特許 6475668 Ｌ−トリプトファン産生能が強化されたエシェリキア属微生物及びこれを用いてＬ−トリプトファンを産生する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6475668

(24)【登録日】2019年2月8日

(45)【発行日】2019年2月27日

(54)【発明の名称】Ｌ−トリプトファン産生能が強化されたエシェリキア属微生物及びこれを用いてＬ−トリプトファンを産生する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20190218BHJP

   C12P 13/22 20060101ALI20190218BHJP

   C12N 15/03 20060101ALI20190218BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21ZNA

   C12P13/22 A

   C12N15/03 Z

【請求項の数】7

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2016-132893(P2016-132893)

(22)【出願日】2016年7月4日

(62)【分割の表示】特願2014-552128(P2014-552128)の分割

【原出願日】2013年1月10日

(65)【公開番号】特開2017-18094(P2017-18094A)

(43)【公開日】2017年1月26日

【審査請求日】2016年8月2日

(31)【優先権主張番号】10-2012-0002906

(32)【優先日】2012年1月10日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2013-0002913

(32)【優先日】2013年1月10日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】512088051

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＣＪ ＣｈｅｉｌＪｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100088904

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100124453

【弁理士】

【氏名又は名称】資延 由利子

(74)【代理人】

【識別番号】100135208

【弁理士】

【氏名又は名称】大杉 卓也

(74)【代理人】

【識別番号】100152319

【弁理士】

【氏名又は名称】曽我 亜紀

(72)【発明者】

【氏名】イ，クァン ホ

(72)【発明者】

【氏名】パク，ヘ ミン

(72)【発明者】

【氏名】イ，ヒョ ヒョン

(72)【発明者】

【氏名】ファン，ヨン ビン

(72)【発明者】

【氏名】イ，ソク ミョン

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０９−１２１８４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第８７／００１１３０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００２−２０９５９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特許第３０３２０１３（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 特開昭６４−０７１４７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−１５１８２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 J.Bacteriol., 1978, vol.133, p.1457-1466

【文献】 J.Mol.Biol., 1990, vol.216, p.25-37

【文献】 Biotechnol lett, 2002, vol.24, p.1815-1819

【文献】 RNA, 2007, vol.13, p.1141-1154

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

野生型のエシェリキア属微生物の産生能に比較して、強化されたL-トリプトファン産生能を持つ組換えエシェリキア属微生物であって、
該組換えエシェリキア属微生物は、染色体のトリプトファンオペロンにおいて配列番号１に示される塩基配列を含む発現調節部位のうち配列番号２に示される塩基配列の全体又は一部が欠損することのみによって修飾されたものであり、
該組換えエシェリキア属微生物は、野生型エシェリキア属微生物と比較してトリプトファンオペロン遺伝子の発現を増大させるために、トリプトファンオペロンの遺伝子である、ｔｒｐＥを除く、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、及びｔｒｐＡが形質転換されたものであり、及び
該組換えエシェリキア属微生物は野生型エシェリキア属微生物と比較してｔｒｐＥ遺伝子の発現が増大されていないものであるか若しくはｔｒｐＥ遺伝子によってコードされるアントラニル酸塩合成酵素の活性が増大されてないものである、組換えエシェリキア属微生物。

【請求項2】

組換えエシェリキア属微生物は染色体のトリプトファンオペロンにおいて、配列番号１の塩基配列を含む発現調節部位のうち配列番号３に示される塩基配列の全体又は一部が欠損するようにさらに変形されたものである、請求項１に記載の組換えエシェリキア属微生物。

【請求項3】

ｔｒｐＤ遺伝子が、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、ｔｒｐＣ遺伝子が、配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、ｔｒｐＢ遺伝子が、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、及び
ｔｒｐＡ遺伝子が、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項２に記載の組換えエシェリキア属微生物。

【請求項4】

組換えエシェリキア属微生物が大腸菌である、請求項１に記載の組換えエシェリキア属微生物。

【請求項5】

Ｌ−トリプトファン産生に適した条件下で請求項１に記載の組換えエシェリキア属微生物を培養する工程を含む、Ｌ−トリプトファンの産生方法。

【請求項6】

組換えエシェリキア属微生物は、染色体のトリプトファンオペロンにおいて、配列番号１の塩基配列を含む発現調節部位のうち配列番号３に示される塩基配列の全体又は一部が欠損するようにさらに変形されたものである、請求項５に記載のＬ−トリプトファンの産生方法。

【請求項7】

組換えエシェリキア属微生物が大腸菌である、請求項５に記載のＬ−トリプトファンの産生方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｌ−トリプトファン産生能が強化されたエシェリキア属微生物及びこれを用いてＬ−トリプトファンを産生する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

必須アミノ酸の一つであるＬ−トリプトファンは、飼料添加剤だけではなく、輸液剤などの医薬品の原料及び健康食品の素材などとして広く用いられてきており、化学合成法、酵素反応法、発酵法などにより産生されてきている。
中でも、最近には、微生物による発酵法が主流をなしており、このときに汎用される微生物は、産業化初期の化学的な突然変異を用いた類似体耐性選別菌株であるが、１９９０年代に入り、遺伝子組換え技術の眩しい発展と分子レベルの調節機序が明らかにされることに伴い、遺伝子組換え技法を用いた大腸菌とコリネバクテリウム組換え菌株が汎用されている。
微生物によるトリプトファンの産生は、解糖過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）の中間産物であるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ：ＰｈｏｓｐｏＥｎｏｌＰｙｒｕｖａｔｅ）とペントースリン酸回路の中間物質であるエリトロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ：Ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ-４-Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）とが重合反応して得られる３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸（ＤＡＨＰ：３-ＤｅｏｘｙＤ-ａｒｏｂｉｎｏ-ｈｅｐｔｕｌｏｓｏｎａｔｅ-７-ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）から始まる。次いで、芳香族共通生合成経路を経てコリスミ酸（ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ）から分岐される生合成経路により産生される。具体的には、トリプトファンは、遺伝子ｔｒｐＥから合成されるアントラニル酸塩合成酵素（ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ, ＥＣ ４．１．３．２７）、遺伝子ｔｒｐＤから合成されるアントラニル酸塩合成酵素（ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ, ＥＣ ４．１．３．２７）とアントラニル酸塩ＰＲＰＰトランスフェラーゼ（ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ ＰＲＰＰ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ, ＥＣ２．４．１．２８）、遺伝子ｔｒｐＣから合成されるインドール−３−グリセロールリン酸合成酵素（ｉｎｄｏｌｅ-３-ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ, ＥＣ ４．１．１．４８）とホスホリボシルアントラニル酸塩異性化酵素（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、遺伝子ｔｒｐＢとｔｒｐＡから合成されるトリプトファン合成酵素（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｓｙｎｔｈａｓｅ, ＥＣ ４．２．１．２０）により合成される。前記反応を媒介する酵素をコードする遺伝子群であるｔｒｐＥＤＣＢＡは、一つの調節部位を含むオペロン構造として染色体の内部に存在する。
トリプトファンオペロンは、通常、細胞が要求する十分な量のトリプトファンを産生するように活発に転写するが、周りにトリプトファンがあれば、リプレッサ（repressor）がトリプトファンと結合してトリプトファンオペロンが不活性化されるため転写が抑制される。また、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、トリプトファン、ヒスチジンなどのアミノ酸生合成オペロンの場合、減衰機序（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）という別の調節機序を有している（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.(１９９１) １７３,２３２８-２３４０）。この減衰機序は、染色体上でプロモータとオペロンの最初の遺伝子との間の領域が有している特異な配列区間において、アミノ酸に乏しい条件下ではｍＲＮＡの構造が解読し易い構造に変わって生合成遺伝子の発現を促すが、当該アミノ酸に富んだ条件下では短く転写されたｍＲＮＡがヘアピン構造（ｈａｉｒｐｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）と命名された３次元的構造を形成して解読過程を妨げる機序であることが知られている（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ., (１９８８) ２６３:６０９-６１２）。
Ｌ−トリプトファン産生菌株の開発方向は、初期には、最終産物であるトリプトファンにより阻害されるトリプトファン生合成経路酵素のフィードバック阻害を克服したり、トリプトファン生合成酵素の発現強化のために染色体やベクターの形でトリプトファンオペロン遺伝子のコピー数を増やしたりするといったように、代謝過程の酵素合成の強化による効率化が主たる目標であった（Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.,(１９８２)４３:２８９-２９７; Ａｐｐｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.,(１９９３)４０:３０１-３０５; Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.,(１９９６) １４:２５０-２５６）。
Ｌ−トリプトファンの産生能を微生物に与えるための方法としては、大きく、化学的な突然変異によりトリプトファン類似体もしくは中間産物であるアントラニル酸塩に耐性を有するように選別する方法や、遺伝工学的な方法により改変する方法が挙げられる。化学的な突然変異を用いたケースとしては、大韓民国登録特許第１９８７−０００１８１３号、大韓民国登録特許第０９４９３１２号などが挙げられ、遺伝工学的な方法を用いたケースとしては、芳香族アミノ酸経路に入ってくる生合成を増加させるためにトランスケトラーゼ（ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ）をコードするｔｋｔＡ遺伝子や、ガラクトースパーミアーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅｐｅｒｍｅａｓｅ）をコードするｇａｌＰ遺伝子を強化してエリトロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ：Ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ-４-Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）やホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ：ＰｈｏｓｐｏＥｎｏｌＰｙｒｕｖａｔｅ）の供給をそれぞれ増加させ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸（ＤＡＨＰ：３-ＤｅｏｘｙＤ-ａｒｏｂｉｎｏ-ｈｅｐｔｕｌｏｓｏｎａｔｅ-７-ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）合成酵素のフィードバック阻害を解除して芳香族経路を強化するような戦略を導入した菌株（ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.,(１９９６)１４:２５０-２５６, ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ (２００９) ８：１９）、あるいは、トリプトファンオペロン遺伝子をベクター若しくは染色体の内部にさらに導入した菌株（Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.,(１９８２) ４３:２８９-２９７, Ａｐｐｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.,(１９９３)４０:３０１-３０５）などが挙げられ、種々のアプローチがある。
しかしながら、生合成酵素のフィードバック阻害を解除するとともにトリプトファンオペロンを導入しても、オペロン遺伝子の転写レベルで抑制及び減衰などの調節機序が存在するため、当該遺伝子を強化した分だけトリプトファンの歩留まりが増加しないという難点があった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】大韓民国登録特許第１９８７−０００１８１３号

【特許文献2】大韓民国登録特許第０９４９３１２号

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.(１９９１) １７３,２３２８-２３４０）

【非特許文献2】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ., (１９８８) ２６３:６０９-６１２）

【非特許文献3】Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.,(１９８２)４３:２８９-２９７

【非特許文献4】Ａｐｐｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.,(１９９３)４０:３０１-３０５

【非特許文献5】Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.,(１９９６) １４:２５０-２５６）

【非特許文献6】ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.,(１９９６)１４:２５０-２５６

【非特許文献7】ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ (２００９) ８：１９）

【非特許文献8】Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.,(１９８２) ４３:２８９-２９７

【非特許文献9】Ａｐｐｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.,(１９９３)４０:３０１-３０５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明者らは、Ｌ−トリプトファンを産生する菌株でオペロン遺伝子の転写レベルの抑制及び減衰を解除する方法及びこれを用いてトリプトファン生合成酵素を強化する方法を開発するために鋭意努力した。さらに、本発明者らは、種々のトリプトファン産生菌株がトリプトファンオペロンを強化することにより、中間物質であるアントラニル酸塩の蓄積に起因して歩留まりが上がらないという問題を解決するために、トリプトファンオペロン遺伝子のうちアントラニル酸塩合成酵素（ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ、ＴｒｐＥ）をコードする遺伝子を除く残りの遺伝子群のみをフィードバック阻害や抑制機序などの調節機序が解除された形で発現させてトリプトファンの産生歩留まりは上がり、アントラニル酸塩の蓄積は低減されたトリプトファン産生菌株を作製するに至った。
本発明の目的は、トリプトファンオペロンの抑制及び減衰調節が解除され、アントラニル酸塩の蓄積が低減されるように変形された、Ｌ−トリプトファンの産生能が強化されたエシェリキア属微生物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記エシェリキア属微生物を用いてＬ−トリプトファンを産生する方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

前記目的を達成するために、本発明は、内在的トリプトファンオペロンにおいて、配列番号１の塩基配列を有する発現調節部位のうち配列番号２の塩基配列を有するリーダペプチド（leader peptide）の全体又は一部が欠損されてＬ−トリプトファンの産生能が強化されたＬ−トリプトファンを産生する組換えエシェリキア属微生物を提供する。
発明は、また、前記組換えエシェリキア属微生物を培養する段階を含むことを特徴とするＬ−トリプトファンの産生方法を提供する。

【発明の効果】

【0007】

本発明により製造された組換え微生物は、アントラニル酸塩の過多蓄積という現象を解消し、Ｌ−トリプトファンを高い歩留まりで産生するのに好適に用いられる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１は、大腸菌染色体内に存在するトリプトファンオペロン遺伝子とその調節部位及びこの明細書に記述された欠失の形を簡単に示す図である。Ａ）大腸菌染色体内に存在するトリプトファンオペロン遺伝子とその調節部位（Ｐｔｒｐ）Ｂ）Ｐｔｒｐ形Ｃ）リーダペプチドをコードする遺伝子ｔｒｐＬが欠失された形（ＤｔｒｐＬ）Ｄ）リーダペプチドをコードする遺伝子ｔｒｐＬ及び減衰調節因子が欠失された形（Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ）

【図2】図２は、トリプトファンオペロン発現調節部位の強度の測定のために用いられたｐＣＬ−ＧＦＰベクターを示す図である。

【図3】図３は、トリプトファン生合成遺伝子ｔｒｐＤＣＢＡを染色体内に導入してコピー数を増加するためのベクターｐＩＮＴ１７Ｅ−Ｐａｔｔ−ｔｒｐＤＣＢＡを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、内在的トリプトファンオペロンにおいて、配列番号１の塩基配列を有する発現調節部位のうち配列番号２の塩基配列を有するリーダペプチド（leader peptide）の全体又は一部が欠損された、Ｌ−トリプトファンの産生能が強化された組換えエシェリキア属微生物を提供する。

【0010】

前記「トリプトファンオペロン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｏｐｅｒｏｎ ｏｒ Ｔｒｐ ｏｐｅｒｏｎ）」という用語は、ｔｒｐＥＤＣＢＡ遺伝子をいずれも包括する全体オペロンを示し、配列番号９に記載されている塩基配列を有する。
本発明で使用可能なＬ−トリプトファン産生微生物は、Ｌ−トリプトファン産生能を有する微生物であれば、原核微生物のいずれも含む。例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及びブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物菌株が挙げられる。好ましくは、エシェリキア属に属する微生物であり、さらに好ましくは、大腸菌である。特に好ましくは、前記大腸菌は、アントラニル酸塩合成酵素（ｔｒｐＥ）、アントラニル酸塩ＰＲＰＰトランスフェラーゼ（ｔｒｐＤ）、ホスホリボシルアントラニル酸塩異性化酵素（ｔｒｐＣ）、トリプトファン合成酵素（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ）などのトリプトファン生合成酵素の活性が強化されながらフィードバック解除形の３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソン酸−７−リン酸合成酵素（ａｒｏＧ）を用い、３−デヒドロキナ酸塩合成酵素（ａｒｏＢ）、シキミ酸脱水素酵素（ａｒｏＥ）、シキミ酸リン酸化酵素（ａｒｏＬ）、５−エノール酸ピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ａｒｏＡ）、コリスミ酸合成酵素（ａｒｏＣ）などの芳香族生合成経路の酵素活性が強化され、トリプトファン生合成経路の中間物質であるセリンとＰＲＰＰの供給を強化するためにホスホグリセリン酸脱水素酵素（ｓｅｒＡ）若しくはケトール転移酵素（ｔｋｔＡ）の活性が強化され、芳香族経路の他の枝であるプレフェン酸脱水酵素、コリスミ酸ムターゼ（ｐｈｅＡ）若しくはプレフェン酸脱水素酵素、コリスミ酸ムターゼ（ｔｙｒＡ）とトリプトファンを分解したり再流入したりするトリプトファン加水分解酵素（ｔｎａＡ）、トリプトファントランスポータ（ｔｎａＢ、ｍｔｒ）の活性が除去される。
さらに好ましくは、本発明による組換え大腸菌ＣＡ０４−２００４（受託番号ＫＣＣＭ１１２４６Ｐ）である。

【0011】

前記内在的トリプトファンオペロンの「発現調節部位（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ）」という用語は、プロモータ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、リーダペプチド（ｌｅａｄｅｒｐｅｐｔｉｄｅ）及び内在的減衰調節因子（ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）が含まれている領域を意味し、好ましくは、配列番号１に記載されている塩基配列を有する。
前記「リーダペプチド（ｌｅａｄｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、遺伝子開始コドン上流の先導配列によりコードされる低分子量のペプチドを意味し、好ましくは、配列番号２に記載されている塩基配列を有する。これにより発現されるポリペプチドは、配列番号４に記載されているアミノ酸配列を有する。このリーダペプチドは、トリプトファンの濃度が高ければ、ヘアピン構造を形成することにより、内在的減衰調節因子の構造形成を促して転写を終結する。

【0012】

本発明における「欠損（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）」は、目的遺伝子の開始コドンに相当する塩基配列から終結コドンまでの塩基配列領域若しくはその調節部位塩基配列のうちの一部若しくは全部を染色体の内部から除去した形を意味する。
本発明は、また、配列番号３の塩基配列を有する内在的減衰調節因子（ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）の全体又は一部がさらに欠損されてＬ−トリプトファンの産生能が強化されたことを特徴とする組換えエシェリキア属微生物を提供する。
前記「内在的減衰調節因子（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）」という用語は、減衰機序を引き起こす発現調節部位のうちプロモータ及びリーダペプチドを除く配列番号３の塩基配列を有する領域を意味する。

【0013】

本発明は、さらに、トリプトファンオペロンがコードするタンパク質の活性がさらに強化された組換えエシェリキア属微生物を提供する。
本発明は、さらに、アントラニル酸塩合成酵素をコードするｔｒｐＥ遺伝子を除くトリプトファン生合成遺伝子群ｔｒｐＤＣＢＡによりコードされたタンパク質の活性がさらに強化されたことを特徴とする組換えエシェリキア属微生物を提供する。

【0014】

前記「トリプトファン生合成遺伝子群（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｃｌｕｓｔｅｒ）」という用語は、トリプトファンオペロンの遺伝子であるｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡのうちの２以上の組み合わせからなる遺伝子の形を意味する。好ましくは、配列番号１０の塩基配列を有するｔｒｐＤＣＢＡ遺伝子群であってもよく、ここで、前記ｔｒｐＤ遺伝子は、配列番号３７のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、前記ｔｒｐＣ遺伝子は、配列番号３８のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、前記ｔｒｐＢ遺伝子は、配列番号３９のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、前記ｔｒｐＡ遺伝子は、配列番号４０のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。

【0015】

トリプトファンオペロンのうちｔｒｐＥ遺伝子によりコードされるアントラニル酸塩合成酵素を除くトリプトファン生合成遺伝子群のみの活性を強化する理由は、トリプトファン産生菌株がトリプトファンオペロンを強化することにより中間物質であるアントラニル酸塩が蓄積される結果、歩留まりが上がらないという問題を解決するためである。
遺伝子の発現を強化する方法としては、１）染色体内又は細胞内のコピー数を増加する方法、２）染色体の自己プロモータをより強力な形の外来プロモータに置換したり活性が強化された形に変形したりする方法が挙げられる。

【0016】

前記コピー数を増加させる方法としては、遺伝子をベクターに導入して発現を強化する方法が挙げられる。本発明で使用可能なベクターは、プラスミドベクターであり、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などが挙げられる。本発明で使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターが挙げられる。好ましくは、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどが挙げられる。最も好ましくは、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＣＬ、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターが挙げられる。
一方、前記使用可能な外来プロモータとしては、ｔｒｃ、ｌａｃ、ｔａｃなど公知のプロモータが挙げられるが、これに制限されるものではない。また、染色体の自己プロモータをより強力な形に変形するために、上述したように、リーダペプチドの全体又は一部を欠損させてさらに内在的減衰調節因子の全体又は一部を欠損させてもよいが、これに制限されるものではない。

【0017】

本発明の好適な態様において、本発明は、内在的トリプトファンオペロンの配列番号１の塩基配列を有する発現調節部位のうち配列番号２の塩基配列を有するリーダペプチド（ｌｅａｄｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）の全体又は一部が欠損され、配列番号３の塩基配列を有する内在的減衰調節因子（ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）の全体又は一部が欠損されてＬ−トリプトファンの産生能が強化され、さらにアントラニル酸塩合成酵素をコードするｔｒｐＥ遺伝子を除くトリプトファン生合成遺伝子群ｔｒｐＤＣＢＡがコードするそれぞれ配列番号３７、３８、３９及び４０のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性を強化させて製造した、Ｌ−トリプトファンを産生する組換えエシェリキア属微生物を製造し、これを受託番号ＫＣＣＭ１１２４６Ｐで寄託した。

【0018】

本発明は、さらに、前記Ｌ−トリプトファンの産生能が強化された組換えエシェリキア属微生物を培養する段階を含むことを特徴とするＬ−トリプトファンの産生方法を提供する。
本発明の好適な態様において、本発明は、内在的トリプトファンオペロンにおいて、配列番号１の塩基配列を有する発現調節部位のうち配列番号２の塩基配列を有するリーダペプチド（ｌｅａｄｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）の全体又は一部が欠損され、配列番号３の塩基配列を有する内在的減衰調節因子（ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）の全体又は一部が欠損されてＬ−トリプトファンの産生能が強化され、さらに、アントラニル酸塩合成酵素をコードするｔｒｐＥ遺伝子を除くトリプトファン生合成遺伝子群ｔｒｐＤＣＢＡの発現を強化してトリプトファンオペロンがコードするタンパク質の活性が強化されて、Ｌ−トリプトファン産生能が強化された組換えエシェリキア属微生物を培養する段階を含む方法を提供する。

【0019】

本発明の微生物の培養に用いられる培地は、通常のエシェリキア属微生物の培養に用いられる培地であればいずれも使用可能であるが、このとき、その他の培養条件として、本発明の微生物の要求条件を適切に満たさなければならない。好ましくは、本発明の微生物を適当な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地内で好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節しながら培養する。
このとき、炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物、糖アルコール、グリセロール、ピルビン酸、乳酸及びクエン酸などのアルコール及び有機酸、グルタミン酸、メチオニン及びリシンなどのアミノ酸などが挙げられ、澱粉加水分解物、糖みつ、廃糖みつ、米糠、キャッサバ、サトウキビ残渣及びトウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができる。好ましくは、前記有機栄養源は、グルコース及び殺菌された前処理糖みつ（すなわち、還元糖に転換された糖みつ）などの炭水化物であり、その他の適正量の炭素源を制限なしに様々に用いることができる。

【0020】

窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムなどの無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸及びペプトン、ＮＺ−アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麥芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物など有機窒素源が挙げられ、これらの窒素源は単独で又は組み合わせて用いることができる。
前記培地には、リン源（ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｓｏｕｒｃｅｓ）としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又は対応するナトリウム含有塩が含まれる。
無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン及び炭酸カルシウムなどが挙げられ、これらに加えて、アミノ酸、ビタミン及び適切な前駆体などが含まれてもよい。これらの培地又は前駆体は、培養物に回分式又は連続式で添加することができる。

【0021】

培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸などの化合物を培養物に適切な方式で添加して培養物のｐＨを調整してもよい。
さらに、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を添加して気泡生成を抑制してもよい。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素又は酸素含有気体を注入してもよい。嫌気及び微好気状態を維持するために気体を注入しなくてもよく、若しくは、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよい。

【0022】

培養物の温度は、通常は２７℃〜３７℃、好ましくは３０℃〜３５℃である。培養期間は、目的物質の目標生産量が得られるまで続けてもよく、好ましくは１０〜１００時間である。
本発明の前記培養段階で産生されたＬ−アミノ酸は、さらに精製又は回収する段階を含んでいてもよく、前記精製又は回収に際しては、本発明の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式又は流加式培養方法などにより当該分野で周知の好適な方法を用いて培養液から目的とするＬ−アミノ酸を精製又は回収することができる。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0023】

実施例１：トリプトファン生合成発現調節部位の解除のためにリーダペプチドが除去された形の発現調節部位とＧＦＰ融合ベクターの作製
図１に示すように、プロモータ（Ｐ）、リーダペプチド（Ｌ）及び減衰調節因子（Ａ）からなるトリプトファンオペロンの発現調節部位のうちリーダペプチド（Ｌ）をコードする遺伝子であるｔｒｐＬが欠損された発現調節部位（以下、「ＤｔｒｐＬ」と称する；図１におけるＣに相当する）を増幅するために、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）から購買した大腸菌Ｗ３１１０菌株の染色体（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ ＡＣ００００９１）を鋳型として重合酵素連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ；以下、「ＰＣＲ法」と称する。）により増幅した。

【0024】

具体的に、プライマー１及びプライマー２を用いて９４℃で１分間の変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合の条件ををＰｆｕポリメラーゼで３０回繰り返し行うＰＣＲ法により５’領域にＫｐｎＩ制限酵素サイトを有する１５５ｂｐの断片を増幅した。第二に、プライマー３及びプライマー４を用いて上記のＰＣＲ法により３’領域にＥｃｏＲＶ制限酵素サイトを有する１０５ｂｐの断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＡｌｌ^Ｒ Ｅｘｐｉｎ^ＴＭＧＥＬ ＳＶキット（大韓民国ソウル）で分離した後、交差ＰＣＲのための鋳型として用いた。

【0025】

前記ＤｔｒｐＬを作製するために、プライマー１及びプライマー４を用いて上記のようにして得られた両ＤＮＡ断片を鋳型として交差ＰＣＲを行った。具体的に、上記のＰＣＲ法により２４５ｂｐの断片を増幅した（配列番号５）。増幅された断片は、制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＶで処理した後、同じ酵素で処理されたｐＣＬ１９２０ＧＦＰ（配列番号８）でライゲーション（ligation）することによりｐＣＬ−ＤｔｒｐＬ−ＧＦＰを作製した。

【0026】

トリプトファンオペロンの発現調節部位のうちリーダペプチド（Ｌ）及び減衰調節因子（Ａ）をコードする遺伝子部位が一緒に欠損された形（以下、「Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ」と称する。）を増幅するために、前記大腸菌Ｗ３１１０菌株の染色体を鋳型としてプライマー１及びプライマー５を用いて前記ＰＣＲ法により５’領域にＫｐｎＩを有し、且つ、３’領域にＥｃｏＲＶ制限酵素サイトを有する１４８ｂｐの断片を増幅した（配列番号６）。増幅された断片は、制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＶで処理した後、同じ酵素で処理されたｐＣＬ１９２０ＧＦＰでライゲーションすることによりｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ＧＦＰを作製した。

【0027】

また、今後の実験で対照群として用いるための野生型発現調節部位を有するベクターを作製するために、大腸菌Ｗ３１１０菌株の染色体を鋳型としてプライマー１及びプライマー４を用いて上記のＰＣＲ法により５’領域にＫｐｎＩを有し、且つ、３’領域にＥｃｏＲＶ制限酵素サイトを有する２９０ｂｐの断片を増幅した。増幅された断片は、制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＶで処理した後、同じ酵素で処理されたｐＣＬ１９２０ＧＦＰでライゲーションすることによりｐＣＬ−Ｐｔｒｐ−ＧＦＰを作製した。

【0028】

プライマー１
５’ＴＴＡＧＧＴＡＣＣＧＧＣＧＣＡＣＴＣＣＣＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡ３’（配列番号１１）
プライマー２
５’ＡＣＴＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＧＡＴＡＣＣＣＴＴＴＴＴＡＣＧＴ３’（配列番号１２）
プライマー３
５’ＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧ３’（配列番号１３）
プライマー４
５’ＡＡＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＴＡＴＴＣＴＣＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴ３’（配列番号１４）
プライマー５
５’ＡＡＴＧＡＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＴＴＡＣＧＴＧＡＡＣＴＴＧ３’（配列番号１５）

【0029】

実施例２：ＧＦＰの発現量の測定
上述した実施例１に従い作製されたｐＣＬ−ＤｔｒｐＬ−ＧＦＰ、ｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ＧＦＰ及びｐＣＬ−Ｐｔｒｐ−ＧＦＰベクターを野生型菌株である大腸菌Ｗ３１１０とトリプトファン産生菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２Ｐに形質転換方法によりそれぞれ導入した後にＧＦＰの強度を測定した。

【0030】

この実施例に用いられた母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２Ｐ（大韓民国登録特許１０−０７９２０９５）は、Ｌ−フェニルアラニン産生能を有する大腸菌変異株（ＫＦＣＣ１００６６、大韓民国特許１９８５−０００１２３２）から由来した菌株であり、染色体上のトリプトファン要求性が解除され、ｐｈｅＡ、ｔｒｐＲ、ｍｔｒ及びｔｎａＡＢ遺伝子が不活性化され、ａｒｏＧ、ｔｒｐＥ遺伝子が変異されたことを特徴とするＬ−トリプトファン産生能を有する組換え大腸菌である。
具体的には、２５０ｍｌのフラスコに準備された２５ｍｌのＭ９培地（０．５％グルコース及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物を添加し、ＫＣＣＭ１０８１２の場合には０．１ｇ／Ｌチロシン、０．１ｇ／Ｌフェニルアラニンをさらに添加する）に菌体を１／１００（ｖ／ｖ）接種し、３７℃で培養して当該ＯＤから遠心分離により菌体を回収し、回収された菌体は１ｘＴＥで１回洗浄してＧＦＰの測定に用いた。ＧＦＰの測定は、Synergy HTマルチモード・マイクロプレーン・リーダー（米国バイオテック社製）を用いて行った。
測定結果を表１に示す。ＯＤ１とＯＤ３は、それぞれ培養液を適正な希釈濃度に希釈した後、島津社（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）のＵＶミニ−１２４０（ＵＶ ｍｉｎｉ-１２４０）吸光計を用いて６００ｎｍで測定したＯＤ値を示す。

【0031】

表１に示すように、野生型であるＷ３１１０菌株の場合、Ｐｔｒｐの相対強度を１としたとき、リーダペプチドと減衰調節因子が除去されたＤｔｒｐ＿ａｔｔの相対強度が、ＯＤ値が１である場合（ＯＤ１）には約７倍、ＯＤ値が３である場合（ＯＤ３）には１０倍と最も強く、リーダペプチドのみを除去したＤｔｒｐＬは野生型発現調節部位（Ｐｔｒｐ）に比べて約１．５〜２倍増加した。これに比べて、産生菌であるＫＣＣＭ１０８１２Ｐに導入したときには、Ｐｔｒｐの相対強度を１としたとき、リーダペプチドと減衰調節因子が除去されたＤｔｒｐ＿ａｔｔの相対強度が、ＯＤ値が１である場合（ＯＤ１）には約１９倍、ＯＤ値が３である場合（ＯＤ３）には２７倍と最も強く、リーダペプチドのみを除去したＤｔｒｐＬは野生型発現調節部位（Ｐｔｒｐ）に比べて約４倍増加した。この結果から、野生型の場合、産生菌に比べて弱いとはいえ、リーダペプチド若しくは減衰調節因子の除去により発現の増加が現れることを確認することができる。

【表1】

【0032】

実施例３：発現調節部位が置換されたトリプトファンオペロン（ｔｒｐＥＤＣＢＡ）を有するベクターの作製
実施例２の結果に基づいて、トリプトファンオペロン遺伝子をベクターの形に強化する大腸菌を作製するために、母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２Ｐの染色体を鋳型としてプライマー６及びプライマー７を用いて上記のＰＣＲ法により６５６４ｂｐの断片を増幅した（配列番号９）。

【0033】

増幅されたＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＡｌｌ^Ｒ Ｅｘｐｉｎ^ＴＭＧＥＬ ＳＶキット（大韓民国ソウル）により回収した後、制限酵素ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩで処理して準備した。準備されたＤＮＡ断片とクローニングのために、ｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ＧＦＰ、ｐＣＬ−ＤｔｒｐＬ−ＧＦＰ、ｐＣＬ−Ｐｔｒｐ＿ＧＦＰベクターはＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩで処理してＧＦＰ部分を除去した４２９１ｂｐに作製した。準備されたベクターとインサート（insert）は、ライゲーション後に形質転換方法により大腸菌ＤＨ５ａに導入し、この過程を経てｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ、ｐＣＬ−ＤｔｒｐＬ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ、ｐＣＬ−Ｐｔｒｐ＿ｔｒｐＥＤＣＢＡベクターをそれぞれ作製した。

【0034】

プライマー６
５’ＣＣＣＧＡＴＡＴＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＧＡＣ３’（配列番号１６）
プライマー７
５’ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＴＴＡＡＣＴＧＣＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＴＴＴ３’（配列番号１７）

【0035】

実施例４：発現調節部位が置換され、ｔｒｐＥが除外されたトリプトファン生合成遺伝子群（ｔｒｐＤＣＢＡ）を有するベクターの作製
上述した実施例１に従い作製されたｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ＧＦＰ、ｐＣＬ−ＤｔｒｐＬ−ＧＦＰ、ｐＣＬ−Ｐｔｒｐ＿ＧＦＰベクターのＧＦＰ領域をｔｒｐＤＣＢＡに置換するベクターを作製するために、ｐＣＬＤｔｒｐ＿ａｔｔ−ＧＦＰ、ｐＣＬ−ＤｔｒｐＬ−ＧＦＰ、ｐＣＬ−Ｐｔｒｐ＿ＧＦＰベクターをＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩで処理してＧＦＰ部分を除去した４２９１ｂｐに作製した。
次いで、トリプトファンオペロンのうちｔｒｐＤＣＢＡ遺伝子をベクターの形に強化する大腸菌を作製するために、母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２Ｐ染色体を鋳型としてプライマー７及びプライマー８を用いて上記のＰＣＲ法により５００２ｂｐの断片を増幅した（配列番号１０）。

【0036】

増幅されたＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＡｌｌ^Ｒ Ｅｘｐｉｎ^ＴＭＧＥＬ ＳＶキット（大韓民国ソウル）により回収した後、制限酵素ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩで処理して準備した。準備されたベクターとインサートは、ライゲーション後に形質転換方法により大腸菌ＤＨ５ａに導入し、その結果、ｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＤＣＢＡ、ｐＣＬ−ＤｔｒｐＬ−ｔｒｐＤＣＢＡ、ｐＣＬ−Ｐｔｒｐ＿ｔｒｐＤＣＢＡベクターをそれぞれ作製した。

【0037】

プライマー８
５’ＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴ３’（配列番号１８）

【0038】

実施例５：様々な発現調節部位を有するトリプトファンオペロン遺伝子の低いコピー数のベクターの作製
大腸菌内で低いコピー数で発現される代表的なベクターは、ｐＣＣ１ＢＡＣ（米国エピセンター社製）である。このベクターを用いてトリプトファンオペロン遺伝子を低いコピー数で発現させるために、上述した実施例３と４に従い作製されたｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ、ｐＣＬ−ＤｔｒｐＬ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ、ｐＣＬ−Ｐｔｒｐ＿ｔｒｐＥＤＣＢＡとｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＤＣＢＡ、ｐＣＬ−ＤｔｒｐＬ−ｔｒｐＤＣＢＡ、ｐＣＬ−Ｐｔｒｐ＿ｔｒｐＤＣＢＡベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。

【0039】

切断後に得られたＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動後にそれぞれのサイズ通りに切断してＧｅｎｅＡｌｌ^Ｒ Ｅｘｐｉｎ^ＴＭＧＥＬ ＳＶキット（大韓民国ソウル）を用いて回収し、ｐＣＣ１ＢＡＣのＨｉｎｄＩＩＩ位置が切断されたベクターを用いてライゲーション後に形質転換方法により大腸菌ＤＨ５ａに導入した。
導入された菌株は、ＬＢＣｍ固体培地（ＬＢ＋クロラムフェニコール寒天平板）に塗抹してＣｍ耐性を有する菌体を対象に確認を行い、ｐＢＡＣ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ、ｐＢＡＣ−ＤｔｒｐＬ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ、ｐＢＡＣ−Ｐｔｒｐ＿ｔｒｐＥＤＣＢＡとｐＢＡＣ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＤＣＢＡ、ｐＢＡＣ−ＤｔｒｐＬ−ｔｒｐＤＣＢＡ、ｐＢＡＣ−Ｐｔｒｐ＿ｔｒｐＤＣＢＡベクターを作製した。

【0040】

実施例６：ｐｈｅＡ遺伝子が不活性化された大腸菌菌株の作製
野生型大腸菌Ｗ３１１０菌株からトリプトファン産生菌株に近い菌株を作製するためにコリスミ酸ムターゼ（ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ ｍｕｔａｓｅ）／プレフェン酸脱水酵素（ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ、ＣＭ−ＰＤＴ）をコードするｐｈｅＡ遺伝子（ＮＣＢＩ ｇｅｎｅ ＩＤ：１２９３４４６７）を相同組換えによる欠失により不活性化させた。ＣＭ−ＰＤＴは、コリスミ酸（ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ）からフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）を生成する最初の段階にある酵素であり、ｐｈｅＡ遺伝子欠損はフェニルアラニン生合成経路を抑制するのに用いられた。このために、Ｄａｔｓｅｎｋｏ ＫＡらにより開発されたラムダレッドリコンビナーゼ（ｌａｍｂｄａ Ｒｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）を利用した突然変異作製法であるワンステップ弱化方法を用いた（Ｏｎｅ-ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ-１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ, Ｄａｔｓｅｎｋｏ ＫＡ, Ｗａｎｎｅｒ ＢＬ., Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ. ２０００ Ｊｕｎ６；９７(１２)：６６４０-５）。遺伝子内部への挿入を確認するためのマーカーとしては、ｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＰのクロラムフェニコール遺伝子を用いた（大韓民国公開特許：２００９−００７５５４９）。
前記ｐｈｅＡ遺伝子の一部分とｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＰベクターのクロラムフェニコール（Chloramphenicol）耐性遺伝子の一部の塩基配列を有するプライマー９及びプライマー１０を用いて、ベクターｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＰを鋳型とするＰＣＲ法により約１２００ｂｐの遺伝子断片を増幅した。

【0041】

プライマー９
５’−ＧＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＴＴＴＴＴＡＴＴＧＡＴＡＡＣＡＡＡＡＡＧＧＣＡＡＣＡＣＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧ−３’（配列番号１９）
プライマー１０
５’−ＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＴＴＴＣＡＡＴＴＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＧＴＡＣＣ−３’（配列番号２０）

【0042】

また、前記ＰＣＲ増幅により得られたＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル電気泳動後に溶出し、２次ＰＣＲの鋳型として用いた。２次ＰＣＲは、前記溶出した１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、１次ＤＮＡ断片の５’及び３’領域の２０ｂｐの相補的塩基配列と、さらにｐｈｅＡ遺伝子の５’及び３’領域を有するプライマー１１及びプライマー１２とをそれぞれ用いて、さらにＰＣＲ法により、約１３００ｂｐの遺伝子断片を増幅した。前記過程を経て得られたＤＮＡ断片は、０．８％アガロースゲル電気泳動後に溶出し、これを組換えに用いた。

【0043】

プライマー１１
５’−ＧＡＡＴＧＧＧＡＧＧＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＧＣＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＧＧＧＧＧＧＣ−３’（配列番号２１）
プライマー１２
５−ＧＧＣＡＣＣＴＴＴＴＣＡＴＣＡＧＧＴＴＧＧＡＴＣＡＡＣＡＧＧＣＡＣＴＡＣＧＴＴＣＴＣＡＣＴＴＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＣＣＴＴＣＡＴＴ−３’（配列番号２２）

【0044】

Ｄａｔｓｅｎｋｏ ＫＡらにより開発された方法によりｐＫＤ４６ベクターで形質転換されたＷ３１１０大腸菌を形質転換菌株（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ）として製造した後、形質転換は、ＰＣＲ法で得られた前記１３００ｂｐの遺伝子断片を流入することにより行った。ＬＢ培地でクロラムフェニコール耐性を有している菌株を選別した。さらにプライマー１３及びプライマー１４を用いたＰＣＲ法で得られたサイズが約２５００ｂｐの遺伝子断片でｐｈｅＡ遺伝子の欠失を確認した。

【0045】

プライマー１３
５’−ＴＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＧＣＣＡＡＣＧＣＧ−３’（配列番号２３）
プライマー１４
５’−ＡＡＡＧＣＣＧＣＧＴＧＴＴＡＴＴＧＣＧＴ−３’（配列番号２４）

【0046】

前記選別されたクロラムフェニコール耐性を有する１次組換え菌株からｐＫＤ４６ベクターを除去した後、ｐＪＷ１６８ベクターを導入してクロラムフェニコールマーカー遺伝子を菌体から除去した（Ｇｅｎｅ,(２０００)２４７, ２５５-２６４）。最終的に得られた菌体は、プライマー１３及びプライマー１４を用いたＰＣＲ法により得られた約５００ｂｐの増幅産物であり、そこに意図した通り欠失が生じた。なお、作製された菌株を大腸菌Ｗ３１１０ｔｒｐΔ１と命名した。

【0047】

実施例７：ｔｎａＡＢ遺伝子が不活性化された大腸菌菌株の作製
前記実施例６に従い作製された大腸菌Ｗ３１１０ｔｒｐΔ１菌株からトリプトファン分解酵素（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎａｓｅ）をコードするｔｎａＡとトリプトファンインポータ（ｉｍｐｏｒｔｅｒ）をコードするｔｎａＢ遺伝子のオペロン形であるｔｎａＡＢ（ＮＣＢＩｇｅｎｅ ＩＤ：１２９３３６００、１２９３３６０２）遺伝子を相同組換えにより欠失させた。前記欠損によりトリプトファンが生成された後に分解される経路を遮断し、生成されて培地内に分泌されたトリプトファンの細胞内への再移動を防いでトリプトファン産生菌株の特性を与えることができる。このために、実施例６の方法と同様にして、前記ｔｎａＡＢ遺伝子の一部分とｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＰ遺伝子のクロラムフェニコール耐性遺伝子の一部の塩基配列を有するプライマー１５及びプライマー１６を用いてベクターｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＰを鋳型としてＰＣＲ法により約１２００ｂｐの遺伝子断片を増幅した。さらに、前記ＰＣＲ増幅により得られたＤＮＡ断片は、実施例６の方法と同様にして、プライマー１７及びプライマー１８を用いたＰＣＲ法により１３００ｂｐの遺伝子断片を増幅した

【0048】

プライマー１５
５’−ＴＴＡＧＣＣＡＡＡＴＴＴＡＧＧＴＡＡＣＡＣＧＴＴＡＡＡＧＡＣＧＴＴＧＣＣＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＡＡＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧ−３’（配列番号２５）
プライマー１６
５’−ＡＴＧＡＡＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴＴＴＡＡＡＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＣＣＧＴＴＣＣＧＴＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＧＴＡＣＣ−３’（配列番号２６）
プライマー１７
５’−ＴＧＡＴＴＴＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＧＣＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＡＧＣＣＡＡＡＴＴＴＡＧＧＴＡＡＣＡ−３’（配列番号２７）
プライマー１８
５’−ＡＡＴＣＧＧＴＡＴＡＧＣＡＧＡＴＧＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＧＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＡＴＧＧＡ−３’（配列番号２８）

【0049】

ｔｎａＡＢ遺伝子を欠損させるために、実施例６の方法と同様にして、ベクターｐＫＤ４６が導入された大腸菌Ｗ３１１０ｔｒｐΔ１を形質転換菌株として製造した後、ＰＣＲ法により得られた１３００ｂｐの遺伝子断片を流入することにより形質転換した。ＬＢ培地でクロラムフェニコール耐性を有している菌株を選別した。さらにプライマー１９及びプライマー２０を用いたＰＣＲ法により得られたサイズが約５４００ｂｐの遺伝子断片でｔｎａＡＢ遺伝子の欠失を確認した。

【0050】

プライマー１９
５’−ＣＧＧＧＡＴＡＡＡＧＴＡＡＡＡＣＣＡＧＧ−３’（配列番号２９）
プライマー２０
５’−ＣＧＧＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＴＴＧＡＴＧＡ−３’（配列番号３０）

【0051】

クロラムフェニコール耐性を有する１次組換え菌株から、実施例６の方法と同様にしてｐＫＤ４６ベクターを除去した後、クロラムフェニコールマーカー遺伝子を菌体から除去した。最終的に得られた菌体は、プライマー１９及びプライマー２０を用いたＰＣＲ法により得られた約５５０ｂｐの増幅産物であり、そこに意図した通り欠失が生じた。なお、作製された菌株を大腸菌Ｗ３１１０ｔｒｐΔ２と命名した。

【0052】

実施例８：様々な発現様相を有するトリプトファンオペロンを有する菌株のＬ−トリプトファン産生性の確認
上述した実施例３、４及び５に従い作製されたベクターを導入した大腸菌の効果の評価を、実施例６及び７に従い作製されたＷ３１１０ｔｒｐΔ２を母菌株として用い、グルコースを炭素源として用いて行った。
力価の評価のために菌体を白金耳で接種した後、ＬＢ固体培地で一晩培養し、下記表２に示す組成からなる２５ｍｌのフラスコ力価培地に一白金耳ずつ接種した。菌株の接種後に３７℃、２００ｒｐｍで４８時間培養し、それから得られた結果を表３に示す。全ての結果は、３つのフラスコ結果の平均値で示す。

【表2】

【表3】

【0053】

前記表３の結果から明らかなように、母菌株である大腸菌Ｗ３１１０ｔｒｐΔ２に種々のベクターを組み合わせて導入したとき、トリプトファンオペロンのみを強化し続ければ、アントラニル酸塩が蓄積されてしまう結果、トリプトファン歩留まりに肯定的な効果を奏さない。Ｔｒｐオペロンを強化するとともに、ｔｒｐＤＣＢＡを強化するように変形された菌株は、トリプトファンオペロンのみが強化されたときよりもアントラニル酸塩の蓄積が低減される結果、トリプトファン歩留まりには肯定的な効果を示すことが分かる。このため、蓄積されたアントラニル酸塩の低減がトリプトファン産生菌株ではＬ−トリプトファンの最終的な歩留まりを高めるための最善の方法であることを確認した。

【0054】

実施例９：様々な発現様相を示すトリプトファンオペロンを有する菌株のＬ−トリプトファン産生性の確認
実施例３、実施例４及び実施例５に従い作製されたベクターを下記表５のように組み合わせ、トリプトファン産生菌株である母菌株の大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２Ｐに導入してグルコースを炭素源として用いて力価評価を行った。実施例８の結果から明らかなように、トリプトファンオペロンの強化とともに、ｔｒｐＤＣＢＡの強化も重要であると認められ、トリプトファンを産生する産生菌株における効果を検証しようとした。
力価の評価のために菌体を白金耳で接種した後、ＬＢ固体培地で一晩培養し、下記表４に示す組成からなる２５ｍｌのフラスコ力価培地に一白金耳ずつ接種した。菌株の接種後に３７℃、２００ｒｐｍで４８時間培養し、それから得られた結果を表５に示す。全ての結果は、３つのフラスコ結果の平均値で示す。

【表4】

【表5】

＊３３時間測定値
＊＊４８時間測定値

【0055】

前記表５の結果から明らかなように、母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２Ｐに種々のベクターを組み合わせて導入したとき、トリプトファンオペロンのみを強化し続ければ、アントラニル酸塩が蓄積されてしまう結果、成長がやや鈍化されてトリプトファン歩留まりに肯定的な効果を奏さない。これに対し、ｐＣＬベクターでオペロンを強化し、ｐＢＡＣベクターでｔｒｐＤＣＢＡを強化するように変形された菌株は、トリプトファンオペロンのみが強化されたときよりもアントラニル酸塩の蓄積が低減される結果、トリプトファン歩留まりには肯定的な効果を示すことが分かる。このため、蓄積されたアントラニル酸塩の低減がトリプトファン産生菌株ではＬ−トリプトファンの最終的な歩留まりを高めるための最善の方法であることを確認した。

【0056】

実施例１０：染色体内トリプトファン生合成遺伝子群ｔｒｐＤＣＢＡのコピー数が増加され、アントラニル酸塩が低減された菌株の作製
実施例９における結果に基づいて、染色体内トリプトファン生合成遺伝子群ｔｒｐＤＣＢＡのコピー数を増加するためにベクターを作製した。
実施例５で言及されたｐＣＬ−Ｄｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＤＣＢＡからＤｔｒｐ＿ａｔｔ−ｔｒｐＤＣＢＡ領域を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断して、同じ制限酵素で切断したｐＩＮＴ１７ＥにライゲーションすることによりｐＩＮＴ１７Ｅ−Ｐａｔｔ−ｔｒｐＤＣＢＡを得た。次いで、これをトリプトファン産生菌株として母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２Ｐに導入してトリプトファン生合成遺伝子群ｔｒｐＤＣＢＡのコピー数を増加するために、実施例６でのように、Ｄａｔｓｅｎｋｏ ＫＡらにより開発されたラムダレッドリコンビナーゼ（lambda Red recombinase）を利用した突然変異作製法であるワンステップ不活性化方法に用いられるｐＫＤ４６を用いた。遺伝子内部への挿入を確認するためのマーカーとしては、ｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＰのクロラムフェニコール遺伝子を用いた。先ず、ｐＫＤ４６を導入した母菌株にｐＩＮＴ１７Ｅ−Ｐａｔｔ−ｔｒｐＤＣＢＡを形質転換した後、３７℃で１日〜２日間培養してコロニーを得た。得られたコロニーを対象に、染色体内部に正常に挿入されたか否かをプライマー２１及びプライマー２２を用いてＰＣＲ法により約２０００ｂｐの断片を増幅して確認した。

【0057】

プライマー２１
５’ＴＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＡＣＧＡＧＣＡＧＧ３’（配列番号３１）
プライマー２２
５’ＡＧＴＴＣＣＧＧＣＡＴＡＣＡＡＣＣＧＧＣＴＴ３’（配列番号３２）

【0058】

クロラムフェニコール耐性を有する１次組換え菌株からｐＫＤ４６を除去した後、ｐＪＷ１６８を導入してクロラムフェニコールマーカー遺伝子を菌体から除去した（Gene,(2000)247,255-264）。プライマー２３及びプライマー２４を用いてＰＣＲ法により得られた約５０００ｂｐの増幅産物とプライマー２５及びプライマー２６を用いて得られた約６５００ｂｐの増幅産物により、染色体の内部に内在的に存在するトリプトファンオペロンに続いて、連続してｔｒｐＤＣＢＡが存在していることを確認し、これをＫＣＣＭ１０８１２Ｐ／ｔｒｐＤＣＢＡと命名した。

【0059】

プライマー２３
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ３’（配列番号３３）
プライマー２４
５’ＣＴＧＴＴＧＧＧＣＧＧＡＡＡＡＡＴＧＡＣ３’（配列番号３４）
プライマー２５
５’ＴＧＡＴＣＧＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＧＡＣＧ３’（配列番号３５）
プライマー２６
５’ＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ３’（配列番号３６）

【0060】

このようにして得られたｔｒｐＤＣＢＡコピー数の増加菌株にさらに１コピーを挿入するために、このようにして得られたＫＣＣＭ１０８１２Ｐ／ｔｒｐＤＣＢＡ菌株にｐＫＤ４６を導入し、ｐＩＮＴ１７Ｅ−Ｐａｔｔ−ｔｒｐＤＣＢＡベクターをＫＣＣＭ１０８１２Ｐ／ｔｒｐＤＣＢＡ／ｐＫＤ４６に導入して上述した方法に従い染色体内に２コピーが挿入された菌株を作製した。作製された菌株は、ＫＣＣＭ１０８１２Ｐ／２ｔｒｐＤＣＢＡと命名した。これを２０１１年１２月２９日付けで韓国ソウル特別市西大門区弘済１洞３６１−２２１番地所在の国際寄託機関である韓国種菌協会付設韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ１１２４６Ｐで寄託した。

【0061】

実施例１１：トリプトファン生合成遺伝子群ｔｒｐＤＣＢＡによりコードされるタンパク質の活性が増加されたＬ−トリプトファン産生菌株の効果の確認
実施例１０に記述されている方法に従い、トリプトファン産生菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２ＰにｔｒｐＤＣＢＡをさらに導入して、トリプトファン生合成経路の一部の酵素の活性が強化されたＫＣＣＭ１０８１２Ｐ／ｔｒｐＤＣＢＡの力価の評価をグルコースを炭素源として用いて行った。
力価の評価のために菌体を白金耳で接種した後、ＬＢ固体培地で一晩培養し、下記表４に示す組成からなる２５ｍｌのフラスコ力価培地に一白金耳ずつ接種した。菌株の接種後に３７℃、２００ｒｐｍで４８時間培養し、それから得られた結果を表６に示す。全ての結果は、３つのフラスコ結果の平均値で示す。

【表6】

＊３３時間測定値
＊＊４８時間測定値

【0062】

前記表６から明らかなように、染色体の内部にトリプトファン生合成遺伝子群ｔｒｐＤＣＢＡを１コピー追加したときにはアントラニル酸塩の濃度が３９％下がるが、２コピーを追加したときには母菌株に比べて６９％下がるという結果が得られた。
また、Ｌ−トリプトファン濃度の場合、それぞれ１０％、１３％増加する結果が得られた。表６に示すように、ｔｒｐＤＣＢＡのコピーを増加したときにグルコースの消耗速度がやや下がる場合もあるが、全体的に見たとき、トリプトファン生合成遺伝子群の強化がＬ−トリプトファン濃度の増加とアントラニル酸塩濃度の低減に良好な影響を及ぼすことを確認した。

【0063】

以上の説明から、本発明が属する技術分野における当業者は、本発明がその技術的思想や必須的な特徴を変更することなく異なる具体的な形態で実施可能であるということが理解できる筈である。これと関連して、以上述べた実施形態は、あらゆる面において例示的なものであり、限定的なものではないと理解されるべきである。本発明の範囲は、前述した詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲並びにその等価概念から導き出されるあらゆる変更又は変形が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
［受託番号］
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１２４６Ｐ
受託日：２０１１１２２９

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]