウイルス不活性化のために、前記界面活性剤を最終組成物の全体積に対して０．０１〜１．００重量％で加え、好ましくは０．０１〜０．５重量％で加えることである。

【0044】

本発明の一実施態様では、代表的なＦａｃＶＩＩ誘導体であるＦａｃＶＩＩのＣ-末端にＡＴＫＡＶＣペプチドが連結されることにより製造されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入されたＣＨＯ細胞で前記ＦａｃＶＩＩ誘導体を生産し、培養上清液は、前記細胞培養液から取得した後精製し、ＦａｃＶＩＩを含む組成物を製造した（実施例１）。さらに、界面活性剤のトリトンＸ-１００を０．２％（ｗ/ｖ）濃度でｐＨ５．５の組成物に加えて４℃で反応させ、ウイルス不活性化を行った（実施例２）。次に、ウイルス不活性化によりＦａｃＶＩＩ誘導体の純度が変化するか否かを検討した。その結果、不活性化する前と不活性化した後において活性型ＦａｃＶＩＩａのバンドは観察されず、特に、不活性化した後にも自己開裂型は観察されなかった（実施例３及び４）。さらに、界面活性剤のトリトンＸ-１００を０．１〜０．５％（ｗ/ｖ）濃度でｐＨ５．５のＦａｃＶＩＩを含む組成物に加えて４℃で反応させ、ウイルス不活性化を行った。その結果、前記の全試料において活性型ＦａｃＶＩＩａ又は自己開裂型のバンドは観察されなかった。さらに、界面活性剤のトリトンＸ-１００を０．１〜０．５％（ｗ/ｖ）の濃度でｐＨ８．０のＦａｃＶＩＩを含む組成物に加えて４℃で反応させ、ウイルス不活性化を行った。その結果、活性型ＦａｃＶＩＩａ又は自己開裂型のバンドは、０．１〜０．２％（ｗ/ｖ）トリトンＸ-１００の低濃度条件では観察されなかったが、０．５％（ｗ/ｖ）トリトンＸ-１００を組成物に加えた場合には、前記活性型ＦａｃＶＩＩａが観察された（実施例５及び６）。

【0045】

前記結果より、ウイルス不活性化の前後における組成物の力価を比較分析すると、ウイルス不活性化の前後において力価がほとんど同様であることを示す。これらの結果より、本発明の方法は、分解又は変形されやすいことが知られているＦａｃＶＩＩ又はその誘導体を含む組成物に適用しても、タンパク質構造にダメージを与えず、力価を低下させることなく、ウイルスを効果的に不活性化させることを示す。

【0046】

以下、本発明を、実施例を参考にしてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、単に目的を例示するためのものであり、本発明がこれらの実施例によって限定されるものではない。

【実施例】

【0047】

実施例１：ＦａｃＶＩＩ誘導体の製造
実施例１−１：ＦａｃＶＩＩ遺伝子を含む発現ベクターの製造
まず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、シグナル配列を含むヒト第ＶＩＩ因子の遺伝子を取得した。第ＶＩＩ因子（ＦａｃＶＩＩ）遺伝子の増幅のために、ヒト胎児肝ｃＤＮＡライブラリー（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ ＵＳＡ）を鋳型として用い、下記配列番号１及び２のフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行った（９５℃で１分間変性；３０サイクル（９５℃で３０秒、６０℃で３０秒及び６８℃で９０秒）；６８℃で５分）。この際、クローニングを容易にするために、ＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を配列番号１のプライマーに挿入し、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位を配列番号２のプライマーに挿入した。引き続き、ＰＣＲにより得られたおよそ１．３ｋｂのＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を調べた。

ＶＩＩ ＢＨＩＳＳ Ｆ：５'-ｃｃｃｇｇａｔｃｃａｔｇｇｔｃｔｃｃｃａｇｇｃｃｃｔｃａｇｇｃｔｃｃ-３'（配列番号１）

ＶＩＩ ＸｈｏＩＡＳ Ｒ：５'-ｇｇｇｃｔｃｇａｇｃｔａｇｇｇａａａｔｇｇｇｇｃｔｃｇｃａｇｇ-３'（配列番号２）

【0048】

ＣＭＶプロモーターの調節の下、得られたＰＣＲ産物を発現させるために、動物細胞の発現ベクターｐＸ０ＧＣにクローニングした。前記ｐＸ０ＧＣベクターは、一つ以上のＣＣＧＣＣＣ反復配列が除去されたＤＨＦＲプロモーターを含み、それに作動可能に連結されたＤＨＦＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターである（特許文献２）。具体的には、前記ＰＣＲ産物は、制限酵素のＢａｎＨＩとＸｈｏＩを用いて３７℃で２時間ダイジェストし、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて開裂したＤＮＡ断片を取得した。前記ＤＮＡ断片を、制限酵素のＢａｎＨＩとＸｈｏＩで処理したｐＸ０ＧＣベクターと混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてクローニングしてＦａｃＶＩＩ遺伝子（ｐＸ０ＧＣ-ＦＶＩＩ）を含む発現ベクターを製造した。

【0049】

実施例１−２： 組み換えＦａｃＶＩＩ誘導体発現ベクターのｐＸ０ＧＣ-ＦＶＩＩ-ＡＴＫＡＶＣの製造
実施例１−１で製造した発現ベクターｐＸ０ＧＣ-ＦＶＩＩに含まれるＦａｃＶＩＩ遺伝子の３-'末端におけるＳＯＤ１配列（ＡＴＫＡＶＣ、配列番号３）の１〜６位の配列をコードするポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドをさらに含む組み換えＦａｃＶＩＩ誘導体の発現ベクターｐＸ０ＧＣ-ＦＶＩＩ-ＡＴＫＡＶＣを製造した。詳しくは、前記発現ベクターｐＸ０ＧＣ-ＦＶＩＩを鋳型として用い、下記配列番号４及び５のフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行った（９５℃で１分間変性；３０サイクル（９５℃で６０秒、６０℃で６０秒及び６８℃で９０秒）；６８℃で５分）。この際、クローニングを容易にするために、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を配列番号４のプライマーに挿入し、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位を配列番号５のプライマーに挿入した。引き続き、ＰＣＲにより得られたおよそ１．４ｋｂのＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を確認した。

ＦＶＩＩ ＥｃｏＲＩＳＳ Ｆ：５'-ｃｃｇｇａａｔｔｃａｔｇｇｃｃａａｃｇｃｇｔｔｃｃｔｇｇａｇｇａｇｃｔｇｃｇｇｃｃｇｇｇｃ-３'（配列番号４）

Ｆ ＶＩＩ ＃１ＸｈｏＩＡＳ Ｒ：５'-ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｃａｇｃａｃａｃｇｇｃｃｔｔｃｇｔｃｇｃｇｇｇａａａｔｇｇｇｇｃｔｃｇｃａｇｇａｇｇａｃｔｃｃｔｇｇｇｃ-３'（配列番号５）

【0050】

ＣＭＶプロモーターの調節の下、得られたＰＣＲ産物を発現させるために、動物細胞の発現ベクターｐＸ０ＧＣにクローニングした。具体的には、前記ＰＣＲ産物は、制限酵素のＥｃｏＲＩとＸｈｏＩを用いて３７℃で２時間ダイジェストし、ＰＣＲ精製キットを用いて開裂したＤＮＡ断片を取得した。前記ＤＮＡ断片を、制限酵素のＢａｎＨＩとＸｈｏＩで処理したｐＸ０ＧＣベクターと混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてクローニングし、ＦａｃＶＩＩ遺伝子の３'-末端に連結されたＳＯＤ１配列の１〜６位の配列ＡＴＫＡＶＣ（配列番号３）をコードするヌクレオチドを含むＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクター（ｐＸ０ＧＣ-ＦＶＩＩ-ＡＴＫＡＶＣ）を製造した。

【0051】

実施例１−３：ＣＨＯ細胞株におけるＦａｃＶＩＩ誘導体（ｐＸ０ＧＣ-ＦＶＩＩ-ＡＴＫＡＶＣ）の発現
実験例２−１で製造した前記発現ベクターｐＸ０ＧＣ-ＦＶＩＩ-ＡＴＫＡＶＣを、ＤＨＦＲの欠損により不完全なＤＮＡ合成を示すＤＧ４４/ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ/ｄｈｆｒ-）（非特許文献１）に導入して形質転換体を取得し、前記形質転換体からＦａｃＶＩＩ-ＡＴＫＡＶＣ誘導体を発現させた。

【0052】

具体的には、前記ＤＧ４４/ＣＨＯ細胞株が８０〜９０％コンフルエンスに達するまで培養し、前記細胞をＯｐｔｉ-ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号５１９８５０３４） で３回洗浄した。

【0053】

一方、３ｍＬのＯｐｔｉ-ＭＥＭと５μｇの発現ベクターｐＸ０ＧＣ-ＦＶＩＩ-ＡＴＫＡＶＣの混合物、及び３ｍＬのＯｐｔｉ-ＭＥＭと２０μＬのリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１８３２４-０１２）の混合物をそれぞれ室温で３０分間静置した。引き続き、前記混合物を混合し、培養したＤＧ４４/ＣＨＯ細胞株に加えた。その後、前記細胞を３７℃、５％ＣＯ₂で約１８時間培養することで、ＤＧ４４/ＣＨＯ細胞株に発現ベクターｐＸ０ＧＣ-ＦＶＩＩ-ＡＴＫＡＶＣを導入した。引き続き、前記培養した細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ-Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１３３０）で３回洗浄した後、前記培地を加え、４８時間培養した。前記培養した細胞をトリプシン処理により分離し、選択培地を含まず（ＨＴサプリメント（ヒポキサンチン-チミジン）１０％ＦＢＳ及び１ｍｇ/ｍＬのＧ４１８（Ｃｅｌｌｇｒｏ、カタログ番号６１-２３４-ＲＧ）を含むＭＥＭ-α培地（ＷＥＬＧＥＮＥ社、カタログ番号ＬＭ００８-０２）に接種した。前記形質転換された細胞が生き残ってコロニーを形成するまで、前記培地を２日又は３日毎に選択培地に交換した。従って、前記形質転換された細胞を前記分離した細胞から選抜した。この際、選抜された形質転換細胞におけるＦａｃＶＩＩ-ＡＴＫＡＶＣ誘導体の発現レベルを増加させるために、１０ｎＭのＭＴＸ（シグマ、カタログ番号Ｍ８４０７）を選択培地に加えてその濃度を徐々に増やし、２〜３週間後にはＭＴＸの含量を３０ｎＭまで増加させた。

【0054】

実施例１−４：ＦａｃＶＩＩ-ＡＴＫＡＶＣの精製
実施例１−３で製造した形質転換体を培養してＦａｃＶＩＩ-ＡＴＫＡＶＣを発現させ、前記培養液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し培養上清液を取得した。

【0055】

前記培養上清液を０．２μｍのマイクロフィルターを用いてろ過し、０．６Ｍの硫酸アンモニウムを加えた。前記結果物をブチルＨＰカラムに供し、０．６〜０Ｍの硫酸アンモニウムを含む濃度勾配緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて溶出し、ＦａｃＶＩＩ-ＡＴＫＡＶＣを含む活性分画を取得した。

【0056】

前記取得した活性分画の緩衝液の条件を１０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に変えた後、ヘパリンＨＰカラムに供した。その後、０〜１．０ＭのＮａＣｌ濃度勾配緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いて溶出し、ＦａｃＶＩＩ-ＡＴＫＡＶＣを含む活性分画を取得した。

【0057】

前記活性分画を濃縮した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムに供した後、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を用いて溶出し、ＦａｃＶＩＩ-ＡＴＫＡＶＣを含む活性分画を取得した。前記取得した活性分画の緩衝液の条件を、２ｍＭのベンズアミジン、２０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液）に変えた後、Ｑ ＦＦカラムに供した。その後、洗浄（２ｍＭのベンズアミジン、０．２ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液）、再平衡化（２ｍＭのベンズアミジン、０．１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液）、及び濃縮勾配溶出（２ｍＭのベンズアミジン、２５ｍＭのＮａＣｌ、３５ｍＭのＣａＣｌ₂、２０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液）し、ＦａｃＶＩＩ-ＡＴＫＡＶＣを精製した。

【0058】

実施例２：ＦａｃＶＩＩ誘導体を含む溶液のウイルス不活性化
実施例１で精製した前記ＦａｃＶＩＩ誘導体を、最終緩衝液（１０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ５．５）、０．０２％プルロニックＦ-６８．５％マンニトール、０．０１％Ｌ-メチオニン、５０ｍＭのＮａＣｌ）に、限外濾過（ペリコンＸＬ、ＰＬＣＧＣ １０ ５０ｃｍ²、ミリポア）及び血液透析濾過により最終濃度が０．４６ｍｇ/ｍＬになるように溶解した。ウイルスの不活性化のために、界面活性剤のトリトンＸ-１００を０．２％（ｗ/ｖ）の濃度でサイズ排除クロマトグラフィーにより純度９７％以上のＦａｃＶＩＩ誘導体を含む溶液に加え、４℃で３０分間ゆっくり攪拌した。

【0059】

実施例３：ウイルスが不活性化されたＦａｃＶＩＩ誘導体における純度分析
実施例２でウイルス不活性化を経たＦａｃＶＩＩ誘導体の純度をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）により分析した（図１）。図１は、ＣＨＯ細胞株を用いて発現させた後精製し、界面活性剤を用いてウイルスを不活性化する前と不活性化した後において純度を分析した結果を表す電気泳動の画像である。図１に示すように、ウイルス不活性化の前後の試料間において分子量と純度の差は見られず、ＦａｃＶＩＩａ誘導体のような活性型又は自己開裂型は観察されなかった。

【0060】

実施例４：ウイルスが不活性化されたＦａｃＶＩＩ誘導体における力価分析
ＦａｃＶＩＩ誘導体の有効濃度５０（ＥＣ₅₀）及びウイルス不活性化ＦａｃＶＩＩ誘導体をＣＯＡＳＥＴ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社、Ｉｔａｌｙ）を用いて測定した。ウイルス不活性化を経ていないＦａｃＶＩＩ誘導体と、ウイルス不活性化を経たＦａｃＶＩＩ誘導体を、キットに含まれるｗｏｒｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いて６０ｎｇ/ｍＬから０．０３ｎｇ/ｍＬまで、２倍連続希釈法により希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬずつ分注した。その後、ＦａｃＸ、ＣａＣｌ₂及びトロンボプラスチンを含む組合せた試薬（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｒｅａｇｅｎｔ）５０μＬを各ウェルに加え、３７℃で７分間反応させた。５０μＬの基質を各ウェルに加えた。最後に、４０５ｎｍの吸光度で測定し、各ＦａｃＶＩＩ誘導体のＥＣ₅₀を比較分析した（図２及び表１）。図２は、ＣＨＯ細胞株を用いて発現させた後精製し、界面活性剤を用いてウイルスを不活性化する前と不活性化した後におけるＦａｃＶＩＩ誘導体の活性を分析した結果を示すグラフであり、丸（○）を示す線は、ウイルス不活性化する前のＦａｃＶＩＩ誘導体の活性を示し、四角（□）を示す線は、ウイルス不活性化した後のＦａｃＶＩＩ誘導体の活性を示す。

【0061】

【表1】

【0062】

図２と表１に示すように、ウイルス不活性化を経ていないＦａｃＶＩＩ誘導体と、ウイルス不活性化を経たＦａｃＶＩＩ誘導体のＥＣ₅₀は、それぞれ０．９６１ｎｇ/ｍＬと１．０２４ｎｇ/ｍＬであり、これは、ウイルス不活性化の後にもＥＣ₅₀値に大きな差はないことを示す。

【0063】

実施例５：ＦａｃＶＩＩを含む溶液のウイルス不活性化
実施例１で説明した方法と同様に、ＦａｃＶＩＩを精製し、最終的に、溶出緩衝液（２ｍＭのベンズアミジン、２５ｍＭのＮａＣｌ、３５ｍＭのＣａＣｌ₂、２０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液）を用いて溶出した。精製したＦａｃＶＩＩは、限外濾過（ペリコンＸＬ、ＰＬＣＧＣ １０ ５０ｃｍ²、ミリポア）及び血液透析濾過を通じて最終緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０））及び５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ５．５）に最終濃度が１．０ｍｇ/ｍＬになるように溶解した。ウイルスの不活性化のために、界面活性剤のトリトンＸ-１００をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより純度９７％以上のＦａｃＶＩＩを含む溶液に０．１〜０．５％（ｗ/ｖ）の濃度で加え、４℃で３０分間ゆっくり攪拌した。その後、前記溶液をサイズ排除クロマトグラフィーにより最終溶液を溶解した。

【0064】

実施例６：ウイルスが不活性化されたＦａｃＶＩＩの純度分析
実施例５でウイルス不活性化を経たＦａｃＶＩＩの純度をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）により分析した（図３）。図３は、ＣＨＯ細胞株を用いて発現させた後精製し、界面活性剤を用いてウイルスを不活性化する前と不活性化した後におけるＦａｃＶＩＩの純度分析の結果を示す電気泳動の画像である。

【0065】

図３に示すように、トリトンＸ-１００を０．１〜０．５％（ｗ/ｖ）の濃度でｐＨ５．５のＦａｃＶＩＩを含む組成物に加えた場合、ウイルス不活性化の前後の試料間において分子量と純度の差は見られず、ＦａｃＶＩＩ誘導体のような活性型又は自己開裂型は観察されなかった。一方、界面活性剤のトリトンＸ-１００を０．１〜０．５％（ｗ/ｖ）の濃度でｐＨ８．０のＦａｃＶＩＩを含む組成物に加えた場合、０．１〜０．２％（ｗ/ｖ）トリトンＸ-１００の低濃度条件では、活性型ＦａｃＶＩＩａ又は自己開裂型のバンドは観察されなかった。しかし、０．５％（ｗ/ｖ）トリトンＸ-１００（高濃度条件）を組成物に加えた場合、活性型ＦａｃＶＩＩａが観察された（点線の四角い部分）。

【0066】

当業界の当業者は、本発明の範囲と思想から離脱することなく、様々な修正又は変更することができる。従って、前記実施例は、全ての面おいて例示的なものであって、限定的ではないものとして理解すべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求範囲の意味及び範囲、及びその等価概念から導出される全ての変更又は修飾されて形態が本発明の範囲に含まれるものとして解釈されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]