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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6475641
(24)【登録日】2019年2月8日
(45)【発行日】2019年2月27日
(54)【発明の名称】ウイルス様粒子の放出方法
(51)【国際特許分類】
C12N 7/02 20060101AFI20190218BHJP
C12N 15/866 20060101ALN20190218BHJP
【ＦＩ】
C12N7/02
!C12N15/866 Z
【請求項の数】9
【全頁数】13
(21)【出願番号】特願2015-557435(P2015-557435)
(86)(22)【出願日】2014年2月14日
(65)【公表番号】特表2016-508720(P2016-508720A)
(43)【公表日】2016年3月24日
(86)【国際出願番号】EP2014052870
(87)【国際公開番号】WO2014125053
(87)【国際公開日】20140821
【審査請求日】2016年11月28日
(31)【優先権主張番号】13155370.3
(32)【優先日】2013年2月15日
(33)【優先権主張国】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】510000976
【氏名又は名称】インターベット インターナショナル ベー． フェー．
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100151448
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 孝博
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100185959
【弁理士】
【氏名又は名称】今藤 敏和
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】フアヒンガー，ビツキー
(72)【発明者】
【氏名】スノ，メラニー
【審査官】
小倉 梢
(56)【参考文献】
【文献】
Biochem. Biophys. Res. Commun.，２００４年，Vol. 313，p. 878-887
【文献】
J. Virol. Methods，２００８年，Vol. 152，p. 1-5
【文献】
Virology Journal，２０１０年，7:366，p. 1-6
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ ７／００ − ７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
バキュロウイルスにより発現される非エンベロープウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の昆虫細胞からの放出方法であって、該方法は、ａ）昆虫細胞をＶＬＰタンパク質をコードする組換えバキュロウイルスにより感染させ、ｂ）昆虫細胞を培養し、ｃ）昆虫細胞からＶＬＰを放出させ、ｄ）ＶＬＰを単離すること、からなるステップを含み、そして、細胞溶解または細胞破壊ステップを含まず、かつ昆虫細胞を塩と混合するステップを含み、ここで該混合から生じる該塩水溶液が、その陽イオンがアルカリ金属およびアルカリ土類金属から成る群より選択され、かつその陰イオンがＣｌ-、Ｂｒ-およびＩ-から成る群より選択される、少なくとも３００ｍＯｓｍｏｌ／ｌの塩を含み、
そしてここで、該塩水溶液が３５〜５０℃の間の温度に保持される、ことを特徴とする前記の方法。
そしてここで、該塩水溶液が３５〜５０℃の間の温度に保持される、ことを特徴とする前記の方法。
【請求項2】
昆虫細胞を塩と混合するステップが、昆虫細胞が濃縮される濃縮ステップによって先行されることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項3】
該陽イオンがＮａ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋およびＫ＋から成る群より選択されることを特徴とする、請求項１または２の方法。
【請求項4】
該塩がＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２から成る群より選択されることを特徴とする、請求項３の方法。
【請求項5】
該混合から生じる該塩水溶液が、請求項１〜４のいずれかの塩、水及び１０％未満の細胞培養液から成ることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項6】
該非エンベロープウイルスがパルボウイルス科またはサーコウイルス科のメンバーであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項7】
該塩水溶液が４０〜４５℃の間の温度に保持されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかの方法。
【請求項8】
該昆虫細胞がＳＦ９またはＳＦ２１細胞であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかの方法。
【請求項9】
バキュロウイルスにより発現される非エンベロープウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の精製方法であって、該方法が
ａ）昆虫細胞をＶＬＰタンパク質をコードする組換えバキュロウイルスにより感染させ、
ｂ）昆虫細胞を培養し、
ｃ）昆虫細胞からＶＬＰを放出させ、
ｄ）ＶＬＰを単離すること、
からなるステップを含み、該方法が溶解または細胞破壊のステップを含まず、かつステップｃがＶＬＰの放出のための請求項１〜８のいずれかの方法を含むことを特徴とする前記の方法。
ａ）昆虫細胞をＶＬＰタンパク質をコードする組換えバキュロウイルスにより感染させ、
ｂ）昆虫細胞を培養し、
ｃ）昆虫細胞からＶＬＰを放出させ、
ｄ）ＶＬＰを単離すること、
からなるステップを含み、該方法が溶解または細胞破壊のステップを含まず、かつステップｃがＶＬＰの放出のための請求項１〜８のいずれかの方法を含むことを特徴とする前記の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バキュロウイルスにより発現される非エンベロープウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の昆虫細胞からの放出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
現今、感染症と闘うことになると医学は、ワクチンを大いに頼りにする。このようなワクチンは、双方ともそれぞれ自身の長所と短所を有する、弱毒生ワクチンまたは不活化ワクチンであり得る。弱毒生ワクチンは、自然感染を厳密に模倣し、結果としてウイルスまたは微生物の病原性型によって引き起こされる免疫応答に匹敵する免疫応答を引き起こす。しかしながら、弱毒生ワクチンはいくつかの望ましくない副作用を引き起こすかもしれず、弱毒化のレベルは非常に重要である。これに反して不活化ワクチンは安全であるが、しかしそれら幾つかの例では、その生のカウンターパートと同程度に有効ではない。
【0003】
ウイルスワクチンの場合、第三の型のワクチン：いわゆるウイルス様粒子（ＶＬＰ）に基づくワクチンが、ますます関心を抱かれている。ウイルス様粒子は、形態的に野生型ウイルスに酷似する粒子である。それらは、野生型ウイルスに見出されるすべての免疫原性成分を含んでおり、しかもそれらは、これらの成分をその天然の組織および構造の中に含んでいる。しかしながらそれらは、それらがウイルスゲノムを欠くという理由で、それらが感染性の子孫ウイルスを産生することが出来ない点で野生型ウイルスと異なる。
【0004】
結果としてウイルス様粒子は、弱毒生ワクチンおよび不活化ワクチンの双方に対する魅力的な代替手段である。
【0005】
ＶＬＰは、主にインビトロで細胞系において産生される。しかも多くの場合それらは、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系において産生される。これらの系は、それらが比較的大量のＶＬＰを産生することができるという長所を有する。
【0006】
バキュロウイルスにより発現されるベクター系（ＢＥＶＳ）において発現されるタンパク質は、分泌性または非分泌性タンパク質であり得る。これは、非分泌性ＶＬＰが、それらがさらに精製され得る前に、昆虫細胞からまず放出されねばならないことを意味する。ＶＬＰ放出のための標準方法には、凍結融解、超音波処理、高せん断機械法、グラスビーズ衝撃法（ｂｅａｄ ｍｅｔｈｏｄ）、「圧力破砕法（ｃｅｌｌ ｂｏｍｂ）」、低張性溶媒を使用する浸透圧ショック、界面活性剤の使用および酵素的方法が含まれる。
【0007】
しかしながらこれらの方法のすべては、不可避的に同様に細胞破壊または細胞溶解をもたらし、細胞内容物の全体：ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、細胞内小器官およびバキュロウイルスに基づく系の場合には同様に生きたバキュロウイルスを周囲の媒体中に放出する。これらの成分のすべてではないが大部分が、ＶＬＰがワクチンに使用される前に除去されねばならないことは明らかである。要求される精製レベルは、多数の品質確認を含む多大な努力を要する多段階のプロセスを伴う。
【0008】
それ故に、細胞の全核酸およびタンパク質内容物を同時に放出することを回避する、細胞培養液中への非分泌性ＶＬＰの放出のための方法には明確なニーズがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
上記の問題を軽減または回避さえする、ＶＬＰの放出方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明において提供される方法は、特に昆虫細胞を使用するバキュロウイルスにより発現されるベクター系において発現される非エンベロープウイルスの非分泌性ＶＬＰのための放出に適している。
【0011】
ところで驚いたことに、いったん非エンベロープＶＬＰを含む昆虫細胞が（混合の結果生じる塩水溶液が、その陽イオンがアルカリ金属およびアルカリ土類金属からなる群より選択され、およびその陰イオンがＣ‐、Ｂｒ‐またはＩ‐から成る群より選択される塩の少なくとも３００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌを含むように）塩と混合されると、該細胞はその全細胞含有物を放出することなくＶＬＰを放出することが見出だされた。該方法は、懸濁液中で担体無しで増殖されるとき特に昆虫細胞に適している。
【0012】
これは、実に非常に驚くべき現象である：本発明による方法は、例えば図４に示すように細胞の大部分を無傷のままにしておく。このＶＬＰの放出の機序は不明である。
【0013】
従って本発明の第一の実施形態は、バキュロウイルスにより発現される非エンベロープウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の昆虫細胞からの放出方法に関し、該方法は、細胞溶解または細胞破壊ステップを含まず、かつ昆虫細胞を塩と混合するステップを含み、ここで混合の結果生じる塩水溶液は、その陽イオンがアルカリ金属およびアルカリ土類金属からなる群より選択され、およびその陰イオンがＣｌ‐、Ｂｒ‐またはＩ‐から成る群より選択される塩の少なくとも３００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌを含むことを特徴とする。
【0014】
この方法の目的のために、昆虫細胞を（混合の結果生じる塩水溶液が、その陽イオンがアルカリ金属およびアルカリ土類金属からなる群より選択され、およびその陰イオンがＣｌ‐、Ｂｒ‐またはＩ‐から成る群より選択される塩の少なくとも３００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌを含むように）塩と混合することには、以下のステップを含むことを理解されたい：細胞培養液（周囲の液体中の昆虫細胞）が、（混合後に生じた塩溶液が該塩の少なくとも３００ｍＯｓｍｏｌ／ｌを含むまで、その陽イオンがアルカリ金属およびアルカリ土類金属からなる群より選択され、およびその陰イオンがＣｌ‐、Ｂｒ‐またはＩ‐から成る群より選択される）塩と混合される。
【0015】
言うまでもないが、混合は種々の方法により実施され得る；例、固体状の塩を細胞培養液に添加する方法または塩水溶液を培養液と混合する方法。
【0016】
混合の結果である塩水溶液は、本発明に記載の通り、例えば、少なくとも１５０ｍＭ ＮａＣｌ／Ｌを含む（これは、ＮａＣｌ／Ｌの少なくとも３００ ｍＯｓｍｏｌのモル浸透圧濃度の塩水溶液を与える）。本発明に記載の塩溶液がＭｇＣｌ２を基に作成されるならば、混合から生じる塩水溶液は、少なくとも１００ｍＭ ＭｇＣｌ２／Ｌを含むであろう（これは、少なくともＭｇＣｌ２／Ｌの３００ ｍＯｓｍｏｌのモル浸透圧濃度の塩水溶液を与える）。
【0017】
次の例は、単なる説明としての役割を果たす；仮に昆虫細胞と培地を含む昆虫細胞培養液の１００ｍｌが３００ｍＭ ＮａＣｌ／Ｌ溶液の１００ｍｌと混合されれば、この混合から生じる液体の最終２００ｍｌは、１５０ｍＭ Ｎａｃｌ／Ｌを含む。塩溶液の最終容量は、もちろん本発明の有利な効果に対して関連性はない。かりに昆虫細胞と培地を含む昆虫細胞培養液の７５ｍｌが、１２００ｍＭ ＮａＣｌ／Ｌ溶液の２５ｍｌと混合されれば、この処置から生じる液体の最終１００ｍｌは３００ｍＭ ＮａＣｌ／Ｌを含む。
【0018】
本発明の予想外の現象に関するゲル上での可視化は、図１に与えられる。図１から分かるように、本発明の方法による処理後の、放出ＶＬＰを含む細胞の上清を示すレーンは、極めて不純物が少ない（詳細は実施例の欄を参照されたい）。
【0019】
上記の通り塩溶液の最終容量は、該方法自体には関連性はないが、実際にはそれは、細胞培養液を本発明の混合ステップにかける前の濃縮ステップを導入するために有益である。濃縮ステップの主な原因は、商業目的のＶＬＰ産生が、比較的大量の細胞培養液量を必要とすることである。この大容量からＶＬＰを直接収集するのは効率的でない；小容量からのＶＬＰ収集には、はるかに少ない操作しか必要とされない。
【0020】
このステップにおける濃縮レベルは重要でない。細胞培養液の元の容量の半分の容量への細胞培養液の濃縮（すなわち、元の容量の５０％）は、すでに収集の容易化において顕著な有利さを与えるであろう。更に４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％さえまでの濃縮は、その順で望ましい。濃縮は、当該技術分野において既知のすべての多数の方法によって実施され得る。しばしば使用される一方法は、限外濾過法、例えば、接線流透析の形態である。
【0021】
もう一つのしばしば使用される方法は、低速遠心分離である。その後に細胞培養液の一部または全部の除去を伴う低速遠心分離は、濃縮をもたらし、最終的に細胞のペレット化をもたらすが、細胞は未だ無傷でありかつ未だ少量の培養液によって囲まれているであろう。このような細胞ペレットは、本発明において記載の通り、それから塩水溶液をあたえるために、塩水溶液と容易に混合され得る。
【0022】
実用的な理由から、非常に好適な方法は、細胞を含む細胞培養液を単に保管し重力により細胞を容器の底に引くことである。収集容量および容器サイズに依存して、約１〜１８時間後に、大部分の細胞が底の細胞培養液の１０％に存在するだろうから、その結果、無細胞の上部の細胞培養液の９０％は廃棄し得る。この方法は、大量の細胞培養液の遠心分離および／または限外濾過の作業を回避する。細胞培養液の底の１０％においてこのように得られたＶＬＰ含有細胞は、それからすぐに本発明に記載の、昆虫細胞を塩と混合するステップにおいて使用され得る。
【0023】
従って、この実施形態の好ましい形態は、昆虫細胞を塩と混合するステップが、昆虫細胞が濃縮される濃縮ステップによって先行されることを特徴とする本発明の方法に関する。
【0024】
原則として、アルカリ金属およびアルカリ土類金属から成る群より選択される陽イオンは、本発明の方法に使用され得る。しかしながらＮａ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋およびＫ＋から成る群より選択される陽イオンが好ましく、それらが安価でもありさらに薬用として許容可能でもあるからである。
【0025】
それ故に本発明のこの実施形態の他の好ましい形態は、陽イオンがＮａ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋およびＫ＋から成る群より選択されることを特徴とする、本発明の方法に関する。
【0026】
好ましい陰イオンはＣｌ‐であり、Ｃｌ‐陰イオンを有する塩は安価でありさらにそれらは薬用として極めて許容可能だからである。
【0027】
従ってこの方法のより好ましい形態は、塩がＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２から成る群より選択されることを特徴とする、本発明の方法に関する。
【0028】
ＶＬＰを保有する昆虫細胞を含む細胞培養液は、細胞を培養するために必要な多くの成分をさらに含む。該培養液はまた、細胞の老廃物も含む。これらの産物は、ＶＬＰを含む最終ワクチンにとって有害であり得る不必要な副産物である。
【0029】
従ってこのような成分は、本発明の方法を細胞に適用する前に、ＶＬＰを含む昆虫細胞から好ましくは分離される。これは、細胞をペレット化し、上清を捨て去りおよび細胞を本発明に記載の塩中に再懸濁することによって容易になし得る。これを注意深く行えば、ほとんど大部分の上清を除去し得る。その場合、細胞と塩の混合から生じる塩水溶液は、本質的に本発明記載の塩と水から構成される。本質的にとは、ここでは混合から生じた塩水溶液が１０％未満の細胞培養液を含むことを意味する。好ましくは混合から生じる水溶液は、８％未満、６％未満、４％未満またはさらに２％未満の細胞培養液を含む。
【0030】
従ってこの実施形態の好ましい形態は、混合から生じる塩水溶液が、本質的に本発明に記載の塩および水から構成されることを特徴とする、本発明の方法に関する。
【0031】
本発明の方法は、一般的にＢＥＶＳにおいて発現される非分泌の非エンベロープＶＬＰに適している。
【0032】
本方法は、従ってとりわけパルボウイルス科およびサーコウイルス科；商業ベースで現在ＶＬＰが作成されている数メンバーを有するウイルス科のメンバーのＢＥＶＳ‐発現ＶＬＰに適している。
【0033】
それ故に本発明のこの実施形態の他の好ましい形態は、非エンベロープウイルスがパルボウイルス科またはサーコウイルス科のメンバーであることを特徴とする、本発明の方法に関する。
【0034】
バキュロウイルスに基づく昆虫細胞系において作成されるＶＬＰの形態で成功裡に投与され得る、非エンベロープウイルスに基づく獣医学における使用のための、重要なパルボウイルスおよびサーコウイルスワクチンの例は、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）およびブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）である。
【0035】
それ故に本発明のこの実施形態のより好ましい形態は、非エンベロープウイルスがブタパルボウイルス（ＰＰＶ）またはブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）であることを特徴とする、本発明の方法に関する。
【0036】
ＢＥＶＳにおけるＶＬＰの産生はまた、原則としてバキュロウイルスの産生ももたらす。このようなバキュロウイルスは、ＶＬＰの不必要な副産物であるので、それ故にそれらは、除去または少なくとも不活化されなければならない。
【0037】
ところでさらにいっそう驚いたことに、仮に塩水溶液が３０〜５５℃、好ましくは３５〜５０℃、より好ましくは４０〜４５℃の間の温度に保持されれば、生きたバキュロウイルス量が顕著に減少することが見出だされた。なおそのうえに、放出される抗原量もまた、温度が上昇すると顕著に増加する。
【0038】
この減少は極めて有利であり、何故ならば本発明の方法の適用後に不活化されねばならないウイルス量が比較的に少なく、それ故に不活化薬品のより少ない量が使用されねばならないからである。
【0039】
あくまで例示である；塩水溶液が３０〜４０℃の温度に保持されるとき、１０００ないし１０．０００倍の間のウイルス価における減少が容易に獲得され得る。
【0040】
一定の温度が適用されねばならない時間は、選択される温度に依存する：約４０℃において、ウイルス価における１０倍の低下は１時間後に得られ、一方で約３５℃の温度においては、このような現象は５〜６時間後に得られる。一般的に、混合から生じた塩水溶液を一定の温度に１８〜２４時間保持することが、いずれにせよ適している。
【0041】
ＶＬＰ‐発現に極めて普通に使用される昆虫細胞の二つの例は、ＳＦ９またはＳＦ２１細胞である。本発明の記載の方法は、双方のこれらの細胞に極めて成功裡に適用され得る。従って本発明のこの実施形態の他の好ましい形態は、昆虫細胞がＳＦ９またはＳＦ２１細胞である、本発明の方法に関する。
【0042】
記載の方法は、バキュロウイルスにより発現される非エンベロープウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の精製のために通常一般的に適用される方法の一部であり、該方法は、ａ）昆虫細胞をＶＬＰタンパク質をコードする組換えバキュロウイルスにより感染し、ｂ）昆虫細胞を培養し、ｃ）昆虫細胞からＶＬＰを放出しならびにｄ）ＶＬＰを単離することからなるステップであるいくつかのステップを含む。
【0043】
本発明の方法から大いに利益を得るであろうＶＬＰを放出するステップは、ステップｃ）である。
【0044】
従ってさらに本発明の他の実施形態は、バキュロウイルスにより発現される非エンベロープウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の精製のための方法に関し、ここで該方法は、ａ）昆虫細胞をＶＬＰタンパク質をコードする組換えバキュロウイルスにより感染し、
ｂ）昆虫細胞を培養し、
ｃ）ＶＬＰを昆虫細胞から放出し、
ｄ）ＶＬＰを単離する、
ことからなるステップを含み、該方法は、溶解または細胞破壊ステップがなく、およびステップｃがＶＬＰの放出のための本発明の方法を含むことを特徴とする。
【0045】
実施例実施例１：ＰＣＶ２ ＶＬＰの産生
本実施例においては、ＢＥＶＳにより産生されるＰＣＶ２ ＶＬＰを使用した。この組換えバキュロウイルスの構築は、以前に米国特許ＵＳ ２００１／００６４７６５において詳細に記載された。本ウイルスは、さらにＢａｃＰＣＶ‐２‐ＯＲＦ‐２ウイルスと称される。
【0046】
発現産物の最大量を得るために、パイロット実験を実施し、組換えＰＣＶ‐２ＯＲＦ‐２ ＶＬＰを得るための条件を最適化した。すべての実験は、スポドプテラ・フルギペルダ２１（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ２１）（Ｓｆ２１）細胞を使用して２８℃で懸濁培養において行った。マスター・シードからの４回継代レベルのＢａｃＰＣＶ‐２‐ＯＲＦ‐２ウイルスを感染に使用した。最適化産生のために、感染時の細胞密度は１．４×１０６細胞／ｍｌ、感染多重度（ＭＯＩ）は０．０１でありおよび培養は感染後６日間継続した。生じた混合物を発現産物収集物と命名した。
【0047】
低速遠心分離前後の細胞培養液の試料を、Ｌａｅｍｍｌｉ法（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）．Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６８０‐６８５））の変性ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。使用した４〜１２％の濃度勾配ゲルをクマシーブリリアントブルーにより染色した。実施例中のすべてのゲルもまた、Ｌａｅｍｍｌｉ法による変性ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドである。
【0048】
実施例２：昆虫細胞からのＶＬＰの放出細胞を実施例１に従って収集した。図１において、「収集物（ｈａｒｖｅｓｔ）」の見出しのレーンは、細胞培養収集物のタンパク質含有物を示す。このレーンは、細胞タンパク質、バキュロウイルスタンパク質およびＶＬＰ関連タンパク質を含む、培養液および培養細胞中に存在するすべてのタンパク質を示す。
【0049】
２００ｇでの収集の遠心分離後に、無細胞上清の９０％を等量の塩水溶液によって、混合後の最終濃度が０．１５、０．２０、０．２５および０．３０ｍＭ ＮａＣｌとなるように交換した。これらの混合物を４０℃で１８時間保持し、残りの細胞をその後に３０００ｇでの遠心分離により遠心沈殿した。上清をゲル電気泳動にかけた。
【0050】
図１に示すように、「上清」の見出しの下のレーンにおいて、上清は実質的に純粋なＰＣＶ２ ＶＬＰタンパク質（および非ＶＬＰタンパク質の痕跡量）を含む。
【0051】
実施例３：アルカリ塩およびリン酸緩衝液の比較本実験において、細胞培養液を収集し、細胞を２００ｇでペレット化し、上清の９０％を除去しそして細胞をそれぞれ等量のＰＢ（２５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）、ＰＢ＋０．５Ｍ ＮａＣｌ、Ｈ２Ｏ（＝ＷＦＩ＝注射用水）および本発明に記載の水溶液中の０．５Ｍ ＮａＣｌに再懸濁した。
【0052】
インキュベーションは、４０℃で一晩行った。細胞をその後３０００ｇでの遠心分離によって除去した。図２に示すように、ＷＦＩは単独ではＶＬＰを放出しないが、一方でＰＢ＋ＮａＣｌ、ＮａＣｌ水溶液およびＰＢはＶＬＰを放出する。ＷＦＩ＋ＮａＣｌ（＝注射用水＋ＮａＣｌ、＝ＮａＣｌ水溶液）のレーンの通り、これは最も高い純粋なＶＬＰ含量を与え、および最も低い非ＶＬＰ関連タンパク質のバックグランドを与える。
【0053】
全試料の抗原マス（ｍｌ当たりの抗原単位‐ＡＵ／ｍｌと表現する）を、既知の抗原マスの対照基準と比較してＥＬＩＳＡによって定量した。その後、全試験試料の回収率（％）を収集物試料の回収率と比較して計算した。代替法として、ゲル上のＰＣＶ２特異的タンパク質バンドの強度を、収集物試料のＰＣＶ２特異的タンパク質バンドの強度と比較して計算した。
【0054】
実施例４：高温でのアルカリ塩とリン酸緩衝液の比較本実施例において細胞培養液を収集し、細胞を２００ｇでペレット化し、上清の９０％を除去しおよび細胞をそれぞれ等量のＰＢ（２５０ｍＭリン酸、ｐＨ７．４）、ＰＢ＋０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１Ｍ ＰＢＳ（８ｇ ＮａＣｌ／Ｌ、０．２ｇ ＫＣｌ／Ｌ、１．４４ｇ Ｎａ２ＨＰＯＰ４／Ｌ、０．２ｇＫＨ２ＰＯ４／Ｌ、ｐＨ７．１）および本発明に記載の０．５Ｍ ＮａＣｌ水溶液に再懸濁した。
【0055】
細胞培養液の希釈レベルの効果を比較するために、いくつかの希釈液を作成した。第一の実験において、収集細胞培養液の３０ｍｌ中の細胞を１０倍に濃縮し、その後、最終５０ｍｌ容量まで塩水溶液と混合した。第二の実験において、収集細胞培養液の３０ｍｌ中の細胞を１０倍に濃縮し、その後、最終２５ｍｌ容量まで塩水溶液と混合した。第三の実験において、収集細胞培養液の３０ｍｌ中の細胞を１０倍に濃縮し、その後、最終１０ｍｌ容量まで塩水溶液と混合した。
【0056】
インキュベーションは、４０℃で一晩行った。細胞をその後３０００ｇで遠心分離によって除去した。図３のゲルから分かるように、ＰＢ、ＰＢ＋ＮａＣｌ、ＰＢＳおよび塩水溶液（ＷＦＩ＋ＮａＣｌ）のすべてがＶＬＰを放出する。ＷＦＩ＋ＮａＣｌ（＝注射用水＋ＮａＣｌ、＝ＮａＣｌ水溶液）のレーンに示すように、これは最も高い純粋なＶＬＰ含量を与え、および最も低い非ＶＬＰ関連タンパク質のバックグランドを与える。同じ効果がすべて三個の濃縮物に認められる。
【0057】
さらに、ＷＦＩ＋ＮａＣｌの実験をまた４５℃でも行った。「ＷＦＩ＋ＮａＣｌ、４５℃」のレーンに示すように、この温度におけるインキュベーションは、４０℃におけるＷＦＩ＋ＮａＣｌ処理に匹敵する：比較的に低含量のタンパク質不純物を有するＶＬＰタンパク質の画像を与える。
【0058】
実施例５：塩水環境における細胞の挙動本実験において顕微鏡画像を細胞培養液中の昆虫細胞から作成したが、ここで細胞は本発明の方法に従って処理した。細胞を、未処理の細胞培養液として維持するか、または本発明の方法で処理したが、この場合には混合により生ずる塩水溶液が０．３Ｍ ＮａＣｌ／Ｌを含むように細胞を塩水溶液と混合した。
【0059】
図４は結果を示す：左の画像は、処理無しの昆虫細胞を示し、一方で 右の画像は、混合後に０．３Ｍ ＮａＣｌ／Ｌを含む、塩水溶液中の昆虫細胞を示す。直ぐに分るように、右の画像の細胞はなおまったく無傷であり、しかもそれらは０．３ｍＭ ＮａＣｌ／Ｌを含む塩水溶液の浸透圧環境下に存在するために、左の画像の細胞と比較するとサイズがやや小さい。
【0060】
実施例６：バキュロウイルス力価に及ぼすインキュベーション温度の影響本実施例において、細胞３０ｍｌを低速遠心分離によって収集し、無細胞培養液の９０％を除去し、さらに残りの細胞ペレットをその後塩水溶液２５ｍｌ中に再懸濁し、最終濃度を０．５Ｍ ＮａＣｌ／Ｌとした。
【0061】
このようにして得られた懸濁液を３５℃、３７℃および４０℃の温度に、１、２、４、６または１８時間（一晩）放置した。細胞をその後３０００ｇの遠心分離によって除去した。図５から分かるように、約１００倍のバキュロウイルス力価の減少が３５℃、一晩で得られた。４０℃において、１００倍の減少は１〜２時間後に既に得られ、一方で１０００倍の減少は６〜１８時間後に得られる。
【0062】
実施例７：いくつかのアルカリ土類の種々の濃度の比較本実験は、異なる塩類によるＶＬＰ放出を比較する。細胞を上記の通り収集し、無細胞培養液容量の９０％を除去した。その後、種々の塩水溶液を添加し、ここで塩水溶液の容量は、５倍の最終細胞濃度を達成するために、常に濃縮された収集容量と等容量とした。試験を種々の濃度のＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２で実施した。その後、細胞を３０００ｇの遠心分離によって除去した。混合後の濃度を以下の表１に示す。
【表1】
【0063】
＊本試料は、同一の収集物由来であるが、残りの試料とは異なる日に０．３Ｍ ＮａＣｌによって処理した結果を図６に示す。第２レーンは、試料の５倍希釈後に収集物中に存在するタンパク質を示す（例外：第１２レーン：未希釈収集物試料）。ゲル上の収集物試料の回収率は表中で１００として示し、ゲル上で定量される相対回収率を表１の第二右欄に示す。抗原マスの回収は、表１の右欄に示す。図６中のゲルと表の双方から、すべての処理品が第２レーン（収集物）の調製品よりも高い回収率を有し、すべての処理が混じりの少ないＶＬＰ調製品を提供することが分かる。（第９レーンの比較的に低い回収率の値は、人工産物のためであると考えられ、第９レーンの試験調製品の抗原マスの定量が、予想どおり高い回収率を示すからである）。図７は、ゲル上定量したＶＬＰの回収率と標準的ＥＬＩＳＡ試験に基づく抗原マスによって定量したＶＬＰの回収率との間には良好な相関関係があることを示す。
【0064】
実施例８：本方法のブタパルボウイルス産生細胞ＳＦ９およびＳＦ２１への適用本実験は、本方法が他の非エンベロープ非分泌性ＶＬＰに同様に適していることを示すことを目的とする。本実験において、パルボウイルス科のＢＥＶＳにより産生されたＶＬＰを選択する：つまりブタパルボウイルス（ＰＰＶ）である。また、本実験において二つの異なる種類の通常使用される昆虫細胞を使用した：ＳＦ９およびＳＦ２１細胞である。
【0065】
ＳＦ９細胞およびＳＦ２１細胞を、ブタパルボウイルスＶＬＰを発現する組換えバキュロウイルスにより感染した。（「収集物」、図９、第２レーンおよび第７レーン）。その後、細胞を２００ｇでペレット化し、上清の９０％を除去し（図８、第４レーンおよび第９レーン）そして細胞を等量のＰＢＳ（図８、第３レーンおよび第８レーン）または０．３Ｍ ＮａＣｌ水溶液に再懸濁した。ＮａＣｌ処理試料の４０℃、一晩のインキュベーション後に、試料を３０００ｇで遠心分離し、上清を収集し（図８、第６レーンおよび第１１レーン）およびペレットを等量のＰＢＳに再懸濁した（図８、第５レーンおよび第１０レーン）。
【0066】
図８は、ＳＦ９細胞およびＳＦ２１細胞中で産生されたＰＰＶ‐ＶＬＰに適用されたときの、本方法の結果を示す。第２レーン：収集物；第３レーン：収集物、ペレットをＰＢＳ中に再懸濁、第４レーン：収集物上清；第５レーン：収集物、０．３Ｍ ＮａＣｌ、４０℃、一晩、ペレット；第６レーン：収集物、０．３Ｍ ＮａＣｌ，４０℃、一晩、上清；第７レーン：収集物；第８レーン：収集物、ＰＢＳ中に再懸濁したペレット、第９レーン：収集物上清；第１０レーン：収集物、０．３Ｍ ＮａＣｌ、４０℃、一晩、ペレット；第１１レーン：収集物、０．３Ｍ ＮａＣｌ、４０℃、一晩、上清。
【0067】
第３レーンと比較して第５レーンから分かる通り、本発明の方法による処理は、実質的にすべてのＶＬＰを昆虫細胞から放出する：処理後のペレット化された細胞は、第５レーンに示す通りほとんどまたは全くＶＬＰを含まない。第３レーンと比較して第４レーンから、ＰＣＶ２ ＶＬＰに関して認められたことと反対に、ＣＰＶ ＶＬＰ産生昆虫細胞はすでにＶＬＰの一部を放出することが分かる。この理由は不明である。それにもかかわらず、本発明の方法は、これらのＣＰＶ ＶＬＰにも適用され得て、何故ならば本発明の方法を適用することなしでは、収集後のＣＰＶ ＶＬＰの相当量が細胞中に閉じ込められて残るからである。
【図面の簡単な説明】
【0068】
【図1】この図は、種々の濃度のＮａＣｌ水溶液を使用して４０℃で、ＶＬＰを含む昆虫細胞に本発明の方法を適用する効果を示す。
【図2】この図は、塩水溶液中の種々の塩類を使用して、ＶＬＰを含む昆虫細胞に本発明の方法を適用する効果を示す。
【図3】この図は、塩水溶液中の種々の塩類を使用して高温で、ＶＬＰを含む昆虫細胞に本発明の方法を適用する効果を示す。
【図4】この図は、その培養液中の昆虫細胞（左の画像）と本発明の方法による処理後の昆虫細胞（右の画像）との間の比較を示す。
【図5】この図は、高温での長期のインキュベーションのバキュロウイルス力価に及ぼす影響を示す。
【図6】この図は、塩水溶液中のアルカリ塩としてＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＫＣｌを使用して、ＶＬＰを含む昆虫細胞に本発明の方法を適用する効果を示す。
【図7】この図は、ゲル上で定量される時と抗原マスＥＬＩＳＡによって定量されるときの本発明の方法を使用して得られるＶＬＰ量の間の関係を示す。
【図8】この図は、バキュロウイルスにより産生されるブタパルボウイルスＶＬＰを発現する二つの異なる昆虫細胞系に本発明の方法を適用することの効果を示す。
【0069】
第２、第７レーン：収集物。第３、第８レーン：収集物、ＰＢＳに再懸濁されたペレット。第４、第９レーン：収取物上清。第５、第１０レーン：収集物、０．３Ｍ ＮａＣｌ 一晩（Ｏ／Ｎ） ４０℃、ペレット。第６、第１１レーン：収集物、０．３Ｍ ＮａＣｌ 一晩（Ｏ／Ｎ） ４０℃、上清。