特許 6475550 リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法及びキット、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤、並びにリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6475550

(24)【登録日】2019年2月8日

(45)【発行日】2019年2月27日

(54)【発明の名称】リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法及びキット、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤、並びにリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20190218BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190218BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20190218BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20190218BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20190218BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20190218BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20190218BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20190218BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20190218BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68ZNA

   A61P43/00 105

   A61P9/04

   A61K31/7088

   A61K31/713

   A61K31/7105

   G01N33/53 M

   G01N33/68

   G01N33/53 D

   !C12N15/113 Z

【請求項の数】5

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2015-76961(P2015-76961)

(22)【出願日】2015年4月3日

(65)【公開番号】特開2016-195567(P2016-195567A)

(43)【公開日】2016年11月24日

【審査請求日】2018年1月26日

(73)【特許権者】

【識別番号】598041566

【氏名又は名称】学校法人北里研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(72)【発明者】

【氏名】今井 浩孝

(72)【発明者】

【氏名】松岡 正城

【審査官】 山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】 医学のあゆみ，２０１４年 ３月２９日，第２４８巻第１３号，第１０７５−１０８３頁

【文献】 Free Radical Biology & Medicine ，２００８年，Vol.45，p.855-865

【文献】 Biochemical and Biophysical Research Communications，２００３年，p.278-286，Vol.305

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

Ｃ１２Ｎ ５／００−２８

Ａ６１Ｋ ３８／００−５８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞中の、プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質の活性化状態を検出する工程を備え、
前記プロテアソーム関連タンパク質が、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１及びＵｂｅ２ａからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質であり、
前記熱ショックタンパク質がＤｎａｊｃ９であり、
前記鉄・硫黄クラスター関連タンパク質がＮｕｂｐ２であり、
前記核小体タンパク質がＦｂｌであり、
前記ＷＤリピートファミリータンパク質がＷｄｆｙ１であり、
前記検出は、前記タンパク質のｍＲＮＡレベルでの発現量を測定すること、前記タンパク質のタンパク質レベルでの発現量を測定すること、又は、前記タンパク質の発現抑制による細胞死の抑制を測定することにより行われる、
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法。

【請求項2】

リン酸化した又はリン酸化していない、プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質に対する抗体、
プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡ増幅用プライマー、あるいは
プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸、
を備え、
前記プロテアソーム関連タンパク質が、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１及びＵｂｅ２ａからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質であり、
前記熱ショックタンパク質がＤｎａｊｃ９であり、
前記鉄・硫黄クラスター関連タンパク質がＮｕｂｐ２であり、
前記核小体タンパク質がＦｂｌであり、
前記ＷＤリピートファミリータンパク質がＷｄｆｙ１である、
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出用キット。

【請求項3】

プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とし、
前記プロテアソーム関連タンパク質が、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１及びＵｂｅ２ａからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質であり、
前記熱ショックタンパク質がＤｎａｊｃ９であり、
前記鉄・硫黄クラスター関連タンパク質がＮｕｂｐ２であり、
前記核小体タンパク質がＦｂｌであり、
前記ＷＤリピートファミリータンパク質がＷｄｆｙ１である、
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤。

【請求項4】

プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とし、
前記プロテアソーム関連タンパク質が、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１及びＵｂｅ２ａからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質であり、
前記熱ショックタンパク質がＤｎａｊｃ９であり、
前記鉄・硫黄クラスター関連タンパク質がＮｕｂｐ２であり、
前記核小体タンパク質がＦｂｌであり、
前記ＷＤリピートファミリータンパク質がＷｄｆｙ１である、
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤。

【請求項5】

前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患は、心不全である、請求項４に記載の予防又は治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法及びキット、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤、並びにリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤に関する。

【背景技術】

【0002】

生体膜を構成するリン脂質は、２位に不飽和脂肪酸を有している。図１に示すように、鉄を介したフェントン反応により、スーパーオキシド又は過酸化水素から生成したヒドロキシラジカルが上記不飽和脂肪酸と反応すると、リン脂質ヒドロペルオキシドが生じることが知られている。

【0003】

リン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、以下「ＰＨＧＰｘ」という場合がある。）は、グルタチオンを補酵素として、生成したリン脂質ヒドロペルオキシドを直接還元し、リン脂質ヒドロキシ体に変換する酵素である。このＰＨＧＰｘ遺伝子のノックアウトマウスは、胎性致死であることが知られていた（例えば、非特許文献１を参照）。しかしながら、ＰＨＧＰｘ欠損による細胞死のメカニズムは不明であった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Imai H, et al., Early embryonic lethality caused by targeted disruption of the mouse PHGPx gene, Biochem Biophys Res Commun., 305, 278-86, 2003.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、ＰＨＧＰｘ欠損による細胞死の経路に関与する因子を明らかにし、上記細胞死（以下、「リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死」という。）の検出方法及びキット、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤、並びにリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は以下の通りである。
（１）細胞中の、プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質の活性化状態を検出する工程を備える、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法。
（２）前記検出は、前記タンパク質の細胞内の局在状態を測定すること、前記タンパク質のｍＲＮＡレベルでの発現量を測定すること、前記タンパク質のタンパク質レベルでの発現量を測定すること、前記タンパク質のリン酸化率を測定すること及び上記タンパク質の発現抑制による細胞死の抑制を測定することからなる群より選択される少なくとも１つにより行われる（１）に記載の検出方法。
（３）前記プロテアソーム関連タンパク質が、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１及びＵｂｅ２ａからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質である（１）又は（２）に記載の検出方法。
（４）前記熱ショックタンパク質がＤｎａｊｃ９である（１）〜（３）のいずれかに記載の検出方法。
（５）前記鉄・硫黄クラスター関連タンパク質がＮｕｂｐ２である（１）〜（４）のいずれかに記載の検出方法。
（６）前記核小体タンパク質がＦｂｌである（１）〜（５）のいずれかに記載の検出方法。
（７）前記ＷＤリピートファミリータンパク質がＷｄｆｙ１である（１）〜（６）のいずれかに記載の検出方法。
（８）リン酸化した又はリン酸化していない、プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質に対する抗体、プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡ増幅用プライマー、あるいはプロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸、を備える、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出用キット。
（９）前記プロテアソーム関連タンパク質が、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１及びＵｂｅ２ａからなる群より選択される少なくとも１つである（８）に記載のキット。
（１０）前記熱ショックタンパク質がＤｎａｊｃ９である（８）又は（９）に記載のキット。
（１１）前記鉄・硫黄クラスター関連タンパク質がＮｕｂｐ２である（８）〜（１０）のいずれかに記載のキット。
（１２）前記核小体タンパク質がＦｂｌである（８）〜（１１）のいずれかに記載のキット。
（１３）前記ＷＤリピートファミリータンパク質がＷｄｆｙ１である（８）〜（１２）のいずれかに記載のキット。
（１４）プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤。
（１５）前記プロテアソーム関連タンパク質が、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１及びＵｂｅ２ａからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質である（１４）に記載のリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤。
（１６）前記熱ショックタンパク質がＤｎａｊｃ９である（１４）又は（１５）に記載のリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤。
（１７）前記鉄・硫黄クラスター関連タンパク質がＮｕｂｐ２である、（１４）〜（１６）のいずれかに記載のリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤。
（１８）前記核小体タンパク質がＦｂｌである（１４）〜（１７）のいずれかに記載のリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤。
（１９）前記ＷＤリピートファミリータンパク質がＷｄｆｙ１である（１４）〜（１８）のいずれかに記載のリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤。
（２０）プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤。
（２１）前記プロテアソーム関連タンパク質が、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１及びＵｂｅ２ａからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質である（２０）に記載の予防又は治療剤。
（２２）前記熱ショックタンパク質がＤｎａｊｃ９である（２０）又は（２１）に記載の予防又は治療剤。
（２３）前記鉄・硫黄クラスター関連タンパク質がＮｕｂｐ２である（２０）〜（２２）のいずれかに記載の予防又は治療剤。
（２４）前記核小体タンパク質がＦｂｌである（２０）〜（２３）のいずれかに記載の予防又は治療剤。
（２５）前記ＷＤリピートファミリータンパク質がＷｄｆｙ１である（２０）〜（２４）のいずれかに記載の予防又は治療剤。
（２６）前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患は、心不全である（２０）〜（２５）のいずれかに記載の予防又は治療剤。

【発明の効果】

【0007】

本発明により、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法及びキットを提供することができる。また、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤を提供することができる。また、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】生体膜新脂質酸化反応とその代謝経路を説明する図である。

【図2】ＰＨＧＰｘタンパク質を検出するウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。

【図3】ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞内で生成されたリン脂質ヒドロペルオキシド（１８：０、２０：４ホスファチジルコリン由来のヒドロペルオキシド）の量の経時変化を示すグラフである。

【図4】タモキシフェン添加によりＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞が致死となるＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。

【図5】（ａ）は、アポトーシス阻害剤を用いた時のリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制効果を細胞生存率（％）で示した結果を示すグラフである。（ｂ）は、スタウロスポリン処理とタモキシフェン処理の際のアポトーシスの指標の蛍光免疫染色の結果を示す写真である。

【図6】（ａ）は、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド添加３０分後のＨＭＧＢ１の蛍光免疫染色の結果を示す写真であり、図６（ｂ）は、タモキシフェン添加４８時間後のＨＭＧＢ１の蛍光免疫染色結果を示す写真である。

【図7】（ａ）は、オートファジー関連因子ＡＴＧ５のノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。（ｂ）は、ＲＴ−ＰＣＲによるＡＴＧ５の発現抑制の結果を示す写真である。

【図8】（ａ）は、ネクロトーシス関連因子Ｒｉｐ１のノックダウン細胞によるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。（ｂ）は、ウエスタンブロッティングによるＲｉｐ１の発現低下の結果を示す写真である。

【図9】発明者らの解析により明らかとなった、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路のモデル図である。

【図10】ｓｈＲＮＡライブラリーのスクリーニング手順の概要を示す図である。

【図11】１５１個の候補遺伝子について、ノックダウンによりリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制効果が高い順に並べた結果を示すグラフである。

【図12】Ｒｂｘ１のノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。

【図13】（ａ）は、ｐｉＭＧ−ｄｒＵ６ベクターの構造を示す図である。（ｂ）は、ｓｈＲＮＡが発現し、ｓｉＲＮＡが形成され、標的ＲＮＡが破壊される過程を示すモデル図である。

【図14】ｐＭＸｓ−ＩＲベクターの構造を示す図である。

【図15】Ｕｂｅ２ｄ１のノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。

【図16】Ｕｂｅ２ａのノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。

【図17】Ｄｎａｊｃ９のノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。

【図18】Ｎｕｂｐ２のノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。

【図19】Ｆｂｌのノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。

【図20】Ｗｄｆｙ１のノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。

【図21】（ａ）は、発生過程１７．５日目、１８．５日目の野生型マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及び心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（ＫＯ）の写真である。（ｂ）は、発生過程１７．５日目のマウスの心臓の組織切片を、ＤＡＰＩ及びＴＵＮＥＬ染色（ＴＵＮＥＬ）した結果を示す写真である。（ｃ）は、発生過程１７．５日目のマウスの心臓におけるＰＨＧＰｘタンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す写真である。

【図22】（ａ）〜（ｃ）は、３−ＡＴＡの効果を検討した際の発生過程１８．５日のマウス胎仔の写真である。

【図23】（ａ）は、餌のビタミンＥ量の低下により引き起こされる不整脈性突然死（心不全）のモデルマウスの説明図、ビタミンＥ添加食から通常食に換えると約１０日で突然死を起こすことを示したマウスの生存率を示すグラフである。（ｂ）は、心臓中のビタミンＥの量を測定した結果を示すグラフである。（ｃ）は、マウスの心電図を示すグラフである。

【図24】ビタミンＥ低下により引き起こされる心不全による突然死マウスモデルに対する３−ＡＴＡの抑制効果を示したグラフである。

【図25】ビタミンＥ低下により引き起こされる心不全による突然死マウスモデルに対するＵ−０１２６の抑制効果を示したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0009】

［リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法］
１実施形態において、本発明は、細胞中の、プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質の活性化状態を検出する工程を備える、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法を提供する。

【0010】

後述するように、発明者らは、アポトーシス、ネクローシス、オートファジー性細胞死、ネクトローシスとは明確に異なる新規の経路による細胞死（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死）を見出した。更に、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に、プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質が関与していることを明らかにした。

【0011】

本実施形態の検出方法において、プロテアソーム関連タンパク質としては、Ｒｂｘ１（ｒｉｎｇ−ｂｏｘ １、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＢＣ０２７３９６）、Ｕｂｅ２ｄ１（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｅ２Ｄ １、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＢＣ０１９４６４）、Ｕｂｅ２ａ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｅ２Ａ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ０１９６６８）等が挙げられる。

【0012】

Ｒｂｘ１タンパク質は、キュリン（ｃｕｌｌｉｎ）と相互作用することが知られている。Ｒｂｘ１タンパク質はユビキチン化反応において独特な役割を果たし、キュリン−１とヘテロ二量体を形成することによってユビキチンの重合を触媒することが明らかにされている。また、タンパク質の代謝回転の調節にも関与する可能性が指摘されている。

【0013】

Ｕｂｅ２ｄ１タンパク質は、代謝回転の早いタンパク質の分解の際のユビキチン化に関与するユビキチンＥ２リガーゼである。Ｐ５３やＨＩＦ−１αの代謝に関与することが報告されている。また、Ｕｂｅ２ａタンパク質はユビキチンＥ２リガーゼである。

【0014】

本実施形態の検出方法において、熱ショックタンパク質としては、Ｄｎａｊｃ９（ＤｎａＪ（Ｈｓｐ４０）ｈｏｍｏｌｏｇ，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｃ，ｍｅｍｂｅｒ ９、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１３４０８１）等が挙げられる。Ｄｎａｊｃ９タンパク質は、ＨＳＰ７０と相互作用し、シャペロンとして働くことが報告されている。

【0015】

本実施形態の検出方法において、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質としては、Ｎｕｂｐ２（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１１９５６）等が挙げられる。Ｎｕｂｐ２タンパク質は、ＮＵＢＰ／ＭＲＰスーパーファミリーのメンバーであり、ＡＴＰ結合型タンパク質である。Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ Ｆｅ−Ｓ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｆａｃｔｏｒとして知られている。

【0016】

本実施形態の検出方法において、核小体タンパク質としては、Ｆｂｌ（ｒＲＮＡ ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｉｎ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７９９１）等が挙げられる。Ｆｂｌタンパク質は、プレリボソーマルＲＮＡ（ｐｒｅ−ｒＲＮＡ）の最初のステップの切り出しに関与しており、核小体に存在している。Ｎ末端部分にグリシン及びアルギニンリッチなドメインを有している。

【0017】

本実施形態の検出方法において、ＷＤリピートファミリータンパク質としては、Ｗｄｆｙ１（ＷＤ ｒｅｐｅａｔ ａｎｄ ＦＹＶＥ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１１１１２７９）等が挙げられる。Ｗｄｆｙ１タンパク質が有するＦＹＶＥドメインは、ＰＩ３Ｐ（ホスファチジルイノシトール３リン酸）を含む膜への輸送を仲介することが知られている。Ｗｄｆｙ１タンパク質はエンドソームに局在するといわれている。

【0018】

細胞中のこれらのタンパク質の活性化状態を検出することにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を検出することができる。本実施形態の方法により、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が進行中であるか否かを検出することもできるし、細胞死が生じた後に当該細胞死がリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路を介していたか否かを判断することもできる。

【0019】

細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル等の細胞が挙げられる。これらの細胞において、活性化状態を検出するタンパク質としては、上述したタンパク質のそれぞれの種におけるホモログを検出すればよい。

【0020】

上記タンパク質の活性化状態の検出は、例えば、上記タンパク質の細胞内の局在状態を測定すること、上記タンパク質のｍＲＮＡレベルでの発現量を測定すること、上記タンパク質のタンパク質レベルでの発現量を測定すること、上記タンパク質のリン酸化率を測定すること及び上記タンパク質の発現抑制による細胞死の抑制を測定することからなる群より選択される少なくとも１つにより行うことができる。

【0021】

細胞内の局在状態は、例えば、対象の細胞を固定し、上記因子に対する蛍光標識抗体で染色し、蛍光顕微鏡で観察することにより、測定することができる。あるいは、対象細胞内で、上記因子と蛍光タンパク質との融合タンパクを発現させ、融合タンパク質の蛍光を蛍光顕微鏡で観察することにより、上記因子の細胞内の局在状態を測定することができる。ここで、蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）等が挙げられる。

【0022】

上記タンパク質の細胞内の局在状態の測定の結果、例えば、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が進行中でない正常細胞と比較して、上記タンパク質の局在状態に変化が認められた場合に、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を検出することができる。

【0023】

上記タンパク質のｍＲＮＡレベルでの発現量は、例えば、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロッティング等により測定することができる。例えば、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が進行中でない正常細胞と比較して、上記タンパク質のｍＲＮＡレベルでの発現量に変化が認められた場合に、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を検出することができる。

【0024】

上記タンパク質のタンパク質レベルでの発現量は、例えば、上記タンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロッティング等により測定することができる。例えば、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が進行中でない正常細胞と比較して、上記タンパク質のタンパク質レベルでの発現量に変化が認められた場合に、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を検出することができる。

【0025】

上記タンパク質のリン酸化率は、例えば、リン酸化した上記因子に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング等により測定することができる。例えば、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が進行中でない正常細胞と比較して、上記タンパク質のリン酸化率に変化が認められた場合に、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を検出することができる。

【0026】

また、上記タンパク質の発現を抑制することにより、細胞死を抑制することができた場合、当該細胞死には、上記タンパク質が関与すると判断することができる。したがって、このような場合には、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を検出することができる。

【0027】

上記タンパク質の発現の抑制は、例えば、上記因子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸等を細胞に導入することにより行うことができる。また、細胞死の抑制の測定は、例えば、上記タンパク質の発現抑制を行った場合と行わなかった場合における細胞の生存率を測定することにより行うことができる。細胞の生存率の測定は、例えば、ＭＴＴアッセイや顕微鏡撮影による生細胞数の変化の計算により行うことができる。

【0028】

ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１〜２３塩基対の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。

【0029】

ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜７０℃で約１〜８時間アニーリングさせることにより調製することができる。

【0030】

ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞に導入し、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターで発現させてもよいし、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。

【0031】

リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となっている。リボザイムは、グループＩイントロン型、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ等の４００ヌクレオチド以上の大きさのものであってもよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等と呼ばれる４０ヌクレオチド程度のものであってもよい。

【0032】

アンチセンス核酸は、標的配列に相補的な核酸である。アンチセンス核酸は、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。

【0033】

本実施形態において、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部がペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成されていてもよい。

【0034】

［リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出用キット］
１実施形態において、本発明は、リン酸化した又はリン酸化していない、プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質に対する抗体；プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡ増幅用プライマー；あるいはプロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸；を備える、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出用キットを提供する。

【0035】

本実施形態のキットにおいて、プロテアソーム関連タンパク質としては、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１、Ｕｂｅ２ａ等が挙げられる。熱ショックタンパク質としては、Ｄｎａｊｃ９等が挙げられる。鉄・硫黄クラスター関連タンパク質としては、Ｎｕｂｐ２等が挙げられる。核小体タンパク質としては、Ｆｂｌ等が挙げられる。ＷＤリピートファミリータンパク質としては、Ｗｄｆｙ１等が挙げられる。

【0036】

リン酸化した又はリン酸化していない上記タンパク質に対する抗体は、上記タンパク質の細胞内の局在状態の測定、上記タンパク質のタンパク質レベルでの発現量の測定、上記タンパク質のリン酸化率の測定等に好適である。

【0037】

上記タンパク質のｍＲＮＡ増幅用プライマーは、上記タンパク質のｍＲＮＡレベルでの発現量の測定等に好適である。

【0038】

上記タンパク質に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸は、上記タンパク質の発現の抑制に好適である。

【0039】

本実施形態のキットを用いることにより、対象とする細胞におけるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を簡便に検出することができる。

【0040】

［リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤］
１実施形態において、本発明は、プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤を提供する。

【0041】

後述するように、発明者らは、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に、プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質が関与することを明らかにした。

【0042】

したがって、プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質の発現抑制剤は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤として使用することができる。

【0043】

本実施形態の抑制剤において、プロテアソーム関連タンパク質としては、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１、Ｕｂｅ２ａ等が挙げられる。熱ショックタンパク質としては、Ｄｎａｊｃ９等が挙げられる。鉄・硫黄クラスター関連タンパク質としては、Ｎｕｂｐ２等が挙げられる。核小体タンパク質としては、Ｆｂｌ等が挙げられる。ＷＤリピートファミリータンパク質としては、Ｗｄｆｙ１等が挙げられる。

【0044】

本実施形態の抑制剤において、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質の発現を抑制することができるものであれば特に制限されない。

【0045】

本実施形態の抑制剤において、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の投与量は、培養細胞の培地に添加する場合には、例えば、５０ｎＭ〜１０μＭが好ましく、例えば、５０〜２００ｎＭが好ましい。また、動物に投与する場合には、例えば１回あたり５０〜５００ｍｇ／ｋｇ体重を１日１回投与することが好ましい。

【0046】

本実施形態の抑制剤において、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、それ自体を投与してもよいし、適宜の薬理学的に許容される添加剤と混合した医薬組成物として製剤化したものを投与してもよい。

【0047】

（医薬組成物）
医薬組成物の剤型としては、例えば注射剤が挙げられる。医薬組成物は、カチオン性脂質等のビヒクル、安定剤、酸化防止剤、防腐剤等の添加剤等を含有していてもよい。また、医薬組成物は、例えば、凍結乾燥等により溶媒を除去した粉末状態であってもよく、液体状態であってもよい。医薬組成物が粉末状態である場合には、使用前に薬学的に許容される媒体に懸濁又は溶解させて注射剤として用いることができる。医薬組成物が液体状態である場合には、そのままで又は薬学的に許容される媒体に懸濁又は溶解させて注射剤として用いることができる。

【0048】

薬学的に許容される媒体としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、その他の補助薬、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムを含む等張液が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。

【0049】

組成物の患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等により行うことができる。組成物の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。

【0050】

本実施形態の抑制剤による治療効果が期待される好適な例として、心不全、不整脈性突然死等が挙げられる。

【0051】

［リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤］
１実施形態において、本発明は、プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤を提供する。

【0052】

別の実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療のための、プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を提供する。

【0053】

別の実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤の製造のためのプロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の使用を提供する。

【0054】

別の実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤の製造のためのプロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療方法を提供する。

【0055】

後述するように、発明者らは、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に、プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質が関与することを明らかにした。したがって、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤の製造のためのプロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質及びＷＤリピートファミリータンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤として使用することができる。

【0056】

本実施形態の予防又は治療剤において、プロテアソーム関連タンパク質としては、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１、Ｕｂｅ２ａ等が挙げられる。熱ショックタンパク質としては、Ｄｎａｊｃ９等が挙げられる。鉄・硫黄クラスター関連タンパク質としては、Ｎｕｂｐ２等が挙げられる。核小体タンパク質としては、Ｆｂｌ等が挙げられる。ＷＤリピートファミリータンパク質としては、Ｗｄｆｙ１等が挙げられる。

【0057】

プロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、鉄・硫黄クラスター関連タンパク質、核小体タンパク質又はＷＤリピートファミリータンパク質に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、それ自体を投与してもよいし、適宜の薬理学的に許容される添加剤と混合した医薬組成物として製剤化したものを投与してもよい。医薬組成物の好ましい形態は、上述したものと同様である。

【0058】

上述した、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患としては、例えば心不全、不整脈性突然死等が挙げられる。

【実施例】

【0059】

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0060】

［実験例１］
（タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の樹立）
ＰＨＧＰｘ欠損細胞死のメカニズムを明らかにするために、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株を樹立した。この細胞は、タモキシフェンを培地に加えると２４時間以内にＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムによりＰＨＧＰｘゲノム遺伝子が欠失する。

【0061】

具体的には、ＰＨＧＰｘ遺伝子ノックアウトマウス（ＰＨＧＰｘ^−／−）に、ｌｏｘＰ配列に挟まれたＰＨＧＰｘ遺伝子（ｌｏｘＰ−ＰＨＧＰｘ）を遺伝子導入（Ｔｇ）した、Ｔｇ（ｌｏｘＰ−ＰＨＧＰｘ）：ＰＨＧＰｘ^−／−マウスと、ＰＨＧＰｘ^＋／−マウスを交配させた。続いて、遺伝子型がＴｇ（ｌｏｘＰ−ＰＨＧＰｘ）：ＰＨＧＰｘ^−／−である１３．５日胚から、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）を調製した。続いて、得られた細胞にＳＶ４０ウイルスのＴ抗原遺伝子を遺伝子導入することにより不死化した。続いて、得られた細胞にタモキシフェン誘導型ＣｒｅＥＲＴ２遺伝子を導入した。これにより、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株が得られた。

【0062】

なお、ＣｒｅＥＲＴ２とは、エストロゲン受容体と融合タンパク質にしたＣｒｅ（ＣｒｅＥＲ）を、エストロゲンに反応せず、タモキシフェンに反応するように変異させたものである。タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地にタモキシフェンを添加すると、ＣｒｅＥＲ２のエストロゲン受容体部分にタモキシフェンが結合し、エストロゲン受容体の核移行シグナルが露出する。その結果、ＣｒｅＥＲ２が核内へ移行し、ｌｏｘＰで挟まれたＰＨＧＰｘゲノム遺伝子が破壊される。添加するタモキシフェンの濃度は終濃度１μＭ程度でよい。

【0063】

［実験例２］
（タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株へのタモキシフェンの投与）
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。続いて、タモキシフェン添加から０、２４及び４８時間後の細胞を回収し、抗ＰＨＧＰｘ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、各細胞サンプル中のＰＨＧＰｘタンパク質の量を測定した。

【0064】

図２は、ＰＨＧＰｘタンパク質を検出するウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、タモキシフェン投与から２４時間以内にＰＨＧＰｘタンパク質の発現量が減少することが確認された。

【0065】

［実験例３］
（ＰＨＧＰｘ欠損細胞におけるリン脂質ヒドロペルオキシドの検出）
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加し、生成されるリン脂質ヒドロペルオキシドを検出した。検出には、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）／質量分析（ＭＳ）を用いた。

【0066】

液体クロマトグラフィーには、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ装置（ウォーターズ社）を用い、質量分析には、四重極リニアイオントラップ質量分析システム（商品名４０００ Ｑ−ＴＲＡＰ、エービー・サイエックス社）を用いた。液体クロマトグラフィーのカラムには、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（商標）ＢＥＨ Ｃ１８カラム（０．１７μｍ、１５０ｍｍ×１．０ｍｍ）を使用した。

【0067】

タモキシフェン添加から、０、１２、２４、３６及び４８時間後の各細胞から抽出した全リン脂質画分のサンプルをオートサンプラーに供し、移動相Ａ（アセトニトリル／メタノール／水＝２：２：１（ｖ／ｖ）、０．１％ほう酸、０．０２８％アンモニア）：移動相Ｂ（イソプロパノール、０．１％ほう酸、０．０２８％アンモニア）の１００：０（０〜５分）、５０：５０（５〜２５分）、５０：５０（２５〜４９分）、１００：０（５９〜６０分）及び１００：０（６０〜７５分）のステップグラジエント、流量７０μＬ／分、カラム温度３０℃の条件で分離した。

【0068】

ＭＳ／ＭＳ解析は、ＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）の手法を用いてネガティブイオンモードで実施した。イオンスプレー電圧は、−４５００Ｖに設定した。窒素ガスを障壁ガス及びコリジョンガスとして使用した。酸化リン脂質の検出において、コリジョンエネルギーは２０−６５ｅＶに設定した。装置のスキャンレンジは、ｍ／ｚ ５０〜９５０、スキャンスピード１０００Ｔｈ／秒に設定した。Ｑ０トラッピングをオンにし、リニアイオントラップフィルタイムを１０ミリ秒に設定した。デクラスタリングポテンシャルを−１０５Ｖに設定した。Ｑ１の解像度を「ユニット」に設定した。ホスファチジルコリンヒドロペルオキシド（１８：０：２０：４由来）の特徴的なフラグメンテーションパターンは、ドウェル タイム５０ミリ秒、デクラスタリングポテンシャルを−８０Ｖに設定した。Ｑ１及びＯ３の解像度はユニットに設定し、Ｑ１は８８６ｍ／ｚ、Ｏ３は２８３ｍ／ｚ（コリジョンエネルギー−６０ｅＶ）及び３３５ｍ／ｚ（コリジョンエネルギー−４５ｅＶ）に設定した。

【0069】

図３は、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加後、０、１２、２４、３６及び４８時間後の細胞内で、１８：０（ステアリン酸）、２０：４（アラキドン酸）をもつホスファチジルコリン（ＰＣ）から酸化により生成した酸化一次生成物であるリン脂質ヒドロペルオキシド（ＰＣＯＯＨ）の生成量を経時的に示したグラフである。タモキシフェンの添加から２４時間後をピークに、アラキドン酸を含むリン脂質の酸化一次生成物であるリン脂質ヒドロペルオキシドが生成された。ＤＨＡを含むリン脂質の酸化一次生成物であるリン脂質ヒドロペルオキシドでも同様な結果が得られている（図なし）。

【0070】

［実験例４］
（ＰＨＧＰｘ欠損細胞のＭＴＴアッセイ）
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加し、ＭＴＴアッセイにより、細胞の生存率を測定した。また、タモキシフェンと同時に終濃度２００μＭのビタミンＥ添加群についても同様の検討を行った。

【0071】

より具体的には、タモキシフェンの添加から２４、４８及び７２時間後の細胞の培地にＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄ）を添加し、４時間後に各細胞をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。

【0072】

図４は、ＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。タモキシフェン添加から４８時間後から７２時間の間に細胞死が起こることが明らかとなった。また、ビタミンＥの添加により細胞死が完全に抑制されることが明らかとなった。

【0073】

［実験例５］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死とアポトーシスとの比較）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死（ＰＨＧＰｘ欠損による細胞死）が、アポトーシスによる細胞死経路を介しているのか否かについて詳細に検討した。

【0074】

タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に、カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫを終濃度５０μＭ、ミトコンドリアタンパク質であるアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）の放出阻害剤であるＤＨＩＱを終濃度３００μＭ、ビタミンＥ誘導体であるトロロックスを終濃度４００μＭ添加したもの、及び、対照として何も添加していない細胞を用意した。各細胞に終濃度１μＭのタモキシフェンを同時に添加した。タモキシフェン、阻害剤添加３日後にＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。対物レンズにＰｌａｎ Ｆｌｏｕｒ ＥＬＷＤ２０ｘ０．４５（Ｎｉｃｏｎ）を用いて１０倍で観察した（一視野 ８７７．５μｍ×６６１．２μｍ）。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加せずに、３日培養した時の細胞数を１００％として表した。

【0075】

結果を図５（ａ）に示す。カスパーゼ阻害剤、ＡＩＦ系の阻害剤では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制することができなかった。一方ビタミンＥ誘導体であるトロロックスは細胞死を抑制することができた。

【0076】

次に、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地にアポトーシス誘導試薬であるスタウロスポリンを終濃度０．５μＭで添加したものと、タモキシフェンを終濃度１μＭで添加したものを用意した。５時間後、２４時間後、４８時間後に、各細胞を、蛍光免疫染色し、シトクロムＣ及び活性化カスパーゼ３を染色した。また、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）法によりアポトーシスの特徴であるＤＮＡの断片化を検出した。

【0077】

結果を図５（ｂ）に示す。スタウロスポリン処理では、５時間後にシトクロムＣの放出が観察され、カスパーゼ３が活性化し、２４時間後にはＴＵＮＥＬ陽性の細胞死（アポトーシス）が観察された。一方、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死では、シトクロムＣの放出やカスパーゼ３の活性化は観察されなかった（図では４８時間後を示したが、６０時間後でも観察されなかった）。ＴＵＮＥＬ染色のみ、核内にドット状の染色が観察されたが、ＤＮＡラダーは検出されなかった。

【0078】

以上のことから、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死は、典型的なアポトーシスとは異なることが明らかとなった。

【0079】

［実験例６］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死とネクローシスとの比較）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が、ネクローシスによるものか否かについて詳細に検討した。

【0080】

タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地にタモキシフェンを終濃度１μＭで添加し、細胞死の瞬間をタイムラプス解析で検討した。しかしながら、細胞死の瞬間にネクローシスの特徴である細胞の膨潤は観察されなかった。細胞死の直前に細胞が形を変形し、最後はシャーレよりはがれて突然致死となった（図示せず。）。

【0081】

続いて、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に、ネクローシス誘導剤であるｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドを終濃度３００ｍＭで添加したものと、タモキシフェンを終濃度１μＭで添加したものを用意した。３０分後（ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド添加群）及び４８時間後（タモキシフェン添加群）に、各細胞を、蛍光免疫染色し、ネクローシスの特徴であるＨＭＧＢ１（Ｈｉｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ Ｂｏｘ１）タンパク質の細胞質への放出を観察した。また、核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。

【0082】

図６（ａ）は、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド添加３０分後の結果を示す写真であり、図６（ｂ）は、タモキシフェン添加４８時間後の結果を示す写真である。その結果、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド添加による細胞死では、ネクローシスの指標であるＨＭＧＢ１の核から細胞質への放出が観察されたのに対し、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死では、ＨＭＧＢ１は核にとどまっており細胞質への放出が認められなかった。

【0083】

以上のことから、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死は、ネクローシスとは異なることが明らかとなった。

【0084】

［実験例７］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死とオートファジー性細胞死との比較）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が、オートファジー性細胞死によるものか否かについて詳細に検討した。オートファジー性細胞死を起こすためにはＡＴＧ５遺伝子が必須であることが知られている。

【0085】

タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、ＡＴＧ５特異的ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）を導入し、ＡＴＧ５の発現をノックダウンした細胞を用意した。ＡＴＧ５特異的ｓｈＲＮＡとしては、ＡＴＧ５ ｓｈＲＮＡ−３（配列番号１）及びＡＴＧ５ ｓｈＲＮＡ−４（配列番号２）の２種類のｓｈＲＮＡを使用した。また、対照として、ｓｈＲＮＡ発現ベクターのみを導入した細胞を用意した。これらの細胞の培地に、タモキシフェンを終濃度１μＭで添加し、２４、３６、４８、６０及び７２時間後の細胞を、Ｋｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、それぞれの時間の生細胞数の割合の変化を細胞生存率（％）として表した。

【0086】

結果を図７（ａ）及び図７（ｂ）に示す。ＡＴＧ５の発現をノックダウンしても、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制することはできなかった。また、図７（ｂ）に示すように、ＲＴ−ＰＣＲの結果から、ｓｈＲＮＡの導入により、ＡＴＧ５遺伝子の発現がノックダウンされたことが確認された。

【0087】

以上のことから、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死は、オートファジー性細胞死とは異なることが明らかとなった。

【0088】

［実験例８］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死とネクトローシスとの比較）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が、ネクトローシスによるものか否かについて詳細に検討した。ネクトローシスは、プログラムされたネクローシスとして知られる細胞死の１形態である。また、ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ １（Ｒｉｐ１）のノックダウンにより、ネクトローシスが顕著に抑制されることが知られている。

【0089】

タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、Ｒｉｐ１特異的ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）を導入し、Ｒｉｐ１の発現をノックダウンした細胞を用意した。Ｒｉｐ１特異的ｓｈＲＮＡとしては、Ｒｉｐ１ ｓｈＲＮＡ−４（配列番号３）を使用した。また、対照として、ｓｈＲＮＡ発現ベクターのみを導入した細胞、及び培地中に終濃度４００μＭでトロロックスを添加した細胞を用意した。これらの細胞の培地に、タモキシフェンを終濃度１μＭで添加し、２４時間後、７２時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、７２時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として表した。

【0090】

結果を図８（ａ）及び図８（ｂ）に示す。Ｒｉｐ１の発現をノックダウンしても、ＰＨＧＰｘ欠損による細胞死を抑制することはできなかった。また、図８（ｂ）に示すように、ウエスタンブロッティングの結果から、ｓｈＲＮＡの導入により、Ｒｉｐ１タンパク質の発現がノックダウンされたことが確認された。

【0091】

以上のことから、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死は、ネクトローシスとは異なることが明らかとなった。すなわち、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死は、アポトーシス、ネクローシス、オートファジー性細胞死、ネクトローシスとは異なる新規の細胞死であることが明らかとなった。

【0092】

図９に、発明者らの解析により明らかとなった、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路のモデル図を示す。ＰＨＧＰｘが欠損すると、２４時間後をピークとしてリン脂質の酸化一次生成物であるリン脂質ヒドロペルオキシドが上昇する。その下流でＣＤＫ４が活性化し、３６時間後以降にＭＡＰキナーゼ経路のＭＥＫ、ＥＲＫがリン酸化され、４８時間後から７２時間の間で細胞死を引き起こす。

【0093】

発明者らは更に、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株を利用した検討の結果、ビタミンＥ、ＣＤＫ４阻害剤である３−ＡＴＡ（３−アミノ−９−チオ［１０Ｈ］−アクリドン）又はＭＥＫ阻害剤であるＵ−０１２６（１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス［２−アミノ−フェニルチオ］ブタジエン）を培地中に添加することにより、ＰＨＧＰｘの欠損により誘導されるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制できることを見出した。

【0094】

［実験例９］
（レンチウイルスｓｈＲＮＡライブラリーを用いた、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子の同定）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子を同定するために、レンチウイルス網羅的ｓｈＲＮＡライブラリー（ＳＢＩ社）を用いたスクリーニングを行った。このシステムでは、ｓｈＲＮＡの配列が、Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（商品名、アフィメトリクス社）に結合するように作成されているため、ｓｈＲＮＡの配列の同定にＧｅｎｅｃｈｉｐを利用することができる。

【0095】

図１０は、ｓｈＲＮＡライブラリーのスクリーニング手順の概要を示す図である。まず、網羅的ｓｈＲＮＡを発現することができるプール型のレンチウイルスを、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞に感染させ、ｓｈＲＮＡ発現細胞を作製した。このｓｈＲＮＡ発現細胞の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加し、通常であれば完全に細胞死が起きる９６時間後に生き残っていた細胞を回収した。回収した細胞からＲＮＡを抽出し、細胞に導入されていたｓｈＲＮＡ配列を含むｃＤＮＡを数回増幅し、Ｇｅｎｅｃｈｉｐのプローブを作成し、マイクロアレイ解析を行った。

【0096】

２回の実験により、２つに分けたレンチウイルス感染細胞をタモキシフェン添加後９６時間後にも生存していた細胞と、タモキシフェン未添加状態で９６時間後に生存している全ての細胞に含まれるｓｈＲＮＡ配列を増幅したプローブを用いてＧｅｎｅｃｈｉｐ解析を行い、タモキシフェン添加細胞で未添加細胞よりも濃縮されたプローブを検出した。２回の実験で濃縮された共通の細胞死実行因子の同定を試みた結果、細胞死実行因子の候補として１５１個の遺伝子を得た。

【0097】

［実験例１０］
（レトロウイルス感染系を用いた単独ｓｈＲＮＡの発現による、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子の候補遺伝子の確定）
同定されたリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子の候補遺伝子１５１遺伝子それぞれをノックダウンし、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制効果を検討した。

【0098】

タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞に、候補遺伝子のｓｈＲＮＡ発現ベクターを、レトロウイルス感染系を用いて１種類ずつ導入し、各候補遺伝子をノックダウンした細胞を作製した。各細胞の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加し、９６時間後の細胞死の抑制効果を測定した。具体的には、タモキシフェンの添加から２４時間後、９６時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、９６時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として計算した。

【0099】

図１１は、１５１個の候補遺伝子について、タモキシフェンの添加から２４時間後の細胞数に対する、タモキシフェンの添加から９６時間後の細胞数の割合（細胞生存率（％））が高い順に並べた結果を示すグラフである。

【0100】

リアルタイムＰＣＲにより目的遺伝子の発現抑制を確認でき、ノックダウンすることによりリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制できる遺伝子を３７個見出した。これらの３７個の遺伝子には、アポトーシス等の既知の細胞死に関与する遺伝子は全く含まれていなかった。この結果は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が新規の細胞死であることを更に支持するものである。以下、これらの候補遺伝子の中から、プロテアソーム関連タンパク質である、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１及びＵｂｅ２ａ；熱ショックタンパク質であるＤｎａｊｃ９；鉄・硫黄クラスター関連タンパク質であるＮｕｂｐ２；核小体タンパク質であるＦｂｌ；ＷＤリピートファミリータンパク質であるＷｄｆｙ１について、詳細に検討した。

【0101】

［実験例１１］
（Ｒｂｘ１タンパク質は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子である）
レトロウイルスでｓｈＲＮＡを発現させることにより、Ｒｂｘ１のノックダウン細胞を作成し、Ｒｂｘ１タンパク質がリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子であるか否かについて検討した。

【0102】

図１２は、検討結果を示すグラフである。まず、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、Ｒｂｘ１特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号４）を導入し、Ｒｂｘ１をノックダウンした細胞を用意した（Ｒｂｘ１ ＫＤ）。対照として、ベクターのみを導入した細胞を用意した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。更に、これらの細胞にＲｂｘ１発現ベクター（Ｒｂｘ１）又は対照としてベクターのみ（ｍｏｃｋ）を導入した。なお、Ｒｂｘ１発現ベクターに組み込んだＲｂｘ１のｃＤＮＡには、Ｒｂｘ１特異的ｓｈＲＮＡによりノックダウンされないようサイレント変異を導入したものを用いた。

【0103】

続いて、各細胞に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。タモキシフェンの添加から２４時間後、９６時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、９６時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として計算した。

【0104】

その結果、Ｒｂｘ１のノックダウン細胞（Ｒｂｘ１ ＫＤ／ｍｏｃｋ）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制された。また、Ｒｂｘ１をノックダウンしたうえで、Ｒｂｘ１遺伝子を再導入した細胞（Ｒｂｘ１ ＫＤ／Ｒｂｘ１）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が回復した。

【0105】

以上の結果から、Ｒｂｘ１タンパク質は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子であることが明らかとなった。

【0106】

ここで、Ｒｂｘ１のノックダウン及び再導入（再発現）についてより詳細に説明する。Ｒｂｘ１のノックダウンは次のようにして行った。まず、図１３（ａ）に示す、ｓｈＲＮＡベクター（ｐｉＭＧ−ｄｒＵ６）のＵ６プロモーターの下流にＲｂｘ１特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号４）をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ。続いて、レトロウイルス感染系を利用して上記ｓｈＲＮＡの発現カセットを対象細胞のゲノムに組み込み、Ｒｂｘ１特異的ｓｈＲＮＡを発現させ、Ｒｂｘ１をノックダウンした細胞を得た。

【0107】

図１３（ｂ）は、発現したｓｈＲＮＡからｓｉＲＮＡが形成され、標的ＲＮＡが破壊される過程を示すモデル図である。ｓｈＲＮＡベクターは、東京大学医学部 廣瀬謙三先生、名古屋大学医学部 菅生厚太郎先生より頂いた。上述した実験例７、８で使用したＡＴＧ５及びＲｉｐ１のノックダウン細胞、並びに後述するＲｂｘ１以外の遺伝子をノックダウンした細胞も同様の方法により作製した。

【0108】

（Ｒｂｘ１の再発現）
再発現実験に用いたレトロウイルス感染系の高発現ベクターとしては、図１４に示すｐＭＸｓ−ＩＲベクターを用いた。ｐＭＸｓ−ＩＲベクターは、東京大学医科学研究所 北村俊雄先生に頂いた。後述する、Ｒｂｘ１以外の遺伝子の発現も同様の方法により行った。

【0109】

（ＰｌａｔＥ細胞への遺伝子導入）
ｓｈＲＮＡベクター及びｐＭＸｓ−ＩＲベクターからのレトロウイルスの調製には、ＰｌａｔＥ細胞を使用した。ＰｌａｔＥ細胞とは、ヒト胎児由来腎臓上皮細胞である２９３Ｔ細胞に、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子が組み込まれた細胞である。

【0110】

ＰｌａｔＥ細胞は、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン（ＧＩＢＣＯ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン（ＧＩＢＣＯ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、日水製薬）を用いて、３７℃にてＣＯ_２インキュベーターで培養した。

【0111】

ＰｌａｔＥ細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／シャーレで６ｃｍシャーレ（ＣＯＲＮＩＮＧ）にまき、１日培養した。１．５ｍＬチューブにＤＭＥＭ ＦＣＳ（−）を２００μＬ、生成したプラスミドＤＮＡ（目的遺伝子を組み込んだｓｈＲＮＡベクター又はｐＭＸｓ−ＩＲベクター）を２μｇ／２μＬ、Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号１１５１４−０１５）８μＬを加え、１５分間室温放置した。次に、ＤＭＥＭ ＦＣＳ（−）５０μＬとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号１８３２４−０２０）１２μＬをあらかじめ混ぜておいたものを上記の反応液に加え、１５分室温放置した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、ＤＭＥＭ ＦＣＳ（−）を１．７２８ｍＬ加えた。続いて、上記の反応液を細胞に添加し、３７℃にて３時間ＣＯ_２インキュベーター中に放置し、遺伝子導入を行った。その後、ＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ ６ｍＬで反応液を置き換えて、３７℃にて約４８時間培養した。

【0112】

（ウイルス液の調製）
続いて、培養上清を１５ｍＬチューブ（ＣＯＲＮＩＮＧ）に移し、３，０００ｒｐｍ、５分、４℃の条件で遠心した。上清を新しいチューブに移し、ウイルス液とした。

【0113】

（ウイルスの感染）
ウイルス感染させる前日にタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損細胞を６ｃｍ シャーレ（ＣＯＲＮＩＮＧ）に１×１０^５ｃｅｌｌｓ／シャーレでまき、１日培養した。最終濃度が８μｇ／ｍＬになるようにＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（商標）（Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｈ９２６８）を加えたウイルス液５ｍＬを、細胞の培地を置き換えることにより感染させ、２４時間培養後に培地を交換した。なお、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（商標）は、クリーンベンチ内において、滅菌水で１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解してフィルター滅菌し、使用時に希釈して用いた。

【0114】

［実験例１２］
（Ｕｂｅ２ｄ１タンパク質は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子である）
実験例１１と同様の手法により、Ｕｂｅ２ｄ１タンパク質がリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子であるか否かについて検討した。

【0115】

図１５は、検討結果を示すグラフである。まず、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、Ｕｂｅ２ｄ１特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号５）を導入し、Ｕｂｅ２ｄ１をノックダウンした細胞を用意した（Ｕｂｅ２ｄ１ ＫＤ）。対照として、ベクターのみを導入した細胞を用意した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。更に、これらの細胞にＵｂｅ２ｄ１発現ベクター（Ｕｂｅ２ｄ１）又は対照としてベクターのみ（ｍｏｃｋ）を導入した。なお、Ｕｂｅ２ｄ１発現ベクターに組み込んだＵｂｅ２ｄ１のｃＤＮＡには、Ｕｂｅ２ｄ１特異的ｓｈＲＮＡによりノックダウンされないようサイレント変異を導入したものを用いた。

【0116】

続いて、各細胞に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。タモキシフェンの添加から２４時間後、９６時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、９６時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として計算した。

【0117】

その結果、Ｕｂｅ２ｄ１のノックダウン細胞（Ｕｂｅ２ｄ１ ＫＤ／ｍｏｃｋ）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制された。また、Ｕｂｅ２ｄ１をノックダウンしたうえで、Ｕｂｅ２ｄ１遺伝子を再導入した細胞（Ｕｂｅ２ｄ１ ＫＤ／Ｕｂｅ２ｄ１）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が回復した。

【0118】

以上の結果から、Ｕｂｅ２ｄ１タンパク質は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子であることが明らかとなった。

【0119】

［実験例１３］
（Ｕｂｅ２ａタンパク質は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子である）
実験例１１と同様の手法により、Ｕｂｅ２ａタンパク質がリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子であるか否かについて検討した。

【0120】

図１６は、検討結果を示すグラフである。まず、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、Ｕｂｅ２ａ特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号６）を導入し、Ｕｂｅ２ａをノックダウンした細胞を用意した（Ｕｂｅ２ａ ＫＤ）。対照として、ベクターのみを導入した細胞を用意した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。

【0121】

続いて、各細胞に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。タモキシフェンの添加から２４時間後、９６時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、９６時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として計算した。

【0122】

その結果、Ｕｂｅ２ａのノックダウン細胞（Ｕｂｅ２ａ ＫＤ）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制された。

【0123】

続いて、Ｕｂｅ２ａをノックダウンしたうえで、Ｕｂｅ２ａ遺伝子を細胞に再導入した。なお、Ｕｂｅ２ａ発現ベクターに組み込んだＵｂｅ２ａのｃＤＮＡには、Ｕｂｅ２ａ特異的ｓｈＲＮＡによりノックダウンされないようサイレント変異を導入したものを用いた。その結果、細胞の培地にタモキシフェンを添加していないにもかかわらず、Ｕｂｅ２ａ遺伝子を細胞に再導入しただけで細胞死が誘導された。

【0124】

Ｕｂｅ２ａ遺伝子の再導入により細胞死が誘導される理由は明らかではないが、以上の結果から、Ｕｂｅ２ａタンパク質は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子であることが明らかとなった。

【0125】

［実験例１４］
（Ｄｎａｊｃ９タンパク質は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子である）
実験例１１と同様の手法により、Ｄｎａｊｃ９タンパク質がリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子であるか否かについて検討した。

【0126】

図１７は、検討結果を示すグラフである。まず、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、Ｄｎａｊｃ９特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号７）を導入し、Ｄｎａｊｃ９をノックダウンした細胞を用意した（Ｄｎａｊｃ９ ＫＤ）。対照として、ベクターのみを導入した細胞を用意した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。更に、これらの細胞にＤｎａｊｃ９発現ベクター（Ｄｎａｊｃ９）又は対照としてベクターのみ（ｍｏｃｋ）を導入した。なお、Ｄｎａｊｃ９発現ベクターに組み込んだＤｎａｊｃ９のｃＤＮＡには、Ｄｎａｊｃ９特異的ｓｈＲＮＡによりノックダウンされないようサイレント変異を導入したものを用いた。

【0127】

続いて、各細胞に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。タモキシフェンの添加から２４時間後、９６時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、９６時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として計算した。

【0128】

その結果、Ｄｎａｊｃ９のノックダウン細胞（Ｄｎａｊｃ９ ＫＤ／ｍｏｃｋ）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制された。また、Ｄｎａｊｃ９をノックダウンしたうえで、Ｄｎａｊｃ９遺伝子を再導入した細胞（Ｄｎａｊｃ９ ＫＤ／Ｄｎａｊｃ９）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が回復した。

【0129】

以上の結果から、Ｄｎａｊｃ９タンパク質は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子であることが明らかとなった。

【0130】

［実験例１５］
（Ｎｕｂｐ２タンパク質は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子である）
実験例１１と同様の手法により、Ｎｕｂｐ２タンパク質がリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子であるか否かについて検討した。

【0131】

図１８は、検討結果を示すグラフである。まず、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、Ｎｕｂｐ２特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号８）を導入し、Ｎｕｂｐ２をノックダウンした細胞を用意した（Ｎｕｂｐ２ ＫＤ）。対照として、ベクターのみを導入した細胞を用意した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。

【0132】

続いて、各細胞に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。タモキシフェンの添加から２４時間後、９６時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、９６時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として計算した。

【0133】

その結果、Ｎｕｂｐ２のノックダウン細胞（Ｎｕｂｐ２ ＫＤ）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制された。

【0134】

続いて、Ｎｕｂｐ２をノックダウンしたうえで、Ｎｕｂｐ２遺伝子を細胞に再導入した。なお、Ｎｕｂｐ２発現ベクターに組み込んだＮｕｂｐ２のｃＤＮＡには、Ｎｕｂｐ２特異的ｓｈＲＮＡによりノックダウンされないようサイレント変異を導入したものを用いた。その結果、細胞の培地にタモキシフェンを添加していないにもかかわらず、Ｎｕｂｐ２遺伝子を細胞に再導入しただけで細胞死が誘導された。

【0135】

Ｎｕｂｐ２遺伝子の再導入により細胞死が誘導される理由は明らかではないが、以上の結果から、Ｎｕｂｐ２タンパク質は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子であることが明らかとなった。

【0136】

［実験例１６］
（Ｆｂｌタンパク質は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子である）
実験例１１と同様の手法により、Ｆｂｌタンパク質がリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子であるか否かについて検討した。

【0137】

図１９は、検討結果を示すグラフである。まず、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、Ｆｂｌ特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号９）を導入し、Ｆｂｌをノックダウンした細胞を用意した（Ｆｂｌ ＫＤ）。対照として、ベクターのみを導入した細胞を用意した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。

【0138】

続いて、各細胞に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。タモキシフェンの添加から２４時間後、９６時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、９６時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として計算した。

【0139】

その結果、Ｆｂｌのノックダウン細胞（Ｆｂｌ ＫＤ）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制された。

【0140】

続いて、Ｆｂｌをノックダウンしたうえで、Ｆｂｌ遺伝子を細胞に再導入した。なお、Ｆｂｌ発現ベクターに組み込んだＦｂｌのｃＤＮＡには、Ｆｂｌ特異的ｓｈＲＮＡによりノックダウンされないようサイレント変異を導入したものを用いた。その結果、細胞の培地にタモキシフェンを添加していないにもかかわらず、Ｆｂｌ遺伝子を細胞に再導入しただけで細胞死が誘導された。

【0141】

Ｆｂｌ遺伝子の再導入により細胞死が誘導される理由は明らかではないが、以上の結果から、Ｆｂｌタンパク質は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子であることが明らかとなった。

【0142】

［実験例１７］
（Ｗｄｆｙ１タンパク質は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子である）
実験例１１と同様の手法により、Ｗｄｆｙ１タンパク質がリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子であるか否かについて検討した。

【0143】

図２０は、検討結果を示すグラフである。まず、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、Ｗｄｆｙ１特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号１０）を導入し、Ｗｄｆｙ１をノックダウンした細胞を用意した（Ｗｄｆｙ１ ＫＤ）。対照として、ベクターのみを導入した細胞を用意した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。

【0144】

続いて、各細胞に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。タモキシフェンの添加から２４時間後、９６時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、９６時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として計算した。

【0145】

その結果、Ｗｄｆｙ１のノックダウン細胞（Ｗｄｆｙ１ ＫＤ）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制された。

【0146】

続いて、Ｗｄｆｙ１をノックダウンしたうえで、Ｗｄｆｙ１遺伝子を細胞に再導入した。なお、Ｗｄｆｙ１発現ベクターに組み込んだＷｄｆｙ１のｃＤＮＡには、Ｗｄｆｙ１特異的ｓｈＲＮＡによりノックダウンされないようサイレント変異を導入したものを用いた。その結果、細胞の培地にタモキシフェンを添加していないにもかかわらず、Ｗｄｆｙ１遺伝子を細胞に再導入しただけで細胞死が誘導された。

【0147】

Ｗｄｆｙ１遺伝子の再導入により細胞死が誘導される理由は明らかではないが、以上の結果から、Ｗｄｆｙ１タンパク質は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の関連因子であることが明らかとなった。

【0148】

［実験例１８］
（リン脂質ヒドロペルオキシドの生成の検討）
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株において、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１、Ｕｂｅ２ａ、Ｄｎａｊｃ９、Ｎｕｂｐ２、Ｆｂｌ及びＷｄｆｙ１をそれぞれノックダウンし、培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した場合のＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成について検討した。

【0149】

まず、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１、Ｕｂｅ２ａ、Ｄｎａｊｃ９、Ｎｕｂｐ２、Ｆｂｌ、Ｗｄｆｙ１をそれぞれノックダウンしたタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞、及び対照としてのタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞を用意した。

【0150】

続いて、これらの細胞の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加し、２６時間インキュベート後、リン脂質ヒドロペルオキシドの生成を検出できる蛍光色素であるＨ２ＤＣＦＤＡで染色し、フローサイトメトリーを用いてリン脂質ヒドロペルオキシドの生成について検討した。

【0151】

結果を表１に示す。表１では、ノックダウンによりＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成が抑制された場合を「○」、ＰＨＧＰｘ欠損によりリン脂質ヒドロペルオキシドが生成された場合を「×」と示す。

【0152】

その結果、Ｕｂｅ２ａのノックダウン細胞及びＮｕｂｐ２のノックダウン細胞において、ＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成が抑制されていることが明らかとなった。これら以外のノックダウン細胞においては、ＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成が認められた。

【0153】

［実験例１９］
（ＥＲＫのリン酸化の検討）
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、終濃度１μＭのタモキシフェンを添加し、抗リン酸化ＥＲＫ抗体で蛍光染色すると、タモキシフェンの添加から３６時間後以降では、ＥＲＫのリン酸化が亢進した細胞を検出することができる。

【0154】

そこで、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株において、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１、Ｕｂｅ２ａ、Ｄｎａｊｃ９、Ｎｕｂｐ２、Ｆｂｌ及びＷｄｆｙ１をそれぞれノックダウンし、培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した場合のＥＲＫのリン酸化の亢進を検討した。

【0155】

まず、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１、Ｕｂｅ２ａ、Ｄｎａｊｃ９、Ｎｕｂｐ２、Ｆｂｌ、Ｗｄｆｙ１をそれぞれノックダウンしたタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞、及び対照としてのタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞を用意した。

【0156】

続いて、各細胞の培地に、終濃度１μＭのタモキシフェンを添加、未添加細胞を準備し、３６時間後に抗リン酸化ＥＲＫ抗体で蛍光染色した。続いて、蛍光顕微鏡観察により、ＥＲＫのリン酸化について検討した。

【0157】

結果を表１に示す。表１では、ノックダウンによりＰＨＧＰｘ欠損によるＥＲＫのリン酸化が抑制された場合を「○」、ＰＨＧＰｘ欠損によりＥＲＫがリン酸化された場合を「×」と示す。

【0158】

その結果、Ｄｎａｊｃ９のノックダウン細胞及びＷｄｆｙ１のノックダウン細胞において、ＥＲＫのリン酸化の亢進が確認された。これら以外のノックダウン細胞においては、ＥＲＫのリン酸化の抑制が認められた。

【0159】

【表1】

【0160】

表１の結果から、Ｒｂｘ１タンパク質、Ｕｂｅ２ｄ１タンパク質及びＦｂｌタンパク質は、ＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成の下流かつＥＲＫのリン酸化の上流で機能していると考えられた。

【0161】

また、Ｕｂｅ２ａタンパク質及びＮｕｂｐ２タンパク質は、ＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成の上流で機能していると考えられた。

【0162】

また、Ｄｎａｊｃ９タンパク質及びＷｄｆｙ１タンパク質は、ＥＲＫのリン酸化の下流、又は、ＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成−ＥＲＫのリン酸化の経路とは関連のない経路で機能している可能性が考えられた。

【0163】

［実験例２０］
（心筋特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスは発生過程の１７．５日で心筋細胞死により致死となる）
ＰＨＧＰｘ欠損マウスは、発生過程の７．５日で致死になることが知られている。ここでは、心臓特異的にＰＨＧＰｘを欠損させたマウスを作製し、その影響を解析した。まず、ＰＨＧＰｘ^＋／−マウスと、心臓特異的プロモーターである筋肉クレアチンキナーゼプロモーター（Ｍｕｓｃｌｅ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）の下流にＣｒｅ遺伝子を有するマウス（Ｃｒｅ^＋／＋）との交配を繰り返し、Ｃｒｅ^＋／＋ＰＨＧＰｘ^＋／−マウスを得た。

【0164】

続いて、Ｃｒｅ^＋／＋ＰＨＧＰｘ^＋／−マウスと、上述したＴｇ（ｌｏｘＰ−ＰＨＧＰｘ）^＋／＋：ＰＨＧＰｘ^−／−マウスとを交配することにより、Ｃｒｅ^＋／−Ｔｇ（ｌｏｘＰ−ＰＨＧＰｘ）^＋／−：ＰＨＧＰｘ^−／−マウスを得た。このマウスは、心臓特異的にＰＨＧＰｘを欠損する。

【0165】

このようにして得られた心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスを観察したところ、発生過程の１６．５日までは正常に生育したが、１７．５日に心筋細胞が突然死を起こし、１８．５日には浮腫を引き起こして致死となった。図２１（ａ）は、発生過程の１７．５日（１７．５ｄｐｃ）及び１８．５日（１８．５ｄｐｃ）における、野生型マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及び心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（ＫＯ）の写真である。

【0166】

また、図２１（ｂ）は、発生過程１７．５日目のマウスの心臓の組織切片を、ＤＡＰＩ染色及びＴＵＮＥＬ染色（ＴＵＮＥＬ）した結果を示す写真である。心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（ＫＯ）の心臓組織では、ＴＵＮＥＬ染色陽性の細胞（細胞死）が多数認められた。母親にビタミンＥ添加食（５０ｍｇビタミンＥ／１００ｇ餌）を毎日与えた時、発生過程１７．５日目の心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（ＫＯ）の心臓組織の細胞死は完全に抑制され、正常に心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスが産まれた。通常食で母親マウスを飼育していたときに１７．５日の心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス胎児で起きる心筋細胞死においても、カスパーゼ３の活性化やＤＮＡのラダーは観察されず、またリン脂質の酸化体の蓄積が観察された（図なし）。このことからこの心筋細胞死も脂質酸化を介した新規細胞死が誘導されていると考えられた。

【0167】

また、図２１（ｃ）は、発生過程１７．５日目のマウスの心臓におけるＰＨＧＰｘタンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す写真である。心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（ＫＯ）では、ＰＨＧＰｘタンパク質が欠損していることが確認された。

【0168】

［実験例２１］
（ＣＤＫ４阻害剤３−ＡＴＡの母親マウス腹腔への投与は、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス１８．５日胎仔の致死を抑制する）
ＣＤＫ４阻害剤３−ＡＴＡを母親マウス腹腔に投与することにより、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの致死を抑制することができるか否かについて検討した。

【0169】

心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス胎仔の発生過程１４．５日、１５．５日、１６．５日、１７．５日に、母親マウスの腹腔に１．５ｍｇ／ｋｇ体重の３−ＡＴＡを投与し、発生過程１８．５日目の胎仔を観察した。

【0170】

その結果、１０匹の心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスのうち、８匹で浮腫が抑制されていた。残りの２匹には浮腫が観察された。また、浮腫が抑制されていた８匹のうち、２匹は生存していた。残りの６匹は死亡していた。

【0171】

図２２（ａ）〜（ｃ）は、発生過程１８．５日のマウス胎仔の写真である。図２２（ａ）は、野生型マウスの写真であり、図２２（ｂ）は、３−ＡＴＡを投与しなかった心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの写真であり（心臓ＰＨＧＰｘ ＫＯ ３−ＡＴＡ（−））、図２９（ｃ）は、３−ＡＴＡを投与した心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの写真である（心臓ＰＨＧＰｘ ＫＯ ３−ＡＴＡ（＋））。

【0172】

［実験例２２］
（心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスはビタミンＥ添加食により正常に育つが、通常食に変えると１０日前後で突然死を引きおこす）
心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの胎仔期において、母親にビタミンＥ添加食を与えると、致死が完全に抑制された。また、誕生した心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスにビタミンＥ添加食（５０ｍｇビタミンＥ／１００ｇ餌）を毎日与え続けると、正常に生育することが明らかとなった。

【0173】

ここで、ビタミンＥ添加食は、一日量当たり１３０ｍｇ／ｋｇ体重のビタミンＥを含んでいた。また、通常食は、一日量当たり１３ｍｇ／ｋｇ体重のビタミンＥを含んでいた。

【0174】

図２３（ａ）は、ビタミンＥ添加食を与えることにより、正常に生育した心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を、通常食に変えてからの生存率を示すグラフである。正常に生育した心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食事を通常食に変えると、１０日前後で突然死を引き起こすことが明らかとなった。

【0175】

図２３（ｂ）は、ビタミンＥ添加食を与えた心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（ビタミンＥ添加食）、食餌を通常食に変えることにより死亡した心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（通常食ＫＯ（死亡））、及び通常食を与えた野生型マウス（通常食ｗｉｌｄ）の心臓中のビタミンＥの量を測定した結果を示すグラフである。ビタミンＥ添加食を与えた心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの心臓中には、心臓１ｇ当たり約２４ｎｍｏｌのビタミンＥが含まれていた。通常食では心臓１ｇ当たり約４ｎｍｏｌのビタミンＥが含まれていた。このマウス致死モデルでは、心臟のビタミンＥ量の低下により、脂質酸化が起因となる心筋細胞死が誘導される（図なし）。

【0176】

図２３（ｃ）は、ビタミンＥ添加食を与えた心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（ビタミンＥ添加食心臓ＫＯ）、及び食餌を通常食に変えて１０日目の心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（通常食心臓ＫＯ）の死直前の心電図を示すグラフである。食餌を通常食に変えた心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの心電図には不整脈が見られ、不整脈性の突然死（心不全）が認められた。

【0177】

［実験例２３］
（ＣＤＫ４阻害剤３−ＡＴＡは、ビタミンＥ添加食から通常食に変えて起きる心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの心不全による突然死を延命することができる）
ビタミンＥ添加食を与えた心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を通常食に変えた後、ＣＤＫ４阻害剤３−ＡＴＡを投与した場合の影響を検討した。

【0178】

図２３は、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を通常食に変えたマウス（Ｖｉｔ．Ｅ−）、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を通常食に変え、更に食餌を通常食に変えてから４日目から１日１回、２ｍｇ／ｋｇ体重の３−ＡＴＡを腹腔内投与したマウス（Ｖｉｔ．Ｅ−，３−ＡＴＡ＋）、及び心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスにビタミンＥ添加食を与え、更に実験開始後４日目から１日１回、２ｍｇ／ｋｇ体重の３−ＡＴＡを腹腔内投与したマウス（Ｖｉｔ．Ｅ＋，３−ＡＴＡ＋）の生存率を示すグラフである。

【0179】

心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を通常食に変えたマウス（Ｖｉｔ．Ｅ−）（ｎ＝２３）の実験開始からの生存期間の中央値は１０日であった。また、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を通常食に変え、更に食餌を通常食に変えてから４日目から１日１回、２ｍｇ／ｋｇ体重の３−ＡＴＡを腹腔内投与したマウス（Ｖｉｔ．Ｅ−，３−ＡＴＡ＋）（ｎ＝６）の実験開始からの生存期間の中央値は１８日であった。これらの結果には、１％未満の危険率で有意差が認められた。

【0180】

以上の結果から、ＣＤＫ４阻害剤３−ＡＴＡは、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスをビタミンＥ添加食から通常食に変えた場合に起きる、心不全による突然死を延命することができることが示された。

【0181】

発明者らの別の検討において、３−ＡＴＡの代わりに、ＭＥＫ阻害剤であるＵ−０１２６を投与した場合においても、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスをビタミンＥ添加食から通常食に変えた場合に起きる、心不全による突然死を延命することができることが示された。

【0182】

以上の結果は、Ｒｂｘ１、Ｕｂｅ２ｄ１、Ｕｂｅ２ａ、Ｄｎａｊｃ９、Ｎｕｂｐ２、Ｆｂｌ及びＷｄｆｙ１の発現抑制剤を投与することによっても、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスをビタミンＥ添加食から通常食に変えた場合に起きる、心不全による突然死を延命することができることを示す。

【産業上の利用可能性】

【0183】

本発明により、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法及びキットを提供することができる。また、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤を提供することができる。また、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤を提供することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]