特許 6474788 抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6474788

(24)【登録日】2019年2月8日

(45)【発行日】2019年2月27日

(54)【発明の名称】抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/078 20100101AFI20190218BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/078

【請求項の数】12

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2016-509421(P2016-509421)

(86)(22)【出願日】2014年4月22日

(65)【公表番号】特表2016-519925(P2016-519925A)

(43)【公表日】2016年7月11日

(86)【国際出願番号】EP2014058051

(87)【国際公開番号】WO2014173858

(87)【国際公開日】20141030

【審査請求日】2017年1月18日

(31)【優先権主張番号】13305530.1

(32)【優先日】2013年4月23日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591100596

【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル

(73)【特許権者】

【識別番号】509033033

【氏名又は名称】ユニベルシテ・パリ・デカルト

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＤＥＳＣＡＲＴＥＳ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】特許業務法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】マローネ，ロベルト

(72)【発明者】

【氏名】アフォンソ，ジョージア

【審査官】 飯室 里美

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５２３２４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／００２５８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／１１９８７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−０１３１６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Dependency on interleukin-1 of primary human in vitro T cell responses to soluble antigens，Plebanski, M et al.，Eur. J. Immunol.，１９９２年，vol. 22，page. 2353-2358

【文献】 Nambu, A et al.，IL-1β, but not IL-1α, is required for antigen-specific T cell activation and the induction of local inflammation in the delayed-type hypersensitivity responses，International Immunology，２００６年，vol. 18, no. 5，p. 701-712

【文献】 Shlomo, Z et al.，IL-1 acts directly on CD4 T cells to enhance their antigen-driven expansion and differentiation，Proc Natl Acad Sci U S A，２００９年，vol. 106, no. 17，p. 7119-7124

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ある量のＩＬ−１β及びある量の少なくとも１つの抗原を含む適切な培養培地中において、被験体から単離された血液試料又は未分画ＰＢＭＣ試料を培養することからなる工程を含む、該血液試料又はＰＢＭＣ試料中の抗原（Ａｇ）特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法であって、ただし、該培養培地は、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−４、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ−３）リガンドからなる群より選択された分化剤を全く含まず、該方法は、検出可能な樹状細胞分化を全く誘導しない、該方法。

【請求項2】

ＩＬ−１βが、０．１〜１，０００ng/ml、好ましくは１〜１００ng/ml、さらにより好ましくは約１０ng/mlの量で使用される、請求項１の方法。

【請求項3】

前記抗原が、タンパク質、ペプチド、核酸、又は組織若しくは細胞の調製物からなる群より選択される、請求項１又は２の方法。

【請求項4】

前記抗原が疾患関連抗原である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。

【請求項5】

前記抗原が治療タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。

【請求項6】

疾患の診断を補助するための、又は、免疫療法などの疾患の処置のモニタリングを補助するための請求項１〜４のいずれか一項記載の方法の使用。

【請求項7】

前記疾患が、自己免疫疾患、癌疾患、及び感染症からなる群より選択される、請求項６の使用。

【請求項8】

治療タンパク質の免疫原性を研究するための請求項５記載の方法の使用。

【請求項9】

ワクチンアジュバントを研究するための請求項１〜３のいずれか一項記載の方法の使用。

【請求項10】

物質の免疫寛容誘発効果を研究するための請求項１〜３のいずれか一項記載の方法の使用。

【請求項11】

エピトープマッピングのための請求項１〜３のいずれか一項記載の方法の使用。

【請求項12】

所与の抗原又は抗原の組合せを認識する、ポリクローナルＴ細胞及びＴ細胞株又はクローンを産生するための請求項１〜３のいずれか一項記載の方法の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法に関する。

【0002】

発明の背景
抗原（Ａｇ）特異的Ｔ細胞応答の研究は、厄介な技術的課題をもたらす［Kern, Trends Immunol. 26:477, 2005］。これは、Ａｇ特異的画分が一般的に、末梢血中に非常に低い出現頻度で示されるという事実に主に起因し、この特徴がその検出を困難なものとしている［Mallone, Clin.Immunol. 110:232, 2004］。この検出は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を考える場合には、さらにより問題のあるものとなる。なぜなら、これらの画分は、しばしば、そのＣＤ８＋の同等物よりもさらに低い出現頻度でしか存在しないからである［Homann, Nat.Med. 7:913, 2001; Seder, Nat.Immunol. 4:835, 2003］。多種多様な構造的又は機能的な解読値を使用してこのようなＡｇ特異的Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）を検出することを可能とするいくつかの検出戦略が現在利用可能である［Kern, Trends Immunol. 26:477, 2005］。しかしながら、全ての技術によって共有される１つの欠点は、Ａｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を、エクスビボでは、およそ直接的に検出することがことができないことである。最も一般的には、これらの細胞を、５〜１４日間のインビトロにおける培養工程を通して予め増殖させて、検出閾値に到達させる必要がある［Mallone, Clin.Immunol. 110:232, 2004］。近年、それらを、未分画の全血又は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料から直接的に分化した樹状細胞と共に、適切なサイトカイン混液及び培養条件を使用して共培養することによって、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答を刺激することが可能であることが発見された（国際公開公報第２０１０／１１９０３３号及びMartinuzzi, Blood 118:2128, 2011）。かなりの利点を与えた該方法（ａｃＤＣ技術と命名）は、ａ）抗原の存在下でＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地中において血液試料又はＰＢＭＣ試料を培養する工程、及びその後、ｂ）ＤＣを、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ２及びインターロイキン（ＩＬ）−１βなどの分子の混液を用いて成熟させる工程からなる。

【0003】

発明の要約：
本発明は、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法に関する。特に、本発明は、ある量のＩＬ−１β及びある量の少なくとも１つの抗原を含む適切な培養培地中において、被験体から単離された血液試料又はＰＢＭＣ試料を培養することからなる工程を含む、該血液試料又はＰＢＭＣ試料中の抗原（Ａｇ）特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法に関する。

【0004】

発明の詳細な説明：
本発明者らは、今回、ａｃＤＣ技術の分化工程は必須ではなく、独特なインターロイキン（すなわちＩＬ−１β）を用いて、ＰＢＭＣ試料又は血液試料からＡｇ特異的Ｔ細胞応答を刺激することが可能であることを同定した。

【0005】

従って、本発明は、ある量のＩＬ−１β及びある量の少なくとも１つの抗原を含む適切な培養培地中において、被験体から単離された血液試料又はＰＢＭＣ試料を培養することからなる工程を含む、該血液試料又はＰＢＭＣ試料中の抗原（Ａｇ）特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法に関する。

【0006】

本明細書において使用する「ＰＢＭＣ」又は「末梢血単核球」又は「未分画ＰＢＭＣ」という用語は、全ＰＢＭＣ、すなわち、所与の亜集団群へと濃縮されていない丸い核を有する白血球の１集団群を指す。臍帯血単核球がさらに、この定義に含まれる。典型的には、本発明によるＰＢＭＣ試料は、接着性ＰＢＭＣ（これは本質的に９０％を超える単球からなる）又は非接着性ＰＢＭＣ（これはＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞及びＤＣ前駆体を含む）のみを含むための選択工程にかけられていない。それ故、本発明によるＰＢＭＣ試料は、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞）、単球、及びその前駆体を含む。典型的には、これらの細胞を、血液の層を分離する親水性多糖であるフィコールを使用して全血から抽出することができ、ＰＢＭＣは血漿の層の下に細胞輪を形成する。さらに、ＰＢＭＣを、赤血球を優先的に溶解する低浸透圧性溶解を使用して全血から抽出することができる。このような手順は、当業者には公知である。

【0007】

本明細書において使用する「血液試料」又は「未分画血液試料」という用語は、被験体から単離され、適切な抗凝固剤（例えばヘパリンリチウム又はクエン酸ナトリウム）を含有するチューブ又は他の容器中に回収された粗血液標本を指す。臍帯血がさらにこの定義に含まれる。血液試料は未分画の全血であり、血漿及び血球（赤血球、白血球）を含有する。それは、新たに単離された血液試料（４８時間未満）であっても、又は以前に入手し使用まで凍結して保存されていた血液試料でもよい。

【0008】

本明細書において使用する「被験体」という用語は、哺乳動物、例えばげっ歯類（例えばマウス又はラット）、ネコ、イヌ又は霊長類を指す。いくつかの態様において、該被験体はヒト被験者である。本発明による被験体は、健康な被験体であっても、又は所与の疾患を患う被験体であってもよい。

【0009】

ＰＢＭＣの増殖、生存及び分化に適した任意の培養培地が使用され得る。典型的には、それは、ヒトの又は他の起源の血清及び／又は増殖因子及び／又は抗生物質を補充することのできる、栄養分（炭素源、アミノ酸）、ｐＨ緩衝液及び塩を含有する基礎培地からなり、これにＩＬ−１β及び抗原を加える。典型的には、基礎培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ又はＡＩＭ−Ｖ培地であり得、その全てが、市販されている標準培地である。

【0010】

本発明の態様においてＰＢＭＣ試料よりもむしろ血液試料を培養する場合には、このような基礎培地の使用は不必要であり、培養培地としての役目を果たす血液中に直接、ＩＬ−１β及び抗原を加えることができる。

【0011】

本発明の重要な特徴は、培養培地が、国際公開公報第２０１０／１１９０３３号に記載のような分化剤、すなわち、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び／又はＩＬ−４及び／又はＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ−３）リガンドを全く含まないことである。同じように、該物質は血液試料にも添加されない。

【0012】

本発明によると、ある量のＩＬ−１βは、それが一旦調製されると（例えば実施例に記載のように０日目又は１日目に）試料中に直接添加される。

【0013】

細胞培養は、この目的に適した組織培養インキュベーターを使用して５％ＣＯ_２雰囲気中３７℃で実施し得る。

【0014】

本明細書において使用する「ＩＬ−１β」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、インターロイキン−１βを指す。典型的には、ＩＬ−１βを、０．１〜１，０００ng/ml、好ましくは１〜１００ng/ml、さらにより好ましくは約１０ng/mlの量で使用する。ＩＬ−１βを多種多様な起源から得ることができる。それは、精製ＩＬ−１βであっても、又は組換えＩＬ−１βであってもよい。ＩＬ−１βは、例えばR&D Systems又はPeproTechのような種々の会社から市販されている。

【0015】

いくつかの態様において、ＩＬ−１βは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）組換えキメラタンパク質、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、リポポリ多糖（ＬＰＳ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ポリイノシン・ポリシチジン酸（ポリＩ：Ｃ）、Pam3CysSerLys4（Pam3CSK4）、及びイミキモドからなる群より選択された少なくとも１つの物質と組み合わせて添加され得る。このような物質の組合せが使用され得る。該物質（群）は、免疫応答を刺激することが知られる物質であり、当業者は適切な濃度を選択することができるだろう。

【0016】

１つの態様において、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答はＣＤ４＋Ｔ細胞応答である。

【0017】

別の態様において、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。

【0018】

本明細書において使用する「抗原」（「Ａｇ」）という用語は、Ｔ細胞応答を誘起することができるタンパク質、ペプチド、核酸（例えばＤＮＡプラスミド）、又は組織若しくは細胞の調製物を指す。いくつかの態様において、該Ａｇは、組換えＤＮＡ技術によって、又は種々の組織若しくは細胞源からの精製によって得ることができるタンパク質である。このようなタンパク質は、天然のタンパク質に限定されず、例えば、選択されたアミノ酸配列を変化させることによって、又は異なるタンパク質の部分を融合することによって得られる改変タンパク質又はキメラ構築物も含む。本発明の別の態様において、該Ａｇは、Ｆｍｏｃ生合成手順、大規模マルチピンペプチド合成、組換えＤＮＡ技術又は他の適切な手順によって得られる合成ペプチドである。本発明の別の態様において、該Ａｇは、トランスフェクション、レンチウイルス若しくはレトロウイルスによる形質導入、ミニ遺伝子導入、又は他の適切な手順によって細胞に導入されたＤＮＡ若しくは他の適切な核酸配列によってコードされたタンパク質若しくはペプチドである。本発明の別の態様において、Ａｇは、粗の組織若しくは細胞の調製物（例えば、生細胞又はアポトーシスを受けた細胞／細胞体）、又は当業者に公知の種々の生化学的手順（例えば固定、溶解、細胞成分分画、密度勾配分離）によって得られる部分精製された組織若しくは細胞の調製物である。

【0019】

いくつかの態様において、前記Ａｇは、組換えＤＮＡ技術によって又は種々の組織若しくは細胞源からの精製によって得ることができるタンパク質である。典型的には、該タンパク質は、１０アミノ酸より長い、好ましくは１５アミノ酸より長い、さらにより好ましくは２０アミノ酸より長い長さを有し、理論的な上限はない。このようなタンパク質は、天然のタンパク質に限定されず、例えば、選択されたアミノ酸配列を変化させることによって、又は異なるタンパク質の部分を融合することによって得られた、改変タンパク質又はキメラ構築物も含む。

【0020】

本発明の別の態様において、前記Ａｇは合成ペプチドである。典型的には、該合成ペプチドは、３〜４０アミノ酸長、好ましくは５〜３０アミノ酸長、さらにより好ましくは８〜２０アミノ酸長である。合成ペプチドを、Ｆｍｏｃ生合成手順、大規模マルチピンペプチド合成、組換えＤＮＡ技術、又は他の適切な手順によって得ることができる。このようなペプチドは、天然のペプチドに限定されず、例えば、選択されたアミノ酸配列を変化若しくは改変させることによって、又は異なるタンパク質の部分を融合することによって得られた、改変ペプチド、翻訳後修飾されたペプチド、又はキメラペプチドも含む。

【0021】

本発明の別の態様において、前記Ａｇは、トランスフェクション、レンチウイルス若しくはレトロウイルスによる形質導入、ミニ遺伝子導入、又は他の適切な手順によって細胞に導入されたＤＮＡ若しくは他の適切な核酸配列によってコードされたタンパク質若しくはペプチドである。レシピエント細胞は、第三者の細胞（例えば同じＰＢＭＣ／血液ドナーから又は関連のないドナーから得られた細胞株）、又はＴ細胞応答の刺激に使用された未分画のＰＢＭＣ若しくは血液試料に存在するのと同じ細胞のいずれかであり得る。

【0022】

本発明の別の態様において、Ａｇは、粗の組織若しくは細胞の調製物（例えば、生細胞又はアポトーシスを受けた細胞／細胞体）、又は当業者に公知の種々の生化学的手順（例えば固定、溶解、細胞成分分画、密度勾配分離）によって得られた部分精製された組織若しくは細胞の調製物である。

【0023】

当業者は、所望のＴ細胞刺激に依存して、適切なＡｇを選択することができる。

【0024】

いくつかの態様において、本発明の方法はさらに、刺激されたＴ細胞を検出することからなる工程を含む。

【0025】

刺激されたＴ細胞を検出するための方法は当業者には公知である。以下に記載の手順は、適切な方法のいくつかの例を提供する。しかしながら、当業者は、Ａｇに応答したＴ細胞の刺激を評価するのに適した任意の方法を使用することができることを容易に解釈することができる。

【0026】

いくつかの態様において、前記方法は、酵素免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイからなり得る。前培養ウェルからの非接着細胞を、所望の抗サイトカイン捕捉抗体（抗体；例えば、抗ＩＦＮ−γ抗体、抗ＩＬ−１０抗体、抗ＩＬ−２抗体、抗ＩＬ−４抗体）でコーティングしておいたプレートに移す。顕色は、ビオチニル化二次抗体、及び標準的な比色定量又は蛍光定量検出法、例えばストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ及びＮＢＴ−ＢＣＩＰを用いて行なわれ、スポットを計数する。その後、ＥＬＩＳｐｏｔの解読値は、１０^６個のＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として表現される。

【0027】

いくつかの態様において、前記方法は、上清サイトカインアッセイからなり得る。培養上清中に放出されたサイトカインは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、BD cytometric bead array、Biorad又はMilliporeサイトカインマルチプレックスアッセイ及びその他のアッセイなどの種々の技術によって測定される。

【0028】

いくつかの態様において、前記方法は、ＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩの多量体を使用し得る。この手順を用いて、特異的ペプチドエピトープを認識するＡｇ反応性Ｔ細胞を、市販されている試薬（例えば、ProImmune MHC Class I Pentamers、Class II Ultimers；又はImmudex MHC Dextramers）、又は自家製の試薬、例えば米国エモリー大学のＮＩＨテトラマー施設の試薬；デンマークのコペンハーゲン大学のS. Buus博士の試薬［Leisner et al., PLoSOne 3:e1678, 2008］、米国シアトルのベナロヤ研究所のG.T. Nepom博士の試薬［Novak et al., J.Clin.Invest. 104:R63, 1999］のいずれかを使用して検出する。

【0029】

いくつかの態様において、前記方法は、活性化マーカー（例えばＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ１３７）のアップレギュレーションの検出に基づく。この手順を用いて、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答を、Ａｇ認識後に膜上に露出される活性化マーカーのその差次的発現によって検出する。

【0030】

いくつかの態様において、前記方法はサイトカイン捕捉アッセイからなり得る。Miltenyi Biotechによって開発されたこのシステムは、そのサイトカイン応答によりＡｇ特異的Ｔ細胞を可視化するためのＥＬＩＳｐｏｔの妥当な代替手段である。さらに、それは、関心対象のＴ細胞の直接的な選別及びクローニングを可能とする（以下参照）。

【0031】

いくつかの態様において、前記方法はＣＤ１５４アッセイからなり得る。この手順は、詳細に記載されている［Chattopadhyay et al., Nat.Med. 11:1113, 2005; Frentsch et al., Nat.Med. 11: 1118, 2005］。それはＡｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出に限定される。

【0032】

いくつかの態様において、前記方法はＣＤ１０７アッセイからなり得る。この手順［Betts et al., J.Immunol.Methods 281:65, 2003］は、細胞障害能を有するＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の可視化を可能とする。

【0033】

いくつかの態様において、前記方法はＣＦＳＥ希釈アッセイからなり得る。この手順は、Ａｇ認識後のその増殖によりＡｇ特異的Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）を検出する［Mannering et al., J.Immunol.Methods 283:173, 2003］。

【0034】

本発明の方法は、様々な適用を見出し得る。

【0035】

例えば、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答を刺激するための本発明の方法は、疾患を診断するため、及び、いくつかの設定における免疫療法の免疫学的効果をモニタリングするための両方に有用であり得る。

【0036】

典型的には、そのような態様において、少なくとも１つの疾患関連抗原が本発明の方法に使用される。

【0037】

いくつかの態様において、前記疾患は、自己免疫疾患からなる群より選択される。この群は、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、多発血管炎性肉芽腫症（以前はウェゲナー肉芽腫症）、クローン病、セリアック病、及び多発性硬化症を含むがそれに限定されるわけではない。本発明の別の態様において、該疾患は、癌疾患からなる群より選択される。この群は、メラノーマ、大腸癌、腎臓癌、及び血液学的悪性疾患、例えば白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫を含むがそれに限定されるわけではない。

【0038】

別の態様において、前記疾患は、感染症からなる群より選択される。この群は、結核菌、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルスなどの感染病原体によって引き起こされる疾患を含むがそれに限定されるわけではない。

【0039】

別の態様において、前記疾患は、骨髄移植及び類似の手技に併発する移植片対宿主疾患である。

【0040】

診断適用のために、本発明の方法を使用して、疾患、好ましくは自己免疫疾患に関連した１つ以上のＡｇ特異的Ｔ細胞応答を検出することができる。例えば、該方法を使用して、Ｉ型糖尿病に関連したプレプロインスリン又はグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）特異的Ｔ細胞応答を検出することができる。

【0041】

本明細書において使用する「免疫療法をモニタリングする」という表現は、免疫調節剤のインビボでの投与後に所与の被験体において誘導されるＴ細胞応答の変化の測定を指す。モニタリング適用では、疾患の種類に応じて、異なる種類の状況が見られる。自己免疫疾患においては、免疫調節療法を使用して、病的な免疫応答を鈍らせることができる。この結果を達成するための１つの戦略は、多くの免疫調節剤に基づいた非Ａｇ特異的介入に依拠する。例えば、薬剤、例えばシクロスポリンＡ（Stiller et al., Science 223:1362, 1984; Feutren et al., Lancet 19:119, 1986; Bougneres et al., Diabetes 39:1264, 1990）、ダクリズマブ、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン、インターロイキン−２、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Herold et al., N.Engl.J.Med. 346:1692, 2002; Keymeulen et al., N.Engl.J.Med. 352:2598, 2005）、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、例えばリツキシマブ（Pescovitz et al., N.Engl.J.Med. 361:2143, 2009）、自己骨髄非破壊的造血幹細胞移植（Voltarelli et al., JAMA 297:1568, 2007）、自己臍帯血注入（Haller et al., Diabetes Care 32:2041, 2009）、ビタミンＤ、制御性Ｔ細胞適応応答が、Ｔ１Ｄの予防及び／又は介入のために試験されたか、試験中であるか、試験される可能性がある。第二のアプローチは、Ａｇ特異的戦略、すなわち、免疫寛容誘発形態の疾患関連Ａｇの投与に依拠する。例えば、（プロ）インスリン（ＤＰＴ−１、N.Engl.J.Med. 346:1685, 2002; Skyler et al., Diabetes Care 28:1068, 2005; Nanto-Salonen et al., Lancet 372:1746, 2008; Fourlanos et al., Diabetes 60:1237, 2011）、（プロ）インスリンから導かれたペプチド（Orban et al., J.Autoimmun. 34:408, 2010; Thrower et al., Clin.Exp.Immunol. 155:156, 2009）、ＧＡＤ（Ludvigsson et al., N.Engl.J.Med. 359:1909, 2008; Wherrett et al., Lancet 378:319, 2011; Axelsson et al., PLoS One 6:e29008, 2011; Ludvigsson et al., N.Engl.J.Med. 366:433, 2012）、ＮＢＩ−６０２４（Alleva et al., Scand.J.Immunol. 63:59, 2006）、ＤｉａＰｅｐ２７７（Raz et al., DiabetesMetab.Res.Rev. 23:292, 2007）などの物質及びその組合せ、β細胞の抗原と組み合わせた抗ＣＤ３抗体（Bresson et al., J.Clin.Invest. 116:1371, 2006）、インビトロ又はインビボでのＤＣへのＡｇのローディング（Mukhopadhaya et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:6374, 2008）、エピトープＨＬＡ多量体（Casares et al., Nat.Immunol. 3:383, 2002; Masteller et al., J.Immunol. 171:5587, 2003; Mallone et al., Blood 106:2798, 2005）、関心対象のＡｇを産生するように遺伝子導入により改変されたラクトコッカス・ラクティス（L.lactis）（Takiishi et al., J.Clin.Invest. 122:1717, 2012）が、Ｔ１Ｄの予防及び／又は介入のために試験されたか、試験中であるか、試験される可能性がある。

【0042】

癌及び感染症においては、発病は、病的な免疫応答によって引き起こされるのではなく、むしろ免疫系による駆除を回避した組織細胞又は感染病原体によって引き起こされる。それ故、癌又は感染細胞／感染病原体に対する免疫応答は、疾患に拮抗しようとする生理学的適応である。これらの生理学的機序を、非Ａｇ特異的戦略（例えば、メラノーマにおける単独で又は様々な薬剤と組み合わせた、細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原４の遮断；Yuan et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:20410, 2008; Maker et al., Ann.Surg.Oncol. 12:1005, 2005）、又はＡｇ特異的アプローチ、すなわち免疫原性形態の疾患関連Ａｇ（群）の投与（いわゆるワクチン接種）のいずれかを使用して治療的にブーストすることができる。これらの後者のアプローチは、Ａｇ（群）を単独で又は種々のアジュバント剤と組み合わせて投与することによって（例えば、メラノーマにおける腫瘍関連Ａｇの投与；Di Pucchio et al., Cancer Res. 66:4943, 2006; Peterson et al., J.Clin.Oncol. 21:2342, 2003; Bystryn et al., Clin.CancerRes. 7:1882, 2001）、ＡｇでパルスされたＤＣを投与することによって（例えば、メラノーマにおける腫瘍関連ＡｇでパルスされたＤＣの注入；Palucka et al., J.Immunother. 26:432, 2003; Banchereau et al., Cancer Res. 61:6451, 2001; Thurner et al., J.Exp.Med. 190:1669, 1999）、又は疾患関連Ａｇ特異的Ｔ細胞の養子移植によって（例えば、メラノーマにおける腫瘍関連Ａｇ特異的Ｔ細胞の注入；Vignard et al., J. Immunol. 175:4797, 2005）遂行され得る。

【0043】

それ故、このような介入によって誘導される免疫変化を追跡することは治療的に関心がある。成功裡の介入は、疾患関連Ａｇ特異的Ｔ細胞応答の減少（自己免疫疾患の場合）又は増加（癌及び感染症の場合）を実現すべきである。疾患関連Ａｇ特異的Ｔ細胞応答におけるこのような変化は、定量的（例えばＡｇ特異的Ｔ細胞の出現頻度の変化）又は定性的（例えば、このようなＴ細胞の表現型及び／又は機能の変化）のいずれかであり得る。臨床的に効力のあるこれらの免疫代用マーカーを入手できることは、多種多様な適用のために非常に有用であり得る。例えば、患者の免疫応答に基づいた処置する患者及び使用する治療剤のより良好な選択（例えば、ＧＡＤ特異的Ｔ細胞応答を提示する患者へのＧＡＤ投与）；治療用量又は投与レジメンの最適化及び／又はテーラーメイド（例えば、免疫変化が記録されない場合の投与量／投与頻度の増加）、従ってリスク・ベネフィット比の向上；処置に応答するその確率による処置患者の予後層別化；誘導される免疫変化の維持又は維持されていないことに基づき、患者を再度処置するかどうかの決定。

【0044】

それ故、本発明のＡｇ特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法は、これらの免疫変化の誘導をモニタリングするために非常に有用であり得る。

【0045】

本明細書において使用する「疾患関連抗原（Ａｇ）」という表現は、免疫応答の分子ターゲットを構成するタンパク質又はペプチドを指す。該分子ターゲットは、免疫応答によってターゲティングされる組織（群）又は細胞（群）によって発現される。疾患関連Ａｇの発現は、ターゲット組織に限定され得るか、又はさらに他の身体区画まで広がり得る。疾患関連Ａｇは最初に、自己抗体若しくはＴ細胞免疫応答のターゲットとして、又はターゲット組織によるその選択的な発現に基づいて同定され得る。疾患関連タンパク質抗原のいくつかの例は、Ｔ１Ｄについては、プレプロインスリン（ＰＰＩ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）、及びクロモグラニンＡ；多発血管炎性肉芽腫症についてはミエロペルオキシダーゼ及びプロテイナーゼ３；多発性硬化症におけるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）及びミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）；セリアック病におけるグリアジン；メラノーマ癌におけるチロシナーゼ、メランＡ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００及びＮＹ−ＥＳＯ−１；結核菌感染についてはＥＳＡＴ−６；ＨＩＶ感染についてはｇａｇ；及びアデノウイルス感染についてはヘキソンタンパク質である。

【0046】

疾患関連ペプチドＡｇの例は、Ａｇ提示細胞（ＤＣを含む）による処理及び異なるＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ分子の状況での提示の後に、上記の該タンパク質Ａｇから得られる。それ故、該ペプチドＡｇは、その起源のＡｇだけに依存するのではなく、それらが提示されるＨＬＡ分子にも依存して異なる。例えば、マウス及びヒトの両方についてのＴ１Ｄ関連ペプチドＡｇのリストを、DiLorenzo et al., Clin.Exp.Immunol. 148:1, 2007に見出し得る。疾患関連ペプチド抗原はまた、翻訳後修飾されたアミノ酸配列及び選択的スプライシングを受けたアイソフォームから得られた配列を含む。

【0047】

「疾患関連抗原」という表現はまた、免疫応答のターゲットを構成する組織又は細胞を指す。疾患関連組織／細胞を、該疾患の病態生理及び臨床所見に基づいて該疾患のターゲットとして同定することができる。疾患関連組織／細胞のいくつかの例は、Ｔ１Ｄについてはインスリン産生膵β細胞；多発性硬化症における乏突起神経膠細胞；セリアック病における腸上皮；メラノーマ癌における悪性メラノサイト；結核感染については結核菌；及びＨＩＶ感染についてはＨＩＶである。

【0048】

疾患関連Ａｇに対して開始される免疫応答は、病的な応答（すなわち自己免疫疾患の場合）、又は、別の進行中の病的過程の結果を制限することを目的とした生理学的で有益な可能性のある応答（すなわち癌又は感染症の場合）であり得る。該疾患の根底にある病的若しくは生理学的な免疫応答のおかげで、このような応答の検出を使用して、これらの疾患を診断することができるか、又はその天然の若しくは治療により改変された展開を追跡することができる。それ故、疾患関連Ａｇ特異的Ｔ細胞応答を測定することによって、本明細書において記載された方法を、該疾患の免疫診断及びモニタリング（例えば免疫段階、治療経過観察）の両方に適用することができる。

【0049】

当業者は、適切な疾患関連Ａｇを選択する方法を知っているだろう。このような選択は、様々な戦略に基づく。Ｔ１Ｄ関連Ａｇについてのこのような戦略の例を、Wenzlau et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2007; Peakman et al., J.Clin.Invest. 1999; Nepom et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001; Arif et al., J.Clin.Invest. 2004; Toma et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2005; Blancou et al., J.Immunol. 2007; Skowera et al., J.Clin.Invest. 2009; Scotto et al., Diabetes 2012; Scotto, Afonso et al., Diabetologia 2012に見出し得る。Ｔ１Ｄ関連ペプチドエピトープについてのこのような戦略のレビューを、Di Lorenzo et al., Clin.Exp.Immunol. 148:1, 2007 and in Martinuzzi et al., Ann.N.Y.Acad.Sci. 1150:61, 2008に見出し得る。

【0050】

本発明の方法の別の適用は、治療タンパク質の免疫原性（又は免疫寛容原性）のインビトロでの研究におけるその使用に関する。

【0051】

本明細書において使用する「治療タンパク質」という用語は、治療効果を達成するためにヒト被験者にインビボにおいて投与されるか又は投与されることが計画される任意のアミノ酸長のタンパク質又はペプチド化合物を指す。このような治療タンパク質の例は、疾患関連Ａｇ（前記に定義した通り）、異なる種の抗体（その天然形又は部分的／完全にヒト化されているかのいずれか）、サイトカイン、ホルモン又はホルモン類似体、凝固因子、酵素、細菌性若しくはウイルス性タンパク質であるがそれに限定されるわけではない。このようなタンパク質は、天然のタンパク質に限定されないが、例えば選択されたアミノ酸配列を変化させることによって、又は異なるタンパク質の部分を融合することによって得られる改変タンパク質若しくはキメラ構築物も含む。

【0052】

理論によって束縛されるものではないが、治療タンパク質の免疫原性の評価が適切である２つの異なる治療設定が存在する。

【0053】

１つの最初の治療設定は、免疫寛容原性効果（例えば自己免疫疾患の場合）又は免疫原性効果（例えば癌又は感染症の場合）を誘導する目的での、インビボ投与のための疾患関連Ａｇ（前記に定義した通り）の使用に関する。所望の該治療効果を達成する能力をインビトロでまず評価することが重要である。

【0054】

他の治療設定においては、目的は、投与されたタンパク質に対するあらゆる種類の免疫原性応答を誘導しないことであり、むしろ、該タンパク質が治療効果（そのために該タンパク質は設計されている）を達成することを可能とするためにこのような応答を回避することである。このような設定の例は、サイトカインに基づいた免疫療法、ホルモン補充療法、及び凝固因子の欠損（例えば血友病Ａにおける第ＶＩＩＩ因子）又は酵素の欠損（例えばムコ多糖症ＶＩＩ型におけるβ−グルクロニダーゼ）のための補充療法を含むがそれに限定されるわけではない。全てのこれらの状況において、投与されたタンパク質に対する免疫原性応答の開始は望ましくない。なぜなら、これは所望の治療効果を達成するのに逆効果であるからである（例えば、サイトカイン放出症候群などの副作用；又は治療タンパク質の中和／分解）。

【0055】

本発明の方法の別の適用は、ヒト治療設定において適切である可能性のあるワクチンアジュバントのインビトロでの研究のためのその使用に関する。

【0056】

本明細書において使用する「アジュバント」という用語は、免疫応答の量（すなわち免疫細胞の応答頻度）又は質（例えば、応答性Ｔ細胞が複数のサイトカインを産生及び／又は複数のエフェクター機能を発揮する能力として定義される、該Ｔ細胞の多機能性；同族Ａｇを提示するターゲット細胞に対する細胞障害性；並びに／又は、Ｔ細胞による同族Ａｇの認識の強度及びこのような認識から生じるエフェクター機能の大きさとして定義される機能的結合力）を改善することによってワクチンの免疫原性を増強する薬理学的又は免疫学的物質を指す。記載された技術を使用して、該アジュバントの存在下でＡｇによる刺激時に誘発されるＴ細胞応答の量及び／又は質をインビトロにおいて定めることができる。

【0057】

理論によって束縛されるものではないが、ワクチンアジュバントの例としては、ｔｏｌｌ様レセプターリガンド、サイトカイン、細菌化合物、毒素又はトキソイド（すなわち、毒性作用を欠失した毒素）が挙げられる。

【0058】

記載の技術は、所与の抗原（群）に対する応答を鈍らせ得る物質のインビボでの免疫寛容誘発効果についての効力をインビトロで定めるために使用され得る。このような物質は、Ａｇ（群）に対する免疫応答をブーストするためではなくむしろ鈍らせるために該Ａｇ（群）が投与されるインビボ適用において、例えば、自己免疫疾患又は移植片対宿主疾患において適切であり得る。

【0059】

理論によって束縛されるものではないが、免疫寛容原性物質の例としては、免疫調節性サイトカイン、例えばＩＬ−１０、又はトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β、又は、負の共刺激レセプターに関与するキメラタンパク質、例えば細胞障害性Ｔリンパ球Ａｇ（ＣＴＬＡ）−４−Ｉｇ若しくはＩＬ−１レセプターアンタゴニストが挙げられる。

【0060】

本発明の方法の別の適用は、Ａｇ又はエピトープの発見（「マッピング」としても知られる）のための使用、すなわち、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答を誘導するものを選択するためにＡｇ及びエピトープをスクリーニングするための、その使用である。

【0061】

本明細書において使用する「エピトープ」という用語は、Ｔ細胞によって認識されるタンパク質Ａｇの部分を指す。エピトープは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合することのできる種々のアミノ酸長のペプチドである。このようにして形成されたペプチド−ＭＨＣ複合体は、Ｔ細胞上に発現されるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）によって認識されることができ、よって、Ｔ細胞の活性化及びエピトープＡｇ特異的Ｔ細胞応答が開始される。

【0062】

Ａｇ及びエピトープは、Ｔ細胞の規定された分子ターゲットであるので、インビトロにおける適用（例えば、診断、予後予測又は治療目的のためのＡｇ特異的Ｔ細胞応答の検出）又はインビボにおける投与（例えば、自己免疫疾患におけるＡｇ又はエピトープに基づいた免疫寛容原性療法；或いは癌及び感染症におけるＡｇ又はエピトープに基づいたワクチン接種）のために使用するための適切なタンパク質又はペプチドを設計するためにこのようなターゲットを正確に同定することはしばしば適切である。さらに、所与のＭＨＣ分子（例えばＨＬＡ−Ａ２、A*02:01；又はＨＬＡ−ＤＲ４、DR*04:01）へのエピトープの結合並びに／又はＴＣＲシグナル伝達及びＴ細胞活性化のトリガーを支配する一般的な原則の定義が、所与のエピトープの挙動を予測することのできるコンピューター計算化アルゴリズムを開発する目的でしばしば求められる。このようなアルゴリズムの開発は、頻繁に、大きな実験データセットを入手できることを必要とする。

【0063】

前記候補Ａｇはまた、免疫応答によってターゲティングされる組織（群）若しくは細胞（群）、又は、当業者に公知の生化学的若しくは分子生物学的技術によって候補Ａｇ若しくはエピトープでコーティング、ローディング、又はそれを発現させるようにした任意のタイプの細胞であり得る。

【0064】

本発明の方法のさらに別の適用は、所与のＡｇ又はＡｇの組合せを認識するポリクローナルＴ細胞及びＴ細胞株又はクローンを産生するためのその使用に関する。従って、本発明は、本発明の方法を実施し、少なくとも１つの特異的な免疫学的特性を提示する少なくとも１つのＴ細胞を単離することからなる工程を含む、被験体から特異的な免疫学的特性を提示するＴ細胞を産生するための方法に関する。前記の特異的な免疫学的特性は、工程ａ）及び／又はｂ）の最中に加えられたＡｇの、単離Ｔ細胞による認識を含むがそれに限定されるわけではない。例えば、前記の特異的な免疫学的特性はまた、ＩＦＮ−γの産生、又は、認識されたＡｇを提示する細胞に対して細胞障害性を発揮する能力を含み得る。ＩＦＮ−γを産生するか又は細胞障害性を提示するＴ細胞は、例えば、癌及び感染症の処置のために有用であり得る。例えば、別の可能な特異的な免疫学的特性は、ＩＬ−１０の産生であり得る。ＩＬ−１０を産生するＴ細胞は、自己免疫疾患の処置のための制御性Ｔ細胞として使用することができる。

【0065】

当業者は、必要に応じて該Ａｇ特異的Ｔ細胞が血液試料又はＰＢＭＣ試料から一旦単離されると該Ａｇ特異的Ｔ細胞を増殖させる方法をよく知っている。このような方法の例を、Reijonen et al., Diabetes 51:1375, 2002; Mallone et al., Blood 106:2798, 2005; Mannering et al., J.Immunol.Methods 298:83, 2005; Yee et al., J.Immunol. 162:2227, 1999; Mandruzzato et al., J.Immunol. 169:4017, 2002; Oelke et al., Nat.Med. 9:619, 2003; Skowera et al., J.Clin.Invest. 118:3390, 2009に見出し得る。

【0066】

当業者はまた、種々の免疫学的特性に基づいて生存状態の前記Ａｇ特異的Ｔ細胞を単離するのに適した方法もよく知っている。例えば、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１０産生Ｔ細胞の選択を、Miltenyiサイトカイン捕捉アッセイによって行なうことができる。別の例としては、細胞障害性Ｔ細胞の選択を、ＣＤ１０７のアップレギュレーションに基づいて行なうことができる［Betts et al., J.Immunol.Methods 281:65, 2003］。さらに別の例として、該Ｔ細胞を、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ多量体を用いて単離することができる［Mallone et al., Diabetes 53:971, 2004; Mallone et al., Blood 106:2798, 2005; Skowera et al., J.Clin.Invest. 118:3390, 2008; Ladell et al., Immunity 38:425, 2013］。

【0067】

本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【0068】

【図1A】ＩＬ−１βは、タンパク質Ａｇ特異的ＩＦＮ−γＴ細胞応答を増幅させるための重要な最小成分である。（Ａ）未分画の新鮮なＰＢＭＣ（９６ウェルの平底プレート中、１０^６個／ウェル）を、ＴＴＸと、０日目（示されているように、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、サイトカインなし、又はＦｌｔ３Ｌ）、その後、１日目、すなわち２４時間後（示されているように、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ_２、１０ng/mlのＩＬ−１β及びその組合せ；「全て」はＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１βを意味する）に加えられた種々のサイトカインの組合せの存在下（黒色の棒グラフ）又は非存在下（白色の棒グラフ）のいずれかで培養した。全ての条件がまた、１日目にＩＬ−７（０．５ng/ml）を受けた。これらの４８時間の終了時に、６時間のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔを方法に詳述されているように実施した。３つの異なるドナーに対して実施された３回中１回の代表的な実験が示され、結果は、１０^６個のＰＢＭＣあたりのＩＦＮ−γ ＳＦＣとして表現される。３つのウェルの平均値±標準偏差が示される。点線は、サイトカインの非存在下で得られたＴＴＸ特異的ＩＦＮ−γ応答を示す。

【図1B】ＩＬ−１βは、タンパク質Ａｇ特異的ＩＦＮ−γＴ細胞応答を増幅させるための重要な最小成分である。（Ｂ）３つの異なるドナーに対して得られ、「サイトカインなし」の条件と比較したＴＴＸ特異的ＩＦＮ−γ応答の倍数として表現された結果の要約。各々の棒グラフは、３回の実験の応答倍数の平均値±標準偏差を示し、各々の個々の実験の数値から基礎値が差し引かれた（すなわち、Ａｇの非存在下における応答の差し引き後の正味のＴＴＸ応答）。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１。

【図1C】ＩＬ−１βは、タンパク質Ａｇ特異的ＩＦＮ−γＴ細胞応答を増幅させるための重要な最小成分である。（Ｃ）ＰＢＭＣ刺激は、０日目に抗ＩＬ１β遮断抗体を添加して又は添加せずに、サイトカインの非存在下で以前のように実施された。データの表示はパネルＡと同じであり、結果は、３回の別々の場合に対して実施された代表的な実験に言及する。

【図2A】０日目又は１日目のいずれかに添加された１０ng/mlの用量のＩＬ−１βは、タンパク質Ａｇ特異的ＩＦＮ−γ Ｔ細胞応答を増幅するのに十分である。（Ａ）未分画の新鮮なＰＢＭＣを、ＴＴＸの存在下（黒色の棒グラフ）又は非存在下（白色の棒グラフ）のいずれかで、さらにサイトカインを全く添加しないか、又は、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４（０日目）を添加し続いてＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１β／ＩＬ−７（１日目）を添加するか、又は０日目若しくは１日目のいずれかに添加されたＩＬ−１β（１０ng/ml）のみと共に、図１Ａのように刺激した。これらの４８時間の終了時に、６時間のＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔを方法に詳述されているように実施した。９個の異なるドナーに対して実施された９回中１回の実験が示され、３つのウェルの平均値±標準偏差が示されている。

【図2B】０日目又は１日目のいずれかに添加された１０ng/mlの用量のＩＬ−１βは、タンパク質Ａｇ特異的ＩＦＮ−γ Ｔ細胞応答を増幅するのに十分である。（Ｂ）９個の異なるドナーに対して得られ、「サイトカインなし」の条件と比較してＴＴＸ特異的ＩＦＮ−γの応答倍数として表現された結果の要約。データの表示は図１Ｂと同じである。^＊ｐ＜０．０５。

【図2C】０日目又は１日目のいずれかに添加された１０ng/mlの用量のＩＬ−１βは、タンパク質Ａｇ特異的ＩＦＮ−γ Ｔ細胞応答を増幅するのに十分である。（Ｃ）０日目又は１日目のいずれかに添加された種々のＩＬ−１β濃度を比較した５個の異なるドナーに対して得られた結果の要約。データの表示は図２Ｂと同じである。^＊ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４＋全てとの比較についてｐ＝０．０６。

【図3】０日目に添加された１０ng/mlの用量のＩＬ−１βは、エピトープＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖するのに十分である。ＨＬＡ−Ａ２＋の健康なドナー（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１）からの未分画の新鮮なＰＢＭＣ（９６ウェルの平底プレート中、１０^６個／ウェル）を、方法に詳述されているように、ＨＬＡ−Ａ２拘束Ｆｌｕ ＭＰ_{５８−６６}ペプチドの存在下又は非存在下のいずれかで、さらに指定されたサイトカイン混液（「全て」は、ＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１β／ＩＬ−７を意味する）を添加して刺激した。これらの培養液を、１０日目にＦｌｕ ＭＰ_{５８−６６}ペプチドのローディングされたＨＬＡ−Ａ２ ＴＭｒを用いて染色した。ＣＤ１４／ＣＤ１９／ＣＤ４陰性ＣＤ８＋生細胞にゲートをかけた事象が示され、全ＣＤ８＋集団群の中のＴＭｒ＋細胞の比率が示されている。結果は、３回実施された代表的な実験を言及する。

【図4A】ＩＬ−１βの刺激は、記憶細胞及びナイーブエピトープＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を効率的に増殖させる。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ２＋の健康なドナー（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１）からの未分画の新鮮なＰＢＭＣ（９６ウェルの平底プレート中、１０^６個／ウェル）を、方法に詳述されているように、ＨＬＡ−Ａ２拘束Ｆｌｕ ＭＰ_{５８−６６}ペプチド又はメランＡ_{２６−３５}ＥＬＡペプチドの存在下で、さらに指定されたサイトカイン混液（「「全て」は、ＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１β／ＩＬ−７を意味する）を添加して刺激した。これらの培養液を、１０日目に示されているようなＦｌｕ ＭＰ_{５８−６６}ペプチド又はメランＡ_{２６−３５}ＥＬＡペプチドのローディングされたＨＬＡ−Ａ２ ＴＭｒを用いて染色した。各条件を、Ａｇの増殖特異性を制御するために、Ｆｌｕ及びメランＡ ＴＭｒの両方を用いて染色した。これらのＴＭｒを用いて直接エクスビボで染色されたＰＢＭＣが、最後の列に比較のために示されている。ＣＤ１４／ＣＤ１９／ＣＤ４陰性ＣＤ８＋生細胞にゲートをかけた事象が示され、各プロットについての全ＣＤ８＋集団群の中のＴＭｒ＋細胞の比率が示されている。いくつかのプロットについてのＴＭｒ＋ゲートの蛍光強度中央値がさらに示されている。結果は、３回実施された代表的な実験を言及する。

【図4B】ＩＬ−１βの刺激は、記憶細胞及びナイーブエピトープＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を効率的に増殖させる。（Ｂ）ＩＬ−１β刺激培養液からのＴＭｒ＋細胞を、１細胞だけ選別し、方法に詳述されているように増殖させた。この増殖終了時に得られた代表的なＣＤ８＋クローンが示されている。メランＡ特異的増殖については、播種されたウェルの１１．７％（１４／１２０）が可視的な増殖を生じ、試験したその中の１００％（１４／１４）がメランＡ_{２６−３５}ＥＬＡ ＴＭｒ染色によってＡｇ特異的であった。関連性のないペプチドのローディングされたＨＬＡ−Ａ２ ＴＭｒを用いての染色がさらなる対照のために示されている。

【図5】ＩＬ−１βは、有意なＤＣの分化を誘導しない。未分画の新鮮なＰＢＭＣ（９６ウェルの平底プレート中、１０^６個／ウェル）を、指定されたサイトカイン混液の存在下で４８時間刺激した：０日目にＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４、Ｆｌｔ３Ｌ、又はＩＬ−１β（１０ng/ml）、その後、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４及びＦｌｔ３Ｌの場合には１日目にＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１β／ＩＬ−７（「全て」）。この４８時間の培養終了時に、接着細胞を回収し、指定されたマーカーのために染色した。各サイトカイン混液の発現プロファイルが、サイトカインの非存在下で得られたもの（同じ抗体が使用される；点線のプロファイル）及びアイソタイプ対照抗体を用いて染色した後に得られたもの（破線のプロファイル）と比較して示されている（連続プロファイル）。ヒストグラムは、ＣＤ１９／ＣＤ３陰性の生細胞にゲートをかける。結果は、３回の独立した実験の中の代表的な実験を言及する。

【0069】

実施例１：
方法：
抗原
破傷風トキソイド（ＴＴＸ；Statens Serum Institut）は９９％超で純粋であり、リムルスライセートアッセイ（Lonza）により０．０３５EU/μg未満のエンドトキシン濃度を有していた。ペプチドＦｌｕマトリックスタンパク質（ＭＰ）_{５８−６６}（GILGFVFTL）、メラノーマ抗原（メランＡ）_{２７−３５}（AAGIGILTV）、メランＡ_{２６−３５}ELA（ELAGIGILTV）は８５％超で純粋であった（ChinaPeptides）。

【0070】

促進された共培養樹状細胞（ａｃＤＣ）の刺激
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、以前に記載されているように新鮮なまま使用した^１、２。０日目に、ＰＢＭＣを、ＡＩＭ−Ｖ培地（Invitrogen）を含む９６ウェル平底プレート中、１０^６個／１００μl／ウェルで蒔き、以下のサイトカインを図の説明文に詳述されているように種々の組合せで添加した又は添加しなかった：顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；１０００U/ml；R&D Systems）、インターロイキン（ＩＬ）−４（５００U/ml；R&D）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ；５０ng/ml；R&D）。タンパク質抗原（４〜４０ng/μL）を同時に、各ドナーの応答に応じて増量した濃度で加えた。選択された実験において、抗ＩＬ１β遮断抗体（クローンＡＳ１０；R&D）を、図の説明文に詳述されているように、培養開始から１０μg/mlで加えた。２４時間後（すなわち１日目に）、以下の試薬を、図の説明文に詳述されているように種々の組合せで加えた：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α（１０００U/ml；R&D）、ＩＬ−１β（１０−５０−１００ng/mL；R&D）、ＩＬ−７（０．５ng/ml；R&D）、ＩＬ−２（０．５U/ml；Proleukin）、プロスタグランジンＥ_２（ＰＥＧ_２；１μM；Merck Calbiochem）。短いペプチド抗原（すなわち、拘束ＨＬＡ−Ａ２分子への直接結合のために最適な長さで切断）が使用される場合には１日目に、各ドナーについて個々に増量された濃度で（０．０６−１０μM）加えられた。２日目に（すなわち培養開始から４８時間後）、非接着細胞を収集し、洗浄し、分析した。いくつかの実験において、接着細胞をＤＣ分化のフローサイトメトリー分析のために回収した（以下参照）。

【0071】

酵素免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）
インターフェロン（ＩＦＮ）−γＥＬＩｓｐｏｔアッセイを以前に記載されているように実施した^３。簡潔に言えば、９６ウェルＰＶＤＦプレート（Millipore）を、抗ＩＦＮ−γ抗体（U-Cytech）を用いて一晩かけてコーティングした。その後、プレートを洗浄し、１０％熱不活化ヒト血清（ＰＡＡ）の補充されたＲＰＭＩ（Invitrogen）を用いて遮断した。４８時間のａｃＤＣ刺激の終了時に、非接着細胞を洗浄し、新たなＡＩＭ−Ｖ培地に再懸濁し、コーティングされたＥｌｉｓｐｏｔプレートの３つのウェルに１０^５個の細胞／ウェルで蒔いた。５％ＣＯ_２で３７℃で６時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、捕捉されたＩＦＮ−γを、ビオチンにコンジュゲートさせた抗ＩＦＮ−γ抗体（U-Cytech）、アルカリホスファターゼをコンジュゲートさせたextravidin、及びSigmaFast５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）タブレット（両方共Sigma製）を用いて顕色させた。スポットを、Bioreader 5000 Pro-SF解読機（BioSys）で計数し、３つのウェルの平均を計算した。ＥＬＩＳｐｏｔ解読値は、１０^６個のＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として表現される。正の応答に対するカットオフ値は、平均基礎活性（すなわち抗原の非存在下）より上の３ＳＤに設定された。これらの自然発生的なバックグラウンド応答は、各グラフに示されているか、又は別様には抗原（Ａｇ）特異的応答から差し引かれている。

【0072】

ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及びヒト白血球Ａｇ（ＨＬＡ）クラスＩテトラマーアッセイ
４８時間のａｃＤＣ刺激後、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＰＡＡ）を各ウェルに加えた。２〜３日間毎日、培地の半分を、１０％ＦＢＳの補充された新たなＲＰＭＩと交換した。ａｃＤＣ刺激開始から１０日後、非接着細胞を回収し、Ｆｌｕ ＭＰ_{５８−６６}、メランＡ_{２７−３５}又はメランＡ_{２６−３５}ＥＬＡのローディングされたフィコエリトリン（ＰＥ）標識ＨＬＡ−Ａ２テトラマー（ＴＭｒ）を用いて染色した。この目的を達成するために、細胞を、５０nMのダサチニブ溶液中、約０．５−１×１０^６個の細胞／２００μLで、３７℃で３０分間かけてインキュベートし、洗浄し、室温（ＲＴ）で２０分間かけてＴＭｒと反応させた。ＣＤ１４／ＣＤ１９（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）、ＣＤ４（Ａｌｅｘａ−７００又はＡＰＣ）、及びＣＤ８（ＡＰＣ又はＡｌｅｘａ−７００）に対する抗体の予混合物を、４℃で１５分間かけて加え、その後、細胞をLiveDead Aqua（Invitrogen/Molecular Probes）と共に室温で１０分間かけてインキュベートした。洗浄後、細胞を、室温で２０分間の間に３．２％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、BD LSRFortessaフローサイトメーターで取得した。ＴＭｒ染色分析のために、細胞をまず生細胞についてゲートにかけ、その後、ＣＤ１４／ＣＤ１９陰性事象及びＣＤ４陰性／ＣＤ８＋事象についてゲートにかけた。

【0073】

Ｔ細胞のクローニング
Ｔ細胞のクローニング実験のために、細胞を、上記のように１０〜１２日目にＴＭｒで染色し、１つのＣＤ８＋ＴＭｒ＋細胞を、４８８、６３３及び４０５nmのレーザーの備えられたBD FACSAria IIを使用して９６ウェル丸底プレートの各ウェルに仕分けた。各ウェルは、１０％ＦＢＳ、１００U/mlのペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシン、２μg/mLのファンギゾン、５％Cellkine（Zeptometrix）、２００U/mlのＩＬ−２、２５ng/mlのＩＬ−１５（R&D）及び１μg/mLのＰＨＡ−Ｌの補充されたＲＰＭＩ培地１００μL中、３つの異なるドナーからの５，０００ラジアンで照射された２×１０^５個のＰＢＭＣ支持細胞の混合液を含んでいた。プレートを、１〜２週間後に増殖について目で確認し、ＴＭｒ染色によってＡｇ特異性を試験するために及びさらなる増殖のために４８ウェルプレートに移した。

【0074】

ＤＣの表現型の決定及び枯渇
４８時間のａｃＤＣ刺激後、接着細胞を回収し、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体を用いて及び生死判定マーカーを用いて染色した。ＤＣ分析のために、ＣＤ１９／ＣＤ３陰性生細胞にゲートをかける。

【0075】

統計分析
全ての分析は、GraphPad Prism 5及びFlowJoソフトウェアを使用して実施された。Ｐ値を、分布に応じて対応スチューデントｔ検定によって、又はウィルコクソン符号順位検定によって計算した。

【0076】

結果：
要するに、提供されたデータは、ＩＬ−１βが、以前に記載されたａｃＤＣ培養液を使用したＡｇ特異的Ｔ細胞応答の効率的な増幅のために必要とされる最小の重要な成分であることを示し、ＤＣは、インサイチューでＰＢＭＣから２工程で分化している：ａ）ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４又はＦｌｔ３Ｌを０日目に加え；ｂ）ＴＮＦ−α、ＰＧＥ２、ＩＬ−１β、及びＩＬ−７又は他のサイトカイン混液を１日目に加える。種々の成分が取り除かれた混液の組合せ分析は、ＩＬ−１βのみが使用される場合に、類似の又はより良好な結果が得られることを示す（図１）。換言すると、ＩＬ−１βのみが、サイトカインの非存在下で実施されたＰＢＭＣ培養液と比較して、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答を増幅させるのに十分である（図１Ａ〜Ｂ）。このＩＬ−１βにより媒介される増幅はまた操作されていない条件でも起こる。なぜなら、Ａｇと共にかつサイトカインの非存在下で培養されたＰＢＭＣ中のＩＬ−１βの遮断は、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答を減少させるからである（図１Ｃ）。最小有効投与量は１０ng/mlであり、０日目又は１日目のいずれかの添加は、タンパク質Ａｇ特異的ＩＦＮ−γ Ｔ細胞応答を増幅させるのに等価である（図２）。しかしながら、０日目のＩＬ−１βの添加は、エピトープＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖にとってより効率的であり、ＩＬ−２又はＩＬ−７の存在下におけるより慣用的なサイトカインの共刺激とは等価ではない（図３）。記憶細胞及びナイーブエピトープＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方について増殖が得られ（図４Ａ）、Ｔ細胞クローンの効果的な生成がもたらされる（図４Ｂ）。最後に、このＩＬ−１βにより媒介されるＡｇ特異的Ｔ細胞応答の増幅は、以前に記載されたａｃＤＣプロトコールと比較して検出可能なＤＣ分化を全く誘導しない（図５）。従って、この方法は、単一のサイトカイン成分を使用することによって、以前のａｃＤＣプロトコールに記載された全ての利点を有する。網羅的ではないが、主な利点は以下の通りである：迅速かつ使用が簡単であること；検出感度；最小限の血液が必要であること；細胞性タンパク質又は他の粗Ａｇ起源を用いて作業することによって複数のＡｇ又はエピトープを認識するＴ細胞を一度に検出することができ、よって、事前のエピトープ及びＨＬＡの同定が不要となること；ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を検出できること；並びに、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両方のＡｇ特異的Ｔ細胞を増殖できること。全てのこれらの利点は、以前のａｃＤＣ法と共有されているが、ＩＬ−１βに基づいたａｃＤＣ培養液は、改善された使用し易さ及びより低いコストによって（単一のサイトカインを使用することによって）、並びにより高いＡｇ特異的Ｔ細胞活性化レベル及び／又はより低いバックグラウンドＴ細胞活性化レベルから生じるＴ細胞応答のより高度な増幅によって特徴付けられる。

【0077】

参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最先端を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。

【0078】

１．Afonso G, Scotto M, Renand A, et al. Critical parameters in blood processing for T-cell assays: validation on ELISpot and tetramer platforms. J Immunol Methods. 2010;359(1-2):28-36。
２．Mallone R, Mannering SI, Brooks-Worrell BM, et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 2011;163(1):33-49。
３．Fourlanos S, Perry C, Gellert SA, et al. Evidence that nasal insulin induces immune tolerance to insulin in adults with autoimmune diabetes. Diabetes. 2011;60(4):1237-45。
４．Martinuzzi E, Afonso G, Gagnerault MC, et al. acDCs enhance human antigen-specific T-cell responses. Blood. 2011;118(8):2128-2137。
５．Axelsson S, Cheramy M, Hjorth M, et al. Long-lasting immune responses 4 years after GAD-alum treatment in children with type 1 diabetes. PLoS One. 2011;6(12):e29008。
６．de Jongste AH, de Graaf MT, Martinuzzi E, et al. Three sensitive assays do not provide evidence for circulating HuD-specific T cells in the blood of patients with paraneoplastic neurological syndromes with anti-Hu antibodies. Neuro Oncol. 2012;14(7):841-8。
７．Iglesias MC, Briceno O, Gostick E, et al. Immunodominance of HLA-B27-restricted HIV KK10-specific CD8(+) T-cells is not related to naive precursor frequency. Immunol Lett. 2013;149(1-2):119-22。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】