特許 6473938 抗線維化化合物、その方法および使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6473938

(24)【登録日】2019年2月8日

(45)【発行日】2019年2月27日

(54)【発明の名称】抗線維化化合物、その方法および使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/198 20060101AFI20190218BHJP

   A61K 31/47 20060101ALI20190218BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20190218BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20190218BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20190218BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20190218BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20190218BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20190218BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20190218BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20190218BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20190218BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190218BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/198

   A61K31/47

   A61P17/02

   A61P11/00

   A61P13/12

   A61P1/16

   A61P9/00

   A61P9/10

   A61P19/08

   A61P37/00

   A61P15/00

   A61P43/00 105

【請求項の数】18

【全頁数】46

(21)【出願番号】特願2016-517101(P2016-517101)

(86)(22)【出願日】2014年6月4日

(65)【公表番号】特表2016-521695(P2016-521695A)

(43)【公表日】2016年7月25日

(86)【国際出願番号】CA2014000484

(87)【国際公開番号】WO2014194407

(87)【国際公開日】20141211

【審査請求日】2017年6月2日

(31)【優先権主張番号】61/831,404

(32)【優先日】2013年6月5日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】300066874

【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア

(74)【代理人】

【識別番号】100109634

【弁理士】

【氏名又は名称】舛谷 威志

(74)【代理人】

【識別番号】100129263

【弁理士】

【氏名又は名称】中尾 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100163991

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 慎司

(74)【代理人】

【識別番号】100146374

【弁理士】

【氏名又は名称】有馬 百子

(74)【代理人】

【識別番号】100153947

【弁理士】

【氏名又は名称】家成 隆彦

(72)【発明者】

【氏名】ガハリー，アジズ

(72)【発明者】

【氏名】リ，ユンユアン

(72)【発明者】

【氏名】キラニ，ルハンギズ，ティー．

(72)【発明者】

【氏名】ハートウェル，ライアン

【審査官】 伊藤 清子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５２０５８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 J. Investig. Dermatol., 2012, Vol.132, No.5, pp.1501-1505

【文献】 Cancer Res., 2012, Vol.72. No.21, pp.5435-5440

【文献】 J. Biol. Chem., 2004, Vol.279, No.24, pp.25284-25293

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／１９８

Ａ６１Ｋ ３１／４７

Ａ６１Ｐ １／１６

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ ９／１０

Ａ６１Ｐ １１／００

Ａ６１Ｐ １３／１２

Ａ６１Ｐ １５／００

Ａ６１Ｐ １７／０２

Ａ６１Ｐ １９／０８

Ａ６１Ｐ ３７／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

線維性疾患を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が化合物または薬学的に許容され得るその塩および薬学的に許容され得る賦形剤を含み、前記化合物が以下の式Ｉ：

式Ｉ
ここで、
Ｅ_１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_４は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｒは、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、または環状である１〜６個の炭素を有する基であり、；
Ａは、ＨまたはＮＨ_２であり；
Ｄは、

もしくは

であり、または、
ＡおよびＤは、以下：

；

；および

から選択される６員環を形成しており；
Ｇは、ＣＨまたはＮであり；
Ｌ_１は、ＯＨ、ＮＨ_２、またはＳＨであり；
Ｍ_１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｍ_４は、ＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｘ_１は、Ｈである；
で表される構造を有し、
前記線維性疾患が、以下：ケロイド、肥厚性瘢痕、肺線維症、腎線維症、肝硬変、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、腎性全身性線維症、陳旧性心筋梗塞、強皮症、全身性硬化症、および子宮筋腫から選択される医薬組成物。

【請求項2】

治療の対象が哺乳動物である、請求項１記載の医薬組成物。

【請求項3】

Ｅ_１が、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３、ＣＨ_３、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_２が、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３、ＣＨ_３、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_３が、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３、ＣＨ_３、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_４が、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３、ＣＨ_３、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ａが、ＨまたはＮＨ_２であり；
Ｄが、

であり；または
ＡおよびＤが、以下：

；および

から選択される６員環を形成し；
Ｇが、ＣＨまたはＮであり；
Ｌ_１が、ＯＨ、ＮＨ_２またはＳＨであり；
Ｍ_１が、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；および
Ｍ_４が、ＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである
請求項１又は２記載の医薬組成物。

【請求項4】

Ｅ_１が、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３であり；
Ｅ_２が、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３であり；
Ｅ_３が、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３であり；
Ｅ_４が、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３であり；
Ａが、ＨまたはＮＨ_２であり；
Ｄが、

；または
ＡおよびＤが、以下：

；および

から選択される６員環を形成し；
Ｇが、ＣＨまたはＮであり；
Ｌ_１が、ＯＨまたはＮＨ_２であり；および
Ｍ_１が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項5】

Ｅ_１が、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３であり；
Ｅ_２が、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３であり；
Ｅ_３が、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３であり；
Ｅ_４が、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３であり；
Ａが、ＨまたはＮＨ_２であり；および
Ｄが、

；または
ＡおよびＤが、以下：

の構造を有する６員環を形成する請求項１〜４のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項6】

Ｅ_１が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２であり；
Ｅ_２が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２であり；
Ｅ_３が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２であり；
Ｅ_４が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２であり；
Ａが、ＨまたはＮＨ_２であり；および
Ｄが、

であり；または
ＡおよびＤが、以下：

の構造を有する６員環を形成する請求項１〜５のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記化合物が、以下の式II：

II
ここで、
Ｅ_１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_４は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ａは、ＨまたはＮＨ_２である、
構造を有する請求項１記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記化合物が、以下の式III：

III
ここで、
Ｅ_１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_４は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｌ_１は、ＯＨ、ＮＨ_２、またはＳＨである
構造を有する請求項１記載の医薬組成物。

【請求項9】

Ｌ_１がＯＨまたはＮＨ_２である請求項８記載の医薬組成物。

【請求項10】

Ｌ_１がＯＨである請求項８記載の医薬組成物。

【請求項11】

Ｅ_１が、ＨまたはＯＨであり；
Ｅ_２が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２であり；
Ｅ_３が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２であり；および
Ｅ_４が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である請求項１〜１０のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項12】

Ｅ_１が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２であり；
Ｅ_２が、ＨまたはＯＨであり；
Ｅ_３が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２であり；および
Ｅ_４が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である請求項１〜１０のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項13】

Ｅ_１が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２であり；
Ｅ_２が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２であり；
Ｅ_３が、ＨまたはＯＨであり；および
Ｅ_４が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である請求項１〜１０のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項14】

Ｅ_１が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２であり；
Ｅ_２が、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２であり；
Ｅ_３が、ＨまたはＯＨであり；および
Ｅ_４が、ＨまたはＮＨ_２である請求項１〜１０のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項15】

Ｅ_１が、ＨまたはＯＨであり；
Ｅ_２が、ＨまたはＯＨであり；
Ｅ_３が、ＨまたはＯＨであり；および
Ｅ_４が、ＨまたはＮＨ_２である請求項１〜１０のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記化合物が、以下：

、

、

、

、

、および

から選択される請求項１記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記化合物が、以下：

、

、

、

、

、および

から選択される請求項１記載の医薬組成物。

【請求項18】

（ａ）線維性疾患を治療するための医薬組成物であって、化合物または薬学的に許容され得るその塩および薬学的に許容され得る賦形剤を含み、前記化合物が以下の式Ｉ：

式Ｉ
ここで、
Ｅ_１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_４は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｒは、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、または環状である１〜６個の炭素を有する基であり、；
Ａは、ＨまたはＮＨ_２であり；
Ｄは、

もしくは

であり、または、
ＡおよびＤは、以下：

；

；および

から選択される６員環を形成しており；
Ｇは、ＣＨまたはＮであり；
Ｌ_１は、ＯＨ、ＮＨ_２、またはＳＨであり；
Ｍ_１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｍ_４は、ＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｘ_１は、Ｈである；
で表される構造を有する、医薬組成物、および
（ｂ）線維性疾患を治療するための前記医薬組成物の使用説明書であって、前記線維性疾患が、以下：ケロイド、肥厚性瘢痕、肺線維症、腎線維症、肝硬変、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、腎性全身性線維症、陳旧性心筋梗塞、強皮症、全身性硬化症、および子宮筋腫から選択される、使用説明書
を含む線維性疾患を治療するための市販用パッケージ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年６月５日に出願された「抗線維化化合物およびその方法」と題する米国仮出願第６１／８３１，４０４号の利益を主張するものである。

【0002】

技術分野
本発明は線維症の治療のための新規方法に関する。具体的には、本明細書中の記載は、線維性疾患、特には例えばケロイドおよび肥厚性瘢痕などの皮膚の疾患または症状の治療のための、キヌレニン、キヌレン酸、キサンツレン酸および／または関連化合物の使用に関する。

【背景技術】

【0003】

線維増殖性の症状に属する障害である一群の線維症は、例えば皮膚、肝臓、肺、腎臓および動脈などの種々の器官において見られる。米国における全死亡事例の約４０％は、部分的には線維増殖性障害によると推定されている。フィブロネクチン、Ｉ型およびIII型コラーゲンなどのマトリックスの過剰産生、もしくはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）などのマトリックス分解酵素の低いレベル、のどちらかまたはその両方に起因する細胞外マトリックスの過剰蓄積がこれら全ての線維化症状の共通の特徴である。

【0004】

全ての他の器官の場合のように、皮膚における創傷治癒は、様々な種類の損傷に対する組織応答を含むダイナミックプロセスである。このプロセスは、組織修復の非常に複雑なプロセスを組織化するために、血小板、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、免疫細胞が、それらの通常の分域の外側で一体となるシグナルおよび応答の連続的なシークエンスを含む。主に成長因子（ＧＦ）およびサイトカインであるこれらのシグナルは、創傷治癒の開始、持続および終結を組織化する（Ｓｃｏｔｔら、１９９４年）。創傷部位におけるサイトカインおよびＧＦｓの合成および遊離の不均衡が、遅延された創傷治癒（例えば糖尿病患者群や高齢者群などにおいて）または過剰な治癒（例えば線維増殖性障害、外科的切開後の合併症、外傷性創傷および重度熱傷など）に至る可能性がある。したがって、創傷治癒の重要な要素は、その時宜を得た停止であり、そしてそのような時宜を得た停止なしには、世界中の何百万人もの患者において見られる過剰なマトリックスの蓄積、有害線維症症状があるかもしれない。

【0005】

マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）は、例えば胚の成長と発生、子宮修復、骨の成長、骨吸収および創傷治癒などの生理学的状態のあいだのＥＣＭの代謝回転および結合組織修復に関与する多種多様なタンパク質分解酵素群の代表的なものである。正常細胞におけるＭＭＰ発現のレベルは低く、そしてこれは正常な結合組織修復を可能にする。しかしながら、ＭＭＰｓの発現における不均衡は、例えば皮膚線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、ならびに腫瘍浸潤および転移などの多くの病態に関与している。

【0006】

肥大瘢痕（ＨＳｃ）およびケロイドなどの皮膚の線維増殖性障害を含む線維症状態に対する現状の治療法は不十分である。従って、様々な線維性疾患と症状の治療について治療戦略をたてることが望ましい。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、部分的に、ある特定の化合物、キヌレニンおよびそのアナログ／アイソフォーム、キヌレン酸、ならびにキサンツレン酸が、コラーゲンおよびフィブロネクチンの発現を抑制しつつ、ＭＭＰ１およびＭＭＰ３の発現を刺激することができるという驚くべき発見に基づく。さらに、本明細書中に記載されるように、これらの化合物はインビボで適用された場合、ケロイド瘢痕形成の抑制、防止または低減が可能である。

【0008】

一実施形態において、以下の式Ｉ：

式Ｉ
ここで、Ｅ_１はＨ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＮＨＲ、ＮＲ_２、ＳＨ、ＳＲ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_２はＨ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、Ｏ、ＮＨＲ、ＮＲ_２、ＳＨ、ＳＲ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_３はＨ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＮＨＲ、ＮＲ_２、ＳＨ、ＳＲ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｅ_４はＨ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｒ、ＯＲ、ＮＨＲ、ＮＲ_２、ＳＨ、ＳＲ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｒは、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、環状、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族であってもよい１〜２０個の炭素基であって、各炭素は、任意にはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＮＨまたはＮＲ’で代替されていてもよく、および、各炭素は、任意には一またはそれ以上のＯＨ、ＯＲ’、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、＝Ｏ、ＳＨ、ＳＲ’、ＮＨ_２、ＮＨＲ’、Ｎ（Ｒ’）_２、ＯＳＯ_３Ｈ、ＯＰＯ_３Ｈ_３、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯＮ（Ｒ’）_２およびＣＯ_２Ｒ’で置換されていてもよく；
Ｒ’は、独立して、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、環状、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族である１〜１０個の炭素基からなる群より選択され；
Ａは、ＨまたはＮＨ_２であり；
Ｄは、

または

であり；または
ＡおよびＤは、以下：

；

；

；

；

；

；

；

；または

から選択される６員環を形成していてもよく；
Ｇは、ＣＨまたはＮであり；
Ｊは、ＳまたはＯであり；
Ｌ_１は、ＯＨ、ＯＱ、ＮＨ_２、ＮＨＱ、ＮＱ_２、ＳＨまたはＳＱであり、
Ｌ_２はＯ、ＳＱ’またはＮＱ’であり；
Ｌ_３は、ＯＨ、ＯＱ、ＮＨ_２、ＮＨＱ、ＮＱ_２、ＳＨまたはＳＱであり；
Ｑは、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、環状、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族であってもよい１〜２０個の炭素基であって、各炭素は任意には０、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＮＨまたはＮＱ’で代替されていてもよく、および、各炭素は、任意には一またはそれ以上のＯＨ、ＯＱ’、Ｑ’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ，＝Ｏ、ＳＨ、ＳＱ’、ＮＨ_２、ＮＨＱ’、Ｎ（Ｑ’）_２、ＯＳＯ_３Ｈ、ＯＰＯ_３Ｈ_３、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯＮ（Ｑ’）_２およびＣＯ_２Ｑ’で置換されていてもよく；
Ｑ’は、独立して、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖直鎖、環状の、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族である１〜１０個の炭素基からなる群より選択され；
Ｍ_１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｔ、ＯＴ、ＮＨＴ、ＮＴ_２、ＳＨ、ＳＴ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｍ_２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｔ、ＯＴ、ＮＨＴ、ＮＴ_２、ＳＨ、ＳＴ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｍ_３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｔ、ＯＴ、ＮＨＴ、ＮＴ_２、ＳＨ、ＳＴ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｍ_４は、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｔ、ＯＴ、ＮＨＴ、ＮＴ_２、ＳＨ、ＳＴ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
ＴはＨ、または、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、環状、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族であってもよい１〜２０個の炭素基であって、各炭素は、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＮＨまたはＮＴ’で代替されていてもよく、および、各炭素は、任意には一またはそれ以上のＯＨ、ＯＴ’、Ｔ’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、＝Ｏ、ＳＨ、ＳＴ’、ＮＨ_２、ＮＨＴ’、Ｎ（Ｔ’）_２、ＯＳＯ_３Ｈ、ＯＰＯ_３Ｈ_３、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯＮ（Ｔ’）_２およびＣＯ_２、Ｔ’で置換されていてもよく；
Ｔ’は、独立して、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖直鎖、環状、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族であってもよい１〜１０個の炭素基からなる群より選択され；
Ｘ_１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｚ、ＯＺ、ＮＨＺ、ＮＺ_２、ＳＨ、ＳＺ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｘ_２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｚ、ＯＺ、ＮＨＺ、ＮＺ_２、ＳＨ、ＳＺ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｘ_３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｚ、ＯＺ、ＮＨＺ、ＮＺ_２、ＳＨ、ＳＺ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；および
Ｚは、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、環状、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族である１〜２０個の炭素基であって、各炭素は、任意にはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＮＨ、ＮＺ’で代替されていてもよく、および、各炭素は、任意には一またはそれ以上のＯＨ、ＯＺ’、Ｚ’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、＝Ｏ、ＳＨ、ＳＺ’、ＮＨ_２、ＮＨＺ’、Ｎ（Ｚ’）_２、ＯＳＯ_３Ｈ、ＯＰＯ_３Ｈ_３、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯＮ（Ｚ’）_２およびＣＯ_２Ｚ’で置換されていてもよく；および
Ｚ’は、独立して、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、環状、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族であってもよい１〜１０個の炭素基からなる群より選択される、
構造を有する化合物の、線維性疾患の治療または線維性疾患を治療するための医薬の製造のための使用が提供される。

【0009】

さらなる実施形態において、線維性疾患を治療するための方法が提供され、方法は、化合物または薬学的に許容され得るその塩を哺乳動物細胞に投与する工程を含み、化合物は式Ｉの構造を有している。

【0010】

さらなる実施形態において、線維性疾患を治療するための方法が提供され、方法は、化合物または薬学的に許容され得るその塩を哺乳動物細胞に投与する工程を含み、化合物は式IIの構造を有している。

【0011】

さらなる実施形態において、線維性疾患を治療するための方法が提供され、方法は、化合物または薬学的に許容され得るその塩を哺乳動物細胞に投与する工程を含み、化合物は式IIIの構造を有している。

【0012】

さらなる実施形態において、線維性疾患を治療するための方法が提供され、方法は、化合物または薬学的に許容され得るその塩を、それを必要としている対象に投与する工程を含み、化合物は式Ｉの構造を有している。

【0013】

さらなる実施形態において、線維性疾患を治療するための方法が提供され、方法は、化合物または薬学的に許容され得るその塩を、それを必要としている対象に投与する工程を含み、化合物は式IIの構造を有している。

【0014】

さらなる実施形態において、線維性疾患を治療するための方法が提供され、方法は、化合物または薬学的に許容され得るその塩を、それを必要としている対象に投与する工程を含み、化合物は式IIIの構造を有している。

【0015】

さらなる実施形態において、線維性疾患を治療するための医薬組成物が提供され、医薬組成物は、化合物または薬学的に許容され得るその塩および薬学的に許容され得る賦形剤を含み、化合物は式Ｉの構造を有している。

【0016】

さらなる実施形態において、線維性疾患を治療するための医薬組成物が提供され、医薬組成物は、化合物または薬学的に許容され得るその塩および薬学的に許容され得る賦形剤を含み、化合物は式IIの構造を有している。

【0017】

さらなる実施形態において、線維性疾患を治療するための医薬組成物が提供され、医薬組成物は、化合物または薬学的に許容され得るその塩および薬学的に許容され得る賦形剤を含み、化合物は式IIIの構造を有している。

【0018】

さらなる実施形態において、医薬組成物が提供され、医薬組成物は、化合物または薬学的に許容され得るその塩および薬学的に許容され得る賦形剤を含み、その化合物は式Ｉの構造を有している。

【0019】

さらなる実施形態において、医薬組成物が提供され、医薬組成物は、化合物または薬学的に許容され得るその塩および薬学的に許容され得る賦形剤を含み、その化合物は式IIの構造を有している。

【0020】

さらなる実施形態において、医薬組成物が提供され、医薬組成物は、化合物または薬学的に許容され得るその塩および薬学的に許容され得る賦形剤を含み、その化合物は式IIＩの構造を有している。

【0021】

さらなる実施形態において、（ａ）本明細書に記載の医薬組成物；および（ｂ）線維性疾患を治療するためのその使用のための使用説明書を含む市販用パッケージが提供される。

【0022】

さらなる実施形態において、（ａ）式Ｉの化合物；および（ｂ）線維性疾患を治療するためのその使用のための使用説明書を含む市販用パッケージが提供される。

【0023】

さらなる実施形態において、（ａ）式IIの化合物；および（ｂ）線維性疾患を治療するためのその使用のための使用説明書を含む市販用パッケージが提供される。

【0024】

さらなる実施形態において、（ａ）式IIIの化合物；および（ｂ）線維性疾患を治療するためのその使用のための使用説明書を含む市販用パッケージが提供される。

【0025】

さらなる実施形態において、線維性疾患の治療のための式Ｉの化合物が提供される。

【0026】

さらなる実施形態において、線維性疾患の治療のための式IIの化合物が提供される。

【0027】

さらなる実施形態において、線維性疾患の治療のための式IIIの化合物が提供される。

【0028】

線維性疾患は、一またはそれ以上の以下：ケロイド、肥厚性瘢痕、肺線維症、腎線維症、肝硬変、白膜慢性炎症（ＣＩＴＡ）、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、腎性全身性線維症、クローン病、陳旧性心筋梗塞、強皮症、全身性硬化症、子宮筋腫および再狭窄から選択され得る。

【0029】

Ｑは、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、環状、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族である１〜６個の炭素基である。Ｒは、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、環状、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族である１〜６個の炭素基である。Ｔは、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、環状、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族である１〜６個の炭素基である。Ｚは、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、環状、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族である１〜６個の炭素基である。

【0030】

Ｑ’は、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、環状、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族である１〜６個の炭素基である。Ｒ’は、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、環状、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族である１〜６個の炭素基である。Ｔ’は、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、環状、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族である１〜６個の炭素基である。Ｚ’は、任意には飽和、不飽和、直鎖、分岐を含む直鎖、環状、分岐を含む環状、芳香族、部分的に芳香族または非芳香族である１〜６個の炭素基である。

【0031】

Ｅ_１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３、ＣＨ_３、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。Ｅ_２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３、ＣＨ_３、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。Ｅ_３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３、ＣＨ_３、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。Ｅ_４は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３、ＣＨ_３、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。Ａは、ＨまたはＮＨ_２である。Ｄは、

または

である。代替的には、ＡおよびＤは、以下：

、

、

から選択される６員環を形成していてもよい。Ｇは、ＣＨまたはＮである。Ｌ_１は、ＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨである。Ｍ_１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。Ｍ_４は、ＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。Ｘ_１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。

【0032】

Ｅ_１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３である。Ｅ_２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３である。Ｅ_３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３である。Ｅ_４は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３である。Ａは、ＨまたはＮＨ_２である。Ｄは、

であってもよい。代替的には、ＡおよびＤは、以下：

または

から選択される６員環を形成していてもよい。Ｇは、ＣＨまたはＮである。Ｌ_１は、ＯＨまたはＮＨ_２である。Ｍ_１は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。

【0033】

Ｅ_１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３である。Ｅ_２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３である。Ｅ_３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３である。Ｅ_４は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３またはＣＨ_３である。Ａは、ＨまたはＮＨ_２である。Ｄは、

であってもよい。代替的には、ＡおよびＤは、以下の構造：

を有する６員環を形成していてもよい。

【0034】

Ｅ_１は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。Ｅ_２は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。Ｅ_３は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。Ｅ_４は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。Ａは、ＨまたはＮＨ_２である。Ｄは、

であってもよい。代替的には、ＡおよびＤは、以下の構造：

を有する６員環を形成していてもよい。

【0035】

化合物は、式II：

II
の構造を有していてもよい。化合物は、式III：

III
の構造を有していてもよい。Ｌ_１は、ＯＨまたはＮＨ_２である。Ｌ_１はＯＨであってもよい。Ｅ_１は、ＨまたはＯＨである。Ｅ_２は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。Ｅ_３は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。Ｅ_４は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。

【0036】

Ｅ_１は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。Ｅ_２は、ＨまたはＯＨである。Ｅ_３は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。Ｅ_４は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。

【0037】

Ｅ_１は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。Ｅ_２は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。Ｅ_３は、ＨまたはＯＨである。Ｅ_４は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。

【0038】

Ｅ_１は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。Ｅ_２は、Ｈ、ＯＨまたはＮＨ_２である。Ｅ_３は、ＨまたはＯＨである。Ｅ_４は、ＨまたはＮＨ_２である。

【0039】

Ｅ_１は、ＨまたはＯＨである。Ｅ_２は、ＨまたはＯＨである。Ｅ_３は、ＨまたはＯＨである。Ｅ_４は、ＨまたはＮＨ_２である。

【0040】

化合物は、一またはそれ以上の以下：

、

、

、

、

、

、

および

から選択されてもよい。

【0041】

化合物は、一またはそれ以上の以下：

、

、

、

、

、

および

から選択されてもよい。化合物は、

であってもよい。化合物は、

であってもよい。化合物は、

であってもよい。化合物は、

であってもよい。化合物は、

であってもよい。化合物は、

であってもよい。化合物は、

であってもよい。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】ヒト皮膚線維芽細胞中のＭＭＰ−１発現のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）アップレギュレーション。パネルＡは、未処理（Ｃ）、アデノウイルスベクター（Ｖ）、またはＩＤＯの組み換え遺伝子を有するベクター（ＩＤＯ）のいずれかで４８時間形質導入された線維芽細胞を示しており、そして、ＩＤＯとその活性は、それぞれ、ウエスタンブロット（左パネル）およびキヌレニンレベルの測定（右パネル）によって検出された（「Ｎ．Ｄ」はキヌレニンのレベルが検出できなかったことを示す）。パネルＢは、４８時間培養された後、細胞溶解された、未処理、アデノウイルスベクター、およびＩＤＯ形質導入線維芽細胞を示し、そして、ＭＭＰ−１発現がウエスタンブロッティングにより検出された。パネルＣは、対照、空のベクター、またはＩＤＯアデノウイルスベクターで４８時間形質導入された線維芽細胞のいずれかから採取された馴化培地とインキュベートされた線維芽細胞を示し、ここで、ＭＭＰ−１発現はウエスタンブロッティングによって分析された。b−アクチンがパネルＡ、ＢおよびＣにおけるローディング対照として使用された。^＊は、ｐ＜０．００１であることを示す。

【図2】ヒト皮膚線維芽細胞におけるＭＭＰ−１の発現に対するキヌレニンとトリプトファンの効果。パネルＡおよびＢは、様々な濃度のキヌレニンの存在下４８時間培養された皮膚線維芽細胞を示し、ここで細胞は収集され、そして細胞溶解されており、その後ウエスタンブロッティングが行われ、βアクチンに対するＭＭＰ−１の比がパネルＢに示されている。パネルＣは、トリプトファン（２５ミｍｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で４８時間培養された皮膚線維芽細胞を示し、ここで細胞は収集され、そして細胞溶解されており、そしてＭＭＰ−１の発現がウエスタンブロッティングによって評価された。パネルＤは、種々のトリプトファンの濃度の存在下で４８時間培養された線維芽細胞を示し、ＭＭＰ−１の発現がウエスタンブロッティングにより評価された。β−アクチンは、すべてのパネルにおいてローディング対照のために使用された。

【図3】ヒト皮膚線維芽細胞におけるＭＭＰ−２及び−３発現におけるキヌレニンの効果。図は様々な濃度のキヌレニンの存在下で４８時間培養された皮膚線維芽細胞を示しており、ここで細胞は収集されそして細胞溶解され、その後ウサギモノクローナル抗ヒトＭＭＰ−２抗体（パネルＡ）、またはマウスモノクローナルＭＭＰ−３抗体（パネルＢ）を用いてウエスタンブロッティングが行われた。パネルＣは、３つの独立した実験における、ｂ−アクチンに対するＭＭＰ−３発現の比を示す。β−アクチンは、すべての実験において、ローディング対照として使用された。

【図4】ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ５２０ジェネリックＭＭＰ分析蛍光キットを用いたヒト皮膚線維芽細胞の馴化培地中のＭＭＰ活性の検出。図は、５０μｇ／ｍＬのキヌレニンの存在下（Ｋｙｎ）または非存在下（ＣＴＬ）で、４８時間培養された線維芽細胞を示し、ここで細胞馴化培地は収集され、その後１０００×ｇで１０分間遠心分離された後、上清が、製造業者の使用説明書に従ってＭＭＰの活性を検出するために使用された（培地は、３７℃で、１ｍＭのＡＰＭＡと共に３時間インキュベートされた。１ウェル当たり５０μＬのＭＭＰ含有サンプルが、５０μＬのＭＭＰ基質溶液と混合され、基質対照として使用され、そして１時間のインキュベーション後、ＥＸ／ＥＭ＝４９０ｎｍ／５２０ｎｍでの蛍光強度が測定された）。ＭＭＰの活性は相対蛍光単位（ＲＦＵ）として示される。データは、標準偏差（ｎ＝３）の平均値として示される。＊はＰ＜０．０５を示している。

【図5】異なるタイプの間葉系細胞におけるＭＭＰ−１発現に対するキヌレニンの効果 − 細胞は、１２．５〜１５０μｇ／ｍＬの濃度のキヌレニンとともに４８時間培養され、処置され、そしてＭＭＰ−１発現がウエスタンブロッティングによって分析され、β−アクチンが全ての実験においてローディング対照として使用された。パネルＡは、滑膜細胞におけるＭＭＰ−１の発現を示す。パネルＢは、肺線維芽細胞株ＩＭＲ−９０におけるＭＭＰ−１の発現を示す。

【図6】異なるタイプの間葉系細胞におけるＭＭＰ−１発現に対するキヌレニンの効果 − １２．５〜１５０μｇ／ｍＬの濃度のキヌレニンとともに４８時間培養され、および処置された細胞を示し、ＭＭＰ−１発現は、ウエスタンブロッティングによって分析され、β−アクチンが全ての実験においてローディング対照として使用され、ここで上部パネルと下部左側のパネルは、それぞれ負および正の対照として使用された、未処置およびキヌレニン処置された線維芽細胞の細胞溶解物を示す。

【図7】キヌレニンはヒト皮膚線維芽細胞においてＥＲＫ１／２リン酸化を刺激する − １００μｇ／ｍＬのキヌレニンの存在または非存在下で、６０分間培養された皮膚線維芽細胞を示し、ここで細胞は収集され、そして細胞溶解バッファで溶解され、その後抗体アレイがヒトホスホキナーゼアレイキット（Ｒ＆Ｄシステム（登録商標））を用いて行われた。ここで、スポット１、正の対照；スポット２、ホスホ−Ｐ３８α；スポット３、ホスホＥＲＫ１／２；スポット４、ホスホＧＳＫ−３α／β；スポット５、ホスホＰ５３；スポット６、正の対照である。

【図8】ヒト皮膚線維芽細胞におけるＭＥＫおよびＥＲＫ１／２リン酸化のキヌレニン刺激 − １００μｇ／ｍＬのキヌレニンの存在下、示された時間で培養された皮膚線維芽細胞を示し、ここで細胞は収集されそして細胞溶解され、リン酸化ＭＥＫまたはリン酸化ＥＲＫ１／２抗体のいずれかを用いてウエスタンブロットが行なわれた（βアクチンがローディング対照として使用された）。

【図9】− ＭＥＫまたはＥＲＫ１／２リン酸化阻害剤の添加は、皮膚線維芽細胞におけるキヌレニン刺激性ＭＭＰ−１発現の効果を無効にする。パネルＡ： 様々な濃度のＰＤ９８０５９の存在下あるいは非存在下で、１００μｇ／ｍＬのキヌレニンの存在下あるいは非存在下で培養された皮膚線維芽細胞を示す。パネルＢ：３０μＭのＰＤ９８０５９（ＥＲＫ１／２阻害剤）、３０μＭのＵ０１２６（ＭＥＫ阻害剤）、１０μＭのＵ０１２６を用いてまたは用いずに、１００μｇ／ｍｌのキヌレニンの存在下あるいは非存在下で培養された皮膚線維芽細胞を示す。ＭＭＰ−１発現は、ウエスタンブロットによって検出された（βアクチンは、すべての実験におけるローディング対照として用いた）。

【図10】− 皮膚線維芽細胞におけるＩ型プロコラーゲン発現に対するキヌレニン、キヌレン酸、キサンツレン酸の効果 − 示された濃度のキヌレニンで４８時間処置されたヒト皮膚線維芽細胞を示し（上側）、ここで細胞は収集され、そして細胞溶解バッファで溶解され、そして計５０μｇのタンパク質が８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画され、その後プロコラーゲンに対する抗体を用いてウエスタンブロッティングが行われた。β−アクチンは、ローディング対照として使用され、キヌレン酸（ＫＡ）またはキサンツレン酸（ＸＡ）もまた試験された（下側）。

【図11】− 線維芽細胞増殖に対するキヌレニンの効果 − 示された濃度のキヌレニン存在下で、４８時間培養されたヒト皮膚線維芽細胞を示す。ＭＴＴ細胞増殖アッセイが、本明細書中に記載されるように行われ、ここで、細胞増殖はＭＴＴアッセイにおける細胞指数（ＯＤ ５７０ｎｍ）として示されている。

【図12】− 創傷および瘢痕の臨床的外観および組織学 − ８日目から開始して３週間、未処置（ＣＴＬ）、ＣＭＣゲルのみ（Ｇｅｌ）、または０．１ｍＬのＣＭＣゲル中５０μｇキヌレニン（ｋｙｎ）のいずれかで毎日処置されたウサギの耳の創傷を示す。パネルＡ：未処置（ＣＴＬ）、ＣＭＣゲル（Ｇｅｌ）、またはＣＭＣゲル中キヌレニン（ｋｙｎ）の処置を受けた、２８日目の、２５倍顕微鏡による創傷の顕微鏡組織診を示す。パネルＢ：測定された瘢痕隆起指数（ＳＥＩ）を示す（未処置、ＣＭＣゲル、ＣＭＣゲル中のキヌレニンで処置された創傷におけるＳＥＩの平均±標準偏差）。＊はキヌレニン処置および未処置の対照間の顕著な差を示す（Ｐ＜０．００１）。＊＊はキヌレニンおよびＣＭＣゲル対照群の間の顕著な差を示す（Ｐ ＜０．０１）。パネルＣ：未処置皮膚創傷（左パネル）、クリーム処置創傷（中央パネル）、キヌレニン処置創傷（右パネル）の２５倍および１００倍に拡大されたマッソントリクローム染色された全層皮膚切片を示す。パネルＤ： 未処置創傷（計４つの創傷）、クリーム処置創傷（計４つの創傷）、キヌレニン処置創傷（計８つの創傷）のいずれかからの皮膚の総ヒドロキシプロリン含有量を示す。＊はＰ＜０．０１を示す。

【図13】− キヌレニン局所的適用は、ウサギの耳の皮膚におけるＩ型α１コラーゲンを減少させ、ＭＭＰ−１発現を増加させる − 上記と同様、未処置（ＣＴＬ）、またはゲルのみ（Ｇｅｌ）、またはキヌレニンが添加されたゲル（Ｋｙｎ）のいずれかで処置されたウサギの耳における創傷を示す。皮膚創傷は、トリゾール（登録商標）による全ＲＮＡを抽出するために使用され、そして１μｇのＲＮＡが、Ｉ型コラーゲン、ＭＭＰ−１、β−アクチンの定量的ＲＴ−ＰＣＲのｃＤＮＡを合成するために使用された。パネルＡ：ウサギの耳皮膚組織におけるＩ型α１コラーゲン相対的発現レベルを示す。パネルＢ：ウサギの耳皮膚組織におけるＭＭＰ−１の相対的発現レベルを示す。＊はｐ＜０．０５を示す。

【図14】− ヒト皮膚線維芽細胞中でのＭＭＰ−１の発現に対するキヌレニンアイソフォームの効果 − ５０μｇ／ｍｌのＤＬ−キヌレニン（ＤＬ−Ｋｙｎ）、またはＤ−キヌレニン（Ｄ−Ｋｙｎ）、またはＬ−キヌレニン（Ｌ−Ｋｙｎ）のいずれかの存在下あるいは非存在下（ＣＴＬ）で４８時間培養された皮膚線維芽細胞を示し、この時点で、細胞は収集され、そしてタンパク質溶解バッファで溶解され、（そして計５０μｇのタンパク質が１０％ ＳＤＳアクリルアミドゲル上へとロードされて）β−アクチンをローディング対照として使用して抗ヒトＭＭＰ−１抗体でウエスタンブロッティングが行われ、すべての試験されたキヌレニンアイソフォームは皮膚線維芽細胞中でのＭＭＰ−１発現を増加させたが、Ｌ−キヌレニンが他の２つのアイソフォームと比較してより大きな活性化を有しているようである。

【図15】− ヒト皮膚線維芽細胞中でのコラーゲン発現に対するキヌレニン（ＦＳ１）アナログの効果 − 様々な濃度の、ＤＬ−キヌレニン（ＦＳ１）、Ｌ−キヌレニン、Ｄ−キヌレニン、キヌレン酸（ＦＳ２）のいずれかで処置された皮膚線維芽細胞、および、リアルタイムＰＣＲによって検出された、β−アクチンを対照として用いたｍＲＮＡレベル中の対応するコラーゲン発現を示す。

【図16】− ヒト皮膚線維芽細胞中でのフィブロネクチン発現に対するキヌレニン（ＦＳ１）アナログの効果 − 様々な濃度のＤＬ−キヌレニン（ＦＳ１）、Ｌ−キヌレニン、Ｄ−キヌレニン、キヌレン酸（ＦＳ２）のいずれかで処置された皮膚線維芽細胞、および、リアルタイムＰＣＲによって検出された、β−アクチンを対照として用いたｍＲＮＡレベル中の対応するコラーゲン発現を示す。

【図17】− ＣｏｎＡ刺激性脾細胞増殖における、５０、１００、１５０μｇ／ｍＬのトリプトファン代謝物（ＦＳ１、ＬＫ、ＦＳ２、ＤＫ）の抑制効果の比較 − １００および１５０μｇ／ｍＬのＤ−Ｋｙｎ、Ｌ−Ｋｙｎ、ＤＬ−Ｋｙｎ（ＦＳ−１）およびキヌレン酸（ＦＳ２）での処置後、９６時間で、脾細胞の増殖におけるほぼ１／５の減少が観察され（ｐ＜０．０５）、４８時間後では、１００および１５０μｇ／ｍｌのＤ−Ｋｙｎ、Ｌ−Ｋｙｎ、およびＤＬ−Ｋｙｎでは脾臓細胞の増殖が、約１／２に顕著に減少したが、ＦＳ２は増殖に対してより少ない効果しか示さなかった。

【図18】− ＦＳ１（ＤＬ−キヌレニン）処置されたまたは未処置のマウス脾細胞における免疫因子タンパク質マイクロアレイ − ＦＳ１は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＣＸＣＬ９、およびＣＸＣＬ１０、ＦＳ１などのいくつかの炎症性サイトカインおよびケモカインの産生に対する免疫抑制効果を有し、そしてＦＳ１は、炎症において重要な役割を果たすと考えられるＩＬ−１７産生に顕著な減少をもたらしている。パネルＡ：４８時間、未処置のままの（ＣｏｎＡ）、または、１００μｇ／ｍＬのＫｙｎで処置された（ＣｏｎＡ＋Ｋｙｎ）活性化脾細胞を示し、この時点で、馴化培地（ＣＭ）が未処置のおよび処置された細胞から集められ、そしてその後プロテオームプロファイラ抗体アレイ（登録商標）メンブレンへと暴露され、パネルＢに示されているそれぞれの参照スポットにおける、未処置のおよび処置された細胞の両方の細胞の密度値パーセンテージが示されている。パネルＢ：プロテオームプロファイラ抗体アレイメンブレンによって識別されたシグナルを示す。パネルＣ：パネルＢに示されているスポット番号が示す参照タンパク質を表す。

【図19】− ヒト皮膚線維芽細胞中のＭＭＰ１発現におけるＦＳ１とＦＳ２の持続効果。パネルＡ：キヌレニン（ＦＳ１）とキヌレン酸（ＦＳ２）のＭＭＰ１発現に対する持続効果を示し、ここで線維芽細胞は、ＦＳ１またはＦＳ２（１００μｇ／ｍＬ）で４８時間処置され、そして培地が交換され、そして細胞が直ちに収集され、そして処置の除去後１２、２４、４８時間で、ウエスタンブロット法を用いて皮膚線維芽細胞中のＭＭＰ１発現が評価された。パネルＢ：処置された線維芽細胞中で算定されたＭＭＰ１／βアクチン発現比を示す。データは４つの独立した実験の平均±平均値の標準誤差である（＊はＰ値＜０．０５および＊＊はＰ値＜０．０１、ｎ＝４）。

【発明を実施するための形態】

【0043】

本明細書中で直接定義されていない用語は、本発明の技術内で理解される、それらに通常関連する意味を有していると理解されるべきである。本明細書を通して使用されるように、以下の用語は、特に明記されない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。

【0044】

本明細書で使用されるように、「対象（subject）」は、例えば鳥類または哺乳類などの動物を指す。特定の動物としては、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタまたは霊長目が挙げられる。対象は、さらにヒトであってもよく、代替的には患者と称される。対象はさらにトランスジェニック動物であってもよい。対象は、さらに、例えばビーバー、マウスまたはラットなどの齧歯動物であってもよい。

【0045】

本明細書で使用されるように、「阻害剤（inhibitor）」とは、生理的、化学的、または酵素的な作用または機能を抑制するまたは遅延させる薬物、化合物または薬剤を指す。阻害剤は、酵素の活性において少なくとも５％の減少をもたらし得る。阻害剤は、また、遺伝子もしくはタンパク質の発現、転写または翻訳を防げるまたは減少させる薬物、化合物もしくは薬剤を指す。

【0046】

「インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ」または「ＩＤＯ」は、トリプトファンをＮ−ホルミルキヌレニンへ、さらにはキヌレニン（Ｋｙｎ）へと触媒するヘム含有律速酵素であり、非肝細胞中の主にマクロファージおよびトロホブラスト中に見られる。最近の発見は、必須アミノ酸であるトリプトファンのＩＤＯによる異化が免疫寛容に関与していることを示している（Kahari and Saarialho-Kere、１９９７年）。本明細書中に示されるように、キヌレニンならびにその分解生成物であるキヌレン酸およびキサンツレン酸が、ＭＭＰ_１およびＭＭＰ_３を誘導し、インビトロおよびインビボで線維形成の減少が見られる。

【0047】

「マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloprotease）」または「ＭＭＰ」ファミリーは、哺乳類系において、２５個の亜鉛およびカルシウム依存性プロテイナーゼで構成される。それらの基質特異性、一次構造、細胞局在性にしたがって、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、マトリリシンおよび膜型ＭＭＰｓとして知られる密接に関係する５つの異なるサブファミリーのメンバーが同定されている（Murphyら、２００２年）。これらの全てのＭＭＰｓのうち、ＭＭＰ１は、コラーゲン分解プロセスに関与し、例えばＩ型、II型およびIII型などの間質コラーゲンを分解するプロセスに関与する、主な酵素であり、ＭＭＰ３（ストロメリシン−１）は、例えばフィブロネクチン、プロテオグリカンおよびラミニンなどのＥＣＭの非コラーゲンを主に分解することが知られているプロテアーゼである（Kahari and Saarialho-Kere、１９９７年）。ＭＭＰ１およびＭＭＰ−３の発現および線維芽細胞による遊離の両方における増大は、ＥＣＭのほぼすべての主要成分の分解を開始し得る（Sausら、１９８８年）。現在では、ケラチノサイトによって産生されるＭＭＰｓが上皮移動を容易にする一方、線維芽細胞によって発現されるＭＭＰｓは組織修復を促進することが認められている（Saloら、１９９１年）。

【0048】

「線維症（fibrosis）」は、器官または組織の正常な構成要素としての線維組織の形成とは対照的に、修復または反応プロセスとしての器官または組織における線維性結合組織の過剰な形成または発達を意味する一般的な用語である。瘢痕は、その下にある器官または組織の構造を消し去る集密的線維形成である。線維形成によって特徴付けられるまたは繊維形成と関連付けられる多くの疾患および／または症状があり、これらに限定される訳ではないが、例えば、ケロイド、肥厚性瘢痕、肺線維症、腎線維症、肝硬変、白膜慢性炎症（ＣＩＴＡ）、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、腎性全身性線維症、クローン病、陳旧性心筋梗塞、強皮症および全身性硬化症などが挙げられる。

【0049】

本明細書において、線維症によって特徴付けられるまたは線維症に関連する疾患または症状の治療における使用のためのいくつかの化合物が提供される。この記載の文脈において、用語「治療（treatment）」とは、既存の線維症または線維性疾患の治療を意味していてもよく、また代替的には、線維症の発症または進行を防止するための、線維形成プロセスの前またはそのあいだに発生する治療を指していてもよい。本明細書に記載の化合物は、単離されていてもよく、または、トレーサー化合物、リポソーム、炭水化物担体、ポリマー担体または当該技術分野における当業者にとって明白である他の薬剤もしくは賦形剤と連結されている、または組み合わされていてもよい。代替的な実施形態において、このような化合物は、医薬品を含んでいてもよく、ここでこのような化合物は薬学的に効果的な量で存在していてもよい。線維症または線維性疾患の予防または治療によって対象が利益を得るという事実によって、化合物はそれらを必要とする対象への投与に適しているかもしれない。化合物はまた、互変異性体または立体異性体を含んでいてもよい。

【0050】

本明細書中で使用される「ＦＳ」は、ＦｉｂｒｏＳｔｏｐｓ（例えば、ＦＳ_１はキヌレニン（またはＤＬ−キヌレニンもしくはＤＬ−Ｋｙｎ）の省略形として使用され、および、ＦＳ２またはＫＡはキヌレン酸の省略形として使用され得る）を指す。Ｌ−キヌレンは本明細書においてＬ−Ｋｙｎとして表され、Ｄ−キヌレニンは本明細書においてＤ−Ｋｙｎとして表され得る。同様に、キサンツレン酸は本明細書においてＸＡとして表され得る。

【0051】

本明細書で使用される用語「医薬（medicament）」とは、患者または試験対象に投与され得る、そして患者または試験対象において効果をもたらすことのできる組成物を指す。効果は、化学的、生物学的または物理的であり得、患者または試験対象は、ヒト、または非ヒト動物、例えば齧歯動物もしくは遺伝子組み換えマウスまたはイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ハムスター、モルモット、ウサギもしくはブタなどであり得る。医薬は、有効な化学成分単独で、または薬学的に許容され得る賦形剤との組み合わせから構成され得る。

【0052】

用語「薬学的に許容され得る賦形剤（pharmaceutically acceptable excipient）」には、生理学的に適合可能である、あらゆる溶媒、分散溶媒、コーティング剤、抗細菌、抗菌または抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。賦形剤は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、髄腔内、局所的または経口投与に適しているかもしれない。賦形剤は、滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液または分散液を含んでいてもよい。医薬の調製のためのこのような媒体の使用は当該技術分野において公知である。

【0053】

幾つかの実施形態による組成物または化合物は、公知のさまざまな経路により投与され得る。化合物の投与に適切であろう方法の例としては例えば、経口、静脈内、吸入、筋肉内、皮下、局所的、腹腔内、直腸内または膣内坐剤、舌下などが挙げられる。本明細書に記載の化合物は、滅菌水溶液として投与されてもよく、または、脂溶性賦形剤中で、もしくは適切な別の溶液、懸濁液、パッチ、錠剤またはペースト形式中で投与されてもよい。本明細書中に記載の化合物を含む組成物は、吸入による投与のために処方されてもよい。例えば、化合物はエアロゾル中での分散を可能にするような賦形剤と組み合わせられてもよい。吸入製剤の例は、当該技術分野における当業者にとって公知であろう。本明細書中に記載の化合物と組み合わせて、取り込みまたは代謝を助けるため、または、宿主内での分散を遅延させるために例えば徐放性製剤中などに他の薬剤が含まれていてもよい。徐放性製剤の例は当業者にとって公知であり、そして、マイクロカプセル化、炭水化物またはポリマーマトリックス内への挿入などが挙げられる。製剤を製造するための当該技術分野において公知の他の方法は、例えば、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」、（19th edition）、ed. A. Gennaro、1995、Mack Publishing Company、Easton、Paなどに見出すことができる。

【0054】

本明細書中に記載のいくつかの実施形態の組成物または化合物の投与量は、投与経路（経口、静脈内、吸入等）および組成物または化合物がその中で投与される形状（溶液、徐放性など）に依存して変わり得る。適切な投与量の決定は、当業者の通常の能力の範囲内である。本明細書中で使用されるように、医薬の「有効量（effective amount）」、「治療上の有効量（’therapeutically effective amount）」、「薬学的有効量（pharmacologically effective amount）」とは、薬物が使用される期間にわたってデリバリーされた薬物の治療的なレベルをもたらすような濃度で存在する医薬の量を意味する。これは、デリバリーのモード、投与期間、医薬を受け取る側の対象の年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事に依存し得る。有効量を決定するための方法は、当該技術分野において公知である。

【0055】

一実施形態において、線維性疾患を患うまたは線維性疾患が疑われる対象の治療のための方法であって、式Ｉ、IIまたはIIIに対応する構造を有する化合物の治療上の有効量を対象に投与する工程を含む方法が提供される。線維性疾患は以下うちの１つであり得る：ケロイド、肥厚性瘢痕、肺線維症、腎線維症、肝硬変、白膜慢性炎症（ＣＩＴＡ）、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、腎性全身性線維症、クローン病、陳旧性心筋梗塞、強皮症、全身性硬化症、子宮筋腫、再狭窄。

【0056】

材料および方法
細胞培養
新生児包皮および関節が、線維芽細胞、ケラチノサイト、滑膜細胞源として使用された。手続きはブリティッシュコロンビア大学のヒト倫理委員会の承認に基づいて行われた。ヒト包皮線維芽細胞の培養は、以前に記載されている方法で確立された（Ｌｉら、２００６年）。簡潔には、包皮が採集され、そして、抗菌性−抗カビ性調製物（１００ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬ アムホテリシンＢ）（インビトロジェンライフテクノロジーズ（登録商標）、メリーランド州ゲーサーズバーグ）で補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ（登録商標）、ニューヨーク州グランドアイランド）で３回洗浄された。検体は、脂肪を含まないように解剖され、そして直径２．０ｍｍ未満の小片に切り刻まれ、ＤＭＥＭで６回洗浄され、６０×１５ｍｍのペトリ皿に分配され、そして５％ＣＯ_２雰囲気中、水が添加された加湿インキュベーター中で、３７℃でインキュベートされた。培地は週２回交換された。コンフルエンスに達したところで、細胞は、トリプシン処理（０．１％ トリプシン、インビトロジェンライフテクノロジー（登録商標））および（０．０２％ ＥＤＴＡ、シグマ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）によって剥離され、１：６の比で継代培養のために分割され、そして７５ｃｍ^２のフラスコ中に再播種された。３〜７代の継代培養からの線維芽細胞が本研究のために使用された。

【0057】

ヒト包皮ケラチノサイトは以前に記載されている方法で確立された（Ｇｈａｈａｒｙら、１９９８年）。細胞は、ウシ下垂体抽出物（５０μｇ／ｍＬ）およびＥＧＦ（０．２ｎｇ／ｍＬ）で補充された無血清ケラチノサイト培地（ＫＳＦＭ；インビトロジェンライフテクノロジーズ（登録商標））中で培養された。これらの細胞は、２〜５代の継代培養で使用された。

【0058】

滑膜細胞は、関節置換術のあいだに関節リウマチを患う患者からの滑膜の、ＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェンライフテクノロジーズ（登録商標））中での３７℃で４時間、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ（登録商標））を用いた酵素消化によって採取された。分離された細胞は、ペニシリンＧナトリウム（１００Ｕ／ｍＬ）、硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびアムホテリシンＢ（０．２５μｇ／ｍＬ）で補充された滑膜細胞増殖培地（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．（登録商標）、サンディエゴ、カリフォルニア）中に播種された。滑膜細胞は、形態学的に均一な繊維芽細胞様細胞であることが発見され、２〜５代で使用された。

【0059】

頭頸部癌を患う患者由来の扁平上皮癌（ＵＭＳＣＣ）細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、ＶＡ）が、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持された。ヒトケラチノサイト細胞株ＨＡＣＡＴ（ＡＴＣＣ）およびヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ（登録商標））が、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養された。正常二倍体肺線維芽細胞 ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ（登録商標））が、１０％ＦＢＳを含む最小必須培地（ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））中で維持された。

【0060】

アデノウイルスベクターによる遺伝子トランスフェクション
インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）発現アデノウイルスベクターの構築は、以前に記載されている（Ｌｉら、２００４年）。組換えアデノウイルスが、感染多重度（ＭＯＩ）１００で、ヒト皮膚線維芽細胞を感染させるために使用された。遊離のウイルス粒子は感染後３０時間で培地から取り除かれた。感染の成功は、レポーター遺伝子ＧＦＰを観察するためのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）フィルターを備えた、ＭＯＴＩＣ（登録商標）倒立顕微鏡（ＭＯＴＩＣインスツルメンツ（登録商標）、リッチモンド、ブリティッシュコロンビア、カナダ）を用いて蛍光顕微鏡法によって確認された。ＩＤＯの発現は、以前に記載されているように、抗ヒトＩＤＯ抗体を用いてウエスタンブロットによって評価された（Ｌｉら、 ２００４年）。ＩＤＯの生物学的活性は、馴化培地中に存在するトリプトファン分解産物、キヌレニンのレベルを測定することによって評価された。

【0061】

馴化培地中のキヌレニン測定
キヌレニンのレベルは、以前に記載されている方法により測定された（Ｔｏｋｉｋａｗａら、１９８８年）。簡潔には、約２ｍＬの馴化培地が、同じ数の細胞数で開始された、トランスフェクション３日後の培養物から採集された。馴化培地からのタンパク質が、トリクロロ酢酸により沈殿された。沈殿したタンパク質を除去するための遠心分離後、約０．５ｍＬの上清が新しい１．５ｍＬチューブに移され、そして室温で１０分間、等容積のエーリック試薬（シグマ（登録商標））を用いてインキュベートされた。得られた溶液の吸収が、２時間以内に、分光光度計によって、４９０ｎｍで測定された。馴化培地中のキヌレニンの値は、規定のキヌレニン濃度（０〜２０mｇ／ｍＬ）を用いた標準曲線により算出された。

【0062】

細胞処理
馴化培地の収集のために、線維芽細胞は、添加なしまたは対照モックベクターまたはＩＤＯアデノウイルスによって、３０時間形質導入された。ウイルスはＰＢＳを用いた洗浄により除去された。１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含む新鮮なＤＭＥＭが添加され、そして、細胞はさらに４８時間培養され続けた。その後、未処置、モックベクターまたはＩＤＯアデノウイルスにより形質導入された線維芽細胞からの馴化培地が収集された。８０％コンフルエンスである線維芽細胞が、１０％ＦＢＳの存在下で、９０％の馴化培地に加えて１０％の新鮮培地を含む培地で処置された。その後細胞は４８時間後に回収され、ウエスタンブロット分析が行われた。

【0063】

実験の別のセットでは、８０％のコンフルエンスである線維芽細胞が、結果の項で記載されている濃度でキヌレニンまたはトリプトファンのいずれかと、２％のＦＢＳと抗生物質を含むＤＭＥＭ中で４８時間処置された。その後、細胞がトリプシン処理により収集され、ウエスタンブロット分析が行われた。

【0064】

同様に、滑膜細胞、ＩＭＲ−９０、ケラチノサイト、ＵＭＳＣＣおよびＡ５４９などの他の細胞が、上述されたように、各細胞型に対して適切な培地中で４８時間、１２．５〜１５０μｇ／ｍＬの濃度のキヌレニンを用いて処置された。その後、細胞はウエスタンブロット分析のため収集された。

【0065】

ウエスタンブロット分析
細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡによって採集され、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＥＧＴＡ、１％トリトンＸ−１００（登録商標）、０．５％のＩｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、０．０２５％ＮａＮ３およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ（登録商標））を含む細胞溶解バッファを用いて溶解された。細胞片は、１０分間、２０，０００×ｇで遠心分離によって除去された。上清中のタンパク質濃度は、ＭｉｃｒｏＢＣＡ（登録商標）法（ピアース（登録商標）、ロックフォード、イリノイ）を用いて測定された。上清中のタンパク質は、タンパク質サンプルローディングバッファ（最終濃度：６０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８０）、２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、１．５％ βーメルカプトエタノール、０．００２％ ブロモフェノールブルー）と混合され、そしてサイズは１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによってサイズ分画された。タンパク質が、ｉＢｌｏｔ（登録商標）（インビトロジェンライフテクノロジー（登録商標））によってニトロセルロースメンブレン上に転写された後、非特異的結合が、５％スキムミルクを含むリン酸緩衝化生理食塩水twenty２０（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて、１時間、ブロックされた。膜はその後、一次抗体とともに終夜インキュベートされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、タンパク質バンドが、高感度化学発光（ＥＣＬ（登録商標））検出システム（サンタクルーズバイオテクノロジー（登録商標）、サンタクルーズ、カリフォルニア）によって可視化された。本研究で用いられた一次抗体は、マウスモノクローナル抗ヒトＭＭＰ−１（Ｒ＆Ｄシステムズ（登録商標）、ミネアポリス、ミネソタ）、マウスモノクローナル抗ヒトＭＭＰ−３（Ｒ＆Ｄシステム（登録商標））、ウサギモノクローナル抗ヒトＭＭＰ−２（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ（登録商標）、バーリンゲーム、カリフォルニア）、ウサギポリクローナル抗リン酸化ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１（登録商標））（セルシグナリングテクノロジー（登録商標）、ダンバース、マサチューセッツ）、ウサギポリクローナル抗リン酸化Ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（セルシグナリングテクノロジー（登録商標））、モノクローナル抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ（登録商標））、マウス抗１型プロコラーゲン（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ（登録商標）、アイオワシティー、アイオワ）であった。二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＰＲコンジュゲートまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＰＲコンジュゲート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（登録商標）（ミシソーガ、ＯＮ、カナダ）のいずれかであった。二次抗体は、１：３０００の濃度で使用された。

【0066】

ＭＭＰ活性アッセイ
ＭＭＰｓの活性は、製造業者のプロトコールに従って、ＭＭＰ基質として、Ｆ−ＦＡＭ ／ ＱＸＬ（登録商標）５２０蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペプチド（ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ ５２０汎用ＭＭＰアッセイキット、ＡｎａＳｐｅｃ Ｉｎｃ．（ＴＭ）、フレモント、カリフォルニア）を使用して評価された。簡潔には、細胞は５０μｇ／ｍＬのキヌレニンと共に、または無しで４８時間処理された。馴化培地が回収され、そして、３時間、３７℃で１ｍＭ ＡＰＭＡ（４−アミノフェニル酢酸水銀、成分Ｃ中、ＡｎａＳｐｅｃｔ（登録商標））と共にインキュベートした。ＡＰＭＡによるＭＭＰｓ活性化後、９６ウェルプレートで１ウェル当たり５０μＬの馴化培地が５０μＬのＭＭＰ基質溶液と混合された。室温で６０分間インキュベートされた後、基質対照を含む各サンプルにおいて、ＥＸ／ＥＭ＝４９０ｎｍ／５２０ｎｍでの蛍光強度が、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５００（登録商標）蛍光マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ（登録商標）、モリスビル、ノースカロライナ）を使用して測定された。

【0067】

タンパク質アレイのリン酸化
９０％コンフルエンスでのヒト線維芽細胞が、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中終夜飢餓状態とされた後、２時間、１００μｇ／ｍＬのキヌレニンを用いてまたは無しで処置された。タンパク質のリン酸化は、製造業者の使用説明書に従ってＨｕｍａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｋｉｎａｓｅ Ａｒｒａｙ（登録商標）（Ｒ＆Ｄシステム（登録商標））を用いて評価された。簡潔には、捕捉および対照抗体が、ニトロセルロースメンブレン上に２つ組でスポットされた（合計で４６個のキナーゼリン酸化部位）。細胞溶解物（アレイ当たり３００μｇの総タンパク質）がアレイとともに終夜でインキュベートされた。アレイは未結合のタンパク質を除去するために洗浄され、続いてビオチン化検出抗体のカクテルとともにインキュベートされた。ストレプトアビジン−ＨＰＲとの３０分間のインキュベーション後、シグナルがＥＣＬ検出システム（サンタクルーズ（登録商標））によって可視化された。ブロットはデンシトメトリーによって分析され、そしてタンパク質のリン酸化がそれぞれのメンブレンにおいて示されている正の対照に対して正規化された。

【0068】

ウサギの耳の肥厚性瘢痕モデルとキヌレニンの局所的適用
４．５〜５ｋｇの体重のメスのウサギ（ニュージーランドホワイト）がこの研究のために使用された。プロトコールは、ブリティッシュコロンビア大学動物飼育委員会によって検討および承認された。ウサギ耳の肥厚性瘢痕のモデルは以前に記載されている方法で作製された（Ｒａｈｍａｎｉ−Ｎｅｉｓｈａｂｏｏｒら、２０１０年）。簡潔には、２匹のウサギは、ケタミン（２２．５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２．５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射によって、さらに気管挿管を通じたイソフルランガスによって麻酔された。皮膚の全層の切片を除去するため、８ミリの皮膚生検パンチを使用して、それぞれの耳の腹側の軟骨を露出するために４つの傷が作製された。キヌレニン処置が開始されるまで、毎日、抗生物質が傷に適用された。

【0069】

５００μｇ／ｍＬの濃度であるＣＭＣゲル中のキヌレニン（Ｒａｈｍａｎｉ−Ｎｅｉｓｈａｂｏｏｒら、２０１０年）が創傷後１週間から開始して、３週間毎日、実験群の創傷へ局所的に適用された（傷当たり０．１ｍＬ）。対照群の創傷は、毎日、等量のクリーム単独による処置を受けた。

【0070】

動物は処置後３週間で犠牲死させた。瘢痕（１０ｍｍパンチ生検）が収集された。各瘢痕は、その長手方向軸に沿って２つに切断し、そしてそれらの半分は通常の組織学的分析のために処理され、他の半分は将来の使用のために−８０℃で保管された。

【0071】

瘢痕隆起は、Ｈ＆Ｅ染色した組織切片からの瘢痕隆起指数（ＳＥＩ）を測定することにより定量化された。ＳＥＩは、肥厚性瘢痕の下の正常組織にたいする創傷組織中の総計の高さの比である。１のＳＥＩは、瘢痕の高さが周囲の無傷の真皮と等しいことを示し、１より大きいＳＥＩは隆起した肥厚性瘢痕を示す。

【0072】

ＭＴＴアッセイ
ヒト皮膚線維芽細胞の増殖に対するキヌレニンの効果がＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］アッセイによって検出された。簡潔には、１０，０００個の細胞が２４ウェルプレート上に播種され、４８時間、種々の濃度のキヌレニンとともにインキュベートされた。培地が除去され、そして０．２ｍＬのＭＴＴ（２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中５ｍｇ／ｍＬ）が添加された。細胞はＭＴＴと共に４時間インキュベートされた。ＰＢＳを用いて３回洗浄した後、０．２ｍＬのＤＭＳＯが結晶を溶解させるために添加された。吸収が５７０ｎｍで測定された。

【0073】

皮膚試料からのヒドロキシプロリン含量の測定：以前に記載されている方法（Ｇａｗｒｏｎｓｋａｏ−Ｋｏｚａｋ Ｂら、２００６年）にしたがい、直径８ｍｍの皮膚パンチの半分が秤量され、そして−８０℃で凍結された。皮膚は、２ｍＬのＰＢＳ中で、ホモジナイズされ、そして４℃で終夜保管された。翌日、１ｍＬの６Ｎ ＨＣｌが添加され、そして混合物が１２０℃で５時間加熱された。２０μＬの冷却された試料および５０μＬのクロラミンＴ溶液が９６ウェルプレートに添加され、そして室温で２０分間インキュベートされた。５０μＬのエーリッヒ溶液が次いで添加され、そして混合物が１５分間６５℃でインキュベートされた。吸光度が５７０ ｎｍで測定された。ヒドロキシプロリン濃度は標準曲線によって算定された。

【0074】

ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成および定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡは、トリゾール（登録商標）（インビトロジェンライフテクノロジーズ（登録商標））により抽出した。簡潔には、１ｍＬのトリゾール（登録商標）がホモジナイズされた皮膚組織に添加された。混合物は室温で５分間静置された後、２５０μＬのクロロホルムが添加された。２０，０００×ｇでの１０分間の遠心分離後、上層の水相が新たなエッペンドルフチューブに移された。等量のイソプロパノールが水相に添加され、そして静かに混合された。２０分間の遠心分離後、ペレットは１ｍＬの７５％エタノールで洗浄された。ＲＮＡは、ＤＥＰＣ処理したＨ_２Ｏ中に溶解され、そしてその濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ２０００（登録商標）によって測定された。ｃＤＮＡは、製造業者の説明にしたがい、それぞれのサンプル中１μｇの総ＲＮＡを使用して、ロシュ製ｃＤＮＡ合成キットにより合成された。ウサギＩ型α１コラーゲン、ＭＭＰ−１およびハウスキーパー遺伝子であるβアクチンに関する定量的リアルタイムＰＣＲがＶｉｉＡ７（インビトロジェン（登録商標））で行われた。ｃＤＮＡサンプルが、ＳＴＢＲグリーンマスターミックス（登録商標）（Ｒｏｘ）（ロシュ（登録商標）、インディアナポリス、インディアナポリス）を含むＰＣＲ反応マスターミックスに添加された。全ての反応は、以下のサイクル条件を用いて、２つ組で行われた：９５℃で１０分間を１サイクル。９５℃で１５秒および６０℃で１分間を４０サイクル。それぞれのサンプル中のＩ型α１コラーゲンおよびＭＭＰ−１の発現レベルが、βアクチンに対して正規化された。ＲＴ−ＰＣＲプライマーは、ウサギＩ型α１コラーゲン：５’−ＡＣＡＡＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＧＡＡＣ−３’（フォーワード）、５’−ＧＣＣＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＣＣ−３’（リバース）；ＭＭＰ−１：５’−ＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＧ−３’（フォーワード）、５’−ＡＧＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧ−３’（リバース）；b−アクチン、５’−ＡＡＣＧＡＧＣＧＣＴＴＣＣＧＴＴＧＧＣＣＣ−３’（フォーワード）、５’−ＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＧＧＴＣＣＧＣＧＡ−３’（リバース）。

【実施例】

【0075】

実施例１ インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）発現はヒト皮膚線維芽細胞中のＭＭＰ−１の発現を上方制御する。
ＭＭＰ−１発現におけるＩＤＯの効果を評価するため、ヒトＩＤＯ組換えアデノウイルスベクターが、以前に報告された手順（Ｌｉら、２００４年）によって、ヒト皮膚線維芽細胞での遺伝子導入のために使用された。トランスフェクション効率は、それぞれ、ウエスタンブロット分析を介したＩＤＯタンパク質発現およびその活性の検出、ならびに、馴化培地中でのキヌレニン測定によって評価された。図１Ａの左パネルに示されるように、ＩＤＯタンパク質は、ＩＤＯのアデノウイルス形質導入線維芽細胞中で発現されたが、対照およびモックアデノウイルス形質導入された線維芽細胞においては検出できなかった。キヌレニンのレベル、ＩＤＯ活性のインデックスは、形質導入されていない、またはモック形質導入された対象（図１Ａ、右パネル）中のものと比較して、ＩＤＯのアデノウイルス形質導入線維芽細胞において顕著により高かった（１４．３±０．４６μｇ／ｍＬ、ｎ＝３）。

【0076】

対照、モック形質導入されたおよびＩＤＯ発現の線維芽細胞中でのＭＭＰ−１の発現が、ウエスタンブロット分析を用いて試験された。図１Ｂに示されるように、モック形質導入された線維芽細胞（１．３７±０．５９、Ｎ＝３）および未処理の対照線維芽細胞（１±０、Ｎ＝３）中のものと比較して、ＩＤＯ発現線維芽細胞中のＭＭＰ−１発現において９倍以上の増大が見られた（１２．５６±２．３７、ｎ＝３）。この発見は、モック形質導入された線維芽細胞がＭＭＰ−１発現において未処置の線維芽細胞からの顕著な差異を示さなかったため、ＩＤＯ発現線維芽細胞におけるＭＭＰ−１発現のアップレギュレーションはアデノウイルス感染に起因するものでないことを示唆している。

【0077】

ＩＤＯはトリプトファンをキヌレニンへと変換する細胞内酵素である。よって、ＩＤＯ発現線維芽細胞におけるＭＭＰ−１刺激の効果が、ＩＤＯタンパク質自体に起因するのか、またはトリプトファン代謝物に起因するのかどうかを明確にする必要がある。これに対処するために、ＩＤＯ発現線維芽細胞および対照の両方からの馴化培地を、４８時間後に収集した。９０％の収集された馴化培地と１０％の新鮮な培地との組み合わせを、その後、皮膚線維芽細胞を処置するために使用された。細胞は処置後４８時間で回収された。図１Ｃに示されるように、ＭＭＰ−１発現の著しい増加が、モック形質導入された線維芽細胞（１．１６±０．３１、ｎ＝３）または未処置の対照線維芽細胞（１±０、ｎ＝３）におけるものと比べて、ＩＤＯ形質導入線維芽細胞（２．０６±０．６２、ｎ＝３）からの馴化培地で処理された細胞において観察された。この結果は、細胞内ＩＤＯタンパク質でなくむしろ、ＩＤＯアデノウイルス感染した線維芽細胞からの馴化培地における因子（または複数の因子）が、線維芽細胞におけるＭＭＰ−１発現レベルの上昇を引き起こしたことを示唆するものである。

【0078】

実施例２ − ヒト皮膚線維芽細胞において、トリプトファン枯渇ではなく、キヌレニンがＭＭＰ−１発現を誘導する
ＩＤＯはトリプトファンをキヌレニンへ転換する酵素である。どの因子（トリプトファン枯渇またはキヌレニンの増加のいずれか）が、ＭＭＰ−１発現のＩＤＯアップレギュレーションの原因であるのかを調べる。どの因子がＭＭＰ−１発現のＩＤＯアップレギュレーションの原因であるのかを調べるため、線維芽細胞は、トリプトファン枯渇培養培地または種々の濃度のキヌレニンを含む通常の培地のいずれかの中で培養された。細胞はその後、ウエスタンブロッティングを使ってＭＭＰ−１発現を評価された。図２Ｃに示されるように、トリプトファン枯渇培養培地中または２５μｇ／ｍＬのトリプトファンの存在下で増殖された線維芽細胞のあいだで、ＭＭＰ−１発現には顕著な差は認められなかった。しかし、ＭＭＰ−１の発現はキヌレニンの異なる投与量（２５〜１５０μｇ／ｍＬ）に応答して著しく増加した（図２Ａおよび図２Ｂ）。これらの発見は、トリプトファン枯渇でなくキヌレニンの存在が、ＩＤＯ発現細胞におけるＭＭＰ−１のアップレギュレーションに寄与していることを示唆している。さらに、発明者らは、わずか１２．５μｇ／ｍＬというキヌレニンが、皮膚線維芽細胞におけるＭＭＰ−１の発現を刺激し得ることを発見した（データは示さず）。キヌレニンのこの濃度は、ＩＤＯ発現線維芽細胞からの馴化培地中で検出されたものと同程度である（図１Ａ、右パネル）。同様の構造を有するさまざまな濃度のトリプトファンの添加では、皮膚線維芽細胞におけるＭＭＰ−１の発現を増加させることはできなかった（図２Ｄ）ため、したがって、線維芽細胞におけるＭＭＰ−１の刺激は明らかにキヌレニンに特有である。

【0079】

実施例３ − 皮膚線維芽細胞におけるＭＭＰ−２およびＭＭＰ−３発現に対するキヌレニンの効果
キヌレニンが他のＭＭＰの発現に影響を与えるかどうかを調べるために、図２で使用されたものと同様な濃度のキヌレニンによって皮膚線維芽細胞を処置した。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−３発現を検出するため対照として未処理の細胞を用いてウエスタンブロットが使用された。図３Ａに示されるように、キヌレニン処置された線維芽細胞と未処理の線維芽細胞のあいだにおいて、ＭＭＰ−２発現について顕著な差は見られなかった。しかし、同様の条件下で、キヌレニン処置は、皮膚皮線維芽細胞におけるＭＭＰ−３の発現を、用量依存的に、顕著に増加させた（図３Ｂ／３Ｃ）。さらに、キヌレニン処置された線維芽細胞における増大されたＭＭＰが増大されたＭＭＰ活性を伴っているのかどうかを試験するために、５０μｇ／ｍＬのキヌレニンの存在下または非存在下における線維芽細胞からの馴化培地が処置後４８時間収集された。馴化培地中のＭＭＰ活性は、ＭＭＰ基質として、５−ＦＡＭ／ＱＸＬ（登録商標）５２０蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペプチドを用いて、一般的なＭＭＰアッセイキットであるＳｅｎｓｏＬｙｔｅ ５２０（登録商標）によって検出された。図４に示されるように、キヌレニン処置された線維芽細胞からの馴化培地中の平均ＭＭＰ活性は、対照培地中と比較して著しく高かった。これはキヌレニンによって処置された線維芽細胞における増大されたＭＭＰｓは酵素活性を有していることを示している。

【0080】

実施例４ − 間葉系および上皮細胞はキヌレニン処置に対して異なる応答をする
どのような種類の細胞がキヌレニン誘導性ＭＭＰ−１発現に対して感受性であるのかを調べるために、間葉系細胞（固定化肺線維芽細胞株ＩＭＲ−９０および線維芽細胞様滑膜細胞など）および上皮細胞（肺上皮癌細胞株Ａ５４９、一次皮膚ケラチノサイト、固定化ヒトケラチノサイト細胞株ＨＡＣＡＴ、および頭頸部扁平上皮癌細胞株ＵＭＳＣＣなど）の両方が使用された。図５に示されるように、皮膚線維芽細胞と同様に、滑膜細胞およびＩＭＲ−９０におけるＭＭＰ−１発現は、１２．５μｇ／ｍＬ〜１５０μｇ／ｍＬの濃度のキヌレニン処置によってアップレギュレートされた。しかしながら、皮膚ケラチノサイト、ＨＡＣＡＴ、Ａ５４９およびＵＭＳＣＣを含む、テストされた全ての上皮細胞においてＭＭＰ−１の発現は、さまざまな濃度のキヌレニンに対する応答において未処置の対照と顕著には違わなかった（図６）。これらの結果は、キヌレニン刺激性ＭＭＰ−１発現への応答において間葉系および上皮細胞の間に差異があることを示唆している。

【0081】

実施例５− キヌレニンで処置された細胞中のホスホキナーゼアレイによるリン酸化シグナル分子の同定
皮膚線維芽細胞におけるキヌレニンによりアップレギュレーションされるＭＭＰ−１発現の考えられるメカニズムを決定するため、ホスホキナーゼアレイを使用して、複数のセリン、スレオニン、チロシンキナーゼの活性化を分析した。このアレイは、４６種のタンパク質キナーゼおよびその下流転写因子の活性化ステータスを同時に検出可能である。図７に示されているように、皮膚線維芽細胞におけるキヌレニンによる処置の１時間後、細胞外シグナル制御キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）が活性化された。

【0082】

ホスホキナーゼアレイからのこれらの結果を確認するために、皮膚線維芽細胞が、１００μｇ／ｍＬのキヌレニンで種々の時間処置された。アレイ上に配置されたものと異なる抗体を用いたイムノブロット分析が、その後、ＥＲＫ１／２およびその上流分子のマイトジェン活性化タンパク質／細胞外シグナル調節キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）のリン酸化を検出するために使用された。図８に示されるように、ＥＲＫ１／２は、キヌレニンで処置された細胞中でリン酸化された。この結果はさらに、キヌレニンで処置された細胞におけるＥＲＫ１／２上流のシグナル分子ＭＥＫのリン酸化の検出によって確認された（図８）。ＥＲＫ１／２およびＭＥＫの両方は、キヌレニン処置の後８時間に、そのピークを有する類似した活性化パターンを示した（図８）。

【0083】

実施例６ − ＭＥＫ−ＥＲＫ１／２リン酸化に対する阻害剤の添加は、皮膚線維芽細胞中でのキヌレニン刺激性ＭＭＰ−１発現の効果を無効にする
他のセットの実験において、キヌレニンによるＭＥＫ−ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫ経路の活性化が、皮膚線維芽細胞中でのキヌレニン刺激性ＭＭＰ−１発現に関連しているのかどうかをテストした。これを行うために、ＭＥＫまたはＥＲＫ１／２リン酸化の阻害剤の、キヌレニン刺激性ＭＭＰ−１発現における効果を調べた。図９Ａに示されているように、ＥＲＫ１／２活性化に対する特異的阻害剤であるＰＤ９８０５９の添加は、用量依存的に、ＭＭＰ−１発現に対するキヌレニンの刺激作用を効果的に防止した。同様に、ＭＥＫの活性化に対する特異的な阻害剤であるＵ０１２６の１０μＭおよび３０μＭを用いた細胞の処置はまた、キヌレニンによるＭＭＰ−１発現のアップレギュレーションを顕著に減少させた（図９Ｂ）。これらの結果は、ＭＥＫ−ＥＲＫ１／２シグナル伝達経路の活性化が皮膚線維芽細胞中でキヌレニンによって誘導されるＭＭＰ−１発現のアップレギュレーションに寄与することを示している。

【0084】

実施例７ − 皮膚線維芽細胞中のコラーゲン発現におけるキヌレニンの効果および線維芽細胞の増殖
インビボにおけるその抗線維化の役割を検討する前に、キヌレニンは、コラーゲン発現および細胞増殖に対するその効果について試験された。図１０（上部）に示されるように、２５〜１５０μｇ／ｍＬのキヌレニンの添加は、Ｉ型プロコラーゲンの発現を著しく減少させた。しかしながら、細胞が１５０μｇ／ｍＬの濃度までのキヌレニンで培養された場合であっても、線維芽細胞の増殖における顕著な効果は見られなかった（図１１）。また、キヌレニンアナログ／代謝物、キヌレン酸、キサンツレン酸を試験すると、これらの化合物はまたＩ型プロコラーゲン（図１０下部）の発現を阻害するのに有効であることが示された。

【0085】

実施例８ − ウサギの耳の創傷へのキヌレニンの局所的適用が瘢痕化を低減する
キヌレニンによる皮膚線維芽細胞の処置が、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３の両方の発現における増加ならびにＩ型プロコラーゲン発現における減少を示したため、キヌレニンが抗線維化剤として肥厚性瘢痕の治療または予防に使用され得るのかどうかを調べることは興味深いと考えられる。以前に記載されているように（Ｒａｈｍａｎｉ−Ｎｅｉｓｈａｂｏｏｒら、２０１０年；Ｋｌｏｅｔｅｒｓら、２００７年；Ｘｉｅら、２００８年）、ウサギの耳の肥厚性瘢痕のモデルが使用された。創傷後８日目から開始して３週間のあいだ、５０μｇのキヌレニンを含むカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ゲル０．１ｍＬで創傷が毎日処置された。創傷１か所あたり５０ミリグラムのキヌレニンという用量は、最適な結果をもたらすインビトロ系において使用される量に一致するものである。この結果は、未処置またはＣＭＣゲルで処置された対照のどちらと比較しても、キヌレニン処置された創傷において創傷閉鎖に対して有意な差異がないことを示した（データは示さず）。しかしながら、図１２Ａに示されるように、キヌレニンで処置した創傷においては、３週間後、未処理の創傷またはビヒクルのみの対照創傷のと比較して、顕著により小さな瘢痕しか見られなかった。平均の瘢痕隆起指数（ＳＥＩ）は、ビヒクルのみの対照群（１．９７８±０．４４２、ｎ＝４、ｐ＜０．０１）および未処置群（２．０９８±０．３２４、ｎ＝４、ｐ＜０．００１）と比較して、キヌレニン処置群（１．１７２±０．１５６、ｎ＝８）において、著しく低下した（図１２Ｂ）。コラーゲンに関するマッソントリクローム染色によって、未処置またはゲルのみの処置を受けた創傷と比較して、キヌレニンで処置された創傷におけるコラーゲン含有量が著しくに低下したことが明らかとなった（図１２Ｃ）。この発見と一致して、ヒドロキシプロリン含有量（組織コラーゲン含有量の指標として使用される）は、未処置またはゲルのみの処置を受けた創傷と比較して、キヌレニンで処置された創傷において著しく低かった（図１２Ｄ）。

【0086】

最終的に、発明者らは、ウサギの耳の線維化モデルにおけるキヌレニンの局所的適用が、未処置またはゲルのみの処置を受けた創傷と比較して、Ｉ型α１コラーゲンの発現を減少させ、そしてＭＭＰ−１の発現を増加させていることを示した（図１３）。これらの結果は、さらに、キヌレニンが肥大性瘢痕、および、熱傷または外科的切開を受けた患者において頻繁に見られるケロイドでさえを処置するための抗線維化因子として使用できる可能性があるという仮定を支持するものである。

【0087】

実施例９ − ヒト皮膚線維芽細胞におけるＭＭＰ−１発現に対するキヌレニンアイソフォームの効果
キヌレニンの種々のアイソフォームが、それらのＭＭＰ−１の発現に影響を与える可能性について試験された。試験されたアイソフォームは、ＤＬ−キヌレニン（ＤＬ−Ｋｙｎ）またはＤ−キヌレニン（Ｄ−Ｋｙｎ）およびＬ−キヌレニン（Ｌ−Ｋｙｎ）であった。結果は、全てのアイソフォームが皮膚線維芽細胞におけるＭＭＰ−１の発現を増加させることが示したが、Ｌ−キヌレンは他の２つのアイソフォームと比較してより高い活性を有しているようである。図１４を参照のこと。

【0088】

実施例１０ − ヒト皮膚線維芽細胞中のコラーゲン発現における種々のキヌレニンアイソフォーム／アナログの効果
図１５に示されるように、皮膚線維芽細胞が、ＦＳ−１（ＤＬ−キヌレニン）またはＤ−キヌレニンまたはＬ−キヌレニンまたはＦＳ_−２（キヌレン酸）のいずれかで処置された。Ｉ型α１コラーゲンの発現がリアルタイムＰＣＲにより検出された。結果は、これらのアイソフォーム／アナログがコラーゲン発現を減少させることにおいて同様の効果を有していることを示す。

【0089】

実施例１１ − キヌレニンおよびその代謝物は、培養線維芽細胞中のフィブロネクチン発現をダウンレギュレーションする
図１６に示されるように、皮膚線維芽細胞が、さまざまな濃度のＤＬ−キヌレニン（ＦＳ_１）、Ｌ−キヌレニン、Ｄ−キヌレニンまたはキヌレン酸（ＦＳ_２）のいずれかによって処置された。フィブロネクチンの発現は、リアルタイムＰＣＲにより検出された。結果は、キヌレニン、ＤＬ−キヌレニンおよびＬ−キヌレニンは、全て、フィブロネクチン発現をダウンレギュレーションする能力を有していることを示しており、これは、キヌレニン代謝産物が線維増殖性障害の予防または治療にも適切である可能性があることを示している。

【0090】

実施例１２ − キヌレニンおよび代謝物／アナログは、脾臓細胞に顕著な効果をもつ
図１７に記載の発見は、９６時間の１００および１５０μｇ／ｍＬのＤ−キヌレニン、Ｌ−キヌレニンまたはＤＬ−キヌレニンを用いた処置後に、ＣｏｎＡ誘発性脾細胞増殖においてほぼ５倍の低下が見られた（Ｐ＜０．０５）が、脾細胞増殖は、１００および１５０μｇ／ｍＬのＤ−キヌレニン、Ｌ−キヌレニンまたはＤＬ−キヌレニンによって４８時間後、約２倍顕著に減少していたことを示した。他の代謝産物と比較して、ＦＳ_２は増殖に対してあまり効果がない。図１８に記載の発見は、ＦＳ_１が、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０などのいくつかの炎症性サイトカインおよびケモカインの産生に、免疫抑制効果があることを示した。そのうえ、炎症において重要な役割を果たしていると考えられているＩＬ−１７産生を顕著に低減し得る。

【0091】

実施例１３ − 線維芽細胞におけるＭＭＰ１発現に対するキヌレン酸およびキヌレニンの持続的効果
線維芽細胞におけるＭＭＰ１発現に対するキヌレン酸（ＫｙｎＡ）とキヌレニン（Ｋｙｎ）の持続的効果を測定するために、細胞は、１００μｇ／ｍＬの薬剤で処理された。処理後４８時間で、培地が新鮮な培地と交換され、そして細胞が、処置後０、１２、２４、４８時間で取り出され収集された。処置後４８時間で、ＫｙｎＡまたはＫｙｎ処置のいずれかに応答した、線維芽細胞のＭＭＰ１発現の顕著な増大が見られた。ＫｙｎおよびＫｙｎＡの除去後、ＭＭＰ１発現は、その後２４時間、未処理の細胞と比較して顕著に高い状態に維持された（図１９Ａ）。興味深いことに、ＭＭＰ１タンパク質発現は、Ｋｙｎの除去後の４８時間以内に徐々に正常レベルへと低下した一方、ＫｙｎＡに応答したＭＭＰ１発現は対照より高く維持続された（図１９Ａ）。図１９Ｂは、図１９Ａに示されているデータの定量的な分析を示している（＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、ｎ＝４）。これらの結果から、処置された線維芽細胞において、Ｋｙｎと比較してＫｙｎＡはＭＭＰ−１の発現においてより長く持続する効果を有しているようである。

【0092】

さまざまな実施形態が本書に開示されているが、多くの改変および変更は、当該技術分野における当業者の一般常識にしたがって、本発明の範囲内で行われ得る。このような変更は、実質的に同じ方法で同じ結果を達成するために、本発明の任意の態様に対する公知の等価物による置換を含む。数値範囲は範囲を規定している数値を包含する。「含む（comprising）」という用語は、「を含むがこれらに限定されない」という表現と実質的に同等の非限定的用語として本明細書で使用され、そして「含む（comprises）」という用語は対応する意味をもつ。本明細書で使用される通り、文脈によって明確に指示されない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数も含む。したがって、例えば、「１つのもの（a thing）」に対する言及はそのようなものを二以上含む。本明細書中の参考文献の引用は、このような参考文献が本発明の実施形態に対する先行技術であると認めるものではない。本発明は本明細書中の上記に実質的に記載されたおよび実施例および図面に実質的に関連する全ての実施形態および変更形を含む。

【0093】

参考文献：
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Ｓａｌｏ， Ｔ．， Ｊ． Ｇ． Ｌｙｏｎｓ その他著（１９９１年）「成長因子ベータ１変換アップレギュレート培養ヒトケラチノサイトＩＶ型コラゲナーゼ発現」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６（１８）：１１４３６−４１．
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12-A】

【図12-B】

【図12-C】

【図12-D】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18】

【図19】