特許 6469643 上皮幹細胞の増殖および培養のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6469643

(24)【登録日】2019年1月25日

(45)【発行日】2019年2月13日

(54)【発明の名称】上皮幹細胞の増殖および培養のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/00 20060101AFI20190204BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20190204BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/00ZNA

   C12N5/071

【請求項の数】6

【全頁数】69

(21)【出願番号】特願2016-501170(P2016-501170)

(86)(22)【出願日】2014年3月11日

(65)【公表番号】特表2016-510999(P2016-510999A)

(43)【公表日】2016年4月14日

(86)【国際出願番号】US2014023197

(87)【国際公開番号】WO2014159356

(87)【国際公開日】20141002

【審査請求日】2017年3月10日

(31)【優先権主張番号】61/783,245

(32)【優先日】2013年3月14日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】515251735

【氏名又は名称】ザ ブリガム アンド ウィミンズ ホスピタル，インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】596060697

【氏名又は名称】マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー

(74)【代理人】

【識別番号】100095832

【弁理士】

【氏名又は名称】細田 芳徳

(72)【発明者】

【氏名】カープ，ジェフリー，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】イン，シアオレイ

(72)【発明者】

【氏名】サッチ，マーク デービッド

(72)【発明者】

【氏名】ランガー，ロバート，サミュエル

【審査官】 千葉 直紀

(56)【参考文献】

【文献】 Laryngoscope, 2006, Vol. 116, pp. 292-296

【文献】 PNAS, 2012, Vol. 109, No. 21, pp. 8167-8172

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

上皮組織内でＬＧＲ５陽性上皮幹細胞の増加が必要な被験体において上皮組織内でＬＧＲ５陽性上皮幹細胞を増加する方法における使用のためのＣＨＩＲ９９０２１およびバルプロ酸（ＶＰＡ）の組み合わせ物であって、前記組み合わせ物は、上皮組織内でのＬＧＲ５陽性上皮幹細胞の増加に十分な量のＣＨＩＲ９９０２１およびＶＰＡを含み、前記上皮幹細胞は、被験体の内耳中に存在する、組み合わせ物。

【請求項2】

被験体の内耳のコルチ器官の感覚毛細胞が損傷している、請求項１記載の組み合わせ物。

【請求項3】

前記組み合わせ物の使用により、被験体の内耳幹細胞の増殖が増加する、請求項１または２記載の組み合わせ物。

【請求項4】

被験体がヒトである、請求項１〜３いずれか記載の組み合わせ物。

【請求項5】

前記組み合わせ物が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＶＰＡを被験体に対して同時投与するためのものである、請求項１〜４いずれか記載の組み合わせ物。

【請求項6】

前記組み合わせ物が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＶＰＡを被験体に対して連続投与するためのものである、請求項１〜４いずれか記載の組み合わせ物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願に対する相互参照
本願は、２０１３年３月１４日に出願された米国仮出願番号６１／７８３，２４５の35 U.S.C. §119(e)による利益を主張し、その内容は、その全体における参照によって、本明細書において援用される。

【0002】

政府の支持
本研究は、歯および脳顔面頭蓋研究の国立研究所の助成番号ＤＥ０１３０２３によって支持された。政府は、本発明について一定の権利を有し得る。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
活発に自己更新（self-renew）し、陰窩および絨毛に組織化する上皮細胞の単層は、腸を覆う。腸上皮の更新がこれらの陰窩の基底に存在するＬｇｒ５＋腸幹細胞（ＩＳＣ）によって駆動されることが最近示された（Barker et al., 2007）。Ｌｇｒ５＋幹細胞は、単離され得、インビトロで培養され得、ネイティブの小腸上皮を再現する陰窩−絨毛構造を含む類臓器体（organoid）を形成し得る（Sato et al., 2009）。これらの幹細胞は、複数回の継代の間、類臓器体の形態で増殖（expand）され得るが、現在の培養条件は、自己複製（self-renewal）および分化に対してほとんどまたは全く制御を提供しない。典型的な培養物は、幹細胞および分化した細胞を含む不均一な（heterogeneous）細胞集団からなる（Sato et al., 2009）。特に、Ｌｇｒ５^＋幹細胞のインビトロおよびインビボ両方での自己複製および増殖は、Ｌｇｒ５^＋幹細胞とパーネト細胞として公知の別の陰窩細胞型との間の直接の細胞接触に依存し（Snippert et al., 2010）、この細胞接触によって、培養中のＬｇｒ５^＋幹細胞の運命を制御する能力がかなり複雑になり、制限される。効率的にＬｇｒ５^＋幹細胞を増殖できないことによって、この生物学の治療への移行がかなり制限され、ここで、該治療では、移植の前に、均一な幹細胞培養物および効率的なスケールアップ方法が、必須である。さらに、損傷したレシピエントの臓器にエキソビボ培養した上皮組織を移植するための改善された臨床に適応した（clinically-oriented）系（system）を開発するニーズが存在し続ける。

【発明の概要】

【0004】

発明の要旨
１つの局面において、本発明は、細胞培養溶液を提供する。

【0005】

１つの態様において、本発明は、骨形成因子（Bone Morphogenic Protein）のインヒビター、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３βのインヒビター、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役レセプター５に結合する薬剤、およびヒストンデアセチラーゼインヒビターを含む細胞培養溶液を提供する。１つの態様において、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３βのインヒビターは、ＣＨＩＲ９９０２１であり得、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役レセプター５に結合する薬剤は、Ｒ−スポンジン（spondin）１であり得、ＨＤＡＣインヒビターは、バルプロ酸（Valproic acid）であり得る。

【0006】

別の態様において、本発明は、骨形成因子のインヒビター、少なくとも約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、およびヒストンデアセチラーゼインヒビターを含む細胞培養溶液を提供する。

【0007】

さらに別の態様において、本発明は、骨形成因子のインヒビター、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役レセプター５に結合する薬剤、Ｗｎｔアゴニスト、およびＨＤＡＣ６インヒビターを含む細胞培養溶液を提供する。

【0008】

さらに別の態様において、本発明は、骨形成因子のインヒビター、Ｒ−スポンジン１、塩化リチウム、およびヒストンデアセチラーゼインヒビターを含む細胞培養溶液を提供する。

【0009】

さらに別の態様において、本発明は、Ｐａｎ−ＨＤＡＣインヒビターであるヒストンデアセチラーゼインヒビターを提供する。Ｐａｎ−ＨＤＡＣインヒビターは、バルプロ酸、トリコスタチン（Trichostatin）Ａ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、およびスベロヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）からなる群より選択され得る。

【0010】

さらに別の態様において、本発明は、ＨＤＡＣ６インヒビターであるヒストンデアセチラーゼインヒビターを提供する。ＨＤＡＣ６インヒビターは、ツバシン（Tubacin）、ツバスタチン（Tubastatin）Ａ、およびコンパウンド（Compound）７からなる群より選択され得る。

【0011】

さらに別の態様において、本発明は、ノギン（Noggin）、コーディン（Chordin）、フォリスタチン（Follistatin）、ＤＡＮ、ＤＡＮシステイン−ノットドメイン（knot domain）を含むタンパク質、スクレロスチン（Sclerostin）、ねじれ原腸形成（Twisted Gastrulation）、子宮感受性関連遺伝子（Uterine Sensitivity-associated Gene）−１、結合組織成長因子、インヒビン（Inhibin）、ＢＭＰ−３、およびドルソモルフィン（Dorsomorphin）からなる群より選択され得る骨形成因子のインヒビターを提供する。

【0012】

さらに別の態様において、本発明は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬｉＣｌ、ＢＩＯ−アセトキシム（acetoxime）、ＣＨＩＲ９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、３Ｆ８、ケンパウロン（Kenpaullone）、１−アザケンパウロン、ＴＣ−Ｇ２４、ＴＣＳ２００２、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＴＣＳ２１３１１、ＴＷＳ１１９、ＢＩＯ−アセトキシム、１０Ｚ−ヒメニアルジシン（Hymenialdisine）、ＧＳＫ−３βインヒビターＩＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＸＸＶＩＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＸＸＶＩ、ＦＲＡＴtideペプチド、Ｃｄｋ１／５インヒビター、およびビキニン（Bikinin）からなる群より選択され得るグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３βのインヒビターを提供する。

【0013】

さらに別の態様において、本発明は、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、およびＲ−スポンジン４からなる群より選択され得るロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役レセプター５に結合する薬剤を提供する。

【0014】

さらに別の態様において、本発明は、Ｗｎｔ−１／Ｉｎｔ−１、Ｗｎｔ−２／Ｉｒｐ（Ｉｎｔ−Ｉ関連タンパク質）、Ｗｎｔ−２ｂ／１３、Ｗｎｔ−３／Ｉｎｔ−４、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−５ｂ、Ｗｎｔ−６、Ｗｎｔ−７ａ、Ｗｎｔ−７ｂ、Ｗｎｔ−８ａ／８ｄ、Ｗｎｔ−８ｂ、Ｗｎｔ−９ａ／１４、Ｗｎｔ−９ｂ／１４ｂ／１５、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−１０ｂ／１２、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−１６、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、Ｒ−スポンジン４、ノリン（Norrin）、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬｉＣｌ、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、ＣＨＩＲ９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、３Ｆ８、ケンパウロン、１−アザケンパウロン、ＴＣ−Ｇ２４、ＴＣＳ２００２、ＡＲ−Ａ０１４４１８、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジル−アミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン、ＩＱ１、ＤＣＡ、ＱＳ１１、ＷＡＹ−３１６６０６、（ヘテロ）アリールピリミジン、１０Ｚ−ヒメニアルジシン、ＴＣＳ２１３１１、ＴＷＳ１１９、ＧＳＫ−３インヒビターＩＸ、ＧＳＫ−３インヒビターＩＶ、ＧＳＫ−３βインヒビターＩＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＸＸＶＩＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＸＸＶＩ、ＦＲＡＴtide、Ｃｄｋ１／５インヒビター、ビキニン、および１−アザケンパウロンからなる群より選択され得るＷｎｔアゴニストを提供する。

【0015】

さらに別の態様において、本発明は、ノギン、Ｒ−スポンジン１、ＣＨＩＲ９９０２１、およびＡｔｏｈ１インヒビターを含む細胞培養溶液を提供する。Ａｔｏｈ１インヒビターは、阻害性核酸であり得る。

【0016】

さらに別の態様において、本発明は、上皮増殖因子および／またはノッチ（Notch）アゴニストをさらに含む細胞培養溶液を提供する。ノッチアゴニストは、ノッチ１抗体（Ｎ１ Ａｂ）、デルタ（Delta）１、デルタ様３、デルタ様４、ジャグド（Jagged）１、ジャグド２、ＤＳＬペプチド、およびデルタＤからなる群より選択され得る。

【0017】

さらに別の態様において、本発明は、約５〜約５００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、約５〜約５００ｎｇ／ｍｌのノギン、約５０〜約１０００ｎｇ／ｍｌのＲ−スポンジン、約０．１〜約１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１、および約０．１〜約５ｍＭのバルプロ酸を提供する。

【0018】

さらに別の局面において、本発明は、本発明の細胞培養溶液を含む細胞培養系（system）を提供する。

【0019】

１つの態様において、本発明は、
i)上皮幹細胞または上皮前駆細胞または上皮幹細胞もしくは上皮前駆細胞の集団；
ii)Ｒ−スポンジン１；
iii)ＣＨＩＲ９９０２１；
iv)ヒストンデアセチラーゼインヒビター；および
v)任意に、骨形成因子のインヒビター
を含む、細胞培養系を提供する。

【0020】

別の態様において、本発明は、
i)上皮幹細胞または上皮前駆細胞または上皮幹細胞もしくは上皮前駆細胞の集団；
ii)Ｒ−スポンジン１；
iii)ＣＨＩＲ９９０２１；
iv)Ａｔｏｈ１インヒビター；および
v)任意に、骨形成因子のインヒビター
を含む、細胞培養系を提供する。

【0021】

さらに別の態様において、本発明は、
i)上皮幹細胞または上皮前駆細胞または上皮幹細胞もしくは上皮前駆細胞の集団；
ii)Ｒ−スポンジン１；
iii)塩化リチウム；
iv)ヒストンデアセチラーゼインヒビター；および
v)任意に、骨形成因子のインヒビター
を含む、細胞培養系を提供する。

【0022】

さらに別の態様において、本発明は、
i)上皮幹細胞または上皮前駆細胞または上皮幹細胞もしくは上皮前駆細胞の集団；
ii)Ｒ−スポンジン１；
iii)Ｗｎｔアゴニスト；
iv)ＨＤＡＣ６インヒビター；および
v)任意に、骨形成因子のインヒビター
を含む、細胞培養系を提供する。

【0023】

さらに別の態様において、本発明の細胞培養系は、ＬＧＲ５陽性幹細胞を含み得る上皮幹細胞および上皮幹細胞の集団を含む。

【0024】

さらに別の態様において、本発明の細胞培養系中の上皮幹細胞または上皮前駆細胞の集団は、該系中に少なくとも３０％、８５％、９０％、９５％または９９％の該細胞を含む。

【0025】

さらに別の態様において、本発明は、
i)腫瘍類臓器体；
ii)ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役レセプター５に結合する薬剤；
iii)Ｗｎｔアゴニスト；
iv)ヒストンデアセチラーゼインヒビターまたはＡｔｏｈ１インヒビター；および
v)任意に、骨形成因子のインヒビター
を含む、細胞培養系を提供する。

【0026】

さらに別の態様において、本発明は、粘膜下組織基底、コラーゲンを含む被覆層、ならびに上皮幹細胞、上皮幹細胞を含む単離された組織、および／または上皮類臓器体からなる群のいずれかの構成メンバーを含む細胞層を含む細胞培養系を提供する。コラーゲンを含む被覆は、上皮幹細胞、上皮幹細胞を含む単離された組織、または上皮類臓器体の上にまたはその周囲に存在し得る。コラーゲンを含む被覆はまた、ＳＩＳ基底と上皮幹細胞、上皮幹細胞を含む単離された組織または上皮類臓器体との間に存在し得る。粘膜下組織基底は、ＳＩＳを含み得、上皮増殖因子、骨形成因子、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役レセプター５に結合する薬剤、Ｗｎｔアゴニスト、Ｙ−２７６３２、およびヒストンデアセチラーゼインヒビターをさらに含み得る。この細胞培養系は、骨形成因子のインヒビター、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役レセプター５に結合する薬剤、Ｗｎｔアゴニスト、Ｙ−２７６３、およびヒストンデアセチラーゼインヒビターを含む溶液を含む本発明の細胞培養溶液をさらに含み得る。

【0027】

さらに別の態様において、本発明は、粘膜下組織基底、および上皮幹細胞、上皮幹細胞を含む単離された組織、または上皮類臓器体を含む細胞培養系を提供し、ここで、該粘膜下組織基底は、上皮増殖因子、骨形成因子、Ｒ−スポンジン１、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｙ−２７６３２、およびヒストンデアセチラーゼインヒビターを含む。この細胞培養系は、上皮増殖因子、骨形成因子のインヒビター、Ｒ−スポンジン１、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｙ−２７６３２、およびヒストンデアセチラーゼインヒビターを含む溶液をさらに含み得る。

【0028】

さらに別の局面において、本発明は、単離された上皮幹細胞から上皮類臓器体を形成する方法を提供する。

【0029】

１つの態様において、本発明は、単離された上皮幹細胞から高い効率で上皮類臓器体を形成する方法を提供し、該方法は：
i)ノギン、Ｒ−スポンジン１、ＣＨＩＲ９９０２１、およびヒストンデアセチラーゼインヒビターの存在下で、単離された上皮幹細胞をインキュベートする工程；ならびに
ii)該単離された上皮幹細胞から上皮類臓器体を形成する工程、ここで、該単離された上皮幹細胞の少なくとも約２５％、４０％、５０％、７５％、９０％が、上皮類臓器体を形成する、
を含む。

【0030】

別の態様において、本発明は、単一の単離された上皮幹細胞から高い効率で上皮類臓器体を形成する方法を提供し、該方法は：
i)ノギン、Ｒ−スポンジン１、ＣＨＩＲ９９０２１、およびヒストンデアセチラーゼインヒビターの存在下で、該単一の単離された上皮幹細胞をインキュベートする工程；ならびに
ii)該単離された上皮幹細胞から上皮類臓器体を形成する工程、ここで、該単一の単離された上皮幹細胞の少なくとも約６％が、上皮類臓器体を形成する、
を含む。

【0031】

さらに別の局面において、本発明は、腫瘍類臓器体に関して化学療法剤の効能を決定する方法を提供し、該方法は：
i)骨形成因子のインヒビター、Ｒ−スポンジン１、Ｗｎｔアゴニスト、ヒストンデアセチラーゼインヒビター、および化学療法剤の存在下で、腫瘍類臓器体をインキュベートする工程；ならびに
ii)細胞生存能力の阻害、細胞増殖の阻害、腫瘍関連遺伝子発現の阻害、アポトーシスの活性化、および細胞生存の阻害からなる群より選択されるパラメータを測定する工程
を含み、該パラメータにおける増加の検出は、腫瘍類臓器体に関する化学療法剤の効能を示す。

【0032】

さらに別の局面において、本発明は、細胞培養系中でパーネト細胞を形成する方法を提供し、該方法は、少なくとも１つのＷｎｔアゴニストおよびノッチの少なくとも１つのインヒビターの存在下で上皮幹細胞をインキュベートする工程を含み、各々は、パーネト細胞を生じるのに十分な量である。

【0033】

１つの態様において、上皮幹細胞は、骨形成因子の少なくとも１つのインヒビターの存在下でさらにインキュベートされ得る。

【0034】

別の態様において、ノッチのインヒビターは、ＤＡＰＴである。

【0035】

さらに別の態様において、上皮幹細胞は、ＬＧＲ５陽性幹細胞である。

【0036】

さらに別の局面において、本発明は、細胞培養系中で腸細胞を形成する方法を提供し、該方法は、少なくとも１つのＷｎｔインヒビターおよび少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼインヒビターの存在下で上皮幹細胞をインキュベートする工程を含み、各々は、細胞培養系中で腸細胞を生じるのに十分な量である。上皮幹細胞は、上皮増殖因子および／または骨形成因子のインヒビターの存在下でさらにインキュベートされ得る。

【0037】

１つの態様において、Ｗｎｔインヒビターは、ＩＷＰ−２、ＸＡＶ−９３９、ＩＣＧ−００１、ＬＧＫ−９７４、ＩＷＲ−１−エンド（endo）、ＫＹ０２１１１、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＤＫＫ−１、ＦＨ−５３５、Ｂｏｘ５、ペプチドＰｅｎ−Ｎ３、抗ＳＦＲＰ抗体、および抗ＬＲＰ６抗体からなる群より選択され得る。

【0038】

さらに別の局面において、本発明は、細胞培養系中で杯細胞を形成する方法を提供し、該方法は、少なくとも１つのＷｎｔインヒビターおよび少なくとも１つのノッチインヒビターの存在下で上皮幹細胞をインキュベートする工程を含み、各々は、細胞培養系中で杯細胞を生じるのに十分な量である。上皮幹細胞は、上皮増殖因子の存在下でさらにインキュベートされ得る。

【0039】

１つの態様において、ノッチインヒビターは、ＤＡＰＴ、ＲＯ４９２９０９７、ＬＹ４５０１３９、ＬＹ９００００９、ＬＹ３０３９４７８、ＬＹ４１１５７５、ＹＯ−０１０２７、ＢＭＳ−７０８１６３、ＢＭＳ−９０６０２４、コンパウンドＥ、ＢＭＳ−２９９８９７、ＳＡＨＭ１、Ａβ４２−セレクティブ（Selective）、およびＳＢ２２５００２からなる群より選択され得る。

【0040】

さらに別の局面において、本発明は、培養系中で腸内分泌細胞を形成する方法を提供し、該方法は、ノッチの少なくとも１つのインヒビターおよびレセプターチロシンキナーゼ、マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼまたは細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）の少なくとも１つを阻害する薬剤の存在下で上皮幹細胞をインキュベートする工程を含み、各々は、細胞培養系中で腸内分泌細胞を生じるのに十分な量である。上皮幹細胞は、上皮増殖因子、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役レセプター５に結合する薬剤および／または骨形成因子のインヒビターの存在下でさらにインキュベートされ得る。ＭＡＰキナーゼは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）であり得る。

【0041】

１つの態様において、ＭＡＰキナーゼを阻害する薬剤は、ＡＳ−７０３０２６、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ９８０５９、セルメチニブ（Selumetinib）、ＳＬ−３２７、Ｕ０１２６、ＴＡＫ−７３３およびトラメチニブ（Trametinib）からなる群より選択され得る。

【0042】

別の態様において、ＲＴＫを阻害する薬剤は、ゲフィチニブ（Gefitinib）、ＡＧ９９、エルロチニブ（Erlotinib）、アファチニブ（Afatinib）、ラパチニブ（Lapatinib）、ＷＺ４００２およびＡＧ−１８からなる群より選択され得る。

【0043】

さらに別の態様において、ＥＲＫを阻害する薬剤は、ＡＳ−７０３０２６またはＰＤ０３２５９０１であり得る。

【0044】

さらに別の局面において、本発明は、腸上皮細胞の形成を必要とする被験体において腸上皮細胞を形成する方法を提供し、該方法は、該被験体に、Ｗｎｔアゴニストおよびヒストンデアセチラーゼインヒビターを該被験体において腸上皮細胞を形成するのに十分な量で投与する工程を含む。Ｗｎｔアゴニストは、ＣＨＩＲ９９０２１であり得、ヒストンデアセチラーゼインヒビターは、バルプロ酸であり得る。ＣＨＩＲ９９０２１は、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与され得、バルプロ酸は、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与され得る。

【0045】

さらに別の局面において、本発明は、腸上皮細胞の形成を必要とする被験体において腸上皮細胞を形成する方法を提供し、該方法は、該被験体に、Ｗｎｔアゴニストおよびノッチアゴニストを該被験体において腸上皮細胞を形成するのに十分な量で投与する工程を含む。

【0046】

さらに別の局面において、本発明は、腸障害を治療する方法を提供し、該方法は、該被験体に、Ｗｎｔアゴニストおよびヒストンデアセチラーゼインヒビター、またはＷｎｔアゴニストおよびノッチアゴニストを投与する工程を含む。いくつかの態様において、腸障害は、腸炎（enterocolitis）；非特異的腸炎（enteritis）または特異的ウイルス性腸炎などのウイルス感染；憩室炎；サルモネラ症、細菌性赤痢、カンピロバクター腸炎またはエルシニア腸炎等の細菌性腸炎；アメーバ症等の原生動物感染；寄生虫感染；ならびに嚢胞性線維症および慢性閉塞性肺疾患における偽膜性腸炎および肺の合併症；虫垂炎；萎縮性胃炎；バレット食道；肺炎；子宮頸管炎；慢性間質性腎炎；結腸炎；大腸憩室炎；結膜炎；接触皮膚炎；カーリング潰瘍；クッシング潰瘍；膀胱炎；壊疽；歯肉炎；乳腺炎；食道炎；膵炎；皮下脂肪組織炎；フレグモーネ性胃炎；糸球体腎炎；ならびに非限定的に、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、アディソン病および糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）を含む自己免疫疾患からなる群より選択される。

【0047】

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。

【図面の簡単な説明】

【0048】

以下の詳細な説明は、実例として示されるが、本発明を、記載される特定の態様に限定することを意図するものではなく、参照によって本明細書に援用される添付の図面と共に理解され得る。

【図1】図１は、インビボでのＬｇｒ５−ＧＦＰの散在した発現を示す。小腸を、Ｌｇｒ５−ＧＦＰマウスから採取し、蛍光顕微鏡下で直接画像化した。小腸の全ての領域が陰窩で覆われているが、これらの陰窩のほぼ半分が、ＧＦＰ＋細胞を含んだ。スケールバー：１００μｍ。

【図2A-B】図２Ａ〜２Ｈは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせがＬｇｒ５＋幹細胞の増殖および自己複製を促進することを示す。図２Ａは、ＥＮＲ（ＥＧＦ、ノギンおよびＲ−スポンジン１）、ＥＮＲ＋ＶＰＡ（ＥＮＲ−Ｖ）、ＥＮＲ＋ＣＨＩＲ（ＥＮＲ−Ｃ）およびＥＮＲ＋ＶＰＡ＋ＣＨＩＲ（ＥＮＲ−ＣＶ）の存在下で６日間培養した小腸陰窩のＧＦＰ画像および明視野画像を示す。アポトーシス性細胞は、自己蛍光により管腔中で可視であり（赤矢印）、白矢印は、陰窩の基底での特定のＬｇｒ５−ＧＦＰを示す。スケールバー：１００μｍ。図２Ｂは、複数の条件で培養した陰窩の細胞増殖およびＧＦＰ発現の定量化を示す。陰窩を、２４ウェルプレートで６日間培養し、アキュターゼ（Accutase）を使用して単一の細胞に分離した。各ウェルの生存細胞数を、細胞増殖の指標として計数した。Ｌｇｒ５−ＧＦＰ発現を、フローサイトメトリー分析によって測定した。エラーバーは、３つの（triplicate）ウェルのＳ．Ｄ．を示す。実験を３回行い、類似の結果を示した。（他に示さない限り、全てのパネルにおいて：^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５；ＮＳ Ｐ＞０．０５。）

【図2C-D】図２Ａ〜２Ｈは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせがＬｇｒ５＋幹細胞の増殖および自己複製を促進することを示す。図２Ｃおよび２Ｄは、示されるとおりの複数の条件下での７日の培養の後の単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ細胞のＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析を示す。エラーバーは３つのウェルのＳ．Ｄ．を示す。（他に示さない限り、全てのパネルにおいて：^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５；ＮＳ Ｐ＞０．０５。）

【図2E】図２Ａ〜２Ｈは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせがＬｇｒ５＋幹細胞の増殖および自己複製を促進することを示す。図２Ｅは、９日の培養後の単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ細胞のＧＦＰ画像および明視野画像を示す。スケールバー：１００μｍ。（他に示さない限り、全てのパネルにおいて：^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５；ＮＳ Ｐ＞０．０５。）

【図2F-H】図２Ａ〜２Ｈは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせがＬｇｒ５＋幹細胞の増殖および自己複製を促進することを示す。図２Ｆは、複数の条件下で７日間培養したＦＡＣＳ単離された４０００個の単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ細胞の代表的な画像を示し、図２Ｇは、コロニー数の定量化を示す。エラーバーは３つのウェルのＳ．Ｄ．を示す。図２Ｈは、正常な核型を有し、ＣＶ条件で８０日間培養した細胞の中期伸展（spread）を示す（２ｎ＝４０）。（他に示さない限り、全てのパネルにおいて：^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５；ＮＳ Ｐ＞０．０５。）

【図3A-B】図３Ａ〜３Ｇは、培養条件の関数としての細胞増殖およびＧＦＰ発現を示す。図３Ａおよび３Ｂは、それぞれ、各時点に数えられた３つのウェル由来のコロニー数および単一の生存細胞の数を示す。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。図３Ａにおいて、系列は、左から右に、第０日、第２日、第４日、第６日、第８日、および第１０日である。

【図3C-D】図３Ａ〜３Ｇは、培養条件の関数としての細胞増殖およびＧＦＰ発現を示す。図３Ｃは、新しく単離された単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ＋細胞のＦＡＣＳソーティング（sorting）を示す。ＧＦＰ^高単一細胞集団を回収した、ＧＦＰ＋細胞集団を画定するための代表的なＦＡＣＳ分析およびゲーティング戦略を示す。陰窩から新たに単離された単一の細胞は、２つの区別されるＧＦＰ^高およびＧＦＰ^低集団を示し、一方、培養した細胞は、区別されるＧＦＰ^高およびＧＦＰ^低集団を示さないので、全てのＧＦＰ＋細胞を、分析のためにゲーティングした。ＥＮＲ−ＣＶ培養細胞は、ＧＦＰが高度に陽性である単一のＧＦＰ＋集団を示したことに留意のこと。ＧＦＰ−集団は、Ｌｇｒ５−細胞およびＬｇｒ５＋／ＧＦＰ−細胞を示し（即ち、ＧＦＰ鎮静化幹細胞）、これは、全てのソーティングされていない陰窩培養物中に存在するが、ソーティングされた単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ細胞培養物には存在しない（図２Ｃ参照）。合計１００００の生存細胞を、各試料について分析した。図３Ｄは、ＣＶ培養条件でのＬｇｒ５＋幹細胞の自己複製には増殖因子が必要であることを示す。陰窩を、示されるとおり、ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１およびこれらの組み合わせと共にＣＨＩＲおよびＶＰＡの存在下で６日間培養した。Ｅ：ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）；Ｎ：ノギン（１００ｎｇ／ｍｌ）；Ｒ：Ｒ−スポンジン１（５００ｎｇ／ｍｌ）；Ｃ：ＣＨＩＲ（３μＭ）；Ｖ：ＶＰＡ（１ｍＭ）。

【図3E-G】図３Ａ〜３Ｇは、培養条件の関数としての細胞増殖およびＧＦＰ発現を示す。図３Ｅは、示されるとおりの複数の条件で６日間培養した陰窩を示す。ＧＦＰ画像および明視野画像を示す。スケールバー：２００μｍ。図３Ｆは、ＥＮＲ、ＥＮＲ−ＣおよびＥＮＲ−ＣＶ条件で培養した結腸陰窩の形態およびＬｇｒ５−ＧＦＰ発現を示す。図３Ｇは、ＥＧＦ、ノギン、および複数の濃度でのＲ−スポンジン１またはＲ−スポンジン２の存在下での第５日に形成された孤立した類臓器体の数を示す。全てのスケールバー：２００μｍ。

【図4】図４Ａ〜４Ｂは、ＥＰＨＢ２＋ヒト結腸幹細胞に対する複数の培養条件の試験を示す。陰窩を、示されるとおりの複数の条件で６日間培養した。ＧＦＰ画像および明視野画像を図４Ａに示す。Ｗ：Ｗｎｔ３ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）；Ｎｉ：ニコチンアミド（１０ｍＭ）；Ｐ：ＰＧＥ２（０．０２μＭ）；Ａ：Ａ−８３−０１（０．５μＭ）；Ｓ：ＳＢ２０２１９０（１０μＭ）；Ｖ：バルプロ酸またはＶＰＡ（１ｍＭ）。ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｗｎｔ３ａおよびＶＰＡ、またはＥＮＲ−Ｗ−Ｖ条件は、ＧＦＰの発現の増加を示すための対照として役に立つ。スケールバー：２００μｍ。図４Ｂは、複数の条件下で培養した陰窩の細胞増殖およびＧＦＰ発現の定量化を示す。陰窩を、２４ウェルプレートで６日間培養し、単一の細胞に分離した。各ウェルの生存細胞数を計数し、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーにより分析した。エラーバーは３つのウェルのＳ．Ｄ．を示す。

【図5】図５Ａ〜５Ｄは、単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ幹細胞の培養を示す。図５Ａは、ＣＶ条件で９日間培養した単一の単離されたＬｇｒ５−ＧＦＰ＋細胞を示す。スケールバー：２００μｍ。図５Ｂは、示されたとおりの条件下でマトリゲル（Matrigel）中で培養したＦＡＣＳソーティングされた１５００個の単一のＬｇｒ５＋細胞を示す。第７日の培養からの代表的な画像を示す。図５Ｃは、コロニー数の定量化を示す。エラーバーは３つのウェルの（or）Ｓ．Ｄ．を示す。図５Ｄは、４８ウェルプレートに播種したソーティングされた単一のＬｇｒ５＋幹細胞を示す。プレーティング（plating）の１２時間後に、生存能力のある細胞数を定量した。コロニー数を第７日に計数し、コロニー形成効率を定量した。１００ｎｇ／ｍｌでＶ：ＶＰＡ；Ｃ：ＣＨＩＲ；Ｗ：Ｗｎｔ３ａ。エラーバーは３つのウェルのＳ．Ｄ．を示す。実験を３×行い、類似の結果を示した。

【図6A】図６Ａ〜６Ｄは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせによるＬｇｒ５＋幹細胞の自己複製の維持を示す。ＥＮＲ条件下で培養した類臓器体（上のパネル）およびＥＮＲ−ＣＶ条件で培養したコロニー（下のパネル）のリゾチーム（図６Ａ）、Ｋｉ６７（図６Ｂ）およびＥｄＵ（図６Ｃ）染色の共焦点画像を示す。ＥｄＵ染色について、細胞を、チミジンアナログＥｄＵ（赤）と共に１時間培養した。スケールバー：５０μｍ。

【図6B】図６Ａ〜６Ｄは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせによるＬｇｒ５＋幹細胞の自己複製の維持を示す。ＥＮＲ条件下で培養した類臓器体（上のパネル）およびＥＮＲ−ＣＶ条件で培養したコロニー（下のパネル）のリゾチーム（図６Ａ）、Ｋｉ６７（図６Ｂ）およびＥｄＵ（図６Ｃ）染色の共焦点画像を示す。ＥｄＵ染色について、細胞を、チミジンアナログＥｄＵ（赤）と共に１時間培養した。図６Ｂおよび６Ｃにおいて、陰窩ドメインのみが、ＥＮＲ条件でＫｉ６７陽性細胞または組み込まれたＥｄＵを含み（上のパネル）、一方、Ｋｉ６７またはＥｄＵは、ＣＶ条件で細胞凝集体のいたるところに存在する（下のパネル）。スケールバー：５０μｍ。

【図6C-D】図６Ａ〜６Ｄは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせによるＬｇｒ５＋幹細胞の自己複製の維持を示す。ＥＮＲ条件下で培養した類臓器体（上のパネル）およびＥＮＲ−ＣＶ条件で培養したコロニー（下のパネル）のリゾチーム（図６Ａ）、Ｋｉ６７（図６Ｂ）およびＥｄＵ（図６Ｃ）染色の共焦点画像を示す。ＥｄＵ染色について、細胞を、チミジンアナログＥｄＵ（赤）と共に１時間培養した。図６Ｂおよび６Ｃにおいて、陰窩ドメインのみが、ＥＮＲ条件でＫｉ６７陽性細胞または組み込まれたＥｄＵを含み（上のパネル）、一方、Ｋｉ６７またはＥｄＵは、ＣＶ条件で細胞凝集体のいたるところに存在する（下のパネル）。図６Ｄは、示されたとおりの条件下で６日間培養した成熟腸上皮細胞についてのマーカーの相対的ｍＲＮＡ発現の定量的リアルタイムＰＣＲ分析を示す（腸細胞について腸アルカリ性フォスファターゼ［Ａｌｐｉ］、杯細胞についてムチン２［Ｍｕｃ２］、腸内分泌細胞についてクロモグラニンＡ［ＣｈｇＡ］、パーネト細胞についてリゾチーム［Ｌｙｚ］、小腸幹細胞についてＬｇｒ５）。ＥＮＲ−ＣＶ（Ｄ４０）は、ＣＶ条件で４０日間培養した細胞を示す。スケールバー：５０μｍ。図６Ｄにおいて、系列は、左から右に、Ａｌｐｉ、Ｍｕｃ２、ＣｈｇＡ、Ｌｙｚ、およびＬｇｒ５である。

【図7A】図７Ａ〜７Ｄは、ＣＶ条件下で培養した腸幹細胞の分化を示す。図７Ａは、ＣＶ条件からＥＮＲ条件に移し、かつ４日間培養した細胞の分化マーカー（腸細胞についてＡｌｐ、杯細胞（白矢印）および杯細胞により分泌されるムチンについてＭｕｃ２、腸内分泌細胞についてＣｈｇＡ、ならびにパーネト細胞についてＬｙｚ）の染色を示す。ＤＡＰＩを、核の染色のために使用し、ＧＦＰは幹細胞の存在を示す。スケールバー：５０μｍ。

【図7B】図７Ａ〜７Ｄは、ＣＶ条件下で培養した腸幹細胞の分化を示す。図７Ｂは、複数の条件下で培養した細胞由来の成熟腸上皮マーカーの相対的ｍＲＮＡ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。細胞を、最初に、ＣＶ条件で６日間、単一の細胞から培養した。次いで、細胞コロニーを、採取し、洗浄し、２４ウェルプレートのいくつかのウェルに再度プレーティングし、示されたとおりの複数の条件下でマトリゲル中で４日間培養した。ＥＮＲを、全ての条件において添加し、ＥＮＲのみと培養した細胞を、対照として使用した。Ｉ：ＩＷＰ−２（２μＭ）、Ｄ：ＤＡＰＴ（１０μＭ）、Ｃ：ＣＨＩＲ（３μＭ）、Ｖ：ＶＰＡ（１ｍＭ）。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。

【図7C】図７Ａ〜７Ｄは、ＣＶ条件下で培養した腸幹細胞の分化を示す。図７Ｃは、複数の条件下で培養した細胞のＡｌｐ染色を示す。ＩＤおよびＣＤ条件で明らかな細胞の形態の変化があり、これは、杯細胞およびパーネト細胞と類似する。スケールバー：５０μｍ。

【図7D】図７Ａ〜７Ｄは、ＣＶ条件下で培養した腸幹細胞の分化を示す。図７Ｄは、分化マーカーの免疫細胞化学的染色を示す。ＣＤおよびＩＤ条件下で培養した細胞を、ムチン２（Ｍｕｃ２）、クロモグラニンＡ（ＣｈｇＡ）、およびリゾチーム（Ｌｙｚ）染色について使用した。３次元再構築共焦点画像を示す。スケールバー：５０μｍ。

【図8A-B】図８Ａ〜８Ｆは、インビトロでのＬｇｒ５＋幹細胞の制御された分化を示す。図８Ａは、ＥＮＲ条件で培養した類臓器体の染色を示す。左のパネルは、腸細胞のＡｌｐ染色を示す。染色の前に、類臓器体を、解剖顕微鏡下で鋭利な刃を使用することによって切り開き、管腔の内容物を除去した。中央のパネルは、杯細胞（矢印）および杯細胞によって分泌されたムチンのＭｕｃ２染色を示し、右のパネルは、腸内分泌細胞のＣｈｇＡ染色を示す。ＧＦＰ＋細胞は、Ｌｇｒ５＋幹細胞を示す。図８Ｂは、分化プロトコルのスキームを提供する。単一のＬｇｒ５＋幹細胞を、ＣＶ条件で４〜６日間培養し、コロニーを形成させた。次いで、細胞コロニーを、採取し、洗浄し、新しいマトリゲルに植え込み、複数の条件下で培養した。全スケールバー：５０μｍ。

【図8C-D】図８Ａ〜８Ｆは、インビトロでのＬｇｒ５＋幹細胞の制御された分化を示す。図８Ｃは、ＣＶ条件からＥＮＲ条件に移し、かつ４日間培養した細胞コロニーの形態を示す（上のパネル）。ＣＶ条件で継続的に培養したコロニーを、対照として示す（下のパネル）。図８Ｄは、各条件について、低倍率画像および高倍率画像で分化した細胞の形態を示す。ＣＤおよびＩＤ条件でほとんどの細胞の形態が明らかに変化し、これは、それぞれ、パーネト細胞および杯細胞の形成を表すことに留意のこと。全スケールバー：５０μｍ。

【図8E-F】図８Ａ〜８Ｆは、インビトロでのＬｇｒ５＋幹細胞の制御された分化を示す。図８Ｅは、ＩＶ条件で培養したコロニーの Ａｌｐ染色を示す。Ａｌｐの先端（左のパネル）および均質な（右のパネル）染色を示す。図８Ｆは、ＩＤおよびＣＤ条件で培養したコロニーのＭｕｃ２染色を示す。全スケールバー：５０μｍ。

【図9A-B】図９Ａ〜９Ｆは、ＣＨＩＲおよびＶＰＡについての作用の機構を示す。図９Ａは、６日間複数の条件で培養した陰窩の形態およびＬｇｒ５−ＧＦＰ発現を示す。Ｃ：ＣＨＩＲ（３μＭ）；Ｌｉ：ＬｉＣｌ（５ｍＭ）；Ｗ：Ｗｎｔ３ａ（１００ｎＭ）。図９Ｂは、６日の陰窩培養についての細胞数およびＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示す。データは、３つの独立した実験を代表する。（他に示さない限り、全てのパネルにおいて：エラーバーは３つのウェルの（or）Ｓ．Ｄ．を示す。^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５；ＮＳ Ｐ＞０．０５。）

【図9C】図９Ａ〜９Ｆは、ＣＨＩＲおよびＶＰＡについての作用の機構を示す。図９Ｃは、ＥＮＲ−Ｃ（対照）条件またはＨＤＡＣインヒビターを伴うＥＮＲ−Ｃ条件での陰窩の６日培養を示す。

【図9D】図９Ａ〜９Ｆは、ＣＨＩＲおよびＶＰＡについての作用の機構を示す。図９Ｄは、図９Ｃの細胞のＧＦＰパーセンテージ、全生存細胞数および相対ＧＦＰ強度の定量化を示す。

【図9E-F】図９Ａ〜９Ｆは、ＣＨＩＲおよびＶＰＡについての作用の機構を示す。図９Ｅは、複数の濃度のＶＰＡおよびＴＳＡの細胞増殖およびＧＦＰ発現に対する効果を示す。図９Ｆは、ニコチンアミド（Ｎｉ）のＷｎｔ３ａ（Ｗ、１００ｎｇ／ｍｌ）またはＣＨＩＲ（Ｃ、３μＭ）と組み合わせた効果を示す。複数の条件で６日間培養した陰窩の細胞数およびＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示す。（他に示さない限り、全てのパネルにおいて：エラーバーは３つのウェルの（or）Ｓ．Ｄ．を示す。^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５；ＮＳ Ｐ＞０．０５。）

【図10】図１０は、複数の条件で培養した単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ細胞の形態およびＧＦＰ発現を示す。スケールバー：１００μｍ。

【図11A】図１１Ａ〜１１Ｄは、ＶＰＡの機構を示す。図１１Ａは、ノッチ阻害後にＶＰＡがＧＦＰ発現を救出する（rescue）ことを示す。陰窩を、３日間、ＤＡＰＴ（Ｄ、５μＭ）ありまたはなしで、かつＶＰＡの濃度を変動させて（Ｖ、０．２５〜４ｍＭ）、ＥＮＲ−Ｃ条件で培養した。スケールバー：２００μｍ。

【図11B-D】図１１Ａ〜１１Ｄは、ＶＰＡの機構を示す。図１１Ｂおよび１１Ｃは、ＥＮＲ（図１１Ｂ）またはＥＮＲ＋ＣＨＩＲ（図１１Ｃ）条件で４日間培養し、その後、種々の濃度のＶＰＡを添加し、さらに２４時間培養した陰窩を示す。ノッチ１、Ｈｅｓ１およびＡｔｏｈ１の発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで分析した。図１１Ｄは、６日の培養後の陰窩中のノッチ１、Ｈｅｓ１およびＡｔｏｈ１の発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲでの分析を示す。図１１Ｂ〜１１Ｃにおいて、系列は、左から右に、０、０．５、１、２、および３である。図１１Ｄにおいて、系列は、左から右に、ＥＮＲ、ＥＮＲ−Ｖ、ＥＮＲ−Ｃ、およびＥＮＲ−ＣＶである。

【図12】図１２Ａ〜１２Ｂは、（図１２Ａ）生理学的条件下および（図１２Ｂ）インビトロ培養での腸幹細胞の自己複製および分化についてのモデルを示す。

【図13】図１３Ａ〜１３Ｂは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせが、マウスの内耳に由来するＬｇｒ５＋幹／前駆細胞の増殖およびＧＦＰ発現を促進することを示す。図１３Ａは、出生後第２日のＬｇｒ５−ＧＦＰマウスに由来する単離された蝸牛感覚上皮の明視野画像およびＧＦＰ画像を示す。図１３Ｂは、単一の細胞に分離し、１１日間複数の条件で培養した単離された蝸牛感覚上皮を示す。Ｅ：ＥＧＦ；Ｎ；ノギン；Ｒ：Ｒ−スポンジン１；Ｃ：ＣＨＩＲ９９０２１、Ｖ：ＶＰＡ。スケールバー：１００μｍ。

【図14A】図１４Ａ〜１４Ｆは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせが、マウスの内耳に由来するＬｇｒ５＋幹／前駆細胞の増殖およびＧＦＰ発現を促進することを示す。図１４Ａは、内耳上皮細胞のＧＦＰ発現を示す。

【図14B】図１４Ａ〜１４Ｆは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせが、マウスの内耳に由来するＬｇｒ５＋幹／前駆細胞の増殖およびＧＦＰ発現を促進することを示す。図１４Ｂは、ＧＦＰ発現の定量化および細胞数を示す。

【図14C】図１４Ａ〜１４Ｆは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせが、マウスの内耳に由来するＬｇｒ５＋幹／前駆細胞の増殖およびＧＦＰ発現を促進することを示す。図１４Ｃは、明視野画像およびＧＦＰ画像を示す。全てのスケールバー：２００μｍ。

【図14D-F】図１４Ａ〜１４Ｆは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせが、マウスの内耳に由来するＬｇｒ５＋幹／前駆細胞の増殖およびＧＦＰ発現を促進することを示す。図１４Ｄは、示されるとおりの複数の条件での内耳幹細胞の８日培養の細胞数を示す。図１４Ｅは、示されるとおりの複数の条件での内耳幹細胞の８日培養のＧＦＰパーセンテージを示す。図１４Ｆは、複数の条件で培養したＬｇｒ５−ＧＦＰ内耳幹細胞の形態およびＧＦＰ発現を示す。全てのスケールバー：２００μｍ。

【図15】図１５は、インビトロでの健康なマウスの結腸組織へのマウス小腸陰窩の播種を示す。左のパネルは、部分的に露出させた（denude）上皮を有する結腸に配置した単離された小腸陰窩を示す。白矢印は、播種した陰窩を示す。右のパネルは、結腸に付着させ、かつ２４時間後にその表面を横切って広げた播種した陰窩を示す。黒矢印は、左のパネルの白矢印と同じ位置を示す。

【図16】図１６は、播種の４８時間後の陰窩の植付けを示す。陰窩を播種したマウス結腸組織の蛍光（上のパネル）および明視野（下のパネル）画像を示す。陰窩を、播種の前にＤｉＤで染色した。白線は、植え付けた細胞を含む領域を示す。

【図17】図１７は、６日のインビトロ培養後の陰窩の植付けを示す。陰窩を播種したマウス結腸組織のＧＦＰ（左のパネル）、ＲＦＰ（中央のパネル）、および明視野（右のパネル）チャネルの画像を示す。ＧＦＰシグナルは、Ｌｇｒ５細胞の存在を示す。

【図18】図１８は、陰窩を植え付けたＴＲＵＣマウスから切除した脱した潰瘍性大腸炎組織の共焦点画像を示す。陰窩を、播種の前にＤｉＤで染色した。脱した組織を、緑の自己蛍光によって示す。

【図19A-F】図１９Ａ〜１９Ｎは、評価した培養系中の播種（左）およびインキュベーション後の類臓器体の成長（右）の概略図を示す。図１９Ａおよび１９Ｂは、典型的な粘膜下組織播種方法（本明細書で「ベアパッチ（bare patch）」という）を示し、これは、単層の成長および類臓器体の分離を支持する。図１９Ｃおよび１９Ｄは、３次元の類臓器体の成長を支持するためのＧＦ注入ＳＩＳ（ＧＦは、ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、ＣＨＩＲを含む）を示す。図１９Ｅおよび１９Ｆは、コラーゲンのかぶせもの（overlay）を有するＧＦ注入ＳＩＳで構成されるゲルパッチを示す。図１９Ｅの挿入図は、各々の類臓器体が個々に軟質ゲルおよびＳＩＳ基底層中に覆われることを示す。

【図19G-N】図１９Ａ〜１９Ｎは、評価した培養系中の播種（左）およびインキュベーション後の類臓器体の成長（右）の概略図を示す。図１９Ｇおよび１９Ｈは、培養培地に直接添加されたＧＦ（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、ＣＨＩＲ）を有する典型的なコラーゲン懸濁物を示す。図１９Ｉおよび１９Ｊは、ゲルに植え込まれたＧＦ（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、ＣＨＩＲ）を有する典型的なコラーゲン懸濁物を示す。図１９Ｋおよび１９Ｌは、培養培地に添加されるさらなるＧＦを有さない典型的なコラーゲン懸濁物を示す。図１９Ｍおよび１９Ｎは、培地に添加されるさらなるＧＦを有さない典型的なマトリゲル懸濁物を示す（実験対照）。

【図20】図２０Ａは、Ｌｇｒ５＋類臓器体を播種する手順の概略図を示し；模様の付いた円は、注入された増殖因子（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、およびＣＨＩＲ）を表す。図２０Ｂは、最初の接着相を示し、矢印は、増殖植付け因子拡散支持体（growth embedded factor diffusion suport）を示す。図２０Ｃは、コラーゲンのかぶせものを有する完全培養系を示し、厚さの測定が示される。

【図21】図２１Ａは、７つの培養系中での類臓器体の成長の比較を提供する。系列は、左から右に、マトリゲル、ＧＦを有するゲルパッチ、ＧＦを有するベアパッチ、コラーゲンＩ、培地ＧＦを有するコラーゲンＩ、ＧＦを植え込んだコラーゲンＩ、およびＧＦなしのベアパッチである。図２１Ｂおよび２１Ｃは、ＧＦを有するゲルパッチ系由来の４８時間での代表的な類臓器体を示し、ＧＦＰ＋蛍光は、陰窩基底に存在するＬｇｒ５＋幹細胞を示す（いくつかの中央の自己蛍光が見られる）。２４時間（コラーゲンＩ（ＣＩ） 対 全て）、４８時間（ＧＦを有するベアパッチ（ＢＰＧＦ） 対 全て；ＣＩ 対 マトリゲル（Ｍ）；ＧＦを有するＣＩ（ＣＩＧＦ） 対 Ｍ、ＣＩ、ＧＦを植え込まれたコラーゲンＩ（ＣＩＥＧＦ）、ベアパッチ（ＢＰ）、ＧＦを有するゲルパッチ系（ＰＳＧＦ））、７２時間（ＣＩ 対 全て；ＢＰ、ＣＩＥＧＦ、およびＣＩＧＦ 対 Ｍ、ＰＳ、ＢＰＧＦ、ＣＩ）および９６時間（ＣＩ 対 全て、ＢＰ、ＣＩＥＧＦ、およびＣＩＧＦ 対 全て）で＊＝ｐ＜．０５。スケールバー（図２１Ｂおよび２１Ｃ）＝２００μｍ。

【図22】図２２は、ＧＦを有するゲルパッチ系において播種された類臓器体の成功裡の成長および陰窩の増殖を示す。ＧＦを有するＳＩＳパッチ系上に播種された類臓器体のエキソビボ成長を示す代表的な画像の順序を示す。ピントがずれている陰窩は、単一面顕微鏡で観察した３次元の増殖の効果である。

【図23】図２３Ａは、４ｍｍの胃の欠損の作製を示す概略図を提供する。欠損を覆う６ｍｍのパッチの配置を、図２３Ｂに示す。図２３Ｃに示すように、胃の外壁には目に見える欠損はなく、これは、手術後１週間の代表的な胃の試料で示された。胃の内壁から見た場合、欠損全体（矢印）は、配置したパッチの型に従って示される：図２３Ｄは、ＧＦを有さないＳＩＳパッチを示し、図２３Ｅは、ＧＦを加えたＳＩＳパッチを示し、図２３Ｆは、ＳＩＳなしのＰＧＳＵ裏当て（backing）のみを示す。ＧＦを有するＳＩＳパッチは、完全な閉鎖および胃の壁の上皮形成効果を示し、一方、ＳＩＳのみにおいて、欠損は部分的に開いたままであり、ＳＩＳなしのＰＧＳＵにおいて、欠損は完全に開いたままであった。

【図24】図２４は、複数の条件で培養した単離されたヒト腸陰窩のマーカー遺伝子発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＥＧＦ、ノギンおよびＲ−スポンジン１を全ての条件に添加した。Ｃ：ＣＨＩＲ、Ｎｉ：ニコチンアミド、Ｗ：Ｗｎｔ３ａ、Ａ：Ａ８３−０１、Ｓ：ＳＢ２０２１９０、Ｐ：ＰＧＥ２、Ｖ：ＶＰＡ、Ｔｕ：ツバスタチンＡ、陰窩は、新たに単離されたヒト小腸陰窩を示す。エラーバーはＳ．Ｄ．を示し、ｎ＝３である。

【図25】図２５Ａ〜２５Ｂは、ヒト腸幹細胞について最適化した培養条件を示す。図２５Ａは、複数の条件で培養したヒト腸上皮細胞の増殖を示す。新たに単離されたヒト小腸陰窩を、示されるとおりの複数の条件で培養した。ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１は、全ての条件において存在した。細胞数を、播種後第９日に定量した。Ｃ：ＣＨＩＲ、Ｖ：０．５〜１．５ｍＭで使用したＶＰＡ、Ｎｉ：ニコチンアミド。図２５Ｂは、図１５Ａのとおりの複数の条件で培養した細胞のＬＧＲ５発現を示す。ＶＰＡを１ｍＭで使用した。

【図26】図２６は、ヒト腸幹細胞の培養を示す。細胞を、ヒト腸幹細胞培養培地（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、ＣＨＩＲ９９０２１、ＶＰＡ、およびニコチンアミドを含む）中で培養した。継代後第５日での第２継代の細胞を示す。スケールバー：４００μｍ。

【図27】図２７は、動物モデル系におけるインビボでの７日の経過をとおしたＣＨＩＲおよびＶＰＡの投与後の陰窩サイズの増加を示す。

【発明を実施するための形態】

【0049】

発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用する場合、「抗体」は、免疫原結合活性を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片である。

【0050】

本明細書で使用する場合、「アゴニスト」は、標的遺伝子または標的タンパク質それぞれの発現または活性の増大を引き起こす薬剤である。アゴニストは、いくらかの様式でそのコグネイト（cognate）レセプターに結合し得、該レセプターを活性化し得、それは、標的遺伝子またはタンパク質に対するこの生理学的効果を直接的または間接的に引き起こす。

【0051】

本明細書で使用する場合、「インヒビター」は、標的遺伝子または標的タンパク質それぞれの発現または活性の減少を引き起こす薬剤である。「アンタゴニスト」は、インヒビターであり得るが、レセプターに結合し、他の分子による結合を低減または排除もするより特異的な薬剤である。

【0052】

本明細書で使用する場合、「阻害性核酸」は、哺乳動物細胞に投与した場合、標的遺伝子の発現の低減を生じる二本鎖核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはアンチセンスＲＮＡ、またはそれらの一部、またはそれらの模倣物である。典型的には、核酸インヒビターは、標的核酸分子もしくはそのオルソログの少なくとも一部を含むか、または標的核酸分子の相補鎖の少なくとも一部を含む。典型的には、標的遺伝子の発現は、１０％、２５％、５０％、７５％、または９０〜１００％でさえ低減される。

【0053】

「アンチセンス」は、長さに関わらず、核酸配列のコード鎖またはｍＲＮＡに相補的である核酸配列を意味する。本明細書で言及する場合、「相補核酸配列」は、相補的ヌクレオチド塩基対で構成される別の核酸配列とハイブリダイズし得る核酸配列である。「ハイブリダイズ」は、適切なストリンジェンシーの条件下で、対が、相補的ヌクレオチド塩基（例えば、ＤＮＡにおいてグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）が塩基対を形成するように、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と塩基対を形成する）の間で二本鎖分子を形成することを意味する。（例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照）。１つの態様において、アンチセンスＲＮＡが、個々の細胞、組織、または類臓器体に導入される。アンチセンス核酸は、改変された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、もしくは当該分野で公知の他の改変された骨格を含み得るか、または非天然のヌクレオシド間結合を含み得る。

【0054】

「ｓｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡを意味する。最適には、ｓｉＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチド長であり、その３’末端に２塩基の突出を有する。これらのｄｓＲＮＡは、個々の細胞または培養系に導入され得る。かかるｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡレベルまたはプロモーター活性をダウンレギュレートするために使用される。

【0055】

本明細書で使用する場合、「断片」は、ポリペプチドまたは核酸分子の一部である。この一部は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含む。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。

【0056】

本明細書で使用する場合、用語「幹細胞」は、自己複製（self-renew）し、複数の細胞系統に分化する能力を有する多能性細胞をいう。

【0057】

本明細書で使用する場合、用語「上皮幹細胞」は、上皮細胞を生じる細胞系統を含む複数の細胞系統になることに付される潜在性を有する多能性細胞をいう。

【0058】

本明細書で使用する場合、用語「前駆細胞」は、幹細胞に由来する系統限定細胞を言う。

【0059】

本明細書で使用する場合、用語「上皮前駆駆胞」は、上皮細胞を生じる細胞系統に限定される潜在性を有する多能性細胞をいう。

【0060】

本明細書で使用する場合、用語「自己複製（self-renewal）」は、幹細胞が分裂して、母細胞の発生の潜在能力と区別できない発生の潜在能力を有する１つ（非対称分裂）または２つ（対称分裂）の嬢細胞を生じるプロセスをいう。自己複製は、増殖および未分化状態の維持の両方を含む。

【0061】

本明細書で使用する場合、用語「植え付ける」または「植付け」は、組織中に存在する細胞との接触を介してインビボで目的の組織に幹細胞または前駆細胞を組み込むプロセスをいう。

【0062】

本明細書で使用する場合、用語「単離された」は、物質をネイティブの状態で見出だした場合に通常該物質に付随する成分を種々の程度で含まない物質をいう。「単離する」は、元の供給源または周囲物（surroundings）からのある程度の分離を示す。

【0063】

本明細書で使用する場合、細胞の「集団」は、１より大きい任意の数の細胞であるが、好ましくは、少なくとも１×１０^３細胞、少なくとも１×１０^４細胞、少なくとも１×１０^５細胞、少なくとも１×１０^６細胞、少なくとも１×１０^７細胞、少なくとも１×１０^８細胞、少なくとも１×１０^９細胞、または少なくとも１×１０^１０細胞である。

【0064】

本明細書で使用する場合、用語「類臓器体」または「上皮類臓器体」は、臓器または臓器の一部に類似し、その特定の臓器に関連する細胞型を有する細胞クラスターまたは細胞凝集体をいう。

【0065】

本明細書で使用する場合、「被験体」は、哺乳動物鋼の任意の構成メンバーを含む脊椎動物である。

【0066】

本明細書で使用する場合、「哺乳動物」は、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、サル、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ウマ、ウシまたはブタを非限定的に含む任意の哺乳動物をいう。

【0067】

本明細書で使用する場合、「非ヒト哺乳動物」は、ヒトではない任意の哺乳動物をいう。

【0068】

本明細書で使用する場合、「増加すること」は、例えば参照のレベルと比べて、少なくとも５％、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、１００％またはそれら以上増加することをいう。

【0069】

本明細書で使用する場合、「増加する」は、例えば参照標準のレベルと比べて、少なくとも１倍、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍またはそれら以上の増加も意味する。

【0070】

本明細書で使用する場合、「減少すること」は、例えば参照のレベルと比べて、少なくとも５％、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％減少することをいう。

【0071】

本明細書で使用する場合、「減少する」は、例えば参照のレベルと比べて、少なくとも１倍、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍またはそれら以上の減少も意味する。

【0072】

本明細書で使用する場合、用語「参照」は、標準または対照条件（例えば、試験薬剤または試験薬剤の組み合わせで治療されない）を意味する。

【0073】

本明細書で使用する場合、用語「排除する」は、検出不可能なレベルにまで減少することを意味する。

【0074】

本明細書で使用する場合、用語「相乗効果（synergy）」または「相乗効果（synergistic effect）」は、別々に摂取した効果の各々の和より大きい；相加的効果より大きい効果である。

【0075】

本明細書で使用する場合、用語「治療する」、「治療すること」、「治療」等は、障害および／またはそれに関連する症状を低減または改善することをいう。除外するわけではないが、障害または状態を治療することは、障害、状態またはそれらに関連する症状が完全に排除されることを必要としないことが理解される。

【0076】

本開示において、「含む（comprises）」、「含むこと（comprising）」、「含むこと（containing）」、および「有すること」等は、米国特許法でそれらにあるとされる意味を有し得、「含む（includes）」、「含むこと（including）」等を意味し得、「から本質的になること」または「から本質的になる（consists essentially）」は同様に、米国特許法であるとされる意味を有し、用語は開放型（open-ended）であり、記載されたものの基本的または新規の特性が、記載されたものより多くの存在によって変化しない限り、記載されたものより多くの存在を許容するが、先行技術の態様を排除する。

【0077】

他の定義は、本開示を通じて文脈中に現れる。他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。対立する場合は、定義を含む本明細書が支配する。

【0078】

本発明の方法および組成物
Ｉ．細胞培養溶液および細胞培養系
均質の上皮幹細胞培養、効率的な上記類臓器体形成および移植における使用のためのこれらのスケールアップを促進するための細胞培養溶液および細胞培養系は、今回発見された。

【0079】

骨形成因子のインヒビター、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ３β）のインヒビター、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役レセプター５（ＬＧＲ５）に結合する薬剤、およびヒストンデアセチラーゼインヒビターを含む細胞培養溶液は、単離された上皮幹細胞から上皮細胞コロニーを形成するために使用され得る。特定の態様において、少なくとも約２５％、約４０％、約５０％、約７５％、約９０％〜約１００％の単離された上皮幹細胞は、本細胞培養溶液の存在下で上皮細胞コロニーを形成する。さらに、少なくとも約６％の単一の単離された上皮幹細胞は、本細胞培養溶液の存在下で上皮細胞コロニーを形成する。１，６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル「ＣＨＩＲ９９０２１」（Ring et al., 2003）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３βのインヒビター、およびバルプロ酸、ヒストンデアセチラーゼインヒビターの組み合わせは、コロニー形成効率に対する相乗効果を有する。

【0080】

骨形成因子（ＢＭＰ）は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの構成メンバーであり、種々の種の間の胚のパターン化（patterning）および後胚細胞シグナル伝達に関与するメタロプロテアーゼを含む。ＢＭＰのインヒビターは、例えば、ＢＭＰ分子に結合し、例えば、ＢＭＰ分子のＢＭＰレセプターへの結合を妨げまたは阻害することによって、ＢＭＰ活性が減少または排除された複合体を形成する薬剤を含む。代替的に、インヒビターは、アンタゴニストまたは逆アゴニスト（reverse agonist）として作用する薬剤である。この型のインヒビターは、ＢＭＰレセプターに結合し、ＢＭＰのレセプターへの結合を妨げる。後者の薬剤の例は、ＢＭＰレセプターに結合し、ＢＭＰの抗体結合レセプターへの結合を妨げる抗体である。ＢＭＰのインヒビターは、当該分野において周知であり（Rider et al., 2010）、ノギン、コーディン、フォリスタチン（Schneyer et al., 1994）、ＤＡＮ、ＤＡＮシステイン−ノットドメイン（セルベルス（Cerberus）およびグレムリン（Gremiln）を含む）を含むタンパク質、スクレロスチン、ねじれ原腸形成、子宮感受性関連遺伝子−１、結合組織成長因子（Abreu et al., 2002）、インヒビン（Wiater and Vale, 2003）、ＢＭＰ−３（Gamer et al., 2005）、ドルソモルフィン（Yu et al., 2008）、ならびにＤＭＨ１（Hao et al., 2010）およびＬＤＮ−１９３１８９（Cuny et al., 2008）を含む誘導体が挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0081】

グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）は、プロリン特異的セリン−トレオニンキナーゼであり、２つの公知のアイソフォーム、α（ＧＳＫ３Ａ）およびβ（ＧＳＫ−３β）を有するリン酸化および不活性化されたグリコーゲンシンターゼとして最初に同定された。ＧＳＫ−３βインヒビターを含むＷｎｔアゴニストは、当該分野で周知であり、１，６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル「ＣＨＩＲ９９０２１」（Ring et al., 2003）、ＬｉＣｌ（Klein et al., 1996）、ＢＩＯ−アセトキシム（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）（Meijer et al., 2003）、Ｎ６−［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］−３−ニトロ−２，６−ピリジンジアミン「ＣＨＩＲ９８０１４」（Ring et al., 2003）、ＧＳＫ−３インヒビターＩＶとしても公知の３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン「ＳＢ２１６７６３」（Coghlan et al., 2000）、３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン「ＳＢ４１５２８６」（Coghlan et al., 2000）、５−エチル−７，８−ジメトキシ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］−イソキノリン−１，３−（２Ｈ）−ジオン「３Ｆ８」（Zhong et al., 2009）、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（５Ｈ）−オン「ケンパウロン」（Schultz et al., 1999; Zaharevits et al., 1999）、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−ピリド［３’，２’：２，３］アゼピノ［４，５−ｂ］インドール−６（５Ｈ）−オン「１−アザケンパウロン」（Schultz et al., 1999; Zaharevits et al., 1999）、Ｎ−（３−クロロ−４−メチルフェニル）−５−（４−ニトロフェニル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−アミン「ＴＣ−Ｇ２４」（Khanfar et al., 2010）、２−メチル−５−［３−［４−（メチルスルフィニル）フェニル］−５−ベンゾフラニル］−１，３，４−オキサジアゾール「ＴＣＳ２００２」（Saitoh et al., 2009）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）メチル］−Ｎ’−（５−ニトロ−２−チアゾリル）尿素「ＡＲ−Ａ０１４４１８」（Bhat et al., 2003）、３−［５−［４−（２−ヒドロキシ−２−メチル−１−オキソプロピル）−１−ピペラジニル］−２−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン「ＴＣＳ２１３１１」（Thomas et al., 2011）、３−［［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ］−フェノール「ＴＷＳ１１９」（Ding et al., 2003）、ＧＳＫ−３インヒビターＩＸとしても公知の（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム「ＢＩＯ−アセトキシム」（Meijer et al., 2003）、４−（２−アミノ−４−オキソ−２−イミダゾリン−５−イリデン）−２−ブロモ−４，５，６，７−テトラヒドロピロロ［２，３−ｃ］アゼピン−８−オン「１０Ｚ−ヒメニアルジシン」（Breton et al., 1997）、ＧＳＫ−３βインヒビターＩＩとしても公知の２−［（３−ヨードフェニル）メチルスルファニル］−５−ピリジン−４−イル−１，３，４−オキサジアゾール（Wada, 2009）、ＧＳＫ−３βインヒビターＩとしても公知の４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン（Wada, 2009）、ＧＳＫ−３βインヒビターＸＸＶＩＩとしても公知の３−アミノ−６−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）スルホニル）フェニル）−Ｎ−（ピリジン−３−イル）ピラジン−２−カルボキサミド，ＨＣｌ（米国特許公開番号2006/0173014）、ＧＳＫ−３βインヒビターＸＸＶＩとしても公知の４，５−ビス（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン（Chen et al., 2011）、ＦＲＡＴtideペプチドＳＱＰＥＴＲＴＧＤＤＤＰＨＲＬＬＱＱＬＶＬＳＧＮＬＩＫＥＡＶＲＲＬＨＳＲＲＬＱ（配列番号：１）（Bax et al., 2001）、３−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］キノキサリン「Ｃｄｋ１／５インヒビター」（Andreani et al., 1996, 2000: Katho et al., 2011）、および４−（（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ）−４−オキソブタン酸「ビキニン」（De Rybel et al., 2009）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ＧＳＫ−３βのインヒビターはＣＨＩＲ９９０２１である。

【0082】

ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役レセプター５（ＬＧＲ５レセプター）は、その限定された陰窩発現ならびに複数の成人組織および癌において幹細胞をマーキング（marking）することについて公知である。ＬＧＲ５レセプターに結合する薬剤としては、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、およびＲ−スポンジン４等のＲ−スポンジン（Kim et al., 2006; Nam et al., 2006）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ＬＧＲ５レセプターに結合する薬剤はＲ−スポンジン１である。

【0083】

代替的な態様において、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）は、ＣＨＩＲ９９０２１の代わりに使用できるか、または少なくとも約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１は、Ｒ−スポンジン１の代わりに使用できる。

【0084】

ヒストンは、ＤＮＡに結合し、ヌクレオソームを形成する核タンパク質である。これらは、ＤＮＡの染色体へのパッケージングおよび転写の調節の両方に直接関与する。ヒストンアセチル化／脱アセチル化は、転写の間のクロマチン構造の動力学の調節の主な因子である。ヒストンデアセチラーゼインヒビターは、ヒストン脱アセチル化を低減または排除するが、当該分野で周知であり、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、およびスベロヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）等のＰａｎ−ＨＤＡＣインヒビター、ならびにツバシン、ツバスタチンＡ、およびコンパウンド７等のＨＤＡＣ６インヒビターが挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0085】

代替的な態様において、Ａｔｏｈ１インヒビターは、ヒストンデアセチラーゼインヒビターを増強し得るか、またはヒストンデアセチラーゼインヒビターの代わりに使用され得る。Ａｔｏｈ１インヒビターとしては、例えば、Ａｔｏｈ１の発現の減少または排除を引き起こす阻害性核酸が挙げられる。Ａｔｏｈ１を標的とする阻害性核酸は、当該分野で公知である（Shi et al., 2010）。

【0086】

細胞培養溶液は、上皮増殖因子および／またはノッチアゴニストを任意に含み得る。上皮増殖因子は、細胞増殖、分化、移動および生存を含む種々の細胞機能、ならびに組織発生に関与する細胞シグナル伝達分子である。ノッチタンパク質は、発生の間に細胞運命の決定を調節する一回膜貫通型レセプターである。ノッチアゴニストとしては、例えば、細胞においてノッチ活性を増大させる薬剤が挙げられる。ノッチアゴニストは、当該分野で周知であり、ノッチ１抗体（Ｎ１ Ａｂ）、デルタ１、デルタ様３、デルタ様４、ジャグド１、ジャグド２、ＤＳＬペプチド、およびデルタＤが挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0087】

特定の態様において、細胞培養溶液は、約５〜約５００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、約５〜約５００ｎｇ／ｍｌのノギン、約５０〜約１０００ｎｇ／ｍｌのＲ−スポンジン、約０．１〜約１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１、および約０．１〜約５ｍＭのバルプロ酸を含む。

【0088】

他の態様において、細胞培養溶液中のＷｎｔアゴニストとＨＤＡＣ６インヒビターの組み合わせが好ましい。従って、細胞培養溶液は、骨形成因子のインヒビター、Ｒ−スポンジン１、Ｗｎｔアゴニスト、およびＨＤＡＣ６インヒビターを含み得る。

【0089】

Ｗｎｔタンパク質は、胚の発生の制御に関与する細胞外シグナル伝達分子である。Ｗｎｔアゴニストは、当該分野で周知であり、Ｗｎｔ−１／Ｉｎｔ−１（Nusse et al., 1982）、Ｗｎｔ−２／Ｉｒｐ（Ｉｎｔ−Ｉ関連タンパク質）（Wainwright et al., 1988）、Ｗｎｔ−２ｂ／１３（Katoh et al., 1996）、Ｗｎｔ−３／Ｉｎｔ−４（Katoh et al., 2001）、Ｗｎｔ−３ａ（Saitoh et al., 2001）、Ｗｎｔ−４（Smolich et al., 1993）、Ｗｎｔ−５ａ（Burrus et al., 1995）、Ｗｎｔ−５ｂ（Burrus et al., 1995）、Ｗｎｔ−６（Burrus et al., 1995）、Ｗｎｔ−７ａ（Smolich et al., 1993）、Ｗｎｔ−７ｂ（Burrus et al., 1995）、Ｗｎｔ−８ａ／８ｄ（Saitoh et al., 2001）、Ｗｎｔ−８ｂ（Lako et al., 1998）、Ｗｎｔ−９ａ／１４（Bergstein et al., 1997）、Ｗｎｔ−９ｂ／１４ｂ／１５（Bergstein et al., 1997）、Ｗｎｔ−１０ａ（Wang et al., 1996）、Ｗｎｔ−１０ｂ／１２（Wang et al., 1996）、Ｗｎｔ−１１（Lako et al., 1998）、Ｗｎｔ−１６（Bergstein et al., 1997; Fear et al., 2000）、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、Ｒ−スポンジン４、ノリン（Planutis et al., 2007）、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬｉＣｌ、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、ＣＨＩＲ９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、３Ｆ８、ケンパウロン、１−アザケンパウロン、ＴＣ−Ｇ２４、ＴＣＳ２００２、ＡＲ−Ａ０１４４１８、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシベンジル−アミノ）−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン（Liu et al., 2005）、２−［２−（４−アセチルフェニル）ジアゼニル］−２−（３，４−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１（２Ｈ）−イソキノリニリデン）アセトアミド「ＩＱ１」（Miyabayashi et al., 2007）、（３α，５β，１２α，２０Ｒ）−３，１２−ジヒドロキシコラン−２４−オイックアシッド「ＤＣＡ」（Pai et al., 2004）、（２Ｓ）−２−［２−（インダン−５−イルオキシ）−９−（１，１’−ビフェニル−４−イル）メチル］−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ］−３−フェニル−ｐ−ロパン−１−オール「ＱＳ１１」（Zhang et al., 2007）、ピペリジニルジフェニルスルホニルスルホンアミド１「ＷＡＹ−３１６６０６」（Bodine et al., 2009）、（ヘテロ）アリールピリミジン（Gilbert et al., 2010）、１０Ｚ−ヒメニアルジシン、ＴＣＳ２１３１１、ＴＷＳ１１９、ＧＳＫ−３βインヒビターＩＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＸＸＶＩＩ、ＦＲＡＴtide、Ｃｄｋ１／５インヒビター、およびビキニンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0090】

細胞培養系は、本発明の細胞培養溶液、および上皮類臓器体、上皮幹細胞または上皮前駆細胞または上皮幹細胞もしくは上皮前駆細胞の集団を含む。上皮類臓器体は、当該分野で公知である（Yao et al., 2010; Lukacs et al., 2010）上皮幹細胞としては、腸、胃、肺、膵臓および結腸の幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上皮幹細胞は、腸、内耳、脳、腎臓、肝臓、網膜、胃、膵臓、乳房、毛包、卵巣、副腎髄質、皮膚、胸腺、味蕾、乳腺、癌および腫瘍を非限定的に含む供給源に由来するＬＧＲ５陽性細胞も含む。上皮幹細胞は、ＬＧＲ５を発現するＬＧＲ５陽性幹細胞の静止前駆体も含み得る（Buczacki et al., 2013）。細胞培養系中の上皮幹細胞または上皮前駆細胞の集団は、例えば、該系中の細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％を構成し得る。好ましくは、上皮幹細胞または上皮前駆細胞の集団は、繰り返しの継代の間維持される。

【0091】

特定の態様において、ヒト上皮幹細胞は、ニコチンアミド、またはＥＸ５２７等のＳｉｒｔ１特異的ＨＤＡＣインヒビターを含むさらなる成分の存在下で培養され得る。

【0092】

特定の態様において、内耳由来の上皮幹細胞は、Ｗｎｔアゴニスト、ヒストンデアセチラーゼインヒビター、上皮増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子および任意に骨形成因子の存在下で培養され得る。

【0093】

細胞培養系は、粘膜下組織基底、およびコラーゲンを含み移植に適切な３次元組織構築物を形成する被覆を非限定的に含むさらなる成分を含み得る。コラーゲン被覆は、選択された上皮組織または細胞型の上およびまたはその周囲にかぶせられ得、選択された上皮組織または細胞型と粘膜下組織基底の間に配置され得る。選択された上皮組織または細胞型としては、上皮幹細胞、上皮幹細胞を含む単離された組織または上皮類臓器体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0094】

小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）は、一般的な生体適合性の臨床的に使用される骨格である（de la Fuente et al., 2003; Ueno et al., 2007; Schultz et al., 2002; Kehoe et al., 2012）。粘膜下組織ベースの骨格は、迅速な新生血管形成、顆粒化、生分解を受け、一般的に、種の間でタンパク質組成の点で良好に保存されている。３次元組織構築物のための改善された粘膜下組織ベースの培養系は、粘膜下組織に前もって選択された上皮細胞型を播種し、コラーゲンベースのかぶせものを伴う増殖を容易にすることによって調製される。このかぶせものを有するＳＩＳの組成が変化することによって、ＳＩＳ上の細胞接着および増殖が容易になり、粘膜下組織に接着した細胞を３次元増殖させ、大きな上皮類臓器体を生じる。温血脊椎動物からの動物由来組織マトリックス骨格（例えば、胃、膀胱、消化器（alimentary）、呼吸器（respiratory）、生殖器粘膜下組織、および肝臓基底膜）は、ＳＩＳと交換可能であり、従って、本開示の範囲内である。

【0095】

組織構築物は、当該分野で公知の細胞培養溶液または本明細書で上記される本発明の細胞培養溶液の存在下で培養され得る。例えば、組織構築物は、骨形成因子のインヒビター、Ｒ−スポンジン１、ＣＨＩＲ９９０２１、およびヒストンデアセチラーゼインヒビターを含む細胞培養溶液の存在下で培養され得る。さらに、粘膜下組織基底は、上皮増殖因子、骨形成因子、Ｒ−スポンジン１、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｙ−２７６３２、およびヒストンデアセチラーゼインヒビターを非限定的に含む小分子および／または増殖因子の類似の組み合わせを含み得る。

【0096】

代替的な態様において、コラーゲンを含まない上皮細胞培養系が提供され、ここで、粘膜下組織基底は、上皮増殖因子、骨形成因子、Ｒ−スポンジン１、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｙ−２７６３２、およびヒストンデアセチラーゼインヒビター等の小分子および／または増殖因子の組み合わせを含む。コラーゲンを含まない組織構築物は、当該分野で公知または本明細書で上記される細胞培養溶液の存在下で培養され得る。

【0097】

ＩＩ．細胞培養溶液および細胞培養系を使用する方法
本発明の細胞培養溶液および細胞培養系は、単離された上皮幹細胞から高い効率で上皮類臓器体を形成するために使用され得る。特定の態様において、ノギン、Ｒ−スポンジン１、ＣＨＩＲ９９０２１、およびヒストンデアセチラーゼインヒビター（例えば、バルプロ酸）の存在下で単離された上皮幹細胞をインキュベートすることによって、少なくとも約２５％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の効率で上皮細胞コロニーを形成する。別の特定の態様において、ノギン、Ｒ−スポンジン１、ＣＨＩＲ９９０２１、およびヒストンデアセチラーゼインヒビターの存在下でインキュベートされた単一の単離された上皮幹細胞は、少なくとも（least）約６％〜約１００％の効率で上皮細胞コロニーを形成する。

【0098】

本発明の細胞培養溶液および細胞培養系内に維持された上皮幹細胞は、次いで、パーネト細胞、腸細胞、杯細胞、および腸内分泌細胞の形成を生じる分化経路を含む特定の分化経路へと振り向けられ得る。

【0099】

パーネト細胞は、腸陰窩内のＬｇｒ５＋幹細胞ニッチ（niche）の重要な構成要素であり、幹細胞維持のために不可欠なシグナルを提供することが示された（Sato et al., 2011b; Yilmaz et al., 2012）。ＢＭＰのインヒビター、Ｒ−スポンジン１、ＣＨＩＲ９９０２１、およびヒストンデアセチラーゼインヒビター（例えば、バルプロ酸）を含む細胞培養溶液の存在下で最初に上皮幹細胞をインキュベートし、次いで、少なくとも１つのＷｎｔアゴニストおよび少なくとも１つのノッチのインヒビター（例えば、ＤＡＰＴ）の存在下で上皮幹細胞をさらにインキュベートすることによって、パーネト細胞が生じる。同様に、少なくとも１つのＷｎｔインヒビターおよび少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼインヒビターの存在下で上皮幹細胞を続いてさらにインキュベートすることによって、腸細胞が生じ；少なくとも１つのＷｎｔインヒビターおよび少なくとも１つのノッチインヒビターの存在下で上皮幹細胞を続いてさらにインキュベートすることによって、杯細胞が生じる。Ｗｎｔインヒビターは、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド（「ＩＷＰ−２」）（Chen, Dodge et al. 2009）であり得るが、これに限定されない。ノッチインヒビターは、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（「ＤＡＰＴ」または「ＬＹ−３７４９７３」）（Dovey, John et al. 2001）、Ｎ１−［（７Ｓ）−６，７−ジヒドロ−６−オキソ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル］−２，２−ジメチル−Ｎ３−（２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル）−（「ＲＯ４９２９０９７」、プロパンジアミド）（He, Luistro et al. 2011）、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−メチル−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−３−メチル−２−オキソ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］アゼピン−１−イルアミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミド（「ＬＹ４５０１３９」）（Lanz, Hosley et al. 2004）、Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−６，７−ジヒドロ−５−メチル−６−オキソ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソエチル］−２−ヒドロキシ−３−メチル−、（２Ｓ）−（「ＬＹ９００００９」、ブタンアミド）（Selleckchem: Catalog No. S7168）、Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−６，７−ジヒドロ−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−５Ｈ−ピリド［３，２−ａ］［３］ベンゾアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソエチル］−４，４，４−トリフルオロ−（「ＬＹ３０３９４７８」、ブタンアミド）Selleckchem: Catalog No. S7169、Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−６，７−ジヒドロ−５−メチル−６−オキソ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソエチル］−３，５−ジフルオロ−α−ヒドロキシ−、（αＳ）−（「ＬＹ４１１５７５」、ベンゼンアセトアミド）（Wehner, Cizelsky et al. 2014）、７−（Ｓ）−［Ｎ’（３，５−ジフルオロフェニルアセチル）−Ｌ−アラニル］アミノ−５−メチル−５，７−ジヒドロ−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−６−オン（「ＹＯ−０１０２７」（ＤＢＺ））（Milano, McKay et al. 2004）、（２Ｒ）−２−（Ｎ−（２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ベンジル）−４−クロロフェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（「ＢＭＳ−７０８１６３」）（Saito, Fu et al. 2014）、（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−［（３Ｓ）−１−メチル−２−オキソ−５−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］−２，３−ビス（３，３，３−トリフルオロプロピル）スクシンアミド（「ＢＭＳ−９０６０２４」）（Huang, Greer et al. 2009）、（Ｓ，Ｓ）−２−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）−アセチルアミノ］−Ｎ−（１−メチル−２−オキソ−５−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゼピン−３−イル）−プロピオンアミド（「コンパウンドＥ」）（Milano, McKay et al. 2004）、２−［（１Ｒ）−１−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］（２，５−ジフルオロフェニル）アミノ］エチル−５−フルオロベンゼンブタン酸（「ＢＭＳ−２９９８９７」）（Anderson, Holtz et al. 2005）、ＳＡＨＭ１ Calbiochemカタログ番号:491002、（Ａβ４２−セレクティブ） Calbiochemカタログ番号:565792、およびＮ−（２−ブロモフェニル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−４−ニトロフェニル）尿素（「ＳＢ２２５００２」）（Bakshi, Jin et al. 2009）であり得るが、これらに限定されない。

【0100】

少なくとも１つのノッチのインヒビター、およびレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、ＭＡＰＫ／ＥＲＫとも称されるマイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼ、またはＭＡＰＫ／ＥＲＫとも称される細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）の少なくとも１つを阻害する薬剤の存在下での上皮幹細胞の続いてのさらなるインキュベーションによって、腸内分泌細胞が生じる。ＭＡＰキナーゼは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼであり得るが、これらに限定されず、ＭＡＰキナーゼを阻害する薬剤は、Ｎ−［（２Ｓ）−２，３−ジヒドロキシプロピル］−３−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−４−ピリジンカルボキサミド（「ＡＳ−７０３０２６」）（Kim, Kong et al. 2010）、Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド（「ＰＤ０３２５９０１」）（Thompson and Lyons 2005）、５−（２−フェニル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−３−イルアミン（「ＦＲ１８０２０４」）（Ohori, Kinoshita et al. 2005）、２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン（「ＰＤ９８０５９」）（Alessi, Cuenda et al. 1995）、６−（４−ブロモ−２−クロロフェニルアミノ）−７−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチル−３Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−カルボキサミド（「セルメチニブ」）（Huynh, Soo et al. 2007）、（Ｚ）−３−アミノ−３−（４−アミノフェニルチオ）−２−（２−（トリフルオロメチル）フェニル）アクリロニトリル（「ＳＬ−３２７」）（Chen, Operana et al. 2005）、（２Ｚ，３Ｚ）−２，３−ビス（アミノ（２−アミノフェニルチオ）メチレン）スクシノニトリル，エタノール（「Ｕ０１２６」）（Favata, Horiuchi et al. 1998）、（Ｒ）−３−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４，７（３Ｈ，８Ｈ）−ジオン（「ＴＡＫ−７３３」）（Dong, Dougan et al. 2011）、およびＮ−（３−（３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリジン−１（２Ｈ）−イル）フェニル）アセトアミド（「トラメチニブ」）（Gilmartin, Bleam et al. 2011）であり得るが、これらに限定されない。ＲＴＫを阻害する薬剤は、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］−４−キナゾリンアミン（「ゲフィチニブ」）（Ciardiello 2000）、（Ｅ）−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２−プロペンアミド（「ＡＧ９９」）（Gazit, Yaish et al. 1989）、４−［［（２Ｓ）−２−（３−クロロフェニル）−２−ヒドロキシエチル］アミノ］−３−［７−メチル−５−（４−モルホリニル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−２（１Ｈ）−ピリジノン（「ＢＭＳ５３６９２４」）（Huang, Greet et al. 2009）、５−（２−フェニル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−３−オール（「ＦＲ１８０２０９」）（Anastassiadis, Duong-Ly et al. 2013）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン塩酸（「エルロチニブ」）（Kuiper, Heideman et al. 2014）、（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）キナゾリン−６−イル）−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エンアミド（「アファチニブ」）（Minkovsky and Berezov 2008）、Ｎ−（４−（３−フルオロベンジルオキシ）−３−クロロフェニル）−６−（５−（（２−（メチルスルホニル）エチルアミノ）メチル）フラン−２−イル）キナゾリン−４−アミン，ジ４−メチルベンゼンスルホネート（「ラパチニブ」）（Xia, Mullin et al. 2002）、Ｎ−（３−（５−クロロ−２−（２−メトキシ−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミノ）ピリミジン−４−イルオキシ）フェニル）アクリルアミド（「ＷＺ４００２」）（Sakuma, Yamazaki et al. 2012）、および２−［（３，４−ジヒドロキシフェニル）メチレン］−（「ＡＧ−１８」、プロパンジニトリル）（Gazit, Yaixh et al. 1989）であり得るが、これらに限定されない。

【0101】

本発明の細胞培養溶液および細胞培養系は、再生目的のために移植可能な上皮を含む３次元組織構築物を形成するためにさらに使用され得る。かかる組織構築物は、当該分野で公知の方法（Lloyd et al. 2006; Gupta et al. 2006; Yui et al. 2012）に従って宿主に移植され得る。治療に感受性の組織は、疾患、損傷、外傷、自己免疫反応、またはウイルスもしくは細菌感染によって損傷したかもしれない損傷組織を含む全ての損傷組織を含む。画像誘導技術を含む最小の侵襲性の移植技術が使用され得る。組織構築物は、損傷組織に直接注入または移植され得、該損傷組織で、組織構築物は、体内の位置に応じて、増殖し、最終的には、必要とされる細胞型に分化し得る。組織構築物は、結腸浣腸を介して直接移植されるか、または注入され得る。上部腸適用のために経口送達の前に、微粉化が使用され得る。従って、修復に特に良好に適した損傷組織は、結腸、小腸、膵臓、食道および胃の系の組織を含む。当業者は、どの組織構築物の適切な損傷が治療されるべき特定の状態に適しているかを認識する。

【0102】

本発明の細胞培養溶液および細胞培養系は、化学療法剤または化学療法剤の組み合わせのインビボでの効能を予測するためにさらに使用され得る。かかる方法は、多くの患者が複数の薬物で治療されるので、臨床設定における使用に特に関連する。

【0103】

腫瘍類臓器体は、単離された腫瘍細胞凝集体または単一の細胞を本発明の培養溶液中で培養することによって、当該分野で公知の方法に従って形成され得る（Sato et al., 2011a）。かかる培養は、前立腺癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、脳の癌、結腸癌、腸の癌、および膀胱癌を非限定的に含む種々の癌に対する臨床モデルとして使用され得る。

【0104】

腫瘍類臓器体は、本発明の細胞培養溶液（例えば、ＢＭＰのインヒビター、Ｒ−スポンジン１、Ｗｎｔアゴニスト、ヒストンデアセチラーゼインヒビターを含む）および１つまたは複数の化学療法剤の存在下でインキュベートされ得る。次いで、関連するパラメータが測定され、評価される。関連するパラメータとしては、細胞生存能力の阻害、細胞増殖の阻害（inhibition cell proliferation）、腫瘍関連遺伝子発現の阻害、アポトーシスの活性化、および細胞生存の阻害が挙げられる。参照（例えば、対照）と比べてのパラメータの増大の検出は、腫瘍類臓器体に関する化学療法剤の効能を示し、これは、インビボでの１つまたは複数の化学療法剤の効能を予測させる。

【0105】

一般的に、化学療法剤は、治療に役立つ（therapeutic）と見積もられた用量範囲で、生理学的効果を生じるのに十分な持続時間の間、腫瘍類臓器体を含む細胞培養系とインキュベートされる。インキュベーション時間は、約１時間〜２４時間の範囲にわたり得るか、または必要な場合、数日または数週さえにもわたり得る。インキュベーション条件は、典型的には、本発明の培養溶液を使用すること、および約３７℃の温度で維持することを含む。

【0106】

化学療法剤は、被験体の癌を治療（cure）、緩和、治療（treat）、または予防するその能力について評価された任意の物質であり、化学的化合物、生物学的薬剤、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、多糖類、サプリメント、および抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0107】

腫瘍関連遺伝子発現の阻害は、当該分野で公知の方法に従って決定され得る。例えば、対照に比べての腫瘍関連遺伝子発現の阻害は、マイクロチップ分析、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、またはノーザン分析によって検出され得る。対照に比べての腫瘍関連タンパク質発現の阻害は、定量ウェスタンブロット、免疫組織化学、免疫蛍光、酵素標識イムノソルベント検定法、アミノ酸配列分析、蛍光活性化細胞ソーティング、またはタンパク質濃度アッセイによって検出され得る。例えば、胃癌遺伝子スクリーニングアッセイは、アンジオテンシン、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、セルロプラスミン、プロトロンビン、フィブロネクチン、ビタミンＤ結合タンパク質、ゲルゾリン、インターα−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ３、キニノーゲン−１、血清パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼ１、α−１−アンチキモトリプシン、およびトランスチレチンについての遺伝子発現の変化を同定するために使用され得る。

【0108】

アポトーシスの活性化は、当該分野で公知の方法に従って決定され得る。例えば、対照に比べての細胞死の増加は、乳酸デヒドロゲナーゼの放出、カスパーゼ活性、アネキシンＶ染色、ホスファチジルセリン染色、またはＴＵＮＥＬアッセイによって検出され得る。特定のアッセイは、乳酸デヒドロゲナーゼの放出等の細胞死のプロセスにおける比較的後期の事象を検出する。カスパーゼ活性化は、慢性毒性および細胞死の共通の特徴である。カスパーゼ活性は、蛍光顕微鏡法によって、毒性の傷害の後比較的迅速に（３０分〜４時間）測定され得、従って、ハイスループットスクリーニング技術に向いている。細胞のアポトーシスまたは壊死のモニタリングに一般に使用される他のマーカーおよびアッセイとしては、影響を受けた細胞の細胞膜の外葉（outer leaflet）上のホスファチジルセリンの存在、アネキシンＶ染色、およびターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼニック−末端標識アッセイ（ＴＵＮＥＬ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0109】

細胞生存能力の阻害は、トリパンブルー、４，６−ジアミノフェニルインドール（ＤＡＰＩ）、およびヨウ化プロピジウム等の生命色素（vital dye）を使用する生存細胞および死細胞の示差計数（differential counting）を非限定的に含む当該分野で公知の方法に従って決定され得る。

【0110】

細胞増殖の阻害は、ブロモデオキシウリジン取り込みを介するＤＮＡの定量、トリチウム化チミジン（３Ｈ−チミジン）の測定、ヨウ化プロピジウム染色、テトラゾリウム塩またはアラマーブルー（AlamarBlue）還元を介する細胞内代謝分析、および細胞内ＡＴＰ濃度の定量を非限定的に含む当該分野で公知の方法に従って決定され得る。さらなる方法は、分光測光分析を介する溶解細胞の全核酸含量の直接測定；抗−ｃｄｃ６−ペプチド抗体、抗−ヒトｍＲＮＡ結合タンパク質ＨｕＲ抗体（抗ＨｕＲ抗体）、Ｄサイクリンに対する抗体およびサイクリン依存性キナーゼインヒビター阻害剤に対する抗体を用いる蛍光タグ法；Ｋｉ−６７抗原検出；定量ウェスタンブロット、免疫組織化学、免疫蛍光、酵素標識イムノソルベント検定法、アミノ酸配列分析、蛍光活性化細胞ソーティング、またはタンパク質濃度アッセイを介するタンパク質含量の測定を含む。上記方法を使用する市販のキットとしては、ChromaTide^TMヌクレオチド標識、カルボキシフルオレセインジアセテートのスクシンイミジルエステル、ABSOLUTE-S^TM SBIP細胞増殖アッセイキット、Vybrant DiI細胞標識溶液、CyQUANT細胞増殖アッセイキット、Vybrant^TM MTT細胞増殖アッセイキット、およびFluoReporter^TMブルー蛍光測定核酸アッセイキットが挙げられる。

【0111】

細胞生存の抑制は、試験管内腫瘍細胞感受性試験（clonogenic assay）を含む当該分野で公知の方法に従って決定され得る。

【0112】

ＩＩＩ．インビボで上皮細胞の増殖または上皮組織の成長を促進する方法
腸、胃、肺、膵臓および結腸の幹細胞、ならびに、特に、腸、内耳、脳、腎臓、肝臓、網膜、胃、膵臓、乳房、毛包、卵巣、副腎髄質、皮膚、胸腺、味蕾、および乳腺内に存在するＬＧＲ５陽性幹細胞を含む上皮幹細胞は、Ｗｎｔアゴニストおよびヒストンデアセチラーゼインヒビター、またはＷｎｔアゴニストおよびノッチアゴニストを被験体に投与することによってインビボで増殖され得る。これらの組み合わせは、上皮細胞の増殖を促進し、インビボで上皮組織の成長を生じる。

【0113】

特定の態様において、腸上皮細胞は、Ｗｎｔアゴニスト、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１およびヒストンデアセチラーゼインヒビター、例えば、バルプロ酸、またはＷｎｔアゴニスト、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１およびノッチアゴニストを被験体に投与した後にインビボで形成され得る。

【0114】

いくつかの態様において、これらの組み合わせ、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１およびバルプロ酸は、被験体において、腸炎（enterocolitis）；非特異的腸炎（enteritis）または特異的ウイルス性腸炎などのウイルス感染；憩室炎；サルモネラ症、細菌性赤痢、カンピロバクター腸炎またはエルシニア腸炎等の細菌性腸炎；アメーバ症等の原生動物感染；寄生虫感染；ならびに嚢胞性線維症および慢性閉塞性肺疾患における偽膜性腸炎および肺の合併症；虫垂炎；萎縮性胃炎；バレット食道；肺炎；子宮頸管炎；慢性間質性腎炎；結腸炎；大腸憩室炎；結膜炎；接触皮膚炎；カーリング潰瘍；クッシング潰瘍；膀胱炎；壊疽；歯肉炎；乳腺炎；食道炎；膵炎；皮下脂肪組織炎；フレグモーネ性胃炎；糸球体腎炎；ならびに非限定的に、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、アディソン病および糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）を含む自己免疫疾患を非限定的に含む腸の疾患を治療し得る。

【0115】

投与される投薬量は、年齢、性別、健康状態、およびレシピエントの体重、もしあれば同時の治療の種類、治療の頻度、ならびに所望される効果の性質に依存する。本発明の組成物の投与のための用量範囲は、所望の効果を生じるのに十分大きい用量範囲である。用量は、例えば、所望されない交差反応、アナフィラキシー反応等の有害な副作用を生じるほどには大きくないものであるべきである。一般的に、投薬量は、患者の状態および疾患の程度によって変化する。もしあれば禁忌、免疫寛容、および他の変数もまた、適切な投薬量に影響する。例えば、患者の年齢、体重、性別、種、一般的な健康状態／状態、治療対象の状態、治療のタイミング、適切な動物モデル（例えば、齧歯類、マウス）において関与する活性成分のＬＤ５０、および他の公知の因子のような因子を考慮に入れる場合、かかる投薬量は、０．５〜５００ｍｇ／ｋｇの程度等のマイクログラム〜ミリグラムの程度もしくは別の適切な量であり得るか、または本明細書中の実施例から、例えば、典型的な試験動物（例えば、マウス）の平均重量および該試験動物に投与される投薬量（例えば、１００マイクログラム）を考慮して計算し得、従って、当業者は、過度の実験なしに投薬量を決定し得る。特に、ヒトの被験体では、ＣＨＩＲ９９０２１は、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与され、バルプロ酸の量は、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与される。特定の態様において、バルプロ酸の量は、１５〜４０ｍｇ／ｋｇ／日である。

【0116】

ＣＨＩＲ９９０２１およびバルプロ酸の医薬組成物は、その意図される目的を達成する任意の手段によって、同時にまたは連続的に投与され得る。例えば、投与は、局所、非経口、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、経皮、直腸、または頬側の経路により得る。代替的にまたは同時に、投与は経口経路により得る。前記記載から、変形および改変が、本明細書中に記載される本発明になされ得、本発明を種々の使用および条件に採用することは明らかである。方法および物質は、本発明における使用のために本明細書に記載され；当該分野で公知の他の適切な方法および物質もまた使用され得る。物質、方法、および実施例は、例示のみであり、限定することを意図しない。かかる態様は、添付の特許請求の範囲の範囲内でもある。本明細書中の変数の任意の定義中の要素のリストの詳説は、リストされる要素の任意の単一の要素または組み合わせ（またはサブコンビネーション）として該変数の定義を含む。本明細書中の態様の詳説は、任意の単一の態様または任意の他の態様もしくはその一部との組み合わせとしての態様を含む。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースの記載事項、および他の参考文献は、それらの全体が参照によって本明細書に援用される。

【0117】

本発明の例示的な態様は、以下の番号を付したパラグラフのいずれか１つによっても記載され得る：
１．少なくとも１つのＷｎｔインヒビターおよび少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼインヒビターの存在下で上皮幹細胞をインキュベートする工程、ここで、各々は、細胞培養系中で腸細胞を生成するのに十分な量である、
を含む、細胞培養系中で腸細胞を形成する方法。
２．ヒストンデアセチラーゼインヒビターがＰａｎ−ＨＤＡＣインヒビターである、パラグラフ１記載の方法。
３．Ｐａｎ−ＨＤＡＣインヒビターが、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、およびＳＢＨＡからなる群より選択される、パラグラフ２記載の方法。
４．ヒストンデアセチラーゼインヒビターがＨＤＡＣ６インヒビターである、パラグラフ１記載の方法。
５．ＨＤＡＣ６インヒビターが、ツバシン、ツバスタチンＡ、およびコンパウンド７からなる群より選択される、パラグラフ４記載の方法。
６．Ｗｎｔインヒビターが、ＩＷＰ−２、ＸＡＶ−９３９、ＩＣＧ−００１、ＬＧＫ−９７４、ＩＷＲ−１−エンド、ＫＹ０２１１１、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＤＫＫ−１、ＦＨ−５３５、Ｂｏｘ５、ペプチドＰｅｎ−Ｎ３、抗ＳＦＲＰ抗体、および抗ＬＲＰ６抗体からなる群より選択される、パラグラフ１記載の方法。
７．骨形成因子のインヒビターの存在下で上皮幹細胞をインキュベートする工程をさらに含む、パラグラフ１記載の方法。
８．骨形成因子が、ノギン、コーディン、フォリスタチン、ＤＡＮ、ＤＡＮシステイン−ノットドメインを含むタンパク質、スクレロスチン、ねじれ原腸形成、子宮感受性関連遺伝子−１、結合組織成長因子、インヒビン、ＢＭＰ−３、およびドルソモルフィンからなる群より選択される、パラグラフ７記載の方法。
９．上皮増殖因子の存在下で上皮幹細胞をインキュベートする工程をさらに含む、パラグラフ１記載の方法。
１０．少なくとも１つのＷｎｔインヒビターおよび少なくとも１つのノッチインヒビターの存在下で上皮幹細胞をインキュベートする工程、ここで、各々は、細胞培養系中で杯細胞を生成するのに十分な量である、
を含む、細胞培養系中で杯細胞を形成する方法。
１１．ノッチインヒビターが、ＤＡＰＴ、ＲＯ４９２９０９７、ＬＹ４５０１３９、ＬＹ９００００９、ＬＹ３０３９４７８、ＬＹ４１１５７５、ＹＯ−０１０２７、ＢＭＳ−７０８１６３、ＢＭＳ−９０６０２４、コンパウンドＥ、ＢＭＳ−２９９８９７、ＳＡＨＭ１、Ａβ４２−セレクティブ、およびＳＢ２２５００２からなる群より選択される、パラグラフ１０記載の方法。
１２．Ｗｎｔインヒビターが、ＩＷＰ−２、ＸＡＶ−９３９、ＩＣＧ−００１、ＬＧＫ−９７４、ＩＷＲ−１−エンド、ＫＹ０２１１１、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＤＫＫ−１、ＦＨ−５３５、Ｂｏｘ５、ペプチドＰｅｎ−Ｎ３、抗ＳＦＲＰ抗体、抗ＬＲＰ６抗体、および抗ＡＰＣ抗体からなる群より選択される、パラグラフ１０記載の方法。
１３．上皮増殖因子の存在下で上皮幹細胞をインキュベートする工程をさらに含む、パラグラフ１０記載の方法。
１４．ノッチの少なくとも１つのインヒビターおよびレセプターチロシンキナーゼ、マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼまたは細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）の少なくとも１つを阻害する薬剤の存在下で上皮幹細胞をインキュベートする工程、ここで、各々は、細胞培養系中で腸内分泌細胞を生じるのに十分な量である、
を含む、培養系中で腸内分泌細胞を形成する方法。
１５．ノッチインヒビターが、ＤＡＰＴ、ＲＯ４９２９０９７、ＬＹ４５０１３９、ＬＹ９００００９、ＬＹ３０３９４７８、ＬＹ４１１５７５、ＹＯ−０１０２７、ＢＭＳ−７０８１６３、ＢＭＳ−９０６０２４、コンパウンドＥ、ＢＭＳ−２９９８９７、ＳＡＨＭ１、Ａβ４２−セレクティブ、およびＳＢ２２５００２からなる群より選択される、パラグラフ１４記載の方法。
１６．ＭＡＰキナーゼが、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）である、パラグラフ１４記載の方法。
１７．ＭＡＰキナーゼを阻害する薬剤が、ＡＳ−７０３０２６、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ９８０５９、セルメチニブ、ＳＬ−３２７、Ｕ０１２６、ＴＡＫ−７３３、およびトラメチニブからなる群より選択される、パラグラフ１４記載の方法。
１８．ＲＴＫを阻害する薬剤が、ゲフィチニブ、ＡＧ９９、エルロチニブ、アファチニブ、ラパチニブ、ＷＺ４００２、およびＡＧ−１８からなる群より選択される、パラグラフ１４記載の方法。
１９．ＥＲＫを阻害する薬剤が、ＡＳ−７０３０２６またはＰＤ０３２５９０１である、パラグラフ１４記載の方法。
２０．骨形成因子のインヒビターの存在下で上皮幹細胞をインキュベートする工程をさらに含む、パラグラフ１４記載の方法。
２１．骨形成因子が、ノギン、コーディン、フォリスタチン、ＤＡＮ、ＤＡＮシステイン−ノットドメインを含むタンパク質、スクレロスチン、ねじれ原腸形成、子宮感受性関連遺伝子−１、結合組織成長因子、インヒビン、ＢＭＰ−３、およびドルソモルフィンからなる群より選択される、パラグラフ２０記載の方法。
２２．ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役レセプター５に結合する薬剤の存在下で上皮幹細胞をインキュベートする工程をさらに含む、パラグラフ１４記載の方法。
２３．ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役レセプター５に結合する薬剤が、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、およびＲ−スポンジン４からなる群より選択される、パラグラフ２２記載の方法。
２４．上皮増殖因子の存在下で上皮幹細胞をインキュベートする工程をさらに含む、パラグラフ１４記載の方法。
２５．被験体に、Ｗｎｔアゴニストおよびヒストンデアセチラーゼインヒビターを、該被験体において腸上皮細胞を形成するのに十分な量で投与する工程を含む、腸上皮細胞の形成が必要な被験体において腸上皮細胞を形成する方法。
２６．被験体がヒトである。パラグラフ２５記載の方法。
２７．Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔ−１／Ｉｎｔ−１、Ｗｎｔ−２／Ｉｒｐ（Ｉｎｔ−Ｉ関連タンパク質）、Ｗｎｔ−２ｂ／１３、Ｗｎｔ−３／Ｉｎｔ−４、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−５ｂ、Ｗｎｔ−６、Ｗｎｔ−７ａ、Ｗｎｔ−７ｂ、Ｗｎｔ−８ａ／８ｄ、Ｗｎｔ−８ｂ、Ｗｎｔ−９ａ／１４、Ｗｎｔ−９ｂ／１４ｂ／１５、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−１０ｂ／１２、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−１６、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、Ｒ−スポンジン４、ノリン、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬｉＣｌ、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、ＣＨＩＲ９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、３Ｆ８、ケンパウロン、１−アザケンパウロン、ＴＣ−Ｇ２４、ＴＣＳ２００２、ＡＲ−Ａ０１４４１８、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジル−アミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン、ＩＱ１、ＤＣＡ、ＱＳ１１、ＷＡＹ−３１６６０６、（ヘテロ）アリールピリミジン、１０Ｚ−ヒメニアルジシン、ＴＣＳ２１３１１、ＴＷＳ１１９、ＧＳＫ−３インヒビターＩＸ、ＧＳＫ−３インヒビターＩＶ、ＧＳＫ−３βインヒビターＩＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＸＸＶＩＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＸＸＶＩ、ＦＲＡＴtide、Ｃｄｋ１／５インヒビター、ビキニン、および１−アザケンパウロンからなる群より選択される、パラグラフ２５記載の方法。
２８．ヒストンデアセチラーゼインヒビターがＰａｎ−ＨＤＡＣインヒビターである、パラグラフ２５記載の方法。
２９．Ｐａｎ−ＨＤＡＣインヒビターが、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、およびＳＢＨＡからなる群より選択される、パラグラフ２８記載の方法。
３０．ヒストンデアセチラーゼインヒビターがＨＤＡＣ６インヒビターである、パラグラフ２５記載の方法。
３１．ＨＤＡＣ６インヒビターが、ツバシン、ツバスタチンＡ、およびコンパウンド７からなる群より選択される、パラグラフ３０記載の方法。
３２．ＷｎｔアゴニストがＣＨＩＲ９９０２１であり、ヒストンデアセチラーゼインヒビターがバルプロ酸である、パラグラフ２５記載の方法。
３３．ＣＨＩＲ９９０２１が、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与され、バルプロ酸が、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与される、パラグラフ３２記載の方法。
３４．被験体に、Ｗｎｔアゴニストおよびヒストンデアセチラーゼインヒビター、またはＷｎｔアゴニストおよびノッチアゴニストを、上皮組織内で上皮幹細胞が増加するのに十分な量で投与し、それによって、被験体内で上皮組織が生成する工程を含む、上皮組織の生成が必要な被験体において上皮組織を生成する方法。
３５．上皮幹細胞が、腸、内耳、脳、腎臓、肝臓、網膜、胃、膵臓、乳房、毛包、卵巣、副腎髄質、皮膚、胸腺、味蕾、または乳腺内に存在するＬＧＲ５陽性幹細胞である、パラグラフ３４記載の方法。
３６．被験体に、Ｗｎｔアゴニストおよびノッチアゴニストを、該被験体において腸上皮細胞を形成するのに十分な量で投与する工程を含む、腸上皮細胞の形成が必要な被験体において腸上皮細胞を形成する方法。
３５．被験体がヒトである、パラグラフ３４または３６記載の方法。
３６．Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔ−１／Ｉｎｔ−１、Ｗｎｔ−２／Ｉｒｐ（Ｉｎｔ−Ｉ関連タンパク質）、Ｗｎｔ−２ｂ／１３、Ｗｎｔ−３／Ｉｎｔ−４、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−５ｂ、Ｗｎｔ−６、Ｗｎｔ−７ａ、Ｗｎｔ−７ｂ、Ｗｎｔ−８ａ／８ｄ、Ｗｎｔ−８ｂ、Ｗｎｔ−９ａ／１４、Ｗｎｔ−９ｂ／１４ｂ／１５、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−１０ｂ／１２、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−１６、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、Ｒ−スポンジン４、ノリン、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬｉＣｌ、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、ＣＨＩＲ９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、３Ｆ８、ケンパウロン、１−アザケンパウロン、ＴＣ−Ｇ２４、ＴＣＳ２００２、ＡＲ−Ａ０１４４１８、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジル−アミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン、ＩＱ１、ＤＣＡ、ＱＳ１１、ＷＡＹ−３１６６０６、（ヘテロ）アリールピリミジン、１０Ｚ−ヒメニアルジシン、ＴＣＳ２１３１１、ＴＷＳ１１９、ＧＳＫ−３インヒビターＩＸ、ＧＳＫ−３インヒビターＩＶ、ＧＳＫ−３βインヒビターＩＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＸＸＶＩＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＸＸＶＩ、ＦＲＡＴtide、Ｃｄｋ１／５インヒビター、ビキニン、および１−アザケンパウロンからなる群より選択される、パラグラフ３４または３６記載の方法。
３７．ノッチアゴニストが、ノッチ１抗体（Ｎ１ Ａｂ）、デルタ１、デルタ様３、デルタ様４、ジャグド１、ジャグド２、ＤＳＬペプチド、およびデルタＤである、パラグラフ３４または３６記載の方法。
３８．被験体に、Ｗｎｔアゴニストおよびヒストンデアセチラーゼインヒビター、またはＷｎｔアゴニストおよびノッチを投与する工程を含む、腸障害の治療方法。
３９．被験体がヒトである。パラグラフ３８記載の方法。
４０．Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔ−１／Ｉｎｔ−１、Ｗｎｔ−２／Ｉｒｐ（Ｉｎｔ−Ｉ関連タンパク質）、Ｗｎｔ−２ｂ／１３、Ｗｎｔ−３／Ｉｎｔ−４、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−５ｂ、Ｗｎｔ−６、Ｗｎｔ−７ａ、Ｗｎｔ−７ｂ、Ｗｎｔ−８ａ／８ｄ、Ｗｎｔ−８ｂ、Ｗｎｔ−９ａ／１４、Ｗｎｔ−９ｂ／１４ｂ／１５、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−１０ｂ／１２、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−１６、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、Ｒ−スポンジン４、ノリン、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬｉＣｌ、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、ＣＨＩＲ９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、３Ｆ８、ケンパウロン、１−アザケンパウロン、ＴＣ−Ｇ２４、ＴＣＳ２００２、ＡＲ−Ａ０１４４１８、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジル−アミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン、ＩＱ１、ＤＣＡ、ＱＳ１１、ＷＡＹ−３１６６０６、（ヘテロ）アリールピリミジン、１０Ｚ−ヒメニアルジシン、ＴＣＳ２１３１１、ＴＷＳ１１９、ＧＳＫ−３インヒビターＩＸ、ＧＳＫ−３インヒビターＩＶ、ＧＳＫ−３βインヒビターＩＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＸＸＶＩＩ、ＧＳＫ−３βインヒビターＸＸＶＩ、ＦＲＡＴtide、Ｃｄｋ１／５インヒビター、ビキニン、および１−アザケンパウロンからなる群より選択される、パラグラフ３８記載の方法。
４１．ヒストンデアセチラーゼインヒビターがＰａｎ−ＨＤＡＣインヒビターである、パラグラフ３８記載の方法。
４２．Ｐａｎ−ＨＤＡＣインヒビターが、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、およびＳＢＨＡからなる群より選択される、パラグラフ４１記載の方法。
４３．ヒストンデアセチラーゼインヒビターがＨＤＡＣ６インヒビターである、パラグラフ３８記載の方法。
４４．ＨＤＡＣ６インヒビターが、ツバシン、ツバスタチンＡ、およびコンパウンド７からなる群より選択される、パラグラフ４３記載の方法。
４５．ＷｎｔアゴニストがＣＨＩＲ９９０２１であり、ヒストンデアセチラーゼインヒビターがバルプロ酸である、パラグラフ３８記載の方法。
４６．ＣＨＩＲ９９０２１が、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与され、バルプロ酸が、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与される、パラグラフ４５記載の方法。
４７．ノッチアゴニストが、ノッチ１抗体（Ｎ１ Ａｂ）、デルタ１、デルタ様３、デルタ様４、ジャグド１、ジャグド２、ＤＳＬペプチド、およびデルタＤである、パラグラフ３８記載の方法。
４８．腸障害が、腸炎（enterocolitis）；非特異的腸炎（enteritis）または特異的ウイルス性腸炎等のウイルス感染；憩室炎；サルモネラ症、細菌性赤痢、カンピロバクター腸炎またはエルシニア腸炎等の細菌性腸炎；アメーバ症等の原生動物感染；寄生虫感染；ならびに嚢胞性線維症および慢性閉塞性肺疾患における偽膜性腸炎および肺の合併症；虫垂炎；萎縮性胃炎；バレット食道；肺炎；子宮頸管炎；慢性間質性腎炎；結腸炎；大腸憩室炎；結膜炎；接触皮膚炎；カーリング潰瘍；クッシング潰瘍；膀胱炎；壊疽；歯肉炎；乳腺炎；食道炎；膵炎；皮下脂肪組織炎；フレグモーネ性胃炎；糸球体腎炎；ならびに非限定的に、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、アディソン病および糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）を含む自己免疫疾患からなる群より選択される、パラグラフ３８〜４７いずれか記載の方法。

【0118】

本発明は、以下の実施例にさらに記載され、該実施例は、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定しない。

【実施例】

【0119】

実施例１：Ｌｇｒ５^＋腸幹細胞の自己複製は、小分子の組み合わせを使用して維持される
ＩＳＣの自己複製および分化は、いくつかのシグナル伝達経路の調和した調節によって制御される（Crosnier, Stamataki, & Lewis, 2006; Scoville, Sato, He, & Li, 2008; van der Flier & Clevers, 2009）。本研究において、Ｌｇｒ５^＋幹細胞の自己複製状態を維持するための関連するシグナル伝達経路および他の細胞型によって提供される合図（cue）とは独立してＬｇｒ５^＋幹細胞の分化を調節するための関連するシグナル伝達経路を標的化する小分子を同定した。

【0120】

陰窩および単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ細胞を、以前に記載されるとおりに単離した（Sato et al., 2009）。簡単に、小腸の近位の半分を採取し、長さ方向に開き、冷ＰＢＳで洗浄し、管腔内含有物を除去した。次いで、組織を、ハサミで２〜４ｍｍ片に切断し、１０ｍｌピペットを使用してピペットで吸ったり出したりする（pipet up and down）ことによって、冷ＰＢＳで５〜１０回さらに洗浄した。組織断片を、氷上で３０分間、ＰＢＳ中の２ｍＭ ＥＤＴＡとインキュベートした。ＥＤＴＡの除去の後、組織断片を、ＰＢＳで洗浄し、陰窩を放出させた。陰窩が濃縮されている上清画分を回収し、７０μｍのセルストレーナーに通し、３００ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、増殖因子を有さない細胞培養培地に再懸濁し、１５０ｇで遠心分離し、単一の細胞を除去した。次いで、陰窩を単一の細胞の単離のために培養または使用した。単一の細胞を得るために、陰窩を３７℃で４５分間培養培地中でインキュベートし、ガラスピペットで粉砕した。分離した細胞を、２０μｍのセルストレーナーに通し、ヨウ化プロピジウムで陰性染色し、単一の可視の高ＧＦＰ細胞を、以前に記載されるとおりに、フローサイトメトリー（FACS Aria, BD）によってソーティングした（Sato et al., 2009）。Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ＣｒｅＥＲＴ２マウスから単離した小腸陰窩を、マトリゲルに植え込み、ＥＧＦ、ノギン、およびＲ−スポンジン１（まとめて、ＥＮＲという）の存在下で従来の培養条件下で培養し、陰窩および絨毛様ドメインならびに陰窩の先にＧＦＰ^＋細胞を有する類臓器体を生じ、これは、以前の報告と一致した（Sato et al., 2009）。単離した陰窩または単一の細胞を、最小限の改変を伴って、以前に記載されるとおりに培養した（Sato et al., 2009）。簡単に、陰窩または単一の細胞を、マトリゲル中に閉じ込め、２４ウェルプレートのウェルの中心にプレーティングした。マトリゲル（増殖因子低減；BD Bioscience）の重合後、ＥＧＦ（50ng/ml, Life Technologies）、ノギン（100ng/ml, Peprotech）およびＲ−スポンジン１（500ng/ml, R&D）を含む増殖因子ならびにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ、Stemgent）およびバルプロ酸（１ｍＭ、Sigma-Aldrich）を含む小分子を含む５００μｌの培養培地（アドバンストDMEM/F12（Life Technologies））を添加した。異なる培養条件との比較のために、小分子または増殖因子を、新たに単離された陰窩に、マトリゲル中にプレーティングされた直後に添加し、陰窩内のＩＳＣの潜在的な分化を最小にし、かつこのようにして陰窩培養を維持する能力を試験した。細胞培養培地を、１日おきに交換した。単一の細胞培養のために、細胞を、ジャグド−１ペプチド（１μＭ；AnaSpec）を含むマトリゲルに植え込み、Ｙ−２７６３２（１０μＭ；Tocris）を最初の２日間添加した。細胞を、以前に記載されるとおりに（Sato et al., 2009）細胞コロニーとして、または単一の細胞としてのいずれかで継代した。単一の細胞の継代のために、細胞培養培地を、除去し、アキュターゼ（Life Technologies）を添加した。３７℃での１０〜２０分間のインキュベーションの後、細胞コロニーを、ピペッティングにより単一の細胞に分離した。次いで、細胞を、洗浄し、新しいマトリゲル中に植え込み、２４ウェルプレートにプレーティングした。ＣＶ条件で培養した細胞を、６日毎に１：２０の継代比率（split ratio）で継代した。培養した陰窩のほぼ半分が、ＧＦＰ＋細胞を含み、これは、Ｌｇｒ５−ＧＦＰマウスのインビボＧＦＰ発現と一致した（図１）。

【0121】

ＥＮＲ条件で使用した増殖因子は、必須のものを提供するが、Ｌｇｒ５^＋幹細胞の自己複製の維持には十分な合図ではなかった。腸幹細胞の自己複製状態の維持に必須の因子を同定するために、Ｗｎｔ、ノッチ、およびＢＭＰなどのＩＳＣのシグナル伝達経路を調節する選択された小分子を、Ｌｇｒ５−ＧＦＰレポーターを使用してＥＮＲ条件下で試験した。Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化するＧＳＫ３βインヒビターであるＣＨＩＲ９９０２１（本明細書中ＣＨＩＲまたはＣという）は、培養物中の類臓器体の平均サイズおよび細胞数の定量化によって示されるように、陰窩細胞の増殖を促進した（図２Ａ、２Ｂおよび３Ａ、３Ｂ）。ＣＨＩＲは、培養物中のＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージおよび相対ＧＦＰ強度を増大させ、これは、幹細胞の自己複製の増大を示した（図２Ａおよび２Ｂ）。特に、多くの数のＧＦＰ陰性細胞が、まだ、類臓器体中に存在し（図２Ａ）、これは、幹細胞自己複製の不十分な維持の結果または陰窩中のより成熟したＧＦＰ陰性細胞の増殖の促進の結果のようであった。ヒストンデアセチラーゼインヒビターであるバルプロ酸（ＶＰＡまたはＶ）もまた、ＧＦＰ^＋類臓器体のＧＦＰ発現を有意に増大させ、ＧＦＰ陰性細胞は最小の存在であった（図２Ａ）。興味深いことに、ＣＨＩＲおよびＶＰＡが組み合わされた場合（ＣＶ）、培養物中の細胞増殖ならびにＧＦＰ発現細胞のパーセンテージおよび相対ＧＦＰ強度は、有意に増大し（図２Ａおよび２Ｂ）、ＧＦＰ^＋類臓器体中にほぼ純粋なＧＦＰ^＋細胞が存在し（図２Ａ）、これは、この培養条件では、分化または分化した細胞の増殖が最小であり、幹細胞の自己複製が増大したことを示した。

【0122】

ＣＶ条件でのＧＦＰ^＋細胞は、新たに単離された単一の細胞の単一の高ＧＦＰ集団に対応する単一の高ＧＦＰ集団を示し（図３Ｃ）、以前に報告されたＬｇｒ５^＋幹細胞集団を示した（Sato et al., 2009）。特に、ＣＶ条件では、Ｒ−スポンジン１およびノギンが、Ｌｇｒ５^＋幹細胞の自己複製を維持するためになお必要であったが、ＥＧＦは陰窩の増殖を促進し、ＥＧＦは、Ｌｇｒ５^＋細胞の維持に影響を与えることなく、培養から除去され得た（図３Ｄ）。ＣＨＩＲの濃度を増大させることによって、ＧＦＰ発現を促進するためのＲ−スポンジン１の必要性をさらに排除し（図３Ｅ）、Ｒ−スポンジン１のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を増大させる役割と一致した。さらに、ＶＰＡまたはＣＨＩＲ＋ＶＰＡはまた、結腸由来のＬｇｒ５^＋幹細胞のＧＦＰ発現を促進した（図３Ｆ）。さらに、Ｒ−スポンジン２は、Ｒ−スポンジン１と比べてＥＮＲ条件での類臓器体の形成の促進において、より低い濃度で良好な効能を示した（図３Ｇ）。我々はまた、ヒトＥＰＨＢ２^＋結腸幹細胞または結腸陰窩を、ほとんど未分化の状態に維持することが以前に示された培養条件を試験したが（Jung et al., 2011; Sato et al., 2011a）、小腸Ｌｇｒ５−ＧＦＰ幹細胞に対して類似の効果を達成せず（図４Ａおよび４Ｂ）、これらの因子は、Ｌｇｒ５^＋幹細胞と対比して異なる機構によってＥＰＨＢ２^＋結腸幹細胞に作用し得ることが示唆された。

【0123】

成熟細胞型およびＧＦＰ陰性幹細胞（陰窩がモザイク様ＧＦＰ発現パターンを示す場合）の非存在下でのＣＨＩＲおよびＶＰＡの増殖およびＬｇｒ５^＋自己複製効果をさらに確認するために、単一の高ＧＦＰ細胞を、ＦＡＣＳソーティングによって単離し（図３Ｃ）、ＥＮＲおよびＣＨＩＲもしくはＶＰＡの存在下または両方の化合物の存在下（ＣＶ条件）でマトリゲル中で培養した。単一の幹細胞のアノイキス（anoikis）を阻害するＲｈｏキナーゼインヒビターＹ−２７６３２（Watanabe et al., 2007）を、以前に記載されるとおりに最初の２日間添加した（Sato et al., 2009）。７日の培養後、ＧＦＰ^＋幹細胞を含むコロニーが自発的に形成された。陰窩培養と同様に、ＣＨＩＲは、細胞増殖を有意に増大させたが、ＧＦＰ発現を中程度にのみ増大させ、ＶＰＡは、最小の増殖前（pro-proliferative）効果を伴ってＧＦＰ発現を促進した。ＣＶ条件について、細胞増殖は、有意に増大し、培養物中の９７％を超える細胞は、ＧＦＰ^＋細胞であった（図２Ｃ〜２Ｅおよび５Ａ）。陰窩培養に比べて、純粋な単一のＬｇｒ５^＋幹細胞をＣＨＩＲ中で培養した場合、形成された類臓器体は、多数のＧＦＰ陰性細胞を含み、このことは、この条件では幹細胞は分化し、従って、Ｌｇｒ５^＋幹細胞の自己複製状態を維持するために他の因子が必要であったことを示した。

【0124】

単離された単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ^＋細胞を標準的なＥＮＲ条件で培養した場合、わずかな細胞が類臓器体に成長し、このことは、以前の報告と一致し（Sato et al., 2009）、最適状態に及ばない培養条件に起因するようであった。ＣＨＩＲを培養に添加した場合（ＥＮＲ−Ｃ）、コロニー形成効率は、２０〜５０倍有意に増大し（図２Ｆ、２Ｇおよび５Ｂ、５Ｃ）、１００ｎｇ／ｍｌで添加した場合は、Ｗｎｔ３Ａの添加に同様に応答した（図２ＦおよびSato et al., 2011b）。これとはっきりと対照的に、ＶＰＡは、ＣＨＩＲの非存在下でコロニー形成効率を弱く増大させただけであった（ＥＮＲ−Ｖ、図２Ｆ、２Ｇおよび５Ｂ、５Ｃ）。驚くべきことに、単離された単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ^＋幹細胞をＣＨＩＲおよびＶＰＡ両方の存在下で培養した場合、相乗効果があり、全細胞集団の約２５％〜４０％がコロニーに成長した（図２Ｆ）。これは、Ｌｇｒ５^＋幹細胞について報告された最も効率的なコロニー形成を示すと考えられる。

【表1】

【表2】

【0125】

ＦＡＣＳでソーティングされた細胞の一部がアポトーシス前状態下にあり、典型的に１２時間以内に死滅する場合（Sato et al., 2011b）、生存細胞を、播種の１２時間後に手動で計数した。ＣＨＩＲおよびＶＰＡの両方が培養培地に存在した場合、９０％を超える生存細胞が類臓器体に成長した（図５Ｄ）。

【表3】

【0126】

さらに、ＣＶ条件で培養された細胞を、１０を超える継代について、新たに単離されたＬｇｒ５−ＧＦＰ^＋細胞のコロニー形成効率と類似のコロニー形成効率を有し、かつ増殖能力の損失を有さない単一の細胞として継代し得、これらは、正常な核型を示した（２ｎ＝４０）（図２Ｈ）。これらの結果は、ＣＨＩＲおよびＶＰＡがＬｇｒ５^＋幹細胞の自己複製を維持するための、標準的なＥＮＲ条件には存在しないシグナルを提供することを示唆する。

【0127】

以前に報告されたように、ＥＮＲ条件中の細胞は、アルカリ性フォスファターゼ（Ａｌｐ）陽性腸細胞、ムチン２（Ｍｕｃ２）陽性杯細胞、クロモグラニンＡ（ＣｈｇＡ）陽性腸内分泌細胞、リゾチーム（Ｌｙｚ）陽性パーネト細胞、およびＬｇｒ５−ＧＦＰ^＋幹細胞の染色によって確認される全ての腸上皮細胞型を含む陰窩−絨毛構造を有する類臓器体に成長した。Ｌｇｒ５^＋幹細胞は、陰窩の先端にのみ存在する（図６Ａおよび７Ａ）。Ｋｉ６７およびＥｄＵ染色によって、増殖している細胞が陰窩ドメイン内にのみ存在したことが明らかになった（図６Ｂおよび６Ｃ）。しかし、ＣＶ条件において、ＧＦＰ^＋幹細胞は、コロニー全体のいたるところに存在し、パーネト細胞の存在は最小であり（図６Ａ）、他の細胞型は存在しなかった。ＥＮＲ培養に比べて、ＣＶ条件においてＫｉ６７およびＥｄＵ陽性増殖細胞は、細胞コロニーのいたるところに存在した（図６Ｂおよび６Ｃ）。これは、定量的リアルタイムＰＣＲで確認され、ここで、ＣＶ条件中の細胞は、ＥＮＲ条件中の細胞に比べて最小レベルのＡｌｐｉ（腸細胞）、Ｍｕｃ２（杯細胞）、ＣｈｇＡ（腸内分泌細胞）、中程度のレベルのリゾチーム（パーネト細胞）、および高いレベルのＬｇｒ５（ＩＳＣ）を発現した。この発現パターンは、複数の継代にわたって維持され、Ｌｇｒ５発現レベルは維持された（図６Ｄ）。

【0128】

ＣＨＩＲ単独は、腸細胞分化を低減するが、同時にパーネト細胞分化を増大させ（図６Ｄ）、これは、以前の報告と一致した（Farin et al., 2012）。ＶＰＡ単独は、分泌性分化を低減し（図６Ｄ）、高い割合のＧＦＰ＋幹細胞の維持を補助したが、幹細胞の分化の抑制には十分ではない。実際、単離された単一の幹細胞を、ＶＰＡの存在下であるが、ＣＨＩＲまたはＷｎｔシグナル伝達を促進する他の薬剤なしで培養した場合、これらの生存は、Ｗｎｔが存在した場合に比べて、大きく低かった。Ｗｎｔ経路がＩＷＰ−２によってブロックされる場合、ＶＰＡ単独は、幹細胞の自己複製を維持できない（図７Ｂ、７Ｃ中のＩＶ条件）。ＣＨＩＲおよびＶＰＡの組み合わせは、腸細胞分化および分泌性分化の両方を抑制し、Ｌｇｒ５^＋幹細胞の自己複製プログラムを維持した（図６Ｄ）。これらの結果は、ＣＨＩＲまたはＶＰＡの単独はＬｇｒ５^＋幹細胞の自己複製を維持するのに十分ではないが、ＣＨＩＲまたは他のＷｎｔアクチベーターと組み合わせた場合、相乗効果を示すことを示唆する。

【0129】

要約すると、２つの小分子、ＣＨＩＲおよびＶＰＡは、パーネト細胞との直接の接触なしで、またはパーネト細胞の非存在下で、Ｌｇｒ５＋幹細胞の自己複製を支持し得る。特に、これらの小分子は、単一の幹細胞からのコロニー形成を大きく改善し得、このことは、これらの小分子がパーネト細胞によって典型的に提供される必須のニッチ（niche）シグナルを提供することを示す。

【0130】

実施例２：Ｌｇｒ５^＋幹細胞はＣＨＩＲおよびＶＰＡ中での培養後多能性のままである
腸幹細胞は、自己複製する能力、ならびに４つの主な細胞型：腸細胞、杯細胞、腸内分泌細胞およびパーネト細胞を含む腸上皮中の全ての細胞型に分化する能力を有する。ＣＶ条件で培養されたＬｇｒ５^＋幹細胞の分化能力を試験するために、細胞コロニーを、Ｌｇｒ５^＋幹細胞が腸の成熟細胞型に自発的に分化するのを可能にするＥＮＲ条件に移した。予想されるとおり、ＣＨＩＲおよびＶＰＡの回収後、類臓器体の形態は、陰窩先端に陰窩−絨毛構造およびＬｇｒ５^＋幹細胞を有するＥＮＲ条件で培養された類臓器体の典型的な形態に変化した（図７Ａおよび８Ａ）。分化マーカーＡｌｐｉ、Ｍｕｃ２、およびＣｈｇＡのｍＲＮＡ発現は上昇し、細胞は、（図７ＢのＥＮＲおよびＣＶに比べて）同様のレベルのリゾチームを発現した。これらのマーカーに対する免疫細胞化学染色により、培養物中の分化した細胞型の存在が確認された（図７Ａ）。

【0131】

実施例３：腸幹細胞の分化は制御される
次に、インビトロで高純度のＬｇｒ５＋幹細胞に増殖する能力に関して、Ｌｇｒ５^＋幹細胞の分化を成熟細胞型の方に振り向けることを試みた。ＷｎｔおよびノッチがＩＳＣの分化を制御する主なシグナル伝達経路の２つであるので、Ｗｎｔ経路インヒビターＩＷＰ−２（Ｉも同様）およびノッチインヒビターＤＡＰＴ（Ｄも同様）を使用して、培養したＬｇｒ５^＋幹細胞の分化を誘導した。ＥＮＲ条件中の細胞が全ての上皮細胞型を含む類臓器体に自発的に分化するので、ＥＮＲを、分化培地中に含めた。ＣＶ条件での６日間の単一の幹細胞の培養の後、細胞コロニーを、回収し、いくつかのウェルに移し、単一または複数のインヒビターの存在下で培養した（図８Ｂ）。図７Ｂに示されるように、ＣＶをＩＷＰ−２またはＤＡＰＴと入れ替えることによって、ＩＳＣマーカーＬｇｒ５発現が減少し、分化マーカーＡｌｐｉ、Ｍｕｃ２、ＣｈｇＡ、およびリゾチームの発現を誘導した。特に、（例えば、ＲとＶ、ＩとＩＶ、ＣとＣＶ、またはＤとＤＶの比較）ＶＰＡの存在によって、Ｍｕｃ２、ＣｈｇＡ、およびリゾチームの低いレベルの発現が引き起こされ、Ａｌｐｉではそうではなく、このことは、ＶＰＡによって、分泌細胞系統分化を特異的に抑制したことを示した。あるいは、ＩＷＰ−２でのＷｎｔ阻害によって、Ａｌｐｉ発現が優先的に誘導され、Ｍｕｃ２およびＣｈｇＡ発現が中程度に上昇し、リゾチームおよびＬｇｒ５発現が完全になくなった（abolish）。これは、Ｗｎｔシグナル伝達が、幹細胞性（stemness）を維持し、分化を抑制するのに必要であり、さらに、Ｗｎｔシグナル伝達は、パーネト細胞分化にも必要であることを示す。ノッチインヒビターＤＡＰＴは、Ｍｕｃ２、ＣｈｇＡ、およびリゾチームを含む分泌性細胞型のマーカーを大きく上昇させ、これは、ノッチ阻害が分泌性細胞分化を誘導するという以前の報告と一致した（Milano et al., 2004; VanDussen et al., 2012: Wong et al., 2004）。さらに、ＩＷＰ−２とＶＰＡの組み合わせは、おそらく両方のインヒビターの効果を組み合わせることによって腸細胞分化を特異的に誘導し、ここで、ＩＷＰ−２は、Ｌｇｒ５^＋幹細胞分化を誘導し、ＶＰＡは、Ｌｇｒ５^＋幹細胞の分泌性細胞型への分化を抑制した。同様に、ＤＡＰＴとＣＨＩＲの組み合わせは、主にパーネト細胞分化を誘導し、ＩＷＰ−２とＤＡＰＴの組み合わせは、主に杯細胞分化を誘導した。これらの条件もまた、各分化した細胞型の形態に類似する明らかな形態学的変化を誘導した（図７Ｃおよび８Ｄ）。腸細胞、杯細胞およびパーネト細胞のマーカーの染色によって、上記の観察を確認した（図７Ｃ、７Ｄおよび８Ｅ、８Ｆ）。ＩＷＰ−２またはＣＨＩＲの存在は、ＣｈｇＡ発現に有意に影響せず、これは、杯細胞およびパーネト細胞に比べて、腸内分泌細胞の分化はＷｎｔ阻害または活性化を厳密に必要とすることを示した。

【0132】

実施例４：ＣＨＩＲおよびＶＰＡの応答を媒介する機構を試験する
ＣＨＩＲは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を活性化する高度に特異的なＧＳＫ３インヒビターであり（Bain et al., 2007）、胚性幹細胞の自己複製状態を維持するために使用されてきた（Ying et al., 2008）。ＣＨＩＲの効果がＷｎｔ経路の活性化によったことを確認するために、リチウムおよびＷｎｔ３ａを含む他のＷｎｔ経路アクチベーターの効果を試験した。ＣＨＩＲをＬｉＣｌまたはＷｎｔ３ａと取り換えることによって、陰窩増殖が増大し、これは、ＥＮＲ条件に比べてコロニーサイズおよび細胞数が増大することによって示された（図９Ａおよび９Ｂ）。これらの条件におけるコロニーは、以前に示されたように（Sato et al., 2011b）、陰窩様構造を示した（図９Ａ）。同様に、ｐａｎ−ＨＤＡＣインヒビターを含む他のＨＤＡＣインヒビターおよびタイプ特異的インヒビターの効果を試験した。ｐａｎ−ＨＤＡＣインヒビターＴＳＡならびにＨＤＡＣ６特異的インヒビターツバスタチンＡおよびコンパウンド７は、ＶＰＡでＧＦＰ発現を促進する同様の効果を示した（図９Ｃおよび９Ｄ）。ＳＢＨＡおよびブチレート（Butyrate）を含む他のｐａｎ−ＨＤＡＣインヒビターならびにクラスＩ（ＣＩ−９９４、ＭＳ２７５、図９Ｃおよび９Ｄ）、クラスＩＩａ（ＭＣ１５６８、図９Ｃおよび９Ｄ）およびクラスＩＩＩ（ニコチンアミド、図９Ｆ）ＨＤＡＣインヒビターは、ＧＦＰ発現を促進する効果を全く示さなかったか、またはほんの中程度示した（図９Ｃ−９Ｆ）。ＴＳＡおよびＶＰＡは、高い濃度で顕著な増殖阻害効果を示したが、両方の濃度でＧＦＰ発現を維持した（図９Ｅ）。注目すべきことに、ヒト結腸陰窩の培養に使用されたサーチュインファミリーＨＤＡＣインヒビター（クラスＩＩＩ）であるニコチンアミド（Jung et al., 2011; Sato et al., 2011a）は、ＣＨＩＲまたはＷｎｔ３ａと組み合わせた場合、ＧＦＰ発現または細胞増殖を促進せず（図９Ｆ）、このことは、ニコチンアミドが、ＶＰＡとは異なる機構を介して作用することを示した。さらに、単一のＬｇｒ５^＋幹細胞を、ＴＳＡもしくはツバスタチンＡと共にＣＨＩＲを、またはＷｎｔ３ａ、ＢＩＯもしくはＬｉＣｌと共にＶＰＡを使用して培養した場合、細胞は、ＣＶ条件と同様のコロニー形成効率、コロニー形態およびＧＦＰ発現を示した（図１０）。

【0133】

以前の報告は、ノッチ経路活性化が分泌性細胞分化の阻害および幹細胞の自己複製の維持に必要であることを示し、ＶＰＡ処置の効果と一致する。ＶＰＡがその効果を発揮するためにノッチ経路の要素を標的化するかどうかを評価した。第１に、ＶＰＡの添加によるノッチ阻害の救出を試験した。γ−セクレターゼインヒビターＤＡＰＴでの処置によって、細胞増殖およびＧＦＰ発現の低減が導かれ、これは、ＶＰＡによって用量依存的様式で救出された（図１１Ａ）。これは、ＶＰＡがＮＩＣＤ形成の下流に作用し、リガンド−レセプター媒介性ノッチ活性化の要件を迂回し得ることを示唆する。

【0134】

ＶＰＡは、癌細胞株においてノッチ経路を活性化することが以前に示された（Greenblatt et al., 2007; Stockhausen et al., 2005）。ＶＰＡのノッチ経路の活性化に対する効果を調査するために、ＥＮＲまたはＥＮＲＣ条件で培養された細胞を、ＶＰＡで処理し、ノッチ経路遺伝子の発現について分析した。しかし、２４時間のＶＰＡのＥＮＲまたはＥＮＲ−Ｃへの添加によって、ノッチ１またはＨｅｓ１の発現が中程度に低下し、これは、ノッチの下流の標的遺伝子であることが決定された（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。さらに、２４時間または６日間ＶＰＡおよびＣＨＩＲで処理された細胞中の陰性ノッチ標的Ａｔｏｈ１（Ｍａｔｈ１）の顕著な減少が観察された（図１１Ｂ−１１Ｄ）。Ａｔｏｈ１は、ＩＳＣの分泌性細胞系統への分化に必須であることが示されている（van Es et al., 2010; Yang et al., 2001）。腸幹細胞は、Ａｔｏｈ１欠乏により誘導されるパーネト細胞の剥離（ablation）の後に、インビボおよびインビトロの両方で機能性のままである（Durand et al., 2012; Kim et al., 2012）。ＣＨＩＲまたはＣＨＩＲ＋ＶＰＡ処理後のＡｔｏｈ１阻害は、腸幹細胞の自己複製プログラムの維持を補助する。

【0135】

従って、インビトロでのＬｇｒ５^＋腸幹細胞の自己複製およびそれらの腸上皮中の異なる細胞型への分化の制御は、増殖因子および小分子インヒビターの組み合わせの使用を介して今回において達成され、これは、インビボ腸上皮の生物学を厳密に模倣する（図１２Ａおよび１２Ｂ）。生理学的条件下で（図１２Ａ）、ＩＳＣの自己複製および分化は、Ｗｎｔおよびノッチ経路の協調によって制御される。両方の経路の活性化（Ｗｎｔオンおよびノッチオンで示される）は、ＩＳＣを未分化の自己複製状態に維持する。ノッチ経路の不活性化によって（ノッチオフ）、分泌性細胞型の特性を有する状態（specification）が導かれ、Ｗｎｔ経路のさらなる不活性化によって（Ｗｎｔオフ）、杯細胞分化が導かれる。ノッチの非存在下でのＷｎｔ経路の連続的な活性化によって、パーネト細胞分化が導かれる。腸内分泌細胞分化についてＷｎｔ経路の強い依存性はない。あるいは、連続的なノッチ活性化およびＷｎｔ不活性化によって、腸内分泌細胞分化が導かれる。Ｌｇｒ５＋幹細胞をインビトロで培養する場合（図１２Ｂ）、ＣＨＩＲ９９０２１は、Ｗｎｔ経路を活性化し、腸細胞分化を阻害するが、ＶＰＡ単独またはＣＨＩＲを伴うＶＰＡは、分泌性細胞の特性を有する状態を抑制する。ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせによって、ＩＳＣが未分化の自己複製状態に維持される。ＤＡＰＴでのノッチ経路の阻害によって、分泌性細胞型の特性を有する状態が導かれ、ＣＨＩＲのさらなる添加によって、パーネト細胞分化が導かれるが、Ｗｎｔ経路インヒビターＩＷＰ−２の添加によって、杯細胞分化が導かれる。あるいは、分化を誘導し、分泌性細胞型の特性を有する状態を抑制するＩＷＰ−２とＶＰＡの組み合わせによって、腸細胞分化が導かれる。

【0136】

実施例５：内耳由来のＬｇｒ５陽性幹細胞の増殖はＣＨＩＲおよびＶＰＡの存在下で増大される
哺乳動物の内耳のコルチ器の感覚毛細胞は、損傷の際に再生しない。Li et al., 2003は、成人の卵形嚢感覚上皮が幹細胞に特有の特徴を示す細胞を含むことを見出した。これらの内耳幹細胞は、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＩＧＦ−１の存在下で懸濁球（suspension sphere）としてインビトロで培養され得る（Li et al., 2003）。その後、有糸分裂後支持細胞が培養中に分裂して、新たな毛細胞に分化転換する能力を保持することが見出され（Patricia et al., 2006, Nature）、これらの支持細胞は内耳幹細胞であり得ることが示唆された。精製された蝸牛支持細胞は、胚性耳周囲間葉フィーダー細胞上でＥＧＦ、ｂＦＧＦの存在下でインビトロで培養され得る（Patricia et al., 2006）。Shi et alは、新生および成体マウスの蝸牛中の支持細胞のサブセットが成体幹細胞のマーカーであるＬｇｒ５を発現することを見出した（Shi et al., 2012）。重要なことに、Ｌｇｒ５陽性細胞は、単離され得、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＩＧＦ−１の存在下で単一細胞懸濁物中で培養され得、Ｌｇｒ５陰性細胞と比較して増強された自己複製能力を示す。以前の内耳幹細胞培養は、懸濁培養法を使用し、該方法においては、おそらく細胞にとって不十分な増殖環境のために、全細胞の約０．０６８％のみ（Li et al., 2003）またはソーティングされたＬｇｒ５陽性細胞の２％が球を形成し得た（Shi et al., 2012）。本明細書で記載するように、内耳幹細胞についての高効率のインビトロ培養系が、今回開発された。

【0137】

Ｐ１からＰ２Ｌｇｒ５−ＧＦＰマウスから単離されたマウス蝸牛は、図１３Ａに示すように、Ｌｇｒ５陽性細胞を含んだ。Ｌｇｒ５＋小腸幹細胞培養において使用されたのと同じ培養条件（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、または「ＥＮＲ」）を、最初に確立した。図１３Ｂに示すように、ＥＧＦ、ノギンおよびＲ−スポンジン１の組み合わせによって、ＥＧＦ単独に比べて、単一の蝸牛上皮幹細胞からのコロニー形成効率が上昇した。予想されるように、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせは、コロニー形成効率、細胞増殖、および細胞のＧＦＰ発現を大きく増大させたが、ＣＨＩＲ単独はそうではなかった。驚くべきことに、ＥＮＲ−ＣＶ組み合わせからノギンを除去することによって（「ＥＲ−ＣＶ」条件）、図１３Ｂに明視野画像およびＧＦＰ画像によって示すように、わずかに高いコロニー形成効率および高いＧＦＰ発現レベルが生じた。これらの結果は、Ｒ−スポンジン１またはＣＨＩＲによるＷｎｔ経路活性化が内耳幹細胞の増殖を促進し、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせが内耳幹細胞の増殖および自己複製を大きく促進することを示す。

【0138】

ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＩＧＦ−１を含む有糸分裂性（mitogenic）増殖因子は、懸濁物培養系で以前に使用され、単離された内耳幹細胞の球形成を促進することが示された（Li et al., 2003; Shi et al., 2011）。次に、ＣＨＩＲおよびＶＰＡの効果を、表１に記載するように、これらの増殖因子の存在下で試験した。

【表4】

【0139】

Ｌｇｒ５−ＧＦＰマウスから単離されたコルチ器を、アキュターゼを使用して単一の細胞に分離し、８日間マトリゲル中で可溶性因子と小分子の複数の組み合わせ中で培養した。得られた培養物を、単一の細胞にさらに分離し、ＦＡＣＳを使用して分析した。以前の結果と一致して、ＣＨＩＲとＶＰＡの添加によって、細胞増殖が大きく増大し（９〜２０倍）、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージで示されるＧＦＰ発現が大きく上昇し（６０倍）、ＧＦＰ＋細胞の相対ＧＦＰ強度が大きく上昇したが（２倍）、ＣＨＩＲまたはＶＰＡの単独はそうではなかった（図１４Ａおよび１４Ｂ）。さらに、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＩＧＦ−１の組み合わせによって（ＥＦＩとして示す）、ＥＮＲ条件と比較して細胞増殖およびＧＦＰ発現が改善した（図１４Ａ〜１４Ｃ）。

【0140】

ＣＨＩＲおよびＶＰＡと組み合わせた場合の個々の増殖因子の効果をさらに調査するために、ＣＨＩＲおよびＶＰＡと組み合わせた有糸分裂性増殖因子（ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＩＧＦ−１）を含む増殖因子ならびにＷｎｔアゴニストＲ−スポンジン１を試験した。ＣＶ条件へのＥＧＦの添加により、培養物中の細胞数の増加によって示される細胞増殖が大きく増加した。ＥＧＦ＋ＣＶへのｂＦＧＦの添加により、細胞増殖およびＧＦＰ発現がさらに増大したが、ＥＧＦ＋ＣＶへのＩＧＦ−１またはＲ−スポンジン１の添加ではそうならなかった（図１４Ｄ）。ＥＧＦ＋ｂＦＧＦ組み合わせへのＩＧＦ−１またはＲ−スポンジン１の添加により、ＧＦＰ発現がわずかに上昇したが（図１４Ｅ）、我々は、これらが培養細胞の増殖およびＧＦＰ発現の維持に必須ではないことを見出した（図１４Ｆ）。

【0141】

実施例６：Ｌｇｒ５陽性腸幹細胞は移植可能な陰窩を形成する
腸幹細胞を移植する可能性を試験するために、インビトロの健康な結腸組織に対する小腸陰窩の植付けを試験した。結腸組織を、野生型マウスから採取し、長さ方向に開いた。１ｃｍ断片を、除去し、ＰＢＳで洗浄した。上皮層を、外科用刃を使用してこすり落とすことによって除去し、組織を２４ウェルプレートに配置した。Ｌｇｒ５−ＧＦＰマウスから単離した小腸陰窩を、ＤｉＤ膜色素で染色し、アドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ（Invitrogen）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Invitrogen）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Invitrogen）、１×Ｎ２サプリメント（Invitrogen）、１×Ｂ２７サプリメント（Invitrogen）、５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Peprotech）、５００ｎｇ／ｍｌ Ｒ−スポンジン１（R & D Systems）、１０μＭ Ｙ−２７６３２（Ｒｈｏキナーゼインヒビター、Sigma-Aldrich；および１００ｍｇ／ｍｌノギン（Peprotech）を含む５〜１０μｌの陰窩培養培地内の結腸組織上に配置した。組織を、加湿環境において３７℃で３０〜６０分間さらにインキュベートし、陰窩の接着を可能にした。次いで、陰窩培養培地を、ウェルに添加し、陰窩を７日間さらに培養した。播種した陰窩を、結腸に付着させ、２４時間の間に広げた（図１５）。蛍光画像は、陰窩が４８時間の間に結腸に植え付けられ（図１６）、少なくとも１週間の間Ｌｇｒ５−ＧＦＰ発現を維持したことを示した（図１７）。

【0142】

小腸陰窩の植付け能力をさらに試験するために、自発的な潰瘍性大腸炎を示し、ヒトの状態を模倣するＴＲＵＣマウスモデルを使用した。脱した組織を、ＴＲＵＣマウスから切除し、ＰＢＳで洗浄し、２４ウェルプレートに配置した。小腸陰窩を、ＤｉＤで染色し、脱した組織上に配置した。次いで、組織を、加湿環境において３７℃で３０〜６０分間インキュベートし、陰窩の接着を可能にした。陰窩培養培地をウェルに添加した。脱した組織および陰窩を、インビトロで２日間さらに培養した。予想されるように、陰窩は、脱した組織に植付けられた（図１７）。

【0143】

実施例７：小腸類臓器体のためのパッチ培養系は３次元生理学的環境を模倣する
粘膜下組織骨格上に大規模な組織化された３次元細胞構造（即ち、類臓器体）の成長を支持し得るインビトロ培養系を、今回開発した。以下に記載するように、３次元組織構築物のための改善された小腸粘膜下組織（「ＳＩＳ」）ベースの培養系を、粘膜下組織に前もって選択した細胞型を播種し、かつ特有のコラーゲンベースのかぶせもので成長を容易にすることによって調製した。このかぶせものは、最初は粘性の液体（fluid）重合前物質（pre-polymerization）であるが、播種された初期の細胞または類臓器体（細胞から二次培養された）を覆い、かつＳＩＳベースを覆い、コラーゲン残基内に細胞を包むために使用される（図１９Ｅおよび１９Ｆ）。重合後、液体は固化し、細胞膜およびＳＩＳに接触するその位置を維持し、類臓器体の拡大を促進する。このかぶせものを有するＳＩＳの組成を変更することによって、細胞接着および増殖が容易になることを今回発見した。これは、インビボとは全く異なるインビトロで組織成熟を容易にする。これは、大きな内生型（endogenous）類臓器体への接着細胞の３次元拡大が移植前に達成される点で、他の粘膜下組織ベースの系および類似の合成系に対して特有の改善である。

【0144】

さらに、ゲル層を使用することなく、マトリゲルに匹敵する速度での粘膜下組織上での３次元類臓器体成長を支持する方法がまた発見された。この系は、脊椎動物ＳＩＳ、およびＳＩＳパッチに播種された前もって選択された細胞で構成される。このゲル不含培養系を支持するために、前もって選択された生体活性活性薬剤を、細胞の播種前にパッチに注入する（図１９Ｃおよび１９Ｄ）。

【0145】

パッチ培養系を開発するために、増殖因子を注入したＳＩＳベースおよびコラーゲンかぶせものの種々の組み合わせ（図１９Ｅおよび１９Ｆ）を試した。これは、硬い（ＳＩＳ）から柔らかい（コラーゲン）マトリックスへの転移を有するより生理学的な組織界面（interface）の作製を可能にした。コラーゲン残基で覆われた播種された細胞および類臓器体に、マトリゲルで提供されるものと類似の３次元環境が提供されることを決定した。従って、この系は、３次元類臓器体構築物の培養においてマトリゲルの適切な交換物である。播種された細胞または類臓器体の大部分は、両方、細胞膜の下半分でＳＩＳに接着するが、膜の非付着領域で重合したコラーゲンによっても覆われる（図１９Ｅ、挿入図）。従って、各細胞膜は、マトリックスがＳＩＳであろうとコラーゲンであろうと、マトリックスの形態中に機能的に覆われる。いくつかの試料において、種々の生体活性薬剤が、ＳＩＳ単独より優れた細胞および類臓器体の播種、成長、および分化を支持するために使用された（図１９Ｆ）。出願人は腸幹細胞培養に特異的な生体分子の注入を記載するが、生体分子は、膵臓、乳房、肝臓、および胃の組織を含む種々の組織からの他の播種された細胞の増殖を補助するためにあつらえる（tailor）ことができることを宣言する。従って、組織特異的生体分子は、以下：抗ウイルス剤、抗菌剤、抗生剤、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク、抗体、ステロイド化合物、抗生物質、抗真菌剤（antimycotic）、サイトカイン、ビタミン、炭水化物、脂質、細胞外マトリックス、細胞外マトリックス成分、化学療法剤、細胞傷害性剤、増殖因子、抗拒絶反応剤、鎮痛薬、抗炎症剤、ウイルスベクター、タンパク質合成補因子、ホルモン、内分泌組織、合成剤（synthesizer）、酵素、実質細胞を有するポリマー細胞骨格形成剤（scaffolding agent）、脈管形成薬、小分子、ナノ粒子、コラーゲン格子、抗原性薬剤、細胞骨格剤、核酸、細胞誘引物質（attractant）から選択され得る。

【0146】

初めに、陰窩を、以前の方法に従って単離した（Sato et al., 2009, Yui et al., 2012）。マウス小腸を、単離し、長さ方向に切開し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、管腔内含有物をきれいにした。断片を、２ｍｍ片に切断し、５０ｍｌファルコンチューブに移し、１０ｍｌピペットを使用して５０ｍｌの氷冷ＰＢＳ中で穏やかに洗浄した。上清を除去し、該プロセスを、上清が澄むまで続けた。断片を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で４℃で４５分間インキュベートし、陰窩を放出させた。上清を除去し、断片を、５０ｍｌのＰＢＳを用いてピペットで吸ったり出したりした。一旦、上清が陰窩画分を含むことが確認されると、上清を、７０μｍのセルストレーナーを通してろ過し、３００ｇで５分間の遠心分離で回転させた（spin）。陰窩を、１０ｍｌの氷冷ベース培養培地（アドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ（Invitrogen）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Invitrogen）および１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Invitrogen）を含む）中に再懸濁し、１５ｍｌのファルコンチューブに移した。ＰＢＳ洗浄を繰り返し、陰窩を、２００ｇで２分間回転させ、単一の細胞を除去した。陰窩を、計数し、２００μｌのマトリックスを含むウェルあたり１０００陰窩の濃度で、マトリゲルまたはコラーゲンＩのいずれか（以下からなる：１００μｌ １０×ＰＢＳ、４．９μｌ ＮａＯＨ、６８４μｌ Ｈ２Ｏおよび２１１μｌ コラーゲンＩ型（ラット尾高濃度９．４９ｍｇ／ｍｌ；BD Biosciences）を有する４８ウェルプレートにプレーティングした。選択したゲル製品の重合の後、アドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ（Invitrogen）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Invitrogen）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Invitrogen）、１×Ｎ２サプリメント（Invitrogen）、１×Ｂ２７サプリメント（Invitrogen）、５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Peprotech）、５００ｎｇ／ｍｌ Ｒ−スポンジン１（R & D Systems）、１０μＭ Ｙ−２７６３２（Ｒｈｏキナーゼインヒビター、Sigma-Aldrich；および１００ｎｇ／ｍｌノギン（Peprotech）を含む５００μｌの１×標準陰窩培養培地（無血清）を添加した。パッチに播種する前に、細胞を４〜５日間増殖させ、一日おきに培地を交換した。Ｙ−２７６３２は、最初の４８時間の間のみ培養培地に含ませた。

【0147】

培養の４〜５日後に、Ｌｇｒ５＋類臓器体を、以前に記載された改変されたプロトコルを使用して継代した（Sato et al., 2009）。培養培地を、マトリゲルから除去し、次いで、マトリゲルを、ｐ１０００ピペットを用いて人力で破壊し、次いで、ＢＳＡコートされた１５ｍｌファルコンチューブに移した。コラーゲンゲルを、コラゲナーゼＸＩ型を含むＤＭＥＭ中で３７℃で５分間インキュベートし、次いで、ＢＳＡコートされた１５ｍｌファルコンチューブに移した。ベースの培地を添加し、類臓器体を、大部分の類臓器体が単一の陰窩になるまで、倒立顕微鏡による頻繁な観察によって穏やかに破壊した。類臓器体を、１０ｍｌのベース培地中で洗浄し、２００ｇで２分間遠心分離した。ペレットを、５００μｌあたり５００の単一の陰窩類臓器体の濃度で陰窩培養培地中に再懸濁した。

【0148】

パッチを、生成し、標準的な４８ウェルプレートのウェル内に播種するために調製した（ウェルあたり１パッチ、管腔側を上にする）。ＳＩＳを、所望の長さに切断し、各ウェルの底を覆った（４８ウェルプレートについて約１ｃｍ）。ＳＩＳの単離は、以前に記載されている（Badylak et al., 1989）。鈍い鉗子を使用して、各ＳＩＳセグメントを、ウェルの底に移し、管腔側を上にしてその全直径まで注意深く広げた。方向を、倒立顕微鏡下の分析によって確認し、表在性表面上の陰窩の無細胞性残存物を可視化した。要求されるコンプライアンスおよび強度に依存して、ＳＩＳの複数の層を、層状に積み重ね、互いに結合させ得る。この場合において、各セグメントを、所望の数のセグメントに対して互いの上部に広げ得、パッチを、鉗子で穏やかに圧縮し、５％ＣＯ_２、３７℃で５分間空気乾燥させた。播種の前に、各パッチセグメントを、受動的蒸発により２４時間脱水させ、濃縮した陰窩培養培地を注入し、任意に、以下に記載されるとおり小分子を注入した。具体的には、パッチの各セグメントを配置し、４８ウェルプレートのウェル中に管腔側を上にして広げ、１００μｌの濃縮した因子（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、およびＣＨＩＲ）を、５％ＣＯ_２および３７℃での２４時間のインキュベーションの間配置した。

【0149】

個々の５００μｌの単一の陰窩類臓器体試料を、パッチベースを含むウェルに配置し、５％ＣＯ_２および３７℃で２４時間インキュベートした（図２０Ａ）。確実に接着させ、パッチ中に植え込まれた増殖因子から栄養的支持を得るために、播種されたパッチを、２４時間培養培地中に維持した（図２０Ｂ）。

【0150】

いくつかの試料において、薄いコラーゲンゲル残基（ゲルパッチと称する）を、パッチ／類臓器体複合体の上部に被覆し、各類臓器体に対して最少であるが機能的な３次元環境を提供した。細胞表面から得られる物理的および化学的合図は、生理学的形態を複製するために、３次元細胞構造増殖を増強した（Seidi, A., et al., 2011）。コラーゲンＩマトリックス（２０〜４０μｌ）を、播種されたパッチの上に層にし、パッチを越えたゲルの拡散を防止するために表面張力を強化することに気を付け（図２０Ｃ）、ウェルプレートを、５％ＣＯ_２、３７℃で３０分間インキュベートした。陰窩培養培地（５００μｌ）を、各ウェルに配置し、１日おきに交換した。

【0151】

いくつかの試料において、パッチを、パッチにより最初の２４時間に類臓器体の接着が容易になったかどうかを試験するために、播種前に、増殖因子中でインキュベートした。従って、ＧＦ注入（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、およびＣＨＩＲを含む）パッチ 対 非注入パッチ（ＰＢＳ中のＳＩＳ）に播種した。このアッセイにおいて、非注入パッチは、培養培地の代わりにベースの媒体を使用し、同様に、類臓器体に培地増殖因子を与えなかった（deprive）。

【0152】

腸類臓器体の成長を、７つの別個の系：マトリゲル（対照）、増殖因子（本明細書中以下ＧＦといい、ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、およびＣＨＩＲを含む）を注入されたゲルパッチ系、ＧＦを注入したがコラーゲンのかぶせものを有さないベアパッチ、コラーゲンＩゲルのみ、培養培地に直接ＧＦを添加したコラーゲンＩゲル（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、およびＣＨＩＲを含む）、ゲル自体にＧＦを植え込んだコラーゲンＩゲル（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、およびＣＨＩＲを含む）、およびコラーゲンのかぶせものまたはＧＦの注入を有さないベアパッチにおける類臓器体あたりの陰窩の数の定量によって評価した。培地に直接ＧＦおよび小分子を添加したコラーゲンＩ群以外は、全ての培養培地は、各系の間の標準であり、全ての培養培地は、１日おきに交換され、ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２（最初の４８時間のみ）を含んだ。標準的な陰窩培養培地を、上記する。

【0153】

実験を９６時間にわたって行い、類臓器体の成長の毎日の定量を、類臓器体あたりの陰窩の数の視認によって、詳細に記録した。ＧＦを有するゲルパッチ系は、マトリゲル対照に匹敵するレベルで類臓器体の成長を支持し得た（図１９）。ＧＦを有さないベアパッチは、測定可能な類臓器体の成長を支持し得なかった。より精密な観察によって、ベアＳＩＳパッチは、３次元類臓器体とは全く異なるシートにおいてＬｇｒ５＋細胞を成長させるようであった。しかし、ＧＦ（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、およびＣＨＩＲ）を注入したベアパッチは、ゲルパッチ系およびマトリゲルの両方で同等に類臓器体の成長を支持した。このことは、十分なＧＦの支持を伴って、ゲルを含まない培養系は、マトリゲルと同等に、短期の３次元の類臓器体の成長を維持し得ることを示す。コラーゲンＩのみは、中程度の類臓器体の成長を容易にするが、ＧＦを注入したＳＩＳは、コラーゲンの３次元成長促進効果に対する実現可能な交換物である。さらに、同じＧＦ（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、およびＣＨＩＲ）を、コラーゲンＩゲル培養の培養培地に直接添加した場合、類臓器体の成長速度は低いままであった。さらに、コラーゲンＩゲルを、播種の前に上記したＧＦをゲルに直接植え込むことによって調製した場合、類臓器体の成長速度は低いままであった。ＧＦＰシグナルは、ゲルパッチ系のいたるところで維持された（図２１Ｂおよび２１Ｃに代表的な例）。ベアパッチ（コラーゲンのかぶせものまたはＧＦを有さないＳＩＳ）が、構造化した類臓器体の成長を支持しなかったとの観察は、３次元構造を促進するための十分な物理的および化学的合図の重要性を再確認する。

【0154】

ＳＩＳまたはコラーゲンのみが、文献において細胞播種のためのベース骨格として使用され、細胞単層の形成が生じている（Baumert et al. 2007; Campodonico et al. 2004; Feil, G., et al. 2006; Zhang, Y., et al. 2000）。対照的に、これらの２つのマトリックスの界面で増殖している細胞は、単層の成長より３次元の類臓器体の成長を好む。これは、生理学的環境をより精密に模倣し、加速されかつ構造化された成長を可能にする。重要なことに、これらの結果は、マトリゲルの優れた代替物である、小腸類臓器体についてのパッチ培養系を記載する。動物モデルにおけるマトリゲルベースの移植は、ヒトモデルに進める際に重大な障壁に遭遇し、最も重大なものは生体適合性の問題を含んだ。３次元の細胞ベースの構造を成長させることは、しばしば、厚いマトリックスゲルに植え込むことを必要とする。パッチ培養系は、この要件を克服し、同等の結果を提供する。マトリゲルを内生型細胞外マトリックス物質と特定の生体活性増殖因子の組み合わせと交換することによって、生体適合性の問題を回避し、３次元の類臓器体のエキソビボ成長を維持する。最初の播種からの３次元のエキソビボ類臓器体拡大の微速度撮影画像を、図２２に示す。

【0155】

播種前の増殖因子中でのパッチのインキュベーションによって最初の２４時間で類臓器体の接着が容易になるかどうかを評価した。播種効率を、増殖因子注入パッチ（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、およびＣＨＩＲを含む）と非処理パッチ（ＰＢＳ中に保存）とで比較した。アッセイを、培地の洗浄後の増殖因子を含まない培地のみ（ベース培地のみ）で細胞を培養する４時間目および１２時間目の時点に維持される類臓器体のパーセンテージを測定することによって実施した。ＳＩＳを省略し、類臓器体をプラスチックのコラーゲン被覆ウェルおよびコラーゲン非被覆ウェルに直接播種した場合、全ての類臓器体の分離が２４時間以内に起こった。しかし、ＳＩＳパッチは、２４時間の時点で、構造およびＧＦＰ発現の両方において類臓器体の大部分を維持した。接着の改善は、細胞を、増殖因子注入パッチ（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、およびＣＨＩＲを含む）上に播種した場合に観察された。従って、増殖因子注入はまた、培養の間および移植の後に十分な栄養および因子を提供し、細胞植付けに対する橋渡しをする（bridge the gap）ために有用であり得る。

【0156】

実施例８：移植したパッチはインビボで成長促進特性を示す
パッチ系の無細胞性ゲル不含の変形物を、インビボでの粘膜治癒特性を評価するために試験した。インビボでの移植パッチの成長促進特性を試験するために、粘膜欠損のラット外科モデルを設計した。ＳＩＳの一部を、６ｍｍの円形のポリ（グリセロールセバセート）ウレタン（ＰＧＳＵ）の裏当て上に管腔側を上にして注意深く広げることによって、移植パッチを組み立てた（assemble）。パッチを、５％ＣＯ_２、３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＧＳＵとＳＩＳの接着を可能にした。図２３に示すように、４ｍｍの欠損を、パンチ生検（punch biopsy）によって胃壁に生成した。無細胞性パッチ（直径６ｍｍ）を、胃の外壁の上に配置し、選択した物質で該欠損を注意深く覆った。縫合糸および近位の結合組織を使用して、採用したGrahamパッチ方法により、パッチを固定した

【数1】

。a)ＰＧＳＵ−裏当てＳＩＳパッチ（ＧＦなし）、b)ＧＦ（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、およびＣＨＩＲ）を注入したＰＧＳＵ−裏当てＳＩＳパッチ、およびc)ＰＧＳＵ裏当てのみ（ＳＩＳなし）を含む、無細胞性パッチの３つのバリアントを適用した。いずれの時点においても、いずれのラットにも腹膜炎は観察されなかった。機械的に誘導した胃壁の欠損の上への移植の１週間後、欠損およびパッチ移植物を含む胃の組織を、採取し、組織の組織学的試験を行った。

【0157】

パッチの変形物の移植は種々の程度の粘膜の治癒を示すと仮説を立てた。全試験は、欠損が上皮形成し、閉じたので、ＧＦを有するＳＩＳパッチにおいて有意な利点を示した。ＧＦを有さないＳＩＳパッチにおいて、上皮形成を有さない部分的な閉鎖が観察され、ＰＧＳＵのみ（対照）のパッチにおいて、閉鎖または上皮形成は観察されなかった。組織学的試験によって、ＧＦを有するおよび有さないＳＩＳパッチの両方において軽度の炎症が明らかになったが、胃の内容物の漏れはなかった。ＰＧＳＵのみのパッチの組織学的試験によって、中程度の炎症および巨細胞の存在が示され、胃の内容物の漏れに応答しているようであった。従って、本明細書に記載されるパッチ培養系は、培養皿から直接患者への移植が可能であり、パッチが硬く、その低い高さプロフィールを考慮すれば、小さい空間（例えば、腸の管腔、脈管の空間）を閉塞する可能性が低いので、移動の潜在性が高い。

【0158】

実施例９：ヒト小腸陰窩／幹細胞の培養
ヒト小腸陰窩を、切除した正常な小腸検体から単離し、実施例１に記載されるとおりに培養した。ＥＮＲ（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１）条件に添加されたＣＨＩＲ９９０２１とＶＰＡまたはツバスタチンＡの組み合わせを含むマウス小腸幹細胞／陰窩の培養に使用した同じ細胞培養条件を、ヒト腸幹細胞／陰窩について公開された細胞培養溶液（Jung et al., 2011; Sato et al., 2011）と比較した。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、特に自己複製または分化状態を決定することによって、培養中の上皮幹細胞の維持を評価した。ＬＧＲ５を幹細胞マーカーとして使用し、ＡＬＰＩ、ＭＵＣ２、ＣＨＧＡおよびＬＹＺを、分化マーカーとして使用した。培養物中の細胞数を計数し、コロニーの形態およびサイズを観察することによって、細胞増殖を評価した。

【0159】

マウス腸幹細胞培養と同様に、ＣＨＩＲ＋ＶＰＡまたはＣＨＩＲ＋ツバスタチンＡの組み合わせは、幹細胞マーカーＬＧＲ５の発現を大きく促進し、培養された細胞は、幹細胞が富化されていることを示唆した（図２４）。特に、ＣＨＩＲおよびＶＰＡまたはＣＨＩＲおよびツバスタチンＡを含む培養条件は、ＬＧＲ５発現の促進において公開された条件より優れていた（図２４）。さらに、培養培地に対する改善を示す、Ａ８３−０１（ＡＬＫ４、５、７、Ｔｇｆ−βインヒビター）、ＳＢ２０２１９０（ｐ３８インヒビター）、およびニコチンアミド（ビタミンＢ誘導体）を含む個々の成分を試験した。ＬＧＲ５発現に大きな影響を与えることなく（図２５Ｂ）、培養物中の細胞数を増大させることによって示されるように（図２５Ａ）、ＣＨＩＲ＋ＶＰＡ条件に添加された場合、１０ｍＭのニコチンアミドがヒト小腸陰窩の増殖を増大させることを決定した。Ａ８３−０１とＳＢ２０２１９０の組み合わせ（ＡＳ）は、細胞の増殖を増大させたが（図２５Ａ）、これらは、ＬＧＲ５の発現を大きく減少させた（図２５Ｂ）。さらに、より低い濃度のＶＰＡ（０．５ｍＭ、マウス培養に使用した（１〜２ｍＭ）のと比べて）が、ヒト小腸陰窩の細胞増殖を増大させた（図２５Ａ）。ひとまとめにすると、ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、ＣＨＩＲ、ＶＰＡ（０．５ｍＭ）、およびニコチンアミドまたはＥＸ５２７を含む培養条件が、ヒト腸幹細胞にとっての最適な培養条件であったことを決定した。この条件において、単離された小腸陰窩は、マウス小腸幹細胞と同等のコロニーに成長した（図２６）。

【0160】

実施例１０：
腸上皮細胞に対するＣＨＩＲおよびＶＰＡのインビボ効果を試験するために、ＣＨＩＲ９９０２１（１００μｌ ＤＭＳＯ中３０ｍｇ／Ｋｇ）およびＶＰＡ（１００μｌ水中２００ｍｇ／Ｋｇ）を、４〜６週齢の雌のＬｇｒ５−ＧＦＰマウスに、胃管栄養法により投与した。対照マウスに、１００μｌ ＤＭＳＯと１００μｌ水の混合物を与えた。薬物を、７日間４８時間毎に投与した（第０日、第２日、第４日および第６日に）。第７日に、マウスを屠殺し、腸組織を回収した。小腸を、ＰＢＳでさらに洗浄し、４％ＰＦＡで１２時間固定し、パラフィンに包埋し、標準的なヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色プロトコルを使用して染色した。倒立顕微鏡（EVOS, Advanced Microscopy Group）を使用して画像を取得した。ＣＨＩＲおよびＶＰＡのインビボ投与によって、７日のクールの間の３回の投与の後、陰窩のサイズが増大した（図２７）。

【0161】

参考文献
本明細書で言及される全ての特許、特許出願および刊行物は、各独立した特許および刊行物が具体的におよび個々に参照によって援用されるべきことが示されていたのと同程度に、参照によって本明細書に援用される。

【数2】

【数3】

【数4】

【数5】

【数6】

【数7】

【数8】

【数9】

【数10】

【数11】

【数12】

【数13】

【数14】

【0162】

他の態様
本発明はその詳細な説明に関連して記載されるが、前述の説明は、例示を意図し、添付の特許請求の範囲の範囲によって画定される発明の範囲を限定することを意図しないことが理解される。他の局面、利点および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

【図1】

【図2A-B】

【図2C-D】

【図2E】

【図2F-H】

【図3A-B】

【図3C-D】

【図3E-G】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C-D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A-B】

【図8C-D】

【図8E-F】

【図9A-B】

【図9C】

【図9D】

【図9E-F】

【図10】

【図11A】

【図11B-D】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D-F】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A-F】

【図19G-N】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]