特許 6475336 ｒＤＮＡ ＮＴＳ基盤の遺伝子多重挿入カセットセット、及びそれを用いたＧＲＡＳ等級の組換え酵母菌株

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6475336

(24)【登録日】2019年2月8日

(45)【発行日】2019年2月27日

(54)【発明の名称】ｒＤＮＡ ＮＴＳ基盤の遺伝子多重挿入カセットセット、及びそれを用いたＧＲＡＳ等級の組換え酵母菌株

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/81 20060101AFI20190218BHJP

   C12N 15/40 20060101ALI20190218BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20190218BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20190218BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20190218BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20190218BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/81 ZZNA

   C12N15/40

   C12N15/31

   C12N15/53

   C12N1/21

   C12N1/19

【請求項の数】12

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2017-529961(P2017-529961)

(86)(22)【出願日】2014年12月30日

(65)【公表番号】特表2017-527306(P2017-527306A)

(43)【公表日】2017年9月21日

(86)【国際出願番号】KR2014013047

(87)【国際公開番号】WO2016027943

(87)【国際公開日】20160225

【審査請求日】2017年2月21日

(31)【優先権主張番号】10-2014-0108910

(32)【優先日】2014年8月21日

(33)【優先権主張国】KR

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC 12607BP

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC 12608BP

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC 12609BP

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC 12610BP

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC 12611BP

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC 12612BP

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC 12613BP

(73)【特許権者】

【識別番号】517060797

【氏名又は名称】チュン−アン ユニヴァーシティ インダストリー−アカデミー コーポレーション ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】ＣＨＵＮＧ−ＡＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮＤＵＳＴＲＹ−ＡＣＡＤＥＭＹ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】100181847

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 かおり

(74)【代理人】

【識別番号】100181272

【弁理士】

【氏名又は名称】神 紘一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100193437

【弁理士】

【氏名又は名称】高木 義和

(72)【発明者】

【氏名】カン ヒョナ

(72)【発明者】

【氏名】ムン ヘユン

(72)【発明者】

【氏名】キム ホンジン

【審査官】 小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／０４６４１０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００５−１１２８４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−０６１６２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１０３６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第０１／０３８５１０（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 Gene, 1989, Vol.79, p.199-206

【文献】 Yeast, 1996, Vol.12, p.467-477

【文献】 Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, Vol.58, p.797-805

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＤＷＰＩ（Ｄｅｒｗｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サッカロミセスセレビシアエリボソームＤＮＡ非転写スペーサー（ｒＤＮＡ ＮＴＳ）のＮ末端断片遺伝子、挿入目的遺伝子、プロモーター領域を含む栄養要求性選択標識マーカー遺伝子及びサッカロミセスセレビシアエｒＤＮＡ ＮＴＳのＣ末端断片遺伝子を順次に含む遺伝子多重挿入カセット。

【請求項2】

前記ｒＤＮＡ ＮＴＳのＮ末端断片遺伝子は、配列番号１で表され、前記ｒＤＮＡ ＮＴＳのＣ末端断片遺伝子は、配列番号２で表されることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子多重挿入カセット。

【請求項3】

前記栄養要求性選択標識マーカー遺伝子は、配列番号３で表されるプロモーター領域を含むＵＲＡ３遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子多重挿入カセット。

【請求項4】

前記挿入目的遺伝子は、ノダウイルスカプシドタンパク質（ＮＮＶ）遺伝子、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元剤（ＨＭＧ１）遺伝子またはスクアレンエポキシダーゼ（ＥＲＧ１）遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子多重挿入カセット。

【請求項5】

請求項１ないし請求項４のうち何れか一項に記載の遺伝子多重挿入カセットを含む組換えベクター。

【請求項6】

前記組換えベクターは、図１Ａ、図２Ａ、図５Ａ、及び図６Ａからなる群から選択された何れか１つの開裂地図を有することを特徴とする請求項５に記載の組換えベクター。

【請求項7】

請求項５に記載の組換えベクターに形質転換された組換え微生物。

【請求項8】

前記組換え微生物は、大腸菌であることを特徴とする請求項７に記載の組換え微生物。

【請求項9】

前記組換え微生物は、ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶ（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６０８ＢＰ）、ＮＴＳ−５０Ｌ−ＮＮＶ（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６１０ＢＰ）、ＮＴＳ−１６Ｕ−ｔＨＭＧ１（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６０９ＢＰ）、及びＮＴＳ−１６Ｕ−ＥＲＧ１（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６０７ＢＰ）からなる群から選択された何れか１つであることを特徴とする請求項８に記載の組換え微生物。

【請求項10】

請求項１ないし請求項４のうち何れか一項に記載の遺伝子多重挿入カセットが、サッカロミセスセレビシアエｒＤＮＡ上に多重挿入されている組換えサッカロミセスセレビシアエ菌株。

【請求項11】

前記菌株は、ノダウイルスカプシドタンパク質（ＮＮＶ）遺伝子が多重挿入されている請求項１０に記載の組換えサッカロミセスセレビシアエＹ２８０５／ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶ（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６１１ＢＰ）菌株またはＹ２８０６／ＮＴＳ−５０Ｌ−ＮＮＶ菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６１３ＢＰ）。

【請求項12】

前記菌株は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元剤（ＨＭＧ１）遺伝子が多重挿入されている請求項１０に記載の組換えサッカロミセスセレビシアエＹ２８０５／ＮＴＳ−１６Ｕ−ｔＨＭＧ菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６１２ＢＰ）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、リボソームＤＮＡ非転写スペーサー（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｎｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ；ｒＤＮＡ ＮＴＳ）基盤の遺伝子多重挿入カセットセット、及びそれを用いたＧＲＡＳ等級の組換え酵母菌株に係り、詳細には、ｒＤＮＡ ＮＴＳ断片と不完全プロモーターを有した栄養要求性選択マーカーとを含んだ遺伝子多重挿入カセットを開発し、それをサッカロミセスセレビシアエ菌株の染色体上に最適の数で多重挿入することによって、安全な経口用組換え菌株を作製することである。

【背景技術】

【0002】

農畜産／魚類養殖産業において、伝染病は、最も重要な問題点の１つである。養殖のような産業の大型化によって、伝染病の危険要素が増加している現状では、環境にやさしい疾病予防の要求が大きくなっている。その中でも、医薬用ワクチン及び免疫力増加機能性食品用新素材の発掘が未来農畜産／魚類産業市場を成長させることができる核心技術である。このような農畜産／魚類産業用ワクチンあるいは機能性食品素材開発のためには、安定かつ経済的な活性物質の量産が必須である。ワクチンとして使える抗原タンパク質を生産する形質転換微生物を用いた動物疾病に対する微生物経口ワクチンの開発は、安価であるだけではなく、経口ワクチンとして飼料に添加して使用が可能なので、ワクチン接種が容易であって、養殖農家に所得増大と労動力減少とを提供すると見込まれる。

【0003】

飼料添加剤は、生産性の改善目的として飼料に少量配合する非栄養素補助物質であって、抗生剤、生菌剤、酵素剤、有機酸剤、香味剤、甘味剤、抗酸化剤、各種の天然物質及び機能性物質などが飼料添加剤に分類されうる。実際に、これら飼料添加剤は、家畜飼料に広く使用されており、適切に飼料に適用される時、少量でも肯定的な効果を表わすことができる。飼料添加剤の全体市場規模は、大韓民国の国内で１５兆ウォンに至り、人口増加、肉類消費増加、穀物価上昇などでその規模は成長し続けている。飼料添加剤の種類としては、アミノ酸、ビタミン、成長促進抗生剤、ミネラル、酵素、有機酸、カロチノイド色素、保存剤などが主をなしており、多くの製品が発酵過程を通じて生産され、その比重も、さらに増えている。このような飼料添加剤事業の核心成功要素は、微生物操作技術とバイオマスの活用技術とである。

【0004】

伝統酵母サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、長期間にわたってビールとパンの発酵で使用されてきた菌株であって、人体に対する安全性が保証されたＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ）微生物として安全性が高い。特に、酵母は、高等生物と非常に類似した遺伝子転写及び翻訳システムと共に、タンパク質分泌器官を備えていて、翻訳後修飾を通して活性化されたタンパク質を生産することができて、大腸菌に比べて、高等生物由来の医薬用タンパク質の量産により有用な宿主システムとして用いられている。また、菌株の培養及び細胞外分泌タンパク質の精製が容易であって、スケールアップ（ｓｃａｌｅ−ｕｐ）が簡単なので、食品及び組換え医薬用タンパク質の産業的生産に有用な宿主システムである。酵母菌株を使って生産している組換えタンパク質は、ホルモン（インスリン、成長ホルモン）、ワクチン（肝炎ワクチン、子宮頸部癌ワクチン）、アルブミン、ヒルミンなどが成功的に量産されている。

【0005】

酵母の細胞壁成分であるβグルカンが、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を刺激するアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）として作用する役割があって、抗原と共に投与される時、免疫反応をさらに増加させるという報告以後、伝統酵母サッカロミセスセレビシアエを経口用ワクチンのための抗原伝達物質として活用するための研究が試みられた。最近、研究結果によって、酵母の細胞壁成分が、微生物感染と関連した危険信号を伝達すれば、樹枝状細胞（Ｄｅｎｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ；ＤＣ）によって組換え酵母が有した抗原タンパク質が、ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩとＩＩ経路を通じてＴ−ｃｅｌｌを含めた免疫関連細胞の活性を増加させることが立証された。それを基盤で抗原タンパク質を発現している組換え酵母自体を人体または動物用の経口用ワクチン開発の可能性を打診する研究が、次世代ワクチン開発の優れた戦略として注目を浴びた。特に、多数研究から組換え酵母菌株を用いたワクチン開発は、酵母の免疫反応を増加させるアジュバントとしての役割だけではなく、宿主動物の臓粘膜に抗原を適切にターゲティングする効果的な伝達システムとしての可能性が提示されており、経口用ワクチン運搬体としての酵母の可能性を示唆している。

【0006】

一方、酵母は、多様な二次代謝産物の生合成経路を導入して発現させることができる宿主として関心が高まっている。多様な生命体が生産する二次代謝産物は、高付加価値化学化合物の主要供給先として多くの場合、重要な医薬的な性質を有している。特に、植物の代謝産物は、抗酸化剤または抗生剤の機能を通じてバクテリア、ウイルス、カビなどの感染を防ぎ、また、人体健康に有益な機能性物質で治療剤としての活用度が高くて、微生物を活用した量産技術に対する需要が高い。二次代謝生合成経路が自体的に制限的な酵母は、遺伝工学を通じて導入された外来代謝経路を妨害するか、競争せず、なによりも多様なオミックス分析システムがよく構築されていて、転写体と代謝体の分析を通じて酵母宿主の生理状態についての総体的な情報を確保することができるという長所がある。また、代謝過程に対する詳細なモデルが開発されて、変形された代謝ネットワークの行動を予測することができるイン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）酵母が構築されていて、それを活用した人工細胞デザイン及び作製がさらに容易な点が大きな長所である。さらに、単細胞真核微生物として酵母は、小胞体及びミトコンドリアのような小器官で発現されて初めて活性を有するｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０のような外来酵素の発現に適した宿主であり、植物及び動物由来の酵素活性に必須的なタンパク質の翻訳後、変形能がある点も、ワンヘック微生物宿主に比べて有する長所である。

【0007】

酵母で異種遺伝子発現を調節するさらに他の重要なツールセットは、所望の発現カセットのコピー数を調節することができる装置である。伝統酵母の場合、２ミクロン−基盤のプラスミドは、１細胞当たり約５〜３０個のコピー程度存在する一方、酵母動原体（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ）と連携された複製起点塩基配列（ＣＥＮ／ＡＲＳ）−基盤のプラスミドは、非常に低い複製数（細胞１つ当たり約１個）に存在する。高複製数発現ベクターは、暗号化された遺伝子を強く発現させて、細胞に大きな負担を与え、発現ベクター自体の不安定性をもたらしうる。低複製数発現ベクターは、さらに安定した発現プラットフォームを提供するが、低い遺伝子発現レベルが問題になりうる。相同組替えを通じる酵母宿主染色体上の標的遺伝子部位に発現カセットを挿入する場合、持続的な選択圧がない条件でも、発現ベクターが安定して保持されるという長所がある。発現ベクターの多重挿入のために、酵母染色体に反復的なコピーで存在しているリボソーム要素、デルタ要素、そして、シグマ要素の配列などを標的として活用する技術が開発された。

【0008】

リボソームは、ｒＲＮＡ分子とタンパク質とで構成されているが、真核リボソームは、２８Ｓ、１６Ｓ、５Ｓ ｒＲＮＡ分子を有している。真核細胞のリボソームＤＮＡは、コーディング領域と非コーティング領域とで構成されている。また、ｒＤＮＡは、進化に保存的な領域、他の領域よりも迅速に進化するＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ）領域、そして、ＩＧＳ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ Ｓｐａｃｅｒ）領域があると知られている。真核細胞のｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）転写単位は、１８Ｓ、５．８Ｓ、２８Ｓの順になっており、それぞれのｒＤＮＡの間に２個のＩＴＳ領域に分離連結されている。さらに他の転写単位は、５Ｓであり、ＮＴＳ（Ｎｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）部位に取り囲まれている。伝統酵母サッカロミセスセレビシアエの場合、リボソームＤＮＡ ｕｎｉｔは、染色体１２番に１００〜１５０個程度繰り返して挿入されている。このような多重で存在するｒＤＮＡ遺伝子部位を用いた多重導入発現ベクターの場合、発現カセットの多重導入のために、主に抗生剤耐性遺伝子を選択マーカーとして活用している。しかし、抗生物質の使用は、培養規模が大きくなるほど、コスト及び環境的側面で大きな問題を引き起こし得る。特に、抗生剤耐性マーカーを有した組換え酵母菌株の場合、経口用ワクチンまたは飼料添加剤として開発しようとする場合、抗生剤耐性マーカー遺伝子が生態系に流出されて抗生剤耐性バクテリア出現を増幅させることができる安全性の問題が大きなイシューとして提起されている。したがって、抗生剤耐性マーカー挿入なしに、目的遺伝子を多重で宿主染色体に挿入させることができる発現カセットの開発に対する必要性がさらに注目されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、サッカロミセスセレビシアエリボソームＤＮＡ非転写スペーサー（ｒＤＮＡ ＮＴＳ）のＮ末端断片遺伝子、挿入目的遺伝子、プロモーター領域を含む栄養要求性選択標識マーカー遺伝子及びサッカロミセスセレビシアエｒＤＮＡ ＮＴＳのＣ末端断片遺伝子を順次に含む遺伝子多重挿入カセットを提供するところにある。

【0010】

本発明の他の目的は、前記遺伝子多重挿入カセットが、サッカロミセスセレビシアエｒＤＮＡ上に多重挿入されている抗生剤耐性マーカーを有さないＧＲＡＳ級の組換えサッカロミセスセレビシアエ菌株を提供するところにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

前記目的を果たすために、本発明は、サッカロミセスセレビシアエリボソームＤＮＡ非転写スペーサー（ｒＤＮＡ ＮＴＳ）のＮ末端断片遺伝子、挿入目的遺伝子、プロモーター領域を含む栄養要求性選択標識マーカー遺伝子及びサッカロミセスセレビシアエｒＤＮＡ ＮＴＳのＣ末端断片遺伝子を順次に含む遺伝子多重挿入カセットを提供する。

【0012】

また、本発明は、前記遺伝子多重挿入カセットを含む組換えベクター及び前記組換えベクターに形質転換された組換え微生物を提供する。

【0013】

また、本発明は、前記遺伝子多重挿入カセットが、サッカロミセスセレビシアエｒＤＮＡ上に多重挿入されている組換えサッカロミセスセレビシアエ菌株を提供する。

【0014】

また、本発明は、前記菌株、その培養物、菌体破砕物またはこれより分離精製されたノダウイルスカプシドタンパク質（ＮＮＶ）を有効成分として含むワクチン組成物を提供する。

【0015】

また、本発明は、前記菌株、その培養物、菌体破砕物またはこれより分離精製されたスクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）またはオキシドスクアレン（ｏｘｉｄｏｓｑｕａｌｅｎｅ）を有効成分として含む飼料添加用組成物を提供する。

【発明の効果】

【0016】

本発明は、ｒＤＮＡ ＮＴＳ基盤の遺伝子多重挿入カセットセット、及びそれを用いたＧＲＡＳ等級の組換え酵母菌株に係り、詳細には、ｒＤＮＡ ＮＴＳ断片と不完全プロモーターを有した栄養要求性選択マーカーとを含んだ遺伝子多重挿入カセットを開発し、それを抗生剤耐性マーカー遺伝子の挿入なしに、サッカロミセスセレビシアエ菌株の染色体上に最適の数で多重挿入することによって、安全な経口用組換え菌株を作製することである。本発明から作製されたカセットを用いてノダカプシド遺伝子を多重挿入し、挿入数に比例して組換えタンパク質発現量の増加が可能であった。また、本カセットを用いてスクアレン前駆体生合成遺伝子を多重挿入することによって、スクアレン生産量が増加した組換え酵母菌株を作製した。このような抗生剤耐性マーカーを有さない組換えタンパク質及び有用代謝産物生産菌株は、畜産産業や魚類養殖産業で生産品の価格の経済性のある経口用ワクチンまたは飼料添加剤として使えることができる。また、選択マーカーを複数個使用することができない酵母菌株の場合、同一マーカーを有している多様な発現カセットを酵母宿主の染色体上に１００余個以上存在するｒＤＮＡ ＮＴＳ部位に同時に多重で挿入される組換え菌株を作製することができるだけではなく、多様な場合の比率で多重挿入された組換え菌株を作製することができて、多様な発現カセットの最適挿入比率で挿入されて、最適の生産量を示す組換え菌株を選別することができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ｒＤＮＡ ＮＴＳ部位に多様な数字で多重挿入されるように長さが異なるプロモーターセットによって発現されるＵＲＡ３選択マーカーを有したサッカロミセスセレビシアエ用多重挿入カセットセット（図１Ａ）と、多重挿入戦略模式図（図１Ｂ）、及びｒＤＮＡ ＮＴＳ部位にノダカプシドタンパク質遺伝子多重挿入に対するｑＲＴ−ＰＣＲ分析結果（図１Ｃ）である。

【0018】

【図2】ｒＤＮＡ ＮＴＳ部位に多様な数字で多重挿入されるように長さが異なるプロモーターセットによって発現されるＬＥＵ２選択マーカーを有したサッカロミセスセレビシアエ用多重挿入カセットセット模式図（図２Ａ）、及びｒＤＮＡ ＮＴＳ部位にノダカプシドタンパク質遺伝子多重挿入に対するｑＲＴ−ＰＣＲ分析結果（図２Ｂ）である。

【0019】

【図3】１６ｂｐプロモーターに発現されるＵＲＡ３選択マーカーを活用したサッカロミセスセレビシアエコドン最適化されたノダカプシドタンパク質遺伝子多重挿入菌株ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶ／Ｙ２８０５候補でノダカプシドタンパク質発現確認のためのウェスタンブロット分析結果（図３Ａ）と、宿主染色体に挿入されたＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶ発現カセットの安定性分析結果（図３Ｂ）である。“ＷＴ”は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ２８０５野生型菌株のサンプルであり、“Ｐｏｓｉｔｉｖｅ”は、２ｕベクターにＮＮＶを発現したベクターＹＥＧａ−ＭＣＳ−ｏｐｔ−ＲＧＮＮＶ−ＣＰを有した組換え菌株のサンプルである。

【0020】

【図4】組換えＮＴＳ−１６ＵＮＮＶ／Ｙ２８０５酵母菌株の免疫原性及び中和抗体誘発性分析のために、マウスに凍結乾燥した組換え酵母菌株を経口投与してＲＧＮＮＶのｃａｐｓｉｄタンパク質に対する血中抗体形成レベルを調査した結果（図４（Ａ））、マウス血清のＲＧＮＮＶに対する中和活性を測定した結果（図４（Ｂ））、マウスグループの血清を１／１００または１／２００に希釈してＲＧＮＮＶと混ぜた後、Ｅ−１１魚類細胞に感染させ、培養した後、細胞と培養液をいずれも集めてウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）（図４の（Ｃ））を進行した結果である。ウェスタンブロットは、マウスａｎｔｉ−ＲＧＮＮＶ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ血清を使ってＲＧＮＮＶカプシドタンパク質の検出を進行した。

【0021】

【図5】１６ｂｐプロモーターに発現されるＵＲＡ３選択マーカーを活用したＮ末端除去されたサッカロミセスセレビシアエＨＭＧ１遺伝子（ｔＨＭＧ１）多重挿入ベクターＮＴＳ（１６Ｕ）−ｔＨＭＧ１（図５Ａ）、サッカロミセスセレビシアエのｒＤＮＡ ＮＴＳ部位にｔＨＭＧ１多重挿入に対するｑＲＴ−ＰＣＲ分析結果（図５Ｂ）、ＨＭＧ１タンパク質発現量を確認したウェスタンブロット分析結果（図５Ｃ）、及びＧＣ（Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析を通じるスクアレン量産菌株選別（図５Ｄ）を示した図面である。

【0022】

【図6】１６ｂｐプロモーターに発現されるＵＲＡ３選択マーカーを活用したサッカロミセスセレビシアエスクアレンエポキシダーゼ（Ｓｑｕａｌｅｎｅ ｅｐｏｘｉｄａｓｅ）遺伝子（ＥＲＧ１）多重挿入ベクターＮＴＳ（１６Ｕ）−ＥＲＧ１図式図（図６Ａ）、多重挿入戦略模式図（図６Ｂ）、及びサッカロミセスセレビシアエのｒＤＮＡ ＮＴＳ部位にＮＴＳ（１６Ｕ）−ｔＨＭＧ１とＮＴＳ（１６Ｕ）−ＥＲＧ１発現カセットが同時に多重挿入した組換え菌株選別のためのｑＲＴ−ＰＣＲ分析結果（図６Ｃ）を示した図面である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明者らは、抗生剤耐性遺伝子の挿入なしに、酵母宿主のｒＤＮＡ ＮＴＳ部位を用いた目的遺伝子発現カセットのみ挿入される技術を開発して、既存の高発現システムと異なって、組換えタンパク質及び有用代謝産物の生産において、高濃度培養時に、抗生剤の供給が必要ない発現システムを構築し、本発明を完成した。本発明から開発された遺伝子多重挿入カセットで開発された組換え酵母菌株は、発現カセットの安定性も高い抗生物質非依存型高発現システムで経口用ワクチン及び飼料添加剤として活用が可能な産業化に適した発現系である。

【0024】

本発明は、サッカロミセスセレビシアエリボソームＤＮＡ非転写スペーサー（ｒＤＮＡ ＮＴＳ、ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｘ００４８６．１）のＮ末端断片遺伝子、挿入目的遺伝子、プロモーター領域を含む栄養要求性選択標識マーカー遺伝子及びサッカロミセスセレビシアエｒＤＮＡ ＮＴＳのＣ末端断片遺伝子を順次に含む遺伝子多重挿入カセットを提供する。

【0025】

望ましくは、前記ｒＤＮＡ ＮＴＳのＮ末端断片遺伝子は、配列番号１で表され、前記ｒＤＮＡ ＮＴＳのＣ末端断片遺伝子は、配列番号２で表される。

【0026】

望ましくは、前記栄養要求性選択標識マーカー遺伝子は、配列番号３で表されるプロモーター領域を含むＵＲＡ３遺伝子（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿００１１７８８３６．３）または配列番号４で表されるプロモーター領域を含むＬＥＵ２遺伝子（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿００１１７８６６５．１）であり得るが、これらに制限されるものではない。

【0027】

望ましくは、前記挿入目的遺伝子は、ノダウイルスカプシドタンパク質遺伝子（ＮＮＶ、ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＣＡＥ５５２０８．２）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元剤遺伝子（ＨＭＧ１、ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿００１１８２４３４．１）またはスクアレンエポキシダーゼ遺伝子（ＥＲＧ１、ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿００１１８１３０４．１）であり得るが、これらに制限されるものではない。

【0028】

本発明において、遺伝子多重挿入カセットは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーのような発現調節エレメント以外にも、膜標的化または分泌のための信号配列またはリーダー配列を含み、目的によって多様に製造可能である。

【0029】

また、本発明は、前記遺伝子多重挿入カセットを含む組換えベクターを提供する。望ましくは、前記組換えベクターは、図１Ａ、図２Ａ、図５Ａ、及び図６Ａからなる群から選択された何れか１つの開裂地図であり得るが、これらに制限されるものではない。

【0030】

本発明において、“ベクター”は、クローン遺伝子（または、クローンＤＮＡの他の切片）を運ぶのに使用される自ら複製されるＤＮＡ分子を意味する。

【0031】

また、本発明は、前記組換えベクターに形質転換された組換え微生物を提供する。望ましくは、前記組換え微生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得るが、これに制限されるものではない。

【0032】

さらに望ましくは、前記組換え微生物は、ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶ（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６０８ＢＰ）、ＮＴＳ−５０Ｌ−ＮＮＶ（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６１０ＢＰ）、ＮＴＳ−１６Ｕ−ｔＨＭＧ１（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６０９ＢＰ）またはＮＴＳ−１６Ｕ−ＥＲＧ１（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６０７ＢＰ）であり得る。

【0033】

前記ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶ（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６０８ＢＰ）菌株は、本明細書の図１ＡのｐＴ−ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶベクターに形質転換された大腸菌菌株である。

【0034】

前記ＮＴＳ−５０Ｌ−ＮＮＶ（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６１０ＢＰ）菌株は、本明細書の図２ＡのｐＴ−ＮＴＳ−５０Ｌ−ＮＮＶベクターに形質転換された大腸菌菌株である。

【0035】

前記ＮＴＳ−１６Ｕ−ｔＨＭＧ１（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６０９ＢＰ）菌株は、本明細書の図５ＡのｐＴ−ＮＴＳ−１６Ｕ−ｔＨＭＧ１ベクターに形質転換された大腸菌菌株である。

【0036】

前記ＮＴＳ−１６Ｕ−ＥＲＧ１（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６０７ＢＰ）菌株は、本明細書の図６ＡのｐＴ−ＮＴＳ−１６Ｕ−ＥＲＧ１ベクターに形質転換された大腸菌菌株である。

【0037】

また、本発明は、前記遺伝子多重挿入カセットが、サッカロミセスセレビシアエｒＤＮＡ上に多重挿入されている組換えサッカロミセスセレビシアエ菌株を提供する。

【0038】

望ましくは、前記菌株は、ノダウイルスカプシドタンパク質（ＮＮＶ）遺伝子が多重挿入されている組換えサッカロミセスセレビシアエＹ２８０５／ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶ（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６１１ＢＰ）菌株またはＹ２８０６／ＮＴＳ−５０Ｌ−ＮＮＶ菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６１３ＢＰ）であり得る。

【0039】

望ましくは、前記菌株は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元剤（ＨＭＧ１）遺伝子が多重挿入されている組換えサッカロミセスセレビシアエＹ２８０５／ＮＴＳ−１６Ｕ−ｔＨＭＧ菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ １２６１２ＢＰ）であり得る。

【0040】

望ましくは、前記菌株は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元剤（ＨＭＧ１）遺伝子及びスクアレンエポキシダーゼ（ＥＲＧ１）遺伝子が多重挿入されている組換えサッカロミセスセレビシアエＣＥＮ．ＰＫ−１Ｃ／ＮＴＳ−１６Ｕ−ｔＨＭＧ＆ＮＴＳ−１６Ｕ−ＥＲＧ１菌株であり得る。

【0041】

また、前記菌株、その培養物、菌体破砕物またはこれより分離精製されたノダウイルスカプシドタンパク質（ＮＮＶ）を有効成分として含むワクチン組成物を提供する。

【0042】

本発明のワクチン組成物は、薬剤学的に許容される担体を含みうるが、抗原物質を生体内部位への伝達に適した任意の成分を意味し、例えば、水、食塩水、リン酸塩緩衝食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンス溶液、その他の水溶性の生理学的平衡溶液、オイル、エステル及びグリコールなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0043】

前記担体は、化学的安定性及び等張性を増進させるために適した補助成分と保存剤とを含み、トレハロース、グリシン、ソルビトール、ラクトースまたはグルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）のような安定化剤を含ませて、温度変化または凍結乾燥に対してワクチン組成物を保護することができる。本発明のワクチン組成物は、滅菌水または食塩水（望ましくは、緩衝された食塩水）のような懸濁液を含みうる。

【0044】

本発明のワクチン組成物は、免疫原に対する免疫反応を向上させるのに十分な量の任意のアジュバントを含有することができる。例えば、アルミニウム塩（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、スクアレン混合物（ＳＡＦ−１）、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリア細胞壁製造物、モノホスホリル脂質Ａ、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロック共重合体界面活性剤、Ｑｕｉｌ Ａ、コレラ毒素Ｂサブユニット、ポリホスファゲン及び誘導体、及び免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭｓ）を含むが、これらに限定されるものではない。

【0045】

他のあらゆるワクチン組成物と同様に、免疫原の免疫学的有効量は、経験的に決定されなければならず、この場合、考慮される因子は、免疫原性、投与経路及び投与される免疫投与回収が挙げられる。

【0046】

本発明ワクチン組成物中の抗原物質である細胞の培養物またはノダウイルスカプシドタンパク質は、本発明の組成物内で多様な濃度で存在することができるが、通常、前記抗原物質が生体内で適切なレベルの抗体形成の誘導に必要な濃度で含む。

【0047】

本発明のワクチン組成物は、全身または粘膜経路を通じて投与することによって、ノダウイルス感染に敏感な動物を保護または治療するために使用される。ワクチン組成物の投与は、筋内、腹膜内、皮内または皮下経路を通じる注射、経口／食事、呼吸器、泌尿生殖管への粘膜投与を含みうるが、これらに限定されるものではない。

【0048】

また、前記菌株、その培養物、菌体破砕物またはこれより分離精製されたスクアレンまたはオキシドスクアレンを有効成分として含む飼料添加用組成物を提供する。

【0049】

前記飼料は、一般的に家畜飼育に使用される公知の構成の飼料に、本発明の飼料添加用組成物を追加して構成することができる。

【0050】

前記公知の構成の飼料は、販売されている一般飼料をいずれも含み、これに限定されるものではないが、米糠、トウモロコシ、大豆粕、豆、キビ、米、麦、小麦、燕麦、ライ麦、粟、ソバ、ティリティゲイル、サツマイモ、タピオカ、小麦ふすま、麦糠、大豆皮、トウモロコシふすま、麦芽根、澱粉粕、コーヒー粕、蚕糞、蚕沙、海鳥糞、綿実粕、菜種粕、カノーラ粉、エゴマ粕、ゴマ粕、亜麻粕、ヒマワリ種粕、落花生粕、ヤシ粕、トウモロコシグルテン、酒精粕、トウモロコシ胚芽粕、トウガラシ種粕、ルピン種実、魚粉、羽毛粉及び肉粉であり得る。

【0051】

また、前記組成物には、一般的な飼料添加剤、例えば、塩、骨粉、リン酸カルシウム剤、無機物混合剤、ビタミン剤、アミノ酸剤、抗生物質、ホルモン剤などの特殊目的のための飼料添加剤が使用される。

【0052】

本発明による飼料添加用組成物は、有効成分として含有される前記菌株、その培養物またはこれより分離精製されたスクアレンまたはオキシドスクアレンを基準に家畜または家禽類に１日０．５〜１．０ｇ／ｋｇの量で投与し、このような投与量は、投与の対象となる動物の種類、動物の年齢、動物の体重、動物の予防しようとする疾病、所望の効果などによって、当該分野の専門家が適切に調節することができる。

【0053】

さらに、本発明は、前記ノダウイルスカプシドタンパク質及びスクアレン以外にも、多様な組換えタンパク質または有用代謝産物を量産するＧＲＡＳ級の組換え酵母菌株を作製することができる技術を提供する。すなわち、イリドウイルス、口蹄疫ウイルス、豚流行性下痢ウイルス、ロタウイルス、ヘパティスＢウイルスなど魚類、家畜及びヒトに感染を誘発する感染ウイルス及び豚流行性肺炎など感染細菌などから由来したタンパク質を大量発現する組換え酵母菌株の作製に使用される。また、アルテミシニン、ジンセノサイドのような多様なイソプレノイド類系の高機能性代謝産物、フラボノイド、アントシアニンのような抗酸化性機能を有したポリフェノール化合物系の二次代謝産物を量産する組換え酵母菌株の作製にも有用に使用される。

【0054】

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。

【0055】

【0056】

実施例１：多様な長さのプロモーターを有した選別標識マーカーの作製及びそれを活用したｒＤＮＡ ＮＴＳターゲット多重挿入ベクターセットの開発

【0057】

サッカロミセスセレビシアエを宿主として使った経口用組換えタンパク質多重挿入カセットを作製するために、ｒＤＮＡ ＮＴＳ部分のうち、それぞれＮ断片（４７ｂｐ）、Ｃ断片（４９ｂｐ）を、ＵＲＡ３遺伝子合成に使用するプライマー作製時に共に含んだＮＴＳ−３００Ｕ−ｆｗとＮＴＳ−３００Ｕ−ｒｖプライマーとを使ってＵＲＡ３選択マーカーを増幅した。増幅断片は、ｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒシステムに挿入してｐＴ−ＮＴＳ−３００Ｕベクターを作製した。引き続きＧＡＬ１０（ｐ）−ＮＮＶ−ＧＡＬ７（ｔ）断片をＹＥＧα−ＭＣＳ−ＮＮＶｃｐ（国際特許公開番号：ＷＯ２０１４０４６４１０ Ａ１）を鋳型としてＧＡＬ１０Ｐ−ｆｗとＧＡＬ７Ｔ−ｒｖプライマーとを使って増幅した後、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩを処理して挿入、ベクターｐＴ−ＮＴＳ−３００Ｕ−ＮＮＶを最終的に作製した（図１Ａ）。ベクターｐＴ−ＮＴＳ−３００Ｕ−ＮＮＶをＮｏｔＩ／ＸｂａＩ処理して３００ｂｐサイズのプロモーターを有したＵＲＡ３遺伝子（３００Ｕ）を除去した後、７７Ｕ−ｆｗと７７Ｕ−ｒｖプライマーとを用いて７７ｂｐサイズのプロモーターを有したＵＲＡ３遺伝子断片（７７Ｕ）を合成し、１６Ｕ−ｆｗと１６Ｕ−ｒｖプライマーとを用いて１６ｂｐサイズのプロモーターを有したＳｃＵＲＡ３遺伝子断片（１６Ｕ）をそれぞれ合成した後、ＮｏｔＩ／ＸｂａＩ処理して準備されたバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）ベクターに挿入、ｐＴ−ＮＴＳ−７７Ｕ−ＮＮＶ、ｐＴ−ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶベクターをそれぞれ作製した（図１Ａ）。それぞれのベクターは、ＳｐｈＩ／ＭｌｎＩ処理して発現カセットを回収した後、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ２８０５（ＭＡＴａ ｐｅｐ４：：ＨＳＩ３、ｐｒｂ１−ｄ、ｃａｎ１、ＧＡＬ２、ｈｉｓ３、ｕｒａ３−５２）菌株を形質転換させた後、ウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）欠乏の最小培地（ＳＣ−ＵＲＡ）に生き残る形質転換体を選別して、発現カセットが宿主ｒＲＮＡのＮＴＳ部位に多重挿入されるように誘導した。確保されたＵｒａ^＋形質転換体を前培養した後、ＯＤ＝０．５になるように接種し、本培養を２４時間行った後、遠心分離を通じて酵母細胞を回収した。該回収された酵母細胞にＳＴＥＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）緩衝溶液とガラスビーズ（ｇｌａｓｓ ｂｅａｄ）とを同量添加して破砕させた後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）とＰｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏａｍｙａｌｃｏｈｏｌ＝２４：１：１混合液をそれぞれ２００ｕｌ添加してもう一度破砕し、細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を確保して、エタノール沈澱法でｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を回収した。得られたｇＤＮＡをＵＲＡ３ ＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（表１）を用いてｑＲＴ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔａｔｉｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）分析を行った（図１Ｃ）。面白くも、ＮＴＳ−３００Ｕ−ＮＮＶカセットが挿入された形質転換体に比べて、ＮＴＳ−７７Ｕ−ＮＮＶとＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶの２つのベクターを活用して確保された形質転換体は、さらに多数のカセット挿入数を示した。特に、ＮＴＳ−７７Ｕ−ＮＮＶ比べて、ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶカセットに形質転換された組換え菌株は、平均的に多数の挿入を示した（図１Ｃ）。

【0058】

サッカロミセスセレビシアエＬＥＵ２マーカーセットも、同じ方式でプロモーター長さをそれぞれ５０、１００、４００ｂｐに異ならせて、ＸｂａＩ／Ｎｏｔ１ ＳｃＵＲＡ３標識遺伝子切片と交換を行って、ｐＴ−ＮＴＳ−４００Ｌ−ＮＮＶ、ｐＴ−ＮＴＳ−１００Ｌ−ＮＮＶ、ｐＴ−ＮＴＳ−５０Ｌ−ＮＮＶベクターを作製した（図２Ａ）。それぞれのベクターは、ＳｐｈＩ／ＭｌｎＩ処理して発現カセットを回収した後、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ２８０６（ＭＡＴａ ｐｅｐ４：：ＨＳＩ３、ｐｒｂ１−ｄ、ｃａｎ１、ＧＡＬ２、ｈｉｓ３、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２：：ｔｃ）菌株を形質転換させた後、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）欠乏の最小培地（ＳＣ−ＬＥＵ）に生き残る形質転換体を選別して、発現カセットが宿主ｒＲＮＡのＮＴＳ部位に多重挿入されるように誘導した。ＮＴＳ−４００Ｌ−ＮＮＶの場合、ただＮＴＳ−５０Ｌ−ＮＮＶカセットを挿入した組換え菌株のみで多重挿入を示したが、約５０コピー（ｃｏｐｙ）まで挿入されたと分析された（図２Ｂ）。前記作製された多重挿入カセットは、Ｙ２８０５由来のサッカロミセスセレビシアエ菌株以外に、ＢＹ４７４２菌株でも使用可能であった。したがって、本発明から作製された多重挿入カセットは、多様なサッカロミセスセレビシアエ菌株で使用可能であると期待する。

【0059】

【0060】

【表1】

【0061】

^１制限酵素は、下線で表示した。

【0062】

^２ＮＴＳ部位は、太字で表示した。

【0063】

^３ＨＡ ｔａｑは、傾けて表示した。

【0064】

【0065】

実施例２：ｐＴ−ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶ用いた経口用ノダウイルスワクチン量産組換え酵母の開発及び特徴分析

【0066】

実施例１から確保されたＹ２８０５／ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶ菌株のノダカプシドタンパク質の発現量を確認するために、酵母細胞を回収した後、ＴＮＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝溶液を添加して、破砕して細胞溶解物を確保した。それをＳＤＳサンプルローディングバッファ（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、０．１％ＢＰＢ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０％ＳＤＳ、１％ｂｅｔａ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）と混合した後、沸湯に１０分間熱処理してウェスタンブロット分析を行った。１次抗体は、ノダカプシド抗体を用い、２次抗体は、ｒａｂｂｉｔ−ＡＰ（ａｌｋａｌｉｏｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を使った。その結果、多重でＮＮＶ発現カセットが挿入された酵母菌株で予想されたサイズのノダカプシドタンパク質発現を確認することができた。それだけではなく、前記行ったカセット挿入数とタンパク質発現量とが正比例的に増加することを確認することができた（図３Ａ）。ウェスタンブロット分析で、“ＷＴ”は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ２８０５野生型菌株のサンプルであり、“Ｐｏｓｉｔｉｖｅ”は、本研究チームの先行研究によって作製された２ｕ基盤のベクターにＮＮＶをＧＡＬ１０プロモーターに発現するベクターＹＥＧａ−ＭＣＳ−ｏｐｔ−ＲＧＮＮＶ−ＣＰを有した組換え菌株のサンプルである。図３の結果は、ｐＴ−ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶを用いてＮＮＶ発現カセットのみがｒＤＮＡのＮＴＳに挿入された組換え酵母菌株が、既存の組換え酵母菌株とほぼ類似しているか、少し高いＮＮＶ発現を示していることを示している。

【0067】

既存の研究されたＹＥＧα−ＭＣＳ−ＮＮＶｃｐ／Ｙ２８０５（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）菌株と本発明から作製されたＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶ／Ｙ２８０５菌株との間の安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を比較分析するために、ＹＰＧ栄養培地とＳＣ−ＵＲＡ−Ｇａｌ選択培地とで２４、４８、７２時間培養したサンプルに対して、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った（図３Ｂ）。その結果、ＹＥＧα−ＭＣＳ−ＮＮＶｃｐ／Ｙ２８０５（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（＋））菌株は、ＳＣ−ＵＲＡ−Ｇａｌ選択培地では安定して挿入数が保持される一方、ＹＰＧ栄養培地では２４時間培養のみでも多数のベクターを失うことを確認した。しかし、ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶ／Ｙ２８０５菌株の場合、ＹＰＧ栄養培地、Ｓｃ−ＵＲＡ−Ｇａｌ選択培地とはかかわらずに、多数のカセットが安定または保持されていることを確認した（図３Ｂ）。

【0068】

前記本発明から開発された遺伝子多重挿入カセットで作製された組換え酵母菌株が、経口用ワクチンとして開発される可能性を検証するために、ＮＴＳ−１６ＵＮＮＶ／Ｙ２８０５酵母菌株の免疫原性及び中和抗体誘発性分析を行った。ＹＰＧ培地で７２時間培養した後、凍結乾燥した組換えＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶ／Ｙ２８０５菌体をマウスに経口投与した後、ＲＧＮＮＶカプシドタンパク質に対する血中抗体形成レベルをＥＬＩＳＡ方法を用いて分析した（図４（Ａ））。この際、陰性対照群として生理食塩水（ＰＢＳ）と凍結乾燥した野生型Ｙ２８０５菌株とを経口免疫させた。組換えＮＴＳ−１６ＵＮＮＶ／Ｙ２８０５菌体を３回、４回経口投与した後、血中ＲＧＮＮＶカプシドタンパク質に対する抗体力価レベルを測定した結果、陰性対照群に比べて、組換えＮＴＳ−１６ＵＮＮＶ／Ｙ２８０５酵母菌体が、経口投与されたマウスでノダウイルスカプシドタンパク質を認知する抗体形成が顕著に誘導されたということを確認することができた。また、ノダウイルスＲＧＮＮＶに対する中和活性を測定するために、単一層で培養したＥ−１１魚類細胞に４次経口免疫後、確保されたマウス血清とＲＧＮＮＶ混合液を感染させた後、細胞病変の有無を通じて中和活性を観察した（図４（Ｂ））。この際、血清は、１／２００に希釈した後、ＲＧＮＮＶと混ぜた後、細胞に感染させた。ＰＢＳと野生型Ｙ２８０５菌株を経口兔疫したマウス血清は、ＲＧＮＮＶを中和させることができなくて、細胞病変が表われたが、組換えＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶ／Ｙ２８０５酵母菌体で経口兔疫したマウス血清は、細胞病変が表われず、ＲＧＮＮＶを中和させると確認された。さらに、マウスグループの血清を１／１００または１／２００に希釈して、ＲＧＮＮＶと混ぜた後、Ｅ−１１魚類細胞に感染させ、培養した後、細胞と培養液をいずれも集めてウェスタンブロット分析を行った結果、ＰＢＳとＹ２８０５グループ血清を適用した細胞では、ＲＧＮＮＶカプシドタンパク質が強く検出されたが、ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶ／Ｙ２８０５グループの血清を適用した細胞では、ＲＧＮＮＶカプシドタンパク質が検出されず、ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶ／Ｙ２８０５の経口免疫が、ＲＧＮＮＶに対する中和抗体を誘導すると確認された。前記結果は、本発明から開発された遺伝子多重挿入カセットで作製された組換えノダウイルスカプシド発現酵母菌株が、経口用ワクチンとして開発される可能性を強力に提示する。

【0069】

【0070】

実施例３：ｒＤＮＡ ＮＴＳと不完全なプロモーターを有した必須アミノ酸選択マーカーとを用いた多重挿入ベクターを活用したスクアレン量産組換え酵母菌株の作製

【0071】

スクアレン量産Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ組換え菌株を作製するために、前記作製されたｐＴ−ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶベクターでＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ ＧＡＬ１０（ｐ）−ＮＮＶ遺伝子切片を除去し、表１に記述されたプライマーｔＨＭＧ１−ｆｗとｔＨＭＧ１−ｒｖとを用いてＮ末端５５２個のアミノ酸が除去されたＨＭＧ１遺伝子を増幅し、それをＴＤＨ３プロモーターに連結して作製されたＴＤＨ３（ｐ）−ｔＨＭＧ１遺伝子切片を挿入して、ｐＴ−ＮＴＳ−１６Ｕ−ｔＨＭＧ１ベクターを作製した（図５Ａ）。前記作製されたｐＴ−ＮＴＳ−１６Ｕ−ｔＨＭＧ１ベクターをＳｐｅＩとＭｌｕＩとに切断して、ＮＴＳ−１６Ｕ−ｔＨＭＧ１カセットを回収してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ２８０５菌株に導入し、ＵＲＡ３標識遺伝子を用いてＳＣ−ＵＲＡ培地で成長する形質転換体を選別した。確保された形質転換体であるＹ２８０５／ＮＴＳ−１６Ｕ−ｔＨＭＧ１菌株を前記と同じ方法でｇＤＮＡを回収した。得られたｇＤＮＡは、ＵＲＡ３ ＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を用いてｑＰＣＲ分析及びウェスタンブロット分析を通じて確認した。その結果、多様な数のカセットが挿入された組換え菌株が得られた（図５Ｂ及び図５Ｃ）。

【0072】

Ｎ末端５５２個のアミノ酸が除去されたＨＭＧ−ＣｏＡ還元剤（ＨＭＧ−ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）に対するｔＨＭＧ１遺伝子の過発現によって生産が増加したと予想されるスクアレンは、生産量をＧＣ分析を通じて確認した。確保された形質転換体であるＹ２８０５／ＮＴＳ−１６Ｕ−ｔＨＭＧ１菌株をＯＤ_６００（０．５）でＹＰＤ培地に本培養を始めた後、３日後にサンプルを回収した後、０．０１ｇの酵母菌体（５０ｕｌ）に１００ｕｌ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を同量添加した後、ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ（５０００、１０ｓ、３ｔｉｍｅｓ）を用いて破砕した後、遠心分離を通じて上澄み液を回収した後、同じ体積のヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）を添加した後、遠心分離を通じて上澄み液（ヘキサン層）を獲得した。得られたヘキサン層に残された水分を除去するために、Ｎａ_２ＳＯ_４粉を添加した後、遠心分離を通じて上澄み液（ヘキサン層）を再び回収した後、乾燥を通じてヘキサンを除去した後、１５０ｕｌクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）にサンプルを再び溶かした後、ＧＣ分析を行った。その結果、４個程度のカセットが挿入された組換え菌株７番で高い量のスクアレンが生成されることを確認した（図５Ｄ）。組換えタンパク質生産とは異なって、挿入数によって比例的にスクアレン生産が増加する態様は表われなかったが、ｑＲＴ−ＰＣＲスクリーンを通じてスクアレン量産に適した挿入数についての情報を得た。

【0073】

【0074】

実施例４：サッカロミセスセレビシアエでｒＤＮＡ ＮＴＳと不完全なプロモーターを有した栄養要求性選択マーカーとを用いた同一選択マーカーを有した２種のベクターの同時多重挿入

【0075】

本遺伝子多重導入ベクターが、プロモーターが短い選別標識遺伝子を活用すれば、ｒＤＮＡ ＮＴＳに５０コピーまで高効率で挿入可能な長所を用いて同じ選択マーカーを有した２種のベクターが同時に多重で挿入される組換え酵母菌株の作製を試みた。その例として、ＮＴＳ−１６Ｕ−ｔＨＭＧ１カセット（Ｎ末端除去されたサッカロミセスセレビシアエＨＭＧ−ＣｏＡ還元剤遺伝子；ｔＨＭＧ１）とＮＴＳ−１６Ｕ−ＥＲＧ１カセット（サッカロミセスセレビシアエスクアレンエポキシダーゼ遺伝子；ＥＲＧ１）の２個を同時に多重挿入して、オキシドスクアレン量産組換え菌株を作製しようとした（図６Ａ）。前記作製されたＮＴＳ−１６Ｕ−ＥＲＧ１カセットの作製のために、ｐＴ−ＮＴＳ−１６Ｕ−ＮＮＶベクターでＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ ＧＡＬ１０（ｐ）−ＮＮＶを除去した後、表１に記載のプライマーを使ってＰＣＲで増幅されたＥＲＧ１遺伝子とＴＥＦ１プロモーターが連結されたＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ ＴＥＦ（ｐ）−ＥＲＧ１遺伝子切片を挿入して、ｐＴ−ＮＴＳ−１６Ｕ−ＥＲＧ１ベクターを作製した。２つのカセットＮＴＳ−１６Ｕ−ｔＨＭＧ１とＮＴＳ−１６Ｕ−ＥＲＧ１をそれぞれＳｐｅＩ／ＭｌｕＩで切断した後、回収してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮ．ＰＫ−１Ｃ（ＭＡＴａ ｕｒａ３−５２ｔｒｐ１−２８９ｌｅｕ２−３、１１２ｈｉｓ３−Ｄ１ＭＡＬ２−８Ｃ ＳＵＣ２）内に導入し、ＳＣ−ＵＲＡ最小培地で成長する形質転換体を選別した（図６Ｂ）。確保された形質転換体であるＹ２８０５／ＮＴＳ−１６Ｕ−ｔＨＭＧ１、ＮＴＳ−１６Ｕ−ＥＲＧ１菌株を前記と同じ方法でｇＤＮＡを回収して、表１に記載のｇＤＮＡは、ＨＭＧ１、ＥＲＧ１ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーを用いてｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。その結果、ＥＲＧ１発現カセットに比べて、ｔＨＭＧ１発現カセットが多様な比率で多重挿入された形質転換体＃１０６（４：１）、＃１０７（８：３）、＃１０８（２：４）、＃１０９（５：２）、＃１４（５：１１）が得られた（図６Ｃ）。

【0076】

【0077】

以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な記述は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。

【0078】

【0079】

【0080】

【0081】

【0082】

【0083】

【0084】

【0085】

【0086】

【0087】

【0088】

【0089】

【0090】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2a】

【図2b】

【図3a】

【図3b】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]