特許 6476194 二重特異性抗ハプテン／抗血液脳関門受容体抗体、それらの複合体、及び血液脳関門シャトルとしてのそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6476194

(24)【登録日】2019年2月8日

(45)【発行日】2019年2月27日

(54)【発明の名称】二重特異性抗ハプテン／抗血液脳関門受容体抗体、それらの複合体、及び血液脳関門シャトルとしてのそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/68 20170101AFI20190218BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20190218BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190218BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20190218BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/68ZNA

   A61P25/00

   A61P35/00

   A61K39/395 N

【請求項の数】8

【全頁数】177

(21)【出願番号】特願2016-544409(P2016-544409)

(86)(22)【出願日】2014年12月29日

(65)【公表番号】特表2017-511301(P2017-511301A)

(43)【公表日】2017年4月20日

(86)【国際出願番号】EP2014079351

(87)【国際公開番号】WO2015101586

(87)【国際公開日】20150709

【審査請求日】2017年12月15日

(31)【優先権主張番号】14150092.6

(32)【優先日】2014年1月3日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】14174045.6

(32)【優先日】2014年6月26日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】特許業務法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】ブリンクマン，ウルリッヒ

(72)【発明者】

【氏名】ジョルジュ，ギー

(72)【発明者】

【氏名】ムンディグル，オラフ

(72)【発明者】

【氏名】ニーヴェーナー，イェンス

【審査官】 高橋 樹理

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００４／０６５５６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５３２１６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５０１１８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５３２１７４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４７／６８

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下を含む共有結合コンジュゲート：
ｉ）ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性及び血液脳関門受容体に特異的に結合する第２の結合特異性を有する二重特異性抗体、及び
ｉｉ）ハプテン化ペイロード、
ここで、ハプテン化ペイロードは、第１の結合特異性により特異的に結合され、
ここで、共有結合コンジュゲートは、ハプテン化ペイロードと、ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性の間に共有結合を有し、
ここで、ハプテン化ペイロードは、ビオチン化ペイロード、テオフィリン化ペイロード、ジゴキシゲニン化ペイロード、カルボラン化ペイロード、フルオレセイン化ペイロード、ヘリカー化ペイロード、及びブロモデオキシウリジン化ペイロードをからなる群より選択され、
ここで、二重特異性抗体は、抗体のＣＤＲ２中のアミノ酸残基にシステイン残基を含み、ここで、ＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔに従って決定され、
共有結合が、抗体のＣＤＲ２中のシステイン残基とハプテン化ペイロード中のチオール基との間であり、
ＣＤＲ２が、重鎖ＣＤＲ２であり、システインが、Ｋａｂａｔナンバリングに従った位置５２ｂ又は５３にあり、
結合特異性は、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【請求項2】

請求項１記載のコンジュゲートであって、ここで、血液脳関門受容体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群より選択される。

【請求項3】

血液脳関門受容体が、トランスフェリン受容体又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８である、請求項１又は２記載のコンジュゲート。

【請求項4】

二重特異性抗体にエフェクター機能がない、請求項１〜３のいずれか一項記載のコンジュゲート。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか一項記載のコンジュゲートであって、ここで、二重特異性抗体は、以下を含む：
ａ）ハプテン化ペイロードのための１つの結合部位及び血液脳関門受容体のための１つの結合部位、又は
ｂ）ハプテン化ペイロードのための２つの結合部位及び血液脳関門受容体のための１つの結合部位、又は
ｃ）ハプテン化ペイロードのための１つの結合部位及び血液脳関門受容体のための２つの結合部位、又は
ｄ）ハプテン化ペイロードのための２つの結合部位及び血液脳関門受容体のための２つの結合部位。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれか一項記載のコンジュゲート及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬的製剤。

【請求項7】

医薬としての使用のための、請求項１〜５のいずれか一項記載のコンジュゲート。

【請求項8】

癌又は神経学的障害の処置のための、請求項１〜５のいずれか一項記載のコンジュゲート。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書において報告するのは、二重特異性抗ハプテン／抗血液脳関門受容体抗体、ハプテン化ペイロードを伴うそれらの非共有結合並びに共有結合複合体、及び血液脳関門シャトルとしての抗体の、並びにそれらの複合体の使用である。

【0002】

［発明の背景］
ポリペプチドの治療的適用についての主要なボトルネックは、それらの限定された溶解度、インビボでの安定性、短い血清半減期、及び血流からの速いクリアランスである。

【0003】

様々なアプローチが、これに対処するために報告されている。治療用ポリペプチドのＰＫ／安定性及び生物物理学的挙動を改善するための１つのアプローチは、それらを、ポリペプチドを安定化し、それを溶液中に保持し、その半減期を延長する実体に融合させることである。そのような実体の例は、ヒト血清アルブミン又はヒト免疫グロブリンＦｃ領域である。治療用ポリペプチドのＰＫ／安定性及び生物物理学的挙動を改善するための別のアプローチは、例えば、ＰＥＧ化又はＨＥＳ化による、ポリマーへの化学的又は酵素的コンジュゲーションである。

【0004】

ＵＳ ５，８０４，３７１には、ハプテン標識ペプチド及び検出の免疫学的方法におけるそれらの使用が報告されている。ジゴキシゲニン標識ペプチド（ブラジキニン）及び炎症組織におけるブラジキニンの化学発光酵素イムノアッセイへのその適用が、Decarie A., et al. (Peptides 15 (1994) 511-518)により報告されている。

【0005】

ＷＯ ２００４／０６５５６９において、多機能抗体が報告されている。

【0006】

ＷＯ ２０１１／００３７８０において、二重特異性ジゴキシゲニン結合抗体が報告されている。

【0007】

ＷＯ ２０１２／０９３０６８において、ペプチドにコンジュゲーションされた、抗ＤＩＧ抗体及びジゴキシゲニンの複合体の医薬的組成物が報告されている。

【0008】

ＷＯ ２０１４／００６１２４において、抗ハプテン抗体及びハプテン化ペイロードの共有結合複合体が報告されている。

【0009】

モノクローナル抗体は、神経学的疾患又は中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の処置のための膨大な治療的潜在力を有するが、しかし、脳中へのそれらの通過は、血液脳関門（ＢＢＢ）により制限される。過去の試験では、血流中に循環するＩｇＧの非常に小さな割合（約０．１%）が、ＢＢＢを通じて、ＣＮＳ中へ横切ることが示されており（Felgenhauer, K., Klin. Wschr. 52 (1974) 1158-1164）、ここで、抗体のＣＮＳ濃度は、頑強な効果を可能にするのに不十分であり得る。

【0010】

血液脳関門受容体（ＢＢＢＲ）に特異的に結合して一価になる抗体又は抗体フラグメントの結合様式を定義することにより、ＢＢＢトランスサイトーシス特性を伴うＢＢＢシャトルモジュールを得ることができることが報告されている（ＷＯ ２０１４／０３３０７４）。

【0011】

中程度の親和性でＢＢＢＲに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを使用することにより、ＢＢＢトランスサイトーシス特性を伴うＢＢＢシャトルモジュールを得ることができることが報告されている（ＷＯ ２０１２／０７５０３７）。

【0012】

異なるｐＨ値で決定されたＥＣ５０値の特定の比率を有する抗体又は抗体フラグメントを使用することにより、ＢＢＢトランスサイトーシス特性を伴うＢＢＢシャトルモジュールを得ることができることが報告されている（ＷＯ ２０１２／１４３３７９）。

【0013】

Pardridge, W. M.は、分子トロイ木馬を用いた、脳への送達のためのバイオ医薬品のリエンジニアリングを報告している（Bioconjug. Chem. 19 (2008) 1327-1338）。ＢＢＢを横切る薬物の受容体媒介輸送が、Feng Ji-Ming et al.により報告されている（Neurometh. 45 (2010) 15-34）。Zhou, Q-H. et al.は、ＩｇＧアビジン融合タンパク質を用いた、脳へのペプチド放射性医薬品の送達を報告している（Bioconjug. Chem. 22 (2011) 1611-1618）。マウスにおいて、血液脳関門を横切る、Ｆａｂ’カーゴを伴う抗トランスフェリン受容体抗体のトランスサイトーシスの試験が、Manich, G.により報告されている（Eur. J. Pharm. Sci. 49 (2013) 556-564）。

【発明の概要】

【0014】

本明細書において報告するのは、ハプテンについての第１の結合特異性及び血液脳関門受容体（ＢＢＢＲ）についての第２の結合特異性を伴う二重特異性抗体である血液脳関門シャトルモジュール（ＢＢＢシャトルモジュール）である。そのようなＢＢＢシャトルモジュールは、血液脳関門上のトランスサイトーシス可能な細胞表面標的（例えばＴｆＲ、ＬＲＰ又は他の標的、ＢＢＢＲなど）を認識し、ハプテン化ペイロードに同時に結合する。

【0015】

結合価、抗体フォーマット、ＢＢＢＲ結合親和性に関するさらなる要求を満たさなくてもよいことが見出されている。

【0016】

さらに、本明細書において報告する二重特異性抗体ベースのシャトルモジュールが、ハプテン化ペイロードのトランスサイトーシスを媒介するために、血液脳関門の内皮細胞から放出されることが要求されないことが見出されている。代わりに、ハプテン化ペイロードは、ＢＢＢＲへの結合時に二重特異性抗体ベースのシャトルモジュールにより複合体化され／それに結合し、ＢＢＢ細胞内で、即ち、細胞内小胞システムにおいて二重特異性抗体ベースのシャトルモジュールから放出され、シャトルモジュールから分離され、その後、ＢＢＢ細胞から脳中へエキソサイトーシスされ、ＢＢＢ細胞中に二重特異性抗体を残す。これは、共有結合複合体を使用する場合にも適用可能である。

【0017】

本明細書において報告する二重特異性抗体ベースのシャトルモジュールは、結合特異性の価数並びにＢＢＢＲ結合特異性の親和性の点で非常に変動している。同時に、それによって、シャトルモジュールからのペイロード放出が可能になる。

【0018】

本明細書において報告する一態様は、ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性及び血液脳関門受容体に特異的に結合する第２の結合特異的を含む二重特異性抗体である。

【0019】

本明細書において報告する一態様は、ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性及び血液脳関門受容体に特異的に結合する第２の結合特異的を有する二重特異性抗体及びハプテン化ペイロード（それにおいて、ハプテン化ペイロードは、第１の結合特異性により特異的に結合される）を含む非共有結合複合体である。

【0020】

本明細書において報告する一態様は、以下を含む共有結合コンジュゲートである： ｉ）二重特異性抗体（ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性及び血液脳関門受容体に特異的に結合する第２の結合特異的を有する）並びにｉｉ）ハプテン化ペイロード（それにおいて、ハプテン化ペイロードは、第１の結合特異性により特異的に結合され、それは、ハプテン化ペイロードと、ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性の間に共有結合を有する）。

【0021】

一実施形態において、ハプテン化ペイロードは、ビオチン化ペイロード、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、ジゴキシゲニン化ペイロード、カルボラン化（ｃａｒｂｏｒａｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、ヘリカー化（ｈｅｌｉｃａｒｙｌａｔｅｄ）ペイロード、及びブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードを含む群より選択される。

【0022】

本明細書において報告する一態様は、以下を含む共有結合コンジュゲートである：
ｉ）ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性及び血液脳関門受容体に特異的に結合する第２の結合特異性を有する二重特異性抗体、並びに
ｉｉ）ハプテン化ペイロード、
それにおいて、ハプテン化ペイロードは、第１の結合特異性により特異的に結合され、
それにおいて、共有結合コンジュゲートは、ハプテン化ペイロードと、ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性の間に共有結合を有し、並びに
それにおいて、ハプテン化ペイロードは、ビオチン化ペイロード、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、ジゴキシゲニン化ペイロード、カルボラン化（ｃａｒｂｏｒａｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、ヘリカー化（ｈｅｌｉｃａｒｙｌａｔｅｄ）ペイロード、及びブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードからなる群より選択される。

【0023】

全ての態様の一実施形態において、共有結合コンジュゲートは、非恒久的な共有結合コンジュゲートである。一実施形態において、共有結合コンジュゲートは、細胞内で切断可能な共有結合コンジュゲートである。

【0024】

一実施形態において、血液脳関門受容体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群より選択される。

【0025】

一実施形態において、二重特異性抗体にはエフェクター機能がない。

【0026】

一実施形態において、二重特異性抗体は以下を含む：
ａ）ハプテン化ペイロードのための１つの結合部位及び血液脳関門受容体のための１つの結合部位、又は
ｂ）ハプテン化ペイロードのための２つの結合部位及び血液脳関門受容体のための１つの結合部位、又は
ｃ）ハプテン化ペイロードのための１つの結合部位及び血液脳関門受容体のための２つの結合部位、又は
ｄ）ハプテン化ペイロードのための２つの結合部位及び血液脳関門受容体のための２つの結合部位。

【0027】

一実施形態において、二重特異性抗体は、抗体のＣＤＲ２中のアミノ酸残基にシステイン残基を含み、ここで、ＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔに従って決定される。

【0028】

一実施形態において、共有結合は、抗体のＣＤＲ２中のシステイン残基とハプテン化ペイロード中のチオール基の間である。

【0029】

本明細書において報告する一態様は、以下を含む共有結合コンジュゲートである：
ｉ）ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性及びトランスフェリン受容体に特異的に結合する第２の結合特異性を有する二重特異性抗体、並びに
ｉｉ）ハプテン化ペイロード、
それにおいて、ハプテン化ペイロードは、第１の結合特異性により特異的に結合され、
それにおいて、共有結合コンジュゲートは、ハプテン化ペイロードと、第１の結合特異性の重鎖ＣＤＲ２中の位置５２ｂ又は５３のシステイン残基の間にジスルフィド結合を有し、それにより、ナンバリングは、Ｋａｂａｔに従い、
それにおいて、ハプテン化ペイロードは、ビオチン化ペイロード、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、ジゴキシゲニン化ペイロード、カルボラン化（ｃａｒｂｏｒａｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、ヘリカー化（ｈｅｌｉｃａｒｙｌａｔｅｄ）ペイロード、及びブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードよるなる群より選択され、並びに
それにおいて、二重特異性抗体は、以下を含む：
ａ）ハプテン化ペイロードのための１つの結合部位及びトランスフェリン受容体のための１つの結合部位、又は
ｂ）ハプテン化ペイロードのための２つの結合部位及びトランスフェリン受容体のための１つの結合部位、又は
ｃ）ハプテン化ペイロードのための１つの結合部位及びトランスフェリン受容体のための２つの結合部位、又は
ｄ）ハプテン化ペイロードのための２つの結合部位及びトランスフェリン受容体のための２つの結合部位。

【0030】

一実施形態において、ハプテンは、ヌクレオチド又はヌクレオシドの誘導体又は類似体である。一実施形態において、ハプテンは、アミノ酸の誘導体又は類似体である。

【0031】

一実施形態において、血液脳関門受容体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群より選択される。

【0032】

一実施形態において、二重特異性抗体は、２つの結合部位を含む完全長抗体である。

【0033】

一実施形態において、二重特異性抗体は、１つ又は２つのｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂが融合されており、３つ又は４つの結合部位を含む完全長抗体である。

【0034】

一実施形態において、二重特異性抗体は抗体フラグメントである。一実施形態において、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）_２及びダイアボディより選択される。

【0035】

一実施形態において、二重特異性抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体である。

【0036】

一実施形態において、二重特異性抗体にはエフェクター機能がない。一実施形態において、二重特異性抗体は、機能的Ｆｃ領域を有さない。一実施形態において、二重特異性抗体は、Ｆｃ領域を有さない。一実施形態において、二重特異性抗体は、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇを伴うヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃ領域を有し、それにおいて、位置は、ＫａｂａｔのＦｃ領域ナンバリング（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス）に従って決定される。一実施形態において、二重特異性抗体は、変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇを伴うヒトＩｇＧ４サブクラスのＦｃ領域を有し、それにおいて、位置は、ＫａｂａｔのＦｃ領域ナンバリング（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス）に従って決定される。

【0037】

一実施形態において、二重特異性抗体は以下を含む：
ａ）ハプテン化ペイロードのための１つの結合部位及び血液脳関門受容体のための１つの結合部位、又は
ｂ）ハプテン化ペイロードのための２つの結合部位及び血液脳関門受容体のための１つの結合部位、又は
ｃ）ハプテン化ペイロードのための１つの結合部位及び血液脳関門受容体のための２つの結合部位、又は
ｄ）ハプテン化ペイロードのための２つの結合部位及び血液脳関門受容体のための２つの結合部位。

【0038】

以前の実施形態のｂ）及びｃ）の場合において、二重特異性抗体の１つの重鎖は、ホール変異を含み、それぞれの他の鎖は、ノブ変異を含む。

【0039】

１つの好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、ハプテン化ペイロードのための２つの結合部位及び血液脳関門受容体のための２つの結合部位を含む。

【0040】

一実施形態において、ハプテン化ペイロードは、ハプテンとペイロードの間にリンカーを含む。一実施形態において、リンカーはペプチドリンカーである。一実施形態において、リンカーは化学的リンカー（非ペプチドリンカー）である。

【0041】

抗ハプテン抗体へのハプテン化ペイロードの共有結合的カップリングにより、ペイロードの安定化及びＰＫ特性の改善を達成することができることが見出されている。

【0042】

本明細書において報告する一態様は、以下を含む、共有結合コンジュゲートの血液脳関門を横切ったハプテン化ペイロードの標的化送達のための使用である：
ｉ）ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性及び血液脳関門受容体に特異的に結合する第２の結合特異性を有する二重特異性抗体、及び
ｉｉ）ハプテン化ペイロード、
ここで、ハプテン化ペイロードは、第１の結合特異性により特異的に結合され、
ここで、共有結合コンジュゲートは、ハプテン化ペイロードと、ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性の間に共有結合を有し、並びに
ここで、ハプテン化ペイロードは、ビオチン化ペイロード、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、ジゴキシゲニン化ペイロード、カルボラン化（ｃａｒｂｏｒａｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、ヘリカー化（ｈｅｌｉｃａｒｙｌａｔｅｄ）ペイロード、及びブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードからなる群より選択される。

【0043】

一実施形態において、使用は、血液脳関門を横切る、遊離の(free)（即ち、単離された(isolated)）ハプテン化ペイロードの標的化送達用である。

【0044】

一実施形態において、血液脳関門受容体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群より選択される。

【0045】

一実施形態において、血液脳関門受容体は、トランスフェリン受容体又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８である。

【0046】

一実施形態において、二重特異性抗体にはエフェクター機能がない。

【0047】

一実施形態において、二重特異性抗体は以下を含む：
ａ）ハプテン化ペイロードのための１つの結合部位及び血液脳関門受容体のための１つの結合部位、又は
ｂ）ハプテン化ペイロードのための２つの結合部位及び血液脳関門受容体のための１つの結合部位、又は
ｃ）ハプテン化ペイロードのための１つの結合部位及び血液脳関門受容体のための２つの結合部位、又は
ｄ）ハプテン化ペイロードのための２つの結合部位及び血液脳関門受容体のための２つの結合部位。

【0048】

一実施形態において、二重特異性抗体は、抗体のＣＤＲ２中のアミノ酸残基にシステイン残基を含み、ここで、ＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔに従って決定される。

【0049】

一実施形態において、共有結合は、抗体のＣＤＲ２中のシステイン残基とハプテン化ペイロード中のチオール基の間である。

【0050】

全ての態様の一実施形態において、二重特異性抗体及びハプテン化ペイロードは、各々、官能基を含み、それにより、二重特異性抗体によるハプテン化ペイロードの結合時、共有結合が、ハプテン化ペイロードと二重特異性抗体の間に形成される。

【0051】

全ての態様の一実施形態において、二重特異性抗体は、抗体のＣＤＲ２中のアミノ酸残基に官能基を含み、ここで、ＣＤＲ２が、Ｋａｂａｔに従い決定される。一実施形態において、抗体のＣＤＲ２中のアミノ酸残基での官能基は、チオール基である。一実施形態において、二重特異性抗体は、抗体のＣＤＲ２中にシステインアミノ酸残基を含む。

【0052】

全ての態様の一実施形態において、ハプテン化ペイロードは、ハプテン中に、又は、リンカー中に存在する場合、ハプテンとペイロードの間に、官能基を含む。一実施形態において、官能基は、チオール、又はマレイミド、又はハロアセチルである。一実施形態において、ハプテン中の、又は、存在する場合、リンカー中の官能基は、チオール基である。

【0053】

一実施形態において、全ての態様の一実施形態において、共有結合は、抗体のＣＤＲ２中のシステイン残基とハプテン化ペイロード中のチオール基の間である。一実施形態において、共有結合はジスルフィド結合である。一実施形態において、共有結合はジスルフィド結合であり、それは、酸化還元活性剤の添加を伴わず形成される。

【0054】

全ての態様の一実施形態において、ＣＤＲ２は、ビオチン化ペイロード、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、ジゴキシゲニン化ペイロード、及びフルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードからなる群より選択されるハプテン化ペイロードの場合において、重鎖ＣＤＲ２である。一実施形態において、抗体の重鎖ＣＤＲ２中のシステイン残基は、Ｋａｂａｔの重鎖可変ドメインナンバリングに従った位置５２、又は位置５２ａ、又は位置５２ｂ、又は位置５２ｃ、又は位置５２ｄ、又は位置５３にある。一実施形態において、抗体の重鎖ＣＤＲ２中のシステイン残基は、Ｋａｂａｔの重鎖可変ドメインナンバリングに従った位置５２ａ、又は位置５２ｂ、又は位置５２ｃ、又は位置５３にある。１つの好ましい実施形態において、抗体の重鎖ＣＤＲ２中のシステイン残基は、Ｋａｂａｔの重鎖可変ドメインナンバリングに従った位置５２ｂに、又は位置５３にある。

【0055】

任意のペイロードを、ハプテン化ペイロードと抗体の重鎖ＣＤＲ２中のアミノ酸残基の間の共有結合の形成のための官能基を含むユニバーサルリンカーを用いた誘導体化時に、ハプテン化ペイロード中に使用することができることが見出されている。ユニバーサルリンカー中の官能基の場所は、抗体の重鎖ＣＤＲ２中の官能基の合成及び位置（ペイロードを変化させる場合）を再操作する必要がないという利点を有する。

【0056】

全ての態様の一実施形態において、ＣＤＲ２は、ヘリカー化（ｈｅｌｉｃａｒｙｌａｔｅｄ）ペイロードの場合において、軽鎖ＣＤＲ２である。一実施形態において、抗体の軽鎖ＣＤＲ２中のシステイン残基は、Ｋａｂａｔの軽鎖可変ドメインナンバリングに従った位置５１に、又は位置５５にある。１つの好ましい実施形態において、抗体の軽鎖ＣＤＲ２中のシステイン残基は、Ｋａｂａｔの軽鎖可変ドメインナンバリングに従った位置５５にある。

【0057】

任意のペイロードを、ヘリカー化（ｈｅｌｉｃａｒｙｌａｔｅｄ）ペイロードと抗体の軽鎖ＣＤＲ２中のシステイン残基の間の共有結合的なジスルフィド結合の形成のための官能基を含むシステインを用いたヘリカーアミノ酸配列の誘導体化時に、ヘリカー化（ｈｅｌｉｃａｒｙｌａｔｅｄ）ペイロード中に使用することができることが見出されている。ヘリカーモチーフアミノ酸配列中のシステイン残基（チオール官能基）の場所は、抗体の軽鎖ＣＤＲ２中のシステイン残基の合成及び位置（ペイロードを変化させる場合）を再操作する必要がないという利点を有する。

【0058】

全ての態様の一実施形態において、ＣＤＲ２当たり正確に１つの共有結合が形成される。

【0059】

全ての態様の一実施形態において、ペイロードは、結合部分、標識部分、及び生物学的活性部分より選択される。

【0060】

全ての態様の一実施形態において、生物学的に活性な部分は、抗体、ポリペプチド、１つ又は複数のＣＮＳ標的の天然リガンド、１つ又は複数のＣＮＳ標的の天然リガンドの改変バージョン、アプタマー、阻害性核酸（即ち、小さな阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、ロックド核酸（ＬＮＡ）、リボザイム、及び小分子、又は前述の任意の活性フラグメントを含む群より選択される。

【0061】

全ての態様の一実施形態において、ペイロードは、核酸又は核酸誘導体である。一実施形態において、核酸はｉＲＮＡ又はＬＮＡである。

【0062】

全ての態様の一実施形態において、ペイロードはポリペプチドである。

【0063】

全ての態様の一実施形態において、ペイロードは、完全長抗体又は抗体フラグメントである。

【0064】

全ての態様の一実施形態において、ハプテン化ペイロードは、ハプテン化された完全長抗アルファ−シヌクレイン抗体である。

【0065】

全ての態様の一実施形態において、ハプテン化ペイロードは、アルファ−シヌクレインに特異的に結合する、ハプテン化された抗アルファ−シヌクレイン抗体フラグメントである。

【0066】

全ての態様の一実施形態において、ハプテンはビオチンである。

【0067】

全ての態様の一実施形態において、抗体は、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２４３〜２４５のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２４６〜２４８のＨＶＲを含む。

【0068】

全ての態様の一実施形態において、抗体は、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２４９、２５０、及び２４５のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２５１〜２５３のＨＶＲを含む。

【0069】

全ての態様の一実施形態において、抗体は、配列番号２５４からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２５５からなる軽鎖可変ドメインを含む。

【0070】

全ての態様の一実施形態において、抗体は、配列番号２５４からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２５５からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られている。

【0071】

全ての態様の一実施形態において、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２４３〜２４５のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２４６〜２４８のＨＶＲを含み、それにおいて、各々のＨＶＲにおいて、３までのアミノ酸残基を変化させることができる。

【0072】

全ての態様の一実施形態において、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２４９、２５０、及び２４５のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２５１〜２５３のＨＶＲを含み、それにおいて、各々のＨＶＲにおいて、３までのアミノ酸残基を変化させることができる。

【0073】

全ての態様の一実施形態において、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインは、配列番号２５４からなる重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインは、配列番号２５５からなる軽鎖可変ドメインに由来する。

【0074】

全ての態様の一実施形態において、抗体は、重鎖において、配列番号２５６〜２５８のＨＶＲ、及び軽鎖において、配列番号２５９〜２６１のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する。

【0075】

全ての態様の一実施形態において、抗体は、重鎖において、配列番号２６２、２６３、及び２５８のＨＶＲ、並びに軽鎖において、配列番号２６４〜２６６のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する。

【0076】

全ての態様の一実施形態において、抗体は、配列番号２６７からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２６８からなる軽鎖可変ドメインを含む。

【0077】

全ての態様の一実施形態において、抗体は、配列番号２６７からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２６８からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られている。

【0078】

全ての態様の一実施形態において、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２５６〜２５８のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２５９〜２６１のＨＶＲを含み、それにおいて、各々のＨＶＲにおいて、３までのアミノ酸残基を変化させることができる。

【0079】

全ての態様の一実施形態において、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２６２、２６３、及び２５８のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２６４〜２６６のＨＶＲを含み、それにおいて、各々のＨＶＲにおいて、３までのアミノ酸残基を変化させることができる。

【0080】

全ての態様の一実施形態において、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインは、配列番号２６７からなる重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインは、配列番号２６８からなる軽鎖可変ドメインに由来する。

【0081】

全ての態様の一実施形態において、抗体は、重鎖において、配列番号２６９〜２７１のＨＶＲ、及び軽鎖において、配列番号２７２〜２７４のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する。

【0082】

全ての態様の一実施形態において、抗体は、重鎖において、配列番号２６９、２７５、及び２７１のＨＶＲ、並びに軽鎖において、配列番号２７６〜２７８のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する。

【0083】

全ての態様の一実施形態において、抗体は、配列番号２７９からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２８０からなる軽鎖可変ドメインを含む。

【0084】

全ての態様の一実施形態において、抗体は、配列番号２７９からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２８０からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られている。

【0085】

全ての態様の一実施形態において、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２６９〜２７１のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２７２〜２７４のＨＶＲを含み、それにおいて、各々のＨＶＲにおいて、３までのアミノ酸残基を変化させることができる。

【0086】

全ての態様の一実施形態において、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２６９、２７５、及び２７１のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２７６〜２７８のＨＶＲを含み、それにおいて、各々のＨＶＲにおいて、３までのアミノ酸残基を変化させることができる。

【0087】

全ての態様の一実施形態において、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインは、配列番号２７９からなる重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインは、配列番号２８０からなる軽鎖可変ドメインに由来する。

【0088】

全ての態様の一実施形態において、ハプテン化ペイロードは、ハプテン化された完全長抗ヒトＴａｕ（ｐＳ４２２）抗体である。

【0089】

全ての態様の一実施形態において、ハプテン化ペイロードは、位置４２２のセリンでリン酸化されたヒトＴａｕに特異的に結合する、ハプテン化された抗ヒトＴａｕ（ｐＳ４２２）抗体フラグメントである。

【0090】

全ての態様の一実施形態において、ハプテンはビオチンである。

【0091】

全ての態様の一実施形態において、抗ヒトＴａｕ（ｐＳ４２２）抗体は、以下を含む：
ａ）重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３０、２３９、及び２３２のＨＶＲ、又は
ｂ）重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３０、２３１、及び２３２のＨＶＲ。

【0092】

全ての態様の一実施形態において、抗体は、以下を更に含む：
ａ）軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３４、２３５、及び２３６のＨＶＲ、又は
ｂ）軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３３、２２９、及び２３６のＨＶＲ。

【0093】

全ての態様の一実施形態において、抗体は以下を含む：
ａ）重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３０、２３９、及び２３２のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３４、２３５、及び２３６のＨＶＲ、又は
ｂ）重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３０、２３１、及び２３２のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３３、２２９、及び２３６のＨＶＲ、又は
ｃ）重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３０、２３１、及び２３２のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３４、２３５、及び２３６のＨＶＲ。

【0094】

全ての態様の一実施形態において、抗体は以下を含む：
ａ）配列番号２４１の重鎖可変ドメイン及び配列番号２３８の軽鎖可変ドメイン、又は
ｂ）配列番号２４０の重鎖可変ドメイン及び配列番号２３７の軽鎖可変ドメイン、又は
ｃ）配列番号２４０の重鎖可変ドメイン及び配列番号２３８の軽鎖可変ドメイン、又は
ｄ）配列番号２４２の重鎖可変ドメイン及び配列番号２３８の軽鎖可変ドメイン。

【0095】

全ての態様の一実施形態において、ハプテン化ペイロードは、ハプテン化された完全長抗Ａｂｅｔａ抗体である。

【0096】

全ての態様の一実施形態において、ハプテン化ペイロードは、ヒトＡｂｅｔａに特異的に結合する、ハプテン化された抗Ａｂｅｔａ抗体フラグメントである。

【0097】

全ての態様の一実施形態において、ハプテンはビオチンである。

【0098】

全ての態様の一実施形態において、抗Ａｂｅｔａ抗体は、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２８１、２８２、及び２８３のＨＶＲを含む。

【0099】

全ての態様の一実施形態において、抗体は、さらに、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２８４、２８５、及び２８６のＨＶＲを含む。

【0100】

全ての態様の一実施形態において、抗体は、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２８１、２８２、及び２８３のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２８４、２８５、及び２８６のＨＶＲを含む。

【0101】

全ての態様の一実施形態において、抗体は以下を含む：
ａ）配列番号２８７の重鎖可変ドメイン及び配列番号２９０の軽鎖可変ドメイン、又は
ｂ）配列番号２８８の重鎖可変ドメイン及び配列番号２９１の軽鎖可変ドメイン、又は
ｃ）配列番号２８９の重鎖可変ドメイン及び配列番号２９２の軽鎖可変ドメイン。

【0102】

全ての態様の一実施形態において、ペイロードは、小分子（非ポリペプチドの生物学的に活性な部分）である。

【0103】

全ての態様の一実施形態において、生物学的に活性な部分は、ポリペプチドである。一実施形態において、ポリペプチドは、５〜５００のアミノ酸残基からなっている。一実施形態において、ポリペプチドは、１０〜４５０のアミノ酸残基を含む。一実施形態において、ポリペプチドは、１５〜４００のアミノ酸残基を含む。一実施形態において、ポリペプチドは、１８〜３５０のアミノ酸残基を含む。

【0104】

全ての態様の一実施形態において、二重特異性抗体は、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性（抗ジゴキシゲニン結合特異性；抗ＤＩＧ結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性；抗（ｈ）ＴｆＲ結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性；抗ＬＲＰ８結合特異性）に特異的に結合する第２の結合特異性を含む。

【0105】

全ての態様の一実施形態において、二重特異性抗体は、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する２つの結合特異性（２つの抗ジゴキシゲニン結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（２つの抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性）に特異的に結合する２つの結合特異性を有する。

【0106】

全ての態様の一実施形態において、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号０１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号０２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号０３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号０５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号０６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号０７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0107】

全ての態様の一実施形態において、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、ヒト化結合特異性である。

【0108】

全ての態様の一実施形態において、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、上記の実施形態のいずれかにおける通りのＣＤＲ及びアクセプターヒトフレームワーク（例、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク）を含む。

【0109】

全ての態様の一実施形態において、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号０９又は２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１０又は２６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１１又は２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号１３又は２９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１４又は３０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号１５又は３１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0110】

全ての態様の一実施形態において、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号０４又は１２又は２０又は２８のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。特定の実施形態において、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ジゴキシゲニン抗体は、ジゴキシゲニンに結合する能力を保持する。特定の実施形態において、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号０１又は０９又は１７又は２５において置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施形態において、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。場合により、抗ジゴキシゲニン抗体は、配列番号０１又は０９又は１７又は２５においてＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0111】

全ての態様の一実施形態において、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号０８又は１６又は２４又は３２のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を更に含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。特定の実施形態において、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ジゴキシゲニン抗体は、ジゴキシゲニンに結合する能力を保持する。特定の実施形態において、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号０８又は１６又は２４又は３２において置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施形態において、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。場合により、抗ジゴキシゲニン抗体は、配列番号０８又は１６又は２４又は３２においてＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0112】

全ての態様の一実施形態において、二重特異性抗体は、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性（抗ビオチン結合特異性；抗ＢＩ結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性；抗（ｈ）ＴｆＲ結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性；抗ＬＲＰ８結合特異性）に特異的に結合する第２の結合特異性を含む。

【0113】

全ての態様の一実施形態において、二重特異性抗体は、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する２つの結合特異性（２つの抗ビオチン結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（２つの抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性）に特異的に結合する２つの結合特異性を有する。

【0114】

全ての態様の一実施形態において、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0115】

全ての態様の一実施形態において、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、ヒト化結合特異性である。

【0116】

全ての態様の一実施形態において、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、上記の実施形態のいずれかにおける通りのＣＤＲ及びアクセプターヒトフレームワーク（例、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク）を含む。

【0117】

全ての態様の一実施形態において、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号４１又は５７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４２又は５８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４３又は５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号４５又は６１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号４６又は６２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号４７又は６３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0118】

全ての態様の一実施形態において、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号３６又は４４又は５２又は６０のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。特定の実施形態において、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ビオチン抗体は、ビオチンに結合する能力を保持する。特定の実施形態において、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号３６又は４４又は５２又は６０において置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施形態において、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。場合により、抗ビオチン抗体は、配列番号３６又は４４又は５２又は６０においてＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0119】

全ての態様の一実施形態において、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号４０又は４８又は５６又は６４のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を更に含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。特定の実施形態において、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ビオチン抗体は、ビオチンに結合する能力を保持する。特定の実施形態において、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号４０又は４８又は５６又は６４において置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施形態において、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。場合により、抗ビオチン抗体は、配列番号４０又は４８又は５６又は６４においてＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0120】

全ての態様の一実施形態において、二重特異性抗体は、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性（抗テオフィリン結合特異性；抗ＴＨＥＯ結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性；抗（ｈ）ＴｆＲ結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性；抗ＬＲＰ８結合特異性）に特異的に結合する第２の結合特異性を含む。

【0121】

全ての態様の一実施形態において、二重特異性抗体は、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する２つの結合特異性（２つの抗テオフィリン結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（２つの抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性）に特異的に結合する２つの結合特異性を有する。

【0122】

全ての態様の一実施形態において、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0123】

全ての態様の一実施形態において、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、ヒト化結合特異性である。

【0124】

全ての態様の一実施形態において、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、上記の実施形態のいずれかにおける通りのＣＤＲ及びアクセプターヒトフレームワーク（例、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク）を含む。

【0125】

全ての態様の一実施形態において、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号７３又は８９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号７４又は９０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７５又は９１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号７７又は９３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７８又は９４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号７９又は９５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0126】

全ての態様の一実施形態において、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号６８又は７６又は８４又は９２のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。特定の実施形態において、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗テオフィリン抗体は、テオフィリンに結合する能力を保持する。特定の実施形態において、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号６８又は７６又は８４又は９２において置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施形態において、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。場合により、抗テオフィリン抗体は、配列番号６８又は７６又は８４又は９２においてＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0127】

全ての態様の一実施形態において、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号７２又は８０又は８８又は９６のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を更に含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。特定の実施形態において、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗テオフィリン抗体は、テオフィリンに結合する能力を保持する。特定の実施形態において、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号７２又は８０又は８８又は９６において置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施形態において、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。場合により、抗テオフィリン抗体は、配列番号７２又は８０又は８８又は９６においてＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0128】

全ての態様の一実施形態において、二重特異性抗体は、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性（抗フルオレセイン結合特異性；抗ＦＬＵＯ結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性；抗（ｈ）ＴｆＲ結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性；抗ＬＲＰ８結合特異性）に特異的に結合する第２の結合特異性を含む。

【0129】

全ての態様の一実施形態において、二重特異性抗体は、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する２つの結合特異性（２つの抗フルオレセイン結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（２つの抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性）に特異的に結合する２つの結合特異性を有する。

【0130】

全ての態様の一実施形態において、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号９８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号９９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0131】

全ての態様の一実施形態において、フルオレセイン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、ヒト化結合特異性である。

【0132】

全ての態様の一実施形態において、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、上記の実施形態のいずれかにおける通りのＣＤＲ及びアクセプターヒトフレームワーク（例、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク）を含む。

【0133】

全ての態様の一実施形態において、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号１０５又は１１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１０６又は１１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１０７又は１１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号１０９又は１１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１１０又は１１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号１１１又は１１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0134】

全ての態様の一実施形態において、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号１０８又は１１６のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。特定の実施形態において、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗フルオレセイン抗体は、フルオレセインに結合する能力を保持する。特定の実施形態において、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号１０８又は１１６において置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施形態において、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。場合により、抗フルオレセイン抗体は、配列番号１０８又は１１６においてＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0135】

全ての態様の一実施形態において、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号１１２又は１２０のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を更に含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。特定の実施形態において、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗フルオレセイン抗体は、フルオレセインに結合する能力を保持する。特定の実施形態において、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号１１２又は１２０において置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施形態において、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。場合により、抗フルオレセイン抗体は、配列番号１１２又は１２０においてＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0136】

全ての態様の一実施形態において、二重特異性抗体は、ブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性（抗ブロモデオキシウリジン結合特異性；抗ＢｒｄＵ結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性；抗（ｈ）ＴｆＲ結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性；抗ＬＲＰ８結合特異性）に特異的に結合する第２の結合特異性を含む。

【0137】

全ての態様の一実施形態において、二重特異性抗体は、ブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する２つの結合特異性（２つの抗ブロモデオキシウリジン結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（２つの抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性）に特異的に結合する２つの結合特異性を有する。

【0138】

全ての態様の一実施形態において、ブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２１８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0139】

全ての態様の一実施形態において、ブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、ヒト化結合特異性である。

【0140】

全ての態様の一実施形態において、ブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、上記の実施形態のいずれかにおける通りのＣＤＲ及びアクセプターヒトフレームワーク（例、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク）を含む。

【0141】

全ての態様の一実施形態において、ブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号２１４又は２１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２１６又は２１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２１８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0142】

全ての態様の一実施形態において、ブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号２２２又は２２４のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。特定の実施形態において、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ブロモデオキシウリジン抗体は、ブロモデオキシウリジンに結合する能力を保持する。特定の実施形態において、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号２２２又は２２４において置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施形態において、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。場合により、抗ブロモデオキシウリジン抗体は、配列番号２２２又は２２４においてＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0143】

全ての態様の一実施形態において、ブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号２２３又は２２５のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を更に含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。特定の実施形態において、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ブロモデオキシウリジン抗体は、ブロモデオキシウリジンに結合する能力を保持する。特定の実施形態において、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号２２３又は２２５において置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施形態において、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。場合により、抗ブロモデオキシウリジン抗体は、配列番号２２３又は２２５においてＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0144】

本明細書において報告する一態様は、本明細書において報告する二重特異性抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬的製剤である。

【0145】

本明細書において報告する一態様は、本明細書において報告する非共有結合複合体及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬的製剤である。

【0146】

本明細書において報告する一態様は、本明細書において報告する共有結合コンジュゲート及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬的製剤である。

【0147】

本明細書において報告する一態様は、医薬としての使用のための、本明細書において報告する二重特異性抗体である。

【0148】

本明細書において報告する一態様は、医薬としての使用のための、本明細書において報告する非共有結合複合体である。

【0149】

本明細書において報告する一態様は、医薬としての使用のための、本明細書において報告する共有結合コンジュゲートである。

【0150】

本明細書において報告する一態様は、癌又は神経学的障害の処置のための、本明細書において報告する二重特異性抗体である。

【0151】

本明細書において報告する一態様は、癌又は神経学的障害の処置のための、本明細書において報告する非共有結合複合体である。

【0152】

本明細書において報告する一態様は、癌又は神経学的障害の処置のための、本明細書において報告する共有結合コンジュゲートである。

【0153】

本明細書において報告する一態様は、医薬の製造における、本明細書において報告する二重特異性抗体の使用である。

【0154】

本明細書において報告する一態様は、医薬の製造における、本明細書において報告する非共有結合複合体の使用である。

【0155】

本明細書において報告する一態様は、医薬の製造における、本明細書において報告する共有結合コンジュゲートの使用である。

【0156】

一実施形態において、医薬は、癌の処置用である。

【0157】

一実施形態において、医薬は、神経学的障害の処置用である。

【0158】

一実施形態において、神経学的障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）（軽度認知障害及び前駆ＡＤを含むが、これらに限定されない）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌（例、ＣＮＳ又は脳に影響する癌）、及び外傷性脳損傷より選択される。

【0159】

本明細書において報告する一態様は、診断剤としての、本明細書において報告する二重特異性抗体の使用である。

【0160】

本明細書において報告する一態様は、診断剤としての、本明細書において報告する非共有結合複合体の使用である。

【0161】

本明細書において報告する一態様は、診断剤としての、本明細書において報告する共有結合コンジュゲートの使用である。

【0162】

本明細書において報告する一態様は、ペイロードの安定性を増加させるための、本明細書において報告する非共有結合複合体の使用である。

【0163】

本明細書において報告する一態様は、ペイロードの安定性を増加させるための、本明細書において報告する共有結合コンジュゲートの使用である。

【0164】

本明細書において報告する一態様は、ペイロードの活性を増加させるための、本明細書において報告する非共有結合複合体の使用である。

【0165】

本明細書において報告する一態様は、ペイロードの活性を増加させるための、本明細書において報告する共有結合コンジュゲートの使用である。

【0166】

本明細書において報告する一態様は、ペイロードのインビボ半減期を増加させるための、本明細書において報告する非共有結合複合体の使用である。

【0167】

本明細書において報告する一態様は、ペイロードのインビボ半減期を増加させるための、本明細書において報告する共有結合コンジュゲートの使用である。

【0168】

本明細書において報告する一態様は、疾患の処置における、本明細書において報告する二重特異性抗体の使用である。

【0169】

本明細書において報告する一態様は、疾患の処置における、本明細書において報告する非共有結合複合体の使用である。

【0170】

本明細書において報告する一態様は、疾患の処置における、本明細書において報告する共有結合コンジュゲートの使用である。

【0171】

本明細書において報告する一態様は、本明細書において報告する非共有結合複合体の効果的な量を個体に投与することを含む、疾患を有する個体を処置する方法である。

【0172】

本明細書において報告する一態様は、本明細書において報告する共有結合コンジュゲートの効果的な量を個体に投与することを含む、疾患を有する個体を処置する方法である。

【0173】

本明細書において報告する一態様は、本明細書において報告する非共有結合複合体の効果的な量を個体に投与することを含む、個体において疾患を処置する方法である。

【0174】

本明細書において報告する一態様は、本明細書において報告する共有結合コンジュゲートの効果的な量を個体に投与することを含む、個体において疾患を処置する方法である。

【0175】

一実施形態において、疾患は癌である。

【0176】

一実施形態において、疾患は神経学的障害である。

【0177】

一実施形態において、神経学的障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）（軽度認知障害及び前駆ＡＤを含むが、これらに限定されない）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌（例、ＣＮＳ又は脳に影響する癌）、及び外傷性脳損傷より選択される。

【0178】

本明細書において報告する一態様は、血液脳関門を横切るハプテン化ペイロードの標的化送達のための、本明細書において報告する二重特異性抗体の使用である。

【0179】

本明細書において報告する一態様は、血液脳関門を横切るハプテン化ペイロードの標的化送達のための、本明細書において報告する非共有結合複合体の使用である。

【0180】

本明細書において報告する一態様は、血液脳関門を横切るハプテン化ペイロードの標的化送達のための、本明細書において報告する共有結合複合体の使用である。

【0181】

本明細書において報告する一態様は、血液脳関門を横切るハプテン化ペイロードの標的化送達、及び、血液脳関門内での、又は脳中でのハプテン化ペイロードの放出のための、本明細書において報告する二重特異性抗体の使用である。

【0182】

本明細書において報告する一態様は、血液脳関門を横切るハプテン化ペイロードの標的化送達、及び、血液脳関門内での、又は脳中でのハプテン化ペイロードの放出のための、本明細書において報告する非共有結合複合体の使用である。

【0183】

一実施形態において、ハプテン化ペイロードの送達は、二重特異性抗体の非存在における送達と比較し、より高い。一実施形態において、送達は２倍高い。一実施形態において、送達は１０倍高い。

【0184】

一実施形態において、ハプテン化ペイロードは、本明細書において報告する二重特異性抗体の存在においてよりも、本明細書において報告する二重特異性抗体の非存在において、より高い生物学的活性を有する。一実施形態において、生物学的活性は、二重特異性抗体の非存在において２倍高い。一実施形態において、生物学的活性は、二重特異性抗体の非存在において１０倍高い。

【図面の簡単な説明】

【0185】

【図1】ペプチドのジゴキシゲニン化（ジゴキシゲニンのコンジュゲーション）のための手順（図１Ａ）。ジゴキシゲニン標識の（フォアフォア−Ｃｙ５；図１Ｂ）、及びジゴキシゲニン化ポリペプチド（ＰＹＹ−誘導体（ＤＩＧ−ＰＹＹ）；図１Ｃ）の例。

【図2】単一特異性二価抗ジゴキシゲニン抗体及びジゴキシゲニンＣｙ５コンジュゲートの複合体（図２Ａ）の、並びに単一特異性二価抗ジゴキシゲニン抗体及びジゴキシゲニン−ポリペプチドコンジュゲートの複合体（図２Ｂ）のスキーム。二重特異的四価抗ジゴキシゲニン抗体及びジゴキシゲニン−ポリペプチドコンジュゲートの複合体のスキーム（図２Ｃ）。

【図3】定義されたサイズの複合体の単一ピークを示すペプチド（ＤＩＧ−ＰＹＹ）にコンジュゲーションされた、抗ジゴキシゲニン抗体及びジゴキシゲニンを含む複合体の（２８０ｎｍで記録された）サイズ排除クロマトグラム。

【図4】Ａ：ジゴキシゲニン（丸で囲んだ）が、ＶＨ及びＶＬ領域のＣＤＲにより形成された深いポケット中に捕捉されることを示す抗ジゴキシゲニンＦａｂの構造モデル（左）。Ｂ：ビオシチンアミド（丸で囲んだ）が、ＶＨ及びＶＬ領域のＣＤＲにより形成された深いポケット中に捕捉されることを示す抗ビオチンＦａｂの構造モデル（右）。

【図5】導入されたＶＨ５３Ｃ変異を伴わない組換えヒト化抗ビオチン抗体の結合の比較。結合特性を、BIAcore T100又はBIAcore 3000機器を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により分析した。ａ）ヒト化抗ビオチン抗体。ヒト化抗ビオチン抗体へのビオチン化ｓｉＲＮＡの結合、ＫＤ＝６２４pM；ｂ）ヒト化Ｃｙｓ５３変異抗ビオチン抗体。ビオチン化ｓｉＲＮＡの結合、ＫＤ＝６４３pM；ｓｉＲＮＡ濃度：０．１４、０．４１、１．２３、３．７０、１１．１、３３．３、及び１００nM；抗ビオチン抗体濃度：２nM；センサーチップＣＭ３；抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を介した抗体の結合。

【表1】

【図6】ハプテン中並びに抗体中の適切な位置でのＳＨ官能基の導入によって、抗体及びハプテンが、共有結合を形成することが可能になり、コンジュゲートがもたらされる。

【図7】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ自己蛍光バンドパターン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのさらなる染色を伴わない）のスキーム：Ａ：共有結合が、還元又は非還元の両方の条件下で、抗体とハプテン−フルオロフォアコンジュゲートの間に形成されていない場合、遊離ハプテン−フルオロフォアコンジュゲートの分子量での１つの自己蛍光バンドを検出することができる。Ｂ：共有結合が、非還元条件下で、抗体とハプテン−フルオロフォアコンジュゲートの間に形成される場合、抗体及びハプテン−フルオロフォアコンジュゲートの組み合わせた分子量での１つの自己蛍光バンドを検出することができる。還元条件下では、抗体とハプテン−フルオロフォアコンジュゲート（ハプテン化合物）の複合体中のジスルフィド架橋が切断され、遊離ハプテン−フルオロフォアコンジュゲートの分子量で、１つの自己蛍光バンドを検出することができる。

【図8】酸化還元活性剤：酸化剤（グルタチオンジスルフィド、ＧＳＳＧ）及び還元剤（ジチオエリスリトール、ＤＴＥ）の存在におけるハプテン−Ｃｙｓ−蛍光標識コンジュゲート（ハプテン化化合物）を伴うハプテン結合Ｃｙｓ変異抗体のコンジュゲート形成：抗体複合体化及び、定義された位置でのその後の共有結合を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析における蛍光シグナルにより検出する。非還元（上画像）及び還元（下画像）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施例１１に記載する通りに実施した。共有結合抗体連結ハプテンは、非還元条件下で、適切な位置でのより大きなサイズのタンパク質結合シグナルとして検出可能である。これらのシグナルは、還元時にタンパク質から脱離し、還元条件下で小実体として目に見える。左：蛍光画像右：クーマシーブルー染色シリーズ１：５２ｂＣ変異を伴う抗ジゴキシゲニン抗体シリーズ２：位置５２ｂで野生型残基を伴う抗ジゴキシゲニン抗体（Ａ）３mM ＤＴＥ及び１０mM ＧＳＳＧを用いた共有結合カップリング；（Ｂ）０．３mM ＤＴＥ及び１mM ＧＳＳＧを用いた共有結合カップリング；（Ｃ）０．０３mM ＤＴＥ及び０．１mM ＧＳＳＧを用いた共有結合カップリング。

【図9】酸化剤（グルタチオンジスルフィド、ＧＳＳＧ）のみの存在における、しかし、還元剤の非存在における、又は、両方の非存在におけるハプテン−Ｃｙｓ−蛍光標識コンジュゲートを伴うハプテン結合Ｃｙｓ変異抗体の複合体形成：抗体複合体化及び、定義された位置でのその後の共有結合を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析における蛍光シグナルにより検出する。非還元（上画像）及び還元（下画像）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施例１２に記載する通りに実施した。共有結合抗体連結ハプテンは、非還元条件下で、適切な位置でのより大きなサイズのタンパク質結合シグナルとして検出可能である。これらのシグナルは、還元時にタンパク質から脱離し、還元条件下で小実体として目に見える。左：蛍光画像右：クーマシーブルー染色シリーズ１：５２ｂＣ変異を伴う抗ジゴキシゲニン抗体シリーズ２：位置５２ｂで野生型残基を伴う抗ジゴキシゲニン抗体（Ａ）添加剤なし；（Ｂ）１mM ＧＳＳＧを用いた共有結合カップリング；（Ｃ）０．１mM ＧＳＳＧを用いた共有結合カップリング。

【図10】Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−ＮＨ２）の構造。

【図11】ＤＩＧ−３−ｃｍｅ−ｅｄａ−Ｃｙ５の構造。

【図12】ＤＩＧ−マレイイミド（ｍａｌｅｉｉｍｉｄ）−Ｃｙ５の構造。

【図13】ＤＩＧ−ｅｄａ−Ｃｙｓ−Ｃｙ５の構造。

【図14】ＤＩＧ−Ａｈｘ−Ｃｙｓ−Ｃｙ５の構造。

【図15】ＤＩＧ−Ｃｙｓ−ＭＲ１２１の構造。

【図16】Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｄｉｇ）の構造。

【図17】Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−Ｄｉｇ）の構造。

【図18】ＰＥＧ３−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−Ｄｉｇ）の構造。

【図19】Ｄｙ６３６−ｅｄａ−Ｂｔｎの構造。

【図20】Ｄｙ６３６−Ｓｅｒ−Ｂｔｎの構造。

【図21】Ｄｙ６３６−Ｃｙｓ−Ｂｔｎの構造。

【図22】Ｃｙ５−Ｃｙｓ−Ｂｔｎの構造。

【図23】Ｃｙ５−Ｓｅｒ−Ｂｔｎの構造。

【図24】Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ２−Ｂｔｎ）の構造。

【図25】Ａｃ−ＰＹＹ−ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−β−Ａｌａ−Ｂｔｎの構造。

【図26】Ａｃ−ＰＹＹ−ＰＥＧ３−Ｓｅｒ−ＰＥＧ２−Ｂｔｎの構造。

【図27】Ａｃ−ＰＹＹ−ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｂｔｎの構造。

【図28】Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４−Ａｂｕ−５−Ｆｌｕｏ）の構造。

【図29】Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−５−Ｆｌｕｏ）の構造。

【図30】Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ２−Ｂｔｎ）の生成のためのスキーム。

【図31】Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−β−Ａｌａ−Ｂｔｎ）の生成のためのスキーム。

【図32】Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４−Ａｂｕ−Ｄｉｇ）の生成のためのスキーム。

【図33】ビオシチンアミドを伴う複合体中でのマウス抗ビオチン抗体のＸ線構造。ビオシチンアミドと相互作用するアミノ酸残基を、スティック表示で示す。

【図34-1】非複合体化抗原／ハプテンに比較した、共有結合コンジュゲート及び非共有結合複合体を用いたインビボ血液ＰＫ試験の結果；ビオチン−Ｃｙ５非共有結合複合体（図３４Ａ）及び共有結合（ジスルフィド架橋）コンジュゲート（図３５Ｂ）の、並びに非複合体化ビオチン−Ｓｅｒ−Ｃｙ５（アスタリスク）のＣｙ５媒介性蛍光の相対残存蛍光強度（%、実線印）を示す。時刻ｔ＝０．０８時間での蛍光シグナルを１００%に設定した；加えて、マウス血清サンプル中のヒトＩｇＧの相対残量を示す（オープン印）；ｔ＝０．０８時間でのＩｇＧ血清濃度（mg/ml）を１００%に設定した。

【図34-2】非複合体化抗原／ハプテンに比較した、共有結合コンジュゲート及び非共有結合複合体を用いたインビボ血液ＰＫ試験の結果；ビオチン−Ｃｙ５非共有結合複合体（図３４Ａ）及び共有結合（ジスルフィド架橋）コンジュゲート（図３５Ｂ）の、並びに非複合体化ビオチン−Ｓｅｒ−Ｃｙ５（アスタリスク）のＣｙ５媒介性蛍光の相対残存蛍光強度（%、実線印）を示す。時刻ｔ＝０．０８時間での蛍光シグナルを１００%に設定した；加えて、マウス血清サンプル中のヒトＩｇＧの相対残量を示す（オープン印）；ｔ＝０．０８時間でのＩｇＧ血清濃度（mg/ml）を１００%に設定した。

【図35】マウスの血清中のジゴキシゲニン化ＰＹＹポリペプチドの量の決定のウエスタンブロット。

【図36】抗ハプテン抗体を伴うハプテン化合物の親和性駆動型の複合体化の分析。抗体複合体化及び、定義された位置でのその後の共有結合連結を、実施例２０に記載する通りに実施された、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析における蛍光シグナルにより指示する。左：非還元（ゲルの左側）及び還元（ゲルの右側）サンプルを用いた蛍光画像。右：クーマシーブルー染色。１：ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体＋ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５２：ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣ＋ビオチンＣｙｓ−Ｃｙ５３：ヒト化抗ビオチン抗体＋ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５４：ヒト化抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃ＋ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５白色矢印は、抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣを使用した場合での、有意に高い過剰な（非カップリング）ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５をマークする。なぜなら、コンジュゲーション反応は、この場合において親和性駆動されないからである。

【図37】ハプテン媒介部位特異的定方向性共有結合ペイロードカップリングのための位置５２ｂで、追加のシステインを伴うＤｉｇ抗体結合を形成するために要求されるＦａｂ領域内のシステイン位置及びジスルフィドパターン。（Ａ）機能的Ｆａｂフラグメントを形成するために要求されるＶＨ及びＣＨ１ドメインにおける、並びにＶＬ及びＣＬドメインにおけるシステイン及びジスルフィドパターン。（Ｂ）ハプテン媒介部位特異的定方向性共有結合ペイロードカップリングのための位置５２ｂでの追加のシステインを伴う機能的Ｆａｂフラグメントを形成するために要求されるＶＨ及びＣＨ１ドメインにおける、並びにＶＬ及びＣＬドメインにおけるシステイン及びジスルフィドパターン。（Ｃ＆Ｄ）ミスフォールドされた非機能的抗体をもたらし得る、ＶＨ５２ｂバリアントのＶＨドメイン内で正しくないジスルフィド結合を形成する潜在能。Ｅ）ミスフォールドされた非機能性抗体をもたらし得る、ＶＨ５２ｂバリアントのＦｖ領域内での潜在的な正しくないドメイン間ジスルフィド結合についての例。

【図38】ハプテン媒介部位特異的定方向性共有結合ペイロードカップリングのための位置５２ｂで、追加のシステインを伴うＤｉｇ結合ジスルフィド安定化一本鎖Ｆｖを形成するために要求されるシステイン位置及びジスルフィドパターン。（Ａ）機能的ｓｃＦｖｓ、ｄｓｓｃＦｖｓ、及び５２ｂ変位ｄｓｓｃＦｖｓを形成するために要求されるＶＨ及びＶＬドメインにおけるシステイン。（Ｂ）機能的ｓｃＦｖｓ、ｄｓｓｃＦｖｓ、及び５２ｂ変位ｄｓｓｃＦｖｓを生成するために形成されなくてはならないジスルフィド結合の正しいパターン。（Ｃ）ミスフォールドされた非機能的ｓｃＦｖｓをもたらし得る、正しくないジスルフィド結合を形成する潜在能。（Ｄ）ミスフォールドされた非機能的ｄｓｓｃＦｖｓをもたらし得る、正しくないジスルフィド結合を形成する潜在能。（Ｅ）ミスフォールドされた非機能的５２ｂ変位ｄｓｓｃＦｖｓをもたらし得る、正しくないジスルフィド結合を形成する潜在能。

【図39】共有結合的にカップリングしたペイロードのための送達媒体としてのＬｅｙ−Ｄｉｇ二重特異性抗体誘導体の組成。

【図40】共有結合ペイロードの標的化送達のための二重特異性抗ハプテン抗体誘導体の発現及び精製。（Ａ）ウエスタンブロット分析のために、細胞培養上清をＳＤＳ ＰＡＧＥ（NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel（１．０mM×１２ウェル）（Invitrogen；カタログＮＰ０３２２）に供し、タンパク質を、その後、Immobilon Transfer Membranes（Immobilon-P）（Millipore；カタログＩＰＶＨ０７８５０）、ＰＶＤＦ（孔径０．４５μm）に移した。抗体誘導体を、ヤギにおいて産生されたAnti-Human Kappa Light Chain-Alkaline Phosphatase抗体（親和性精製）、Sigma（カタログ番号Ａ３８１３）（１：１０００希釈）、及びヤギにおいて産生されたAnti-Human IgG（Ｆｃ特異的）Alkaline Phosphatase抗体、Sigma（カタログ番号Ａ９５４４）（１：１０００希釈）により検出した。基質BCIP/NBT Blue Liquid Substrate（Sigmaカタログ番号Ｂ３８０４）をウエスタンブロットの展開のために適用した。レーン１−分子量マーカー；レーン２＆３ − 未改変重鎖を伴う対照抗体；レーン４−伸長Ｈ鎖を伴うＬｅＹ−Ｄｉｇ（５２ｂＣ）二重特異性抗体。（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel［Invitrogen］）及び、クマシーブリリアントブルーを用いたその後の染色によって、タンパク質調製物の純度が示され、それらの計算された分子量に対応する見掛け上の分子サイズを伴うＩｇＧに関連したポリペプチド鎖が可視化される。レーン１−分子量マーカー；レーン２−還元伸長Ｈ鎖を伴うＬｅＹ−Ｄｉｇ（５２ｂＣ）二重特異性抗体；レーン３−非還元伸長重鎖を伴うＬｅＹ−Ｄｉｇ（５２ｂＣ）二重特異性抗体；（Ｃ）サイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200）によって、プロテインＡ精製後のＬｅＹ−Ｄｉｇ（５２ｂＣ）二重特異性抗体誘導体のタンパク質調製物中の均質性及び凝集体の欠如が実証される。

【図41】非複合体化ハプテン化合物Ｄｉｇ−Ｃｙ５に比較した、共有結合コンジュゲート及び非共有結合複合体を用いたインビボ血中薬物動態試験の結果；Ｄｉｇ−Ｃｙ５非共有結合複合体（上パネル）Ｄｉｇ−Ｃｙｓ−Ｃｙ５共有結合（ジスルフィド架橋）複合体（下パネル）の、並びに非複合体化Ｄｉｇ−Ｃｙ５（灰色の三角）の相対残存蛍光強度（%）を示す；時刻ｔ＝０．０８時間での蛍光シグナルを１００%に設定した；加えて、マウス血清サンプル中のヒトＩｇＧの相対残量を示す；ｔ＝０．０８時間でのＩｇＧ血清濃度（mg/ml）を１００%に設定した。

【図42】Ｃｙ５蛍光のインビボでの薬物動態を、ビオチン−Ｃｙ５又はビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５をそれぞれ含む非共有結合複合体の、又は共有結合（ジスルフィド架橋）コンジュゲートの、或いは非複合体化ビオチン−Ｃｙ５の注射後、非侵襲的な眼イメージングにより決定した；実線ダイヤモンド：ビオチン−Ｃｙ５；実線四角：ビオチン−Ｃｙ５抗ビオチン抗体複合体；三角形：ビオチン−Ｃｙ５抗ビオチン抗体コンジュゲート。

【図43-1】ａ）テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５の組成、構造、及び分子量；ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーによって、精製テオフィリン結合抗体バリアントの純度及び均質性が実証される；ピーク＃２は精製産物を示し、ピーク＃１の欠如は、そのような調製物が凝集体を含まないことを示す。ｃ）テオフィリン結合抗体とテオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５の間での共有結合複合体の形成（非還元（左レーン）及び還元（右レーン）ＳＤＳ ＰＡＧＥにより実証される通り）；Ｃｙ５は、テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５及びＣｙｓ変異抗体を含むサンプル中だけで、非還元条件下で、Ｈ鎖にカップリングされて現れるが、これらの共有結合コンジュゲートは、還元時（右レーン）に崩壊する；レーン１：分子量マーカー；２−４非還元、２：抗テオフィリン抗体（Ｃｙｓ変異を伴わない）＋テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（複合体）；３：抗テオフィリン抗体ｃｙｓ＿５５＋テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（コンジュゲート）；４：抗テオフィリン抗体ｃｙｓ＿５４＋テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（コンジュゲート）；５−７還元、５：抗テオフィリン抗体（Ｃｙｓ変異を伴わない）＋テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（複合体）；６：抗テオフィリン抗体ｃｙｓ＿５５＋テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（コンジュゲート）；７：抗テオフィリン抗体ｃｙｓ＿５４＋テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（コンジュゲート）。

【図43-2】ａ）テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５の組成、構造、及び分子量；ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーによって、精製テオフィリン結合抗体バリアントの純度及び均質性が実証される；ピーク＃２は精製産物を示し、ピーク＃１の欠如は、そのような調製物が凝集体を含まないことを示す。ｃ）テオフィリン結合抗体とテオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５の間での共有結合複合体の形成（非還元（左レーン）及び還元（右レーン）ＳＤＳ ＰＡＧＥにより実証される通り）；Ｃｙ５は、テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５及びＣｙｓ変異抗体を含むサンプル中だけで、非還元条件下で、Ｈ鎖にカップリングされて現れるが、これらの共有結合コンジュゲートは、還元時（右レーン）に崩壊する；レーン１：分子量マーカー；２−４非還元、２：抗テオフィリン抗体（Ｃｙｓ変異を伴わない）＋テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（複合体）；３：抗テオフィリン抗体ｃｙｓ＿５５＋テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（コンジュゲート）；４：抗テオフィリン抗体ｃｙｓ＿５４＋テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（コンジュゲート）；５−７還元、５：抗テオフィリン抗体（Ｃｙｓ変異を伴わない）＋テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（複合体）；６：抗テオフィリン抗体ｃｙｓ＿５５＋テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（コンジュゲート）；７：抗テオフィリン抗体ｃｙｓ＿５４＋テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（コンジュゲート）。

【図44】ビオチン結合抗体とビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５の間での共有結合複合体の形成は、非還元及び還元ＳＤＳ ＰＡＧＥにより実証される；カップリング反応は、３７℃で１時間にわたり、マウス血清中で実施した。Ｃｙ５は、ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５及びＣｙｓ変異抗体を含むサンプル中だけで、非還元条件下で、Ｈ鎖にカップリングされて現れる；これらの共有結合コンジュゲートは、還元時（右レーン）に崩壊する；レーン１：分子量マーカー；２−３非還元、２：抗ビオチン抗体（Ｃｙｓ変異を伴わない）＋ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（複合体）；３：抗ビオチン抗体−Ｃｙｓ＋ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（コンジュゲート）；４−５還元、５：抗ビオチン抗体（Ｃｙｓ変異を伴わない）＋ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（複合体）；６：抗ビオチン抗体−Ｃｙｓ＋ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５（コンジュゲート）。

【図45】Ｃｙ５蛍光のインビボでの薬物動態を、ビオチン−Ｃｙ５又はビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５をそれぞれ含む非共有結合複合体の、又は共有結合（ジスルフィド架橋）コンジュゲートの、或いは非複合体化ビオチン−Ｃｙ５の注射後、非侵襲的な眼イメージングにより決定した；実線ダイヤモンド：ビオチン−Ｃｙ５；実線四角：ビオチン−Ｃｙ５抗ビオチン抗体複合体；三角形：ビオチン−Ｃｙ５抗ビオチン抗体コンジュゲート。

【図46】マウス抗ビオチン抗体Ｆａｂフラグメントのタンパク質構造を、ビオシチンアミドを伴う複合体中で測定した：複合体化ハプテンは、アミノ酸の負荷電クラスターに近接して位置付けられる；ビオチン（‐ハプテンとして‐そのカルボキシル基でのペイロードカップリングのために誘導体化されている）は、良好な有効性を伴い結合する。なぜなら、この位置で電荷反発がないからである（ＣＯＯＨ基の欠如による）；対照的に、遊離の（正常な）ビオチンは、抗体に効率的に結合しない。なぜなら、そのカルボキシル基は、この負荷電クラスターに近接し得るが、故に、反発するからである。

【図47】血液脳関門シャトルモジュール組成物のスキーム。

【図48】実施例２７において産生された血液脳関門シャトルモジュールのＳＥＣプロファイル及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ。

【図49】ＴｆＲ発現ＢＢＢ由来細胞株としてのｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞及び蛍光ペイロードとしてのＤｉｇ−Ｃｙ５を使用したＦＡＣＳ解析の結果。

【図50】ハプテン結合二重特異性抗体の血液脳関門−シャトルモジュールの内皮細胞からのトランスサイトーシス及び放出； Ａ：抗ＣＤ３３−ｄｉｇ抗体トランスウェルアッセイ、ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡ；Ｂ：抗ＴｆＲ１抗体トランスウェルアッセイ、ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡ；Ｃ：抗ＴｆＲ１抗体Ｄｉｇトランスウェルアッセイ、ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡ； Ｄ：抗ＴｆＲ２抗体トランスウェルアッセイ、ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡ； Ｅ：抗ＴｆＲ２抗体Ｄｉｇトランスウェルアッセイ、ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡ。

【図51-1】Ａ：二重特異性抗体−ハプテン化ペイロード非共有結合複合体の組成及び定量化；Ｂ：ＴｆＲに対する、低下した親和性を伴う二重特異性抗体を使用した、ハプテン化ペイロードの内皮細胞からの：トランスサイトーシス及び放出（Ａ：抗ＣＤ３３−Ｄｉｇ ＋ Ｄｉｇ−ＤＮＡ トランスウェルアッセイ、ｑＰＣＲ；Ｂ：抗ＣＤ３３−Ｂｉｏ ＋ Ｂｉｏ−ＤＮＡ トランスウェルアッセイ、ｑＰＣＲ、Ｃ：抗ＴｆＲ２−Ｄｉｇ ＋ Ｄｉｇ−ＤＮＡ トランスウェルアッセイ、ｑＰＣＲ、Ｄ：抗ＴｆＲ２−Ｂｉｏ ＋ Ｂｉｏ−ＤＮＡトランスウェルアッセイ、ｑＰＣＲ）。

【図51-2】Ａ：二重特異性抗体−ハプテン化ペイロード非共有結合複合体の組成及び定量化；Ｂ：ＴｆＲに対する、低下した親和性を伴う二重特異性抗体を使用した、ハプテン化ペイロードの内皮細胞からの：トランスサイトーシス及び放出（Ａ：抗ＣＤ３３−Ｄｉｇ ＋ Ｄｉｇ−ＤＮＡ トランスウェルアッセイ、ｑＰＣＲ；Ｂ：抗ＣＤ３３−Ｂｉｏ ＋ Ｂｉｏ−ＤＮＡ トランスウェルアッセイ、ｑＰＣＲ、Ｃ：抗ＴｆＲ２−Ｄｉｇ ＋ Ｄｉｇ−ＤＮＡ トランスウェルアッセイ、ｑＰＣＲ、Ｄ：抗ＴｆＲ２−Ｂｉｏ ＋ Ｂｉｏ−ＤＮＡトランスウェルアッセイ、ｑＰＣＲ）。

【図52】ＴｆＲに対する高親和性を伴う非放出血液脳関門シャトルモジュールを適用した、ハプテン化ペイロードの内皮細胞からのトランスサイトーシス及び放出； Ａ：抗ＴｒＦ１−Ｄｉｇ＋Ｄｉｇ−ＤＮＡトランスウェルアッセイ、ｑＰＣＲ、Ｂ：抗ＴｆＲ１抗体−Ｂｉｏ＋Ｂｉｏ−ＤＮＡトランスウェルアッセイ、ｑＰＣＲ）。

【図53】ＴｆＲに対する高親和性を伴う非放出血液脳関門シャトルモジュールからのハプテン化ペイロードの結合、取り込み、及び細胞内分離；示すのは、３７℃での３時間のインキュベーションに続く、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞における二重特異性抗体複合化ハプテン蛍光ペイロードの細胞内分離である。ＤＩＧ−ＤＮＡ−ＣＹ５又はＢｉｏ−ＤＮＡ−Ｃｙ５（濃い灰色）は、内在化した抗ジゴキシゲニン又は抗ビオチン結合二重特異性抗体（中灰色）と重複しない別個の細胞内小胞中に現れる。

【図54】２．５モル過剰のヘリカーモチーフアミノ酸配列を含む化合物形態、共有結合複合体０１５６を使用した、ヘリカーモチーフアミノ酸配列のシステインバリアント２を伴う抗体０１５５のカップリングのＳＤＳ ＰＡＧＥゲル；１＝ヘリカーモチーフアミノ酸配列のシステインバリアント２；２＝抗体００１９；３ ＝抗体０１５５。

【図55】ヘリカーモチーフアミノ酸配列のシステインバリアント１を伴う抗体０１５７のカップリングのＳＤＳ ＰＡＧＥゲル；１＝ヘリカーモチーフのアミノ酸配列のシステインバリアント１（酸化）；２＝対照カップリング（酸化）；３＝共有結合コンジュゲート（酸化）；４＝分子量マーカー；５＝共有結合コンジュゲート（還元）；６＝対照カップリング（還元）；７＝ヘリカーモチーフアミノ酸配列のシステインバリアント１（還元）。

【図56】抗体０１５５（シュードモナス外毒素分子ＬＲ８Ｍを含み、配列番号２８の欠失したＣ末端リジン残基及びその共有結合コンジュゲートを伴う、ヘリカーモチーフアミノ酸配列のシステインバリアント１）のＳＥＣクロマトグラム。

【図57】非還元サンプルについてのSDS-CE、Caliperによるコンジュゲーション効率の分析。

【図58】Ａ：ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析を実施し、ＢｒｄＵ標識ＤＮＡ並びに遊離二重特異性抗体及び遊離ＢＲＤＵ−ＤＮＡを伴う抗ＴｆＲ／ＢＲＤＵ二重特異性抗体の複合体を同定し、特徴付けた。複合体は、２４４．９kDaのＭＷでカラムから溶出し、遊離二重特異性抗体は、２１５．４kDaのＭＷで検出され、遊離ＢＲＤＵ−ＤＮＡは、１６．４kDaのＭＷで検出される。Ｂ：ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析を実施し、ＢｒｄＵ標識ＤＮＡ並びに遊離二重特異性抗体及び遊離ＢＲＤＵ−ＤＮＡを伴う抗ＴｆＲ／ＢＲＤＵ二重特異性抗体の複合体を同定し、特徴付けた。複合体は、６．８nmの流体力学的半径を示すのに対し、遊離二重特異性抗体は、６．２nmの流体力学半径を示す。

【図59-1】Ａ：ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析を実施し、ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体並びに遊離二重特異性抗体及び遊離ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体を伴う抗ＴｆＲ／ビオチン二重特異性抗体の複合体を同定し、特徴付けた。複合体は、８．０nmの流体力学的半径を示すのに対し、遊離二重特異性抗体は、６．２nmの流体力学半径を示し、遊離ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体は、５．５nmの流体力学半径を示す。Ｂ：ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析を実施し、ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体並びに遊離二重特異性抗体及び遊離ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体を伴う抗ＴｆＲ／ビオチン二重特異性抗体の複合体を同定し、特徴付けた。複合体は、５０１kDaのＭＷでカラムから溶出し、遊離二重特異性抗体は、２０５kDaのＭＷで検出され、遊離ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体は、１５０kDaのＭＷで検出される。Ｃ：複合体は、ハプテン及び抗ハプテン抗体の誤った組み合わせが使用された場合、形成されない。

【図59-2】Ａ：ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析を実施し、ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体並びに遊離二重特異性抗体及び遊離ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体を伴う抗ＴｆＲ／ビオチン二重特異性抗体の複合体を同定し、特徴付けた。複合体は、８．０nmの流体力学的半径を示すのに対し、遊離二重特異性抗体は、６．２nmの流体力学半径を示し、遊離ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体は、５．５nmの流体力学半径を示す。Ｂ：ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析を実施し、ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体並びに遊離二重特異性抗体及び遊離ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体を伴う抗ＴｆＲ／ビオチン二重特異性抗体の複合体を同定し、特徴付けた。複合体は、５０１kDaのＭＷでカラムから溶出し、遊離二重特異性抗体は、２０５kDaのＭＷで検出され、遊離ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体は、１５０kDaのＭＷで検出される。Ｃ：複合体は、ハプテン及び抗ハプテン抗体の誤った組み合わせが使用された場合、形成されない。

【図60】ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体及び抗ＣＤ３３／ビオチン二重特異性抗体（左上パネル）及び遊離ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体（右上パネル）の複合体は、効果的にエンドサイトーシスされず（細胞溶解物、線）、（３．８/mlローディング）側底（左列、明るい灰色）又は頂端（右列、黒色）コンパートメント中に輸送されない。抗ＴｆＲ／ビオチン二重特異性抗体１（左下パネル）又は抗ＴｆＲ／ビオチン二重特異性抗体２（右下パネル）のいずれかを用いてビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体を複合体化することによって、側底（左列、明るい灰色）コンパートメント中へのビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体の効果的なエンドサイトーシス（細胞溶解物、線）及びその後の輸送、並びに頂端（右列、黒色）コンパートメント中への戻りが媒介される（３．８μg/mlローディング）。

【図61】ハプテン化ペイロードの、及びハプテン結合二重特異性抗体の血液脳関門シャトルモジュールの内皮細胞からのトランスサイトーシス及び放出のトランスウェルアッセイ；ＴｆＲ（ＴｆＲ２）に対して低下した親和性を伴う二重特異性抗体及び非結合二重特異性抗体（抗ＣＤ３３）を使用、並びに、３４ｍｅｒオリゴヌクレオチドペイロード（オリゴヌクレオチドＳ１）を使用。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ：ＤＮＡペイロードのｑＰＣＲ定量化Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ： 血液脳関門シャトルモジュール（二重特異性抗体）のＥＬＩＳＡ定量化Ａ、Ｅ：抗ＴｆＲ２−Ｂｉｏ ＋ Ｂｉｏ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドＳ１Ｂ、Ｆ：抗ＣＤ３３−Ｂｉｏ ＋ Ｂｉｏ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドＳ１Ｃ、Ｇ：抗ＴｆＲ２−Ｄｉｇ ＋ Ｄｉｇ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドＳ１Ｄ、Ｈ：抗ＣＤ３３−Ｄｉｇ ＋ Ｄｉｇ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドＳ１

【図62】ハプテン化ペイロードの、及びハプテン結合二重特異性抗体の血液脳関門シャトルモジュールの内皮細胞からのトランスサイトーシス及び放出のトランスウェルアッセイ；ＴｆＲ（ＴｆＲ２）に対して低下した親和性を伴う二重特異性抗体及び非結合二重特異性抗体（抗ＣＤ３３）を使用、並びに、２８ｍｅｒオリゴヌクレオチドペイロード（オリゴヌクレオチドＳ２）を使用。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ：オリゴヌクレオチドペイロードのｑＰＣＲ定量化Ｅ、Ｆ、Ｇ：血液脳関門シャトルモジュール（二重特異性抗体）のＥＬＩＳＡ定量化Ａ、Ｅ：抗ＴｆＲ２−Ｂｉｏ ＋ Ｂｉｏ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドＳ２Ｂ、Ｆ：抗ＣＤ３３−Ｂｉｏ ＋ Ｂｉｏ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドＳ２Ｃ、Ｇ：抗ＴｆＲ２−Ｄｉｇ ＋ Ｄｉｇ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドＳ２Ｄ：抗ＣＤ３３−Ｄｉｇ ＋ Ｄｉｇ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドＳ２Ｈ：Ｄｉｇ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドＳ２ペイロードだけ。

【図63】ハプテン化ペイロードの、及びハプテン結合二重特異性抗体の血液脳関門シャトルモジュールの内皮細胞からのトランスサイトーシス及び放出のトランスウェルアッセイ；ＴｆＲ（ＴｆＲ１）に対して高親和性を伴う二重特異性抗体を使用、及び、３４ｍｅｒオリゴヌクレオチドペイロード（オリゴヌクレオチドＳ１）又は２８ｍｅｒオリゴヌクレオチドペイロード（オリゴヌクレオチドＳ２）を使用。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ：ＤＮＡペイロードのｑＰＣＲ定量化Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ：血液脳関門シャトルモジュール（二重特異性抗体）のＥＬＩＳＡ定量化Ａ、Ｅ：抗ＴｆＲ１−Ｂｉｏ ＋ Ｂｉｏ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドＳ１Ｂ、Ｆ：抗ＴｆＲ１−Ｄｉｇ ＋ Ｄｉｇ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドＳ１Ｃ、Ｇ：抗ＴｆＲ１−Ｂｉｏ ＋ Ｂｉｏ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドＳ２Ｄ、Ｈ：抗ＴｆＲ１−Ｄｉｇ ＋ Ｄｉｇ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドＳ２

【0186】

［発明の詳細な説明］
Ｉ．定義
本明細書において使用する通り、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置が、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において記載されるＫａｂａｔナンバリングシステムに従って番号付けされており、本明細書において「Ｋａｂａｔに従ったナンバリング」として言及される。具体的には、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＫａｂａｔナンバリングシステム（ページ６４７−６６０を参照のこと）は、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬのために使用され、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（ページ６６１−７２３を参照のこと）は、定常重鎖ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３）のために使用される。

【0187】

本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下の通りに定義されるヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得る、或いは、それは、アミノ酸配列変化を含み得る。一部の実施形態において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、或いは２以下である。一部の実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と、配列において同一である。

【0188】

用語「アミノ酸」は、天然に生じる、即ち、直接的に、若しくは前駆体の形態で、核酸によりコードされ得るか、又は非天然に生じる、カルボキシαアミノ酸の群を意味する。個々の自然に生じるアミノ酸は、３つのヌクレオチド、いわゆる、コドン又は塩基トリプレットからなる核酸によりコードされる。各々のアミノ酸は、少なくとも１つのコドンによりコードされる。これは、「遺伝コードの縮重」として公知である。本願内で使用する用語「アミノ酸」は、天然に生じるカルボキシαアミノ酸を意味し、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）を含む。非天然に生じるアミノ酸の例は、Ａａｄ（アルファ−アミノアジピン酸）、Ａｂｕ（アミノ酪酸）、Ａｃｈ（アルファ‐アミノシクロヘキサン‐カルボン酸）、Ａｃｐ（アルファ−アミノシクロペンタン‐カルボン酸）、Ａｃｐｃ（１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸）、Ａｉｂ（アルファ−アミノイソ酪酸）、Ａｉｃ（２−アミノインダン−２−カルボン酸；また、２−２−Ａｉｃと呼ばれる）、１−１−Ａｉｃ（１−アミノインダン−１−カルボン酸）、（２−アミノインダン−２−カルボン酸）、アリルグリシン（ＡｌｌｙｌＧｌｙ）、アロイソロイシン（ａｌｌｏ−Ｉｌｅ）、Ａｓｕ（アルファ−アミノスベリン酸、２−アミノオクタン酸（Ａｍｉｎｏｏｃｔａｎｅｄｉｏｃ ａｃｉｄ））、Ｂｉｐ（４−フェニル−フェニルアラニン−カルボン酸）、ＢｎＨＰ（（２Ｓ、４Ｒ）−４−ヒドロキシプロリン）、Ｃｈａ（ベータ−シクロヘキシルアラニン）、Ｃｉｔ（シトルリン）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロペンチルアラニン（Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙｌａｌａｎｉｎｅ）、ベータ−シクロプロピルアラニン、Ｄａｂ（１，４−ジアミノ酪酸）、Ｄａｐ（１，３−ジアミノプロピオン酸）、ｐ（３，３−ジフェニルアラニンカルボン酸）、３，３−ジフェニルアラニン、ジ−ｎ−プロピルグリシン（Ｄｐｇ）、２−フリルアラニン、ホモシクロヘキシルアラニン（ＨｏＣｈａ）、ホモシトルリン（ＨｏＣｉｔ）、ホモシクロロイシン、ホモロイシン（ＨｏＬｅｕ）、ホモアルギニン（ＨｏＡｒｇ）、ホモセリン（ＨｏＳｅｒ）、ヒドロキシプロリン、Ｌｙｓ（Ａｃ）、（１）Ｎａｌ（１−ナフチルアラニン）、（２）Ｎａｌ（２−ナフチルアラニン）、４−ＭｅＯ−Ａｐｃ（１−アミノ−４−（４−メトキシフェニル） − シクロヘキサン−１−カルボン酸）、ノル−ロイシン（Ｎｌｅ）、Ｎｖａ（ノルバリン）、オマチン（Ｏｍａｔｈｉｎｅ）、３−Ｐａｌ（アルファ−アミノ−３−ピリジルアラニン−カルボン酸）、４−Ｐａｌ（アルファ−アミノ−４−ピリジルアラニン−カルボン酸）、３，４，５，Ｆ３−Ｐｈｅ（３，４，５−トリフルオロ−フェニルアラニン）、２，３，４，５，６，Ｆ５−Ｐｈｅ（２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−フェニルアラニン）、Ｐｑａ（４−オキソ−６−（１−ピペラジニル）−３（４Ｈ）−キナゾリン−酢酸（ＣＡＳ ８８９９５８−０８−１））、ピリジルアラニン、キノリルアラニン（Ｑｕｉｎｏｌｙｌａｌａｎｉｎｅ）、サルコシン（Ｓａｒ）、チアゾリルアラニン、チエニルアラニン、Ｔｉｃ（アルファ−アミノ−１，２，３，４テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）、Ｔｉｃ（ＯＨ）、Ｔｌｅ（タートブチルグリシン）、及びＴｙｒ（Ｍｅ）を含むが、これらに限定されない。

【0189】

用語「アミノ酸配列バリアント」は、天然／親／野生型アミノ酸配列とある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。通常、アミノ酸配列バリアントは、天然／親／野生型アミノ酸配列と少なくとも約７０%の配列同一性を持つ。一実施形態において、バリアントは、天然／親／野生型アミノ酸配列と約８０%以上の配列同一性を有する。一実施形態において、バリアントは、天然／親／野生型アミノ酸配列と約９０%以上の配列同一性を有する。一実施形態において、バリアントは、天然／親／野生型アミノ酸配列と約９５%以上の配列同一性を有する。一実施形態において、バリアントは、天然／親／野生型アミノ酸配列と約９８%以上の配列同一性を有する。アミノ酸配列バリアントは、天然／親／野生型アミノ酸配列のアミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、及び／又は挿入を持つ。アミノ酸は、従来の名称、１文字及び３文字コードにより指定することができる。

【0190】

本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味において使用され、それらが、所望の抗原結合活性及び特異性を示す限り、種々の抗体構造（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントを含むが、これらに限定されない）を包含する。

【0191】

用語「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体も特異的に結合する抗原に特異的に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を意味する。抗体フラグメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例、ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂフラグメント（ｓｃＦａｂ）、単一重鎖抗体（ＶＨＨ）、及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。

【0192】

抗体のパパイン消化によって、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント（各々が、単一の抗原結合部位を伴う）、及び残りの「Ｆｃ」フラグメント（その名称は、容易に結晶化するその能力を反映する）が産生される。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することが可能であるＦ（ａｂ’）_２フラグメントがもたらされる。

【0193】

Ｆａｂフラグメントは、また、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含む、重鎖ＣＨｌドメインのカルボキシル末端での数個の残基の付加により、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆａｂ’についての本明細書における命名であり、それにおいて、定常ドメインのシステイン残基は、少なくとも１つの遊離チオール基を担持する。Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメントは、本来は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として産生された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公知である。

【0194】

「Ｆｖ」は完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、堅固な非共有結合的会合における１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各々の可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義する。集合的に、６つの超可変領域が、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（又は、抗原について特異的なわずか３つの超可変領域を含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し、それに結合する能力を有するが、全体的な結合部位よりも低い親和性である。

【0195】

用語「ビオチン」、短い「ＢＩ」は、５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタン酸を意味する。ビオチンは、また、ビタミンＨ又は補酵素Ｒとして公知である。

【0196】

用語「ビオチン化ペイロード」は、ビオチン部分、場合により、リンカー及びペイロードを含むコンジュゲーションされた実体を意味する。リンカーは、任意のリンカー（例えばペプチドリンカー又は化学的リンカーなど）であり得る。

【0197】

用語「二重特異性抗体」は、２つの異なる（抗原／ハプテン）結合特異性を有する抗体を意味する。一実施形態において、本明細書において報告する二重特異性抗体は、２つの異なる抗原（即ち、ハプテン及び非ハプテン抗原）について特異的である。

【0198】

用語「ブロモデオキシウリジン」、短い「ＢｒｄＵ」は、５−ブロモ−２’−デソキシウリジン（ｄｅｓｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）を意味する。ブロモデオキシウリジンは、また、ブロクスウリジン（ｂｒｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ＢｕｄＲ、ＢｒｄＵｒｄとして公知である。

【0199】

用語「ブロモデオキシウリジン化ペイロード」は、ブロモデオキシウリジン部分、場合により、リンカー及びペイロードを含むコンジュゲーションされた実体を意味する。リンカーは、任意のリンカー（例えばペプチドリンカー又は化学的リンカーなど）であり得る。

【0200】

用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の供給源又は種に由来している抗体を指し、重鎖及び／又は軽鎖の残り部分は、異なる供給源又は種に由来する。

【0201】

抗体の「クラス」は、その重鎖により持たれる定常ドメイン又は定常領域の型を指す。抗体の５つの主要なクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）、及びこれらのいくつかを、サブクラス（アイソタイプ）（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）に更に分けてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0202】

用語「細胞傷害性薬剤」は、本明細書において使用する通り、細胞機能を阻害若しくは防止する、及び／又は細胞死若しくは破壊を起こす物質を指す。細胞傷害性薬剤は、特定のペイロードである。細胞傷害性薬剤は、放射性同位体（例、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法薬剤又は薬物（例、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、又は他の挿入剤）；成長阻害剤；酵素及びそれらのフラグメント、例えば核酸分解酵素など；抗生物質；毒素、例えば細菌、真菌、植物、又は動物起源の小分子毒素又は酵素活性毒素（それらのフラグメント及び／又はバリアントを含む）；及び以下に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌薬剤を含むが、これらに限定されない。

【0203】

用語「ジゴキシゲニン」、短い「ＤＩＧ」は、３−［（３Ｓ，５Ｒ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）−３，１２，１４−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−１，２，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−シクロペンタ［ａ］−フェナントレン−１７−イル］−２Ｈ−フラン−５−オン （ＣＡＳ番号１６７２−４６−４）を意味する。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）は、植物ジギタリス・パープレア（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ジギタリス・オリエンタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、及びジギタリス・ラナタ（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌａｎａｔａ）（フォックスグローブス）の花及び葉においてもっぱら見出されるステロイドである（Polya, G., Biochemical targets of plant bioactive compounds, CRC Press, New York (2003) p. 847）。

【0204】

用語「ジゴキシゲニン化ペイロード」は、ジゴキシゲニン部分、場合により、リンカー及びペイロードを含むコンジュゲーションされた実体を意味する。リンカーは、任意のリンカー（例えばペプチドリンカー又は化学的リンカーなど）であり得る。

【0205】

用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因し得る、それらの生物学的活性を意味し、それらは、抗体クラスに伴って変動する。抗体エフェクター機能の例は以下を含む：Ｃ１ｑ結合及び補体依存的細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存的細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例、Ｂ細胞受容体）の下方調節；及びＢ細胞活性化。エフェクター機能を伴わないＦｃ領域（＝エフェクターレスＦｃ領域）は、Ｃ１ｑ又はＦｃγ受容体へのＦｃ領域の結合を消失させる、アミノ酸配列における変異を含む。

【0206】

薬剤（例、医薬的製剤）の用語「効果的な量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な投与量で、及び期間にわたり効果的である量を意味する。

【0207】

本明細書における用語「Ｆｃ領域」を使用し、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義する。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在し得る、又はしないことがある。本明細書において他に特定しない場合、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従い、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242において記載される通りである。

【0208】

用語「フルオレセイン」、短い「ＦＬＵＯ」は、６−ヒドロキシ−９−（２−カルボキシフェニル）−（３Ｈ）−キサンテン−３−オン、或いは、２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−（３Ｈ）−キサンテン（ｘａｎｔｈｅｎ）−９−イル）−安息香酸を意味する。フルオレセインは、また、レゾルシノールフタレイン、Ｃ．Ｉ．４５３５０、溶媒イエロー９４、Ｄ ＆ Ｃイエローｎｏ．７、アンギオフルオル（ａｎｇｉｏｆｌｕｏｒ）、ジャパンイエロー２０１、又はソープイエローとして公知である。

【0209】

用語「フルオレセイン化ペイロード」は、フルオレセイン部分、場合により、リンカー及びペイロードを含むコンジュゲーションされた実体を意味する。リンカーは、任意のリンカー（例えばペプチドリンカー又は化学的リンカーなど）であり得る。

【0210】

用語「フレームワーク」、短い「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の重鎖及び軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基を意味する。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメインからなる：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）において、以下の配列中で現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。

【0211】

用語「人工システイン残基」は、（親）抗体又は（親）ポリペプチド中に操作されたシステインアミノ酸残基を意味し、それらは、チオール官能基（ＳＨ）を有し、それらは、分子内ジスルフィド架橋として対になっていない。それにもかかわらず、人工システイン残基は、分子間ジスルフィド架橋として（例、グルタチオンを用いて）対になることができる。

【0212】

用語「完全長抗体」は、天然の抗体構造に実質的に類似する構造を有する、又は本明細書において定義するＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を意味する。天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。ＮからＣ末端へ、各々の重鎖は、可変領域（ＶＨ）（可変重ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる）を有しており、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）が続く。同様に、ＮからＣ末端へ、各々の軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（可変軽ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる）を有しており、定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの型（カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる）の１つに割り当てられ得る。

【0213】

「完全長抗体」は、ＶＬ及びＶＨドメイン、並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む抗体である。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例、ヒト天然配列の定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列バリアントであり得る。完全長抗体は、抗体のＦｃ定常領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に起因する、それらの生物学的活性を指す、１つ又は複数の「エフェクター機能」を有し得る。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合；補体依存的細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存的細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；並びに細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体及びＢＣＲなど）の下方調節を含む。

【0214】

用語「ハプテン」は、大きな担体（例えばタンパク質など）に付着された場合にだけ、免疫応答を誘発することができる小分子を意味する。例示的なハプテンは、アニリン、ｏ、ｍ、及びｐアミノ安息香酸、キノン、ヒスタミン−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）、ヒドララジン、ハロタン、インジウムＤＴＰＡ、フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、テオフィリン、ブロモデオキシウリジン、並びにジニトロフェノールである。一実施形態において、ハプテンは、ビオチン又はジゴキシゲニン又はテオフィリン又はフルオレセイン又はブロモデオキシウリジンである。

【0215】

用語「ハプテン化ペイロード」は、ペイロードに（共有結合的に）コンジュゲーションされたハプテンを意味する。活性化ハプテン誘導体は、そのようなコンジュゲートの形成のための出発材料として使用することができる。一実施形態において、ハプテンは、リンカーを介して（一実施形態において、その３ヒドロキシ基を介して）ペイロードにコンジュゲーションされる。一実施形態において、リンカーは、ａ）１つ又は複数の（一実施形態において、３から６の）メチレン−カルボキシ−メチル基（−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−）、及び／又はｂ）１から１０の（一実施形態において、１から５の）アミノ酸残基（一実施形態において、グリシン、セリン、グルタミン酸、βアラニン、γアミノ酪酸、εアミノカプロン酸、又はリジンより選択される）、及び／又はｃ）構造式ＮＨ_２−［（ＣＨ_２）ｎＯ］ｘＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＯＯＨ（式中、ｎは２又は３であり、ｘは１から１０であり、一実施形態において、１から７である）を有する１つ又は複数の（一実施形態において、１又は２の）化合物を含む。最後のエレメントは、式−ＮＨ−［（ＣＨ_２）ｎＯ］ｘＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−のリンカー（部分）を（少なくとも部分的に）もたらす。そのような化合物の１つの例は、例えば、１２アミノ４，７，１０トリオキサドデカン酸（ＴＥＧ（トリエチレン）リンカーをもたらす）である。一実施形態において、リンカーは、マレイミド基を更に含む。リンカーは、安定化及び可溶化効果を有する。なぜなら、それは電荷を含む、又は／及び、水素架橋を形成することができるからである。また、それは、ハプテン化ペイロードへの抗ハプテン抗体の結合を立体的に促進することができる。一実施形態において、リンカーは、ペイロード（一実施形態において、ポリペプチド）のアミノ酸の側鎖にコンジュゲーションされている（例、アミノ基又はチオール基を介してリジン又はシステイン側鎖にコンジュゲーションされている）。一実施形態において、リンカーは、ペイロード（一実施形態において、ポリペプチド）のアミノ末端又はカルボキシ末端にコンジュゲーションされている。ペイロードへのリンカーのコンジュゲーション位置は、典型的には、リンカーへのコンジュゲーションが、ペイロードの生物学的活性に影響しない領域中になるように選ばれる。したがって、リンカーの付着位置は、ペイロードの性質及びペイロードの生物学的活性に関与している関連構造エレメントに依存する。ハプテンが付着しているペイロードの生物学的活性は、インビトロアッセイにおいて、コンジュゲーションの前後に試験することができる。

【0216】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、それらは、継代の数にかかわらず、一次形質転換細胞及びそれらに由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸含量において完全に同一ではないことがあり、しかし、変異を含み得る。本来は形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異子孫が、本明細書において含まれる。

【0217】

「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生される、又は、ヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を持つものである。ヒト抗体のこの定義では、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が除外される。

【0218】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全て又は実質的に全てを含み、それにおいて、ＨＶＲ（例、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体の「ヒト化形態」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を受けた抗体を指す。

【0219】

用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、本明細書において使用する通り、配列（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）中で超可変である、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触部」）を含む、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般的に、抗体は６つのＨＶＲを含む；ＶＨ中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。

【0220】

本明細書におけるＨＶＲは、以下を含む：
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触部（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；並びに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）、及び９４−１０２（Ｈ３）を含む（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ。

【0221】

「個体」又は「被験者」は哺乳動物である。哺乳動物は、家畜（例、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサルなど）、ウサギ、及び齧歯類（例、マウス及びラット）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、個体又は被験者はヒトである。

【0222】

「単離」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。一部の実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定される通り、９５%を上回る、又は９９%の純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の概説については、例えば、Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87を参照のこと。

【0223】

「単離」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸は、通常、核酸分子を含む細胞中に含まれる核酸分子を含むが、しかし、核酸分子は、染色体外に、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在している。

【0224】

本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、集団を含む個々の抗体は、同一であり、及び／又は可能なバリアント抗体（例、天然に生じる変異を含む、又は、モノクローナル抗体調製の産生の間に生じる。そのようなバリアントは、一般的に、少量で存在する）を除き、同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた、異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。このように、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られるとして、抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を要求するとして解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、種々の技術（ハイブリドーマ方法、組換えＤＮＡ方法、ファージディスプレイ方法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は部分を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない）により作製され得る。モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法が、本明細書において記載されている。

【0225】

用語「単一特異性抗体」は、各々が、同じ結合特異性を有する、即ち、同じ抗原又はハプテンに結合する、１つ又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。

【0226】

「ネイキッド抗体」は、異種部分（例、細胞傷害性部分）又は放射標識にコンジュゲーションされていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、医薬的製剤中に存在し得る。

【0227】

用語「添付文書」を使用し、治療的産物の市販パッケージ中に習慣的に含まれる説明書を指し、それには、そのような治療的産物の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、併用治療、禁忌、及び／又は警告に関する情報が含まれている。

【0228】

用語「ペイロード」は、ハプテンにコンジュゲーションすることができる、任意の分子又は分子の組み合わせを意味する。用語「ペイロード」は、さらに、その生物学的活性が、細胞又は組織（中）に送達及び／又は局在化されることが望まれる部分を意味する。ペイロードは、標識、化学療法薬剤、抗血管新生剤、細胞毒（例、シュードモナス外毒素、リシン、アブリン、ジフテリア毒素など）、サイトカイン、プロドラッグ、酵素、成長因子、転写因子、薬物、放射性核種、リガンド、抗体又はそれらのフラグメント、リポソーム、ナノ粒子、ウイルス粒子、サイトカインなどを含むが、これらに限定されない。

【0229】

「化学療法薬剤」は、癌の処置において有用な化学的化合物である。化学療法薬剤の例は、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（CYTOXAN（商標））など；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなど；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパなど；エチレンイミン及びメチルアミルアミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホアミド、トリエチレン、及びトリメチロメラミンを含む）；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなど；抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、ミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプト、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなど；抗代謝産物、例えばメトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなど；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；葉酸補充液、例えばフロリン（ｆｒｏｌｉｎｉｃ）酸など；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォルニチン；エリプチニウム酢酸；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えばパクリタキセル（TAXOL（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology、Princeton、NJ）及びドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、Rh6ne-Poulenc Rorer、Antony、France）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−ＩＩ；３５トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；及び上記のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸、又は誘導体を含む。また、この定義において含まれるのは、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン薬剤、例えば抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む）；並びに抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに上記のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸、又は誘導体である。

【0230】

「抗血管新生剤」は、血管の発達を、ある程度、遮断する、又はそれに干渉する化合物を指す。抗血管新生剤は、例えば、血管新生を促す際に含まれる成長因子又は成長因子受容体に結合する小分子又は抗体であり得る。抗血管新生因子は、一実施形態において、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。

【0231】

用語「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用する１つの細胞集団により放出されるタンパク質の総称である。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインの間に含まれるのは、成長ホルモン（例えばヒト成長ホルモン、Ｎメチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンなど）；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン（例えば卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）など）；肝成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子α及びＰ；ミュラー管阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子（例えばＮＧＦ−ｐなど）；血小板成長因子；形質転換成長因子（ＴＧＦ）（例えばＴＧＦ−α及びＴＧＦ−ｐなど）；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン（例えばインターフェロンａ、Ｐ、及びｙなど）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えばマクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）など）；顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球ＣＳＦ（ＧＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬＳ）（例えばＩＬ−Ｉ、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−ＩＯ、ＩＬ−ＩＩ、ＩＬ−１２など）；腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−Ｐなど）；並びに他のポリペプチド因子（ＬＩＦ及びｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む）である。本明細書において使用する通り、用語「サイトカイン」は、天然供給源からの、又は組換え細胞培養物からのタンパク質及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。

【0232】

用語「ｆＭＬＰ」は、Ｎホルミルメチオニン、ロイシン、及びフェニルアラニンからなるトリペプチドを意味する。一実施形態において、エフェクター部分は、ｆＭＬＰ又はその誘導体である。

【0233】

用語「プロドラッグ」は、親薬物と比較し、腫瘍細胞にそれほど細胞傷害性ではなく、酵素的に活性化される、又は、より活性な親形態に変換されることが可能な医薬的に活性な物質の前駆体又は誘導体形態を指す。例えば、Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, Vol. 14, 615th Meeting Belfast (1986) pp. 375-382及びStella, et al., “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”, Directed Drug Delivery, Borchardt, et al., (eds.), pp. 247-267, Humana Press (1985)を参照のこと。エフェクター部分として使用することができるプロドラッグは、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄアミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、ｂラクタム含有プロドラッグ、場合により、置換フェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、又は、場合により、置換フェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５フルオロシトシン及び他の５フルオロウリジンプロドラッグ（それらは、より活性な細胞傷害性遊離薬物に変換されることができる）を含むが、これらに限定されない。本発明における使用のためのプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞傷害性薬物の例は、本明細書において記載する化学療法薬剤を含むが、これらに限定されない。

【0234】

用語「細胞毒素」は、細胞機能を阻害若しくは防止し、及び／又は、細胞死若しくは破壊を起こす物質を指す。細胞毒素は、放射性同位体（例、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法薬剤又は薬物（例、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入薬剤）；成長阻害剤；酵素及びそれらのフラグメント（例えば核酸分解酵素など）；抗生物質；毒素、例えば細菌、真菌、植物、又は動物起源の小分子毒素又は酵素活性毒素（それらのフラグメント及び／又はバリアントを含む）など；並びに、本明細書において開示する種々の抗腫瘍又は抗癌薬剤を含むが、これらに限定されない。

【0235】

参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（%）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、ギャップを導入し（必要な場合）、最高パーセント配列同一性を達成した後（任意の保存的置換を配列同一性の部分として考えず）、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当技術分野内にある種々の方法において、例えば、公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、又はMEGALIGN（商標）（DNASTAR）ソフトウェアなどを使用して達成することができる。当業者は、配列を整列させるための適切なパラメーター（比較されている配列の全長にわたる最高アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む）を決定することができる。本明細書における目的のために、しかし、%アミノ酸配列同一性の値を、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用して生成する。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムが、Genentech, Inc.により作成され、ソースコードが、米国著作権局（Washington D.C., 20559）において、ユーザー文書と提出されており、そこでは、それは、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ALIGN-2プログラムが、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaを通じて公的に利用可能である。ALIGN-2プログラムを、UNIX操作システム（デジタルUNIX V4.0Dを含む）上での使用のためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメーターが、ALIGN-2プログラムにより設定され、変動しない。

【0236】

ALIGN-2がアミノ酸配列比較のために用いられる状況において、所与のアミノ酸配列Ｂに、それと、又はそれに対する、所与のアミノ酸配列Ａの%アミノ酸配列同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂに、それと、又はそれに対する特定の%アミノ酸配列同一性を有する、又は含む所与のアミノ酸配列Ａとして表現することができる）を以下の通りに計算する：１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、Ａ及びＢのそのプログラムのアラインメントにおける配列アラインメントプログラムALIGN-2による同一のマッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、式中、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さとは等しくない場合、ＡのＢに対する%アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する%アミノ酸配列同一性とは等しくないと理解されるであろう。別に特記なき場合、本明細書において使用する全ての%アミノ酸配列同一性の値は、直前のパラグラフにおいて記載される通りに、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して得られる。

【0237】

用語「医薬的製剤」は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が効果的になることを許すような形態であり、及び製剤が投与され得る被験者に、非許容可能に有毒である追加成分を含まない調製物を指す。

【0238】

「医薬的に許容可能な担体」は、被験者に非毒性である、活性成分以外の、医薬的製剤中の成分を指す。医薬的に許容可能な担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含むが、これらに限定されない。

【0239】

「ポリペプチド」は、天然で又は合成的に産生されたかにかかわらず、ペプチド結合により連結されたアミノ酸からなるポリマーである。約２０アミノ酸残基未満のポリペプチドを「ペプチド」として言及してもよいのに対し、２つ以上のポリペプチドからなる、又は１００を上回るアミノ酸残基の１つのポリペプチドを含む分子を「タンパク質」として言及してもよい。ポリペプチドは、また、非アミノ酸成分、例えば糖基、金属イオン、又はカルボン酸エステルなどを含み得る。非アミノ酸成分は、細胞により加えられ得るが、それにおいて、ポリペプチドが発現され、細胞の型により変動し得る。ポリペプチドは、それらのアミノ酸骨格構造又は同をコードする核酸の点で、本明細書において定義される。付加基、例えば糖基などは、一般的に特定されないが、しかし、それにもかかわらず存在し得る。

【0240】

全てのポリペプチド配列が、一般的に受け入れられた慣習に従って書かれており、それにより、アルファ−Ｎ末端アミノ酸残基は左にあり、アルファ−Ｃ末端アミノ酸残基は右にある。本明細書において使用する通り、用語「Ｎ末端」は、ポリペプチド中のアミノ酸の遊離アルファ−アミノ基を指し、用語「Ｃ末端」は、ポリペプチド中のアミノ酸の遊離ａカルボン酸末端を指す。基を用いてＮ末端化されているポリペプチドは、Ｎ末端アミノ酸残基のアルファ−アミノ窒素上に基を担持するポリペプチドを指す。基を用いてＮ末端化されているアミノ酸は、アルファ−アミノ窒素上に基を担持するアミノ酸を指す。

【0241】

他に示さない場合、「Ｄ」の接頭辞（例、Ｄ−Ａｌａ又はＮ−Ｍｅ−Ｄ−Ｉｌｅ、又は小文字のフォーマットで書かれる（例、ａ、ｉ、１、（Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＬｅｕのＤバージョン））により、本明細書及び添付の特許請求の範囲において記載されるポリペプチド中のアミノ酸及びアミノアシル残基のアルファ炭素の立体化学は、天然又は「Ｌ」立体配置である。Ｃａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ「Ｒ」及び「Ｓ」の記号は、ポリペプチドのＮ末端での特定のアシル置換基におけるキラル中心の立体化学を特定するために使用される。記号「Ｒ、Ｓ」は、２つのエナンチオマー形態のラセミ混合物を示すことを意味する。この命名法は、Cahn, R.S., et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 5 (1966) 385-415において記載されるものに従う。

【0242】

用語「一本鎖Ｆｖ」、短い「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、それにおいて、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。一実施形態において、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを更に含み、それによって、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。ｓＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)を参照のこと。

【0243】

用語「テオフィリン」、短く「ＴＨＥＯ」は、１，３−ジメチル−７Ｈプリン−２，６−ジオンを意味する。テオフィリンは、また、ジメチルキサンチンとして公知である。

【0244】

用語「テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードは、テオフィリン部分、場合により、リンカー及びペイロードを含むコンジュゲーションされた実体を意味する。リンカーは、任意のリンカー（例えばペプチドリンカー又は化学的リンカーなど）であることができる。

【0245】

用語「処置」（及び、その文法的なバリエーション、例えば「処置する」又は「処置している」など）は、処置されている個体の自然経過を変化させる意図における臨床介入であり、予防のために、又は臨床病理の経過の間のいずれかに実施することができる。処置の所望の効果は、疾患の発生又は再発を防止すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的転帰の減弱、転移を防止すること、疾患進行の速度を減少させること、疾患状態の寛解又は緩和、及び寛解又は改善された予後を含む。一部の実施形態において、本発明の抗体を使用し、疾患の発生を遅延させる、又は、疾患の進行を遅らせる。

【0246】

用語「ｘ価」（例、「一価」又は「二価」又は「三価」又は「四価」）は、抗体分子における結合部位の特定された数、即ち、「ｘ」の存在を意味する。そのようなものとして、用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、それぞれ、抗体分子中の２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を意味する。本明細書において報告する二重特異性抗体は、少なくとも「二価」であり、「三価」又は「多価」（例、「四価」又は「六価」）であり得る。一実施形態において、本明細書において報告する二重特異性抗体は、二価、三価、又は四価である。一実施形態において、二重特異性抗体は二価である。一実施形態において、二重特異性抗体は三価である。一実施形態において、二重特異性抗体は四価である。

【0247】

特定の態様及び実施形態において、本明細書において報告する抗体は、２つ以上の結合部位を有し、二重特異性である。すなわち、抗体は、２を上回る結合部位がある（即ち、抗体が三価又は多価である）場合においてでさえ、二重特異性であり得る。用語「二重特異性抗体」は、例えば、多価一本鎖抗体、ダイアボディ及びトリアボディ、並びに完全長抗体の定常ドメイン構造を有する抗体（それには、さらなる抗原結合部位（例、一本鎖Ｆｖ、ＶＨドメイン、及び／又はＶＬドメイン、Ｆａｂ又は（Ｆａｂ）２）が、１つ又は複数のペプチドリンカーを介して連結されている）を含む。抗体は、単一の種からの完全長である、又は、キメラ化若しくはヒト化されることができる。２を上回る抗原結合部位を伴う抗体について、一部の結合部位は、タンパク質が、２つの異なる抗原についての結合部位を有する限り、同一であり得る。すなわち、第１の結合部位が、ハプテンについて特異的であるのに対し、第２の結合部位は、非ハプテン抗原について特異的であり、及び、その逆も同様である。

【0248】

用語「可変領域」は、抗体をその抗原に結合させる際に含まれる抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを意味する。天然抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは、一般的に、類似の構造を有し、各々のドメインが、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む（例、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照のこと）。単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体からのＶＨドメイン又はＶＬドメインを使用して単離し、相補的ＶＬドメイン又はＶＨドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングしてもよい。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887;Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照のこと。

【0249】

用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝搬することが可能である核酸分子を意味する。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、並びに、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結された核酸の発現に向けることが可能である。そのようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」として言及される。
ＩＩ．本明細書において報告するコンジュゲート

【0250】

本明細書において報告するのは、ハプテンについての第１の結合特異性及び血液脳関門受容体（ＢＢＢＲ）についての第２の結合特異性を伴う二重特異性抗体である血液脳関門シャトルモジュール（ＢＢＢシャトルモジュール）である。そのようなＢＢＢシャトルモジュールは、血液脳関門上のトランスサイトーシス可能な細胞表面標的（例えばＴｆＲ、ＬＲＰ又は他の標的、ＢＢＢＲなど）を認識し、ハプテン化ペイロードに同時に結合する。

【0251】

結合価、抗体フォーマット、ＢＢＢＲ結合親和性に関するさらなる要求を満たさなくてもよいことが見出されている。

【0252】

さらに、本明細書において報告する二重特異性抗体ベースのシャトルモジュールが、ハプテン化ペイロードのトランスサイトーシスを媒介するために、血液脳関門の内皮細胞から放出されることが要求されないことが見出されている。代わりに、ハプテン化ペイロードは、ＢＢＢＲへの結合時に二重特異性抗体ベースのシャトルモジュールにより複合体化され／それに結合し、ＢＢＢ細胞内で、即ち、細胞内小胞システムにおいて二重特異性抗体ベースのシャトルモジュールから放出され、シャトルモジュールから分離され、その後、ＢＢＢ細胞から脳中へエキソサイトーシスされ、ＢＢＢ細胞中に二重特異性抗体を残す。

【0253】

本明細書において報告する二重特異性抗体ベースのシャトルモジュールは、結合特異性の価数並びにＢＢＢＲ結合特異性の親和性の点で非常に変動している。同時に、それによって、シャトルモジュールからのペイロード放出が可能になる。
非共有結合複合体

【0254】

本明細書において報告する二重特異性抗体は、治療的又は診断的ペイロードのためのハプテン化ペイロード送達媒体として使用される。治療的又は診断的ペイロードは、ハプテンを用いてコンジュゲーションされ、このように、本明細書において報告する二重特異性抗体のハプテン結合部位により複合体化される。この複合体は定義され、安定であり、ハプテン化ペイロードを標的細胞又は組織に送達する。ハプテン化された治療的又は診断的ペイロードは、二重特異性抗体により、非共有結合の様式において複合体化されるため、ハプテン化ペイロードは、一方で、循環中のその時間の間に、その送達媒体（＝二重特異性抗体）に結合されるが、しかし、また、他方で、内在化又はトランスサイトーシス後に効率的に放出されることができる。ハプテンを用いたコンジュゲーションは、治療的又は診断的ペイロードの活性に干渉することなくもたらすことができる。二重特異性抗体は、異常な共有結合的付加を含まず、したがって、免疫原性の任意のリスクを未然に防ぐ。したがって、この単純な複合体化手順は、１つだけの抗ハプテン抗体との組み合わせにおいて、任意のペイロードのために使用することができる；例えば、ペプチド、タンパク質、小分子、造影試薬、及び核酸。ハプテン特異的結合部位を含む、本明細書において報告する二重特異性抗体を用いたハプテン化された診断的又は治療的ペイロードの複合体は、診断的又は治療的ペイロードに（例、診断的又は治療的ポリペプチド或いは小分子に）、良性の生物物理学的挙動及び改善されたＰＫパラメーターを付与する。さらに、そのような複合体は、二重特異性抗体の第２の結合特異性により認識される抗原を示す細胞又は組織への送達ロードを標的化することが可能である。

【0255】

標的組織及び標的細胞への核酸の特異的標的化及び送達は、主要な課題である。治療的適用のために、均質な定義された実体が望まれる。抗体又は抗体フラグメント媒介核酸送達が、いくつかの例において示されている（例、Lieberman et al., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 709）。特に興味深いのは、標的組織及び標的細胞への二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）の特異的な標的化及び送達である。二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知である高度に保存された調節機構において遺伝子発現を遮断することが示されている。ｄｓＲＮＡは、良好な安定性を伴う抗体にコンジュゲーションさせ、特定の標的化を保証し、全身性の非特定の放出を避けることができる。他方、ｄｓＲＮＡは、標的細胞で、又はその内で放出され、細胞中への侵入を可能にしなければならない。

【0256】

本明細書において報告する二重特異性抗体は、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）のための送達媒体として使用することができる。このように、本発明は、標的化遺伝子治療のための特異的な送達プラットフォーム、標的化ＲＮＡｉ、及び標的化ＬＮＡ送達を提供する。

【0257】

一実施形態において、ハプテン化核酸及び本明細書において報告する二重特異性抗体の複合体は、細胞又は組織への核酸の特異的な標的化送達のために使用される。核酸は、ハプテン化されている、並びに抗体により複合体化されているにもかかわらず、それらの機能性を保持する。また、二重特異性抗体の血液脳関門受容体結合部位は、複合体化したハプテン化核酸の存在において、その結合特異性及び親和性を保持する。本明細書において報告する二重特異性抗体を伴うハプテン化核酸の複合体は、核酸を、血液脳関門受容体を発現する細胞に特異的に標的化するために使用することができる。それにより、トランスサイトーシス後に血液脳関門受容体又は脳により認識される細胞を、核酸により選択的に対処され、核酸により起こされる活性（例、ＲＮＡｉ又は核酸媒介性細胞傷害性）は、したがって、血液脳関門受容体を発現する細胞又は脳において増強されている。一実施形態において、これらの活性は、標的化エンドソームに調節剤を追加的に適用することにより、更に増強される。核酸は、抗原発現細胞に特異的に送達されるだけでなく、しかし、また、標的細胞中に内在化されるようになる。ハプテン化核酸は、本明細書において報告する二重特異性抗体への非共有結合様式においてカップリングされるため、ペイロード（例、核酸）は、内在化又はトランスサイトーシス後に放出されることができる。

【0258】

１つの好ましい実施形態において、核酸はＤＮＡである。１つの好ましい実施形態において、核酸はｄｓＲＮＡである。１つの好ましい実施形態において、核酸はＬＮＡである。

【0259】

それらの活性（例、ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡの特異的破壊）を媒介するために、治療的又は診断的な核酸は、それらの標的細胞の細胞質にアクセスしなければならない。特定の核酸活性の送達のための１つの重要な因子は、分子が細胞に送達されるだけでなく、しかし、また、核酸の十分な量が、これらの細胞の細胞質中に移動されなければならないことである。そのために、これらの分子は、少なくとも１回、生体膜に浸透しなければならない。生物製剤は、膜を横切って簡単に通過しないため、このプロセスは、核酸活性の効果的な送達のために克服しなければならないボトルネックである。このボトルネックを克服するための手段は、膜浸透、膜を横切るタンパク質移行、又は膜破壊プロセスを含み得るエンドソームエスケープ又は小胞エスケープ機構であり得る。

【0260】

一実施形態において、本明細書において報告する二重特異性抗体又は、ハプテン化核酸を伴う、本明細書において報告する二重特異性抗体の非共有結合複合体は、エンドソーム機能のモジュレーター、又はエンドソームエスケープ／破壊モジュールが連結された核酸送達モジュールとして使用される。一実施形態において、エンドソームエスケープモジュールは、ペプチドを含む。

【0261】

一実施形態において、エンドソームエスケープモジュールは、ダイナミックポリコンジュゲート（ＤＰＣ）を含む。ＤＰＣは、細胞結合及び内在化時に、ｓｉＲＮＡのエンドソームエスケープを起こす化学的実体である（Rozema, D.B., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(2007) 12982-12987）。そのようなＤＰＣは、ＰＢＡＶＥ（ブチルアミノビニルエーテルのポリマー）スキャフォールドで構成されており、それには、ＰＥＧ分子が、二官能性マレアミド（ｍａｌｅａｍａｔｅ）連結を使用して可逆的に付着されている。後者について、カルボキシル化ジメチルマレイン酸（ＣＤＭ）を適用することができる。ＰＥＧユニットを使用し、ＰＢＡＶＥのエンドソーム溶解正電荷を遮蔽する。また、ＰＢＡＶＥに連結されているのは、ｓｉＲＮＡカーゴである（例、可逆的ジスルフィド結合を介した）。結果として得られた送達媒体は、ｓｉＲＮＡダイナミックポリコンジュゲートと呼ばれる。なぜなら、ｓｉＲＮＡは、遮蔽基（及び追加の標的リガンド）が、可逆的な様式で、ポリマーにコンジュゲーションされているからである。ｓｉＲＮＡの細胞質送達を起こす、そのようなＤＰＣのエンドソーム溶解特性は、その化学的環境により誘導される：成熟エンドリソーム（ｅｎｄｏｌｙｓｏｍｅｓ）内のｐＨにおける減少は、ＣＤＭ−ＰＥＧの放出を誘導し、順に、エンドソーム溶解（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｓｉｓ）を媒介するＰＢＡＶＥの正電荷を曝露する。

【0262】

したがって、一実施形態において、二重特異性ハプテン化ペイロード送達システムの特異的標的特性を伴うＤＰＣのエンドソーム溶解特色を組み合わせる。

【0263】

一実施形態において、本明細書において報告する二重特異性抗体及びハプテン化核酸の非共有結合複合体が、イメージング分析のために使用される。本実施形態において、核酸は、ハプテン及び検出可能な標識に同時にコンジュゲーションされる。それにより、血液脳関門受容体を発現する細胞に標的化された核酸の局在化を、顕微鏡又は他のイメージング技術により可視化することが可能である。一実施形態において、検出可能な標識は、蛍光標識である。一実施形態において、核酸の局在化は、細胞において、即ち、インビトロで可視化される。別の実施形態において、核酸の局在化は、インビボで可視化される。

【0264】

それらの化学的及び物理的特性（例えば分子量及びドメイン構築物（二次改変を含む）など）のため、抗体の下流プロセシングは、非常に複雑である。例えば、製剤化薬物のためだけでなく、下流プロセシング（ＤＳＰ）における中間体のためにも、濃縮溶液が、経済的な取り扱い及び適用保存のための低容積を達成するために要求される。

【0265】

しかし、増加する抗体の濃度に伴い、凝集体を形成する傾向を観察することができる。これらの凝集抗体は、単離抗体と比較し、損なわれた特徴を有する。本明細書において報告する抗体の凝集は、単一特異的二価親抗体に接続された一本鎖抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン間のジスルフィド結合の導入により低下させることができる。この改善された安定性は、産生プロセスの間だけでなく、抗体の保存のためにも有用である。一実施形態において、本明細書において報告する二重特異性抗体中に含まれる一本鎖抗体の可変ドメイン間のジスルフィド結合は、各々の一本鎖抗体について、以下より独立に選択される：
ｉ）重鎖可変ドメインの位置４４から軽鎖可変ドメインの位置１００、
ｉｉ）重鎖可変ドメインの位置１０５から軽鎖可変ドメインの位置４３、又は
ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの位置１０１と軽鎖可変ドメインの位置１００。

【0266】

一実施形態において、本明細書において報告する二重特異性抗体中に含まれる一本鎖抗体の可変ドメイン間のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの位置４４と軽鎖可変ドメインの位置１００の間である。

【0267】

一実施形態において、本明細書において報告する二重特異性抗体中に含まれる一本鎖抗体の可変ドメイン間のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの位置１０５と軽鎖可変ドメインの位置４３の間である。
共有結合コンジュゲート

【0268】

抗ハプテン抗体へのハプテン化ペイロードの共有結合により、ペイロードの安定化及びＰＫ特性の改善を達成することができることが見出されている。

【0269】

ハプテン化ペイロード及び抗ハプテン抗体の共有結合的複合体は、良性の生物物理学的挙動及びポリペプチドへの改善されたＰＫ特性を付与し得る。さらに、二重特異性抗体を使用した場合において、コンジュゲートは、二重特異性抗体の第２の結合特異性により認識される抗原を示す細胞に、ポリペプチドを標的化するために使用することができる。そのようなコンジュゲートは、１つの抗ハプテン結合特異性及び１つの（非ハプテン）抗原結合特異性で構成される。抗体とハプテン化ペイロードとの化学量論比は、二重特異性抗体のフォーマットに依存し、１：１、１：２、２：１、２：２、２：４、４：２（抗体：ハプテン−ポリペプチド）であり得る。

【0270】

ペイロードが、ハプテンにコンジュゲーションされ、並びに抗体にコンジュゲーションされているにもかかわらず、良好な生物学的活性を保持することが望ましい。また、二重特異性抗体の細胞表面標的結合部位が、共有結合的にコンジュゲーションされたハプテン化ペイロードの存在において、その結合特異性及び親和性を保持することが、（二重特異的標的化モジュールの場合において）が望ましい。

【0271】

ハプテン化ペイロード中の反応基は、任意の反応基、例えばマレイミド（例、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ））、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィド、又は他の反応性結合パートナーなどであり得る（例、Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2；Garman,1997, Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2；Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996)Academic Press, San Diego, pp. 40-55 and 643-671を参照のこと）。

【0272】

抗体上の反応基は、選択的に、即ち、位置特異的に生成することができるものに限定される。したがって、それは、アミノ酸残基システイン、セリン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸の側鎖基に限定される。

【0273】

抗体とハプテン化ペイロードの間での共有結合コンジュゲートの形成のために、両方の化合物を、反応基の導入により改変しなければならない。抗体によるハプテン化ペイロードの結合時、２つの反応基は、近接してもたらされ、共有結合の形成を可能にする。一実施形態において、改変は、化合物の各々におけるチオール官能基の導入である。一実施形態において、チオール化合物はシステイン残基である。

【0274】

官能基を含む位置は、２つの要件を同時に満たさなければならない：（ｉ）カップリング位置は、有向カップリングのためのハプテン位置決め効果を利用するために、抗体の抗ハプテン結合特異性の結合領域に近接してあるべきである、及び（ｉｉ）変異及びカップリング位置は、ハプテン結合が、それ自体により影響されない様式で位置付けられなければならない。適切な位置を見出すためのこれらの要件は、事実上、互いに「矛盾」している。なぜなら、要件は、（ｉ）結合位置に近い位置により最良に提供されるが、（ｉｉ）結合部位から遠い位置により最も安全に達成されるからである。

【0275】

これらの実質的な除外要件にもかかわらず、ハプテンの位置付けに影響することなく変異させることができ、それにもかかわらず、有向共有結合的カップリングを同時に可能にする位置を同定した。

【0276】

第１の位置は、重鎖可変ドメインのＫａｂａｔナンバリングに従った位置ＶＨ５２ｂに、又は位置ＶＨ５３にそれぞれ位置付けられる。抗体が短いＶＨ ＣＤＲ２（それは、間欠的な残基（例えば５２ａ、５２ｃ、５２ｃ、及び５２ｄなど）を有さない）を有する場合、その位置は５３（抗体重鎖可変ドメインについてのＫａｂａｔのナンバリングスキーム及びルールに従ったナンバリング及びアラインメント）である。抗体が、残基５２ａ及び５２ｂ、並びに、場合により、さらなる残基５２ｃ及び５２ｄなどを含む長いＶＨ ＣＤＲ２を有する場合、その位置は５２ｂ（抗体重鎖可変ドメインについてのＫａｂａｔのナンバリングスキーム及びルールに従ったナンバリング及びアラインメント）である。

【0277】

任意のペイロードを、ハプテン化ペイロードと抗体の重鎖ＣＤＲ２中のアミノ酸残基の間の共有結合の形成のための官能基を含むユニバーサルリンカーを用いた誘導体化時に、ハプテン化ペイロードにおいて（ビオチン化ペイロード、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、ジゴキシゲニン化ペイロード、及びフルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードからなる群より選択されるハプテン化ペイロードの場合において）使用することができることが見出されている。ユニバーサルリンカー中の官能基の場所は、抗体の重鎖ＣＤＲ２中の官能基の合成及び位置（ペイロードを変化させる場合）を再操作する必要がないという利点を有する。

【0278】

任意のペイロードを、ヘリカー化（ｈｅｌｉｃａｒｙｌａｔｅｄ）ペイロードと抗体の軽鎖ＣＤＲ２中のシステイン残基の間の共有結合的なジスルフィド結合の形成のための官能基を含むシステインを用いたヘリカーアミノ酸配列の誘導体化時に、ヘリカー化（ｈｅｌｉｃａｒｙｌａｔｅｄ）ペイロード中に使用することができることが更に見出されている。ヘリカーモチーフアミノ酸配列中のシステイン残基（チオール官能基）の場所は、抗体の軽鎖ＣＤＲ２中のシステイン残基の合成及び位置（ペイロードを変化させる場合）を再操作する必要がないという利点を有する。

【0279】

第２の位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従った位置ＶＨ２８に位置付けられる。

【0280】

例えば、抗ジゴキシゲニン抗体構造において、ハプテンは、疎水性残基により形成される深いポケット中に結合される。蛍光ジゴキシゲニン−Ｃｙ５コンジュゲートが、この結晶学的試験において使用されたが、それにおいて、フルオロフォア並びにジゴキシゲニンとＣｙ５の間のリンカーは、高い柔軟性及び結果として得られる結晶中の無秩序のため、構造中では目に見えなかった。しかし、リンカー及びＣｙ５は、重鎖のＣＤＲ２の方向中を指し示す、ジゴキシゲニンのＯ３２に付着される。ジゴキシゲニンのＯ３２からＫａｂａｔに従った位置５２ｂにおけるアミノ酸残基のＣαの間の距離は、約１０．５Aである。

【0281】

位置が「ユニバーサル」位置である、即ち、位置が、それぞれ任意の（抗ハプテン）抗体又はヘリカー化（ｈｅｌｉｃａｒｙｌａｔｅｄ）ペイロードに適用可能であり、このように、例えば、結晶構造を提供し、ハプテンに位置付けられた共有結合カップリングを可能にする適切な位置を決定することにより、新たな共有結合複合体を生成しなくてはならない度に、最初から開始することは要求されないことが見出されている。

【0282】

本明細書において報告する通りに改変された抗体は、それらの親（即ち、野生型）抗体対応物のハプテン（抗原）結合能力を保持する。このように、操作された抗体は、結合することが可能であり、一実施形態において、それは、ハプテン（抗原）に特異的に結合することが可能である。

【0283】

用語「特異的に結合する結合部位」又は「特異的に結合する抗体」は、結合部位又は抗体を含む分子が、特定の様式において、さらなる分子と複合体を形成することができることを意味する。結合は、インビトロアッセイにおいて、例えばプラズモン共鳴アッセイ（BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden）などにおいて検出することができる。複合体形成の親和性は、用語ｋａ（化合物の会合が、複合体を形成する速度定数）、ｋ_Ｄ（解離定数、複合体の解離）、及びＫ_Ｄ（ｋ_Ｄ／ｋａ）により定義される。結合する、又は特異的に結合するは、約１０^−７Ｍ以下の結合親和性（Ｋ_Ｄ）を意味する。

【0284】

ハプテンとペイロードの間のリンカーにおいて、又はハプテン内に、又はペイロード内にシステイン残基を担持する、システイン改変抗体とシステイン改変ハプテン化ペイロードの間での共有結合的な結合の形成が、形成される結合がジスルフィド結合である場合、還元剤及び／又は酸化剤の添加の要求を伴わず、ハプテン化ペイロードへの抗体の結合時に起こることが見出されている。このように、２つの化合物の間でのジスルフィド架橋が、非共有結合複合体の形成時に自発的に形成される。したがって、本明細書において報告する共有結合的な複合体の形成のための方法では、２つの化合物の混合が単純に要求される。ジスルフィド結合の形成のための唯一の前提条件は、互いに関する２つの化合物の適した配向である。

【0285】

Ｃｙｓ残基を用いた、それぞれ位置ＶＨ５２ｂ及びＶＨ５３（Ｋａｂａｔナンバリングスキームに従う）のアミノ酸残基の置換によって、抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣについては配列番号２０及び２８において、抗テオフィリン抗体ＶＨ５３Ｃについては配列番号８４及び９２において、抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃについては配列番号５２及び６０において、抗フルオレセイン抗体ＶＨ５２ｂＣについては配列番号１０８において、並びに抗ブロモデオキシウリジン抗体ＶＨ５３Ｃについては配列番号２２６において列挙される重鎖可変領域配列を伴う抗体誘導体がもたらされた。

【0286】

Ｃｙｓ残基を用いた、位置ＶＨ２８（Ｋａｂａｔナンバリングスキームに従う）の重鎖可変ドメインアミノ酸残基の置換によって、それぞれ配列番号１１６、１２４、１３２、１４０、１４８、１５６、及び１６４において列挙される重鎖可変領域配列を伴う抗体誘導体がもたらされた。

【0287】

改変点として同定されたさらなる位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従った位置ＶＨ２８である。

【0288】

Ｃｙｓを用いたＫａｂａｔに従った位置ＶＨ２８のアミノ酸の置換によって、抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ２８Ｃについては配列番号１２４及び１３２において、抗テオフィリン抗体ＶＨ２８Ｃについては配列番号１５６及び１６４において、抗ビオチン抗体ＶＨ２８Ｃについては配列番号１４０及び１４８において、抗フルオレセイン抗体ＶＨ２８Ｃについては配列番号１１６において、並びに抗ブロモデオキシウリジンＶＨ２８Ｃについては配列番号２２７において列挙される重鎖可変領域配列を伴う抗体誘導体が生成された。

【0289】

ＥＳＩ−ＭＳ分析によって、ハプテン化ペイロード（ペイロード＝治療的ペプチド）の共有結合的な抗体コンジュゲーションが、非複合体化抗体又は非複合体化ペプチドよりも大きな、定義されたサイズのコンジュゲートをもたらすことが実証される。

【表2】

【0290】

インビボ実験の結果は、ハプテン及びＴｆＲ結合二重特異性ＢＢＢシャトル媒体が、ハプテン化ペイロード抗体に結合し、ＢＢＢを横切るペイロードの輸送を可能にすることを示す。これらの実験の結果は、また、ペイロードがシャトル媒体から放出されることができ、その後、脳中のその標的に結合し、それに蓄積することを示す。
抗体親和性

【0291】

特定の実施形態において、本明細書において報告する抗体自体又は本明細書において報告する複合体中の抗体は、≦１０nM、≦１nM、≦０．１nM、≦０．０１nM、又は≦０．００１nMの（例、約１０^−８M以下、例、約１０^−８M〜約１０^−１３M、例、約１０^−９M〜約１０^−１３Mの）解離定数（Ｋｄ）を有する。

【0292】

一実施形態において、Ｋｄは、以下のアッセイにより記載される通り、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて実施される放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。抗原についてのＦａｂの溶液結合親和性を、Ｆａｂを、非標識抗原の滴定系列の存在において、最小濃度の（^１２５Ｉ）標識抗原を用いて平衡化し、次に、結合抗原を、抗Ｆａｂ抗体コーティングされたプレートを用いて捕捉することにより測定する（例、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照のこと）。アッセイのための条件を確立するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート（Thermo Scientific）を、５０mM炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μg/mlの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Cappel Labs）を用いて一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中の２%（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで２〜５時間にわたり室温（約２３℃）でブロックした。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中で、１００pM又は２６pMの［^１２５Ｉ］抗原を、目的のＦａｂの希釈系列と混合した（例、Presta, L.G. et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。目的のＦａｂを、次に、一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションを、より長い期間（例、約６５時間）にわたり継続し、平衡に達することを確実にしてもよい。その後、混合物を、室温での（例、１時間にわたる）インキュベートのために、捕捉プレートに移す。溶液を次に除去し、プレートを、ＰＢＳ中の０．１%ポリソルベート２０（Tween20（登録商標））を用いて８回洗浄する。プレートが乾燥した際、１５０μL/ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）；Packard）を加え、プレートを１０分間にわたりTOPCOUNT（商標）ガンマカウンター（Packard）でカウントする。２０%を下回る、又は、それと等しい最大結合を与える、各々のＦａｂの濃度を、競合結合アッセイにおける使用のために選ぶ。

【0293】

別の実施形態に従い、Ｋｄを、〜１０反応単位（ＲＵ）での固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて、２５℃でBIACORE（登録商標）2000又はBIACORE（登録商標）3000（BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定する。簡単には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5、BIACORE, Inc.）を、供給者の使用説明書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ） を用いて活性化させる。抗原を、５μL/分の流速での注射前に、１０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を用いて５μg/ml（約０．２μM）に希釈し、カップリングタンパク質の約１０反応単位（ＲＵ）を達成する。抗原の注射に続き、１Ｍエタノールアミンを注射し、未反応基をブロックする。動態測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８nM〜５００nM）を、０．０５%ポリソルベート２０（Tween20（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を伴うＰＢＤ中で、２５℃で、約２５μL/分の流速で注射する。会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を、単純一対一ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標）Evaluation Softwareバージョン３．２）を使用し、会合及び解離センサーグラムを同時に適合することにより計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）を、比率ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして計算する。例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照のこと。オン速度が、上の表面プラズモン共鳴アッセイにより、１０^６Ｍ^−１ｓ^−１を超える場合、次に、オン速度は、ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）中の２０nM抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の、２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５nm；発光＝３４０nm、１６nmバンドパス）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を使用することにより、分光計、例えばストップ−フロー装備の分光光度計（Aviv Instruments）又は撹拌キュベットを伴う8000シリーズSLM-AMINCO（商標）分光光度計（ThermoSpectronic）などにおいて測定される、抗原の増加濃度の存在において決定することができる。
抗体フラグメント

【0294】

特定の実施形態において、本明細書において提供する、又は、本明細書において報告するコンジュゲート中の抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖフラグメント、並びにそれらのコンジュゲート、及び、フラグメントが二価及び多特異性である、又は、組み合わせて、二価の二重特異性抗体フラグメント融合ポリペプチドを形成する限り、下記に記載する他のフラグメントを含むが、これらに限定されない。特定の抗体フラグメントの概説については、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照のこと。ｓｃＦｖフラグメントの概説については、例えば、Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照のこと；また、ＷＯ ９３／１６１８５；並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、及び、増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２フラグメントの考察については、ＵＳ ５，８６９，０４６を参照のこと。

【0295】

ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を伴う抗体フラグメントである。例えば、ＥＰ ０ ４０４ ０９７；ＷＯ １９９３／０１１６１；Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及びHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディが、また、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134)に記載されている。

【0296】

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て、若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全て、若しくは一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例、ＵＳ ６，２４８，５１６を参照のこと）。

【0297】

抗体フラグメントは、種々の技術（インタクトな抗体のタンパク質分解性消化並びに組換え宿主細胞（例、大腸菌又はファージ）による産生を含むが、これらに限定されない）により、本明細書において記載する通りに作製することができる。
キメラ抗体及びヒト化抗体

【0298】

特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体又は本明細書において報告するコンジュゲート中の抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、ＵＳ ４，８１６，５６７；及びMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855)において記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類（例えばサルなど）に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが、親抗体のものから変化されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、それらの抗原結合フラグメントを含む。

【0299】

特定の実施形態において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトへの免疫原性を低下させるためにヒト化されており、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持している。一般的に、ヒト化抗体は、１つ又は複数の可変ドメインを含み、それにおいて、ＨＶＲ（例、ＣＤＲ（又はその一部））は、非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）は、ヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、場合により、また、ヒト定常領域の少なくとも一部を含むであろう。一部の実施形態において、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、非ヒト抗体（例、ＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基を用いて置換され、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善する。

【0300】

ヒト化抗体及びそれらを作製する方法が、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633において概説されており、さらに、例えば、Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329；Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号、及び第７，０８７，４０９号；Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植が記載されている）；Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498（「リサーフェイシング」が記載されている）；Dall’Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60（「ＦＲシャフリング」が記載されている）；並びにOsbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68、及びKlimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（ＦＲシャフリングへの「ガイド付き選択」アプローチが記載されている）において記載されている。

【0301】

ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域は、「ベストフィット」方法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照のこと）；軽又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及びPresta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照のこと）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照のこと）；及びＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及びRosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618を参照のこと）を含むが、これらに限定されない。
ヒト抗体

【0302】

特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体又は本明細書において報告するコンジュゲート中の抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体を、当技術分野において公知の種々の技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は、一般的に、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459において記載されている。

【0303】

ヒト抗体は、抗原刺激に応答して、ヒト可変領域を伴うインタクトなヒト抗体又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより調製され得る。そのような動物は、典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て、又は一部を含むが、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換し、或いは、それらは、染色体外に存在する、又は動物の染色体中にランダムに組み込まれる。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125を参照のこと。また、例えば、XENOMOUSE（商標）技術を記載するＵＳ ６，０７５，１８１及びＵＳ ６，１５０，５８４；HUMAB（登録商標）技術を記載するＵＳ ５，７７０，４２９；K-M MOUSE（登録商標）技術を記載するＵＳ ７，０４１，８７０、並びにVELOCIMOUSE（登録商標）技術を記載するＵＳ ２００７／００６１９００を参照のこと。そのような動物により生成されるインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なる定常領域と組み合わせることにより、更に改変され得る。

【0304】

ヒト抗体は、又はイブリドーマベースの方法により作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種細胞株が記載されている。（例、Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005;Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63；及びBoerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95を参照のこと）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体が、また、Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562において記載されている。追加の方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）及びNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載する）において記載されるものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（Ｔｒｉｏｍａ技術）が、また、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937及びVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191において記載されている。

【0305】

ヒト抗体は、また、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することにより生成され得る。そのような可変ドメイン配列を、次に、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を、以下記に記載する。
ライブラリー由来抗体

【0306】

本発明の抗体又は本明細書において報告するコンジュゲート中の抗体は、所望の活性又は活性を伴う抗体について、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。例えば、種々の方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を持つ抗体について、そのようなライブラリーをスクリーニングするために、当技術分野において公知である。そのような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37において概説されており、例えば、McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554；Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628；Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597；Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175；Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310；Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093；Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472;及びLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132において更に記載されている。

【0307】

特定のファージディスプレイ方法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいてランダムに組み換えられ、それらは、次に、Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455において記載される通りに、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントとして、又はＦａｂフラグメントとして、抗体フラグメントを示す。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築することを要求せず、免疫原への高親和性抗体を提供する。或いは、未感作レパートリーをクローニングし（例、ヒトから）、Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734により記載される通りに、任意の免疫化を伴わず、広範な非自己抗原及び、また、自己抗原への抗体の単一供給源を提供することができる。最後に、未感作ライブラリーが、また、幹細胞からの非再配列Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配列を達成するためのランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより（Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388により記載される通り）、合成的に作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公開は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、並びに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号、及び第２００９／０００２３６０号を含む。

【0308】

ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体フラグメントは、本明細書において考慮されるヒト抗体又はヒト抗体フラグメントである。
抗体フォーマット

【0309】

上に概説する抗体及び抗体フラグメントを、複数の方法において組み合わせ、異なる抗体フォーマットを生成することができる。

【0310】

例えば、１つ又は複数のｓｃＦｖ抗体フラグメントを、完全抗体の１つ又は複数のポリペプチド鎖のＣ末端に融合することができる。特に、各々の重鎖Ｃ末端に、又は各々の軽鎖Ｃ末端に、ｓｃＦｖ抗体フラグメントを融合させることができる。

【0311】

例えば、１つ又は複数の抗体Ｆａｂフラグメントを、完全抗体の１つ又は複数のポリペプチド鎖のＣ末端に融合することができる。特に、各々の重鎖Ｃ末端に、又は各々の軽鎖Ｃ末端に、抗体Ｆａｂフラグメントを融合させることができる。

【0312】

例えば、１つのｓｃＦｖ及び１つの抗体Ｆａｂフラグメントを、抗体Ｆｃ領域のＮ末端に融合することができる。

【0313】

例えば、１つのｓｃＦｖ又は抗体Ｆａｂフラグメントを、抗体Ｆｃ領域のＮ末端に融合することができ、１つのｓｃＦｖ又は抗体Ｆａｂフラグメントを、抗体Ｆｃ領域のそれぞれの他の鎖のＣ末端に融合することができる。
多重特異性抗体

【0314】

多種多様な組換え抗体フォーマットが開発されており、例えば、ＩｇＧ抗体フォーマット及び一本鎖ドメインの融合による四価の二重特異性抗体である（例、Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163；ＷＯ ２００１／０７７３４２；及びMorrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234を参照のこと）。

【0315】

また、抗体コア構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ）がもはや保持されない、いくつかの他のフォーマット（例えばジア、トリア、又はテトラボディ、ミニボディ、いくつかの一本鎖フォーマット（ｓｃＦｖ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ）などで、それらは、２つ以上の抗原に結合すること可能である）が開発されている（Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136；Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14；Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74；Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297）。

【0316】

全てのそのようなフォーマットでは、リンカーを使用し、さらなる結合タンパク質（例、ｓｃＦｖ）へ抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ）を融合させる、又は、例えば、２つのＦａｂフラグメント若しくはｓｃＦｖ（Fischer, N. and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14）を融合させる。天然抗体との高度の類似性を維持することにより、エフェクター機能（例えば補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）（それらは、Ｆｃ受容体結合を通じて媒介される）など）を保持することが望まれ得ることを念頭に置かなければならない。

【0317】

ＷＯ ２００７／０２４７１５において報告するのは、操作された多価及び多重特異性結合タンパク質としての二重可変ドメイン免疫グロブリンである。生物学的に活性な抗体二量体の調製のためのプロセスが、ＵＳ ６，８９７，０４４において報告されている。ペプチドリンカーを介して互いに連結されている少なくとも４つの可変ドメインを有する多価ＦＶ抗体構築物が、ＵＳ ７，１２９，３３０において報告されている。二量体及び多量体の抗原結合構造が、ＵＳ ２００５／００７９１７０において報告されている。接続構造により互いに共有結合的に結合された、３つ又は４つのＦａｂフラグメントを含む、三価又は四価の単一特異性の抗原結合タンパク質（そのタンパク質は、天然免疫グロブリンではない）が、ＵＳ ６，５１１，６６３において報告されている。ＷＯ ２００６／０２０２５８において、四価の二重特異性抗体が報告されており、それは、原核細胞及び真核細胞中で効率的に発現させることができ、治療的及び診断的方法において有用である。２つの型のポリペプチド二量体を含む混合物からの少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合されていない二量体から、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合されている二量体を分離する、又は優先的に合成する方法が、ＵＳ ２００５／０１６３７８２において報告されている。二重特異性の四価受容体が、ＵＳ ５，９５９，０８３において報告されている。３以上の官能性の抗原結合部位を伴う操作抗体が、ＷＯ ２００１／０７７３４２において報告されている。

【0318】

多重特異性及び多価抗原結合ポリペプチドが、ＷＯ １９９７／００１５８０において報告されている。ＷＯ １９９２／００４０５３には、ホモコンジュゲート（典型的には、同じ抗原決定基に結合するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体から調製される）が、合成架橋により共有結合的に連結されていることが報告されている。抗原についての高い結合力を伴うオリゴマーモノクローナル抗体が、ＷＯ １９９１／０６３０５において報告されており、それにより、オリゴマー（典型的にはＩｇＧクラスの）が分泌され、２つ以上の免疫グロブリン単量体を一緒に会合し、四価又は六価のＩｇＧ分子を形成する。ヒツジ由来抗体及び操作抗体構築物が、ＵＳ ６，３５０，８６０において報告されており、それらは、インターフェロンガンマ活性が病原性である疾患を処置するために使用することができる。ＵＳ ２００５／０１００５４３において報告されるのは、二重特異性抗体の多価担体である標的化可能な構築物である（即ち、標的化可能な構築物の各々の分子が、２つ以上の二重特異性抗体の担体としての役割を果たすことができる）。遺伝的に操作された二重特異性四価抗体が、ＷＯ １９９５／００９９１７において報告されている。ＷＯ ２００７／１０９２５４において、安定化ｓｃＦｖからなる、又はそれを含む安定化結合分子が報告されている。

【0319】

特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体又は本明細書において報告するコンジュゲート中の抗体は、多重特異性抗体（例、二重特異性抗体）である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位についての結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態において、結合特異性の１つは、ハプテンについてであり、他は、任意の他の（非ハプテン）抗原についてである。二特異性抗体を、また、細胞傷害性薬剤を細胞に局在化させるために使用してもよい。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメントとして調製することができる。

【0320】

多重特異性抗体を作製するための技術は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え同時発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829、及びTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照のこと）、及び「ノブ・イン・ホール」操作（例、米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）を含むが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、また、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するために、静電ステアリング効果を操作すること（ＷＯ ２００９／０８９００４）；２つ以上の抗体又はフラグメントを架橋すること（例、米国特許第４，６７６，９８０号、及びBrennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83を参照のこと）；二重特異性抗体を産生するためにロイシンジッパーを使用すること（例、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照のこと）；二重特異性抗体フラグメントを作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例、Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照のこと）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体を使用すること（例、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照のこと）；及び三重特異性抗体を調製すること（例、Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69において記載される通り）により作製することができる。

【0321】

一実施形態において、二重特異性抗体の重鎖のＣＨ３ドメインは、「ノブ−インツ−ホール」技術により変化され、それは、例えば、ＷＯ ９６／０２７０１１、ＷＯ ９８／０５０４３１、Ridgway J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621、Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681において、いくつかの例を用いて詳細に記載されている。この方法において、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を変化させ、これら２つのＣＨ３ドメインを含む両方の重鎖のヘテロ二量体化を増加させる。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインの各々は、「ノブ」であり得るが、他は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入によって、ヘテロ二量体を安定化させ（Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677 681, Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）、収量を増加させる。

【0322】

全ての態様の一実施形態において、二重特異性抗体は、以下において特徴付けられる：
−１つの重鎖のＣＨ３ドメイン及び他の重鎖のＣＨ３ドメイン（各々が、抗体ＣＨ３ドメイン間に元の界面を含む界面で会合する）、
それにおいて、界面を変化させ、二重特異性抗体の形成を促し、それにおいて、変化は、以下であることを特徴とする：
ａ）１つの重鎖のＣＨ３ドメインを変化させ、
元の界面内で、１つの重鎖のＣＨ３ドメインが、二重特異性抗体内の他の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面と会合するようにし、
アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基を用いて置換されており、それにより、他の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞内に配置可能である、１つの重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に突起を生成し、
及び
ｂ）他の重鎖のＣＨ３ドメインを変化させ、
元の界面内で、第２のＣＨ３ドメインが、二重特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元の界面と会合するようにし、
アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基を用いて置換されており、それにより、第２のＣＨ３ドメインの界面内の空洞を生成し、その内で、第１のＣＨ３ドメインの界面内の突起を配置可能である。

【0323】

このように、本明細書において報告する抗体は、一実施形態において、以下において特徴付けられる：
−完全長抗体の第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び完全長抗体の第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、各々、抗体ＣＨ３ドメイン間の元の界面において変化を含む界面で会合する。
それにおいて、ｉ）第１の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、
アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基を用いて置換されており、それにより、他の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞内に配置可能である、１つの重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に突起を生成し、
及び、それにおいて、ｉｉ）第２の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、
アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基を用いて置換されており、それにより、第２のＣＨ３ドメインの界面内の空洞を生成し、その内で、第１のＣＨ３ドメインの界面内の突起を配置可能である。

【0324】

一実施形態において、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。

【0325】

一実施形態において、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群より選択される。

【0326】

一実施形態において、両方のＣＨ３ドメインは、各々のＣＨ３ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン（Ｃ）の導入により更に変化され、両方のＣＨ３ドメイン間のジスルフィド架橋を形成できるようにする。

【0327】

１つの好ましい実施形態において、多重特異性抗体は、「ノブ鎖」の第１のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸Ｔ３６６Ｗ変異及び「ホール鎖」の第２のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む。ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋は、また、例えば、「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン中にアミノ酸Ｙ３４９Ｃ変異及び「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中にアミノ酸Ｅ３５６Ｃ変異又はアミノ酸Ｓ３５４Ｃ変異を導入することにより、使用することができる（Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681）。

【0328】

一実施形態において、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおいてＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び２つのＣＨ３ドメインの他においてＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む。一実施形態において、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおいてＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び２つのＣＨ３ドメインの他においてＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む（鎖間ジスルフィド架橋を形成する、１つのＣＨ３ドメイン中の追加のＹ３４９Ｃ変異及び他のＣＨ３ドメイン中の追加のＥ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃ変異）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング；（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。ＥＰ １ ８７０ ４５９ Ａ１により記載される通りのさらなるノブ−イン−ホール技術を、代わりに、又は追加で使用することができる。このように、二重特異性抗体についての別の例は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中のＲ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン中のＤ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ変異である（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。

【0329】

一実施形態において、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｗ変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を、並びに、追加で、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中のＲ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン中のＤ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ変異を含む。

【0330】

一実施形態において、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び２つのＣＨ３ドメインの他におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含み、又は、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び２つのＣＨ３ドメインの他におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異、並びに、追加で、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中のＲ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン中のＤ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ変異を含む。ＣＨ３ドメイン中のそのようなノブ及びホール変異は、典型的には、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、又は配列番号１７２（ヒトＩｇＧ１サブクラスアロタイプ（白人及びアフリカ系アメリカ人又は変異体Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）、配列番号１７３、配列番号１７４、又は配列番号１７５（ヒトＩｇＧ４サブクラス又は変異体Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＳ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３２９Ｇ）（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスに従ったナンバリング）のヒト重鎖定常領域において使用される。

【0331】

一実施形態において、二重特異性抗体は、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、又は配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、又は配列番号１７５のヒト重鎖定常領域を含む（ＣＨ３ドメイン中のそのような「ノブ」及び「ホール」変異（例、２つのＣＨ３ドメインの１つにおけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び２つのＣＨ３ドメインの他におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異）を更に含む）（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスに従ったナンバリング）。

【0332】

「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を伴う操作抗体も本明細書において含まれる（例、ＵＳ ２００６／００２５５７６を参照のこと）。

【0333】

本明細書における抗体又はフラグメントは、また、ハプテン並びに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」を含む（例えば、ＵＳ ２００８／００６９８２０を参照のこと）。

【0334】

本明細書における抗体又はフラグメントは、また、ＷＯ ２００９／０８０２５１、ＷＯ ２００９／０８０２５２、ＷＯ ２００９／０８０２５３、ＷＯ ２００９／０８０２５４、ＷＯ ２０１０／１１２１９３、ＷＯ ２０１０／１１５５８９、ＷＯ ２０１０／１３６１７２、ＷＯ ２０１０／１４５７９２、及びＷＯ ２０１０／１４５７９３において記載される多重特異性抗体を含む。

【0335】

１つの好ましい実施形態においては、多重特異性抗体（それは、各々の重鎖においてＣＨ３ドメインを含む）は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおいてアミノ酸Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び２つのＣＨ３ドメインの他においてアミノ酸Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異（１つのＣＨ３ドメイン中の追加のアミノ酸Ｓ３５４Ｃ変異及び鎖間ジスルフィド架橋を形成する他のＣＨ３ドメイン中の追加のアミノ酸Ｙ３４９Ｃ変異）を含む（Ｋａｂａｔに従ったナンバリング）。

【0336】

ヘテロ二量体を強制するＣＨ３改変のための他の技術が、代替物として熟慮され、例えば、ＷＯ ９６／２７０１１、ＷＯ ９８／０５０４３１、ＥＰ １８７０４５９、ＷＯ ２００７／１１０２０５、ＷＯ ２００７／１４７９０１、ＷＯ ２００９／０８９００４、ＷＯ ２０１０／１２９３０４、ＷＯ ２０１１／９０７５４、ＷＯ ２０１１／１４３５４５、ＷＯ ２０１２／０５８７６８、ＷＯ ２０１３／１５７９５４、ＷＯ ２０１３／０９６２９１において記載されている。

【0337】

一実施形態において、ＥＰ１８７０４５９ Ａ１において記載されるヘテロ二量体化アプローチが使用される。このアプローチは、両方の重鎖間でのＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置に反対の電荷を伴う荷電アミノ酸の置換／変異の導入に基づく。１つの好ましい実施形態において、多重特異性抗体は、（多重特異性抗体の）第１の重鎖のＣＨ３ドメインにおいてアミノ酸Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ変異及び（多重特異性抗体の）第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおいてアミノ酸Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ変異を含む（Ｋａｂａｔに従ったナンバリング）。

【0338】

別の実施形態において、多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｔ３６６Ｗ変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を、並びに、追加で、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ変異を含む。

【0339】

別の実施形態において、多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおけるアミノ酸Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び２つのＣＨ３ドメインの他におけるアミノ酸Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含み、又は、多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおけるアミノ酸Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び２つのＣＨ３ドメインの他におけるアミノ酸Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異並びに、追加で、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ変異を含む。

【0340】

一実施形態において、ＷＯ２０１３／１５７９５３において記載されるヘテロ二量体化アプローチが使用される。一実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ｋ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｌ３５１Ｄ変異を含む。さらなる実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｌ３５１Ｋ変異を更に含む。さらなる実施形態において、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ、及びＬ３６８Ｅより選択されるアミノ酸変異（好ましくＬ３６８Ｅ）を更に含む。

【0341】

一実施形態において、ＷＯ２０１２／０５８７６８において記載されるヘテロ二量体化アプローチが使用される。一実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ変異を含む。さらなる実施形態において、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、又はＫ３９２（例えば、ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ、又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ又はＳ４００Ｋ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅより選択される）でさらなるアミノ酸変異を含む。さらなる実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆ変異を含む。さらなる実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｙ４０７Ａ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ変異を含む。さらなる実施形態において、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ、及びＳ４００Ｒ変異を更に含む。

【0342】

一実施形態において、ＷＯ２０１１／１４３５４５において記載されるヘテロ二量体化アプローチが使用され、例えば、３６８及び４０９からなる群より選択される位置にアミノ酸改変を伴う。

【0343】

一実施形態において、ＷＯ２０１１／０９０７６２において記載されるヘテロ二量体化アプローチが使用され、そこでは、また、上記に記載するノブ−インツー−ホール技術が使用される。一実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ｗ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｙ４０７Ａ変異を含む。一実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ｙ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｙ４０７Ｔ変異を含む。

【0344】

一実施形態において、多重特異性抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプであり、ＷＯ２０１０／１２９３０４において記載されるヘテロ二量体化アプローチが使用される。

【0345】

一実施形態において、ＷＯ２００９／０８９００４において記載されるヘテロ二量体化アプローチが使用される。一実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、負荷電アミノ酸（例、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）を用いた、アミノ酸残基Ｋ３９２又はＮ３９２の置換を含み、及び、第２のＣＨ３ドメインは、正荷電アミノ酸（例、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、好ましくＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、又はＥ３５７Ｋ、並びに、より好ましくＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）を用いた、アミノ酸残基Ｄ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６、又はＥ３５７の置換を含む。さらなる実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、負荷電アミノ酸（例、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）を用いた、アミノ酸残基Ｋ４０９又はＲ４０９の置換を更に含む。さらなる実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、負荷電アミノ酸（例、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ））を用いた、アミノ酸残基Ｋ４３９及び／又はＫ３７０の置換を更に、又は代わりに含む。

【0346】

一実施形態において、ＷＯ２００７／１４７９０１において記載されるヘテロ二量体化アプローチが使用される。一実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＫ３２２Ｄ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、及びＫ２９２Ｄ変異を含む。

【0347】

一実施形態において、ＷＯ２００７／１１０２０５において記載されるヘテロ二量体化アプローチが使用される。

【0348】

一実施形態において、二重特異性抗体の第１の結合特異性は、ハプテンに対してであり、第２の結合特異性は、非ハプテン抗原に対してである。一実施形態において、非ハプテン抗原は、白血球マーカー、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ｂ、ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７及びそのリガンド、ＣＤ２８及びそのリガンドＢ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７．３、ＣＤ２９及びそのリガンド、ＣＤ３０及びそのリガンド、ＣＤ４０及びそのリガンドｇｐ３９、ＣＤ４４、ＣＤ４５及びアイソフォーム、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＴＬＡ−４、ＬＦＡ−１及びＴＣＲ；組織適合性抗原、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ルイスＹ抗原、ＳＬｅｘ、ＳＬｅｙ、ＳＬｅａ、及びＳＬｅｂ；インテグリン、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−２、ＶＬＡ−３、ＶＬＡ−４、ＶＬＡ−５、ＶＬＡ−６、αＶβ３、及びＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１、及びｐｌ５０，９５、αＶβ１、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、αＲβ３、α６β４、αＶβ５、αｖβ６、及びαＶ６２７；セレクチン、Ｌセレクチン、Ｐセレクチン、並びにＥセレクチン及びそれらのカウンター受容体ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、及びＬＦＡ−３；インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、及びＩＬ−１５より選択される；インターロイキン受容体は、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−８Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−１１Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１４Ｒ、及びＩＬ−１５Ｒからなる群より選択される；ケモカインは、ＰＦ４、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＣＰ１、ＮＡＰ−２、Ｇｒｏα、Ｇｒｏβ、及びＩＬ−８からなる群より選択される；成長因子は、ＴＮＦアルファ、ＴＧＦベータ、ＴＳＨ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦ１１１、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６、ＰＴＨｒＰ、ＥＧＦファミリー、ＰＤＧＦファミリー、エンドセリン、フィブロシン（Ｆｉｂｒｏｓｉｎ）（ＦＳＦ−１）、ヒトラミニン、及びガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ＰＬＧＦ、ＨＧＨ、ＨＧＨＲから成る群より選択される；成長因子受容体は、ＴＮＦアルファＲ、ＲＧＦベータＲ、ＴＳＨＲ、ＶＥＧＦＲ／ＶＰＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰＴＨｒＰＲ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＥＰＯ−Ｒ、ＧＣＳＦ−Ｒ、及び他の造血受容体からなる群より選択される；インターフェロン受容体は、ＩＦＮＣαＲ、ＩＦＮβＲ、及びＩＦＮλＲからなる群より選択される；Ｉｇ及びその受容体は、ＩｇＥ、ＦｃγＲＩ、及びＦｃγＲＩＩからなる群より選択される；腫瘍抗原は、ｈｅｒ２−ｎｅｕ、ムチン、ＣＥＡ及びエンドシアリンからなる群より選択される；アレルゲンは、ハウスダストダニ抗原、ｌｏｌ ｐ１（グラス）抗原、及び得るシオールからなる群より選択される；ウイルス性ポリペプチドは、ＣＭＶ糖タンパク質Ｂ、Ｈ、及びｇＣＩＩＩ、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質、ＲＳＶエンベロープ糖タンパク質、ＨＳＶエンベロープ糖タンパク質、ＨＰＶエンベロープ糖タンパク質、肝炎ファミリー表面抗原からなる群より選択される；毒素は、シュードモナスエンドトキシン及びオステオポンチン／ウロポンチン（ｕｒｏｐｏｎｔｉｎ）、ヘビ毒、クモ毒、及びハチ毒コノトキシンからなる群より選択される；血液因子は、補体Ｃ３ｂ、補体Ｃ４ａ、補体Ｃ４ｂ−９、Ｒｈ因子、フィブリノゲン、フィブリン、及びミエリン関連成長阻害物質からなる群より選択される；酵素は、コレステロールエステル転移ポリペプチド、膜結合マトリクスメタロプロテアーゼ、及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）からなる群より選択される。
抗体バリアント

【0349】

特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体のアミノ酸配列バリアントが熟慮される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列バリアントを、抗体をコードするヌクレオチド配列中へ適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成により調製してもよい。そのような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はその中への挿入、及び／又はその置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを作製し、最終的な構築物に達することができる（最終的な構築物が、所望の特徴（例、抗原結合）を持つとの条件で）。
ａ）置換、挿入、及び欠失バリアント

【0350】

特定の実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換変異誘発のための目的の部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。アミノ酸置換を、目的の抗体中に導入し、産物を、所望の活性（例、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ）についてスクリーニングしてもよい。

【表3】

【0351】

アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ化してもよい：
（１） 疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２） 中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３） 酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４） 塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５） 鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６） 芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0352】

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを、別のクラスについて交換することを伴い得る。

【0353】

置換バリアントの１つの型は、親抗体（例、ヒト化又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域の残基を置換することを含む。一般的には、さらなる試験のために選択された、結果として得られたバリアントは、親抗体と比べて、特定の生物学的特性における改変（例、改善）を有するであろう（例、増加した親和性、低下した免疫原性）、及び／又は、親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換バリアントは、親和性成熟抗体であり、それらは、例えば、ファージディスプレイベースの親和性成熟技術（例えば、本明細書において記載するものなど）を使用して簡便に生成され得る。簡単には、１つ又は複数のＨＶＲ残基を変異させ、バリアント抗体が、ファージ上にディスプレイされ、特定の生物学的活性（例、結合親和性）についてスクリーニングされる。

【0354】

変化（例、置換）をＨＶＲ中に作製し、例えば、抗体の親和性を改善させてもよい。そのような変化は、ＨＶＲ「ホットスポット」、即ち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異を受けるコドンによりコードされる残基（例、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照のこと）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において作製され、結果として得られたバリアントＶＨ又はＶＬは、結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築及び再選択することによる親和性成熟が、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37において記載されている。親和性成熟の一部の実施形態において、多様性が、種々の方法（例、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド定方向性変異誘発）のいずれかにより、成熟について選ばれた可変遺伝子中に導入される。二次ライブラリーが、次に作製される。ライブラリーを、次に、スクリーニングし、所望の親和性を伴う任意の抗体バリアントを同定する。多様性を導入するための別の方法は、ＨＶＲ定方向性アプローチを含み、それにおいて、いくつかのＨＶＲ残基（例、一度に４〜６残基）が無作為化される。抗原結合に含まれるＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用し、特異的に同定され得る。重鎖ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ３が、特に、しばしば標的化される。

【0355】

特定の実施形態において、置換、挿入、又は欠失が、そのような変化が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ又は複数のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変化（例、本明細書において提供する保存的置換）を、ＨＶＲにおいて作製してもよい。そのような変化は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であり得る。上に提供するバリアントＶＨ及びＶＬ配列の特定の実施形態において、各々のＨＶＲのいずれかが不変である、又は、わずか１、２、若しくは３のアミノ酸置換を含む。

【0356】

変異誘発のために標的化され得る、抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれ、Cunningham and Wells in Science, 244: 1081-1085 (1989)により記載される通りである。この方法において、標的残基（例、荷電残基、例えばＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなど）の残基又は群が同定され、中性又は負に荷電したアミノ酸（例、アラニン又はポリアラニン）により置換され、抗体と抗原との相互作用が影響を受けているか否かを決定する。さらなる置換を、アミノ酸位置に導入し、初期置換への機能的感受性を実証してもよい。或いは、又は、加えて、抗体と抗原の間の接触点を同定するための、抗原−抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基を、置換のための候補として標的化又は排除してもよい。バリアントをスクリーニングし、それらが所望の特性を含むか否かを決定してもよい。

【0357】

アミノ酸配列の挿入は、１つの残基から、１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ及び／又はカルボキシ末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を伴う抗体を含む。抗体分子の他の挿入バリアントは、酵素（例、ＡＤＥＰＴ用）、又は抗体の血清中半減期を増加させるポリペプチドへの、抗体のＮ又はＣ末端への融合を含む。
ｂ）グリコシル化バリアント

【0358】

特定の実施形態において、本明細書において提供する、又は本明細書において報告するコンジュゲート中に含まれる抗体を変化させ、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させる。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作製又は除去されるように、アミノ酸配列を変化させることにより、簡便に達成され得る。

【0359】

抗体がＦｃ領域を含む場合、それに付着した糖を変化させてもよい。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ連結により一般的に付着されている分枝鎖、二分岐オリゴ糖を典型的に含む。例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照のこと。オリゴ糖は、種々の糖（例、マンノース、Ｎアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸）、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」中でＧｌｃＮＡｃに付着したフコースを含み得る。一部の実施形態において、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾を、特定の改善された特性を伴う抗体バリアントを作るために作製してもよい。

【0360】

一実施形態において、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）付着したフコースを欠く糖構造を有する抗体バリアントが提供される。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１%〜８０%、１%〜６５%、５%〜６５%、又は２０%〜４０%であり得る。フコースの量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定される通り、Ａｓｎ２９７に付着されている全ての糖構造（例、複雑なハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより決定される決定される（例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載される通り）。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中の位置２９７（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）あたりに位置するアスパラギン残基を指す；しかし、Ａｓｎ２９７は、また、抗体中の小さな配列変動に起因し、位置２９７の約±３アミノ酸上流又は下流、即ち、位置２９４と３００の間に位置してもよい。そのようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、ＵＳ ２００３／０１５７１０８；ＵＳ ２００４／００９３６２１を参照のこと。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体バリアントに関連する刊行物の例は、以下を含む：ＵＳ ２００３／０１５７１０８；ＷＯ ２０００／６１７３９；ＷＯ ２００１／２９２４６；ＵＳ ２００３／０１１５６１４；ＵＳ ２００２／０１６４３２８；ＵＳ ２００４／００９３６２１；ＵＳ ２００４／０１３２１４０；ＵＳ ２００４／０１１０７０４；ＵＳ ２００４／０１１０２８２；ＵＳ ２００４／０１０９８６５；ＷＯ ２００３／０８５１１９；ＷＯ ２００３／０８４５７０；ＷＯ ２００５／０３５５８６；ＷＯ ２００５／０３５７７８；ＷＯ ２００５／０５３７４２；ＷＯ ２００２／０３１１４０；Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249；Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例は、タンパク質フコシル化の欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545；ＵＳ ２００３／０１５７１０８；及びＷＯ ２００４／０５６３１２、特に、実施例１１）及び細胞株ノックアウト（例えばα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞など）（例、Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688；及びＷＯ ２００３／０８５１０７を参照のこと）を含む。

【0361】

抗体バリアントは、二分オリゴ糖と更に提供され、例えば、それにおいて、抗体のＦｃ領域に付着した二分岐オリゴ糖が、ＧｌｃＮＡｃにより二分されている。そのような抗体バリアントは、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、ＷＯ ２００３／０１１８７８；米国特許第６，６０２，６８４号；及びＵＳ ２００５／０１２３５４６において記載されている。Ｆｃ領域に付着されたオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を伴う抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有する。そのような抗体バリアントは、例えば、ＷＯ １９９７／３００８７；ＷＯ １９９８／５８９６４；及びＷＯ １９９９／２２７６４において記載されている。

【0362】

ｃ） Ｆｃ領域バリアント
特定の実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸改変を、本明細書において提供する抗体のＦｃ領域中に導入してもよく、それにより、Ｆｃ領域バリアントを生成する。Ｆｃ領域バリアントは、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでもよい。

【0363】

特定の実施形態において、本発明では、一部の、しかし、全てではないエフェクター機能を持つ抗体バリアントが熟慮され、それらによって、それが、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、しかし、特定のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である適用のための望ましい候補になる。インビトロ及び／又はインビボでの細胞傷害アッセイを行い、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低下／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行い、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（故に、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、しかし、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確認することができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する主要な細胞が、ＦｃＲＩＩＩだけを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現が、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492のページ４６４の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例が、米国特許第５，５００，３６２号（例、Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；及びHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502を参照のこと）；米国特許第５，８２１，３３７号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照のこと）において記載されている。或いは、非放射性アッセイ方法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのACTI（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega, Madison, WI）。そのようなアッセイにのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。或いは、又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、動物モデル（例えば、Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656において開示されるものなど）において評価してもよい。Ｃ１ｑ結合アッセイは、また、抗体がＣ１ｑに結合できず、故に、ＣＤＣ活性を欠くことを確認するために行ってもよい。例えば、ＷＯ ２００６／０２９８７９及びＷＯ ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171；Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合及びインビボでのクリアランス／半減期の決定は、また、当該分野において公知の方法を使用して実施することができる（例、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769)を参照のこと）。

【0364】

低下したエフェクター機能を伴う抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９の１つ又は複数の置換を伴うものを含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７の２つ以上に置換を伴うＦｃ変異体（いわゆる、アラニンへの残基２６５及び２９７の置換を伴う「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む）を含む。

【0365】

ＦｃＲへの改善又は減弱された結合を伴う、特定の抗体バリアントが記載されている（例、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ ２００４／０５６３１２、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照のこと）。

【0366】

特定の実施形態において、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善させる１つ又は複数アミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４（残基のＥＵナンバリング）での置換を伴うＦｃ領域を含む。

【0367】

一部の実施形態において、変化をＦｃ領域中に作製し、それらは、変化した（即ち、改善又は減弱した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす（例、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ ９９／５１６４２、及びIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に記載される通り）。

【0368】

増加した半減期及び、胎児への母性ＩｇＧの移動に関与する、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を伴う抗体（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593、及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）が、ＵＳ ２００５／００１４９３４に記載されている。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善させる、それにおける１つ又は複数の置換を伴うＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントは、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、又は４３４の１つ又は複数での置換（例、Ｆｃ領域残基４３４の置換）を伴うものを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。

【0369】

また、Ｆｃ領域バリアントの他の例に関するDuncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；ＵＳ ５，６４８，２６０；ＵＳ ５，６２４，８２１；及びＷＯ ９４／２９３５１を参照のこと。

【0370】

１つの好ましい実施形態において、抗体は、両方の重鎖において、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む。
ｄ）システイン操作抗体バリアント

【0371】

特定の実施形態において、システイン操作抗体（例、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」）を作ることが望ましいことがあり、それにおいて、抗体の１つ又は複数の残基が、システイン残基で置換されている。特定の実施形態において、置換された残基は、抗体の接近可能な部位で生じる。それらの残基をシステインと置換することにより、反応性チオール基が、それにより、抗体の接近可能な部位に位置付けられ、抗体を他の部分（例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分など）にコンジュゲーションさせるために使用し、イムノコンジュゲートを作製してもよい（本明細書において更に記載する通り）。特定の実施形態において、以下の残基の任意の１つ又は複数をシステインで置換してもよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）；重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作抗体を、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号において記載される通りに生成してもよい。
ｅ） 抗体誘導体

【0372】

特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体を更に改変させ、当技術分野において公知であり、容易に入手可能である追加の非タンパク質性部分を含んでもよい。抗体の誘導体化のために適切な部分は、水溶性ポリマーを含むが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定はしないが、以下を含む：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオル（例、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造において利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であり得る、分岐又は非分岐であり得る。抗体に付着するポリマーの数は変動し得るが、１つを上回るポリマーが付着する場合、それらは同じ又は異なる分子であり得る。一般的に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又は型は、抗体誘導体が、定義された条件などの下での治療において使用されるか否かにかかわらず、考察（限定はしないが、改善される抗体の特定の特性又は機能を含む）に基づいて決定することができる。

【0373】

別の実施形態において、照射(radiation)への曝露により選択的に加熱され得る、抗体及び非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。一実施形態において、非タンパク質性部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。照射は、任意の波長であり得るが、通常の細胞に害を与えず、しかし、抗体−非タンパク質性部分に近い細胞が死滅される温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含むが、これに限定されない。
ハプテン化化合物

【0374】

本明細書において報告するコンジュゲート中のハプテンは、それ自体が分子の１つではない場合、治療用薬剤（薬物）、細胞傷害性薬剤（例、毒素、例えばドキソルビシン又は百日咳毒素など）、フルオロフォア（例えばフルオレセイン又はローダミンなどのフルオレセイン色素など）、イメージング又は放射線治療用金属のためのキレート剤、ペプチジル標識又は非ペプチジル標識又は検出タグ、或いはクリアランス修飾剤（例えばポリエチレングリコールの種々の異性体など）、第３成分に結合するペプチド、或いは別の糖又は親油性薬剤にコンジュゲーションされ得る。そのようなコンジュゲートは、ハプテン化化合物として表示される。コンジュゲーションは、直接的に、又は介在リンカーを介することができる。
ａ） 治療用部分

【0375】

ハプテン−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ、ハプテン化薬物）の薬物部分（Ｄ）は、細胞傷害性効果又は細胞分裂阻害効果を有する任意の化合物、部分、又は基であり得る。薬物部分は以下を含む：（ｉ）化学療法薬剤（微小管阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、又はＤＮＡインターカレーターとして機能し得る）；（ｉｉ）タンパク質毒素（酵素的に機能し得る）；及び（ｉｉｉ）放射性同位体。

【0376】

例示的な薬物部分は、マイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カリケアマイシン及び他のエンジイン抗生物質、タキサン、アントラサイクリン、並びにその立体異性体、アイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｓ）、それらの類似体又は誘導体を含むが、これらに限定されない。

【0377】

タンパク質毒素は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌からの）、リシンＡ鎖、（Vitetta et al (1987) Science, 238:1098）、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−５）、ゴーヤー阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含む（ＷＯ ９３／２１２３２）。

【0378】

治療用の放射性同位元素は、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^９０Ｙ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^１５３Ｓｍ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｂ、^２１２Ｐｂ、及びＬｕの放射性同位体を含む。

【0379】

放射性同位元素又は他の標識を、公知の方法において組み入れてもよい（Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57;”Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”Chatal, CRC Press 1989）。炭素１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、複合体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である（ＷＯ ９４／１１０２６）。
ｂ）標識

【0380】

ハプテン化化合物は、ハプテン化標識であることができる。ハプテンに共有結合的に付着させることができる任意の標識部分を使用することができる（例、Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147-15；Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;Lundblad R. L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, Fla.を参照のこと）。標識は、以下のために機能し得る：（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用し、第１又は第２の標識により提供される検出可能なシグナルを改変し、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を与える；（ｉｉｉ）電荷、疎水性、形状、又は他の物理的パラメーターにより、移動度（例、電気泳動移動度又は細胞透過性）に影響を及ぼす、或いは（ｉｖ）捕捉部分を提供し、例えば、イオン錯体形成を調節する。

【0381】

本明細書において報告するハプテン化標識を含むコンジュゲートは、例えば、特定の細胞、組織、又は血清において目的の抗原の発現を検出するための診断アッセイにおいて有用であり得る。診断適用のために、二重特異性抗体が使用され、それにおいて、第１の結合特異性は標的に結合し、第２の結合特異性はハプテン化標識に結合する。ハプテンは、典型的には、検出可能な部分を用いて標識される。多数の標識が利用可能であり、それらは、一般的に、以下のカテゴリー中に分類することができる：

【0382】

（ａ）放射性同位元素（放射性核種）、例えば^３Ｈ、^１１Ｃ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^６４Ｃｕ、^６８Ｇｎ、^８６Ｙ、^８９Ｚｒ、^９９ＴＣ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１３３Ｘｅ、^１７７Ｌｕ、^２１１Ａｔ、又は^１３１Ｂｉなど。放射性同位体標識コンジュゲートは、受容体標的化イメージング実験において有用である。抗原（ハプテン）は、Current Protocols in Immunology, (1991) Volumes 1 and 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubsにおいて記載される技術を使用し、放射性同位体金属に結合する、キレート化する、又は、そうでなければ複合体化するリガンド試薬を用いて標識することができる。金属イオンと複合体化し得るキレートリガンドは、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡ、及びＴＥＴＡ（Macrocyclics, Dallas, Tex.）を含む。放射性核種は、本明細書において報告する通りの複合体との複合体化を介して標的化することができる（Wu et al, Nature Biotechnology 23(9) (2005) 1137-1146）。放射性核種で標識された複合体を用いた受容体標的イメージングによって、腫瘍組織中での複合体又は対応する治療用抗体の進行性蓄積の検出及び定量化により、経路活性化のマーカーを提供することができる（Albert et al (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210）。

【0383】

イメージング実験用の標識として適切な金属キレート複合体（ＵＳ ２０１０／０１１１８５６；ＵＳ ５，３４２，６０６；ＵＳ ５，４２８，１５５；ＵＳ ５，３１６，７５７；ＵＳ ５，４８０，９９０；ＵＳ ５，４６２，７２５；ＵＳ ５，４２８，１３９；ＵＳ ５，３８５，８９３；ＵＳ ５，７３９，２９４；ＵＳ ５，７５０，６６０；ＵＳ ５，８３４，４５６；Hnatowich et al, J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157；Meares et al, Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78；Mirzadeh et al, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 59-65；Meares et al, J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26；Izard et al, Bioconjugate Chem. 3 (1992) 346-350；Nikula et al, Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90；Camera et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62；Kukis et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 2105-2110；Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670；Camera et al, J. Nucl. Med. 21 (1994) 640-646；Ruegg et al, Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226；Verel et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670；Lee et al, Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482；Mitchell, et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112；Kobayashi et al Bioconjugate Chem. 10 (1999) 103-111；Miederer et al, J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137；DeNardo et al, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90；Blend et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363；Nikula et al J. Nucl. Med. 40 (1999) 166-76；Kobayashi et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36；Mardirossian et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74；Roselli et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20）。

【0384】

（ｂ）蛍光標識、例えば希土類キレート（ユウロピウムキレート）、フルオレセイン型（ＦＩＴＣ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセインを含む）；ローダミン型（ＴＡＭＲＡを含む）；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリトリン；テキサスレッド；及びそれらの類似体など。蛍光標識は、例えば、Current Protocols in Immunology（上記）に開示されている技術を使用して、抗原（ハプテン）にコンジュゲーションさせることができる。蛍光色素及び蛍光標識試薬は、Invitrogen/Molecular Probes（Eugene, Oregon, USA）及びPierce Biotechnology, Inc.（Rockford, Ill.）から商業的に入手可能であるものを含む。

【0385】

検出標識（例えば蛍光色素及び化学発光色素など）（Briggs et al “Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids,” J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058）は、検出可能なシグナルを提供し、一般的に、標識のために適用可能であり、以下の特性を伴う：（ｉ）標識コンジュゲートは、少量のコンジュゲートを、無細胞及び細胞ベースの両方のアッセイにおいて高感度に検出できるように、低バックグラウンドを伴う非常に高いシグナルを産生すべきである；及び、（ｉｉ）標識コンジュゲートは、蛍光シグナルが、有意な光退色を伴わずに、観察、モニター、及び記録され得るように、光安定的であるべきである。膜又は細胞表面（特に生細胞）への標識コンジュゲートの細胞表面結合を含む適用のために、標識は、（ｉｉｉ）効果的なコンジュゲート濃度及び検出感度を達成するために、良好な水溶性を有し、及び（ｉｖ）細胞の正常な代謝プロセスを破壊しないように、又は早期の細胞死を起こさないように、生細胞に非毒性であるべきである。

【0386】

（ｃ）種々の酵素−基質標識が、入手可能であるか、又は開示されている（例、ＵＳ４，２７５，１４９を参照のこと）。酵素は、一般的に、種々の技術を使用して測定することができる発色基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、基質における色の変化を触媒し得るが、それは、分光光度的に測定することができる。或いは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変化させ得る。化学発光基質は、化学反応により電子的に励起され、次に、（例えば、化学発光計を使用して）測定することができる光を放出し得る、又はエネルギーを蛍光アクセプターに供与する。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（例、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；ＵＳ ４，７３７，４５６）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）など、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む。酵素をポリペプチドにコンジュゲーションさせるための技術が、O’Sullivan et al “Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay”, in Methods in Enzym. (ed. by J. Langone & IT Van Vunakis), Academic Press, New York, 73 (1981) 147-166に記載されている。

【0387】

酵素−基質の組み合わせの例（ＵＳ ４，２７５，１４９；ＵＳ ４，３１８，９８０）は、例えば、以下を含む：
（ｉ）基質として水素ペルオキシダーゼを伴う西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（それにおいて、水素ペルオキシダーゼは、色素前駆体（例、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；
（ｉｉ）発色基質としてパラ−ニトロフェニルホスフェートを伴うアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；及び
（ｉｉｉ）発色基質（例、ｐ−ニトロフェニル（３−Ｄ−ガラクトシダーゼ））又は蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−（３−Ｄ−ガラクトシダーゼ）を伴う３−Ｄ−ガラクトシダーゼ（３−Ｄ−Ｇａｌ）。

【0388】

本明細書において報告する標識コンジュゲートは、任意の公知のアッセイ方法（例えばＥＬＩＳＡ、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイなど）において用いてもよい（Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (1987) pp. 147-158, CRC Press, Inc.）。

【0389】

本明細書において報告する標識コンジュゲートは、生物医学的及び分子イメージングの種々の方法及び技術、例えば（ｉ）ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）；（ｉｉ）マイクロＣＴ（コンピュータ断層撮影）；（ｉｉｉ）ＳＰＥＣＴ（単光子放出コンピュータ断層撮影）；（ｉｖ）ＰＥＴ（陽電子放射断層撮影）Tinianow, J. et al Nuclear Medicine and Biology, 37(3) (2010) 289-297；Chen et al, Bioconjugate Chem. 15 (2004) 41-49;US 2010/0111856；（ｖ）生物発光；（ｖｉ）蛍光；及び（ｖｉｉ）超音波などによる、イメージングバイオマーカー及びプローブとして有用である。免疫シンチグラフィーは、放射性物質を用いて標識されたコンジュゲートが、動物又はヒト患者に投与され、コンジュゲートが局在化する身体中の部位の写真を撮る、イメージング手順である（ＵＳ ６，５２８，６２４）。イメージングバイオマーカーは、治療的介入への正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、又は薬理学的応答の指標として客観的に測定され、評価され得る。バイオマーカーは、いくつかの型であり得る：０型マーカーは、疾患の自然経過マーカーであり、公知の臨床指標（例、関節リウマチにおける滑膜炎症のＭＲＩ評価）と長期的に相関する；Ｉ型マーカーは、作用機構に従った介入の効果を捕捉する（その機構が、臨床転帰に関連付けられないであろう場合でさえ）；ＩＩ型マーカーは、サロゲートエンドポイントとして機能し、そこでは、バイオマーカーにおける変化、又はそこからのシグナルによって、標的化応答（例えば、ＣＴによる関節リウマチにおける、測定された骨侵食など）を「検証」するための臨床的利益が予測される。イメージングバイオマーカーは、このように、以下に関する薬力学的（ＰＤ）な治療情報を提供することができる：（ｉ）標的タンパク質の発現、（ｉｉ）標的タンパク質への治療用薬剤の結合（即ち、選択性）、並びに（ｉｉｉ）クリアランス及び半減期の薬物動態データ。ラボベースのバイオマーカーに関するインビボのイメージングバイオマーカーの利点は、非侵襲的治療、定量化可能な、全身評価、反復投与及び評価、すなわち、複数の時点、及び臨床（ヒト）の結果と前臨床（小動物）から潜在的に移転可能効果を含む。一部の適用について、バイオイメージングによって、前臨床試験における動物実験の数が取って代わられる、又は最小限になる。

【0390】

ペプチド標識方法は周知である。Haugland (2003) Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.；Brinkley (1992) Bioconjugate Chem. 3:2；Garman, (1997) Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London；Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2；Glazer et al Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York；Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York；Pfleiderer, G. (1985) “Chemical Modification of Proteins”, Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGruyter, Berlin and New York；and Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.)；DeLeon-Rodriguez et al, Chem. Eur. J. 10 (2004) 1149-1155；Lewis et al, Bioconjugate Chem. 12 (2001) 320-324；Li et al, Bioconjugate Chem. 13 (2002) 110-115；Mier et al Bioconjugate Chem. 16 (2005) 240-237を参照のこと。
抗体コンジュゲート

【0391】

本明細書において報告するコンジュゲート中の抗体は、それが、それ自体により、分子の１つではない場合、治療用薬物（薬物）、細胞傷害性薬剤、（例、毒素、例えばドキソルビシン又は百日咳毒素など）、フルオロフォア（例えばフルオレセイン又はローダミンのような蛍光色素など）、イメージング又は放射線治療用金属のためのキレート剤、ペプチジル標識若しくは非ペプチジル標識又は検出タグ、又はクリアランス修飾剤（例えばポリエチレングリコールの種々の異性体など）、第３成分に結合するペプチド、又は他の糖若しくは親油性薬剤に更にコンジュゲーションさせることができる。
イムノコンジュゲート

【0392】

本発明は、また、１つ又は複数の細胞傷害性薬剤、例えば化学療法用の薬剤又は薬物、成長阻害剤、毒素（例、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素活性毒素、又はそれらのフラグメント）、又は放射性同位体にコンジュゲーションされた、本明細書において報告する抗体又は本明細書において報告するコンジュゲートを含むイムノコンジュゲートを提供する。

【0393】

一実施形態において、イムノコンジュゲートは、抗体が、以下の１つ又は複数の薬物にコンジュゲーションされた抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である：メイタンシノイド（ＵＳ ５，２０８，０２０、ＵＳ ５，４１６，０６４、及びＥＰ ０ ４２５ ２３５ Ｂ１を参照のこと）；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）など（ＵＳ ５，６３５，４８３、ＵＳ ５，７８０，５８８、及びＵＳ ７，４９８，２９８を参照のこと）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（ＵＳ ５，７１２，３７４、ＵＳ ５，７１４，５８６、ＵＳ ５，７３９，１１６、ＵＳ ５，７６７，２８５、ＵＳ ５，７７０，７０１、ＵＳ ５，７７０，７１０、ＵＳ ５，７７３，００１、及びＵＳ ５，８７７，２９６；Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342；及びLode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928を参照のこと）；アントラサイクリン、例えばダウノマイシン又はドキソルビシンなど（Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523；Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362；Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721；Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834；Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532；King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照のこと）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなど；トリコテセン；並びにＣＣ１０６５を含む。

【0394】

別の実施形態において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はそのフラグメント（ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、エノマイシン、及びトリコテセンを含むが、これらに限定されない）にコンジュゲーションされた、本明細書において記載する抗体を含む。

【0395】

別の実施形態において、イムノコンジュゲートは、本明細書において記載する抗体又は本明細書において報告する複合体を含み、放射性原子にコンジュゲーションされ、放射性コンジュゲートを形成する。種々の放射性同位体が、放射性コンジュゲートの産生に利用可能である。例は、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。放射性コンジュゲートが検出のために使用される場合、それは、シンチグラフィー試験用の放射性原子（例えばＴＣ^９９ｍ又はＩ^１２３）、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング用のスピン標識（磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）としても公知）（例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、又は鉄など）を含み得る。

【0396】

抗体及び細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング薬剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣｌなど）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ型アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などを使用して作製され得る。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104において記載される通りに調製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。ＷＯ ９４／１１０２６を参照のこと。リンカーは、細胞において、細胞傷害性薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定なリンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。

【0397】

本明細書におけるイムノコンジュゲート又はＡＤＣでは、架橋試薬（ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホＥＭＣＳ、スルホＧＭＢＳ、スルホＫＭＵＳ、スルホＭＢＳ、スルホＳＩＡＢ、スルホＳＭＣＣ、及びスルホＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）安息香酸）を含むが、これらに限定されず、これらは、商業的に入手可能である（例、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから））を用いて調製された、そのようなコンジュゲートが明示的に熟慮されるが、これらに限定されない。
リンカー

【0398】

用語「リンカー」は、他の部分（例えば検出可能な標識又は薬物など）に抗原（例、ハプテン）をコンジュゲーション（連結）するために使用することができる二官能性又は多官能性部分を意味する。抗原（ハプテン）コンジュゲートを、薬物への、抗原（ハプテン）への、及び抗ハプテン抗体への結合のための反応性官能基を有するリンカーを使用して簡便に調製することができる。

【0399】

一実施形態において、リンカーは抗ハプテン抗体上に存在する求核基に反応性である求電子基を有する反応性部位を有する。抗体上のシステインチオール基は、例えば、リンカー上の求電子基と反応性であり、リンカーに共有結合を形成する。有用な求電子基は、別のチオール基、マレイミド基、及びハロアセトアミド基を含むが、これらに限定されない（例、Klussman et al, Bioconjugate Chemistry 15(4) (2004) 765-773のページ７６６のコンジュゲーション方法を参照のこと）。

【0400】

チオール反応性官能基の例は、チオール、マレイミド、アルファ−ハロアセチル、活性化エステル（例えばスクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステルなど）、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネート、及びイソチオシアネートを含むが、これらに限定されない。

【0401】

リンカーは、ペイロードに抗原（ハプテン）を連結するアミノ酸残基を含み得る。アミノ酸残基は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチド、又はドデカペプチドの単位を形成し得る。アミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに非天然に生じるアミノ酸類似体（例えばシトルリン）又はβアミノ酸（例えば、βアラニンなど）、又はωアミノ酸（例えば４−アミノ酪酸など）を含む。

【0402】

別の実施形態において、リンカーは、抗原（ハプテン）又は抗体（抗ハプテン抗体）上に存在する求電子基に反応性である求核基を有する反応性官能基を有する。有用な求電子基は、アルデヒド基及びケトンカルボニル基を含むが、これらに限定されない。リンカーの求核基のヘテロ原子は、ハプテン又は抗体上の求電子基と反応し、抗原（ハプテン）又は抗体に共有結合を形成することができる。リンカー上の有用な求核基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドを含むが、これらに限定されない。抗原（ハプテン）上の求電子基は、リンカーへの付着のための簡便な部位を提供する。

【0403】

典型的には、ペプチド型リンカーは、２つ以上のアミノ酸及び／又はペプチドフラグメントの間でペプチド結合を形成することにより調製することができる。そのようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知である、液相合成方法（E. Schroder and K. Lubke “The Peptides”, volume 1 (1965) 76-136, Academic Press）に従って調製することができる。

【0404】

別の実施形態において、リンカーは溶解性又は反応性が調節された基を用いて置換されてもよい。例えば、荷電置換基（例えばスルホン酸（ＳＯ_３⁻）若しくはアンモニウムなど）又はポリマー（例えばＰＥＧなど）は、試薬の水溶性を増加し得る、抗原（ハプテン）又は薬剤部分を伴うリンカー試薬のカップリング反応を促進し得る、或いは、用いられる合成経路に依存して、カップリング反応を促進し得る。

【0405】

本明細書において報告する薬物又は標識を含むコンジュゲートでは、架橋試薬（ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホＥＭＣＳ、スルホＧＭＢＳ、スルホＫＭＵＳ、スルホＭＢＳ、スルホＳＩＡＢ、スルホＳＭＣＣ、スルホＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸）、並びにビスマレイミド試薬ＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＭ（ＰＥＯ）_３、及びＢＭ（ＰＥＯ）_４を含み、これらは、商業的に入手可能である（例、Pierce Biotechnology, Inc.から））を用いて調製された複合体が明示的に熟慮されるが、これらに限定されない。ビスマレイミド試薬は、例えば、連続又は同時の様式において、チオール含有薬物部分、標識、又はリンカー中間体へのチオール基の付着を可能にする。例えば、チオール基と反応性である、マレイミド以外の他の官能基は、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、及びイソチオシアネートを含む。

【0406】

例示的なリンカーは、マレイミドストレッチャー及びパラ−アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢ）自壊性スペーサーを持つバリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ又はｖｃ）ジペプチドリンカー試薬、並びにマレイミドストレッチャー単位及びｐ−アミノベンジル自壊性スペーサーを有するｐｈｅ−ｌｙｓ（Ｍｔｒ）ジペプチドリンカー試薬を含む。

【0407】

システインチオール基は求核性であり、反応し、リンカー試薬及びハプテン化化合物上で、求電子基と共有結合を形成することが可能であり、以下を含む：（ｉ）活性エステル（例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸性ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド（例えばハロアセトアミドなど）；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル基、及びマレイミド基；並びに（ｉｖ）スルフィド交換を介したジスルフィド（ピリジルジスルフィドを含む）。ハプテン化化合物上の求核基は、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基（反応し、リンカー部分及びリンカー試薬上で求電子基と共有結合を形成することが可能である）を含むが、これらに限定されない。
ＩＩＩ．核酸

【0408】

本明細書において報告する、又は本明細書において報告するコンジュゲート中に含まれる、抗体のアミノ酸配列バリアントをコードするＤＮＡは、当技術分野において公知の種々の方法により調製することができる。これらの方法は、部位定方向性（又はオリゴヌクレオチド媒介性）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びポリペプチドをコードする以前に調製されたＤＮＡのカセット変異誘発による調製を含むが、これらに限定されない。組換え抗体のバリアントは、また、制限フラグメント操作により、又は合成オリゴヌクレオチドを用いたオーバーラップ伸長ＰＣＲにより構築され得る。変異誘発プライマーは、システインコドン置換をコードする。標準的な変異誘発技術を用いて、そのような改変操作抗体をコードするＤＮＡを生成することができる。一般的なガイダンスは、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; and Ausubel et al Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1993において見出すことができる。
ＩＶ．発現及び精製

【0409】

抗体は、組換え方法及び組成物を使用して産生してもよい（例、ＵＳ４，８１６，５６７において記載される通り）。一実施形態において、本明細書において記載する抗体をコードする単離核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列をコードし得る（例、抗体の軽及び／又は重鎖）。さらなる実施形態において、そのような核酸を含む、１つ又は複数のベクター（例、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。１つのそのような一実施形態において、宿主細胞（例、形質転換された）は、以下を含む：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクター。一実施形態において、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ細胞（例、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態において、本明細書において報告する抗体を作製する方法が提供され、それにおいて、この方法は、上に提供する抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現のために適切な条件下で培養すること、及び、場合により、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。

【0410】

本明細書において報告する抗体の組換え産生のために、抗体をコードする核酸（例、上記に記載する通り）を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／又は発現のために、１つ又は複数のベクター中に挿入する。そのような核酸は、従来の手順を使用し、容易に単離及び配列決定され得る（例、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）。

【0411】

抗体をコードするベクターのクローニング又は発現のための適切な宿主細胞は、本明細書において記載する原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ではない場合、細菌中で産生させてもよい。細菌における抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば、ＵＳ ５，６４８，２３７、ＵＳ ５，７８９，１９９、及びＵＳ ５，８４０，５２３を参照のこと。（また、Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254（大腸菌における抗体フラグメントの発現が記載されている）を参照のこと）。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離してもよく、更に精製することができる。

【0412】

原核生物に加えて、真核微生物（例えば糸状菌又は酵母など）は、グリコシル化経路が「ヒト化」された、抗体コードベクター用の適切なクローニング又は発現宿主（真菌及び酵母株を含む）であり、部分的な、又は完全なヒトグリコシル化パターンを伴う抗体の産生をもたらす。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及びLi, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照のこと。

【0413】

グリコシル化抗体の発現のための適切な宿主細胞は、また、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株が同定されており、それらは、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用され得る。

【0414】

植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、及び第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのPLANTIBODIES（商標）技術を記載している）を参照のこと。

【0415】

脊椎動物細胞も宿主として使用してもよい。例えば、懸濁液中で成長するように適応された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚腎臓株（例、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74において記載される２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252において記載されるＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ；緩衝液ローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞（Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68において記載される通り）；ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)を含む）；並びに骨髄腫細胞株（例えばＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０など）を含む。抗体産生にための適切な特定の哺乳動物宿主細胞系の概説については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照のこと。
Ｖ．診断及び検出のための方法及び組成物

【0416】

特定の実施形態において、抗体、特に二重特異性抗体、及び本明細書において報告するコンジュゲートのいずれかが、生物学的サンプル中の１つ又は複数の標的分子の存在を検出するために有用である。本明細書において使用する用語「検出する」は、定量的又は定性的な検出を包含する。一実施形態において、生物学的サンプルは細胞又は組織を含む。

【0417】

一実施形態において、診断又は検出の方法における使用のための、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートが提供される。特定の実施形態において、この方法は、標的への抗体又はコンジュゲートの結合のための許容可能な条件下で、生物学的サンプルを、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートと接触させること、及び、複合体が、抗体又はコンジュゲートと標的の間で形成されるか否かを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボの方法であり得る。

【0418】

特定の実施形態において、標識された抗体又はコンジュゲートが提供される。標識は、直接的に検出される標識又は部分（例えば蛍光標識、発色標識、高電子密度標識、化学発光標識、及び放射性標識など）、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を通じて間接的に検出される部分（例えば酵素又はリガンドなど）を含むが、これらに限定されない。例示的な標識は、放射性同位元素^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、及び^１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ（例、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（ＵＳ４，７３７，４５６））、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ（色素前駆体（例えばＨＲＰなど）を酸化するために過酸化水素を用いた酵素とカップリングされている）、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン標識、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカルなどを含むが、これらに限定されない。
ＶＩ．医薬的製剤

【0419】

本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートの医薬的製剤を、所望の程度の純度を有するそのような抗体又はコンジュゲートを、１つ又は複数の任意の医薬的に許容可能な担体（Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)）を用いて、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態において混合することにより調製する。医薬的に許容可能な担体は、一般的に、用いられる投薬量及び濃度で、レシピエントに非毒性であり、緩衝剤、例えばリン酸、クエン酸、及び他の有機酸など；抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベンなど；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えばポリ（ビニルピロリドン）など；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなど；単糖類、二糖類、及び他の糖（グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む）；キレート剤、例えばＥＤＴＡなど；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなど；塩形成対イオン、例えばナトリウムなど；金属錯体（例、亜鉛タンパク質複合体）；並びに／或いは、非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含むが、これらに限定されない。本明細書における例示的な医薬的に許容可能な担体は、さらに、間質性薬物分散剤、例えば可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒｈｕＰＨ２０（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）などを含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用の方法（ｒｈｕＰＨ２０を含む）が、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ又は複数の追加のグリコサミノグリカナーゼ（例えばコンドロイチナーゼなど）と組み合わせる。

【0420】

例示的な凍結乾燥抗体製剤が、ＵＳ ６，２６７，９５８に記載されている。水性抗体製剤は、ＵＳ ６，１７１，５８６及びＷＯ ２００６／０４４９０８に記載されているものを含み、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。

【0421】

本明細書における製剤は、また、処置されている特定の適応症について必要な際に１を上回る活性成分、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的な活性を伴うものを含み得る。そのような活性成分は、意図される目的のために効果的である量で、組み合わせで適切に存在する。

【0422】

活性成分は、例えば、コアセルベーション技術により、又は、界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれコロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中又はマクロエマルジョン中のヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中に封入してもよい。そのような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。

【0423】

持続放出調製物を調製してもよい。持続放出製剤の適切な例は、抗体又はコンジュゲートを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは、成形品（例、フィルム、又はマイクロカプセル）の形態である。

【0424】

インビボ投与のために使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、無菌濾過膜を通した濾過により容易に達成され得る。
ＶＩＩ．治療的方法及び組成物

【0425】

本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートのいずれかを、治療的方法において使用してもよい。

【0426】

一態様において、医薬としての使用のための、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートが提供される。さらなる態様において、疾患の処置における使用のための、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートが提供される。特定の実施形態において、処置の方法における使用のための、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートが提供される。特定の実施形態において、本発明は、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートの効果的な量を個体に投与することを含む、個体を処置する方法における使用のための、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートを提供する。１つのそのような実施形態において、方法は、少なくとも１つの追加の治療用薬剤の効果的な量を個体に投与することを更に含む（例、下記に記載する通り）。上記の実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトであり得る。

【0427】

さらなる態様において、本発明は、医薬の製造又は調製における、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートの使用を提供する。一実施形態において、医薬は、疾患の処置のためである。さらなる実施形態において、医薬は、医薬の効果的な量を、疾患を有する個体に投与することを含む、疾患を処置する方法における使用のためである。１つのそのような実施形態において、方法は、少なくとも１つの追加の治療用薬剤の効果的な量を個体に投与することを更に含む（例、下記に記載する通り）。上記の実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトであり得る。

【0428】

さらなる態様において、本発明は、疾患を処置するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートの効果的な量を、そのような疾患を有する個体に投与することを含む。１つのそのような実施形態において、方法は、少なくとも１つの追加の治療用薬剤の効果的な量を個体に投与することを更に含む（例、下記に記載する通り）。上記の実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトであり得る。

【0429】

さらなる態様において、本発明は、例えば、上の治療的方法のいずれかにおける使用のための、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートのいずれかを含む医薬的製剤を提供する。一実施形態において、医薬的製剤は、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートのいずれか、及び医薬的に許容可能な担体を含む。別の実施形態において、医薬的製剤は、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートのいずれか、及び少なくとも１つの追加の治療用薬剤（例、以下記に記載する通り）を含む。

【0430】

本明細書において報告する抗体及びコンジュゲートは、治療において、単独で、又は他の薬剤との組み合わせにおいて使用することができる。例えば、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートは、少なくとも１つの追加の治療用薬剤と同時投与され得る。

【0431】

上に記述するそのような組み合わせ治療は、組み合わせ投与（そこでは、２つ以上の治療用薬剤が、同じ又は別々の製剤中に含まれる）、及び別々の投与（その場合において、本発明の抗体の投与は、追加の治療用薬剤及び／又はアジュバントの投与に先立ち、それと同時に、及び／又はそれに続いて起こり得る）を包含する。本明細書において報告する抗体及びコンジュゲートは、また、放射線治療との組み合わせにおいて使用することができる。

【0432】

本明細書において報告する抗体又はコンジュゲート（及び任意の追加の治療用薬剤）を、任意の適切な手段（非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに、局所処置のために望ましい場合、病巣内投与を含む）により投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、投与が短期又は慢性であるかに部分的に依存し、任意の適切な経路により、例えば、注射（例えば静脈内又は皮下注射など）によることができる。種々の投薬スケジュール（種々の時間点にわたる単一又は複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されない）を、本明細書において熟慮する。

【0433】

本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートを、良好な医学的行為と一致した様式において、製剤化、投薬、及び投与し得る。この文脈における考慮のための因子は、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジュール、及び医療従事者に公知の他の因子を含む。抗体又はコンジュゲートは、問題の障害を防止又は処置するために現在使用される１つ又は複数の薬剤を用いて、必要はないが、しかし、場合により、製剤化される。そのような他の薬剤の効果的な量は、製剤中に存在する抗体又はコンジュゲートの量、障害又は処置の型、及び上に考察する他の因子に依存する。これらは、一般的に、同じ投与量において、及び本明細書において記載する投与経路を用いて、又は、本明細書において記載する投与量の約１〜９９%、又は、任意の投与量において、及び経験的／臨床的に適切であると決定された任意の経路により使用される。

【0434】

疾患の防止又は処置のために、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲート（単独で、或いは、１つ又は複数の他の追加の治療用薬剤との組み合わせにおいて使用される場合）の適切な投与量は、処置される疾患の型、抗体又はコンジュゲートの型、疾患の重症度及び経過、抗体又はコンジュゲートが、防止的又は治療的な目的のために投与されるか否か、以前の治療、患者の病歴及び抗体又はコンジュゲートへの応答、並びに主治医の判断に依存する。抗体又はコンジュゲートは、１回で、又は一連の処置にわたり患者に適切に投与される。疾患の型及び重症度に依存して、抗体又はコンジュゲートの約１μg/kg〜１５mg/kg（例、０．５〜１０mg/kg）は、例えば、１つ又は複数の別々の投与による、又は連続注入によるかにかかわらず、患者に投与するための初期候補投与量であることができる。１つの典型的な１日投与量は、上に言及する因子に依存して、約１μg/kg〜１００mg/kg以上の範囲であり得る。数日間又はそれより長い反復投与のために、状態に依存し、処置を、一般的に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続し得る。抗体又はコンジュゲートの１つの例示的な投与量は、約０．０５mg/kgから約１０mg/kgの範囲であろう。このように、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg、又は１０mg/kg（又はそれらの任意の組み合わせ）の１つ又は複数の用量を、患者に投与してもよい。そのような用量は、間欠的に、例えば、毎週又は３週間毎（例、患者が、約２〜約２０、又は、例えば、約６用量の抗体を受けるように）に投与することができる。初期のより高い負荷用量、それに続く１つ又は複数の低用量を投与してもよい。しかし、他の投与計画が有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイにより簡単にモニターされる。

【0435】

上の製剤又は治療的方法のいずれかを、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートの代わりに、又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使用して行ってもよいことが理解される。
ＶＩＩＩ．製造品

【0436】

本発明の別の態様において、上記に記載する障害の処置、防止、及び／又は診断のために有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器及び容器上に、又はそれと関連するラベル若しくは添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどを含む。容器は、種々の材料（例えばガラス又はプラスチックなど）から形成され得る。容器は、それ自体である、又は状態を処置、防止、及び／又は診断するために効果的な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書において報告する抗体又は複合体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選んだ状態を処置するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本明細書において含まれる組成物を伴う第１の容器（それにおいて、組成物は、本明細書において報告する抗体又は複合体を含む）；及び（ｂ）本明細書において含まれる組成物を伴う第２の容器（それにおいて、組成物は、さらに、細胞傷害性又は他の治療用薬剤を含む）を含み得る。本発明のこの実施形態における製造品は、組成物が、特定の状態を処置するために使用することができることを示す添付文書を含み得る。或いは、又は加えて、製造品は、さらに、医薬的に許容可能な緩衝液（例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、及びデキストロース溶液など）を含む第２の（又は第３の）容器を含み得る。それは、さらに、商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料（他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む）を含み得る。

【0437】

上の製造品のいずれかが、本明細書において報告する抗体又はコンジュゲートの代わりに、又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。
ＩＸ．具体的な実施形態

【0438】

１．以下を含む共有結合コンジュゲート：
ｉ） ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性及び血液脳関門受容体に特異的に結合する第２の結合特異性を有する二重特異性抗体、並びに
ｉｉ）ハプテン化ペイロード、
ここで、ハプテン化ペイロードは、第１の結合特異性により特異的に結合され、
ここで、共有結合コンジュゲートは、ハプテン化ペイロードと、ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性の間に共有結合を有し、並びに
ここで、ハプテン化ペイロードは、ビオチン化ペイロード、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、ジゴキシゲニン化ペイロード、カルボラン化（ｃａｒｂｏｒａｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、ヘリカー化（ｈｅｌｉｃａｒｙｌａｔｅｄ）ペイロード、及びブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードからなる群より選択される。

【0439】

２．ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性及び血液脳関門受容体に特異的に結合する第２の結合特異的を有する二重特異性抗体及びハプテン化ペイロード（それにおいて、ハプテン化ペイロードは、第１の結合特異性により特異的に結合される）を含む非共有結合複合体。

【0440】

３．ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性及び血液脳関門受容体に特異的に結合する第２の結合特異的を有する二重特異性抗体及びハプテン化ペイロード（それにおいて、ハプテン化ペイロードは、第１の結合特異性により特異的に結合され、それは、ハプテン化ペイロードと、ハプテン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性の間に共有結合を有する）を含む共有結合コンジュゲート。

【0441】

４．項目１〜３のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ハプテン化ペイロードは、ビオチン化ペイロード、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、ジゴキシゲニン化ペイロード、カルボラン化（ｃａｒｂｏｒａｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、ヘリカー化（ｈｅｌｉｃａｒｙｌａｔｅｄ）ペイロード、及びブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードを含む群より選択される。

【0442】

５．項目１〜４のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ハプテンは、ヌクレオチド又はヌクレオシドの誘導体又は類似体である。一実施形態において、ハプテンは、アミノ酸の誘導体又は類似体である。

【0443】

６．項目１〜５のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、血液脳関門受容体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群より選択される。

【0444】

７．項目１〜６のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、２つの結合部位を含む完全長抗体である．

【0445】

８．項目１〜７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、１つ又は２つのｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂが融合されており、３つ又は４つの結合部位を含む完全長抗体である。

【0446】

９．項目１〜８のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は抗体フラグメントである。一実施形態において、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）_２及びダイアボディより選択される。

【0447】

１０．項目１〜９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体である。

【0448】

１１．二重特異性抗体にエフェクター機能がない、項目１〜１０のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲート。

【0449】

１２．項目１〜１１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、機能的Ｆｃ領域を有さない。

【0450】

１３．項目１〜１２のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、Ｆｃ領域を有さない。

【0451】

１４．項目１〜１３のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇを伴うヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃ領域を有し、それにおいて、位置は、ＫａｂａｔのＦｃ領域ナンバリング（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス）に従って決定される。

【0452】

１５．項目１〜１４のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇを伴うヒトＩｇＧ４サブクラスのＦｃ領域を有し、それにおいて、位置は、ＫａｂａｔのＦｃ領域ナンバリング（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス）に従って決定される。

【0453】

１６．項目１〜１５のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、以下を含む：
ａ）ハプテン化ペイロードのための１つの結合部位及び血液脳関門受容体のための１つの結合部位、又は
ｂ）ハプテン化ペイロードのための２つの結合部位及び血液脳関門受容体のための１つの結合部位、又は
ｃ）ハプテン化ペイロードのための１つの結合部位及び血液脳関門受容体のための２つの結合部位、又は
ｄ）ハプテン化ペイロードのための２つの結合部位及び血液脳関門受容体のための２つの結合部位。

【0454】

１７．項目１〜１６のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、ハプテン化ペイロードのための２つの結合部位及び血液脳関門受容体のための２つの結合部位を含む。

【0455】

１８．項目１〜１７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ハプテン化ペイロードは、ハプテンとペイロードの間にリンカーを含む。

【0456】

１９．項目１８に従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、リンカーはペプチドリンカーである。

【0457】

２０．項目１８に従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、リンカーは化学的リンカー（非ペプチドリンカー）である。

【0458】

２１．項目１〜２０のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体及びハプテン化ペイロードは、各々、官能基を含み、それにより、二重特異性抗体によるハプテン化ペイロードの結合時、共有結合が、ハプテン化ペイロードと二重特異性抗体の間に形成される。

【0459】

２２．項目１〜２１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、抗体のＣＤＲ２中のアミノ酸残基に官能基を含み、ここで、ＣＤＲ２が、Ｋａｂａｔに従い決定される。

【0460】

２３．項目２２に従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体のＣＤＲ２中のアミノ酸残基での官能基は、チオール基である。

【0461】

２４．項目１〜２３のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、抗体のＣＤＲ２中にシステインアミノ酸残基を含む。

【0462】

２５．項目１〜２４のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ハプテン化ペイロードは、ハプテン中に、又は、リンカー中に存在する場合、ハプテンとペイロードの間に、官能基を含む。

【0463】

２６．項目２５に従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、官能基は、チオール、又はマレイミド、又はハロアセチルである。

【0464】

２７．項目２５〜２６のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ハプテン中の、又は、存在する場合、リンカー中の官能基は、チオール基である。

【0465】

２８．項目１〜２７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、共有結合は、抗体のＣＤＲ２中のシステイン残基とハプテン化ペイロード中のチオール基の間である。

【0466】

２９．項目２８に従った複合体又はコンジュゲート、それにおいて、共有結合はジスルフィド結合である。

【0467】

３０．項目２８〜２９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、共有結合はジスルフィド結合であり、それは、酸化還元活性剤の添加を伴わず形成される。

【0468】

３１．項目１〜３０のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ＣＤＲ２が、ビオチン化ペイロード、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロード、ジゴキシゲニン化ペイロード、及びフルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードからなる群より選択されるハプテン化ペイロードの場合において、重鎖ＣＤＲ２である。

【0469】

３２．項目３１に従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体の重鎖ＣＤＲ２中のシステイン残基は、Ｋａｂａｔの重鎖可変ドメインナンバリングに従った位置５２、又は位置５２ａ、又は位置５２ｂ、又は位置５２ｃ、又は位置５２ｄ、又は位置５３にある。

【0470】

３３．項目３１〜３２のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体の重鎖ＣＤＲ２中のシステイン残基は、Ｋａｂａｔの重鎖可変ドメインナンバリングに従った位置５２ａ、又は位置５２ｂ、又は位置５２ｃ、又は位置５３にある。

【0471】

３４．項目３１〜３３のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体の重鎖ＣＤＲ２中のシステイン残基は、Ｋａｂａｔの重鎖可変ドメインナンバリングに従った位置５２ｂに、又は位置５３にある。

【0472】

３５．項目１〜３０のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ＣＤＲ２は、ヘリカー化（ｈｅｌｉｃａｒｙｌａｔｅｄ）ペイロードの場合において、軽鎖ＣＤＲ２である。

【0473】

３６．項目３５に従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体の軽鎖ＣＤＲ２中のシステイン残基は、Ｋａｂａｔの軽鎖可変ドメインナンバリングに従った位置５１に、又は位置５５にある。

【0474】

３７．項目３５〜３６のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体の軽鎖ＣＤＲ２中のシステイン残基は、Ｋａｂａｔの軽鎖可変ドメインナンバリングに従った位置５５にある。

【0475】

３８．項目１〜３７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ＣＤＲ２当たり正確に１つの共有結合が形成される。

【0476】

３９．項目１〜３８のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ペイロードは、結合部分、標識部分、及び生物学的活性部分より選択される。

【0477】

４０．項目１〜３９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、生物学的に活性な部分は、抗体、抗体フラグメント、抗体コンジュゲートポリペプチド、１つ又は複数のＣＮＳ標的の天然リガンド、１つ又は複数のＣＮＳ標的の天然リガンドの改変バージョン、アプタマー、阻害性核酸（即ち、小さな阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、ロックド核酸（ＬＮＡ）、リボザイム、及び小分子、又は前述の任意の活性フラグメントを含む群より選択される。

【0478】

４１．項目１〜４０のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ペイロードは、核酸又は核酸誘導体である。

【0479】

４２．項目１〜４１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、核酸はｉＲＮＡ又はＬＮＡである。

【0480】

４３．項目１〜４２のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ペイロードはポリペプチドである。

【0481】

４４．項目１〜４３のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ペイロードは、小分子（非ポリペプチドの生物学的に活性な部分）である。

【0482】

４５．項目１〜４４のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、生物学的に活性な部分は、ポリペプチドである。

【0483】

４６．項目４５に従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ポリペプチドは、５〜５００のアミノ酸残基からなる。

【0484】

４７．項目４５〜４６のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ポリペプチドは、１０〜４５０のアミノ酸残基を含む。

【0485】

４８．項目４５〜４７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ポリペプチドは、１５〜４００のアミノ酸残基を含む。

【0486】

４９．項目４５〜４８のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ポリペプチドは、１８〜３５０のアミノ酸残基を含む。

【0487】

５０．項目１〜４９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性（抗ジゴキシゲニン結合特異性；抗ＤＩＧ結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性；抗（ｈ）ＴｆＲ結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性；抗ＬＲＰ８結合特異性）に特異的に結合する第２の結合特異性を含む。

【0488】

５１．項目１〜５０のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する２つの結合特異性（２つの抗ジゴキシゲニン結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（２つの抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性）に特異的に結合する２つの結合特異性を有する。

【0489】

５２．項目１〜５１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、それにおいて、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号０１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号０２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号０３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号０５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号０６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号０７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0490】

５３．項目１〜５２のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、ヒト化結合特異性である。

【0491】

５４．項目１〜５３のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、上記の実施形態のいずれかにおける通りのＣＤＲ及びアクセプターヒトフレームワーク（例、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク）を含む。

【0492】

５５．項目１〜５４のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号０９又は２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１０又は２６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１１又は２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号１３又は２９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１４又は３０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号１５又は３１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0493】

５６．項目１〜５５のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号０４又は１２又は２０又は２８のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0494】

５７．項目１〜５６のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ジゴキシゲニン抗体は、ジゴキシゲニンに結合する能力を保持する。

【0495】

５８．項目１〜５７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号０１又は０９又は１７又は２５において置換、挿入、及び／又は欠失されている。

【0496】

５９．項目１〜５８のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。

【0497】

６０．項目１〜５９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗ジゴキシゲニン抗体は、配列番号０１又は０９又は１７又は２５においてＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0498】

６１．項目１〜６０のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ジゴキシゲニン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号０８又は１６又は２４又は３２のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を更に含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0499】

６２．項目１〜６１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ジゴキシゲニン抗体は、ジゴキシゲニンに結合する能力を保持する。

【0500】

６３．項目１〜６２のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号０８又は１６又は２４又は３２において置換、挿入、及び／又は欠失されており、場合により、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。

【0501】

６４．項目１〜６３のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗ジゴキシゲニン抗体は、配列番号０８又は１６又は２４又は３２においてＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0502】

６５．項目１〜４９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性（抗ビオチン結合特異性；抗ＢＩ結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性；抗（ｈ）ＴｆＲ結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性；抗ＬＲＰ８結合特異性）に特異的に結合する第２の結合特異性を含む。

【0503】

６６．項目１〜４９及び６５のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する２つの結合特異性（２つの抗ビオチン結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（２つの抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性）に特異的に結合する２つの結合特異性を有する。

【0504】

６７．項目１〜４９及び６５〜６６のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0505】

６８．項目１〜４９及び６５〜６７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、ヒト化結合特異性である。

【0506】

６９．項目１〜４９及び６５〜６８のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、上記の実施形態のいずれかにおける通りのＣＤＲ及びアクセプターヒトフレームワーク（例、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク）を含む。

【0507】

７０．項目１〜４９及び６５〜６９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号４１又は５７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４２又は５８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４３又は５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号４５又は６１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号４６又は６２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号４７又は６４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0508】

７１．項目１〜４９及び６５〜７０のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号３６又は４４又は５２又は６０のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0509】

７２．項目１〜４９及び６５〜７１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ビオチン抗体は、ビオチンに結合する能力を保持する。

【0510】

７３．項目１〜４９及び６５〜７２のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号３６又は４４又は５２又は６０において置換、挿入、及び／又は欠失されており、場合により、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。

【0511】

７４．項目１〜４９及び６５〜７３のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗ビオチン抗体は、配列番号３６又は４４又は５２又は６０においてＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0512】

７５．項目１〜４９及び６５〜７４のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ビオチン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号４０又は４８又は５６又は６４のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を更に含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0513】

７６．項目１〜４９及び６５〜７５のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ビオチン抗体は、ビオチンに結合する能力を保持する。

【0514】

７７．項目１〜４９及び６５〜７６のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号４０又は４８又は５６又は６４において置換、挿入、及び／又は欠失されており、場合により、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。

【0515】

７８．項目１〜４９及び６５〜７７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗ビオチン抗体は、配列番号４０又は４８又は５６又は６４においてＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0516】

７９．項目１〜４９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性（抗テオフィリン結合特異性；抗ＴＨＥＯ結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性；抗（ｈ）ＴｆＲ結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性；抗ＬＲＰ８結合特異性）に特異的に結合する第２の結合特異性を含む。

【0517】

８０．項目１〜４９及び７９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する２つの結合特異性（２つの抗テオフィリン結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（２つの抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性）に特異的に結合する２つの結合特異性を有する。

【0518】

８１．項目１〜４９及び７９〜８０のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0519】

８２．項目１〜４９及び７９〜８１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、ヒト化結合特異性である。

【0520】

８３．項目１〜４９及び７９〜８２のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、上記の実施形態のいずれかにおける通りのＣＤＲ及びアクセプターヒトフレームワーク（例、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク）を含む。

【0521】

８４．項目１〜４９及び７９〜８３のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号７３又は８９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号７４又は９０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７５又は９１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号７７又は９３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７８又は９４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号７９又は９５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0522】

８５．項目１〜４９及び７９〜８４のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号６８又は７６又は８４又は９２のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0523】

８６．項目１〜４９及び７９〜８５のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗テオフィリン抗体は、テオフィリンに結合する能力を保持する。

【0524】

８７．項目１〜４９及び７９〜８６のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号６８又は７６又は８４又は９２において置換、挿入、及び／又は欠失されており、場合により、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。

【0525】

８８．項目１〜４９及び７９〜８７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗テオフィリン抗体は、配列番号６８又は７６又は８４又は９２においてＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0526】

８９．項目１〜４９及び７９〜８８のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、テオフィリン化（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号７２又は８０又は８８又は９６のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を更に含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0527】

９０．項目１〜４９及び７９〜８９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗テオフィリン抗体は、テオフィリンに結合する能力を保持する。

【0528】

９１．項目１〜４９及び７９〜９０のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号７２又は８０又は８８又は９６において置換、挿入、及び／又は欠失されており、場合により、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。

【0529】

９２．項目１〜４９及び７９〜９１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗テオフィリン抗体は、配列番号７２又は８０又は８８又は９６においてＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0530】

９３．項目１〜４９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性（抗フルオレセイン結合特異性；抗ＦＬＵＯ結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性；抗（ｈ）ＴｆＲ結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性；抗ＬＲＰ８結合特異性）に特異的に結合する第２の結合特異性を含む。

【0531】

９４．項目１〜４９及び９３のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する２つの結合特異性（２つの抗フルオレセイン結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（２つの抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性）に特異的に結合する２つの結合特異性を有する。

【0532】

９５．項目１〜４９及び９３〜９４のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号９８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号９９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0533】

９６．項目１〜４９及び９３〜９５のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、フルオレセイン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、ヒト化結合特異性である。

【0534】

９７．項目１〜４９及び９３〜９６のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、上記の実施形態のいずれかにおける通りのＣＤＲ及びアクセプターヒトフレームワーク（例、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク）を含む。

【0535】

９８．項目１〜４９及び９３〜９７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号１０５又は１１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１０６又は１１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１０７又は１１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号１０９又は１１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１１０又は１１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号１１１又は１１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0536】

９９．項目１〜４９及び９３〜９８のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号１０８又は１１６のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0537】

１００．項目１〜４９及び９３〜９９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗フルオレセイン抗体は、フルオレセインに結合する能力を保持する。

【0538】

１０１．項目１〜４９及び９３〜１００のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号１０８又は１１６において置換、挿入、及び／又は欠失されており、場合により、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。

【0539】

１０２．項目１〜４９及び９３〜１０１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗フルオレセイン抗体は、配列番号１０８又は１１６においてＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0540】

１０３．項目１〜４９及び９３〜１０２のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号１１２又は１２０のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を更に含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0541】

１０４．項目１〜４９及び９３〜１０３のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗フルオレセイン抗体は、フルオレセインに結合する能力を保持する。

【0542】

１０５．項目１〜４９及び９３〜１０４のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号１１２又は１２０において置換、挿入、及び／又は欠失されており、場合により、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。

【0543】

１０６．項目１〜４９及び９３〜１０５のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗フルオレセイン抗体は、配列番号１１２又は１２０においてＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0544】

１０７．項目１〜４９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、ブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する第１の結合特異性（抗ブロモデオキシウリジン結合特異性；抗ＢｒｄＵ結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性；抗（ｈ）ＴｆＲ結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性；抗ＬＲＰ８結合特異性）に特異的に結合する第２の結合特異性を含む。

【0545】

１０８．項目１〜４９及び１０７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、二重特異性抗体は、ブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する２つの結合特異性（２つの抗ブロモデオキシウリジン結合特異性）及び（ヒト）トランスフェリン受容体（２つの抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性）に、又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８結合特異性）に特異的に結合する２つの結合特異性を有する。

【0546】

１０９．項目１〜４９及び１０７〜１０８のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２１８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0547】

１１０．項目１〜４９及び１０７〜１０９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、ヒト化結合特異性である。

【0548】

１１１．項目１〜４９及び１０７〜１１０のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ブロモデオキシウリジン化ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、非ヒト抗体及びアクセプターヒトフレームワーク（例、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク）からのＣＤＲを含む。

【0549】

１１２．項目１〜４９及び１０７〜１１１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、（ａ）配列番号２１４又は２１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２１６又は２１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２１８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0550】

１１３．項目１〜４９及び１０７〜１１２のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号２２２又は２２４のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0551】

１１４．項目１〜４９及び１０７〜１１３のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ブロモデオキシウリジン抗体は、ブロモデオキシウリジンに結合する能力を保持する。

【0552】

１１５．項目１〜４９及び１０７〜１１４のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号２２２又は２２４において置換、挿入、及び／又は欠失されており、場合により、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。

【0553】

１１６．項目１〜４９及び１０７〜１１５のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗ブロモデオキシウリジン抗体は、配列番号２２３又は２２５においてＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0554】

１１７．項目１〜４９及び１０７〜１１６のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ブロモデオキシウリジン化（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）ペイロードに特異的に結合する結合特異性は、配列番号２２３又は２２５のアミノ酸配列と少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を更に含む、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインの対である。

【0555】

１１８．項目１〜４９及び１０７〜１１７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比べて、置換（例、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ブロモデオキシウリジン抗体は、ブロモデオキシウリジンに結合する能力を保持する。

【0556】

１１９．項目１〜４９及び１０７〜１１８のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号２２３又は２２５において置換、挿入、及び／又は欠失されており、場合により、置換、挿入、又は欠失が、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。

【0557】

１２０．項目１〜４９及び１０７〜１１９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗ブロモデオキシウリジン抗体は、配列番号２２３又は２２５においてＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0558】

１２１．項目１〜３８、４０、４３及び４５〜１２０のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ペイロードは、ハプテン化完全長抗体又はハプテン化抗体フラグメントである。

【0559】

１２２．項目１〜３８、４０、４３及び４５〜１２１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ハプテン化ペイロードは、ハプテン化された完全長抗アルファシヌクレイン抗体である。

【0560】

１２３．項目１〜３８、４０、４３及び４５〜１２１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ハプテン化ペイロードは、アルファ−シヌクレインに特異的に結合する、ハプテン化された抗アルファ−シヌクレイン抗体フラグメントである。

【0561】

１２４．項目１２１〜１２３のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ハプテンはビオチンである。

【0562】

１２５．項目１〜３８、４０、４３及び４５〜１２４のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２４３〜２４５のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２４６〜２４８のＨＶＲを含む。

【0563】

１２６．項目１〜３８、４０、４３及び４５〜１２５のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２４９、２５０、及び２４５のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２５１〜２５３のＨＶＲを含む。

【0564】

１２７．項目１〜３８、４０、４３及び４５〜１２６のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、配列番号２５４からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２５５からなる軽鎖可変ドメインを含む。

【0565】

１２８．項目１〜３８、４０、４３及び４５〜１２７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、配列番号２５４からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２５５からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られている。

【0566】

１２９．項目１〜３８、４０、４３及び４５〜１２８のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体はヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２４３〜２４５のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２４６〜２４８のＨＶＲを含み、それにおいて、各々のＨＶＲにおいて、３までのアミノ酸残基を変化させることができる。

【0567】

１３０．項目１〜３８、４０、４３及び４５〜１２９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体はヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２４９、２５０、及び２４５のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２５１〜２５３のＨＶＲを含み、それにおいて、各々のＨＶＲにおいて、３までのアミノ酸残基を変化させることができる。

【0568】

１３１．項目１〜３８、４０、４３及び４５〜１３０のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインは、配列番号２５４からなる重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインは、配列番号２５５からなる軽鎖可変ドメインに由来する。

【0569】

１３２．項目１〜３８、４０、４３及び４５〜１３１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、重鎖において、配列番号２５６〜２５８のＨＶＲ、及び軽鎖において、配列番号２５９〜２６１のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する。

【0570】

１３３．項目１〜３８、４０、４３及び４５〜１３２のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、重鎖において、配列番号２６２、２６３、及び２５８のＨＶＲ、並びに軽鎖において、配列番号２６４〜２６６のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する。

【0571】

１３４．項目１〜３８、４０、４３及び４５〜１３３のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、配列番号２６７からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２６８からなる軽鎖可変ドメインを含む。

【0572】

１３５．項目１〜３８、４０、４３及び４５〜１３４のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、配列番号２６７からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２６８からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られている。

【0573】

１３６．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１３５のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２５６〜２５８のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２５９〜２６１のＨＶＲを含み、それにおいて、各々のＨＶＲにおいて、３までのアミノ酸残基を変化させることができる。

【0574】

１３７．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１３６のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２６２、２６３、及び２５８のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２６４〜２６６のＨＶＲを含み、それにおいて、各々のＨＶＲにおいて、３までのアミノ酸残基を変化させることができる。

【0575】

１３８．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１３７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインは、配列番号２６７からなる重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインは、配列番号２６８からなる軽鎖可変ドメインに由来する。

【0576】

１３９．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１３８のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、重鎖において、配列番号２６９〜２７１のＨＶＲ、及び軽鎖において、配列番号２７２〜２７４のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する。

【0577】

１４０．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１３９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、重鎖において、配列番号２６９、２７５、及び２７１のＨＶＲ、並びに軽鎖において、配列番号２７６〜２７８のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する。

【0578】

１４１．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１４０のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、配列番号２７９からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２８０からなる軽鎖可変ドメインを含む。

【0579】

１４２．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１４１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、配列番号２７９からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２８０からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られている。

【0580】

１４３．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１４２のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２６９〜２７１のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２７２〜２７４のＨＶＲを含み、それにおいて、各々のＨＶＲにおいて、３までのアミノ酸残基を変化させることができる。

【0581】

１４４．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１４３のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２６９、２７５、及び２７１のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２７６〜２７８のＨＶＲを含み、それにおいて、各々のＨＶＲにおいて、３までのアミノ酸残基を変化させることができる。

【0582】

１４５．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１４４のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体はヒト化抗体であって、重鎖可変ドメインは、配列番号２７９からなる重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインは、配列番号２８０からなる軽鎖可変ドメインに由来する。

【0583】

１４６．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１２１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ハプテン化ペイロードは、ハプテン化された完全長抗ヒトＴａｕ（ｐＳ４２２）抗体である。

【0584】

１４７．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１２１及び１４６のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ハプテン化ペイロードは、位置４２２のセリンでリン酸化されたヒトＴａｕに特異的に結合する、ハプテン化された抗ヒトＴａｕ（ｐＳ４２２）抗体フラグメントである。

【0585】

１４８．項目１４６〜１４７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ハプテンはビオチンである。

【0586】

１４９．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１２１及び１４６〜１４８のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗ヒトＴａｕ（ｐＳ４２２）抗体は、以下を含む：
ａ）重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３０、２３９、及び２３２のＨＶＲ、又は
ｂ）重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３０、２３１、及び２３２のＨＶＲ。

【0587】

１５０．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１２１及び１４６〜１４９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、以下を更に含む：
ａ）軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３４、２３５、及び２３６のＨＶＲ、又は
ｂ）軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３３、２２９、及び２３６のＨＶＲ。

【0588】

１５１．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１２１及び１４６〜１５０のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、以下を含む：
ａ）重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３０、２３９、及び２３２のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３４、２３５、及び２３６のＨＶＲ、又は
ｂ）重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３０、２３１、及び２３２のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３３、２２９、及び２３６のＨＶＲ、又は
ｃ）重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３０、２３１、及び２３２のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２３４、２３５、及び２３６のＨＶＲ。

【0589】

１５２．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１２１及び１４６〜１５１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、以下を含む：
ａ）配列番号２４１の重鎖可変ドメイン及び配列番号２３８の軽鎖可変ドメイン、又は
ｂ）配列番号２４０の重鎖可変ドメイン及び配列番号２３７の軽鎖可変ドメイン、又は
ｃ）配列番号２４０の重鎖可変ドメイン及び配列番号２３８の軽鎖可変ドメイン、又は
ｄ）配列番号２４２の重鎖可変ドメイン及び配列番号２３８の軽鎖可変ドメイン。

【0590】

１５３．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１２１のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ハプテン化ペイロードは、ハプテン化された完全長抗Ａｂｅｔａ抗体である。

【0591】

１５４．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１２１及び１５４のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ハプテン化ペイロードは、ヒトＡｂｅｔａに特異的に結合する、ハプテン化された抗Ａｂｅｔａ抗体フラグメントである。

【0592】

１５５．項目１５３〜１５４のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、ハプテンはビオチンである。

【0593】

１５６．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１２１及び１５３〜１５５のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗Ａｂｅｔａ抗体は、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２８１、２８２、及び２８３のＨＶＲを含む。

【0594】

１５７．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１２１及び１５３〜１５６のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、さらに、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２８４、２８５、及び２８６のＨＶＲを含む。

【0595】

１５８．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１２１及び１５３〜１５７のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２８１、２８２、及び２８３のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２８４、２８５、及び２８６のＨＶＲを含む。

【0596】

１５９．項目１〜３８、４０、４３、及び４５〜１２１及び１５３〜１５８のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートであって、それにおいて、抗体は、以下を含む：
ａ）配列番号２８７の重鎖可変ドメイン及び配列番号２９０の軽鎖可変ドメイン、又は
ｂ）配列番号２８８の重鎖可変ドメイン及び配列番号２９１の軽鎖可変ドメイン、又は
ｃ）配列番号２８９の重鎖可変ドメイン及び配列番号２９２の軽鎖可変ドメイン。

【0597】

１６０．項目１〜１５９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲート及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬的製剤。

【0598】

１６１．医薬としての使用のための、項目１〜１５９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲート。

【0599】

１６２．癌又は神経学的障害の処置のための、項目１〜１５９のいずれか１つに従ったコンジュゲート。

【0600】

１６３．医薬の製造における、項目１〜１５９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートの使用。

【0601】

１６４．項目１６３に従った使用であって、それにおいて、医薬は、癌の処置用である。

【0602】

１６５．項目１６３に従った使用であって、それにおいて、医薬は、神経学的障害の処置用である。

【0603】

１６６．項目１６５に従った使用であって、それにおいて、神経学的障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）（軽度認知障害及び前駆ＡＤを含むが、これらに限定されない）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌（例、ＣＮＳ又は脳に影響する癌）、及び外傷性脳損傷より選択される。

【0604】

１６７．診断剤としての、項目１〜１５９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートの使用。

【0605】

１６８．ペイロードの安定性を増加させるための、項目１〜１５９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートの使用。

【0606】

１６９．ペイロードの活性を増加させるための、項目１〜１５９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートの使用。

【0607】

１７０．ペイロードのインビボ半減期を増加させるための、項目１〜１５９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートの使用。

【0608】

１７１．疾患の処置における、項目１〜１５９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートの使用。

【0609】

１７２．項目１〜１５９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートの効果的な量を個体に投与することを含む、疾患を有する個体を処置する方法。

【0610】

１７３．項目１〜１５９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートの効果的な量を個体に投与することを含む、個体において疾患を処置する方法。

【0611】

１７４．項目１７１〜１７３のいずれか１つに従った使用又は方法であって、それにおいて、疾患は癌である。

【0612】

１７５．項目１７１〜１７３のいずれか１つに従った使用又は方法であって、それにおいて、疾患は神経学的障害である。

【0613】

１７６．項目１７５に従った使用又は方法であって、それにおいて、神経学的障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）（軽度認知障害及び前駆ＡＤを含むが、これらに限定されない）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌（例、ＣＮＳ又は脳に影響する癌）、及び外傷性脳損傷より選択される。

【0614】

１７７．血液脳関門を横切るハプテン化ペイロードの標的化送達のための、項目１〜１５９のいずれか１つに従った複合体又はコンジュゲートの使用。

【0615】

１７８．項目１７７に従った使用であって、それにおいて、使用は、血液脳関門を横切る遊離（即ち、単離）ハプテン化ペイロードの標的化送達用である。

【0616】

１７９．血液脳関門を横切るハプテン化ペイロードの標的化送達及び血液脳関門又は脳中でのハプテン化ペイロードの放出のための、項目１〜２及び４〜１５９のいずれか１つに従った複合体の使用。

【0617】

１８０．項目１７９に従った使用であって、それにおいて、ハプテン化ペイロードの送達は、二重特異性抗体又は複合体の非存在における送達と比較し、より高い。

【0618】

１８１．項目１８０に従った使用であって、それにおいて、送達は２倍高い。

【0619】

１８２．項目１８０〜１８１のいずれか１つに従った使用であって、それにおいて、送達は１０倍高い。

【0620】

１８３．項目１７９〜１８２のいずれか１つに従った使用であって、それにおいて、ハプテン化ペイロードは、二重特異性抗体又は複合体の存在においてよりも、二重特異性抗体又は複合体の非存在において、より高い生物学的活性を有する。

【0621】

１８４．項目１８３に従った使用であって、それにおいて、生物学的活性は、二重特異性抗体又は複合体の非存在において２倍高い。

【0622】

１８５．項目１８３〜１８４のいずれか１つに従った使用であって、それにおいて、生物学的活性は、二重特異性抗体又は複合体の非存在において１０倍高い。

【0623】

本明細書において引用する全ての参考文献の開示が、本明細書とともに、参照により組み入れられる。

【0624】

以下記の実施例及び図、及び配列を提供し、本発明の理解を助け、その真の範囲が添付の特許請求の範囲において示される。本発明の精神から逸脱することなく、示した手順において改変を作ることができることが理解される。

【実施例】

【0625】

実施例１
マウスハイブリドーマからのカッパ軽鎖を伴うＩｇＧ１クラスのマウス抗ジゴキシゲニン抗体及びマウス抗ビオチン抗体のＶＨ及びＶＬドメインをコードするｃＤＮＡの単離及び特徴付け

【0626】

抗ジゴキシゲニン抗体のＶＨ及びＶＬドメインをコードするｃＤＮＡの単離及び特徴付け、ＲＮＡ調製、ＤＮＡフラグメントの生成、プラスミド中へのＤＮＡフラグメントのクローニング、並びにＤＮＡ配列及びアミノ酸配列の決定が、ＷＯ ２０１１／００３５５７及びＷＯ ２０１１／００３７８０においてそれぞれ記載された。

【0627】

マウスハプテン結合抗体のＶＨ及びＶＬドメインのタンパク質及び（ＤＮＡ）配列情報が、ハイブリドーマクローンから直接的に得られた。その後に実施された実験工程は、（ｉ）抗体産生ハイブリドーマ細胞からのＲＮＡの単離、（ｉｉ）ｃＤＮＡへのこのＲＮＡの変換（ＶＨ及びＶＬを保有するＰＣＲフラグメント中への移動）、並びに（ｉｉｉ）大腸菌における増殖のためのプラスミドベクター中へのこれらのＰＣＲフラグメントの組込み、及びそれらのＤＮＡ（及び推定タンパク質）配列の決定であった。
ハイブリドーマ細胞からのＲＮＡ調製：

【0628】

ＲＮＡを、RNAeasyキット（Qiagen）を適用し、５×１０^６個の抗体発現ハイブリドーマ細胞から調製した。簡単には、沈降した細胞を、ＰＢＳ中で１回洗浄し、沈降させ、その後、５００μLのＲＬＴ緩衝液（＋β−ＭＥ）中での溶解のために再懸濁した。細胞を、Qiashredder（Qiagen）を通して完全に溶解させ、次に、製造者のマニュアルに記載されている通り、マトリックス媒介精製手順（ETOH、RNAeasyカラム）に供した。最後の洗浄工程後、ＲＮＡを、５０μLのＲＮａｓｅフリー水中で、カラムから回収した。回収されたＲＮＡの濃度を、１：２０希釈したサンプルのＡ２６０及びＡ２８０を定量化することにより決定した。単離されたＲＮＡサンプルの完全性（品質、分解の程度）を、ホルムアミド−アガロースゲル上での変性ＲＮＡゲル電気泳動（Maniatis Manualを参照のこと）により分析した。インタクトな１８ｓ及び２８ｓリボソームＲＮＡを表す別々のバンドが得られ、これらのバンドのインタクトさ（及び約２：１強度比）は、ＲＮＡ調製物の良好な品質を示した。ハイブリドーマからの単離ＲＮＡを凍結し、−８０℃でアリコート中に保存した。
ＲＡＣＥ ＰＣＲによるＶＨ及びＶＨをコードするＤＮＡフラグメントの生成、プラスミド中へのこれらのＤＮＡフラグメントのクローニング、並びにそれらのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列の決定

【0629】

その後の（ＲＡＣＥ）ＰＣＲ反応のためのｃＤＮＡを、国際特許出願ＷＯ ２０１２／０９３０６８において記載されている技術を適用することにより、ＲＮＡ調製物から調製した。その後、ＶＨ及びＶＬをコードするＰＣＲフラグメントを、標準的な分子生物学的技術によるアガロースゲル抽出及びその後の精製により単離した。ＰＷＯ生成された精製ＰＣＲフラグメントを、製造者の使用説明書に厳密に従い、pCR bluntII topo Kit（Invitrogen）を適用することにより、ベクターpCR bluntII topo中に挿入した。Topoライゲーション反応物を、大腸菌Topo10−ワンショットコンピテント細胞中に形質転換した。その後、ＶＬ又はＶＨのいずれかを含むインサートを伴うベクターを含む大腸菌クローンを、ＬＢカナマイシン寒天プレート上のコロニーとして同定した。プラスミドを、これらのコロニーから調製し、ベクター中の所望のインサートの存在を、ＥｃｏＲＩを用いた制限消化により確認した。ベクター骨格は、インサートの各々の側に隣接するＥｃｏＲＩ制限認識部位を含むため、インサートを保有するプラスミドを、約８００bp（ＶＬ用）又は約６００bp（ＶＨ用）のＥｃｏＲＩ放出可能インサートを有することにより定義した。ＤＮＡ配列並びにＶＬ及びＶＨの推定タンパク質配列を、ＶＨ及びＶＬについての複数のクローン上での自動化ＤＮＡ配列決定により決定した。

【0630】

抗ビオチン抗体のマウスＶＬ配列が、配列番号４０に描写されている。抗ビオチン抗体のマウスＶＨ配列が、配列番号３６に描写されている。

【0631】

抗ジゴキシゲニン抗体のマウスＶＬ配列が、配列番号０８に描写されている。抗ジゴキシゲニン抗体のマウスＶＨ配列が、配列番号０４に描写されている。

【0632】

実施例２
マウスハイブリドーマからのカッパ軽鎖を伴うＩｇＧ１クラスのマウス抗テオフィリン抗体のＶＨ及びＶＬドメインをコードするｃＤＮＡの単離及び特徴付け

【0633】

抗テオフィリン抗体の配列が、実施例１において概説する通りに得られた。

【0634】

抗テオフィリン抗体のマウスＶＬ配列が、配列番号７２に描写されている。抗テオフィリン抗体のマウスＶＨ配列が、配列番号６８に描写されている。

【0635】

実施例３
マウス抗ジゴキシゲニン抗体及び抗ビオチン抗体のＶＨ及びＶＬドメインのヒト化

【0636】

ジゴキシゲニン結合抗体のヒト化バリアントの生成が、ＷＯ ２０１１／００３５５７及びＷＯ ２０１１／００３７８０において詳細に記載されている。マウスビオチン結合抗体ｍｕＭ３３を、以下の通りに、同様の様式でヒト化した：

【0637】

マウスハイブリドーマからのカッパ軽鎖を伴うＩｇＧ１クラスのマウス抗ビオチン抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むコード配列及びアミノ酸配列の生成及び特徴付けが、ＷＯ ２０１１／００３５５７及びＷＯ ２０１１／００３７８０に記載されている。この情報に基づき、対応するヒト化抗ビオチン抗体を、ヒト生殖系列フレームワークＩＧＨＶ１−６９−０２及びＩＧＫＶ１−２７−０１の組み合わせに基づいて生成した（ｈｕＭ３３）。ＶＬについて、ヒトＩＧＫＶ１−２７−０１及びＩＧＫＪ２−０１生殖系列のヒトＪエレメントのフレームワーク中に任意の復帰変異を組み込む必要はなかった。ヒト化ＶＨは、ヒトＩＧＨＶ１−６９−０２生殖系列及びＩＧＨＪ４−０１−３生殖系列のヒトＪエレメントに基づく。位置２４（Ａ２４Ｓ）のフレームワーク領域１における、及び位置７３（Ｋ７３Ｔ）のフレームワーク領域３における２つの復帰変異が導入された。ヒト化ＶＨのアミノ酸配列を配列番号４４に描写し、ヒト化ＶＬのアミノ酸配列を配列番号４８に示す。

【0638】

実施例４
マウス抗テオフィリン抗体のＶＨ及びＶＬドメインのヒト化

【0639】

マウステオフィリン結合抗体を、以下の通りにヒト化した：ヒト化抗テオフィリン抗体を、ヒト生殖系フレームワークＩＧＨＶ４−３１−０２及びＩＧＫＶ２−３０−０１の組み合わせに基づいて生成した。ヒト化ＶＨは、ヒトＩＧＨＶ４−３１−０２生殖系列及びＩＧＨＪ４−０１−３生殖系列のヒトＪエレメントに基づく。位置７１（Ｖ７１Ｒ）での、フレームワーク領域３における１つの復帰変異が導入された。ヒト化ＶＬは、ヒトＩＧＨＶ２−３０−０１生殖系列及びＩＧＫＪ２−０１生殖系列のヒトＪエレメントに基づく。位置４６（Ｒ４６Ｌ）での、フレームワーク領域２における１つの復帰変異が導入された。ヒト化ＶＨのアミノ酸配列を配列番号７６に描写し、ヒト化ＶＬのアミノ酸配列を配列番号８０に示す。

【0640】

実施例５
ジゴキシゲニンの存在におけるマウス抗ジゴキシゲニンＦｖ領域の結合領域の、及びビオチンの存在におけるマウス抗ビオチンＦｖ領域の結合領域の結晶化及びＸ線構造決定。

【0641】

ジゴキシゲニン結合抗体のＦａｂフラグメントの構造の決定は、ＷＯ ２０１１／００３５５７及びＷＯ ２０１１／００３７８０において詳細に記載されており、また、Metz, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 8194-8199において公開されている（３ＲＡ７）。

【0642】

マウス抗ビオチン抗体の構造を決定した。したがって、Ｆａｂフラグメントを、精製ＩｇＧのプロテアーゼ消化により生成し、その後、周知の最先端の方法（パパイン消化）を適用して精製した。

【0643】

アポの結晶化のために、２０mM Ｈｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ ６．０）中のＦａｂフラグメント（精製Ｆａｂ）を１３mg/mlに濃縮した。結晶化液滴を、蒸気拡散シッティングドロップ実験において、０．２μLのタンパク質溶液を０．２μLのリザーバー溶液と混合することにより、２１℃に設定した。結晶が、０．１M Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．５、０．０１M塩化コバルト、２０%ポリビニルピロリドンＫ１５から５日間以内に出現し、８日間以内に０．３mm×０．０６mm×０．０３mmの最終サイズまで成長した。

【0644】

結晶は、凍結保護剤としての１５%グリセロール中に収集し、次に、液体Ｎ２中で急速凍結した。回折像を、Swiss Light SourceのビームラインX10SAで、１００Kの温度でPilatus 6M検出器を用いて回収し、プログラムＸＤＳ（Kabsch, W., J. Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800）を用いて加工し、SCALA（BRUKER AXSから得た）でスケーリングし、２．２２A分解能までのデータをもたらした。このＦａｂフラグメント結晶は、ａ＝９０．２３A、ｂ＝１１８．４５A、ｃ＝９６．７９A、及びβ＝１１７．５３°の格子寸法を伴う単斜晶空間群Ｐ２１に属し、結晶非対称単位当たり４個のＦａｂ分子を含む（表３を参照のこと）。

【0645】

ＣＣＰ４ソフトウェアスイートからの標準的な結晶学的プログラムを使用し、検索モデルとしてのＰＤＢエントリー３ＰＱＰとの分子置換により構造を解析し、電子密度を計算し、Ｘ線構造を精緻化した（CCP4, Collaborative Computational Project, Acta Crystallogr. D, 760-763 (1994)）。構造モデルを、ＣＯＯＴを使用し、電子密度中に再構築した（Emsley, P., et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60 (2010) 486-501）。座標を、ＲＥＦＭＡＣ５（Murshudov, G.N., et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53 (1997) 240-55）を用いて、及び、autoBUSTER（Global Phasing Ltd.）を用いて精緻化した。

【表4】

【0646】

ビオチン誘導体を伴う複合体中でのＦａｂフラグメントの結晶化のために、浸漬実験のために使用したＦａｂフラグメントのアポ結晶を、スクリーニング後３日以内に０．８Mコハク酸から得て、５日以内に０．２５mm×０．０４mm×０．０４mmの最終的なサイズまで成長させた。ビオシチンアミドを、水中で、１００mMで溶解した。その後、化合物を、結晶化溶液中の１０mMの作業濃度に希釈し、結晶化小滴中の結晶に適用した。結晶を、２μLの１０mM化合物溶液で３回洗浄し、最後に、２１℃でビオシチンアミドと１６時間にわたりインキュベートした。

【0647】

結晶は、凍結保護剤としての１５%グリセロール中に収集し、次に、液体Ｎ_２中で急速凍結した。回折像を、Swiss Light SourceのビームラインX10SAで、１００Kの温度でPilatus 6M検出器を用いて回収し、プログラムＸＤＳ（Kabsch, W., J. Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800）を用いて加工し、SCALA（BRUKER AXSから得た）でスケーリングし、２．３５A分解能までのデータをもたらした。このＦａｂフラグメント結晶は、ａ＝８９．０９A、ｂ＝１１９．６２A、ｃ＝９６．１８A、及びβ＝１１７．１５°の格子寸法を伴う単斜晶空間群Ｐ２１に属し、結晶非対称単位当たり４個のＦａｂ分子を含む（表４を参照のこと）。

【0648】

ＣＣＰ４ソフトウェアスイートからの標準的な結晶学プログラムを使用し、検索モデルとしてのアポＦａｂフラグメントの座標との分子置換により構造を解析し、電子密度を計算し、Ｘ線構造を２．５Aの分解能まで精緻化した（ＣＣＰ４）。構造モデルを、ＣＯＯＴ（Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G. & Cowtan, K. Features and development of COOT. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 486-501 (2010)）を使用し、電子密度中に再構築した。座標を、ＲＥＦＭＡＣ５（Murshudov, G.N., et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53, 240-255 (1997)）を用いて、及び、autoBUSTER（Global Phasing Ltd.）を用いて精緻化した。

【表5】

【0649】

実験的構造決定の結果を図３３に示す。複合体の結晶形態は、全てのＦａｂ分子により同様に結合されたビオシチンアミドを伴う、非対称単位中の４つの独立したビオシチンアミド：抗ビオチンＦａｂ複合体を含んだ。ビオシチンアミドは、重鎖のＣＤＲ１及び３並びに全ての３つの軽鎖のＣＤＲにより形成されたポケット中で結合される。リガンドの結合ポケットを、重鎖からの残基ＡＳＮ２９、ＡＳＰ３１、ＴＨＲ３２、ＰＨＥ３３、ＧＬＮ３５、ＴＲＰ９９、及びＴＲＰ１０６並びに軽鎖からの残基ＡＳＮ３１、ＴＹＲ３２、ＬＥＵ３３、ＳＥＲ３４、ＴＹＲ４９、ＳＥＲ５０、ＰＨＥ９１、及びＴＹＲ９６により定義する。ビオチン頭部基は、ポケットの一端でのＣＤＲ２及びＣＤＲ１の残基と水素結合を形成する：ビオシチンアミドのＮ３は、Ｓｅｒ５０のヒドロキシル酸素と相互作用するのに対し、Ｏ２２は、同じ残基の主鎖アミド窒素と接触する。また、ビオシチンアミドのＯ２２は、また、Ｓｅｒ３４のヒドロキシル基の酸素に水素結合する。それに加えて、疎水性相互作用が、ビオシチンアミドと結合ポケットを裏打ちする芳香族側鎖の間に観察される。ビオチンの（ＣＨ２）４脂肪族尾の末端でのアミド結合が、重鎖ＣＤＲ１のＰＨＥ３３上に積み重なり、ＰＨＥ３３の骨格アミド窒素への、及びＡｓｐ３１への追加の水素結合により安定化される。これによって、アミド窒素が位置付けられ、それは、窒素に続く原子が、結合ポケットから溶媒に向かって離れる方法で、活性実体への結合部位である。

【0650】

２．５Aの分解能での結合領域の実験的決定の結果によって、リガンドの、その抗体への結合様式の特徴付けが可能になり、それは、組換えビオチン結合モジュールのタンパク質工学を介した詳細なモデリング及びさらなる改善のための前提条件である。

【0651】

実施例６
共有結合的コンジュゲーションのための、導入された機能性を伴う抗ハプテン抗体の定義及び生成

【0652】

上記に記載する抗ハプテン抗体のヒト化ＶＨ及びＶＬ配列の誘導体化を行い、定義された位置での、抗体への抗原／ハプテンの共有結合的カップリングを可能にする化合物を生成した。

【0653】

ジゴキシゲニンに結合した抗ジゴキシゲニンＦａｂフラグメント（３ＲＡ７）の実験的に決定された構造（Metz, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 8194-8199）を使用し、変化によって、抗体とその複合体化抗原／ハプテンの間での部位特異的カップリング反応が生じることを可能にする位置を同定した。ビオシチンアミドに結合した抗ビオチンのＦａｂフラグメントの構造（実施例５を参照のこと）によって、ビオチン結合抗体フラグメントのための導入システイン残基の正しい位置が確認され、同定位置の一般的な適用可能性の証拠が提供される。

【0654】

変異させる位置は、２つの要件を同時に満たさなければならない：（ｉ）カップリング位置は、有向カップリングのための抗原／ハプテン位置決め効果を利用するために、結合領域に近接してあるべきである、並びに（ｉｉ）変異及びカップリング位置は、抗原／ハプテン結合が、それ自体により影響されない様式で位置付けられなければならない。適切な位置を見出すためのこれらの要件は、事実上、互いに「矛盾」している。なぜなら、要件は、（ｉ）結合位置に近い位置により最良に提供されるが、（ｉｉ）結合部位から遠い位置により最も安全に達成されるからである。

【0655】

これらの実質的な除外要件にもかかわらず、本発明者らは、ハプテンの位置付けに影響することなく変異させることができ、それにもかかわらず、ハプテン化化合物の有向共有結合的カップリングを同時に可能にする位置を同定することができた。

【0656】

第１の位置は、それぞれの抗体のＣＤＲ２の実際の長さに依存して、Ｋａｂａｔナンバリングに従った位置ＶＨ５２ｂ又はＶＨ５３に位置付けられる。抗ジゴキシゲニン抗体構造において、ハプテンは、疎水性残基により形成される深いポケット中に結合される。蛍光ジゴキシゲニン−Ｃｙ５コンジュゲートが、この結晶学的試験において使用されたが、それにおいて、フルオロフォア並びにジゴキシゲニンとＣｙ５の間のリンカーは、高い柔軟性及びその結果としての結晶中の無秩序のため、構造中では見えなかった。しかし、リンカー及びＣｙ５は、重鎖のＣＤＲ２の方向中を指し示す、ジゴキシゲニンのＯ３２に付着される。ジゴキシゲニンのＯ３２（上を参照のこと）からＫａｂａｔナンバリングに従った位置５２ｂにおけるアミノ酸残基のＣαの間の距離は、１０．５Aである。

【0657】

Ｃｙｓを用いた位置ＶＨ５２ｂ／ＶＨ５３のアミノ酸の置換によって、抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣについては配列番号２０及び２８、抗テオフィリン抗体ＶＨ５３Ｃについては配列番号８４及び９２、抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃについては配列番号５２及び６０、並びに抗フルオレセイン抗体ＶＨ５２ｂＣについては配列番号１０８として列挙される重鎖可変領域配列を伴う抗体誘導体が生成された。

【0658】

改変点として同定されたさらなる位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従った位置ＶＨ２８である。

【0659】

結果として、本発明者らは、Ｋａｂａｔ位置ＶＨ２８にシステインを導入した。Ｃｙｓを用いた位置ＶＨ２８のアミノ酸の置換によって、抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ２８Ｃについては配列番号１２４及び１３２、抗テオフィリン抗体ＶＨ２８Ｃについては配列番号１５６及び１６４、抗ビオチン抗体ＶＨ２８Ｃについては配列番号１４０及び１４８、並びに抗フルオレセイン抗体ＶＨ２８Ｃについては配列番号１１６として列挙される重鎖可変領域配列を伴う抗体誘導体が生成された。

【0660】

これらの位置の１つが「ユニバーサル」位置である、即ち、この位置が、任意の抗体に適用可能であり、このように、結晶構造を提供し、ハプテンに位置付けられた共有結合カップリングを可能にする適切な位置を決定することにより、新たな抗体を改変しなくてはならない度に、最初から開始することが要求されないことが見出されている。

【0661】

Ｋａｂａｔの重鎖可変領域のナンバリングにそれぞれ従った変異ＶＨ５２ｂＣ又はＶＨ５３Ｃを、各々のハプテン結合抗体（抗ハプテン抗体）について使用することができる。抗体及びそれらの結合ポケットの構造が、非常に多様であるにもかかわらず、ＶＨ５２ｂＣ／ＶＨ５３Ｃ変異を、ジゴキシゲニン、ビオチン、フルオレセイン、並びにテオフィリンに結合する抗体への抗原／ハプテンの共有結合的な付着のために使用することができることが示されている。

【0662】

これらの配列で構成される結合実体を発現させ、標準的なプロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製することができ得る（実施例７を参照のこと）。結果として得られた分子が、完全に機能的であり、それらの未修飾の親分子と同じ様式で、それらの同族ハプテンに対する親和性を保持していた。これは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験により実証された（実施例９を参照のこと）。

【0663】

実施例７
組換え抗ハプテン抗体の組成、発現、及び精製

【0664】

マウス及びヒト化抗ハプテン抗体の可変領域を、ヒト由来の定常領域と組み合わせ、単一又は二重特異性キメラ又はヒト化抗体を形成した。

【0665】

ハプテン並びに異なる非ハプテン標的（例、受容体チロシンキナーゼ又はＩＧＦ−１Ｒ）に特異的に結合する単一特異性ヒト化抗ハプテン抗体及び二重特異性ヒト化抗ハプテン抗体の生成では、（ｉ）そのような分子についてのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列の設計及び定義、（ｉｉ）トランスフェクトされた培養哺乳動物細胞におけるこれらの分子の発現、並びに（ｉｉｉ）トランスフェクト細胞の上清からのこれらの分子の精製が要求される。これらの工程を、ＷＯ ２０１２／０９３０６８において以前に記載された通りに実施した。

【0666】

一般的に、（元の）マウス抗ハプテン抗体の結合特異性を有するＩｇＧクラスのヒト化抗体を生成するために、ヒト化ＶＨ配列を、サブクラスＩｇＧ１のヒトＦｃ領域のＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３のＮ末端にインフレームで融合した。同様に、ヒト化ＶＬ配列を、ヒトＣＬカッパ定常領域のＮ末端にインフレームで融合した。

【0667】

ハプテン結合特異性並びに他の標的への特異性を含む二重特異性抗体誘導体を生成するために、抗ハプテン抗体、ｓｃＦｖ又はＦａｂフラグメントを、以前に記載された抗体の重鎖のＣ末端にインフレームで融合した。多くの場合において、適用される抗ハプテンｓｃＦｖは、さらに、以前に記載されているＶＨ４４−ＶＬ１００ジスルフィド結合の導入により安定化した（例、Reiter, Y., et al., Nature biotechnology 14 (1996) 1239-1245）。
発現プラスミド

【0668】

重鎖及び軽鎖の発現のための発現カセットを含む発現プラスミドを、哺乳動物細胞発現ベクター中で別々に組み立てた。

【0669】

それにより、個々のエレメントをコードする遺伝子セグメントを、上に概説する通りに連結した。

【0670】

コドン使用を推定することができる、ヒト軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報が、以下において与えられる：Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication No 91-3242。

【0671】

κ軽鎖の転写単位は、以下のエレメントで構成される：
−ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）からの最初期エンハンサー及びプロモーター、
−Ｋｏｚａｋ配列を含む合成５’−ＵＴ、
−シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−５’末端に固有のＢｓｍＩ制限部位並びに３’末端にスプライスドナー部位及び固有のＮｏｔＩ制限部位を伴い配置された、クローン化された可変軽鎖ｃＤＮＡ、
−イントロン２マウスＩｇ−κエンハンサーを含むゲノムヒトκ遺伝子定常領域（Picard, D., and Schaffner, W. Nature 307 (1984) 80-82）、並びに
−ヒト免疫グロブリンκポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列。

【0672】

γｌ重鎖の転写単位は、以下のエレメントで構成される：
−ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）からの最初期エンハンサー及びプロモーター、
−Ｋｏｚａｋ配列を含む合成５’−ＵＴ、
−シグナル配列イントロンを含む改変マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−５’にユニークなＢｓｍＩ制限部位並びに３’末端にスプライスドナー部位及びユニークなＮｏｔＩ制限部位を配置した、クローン化された単一特異性可変重鎖ｃＤＮＡ又はクローン化された二重特異性融合ｓｃＦｖ可変重鎖ｃＤＮＡ、
−マウスＩｇμエンハンサーを含むゲノムヒトγｌ重遺伝子定常領域（Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378）、及び
−ヒトγＬ−免疫グロブリンのポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列。

【0673】

κ軽鎖又はγ１重鎖発現カセットの他、これらのプラスミドは以下を含む：
−ハイグロマイシン耐性遺伝子、
−エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点ｏｒｉＰ、
−大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、及び
−大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子。
組換えＤＮＡ技術

【0674】

クローニングは、Sambrook et al., 1999（上記）において記載される通り、標準的なクローニング技術を使用して実施した。全ての分子生物学的試薬は、商業的に入手可能で（他に示さない場合）、製造者の使用説明書に従って使用された。

【0675】

コード配列、変異、又はさらなる遺伝子エレメントを含むＤＮＡが、Geneart AG, Regensburgにより合成された。

【0676】

ＤＮＡ配列が、SequiServe（SequiServe GmbH, Germany）で実施された二本鎖シーケンシングにより決定された。
ＤＮＡ及びタンパク質配列分析並びに配列データ管理

【0677】

Vector NTI Advanceスイートバージョン９．０を、シーケンス作成、マッピング、分析、注釈、及び図示のために使用した。
抗ハプテン抗体及び誘導体の発現

【0678】

抗ハプテン抗体を、懸濁液中でのヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞の一過性トランスフェクションにより発現させた。そのために、対応する単一又は二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖を、上に概説する通り、原核生物及び真核生物の選択マーカーを保有する発現ベクター中で構築した。これらのプラスミドを、大腸菌において増幅させ、精製し、その後、一過性トランスフェクションのために適用した。標準的な細胞培養技術を、細胞の取り扱いのために使用した（Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.において記載される通り）。

【0679】

細胞を、適切な発現培地中で、３７℃／８%ＣＯ_２で培養した。トランスフェクションの日、細胞を、新鮮培地中に１〜２×１０^６個の生細胞/mlの密度で播種した。トランスフェクション試薬を伴うＤＮＡ複合体を、２５０mlの最終トランスフェクション容積についての１：１モル比において２５０μgの重鎖及び軽鎖プラスミドＤＮＡを含むOpti-MEM I培地（Invitrogen、ＵＳＡ）中で調製した。単一特異性又は二重特異性抗体を含む細胞培養上清を、トランスフェクション後７日目に、１４，０００gで３０分間にわたる遠心分離及び滅菌フィルター（０．２２μM）を通じた濾過により浄化した。上清を、精製まで−２０℃で保存した。

【0680】

細胞培養物上清中の抗体及び誘導体の濃度を決定するために、親和性ＨＰＬＣクロマトグラフィーを適用した。そのために、プロテインＡに結合する単一若しくは二重特異性抗体又はそれらの誘導体を含む細胞培養上清を、２００mM ＫＨ_２ＰＯ_４、１００mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を含む溶液中で、Applied Biosystems Poros A/20に適用した。クロマトグラフィー材料からの溶出を、２００mM ＮａＣｌ、１００mMクエン酸（ｐＨ２．５）を含む溶液を適用することにより実施した。UltiMate 3000 HPLCシステム（Dionex）を使用した。溶出タンパク質を、ＵＶ吸収及びピーク面積の積分により定量化した。精製ＩｇＧ１抗体は、標準としての役割を果たした。
ジゴキシゲニン、フルオレセイン、テオフィリン、又はビオチンに結合する抗ハプテン抗体の精製

【0681】

トランスフェクション後７日目、ＨＥＫ２９３細胞上清を収集した。その中に含まれる組換え抗体（又は誘導体）を、プロテインA Sepharose（商標）親和性クロマトグラフィー（GE Healthcare、スウェーデン）及びSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィーを使用した親和性クロマトグラフィーにより、２つの工程において上清から精製した。簡単には、抗体を含む、浄化した培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０mM Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１mM ＫＨ_２ＰＯ_４、１３７mM ＮａＣｌ、及び２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ ７．４）を用いて平衡化したMabSelectSuReプロテインＡ（５〜５０ml）カラム上に適用した。非結合タンパク質を、平衡化緩衝液で洗浄した。抗体（又は誘導体）を、５０mMクエン酸緩衝液（ｐＨ３．２）を用いて溶出した。タンパク質含有画分を、０．１mlの２M Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて中和した。次に、溶出タンパク質画分をプールし、Amicon Ultra遠心フィルター装置（ＭＷＣＯ：３０Ｋ、Millipore）を用いて濃縮し、２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）を用いて平衡化したSuperdex200 HiLoad 26/60ゲル濾過カラム（GE Healthcare、スウェーデン）上にロードした。精製抗体及び誘導体のタンパク質濃度を、Pace et. al., Protein Science 4 (1995) 2411-2423に従い、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用し、バックグラウンド補正としての３２０nmでのＯＤで２８０nmの光学密度（ＯＤ）を決定することにより決定した。単量体抗体画分をプールし、急速凍結し、−８０℃で保存した。サンプルの一部を、その後のタンパク質分析及び特徴付けのために提供した。

【0682】

抗体の均質性を、還元剤（５mM１，４−ジチオスレイトール）の存在及び非存在におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びにクマシーブリリアントブルーを用いた染色により確認した。NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲルシステム（Invitrogen、ＵＳＡ）を、製造者の使用説明書に従って使用した（４〜２０%Ｔｒｉｓ−グリシンゲル）。

【0683】

還元条件下で、ＩｇＧに関連するポリペプチド鎖を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、計算された分子量と類似の見掛け上の分子サイズで同定した。全ての構築物の発現レベルを、プロテインＡにより分析した。平均タンパク質収量は、そのような非最適化された一過性発現実験において、細胞培養上清１リットル当たり６mgと３５mgの間の精製タンパク質であった。

【0684】

実施例８
ハプテン化化合物の生成

【0685】

非共有結合的な複合体化のための化合物の生成のために、並びにコンジュゲーション（共有結合的な複合体化）のために、（ｉ）ハプテンを、適切なリンカーを介して、化合物（＝ペイロード）にカップリングすること、及び、（ｉｉ）カップリングが、化合物がその官能性を保持することを可能にする様式で生じることを保証することが必要である。
ａ）ハプテン−ポリペプチドコンジュゲート：

【0686】

任意のポリペプチドを、反応性残基（例えばシステイン残基など）を、ポリペプチドとハプテンの間のリンカー中に導入することができる限り、ハプテン担持リンカーにより、Ｎ若しくはＣ末端又は側鎖の位置において誘導体化することができる。特に、ポリペプチドは、非天然アミノ酸残基を含むことができる。

【0687】

例示的なハプテン化化合物を、以下の表５に列挙する。

【表6】

【0688】

略語：４Ａｂｕ＝４−アミノ−ブチル酸
Ａｈｘ＝アミノヘキサン酸
Ｂｔｎ＝ビオチニル
ｃｍｅ＝カルボキシメチル
Ｃｙ５＝インドジカルボシアニン、シアニン−５
Ｄａｄｏｏ＝１，８−ジアミノ−３，６−ジオキソ−オクタン
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
Ｄｉｇ（ＯＳｕ）＝ジゴキシゲニン−３−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
Ｄｙ６３６＝フルオロフォア
ｅｄａ＝エチレンジアミン
Ｆｌｕｏ＝５−カルボキシ−フルオレセイン
ＨＡＴＵ＝０−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＦＩＰ＝１，１，１，３，３，３，−ヘキサフルオロ−２−プロパノール
Ｍｍｔ＝４−メトキシトリチル
ＭＲ１２１＝オキサジンフルオロフォア
ＭＴＢＥ＝ｔｅｒｔ．ブチル−メチル−エーテル
ＮＭＭ＝Ｎ−メチル−モルホリン
ＮＭＰ＝Ｎ−メチル−２−ピロリドン
ＰＥＧ２＝８−アミノ−３，６−ジオキサ−オクタン酸
ＰＥＧ３＝１２−アミノ−４，７，１０−トリオキサドデカン酸
Ｏ_２Ｏｃ＝８−アミノ−３，６−ジオキサ−オクタン酸
Ｐｉｐ＝ピペリジン
Ｐｑａ＝４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸
ＴＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＣＥＰ＝Ｔｒｉｓ（２−クロロエチル）ホスフェート
ＴＦＥ＝２，２，２，トリフルオロエタノール
ＴＩＳ＝トリイソプロピルシラン

【0689】

カップリング手順及び用いられる試薬のスキームを、図３０、３１、及び３２に示す。

【0690】

本明細書において使用されている例示的なポリペプチドは、ニューロペプチド２受容体アゴニスト誘導体であった。このポリペプチドは、ペプチドチロシンチロシン又は膵臓ペプチドＹＹの短いＰＹＹ（３−３６）類似体（ＷＯ ２００７／０６５８０８において報告する通り）である。それは、位置２におけるいアミノ酸残基リジンを介してジゴキシゲニン化された。ジゴキシゲニン化ＰＹＹポリペプチドは、ジゴキシゲニン残基へのポリペプチドの側鎖連結に関係なく、以下のテキストにおいてＤＩＧ−ＰＹＹと呼ばれる。

【0691】

他の例示的な化合物は、非ペプチド蛍光色素Ｃｙ５、Ｄｙ６３６、及びＭＲ１２１である。これらの化合物は、ＮＨＳエステル化学を介して、ジゴキシゲニン又はビオチン含有リンカーシステムにカップリングすることができる。
ｉ）ＰＹＹ（３−３６）由来ポリペプチドコンジュゲーション前駆体の生成のための一般的な方法

【0692】

自動化されたマルチプルシンセサイザーでのＰＹＹ誘導体についての標準プロトコール：
シンセサイザー：ボルテックス撹拌システムを伴うMultiple Synthesizer SYRO I（MultiSynTech GmbH, Witten）
樹脂：２００mg TentaGel S RAM（０．２５mmol/g）、RAPP Polymere、Tubingen、反応容器としてテフロンフリットを伴う１０mlプラスチックシリンジ
ストック溶液：
Ｆｍｏｃアミノ酸：ＤＭＦ又はＮＭＰ中の０．５M
デブロッキング試薬：ＤＭＦ中の３０%ピペリジン
活性化剤：それぞれ０．５Ｍ ＴＢＴＵ及びＨＡＴＵ
基剤：ＮＭＰ中の５０%ＮＭＭ
カップリング：
Ｆｍｏｃアミノ酸：５１９μl
基剤：１１６μl
活性化剤：５１９μl
反応時間：二重カップリング：２×３０分
Ｆｍｏｃ−デブロック：
デブロッキング試薬：１２００μl
反応時間：５分 ＋ １２分
洗浄：
溶媒：１２００μl
容積：１３００μl
反応時間：５×１分
最終切断：
切断試薬：８ｍｌ ＴＦＡ／チオアニソール／チオクレゾール／ＴＩＳ（９５：２，５：２，５：３）
反応時間：４時間
操作：切断溶液を濾過し、１−２mlに濃縮し、ペプチドを、ＭＴＢＥの添加により沈殿させた。白色固体を遠心分離により回収し、ＭＴＢＥで２回洗浄し、乾燥させた。
Ａｃ ＩＫ Ｐｑａ Ｒ（Ｐｂｆ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｙ（ｔＢｕ）ＬＮ（Ｔｒｔ）Ｗ（Ｂｏｃ）ＶＴ（Ｂｕｔ）Ｒ（Ｐｂｆ）Ｑ（Ｔｒｔ）−ＭｅＡｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｙ（ｔＢｕ）−ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂（配列番号１７６）

【0693】

ＰＹＹ（３−３６）−ポリペプチド誘導体（ＰＹＹと呼ばれる）は、結合ペプチド配列Ａｃ−ＩＫ（Ｍｍｔ）−Ｐｑａ−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｙ（ｔＢｕ）ＬＮ（Ｔｒｔ）Ｗ（Ｂｏｃ）ＶＴ（ｔＢｕ）Ｒ（Ｐｂｆ）Ｑ（Ｔｒｔ）−ＭｅＡｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｙ（ｔＢｕ）−ＴｅｎｔａＧｅｌ−ＲＡＭ樹脂の自動化固相合成により得られた。ペプチド合成は、Ｆｍｏｃ化学を使用したボルテックス撹拌システムを伴うマルチプルシンセサイザーSYRO I（MultiSynTech GmbH、Witten）に従って実施した。TentaGel RAM樹脂（ローディング：０．２mmol/g；Rapp Polymers、Germany）を用いて、ペプチド配列は、対応するＦｍｏｃアミノ酸の連続的カップリング（スケール：０．０５mmol）により、反復サイクルにおいて組み立てた。すべてのカップリング工程において、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の３０%ピペリジンを用いた樹脂（５分間＋１２分間）の処理により除去した。カップリングは、位置１、１３、１４及び１５でＴＢＴＵ（０．２５mmol）により活性化されたＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．２５mmol）並びにＮＭＰ中のＮＭＭ５０%（二重カップリング２×３０分間ボルテックス）を用いて行った。全ての他の位置で、ＨＡＴＵ（０．２５mmol）及びＮＭＰ中のＮＭＭ５０%を、活性剤として使用した。各々のカップリング工程の間に、樹脂を、ＤＭＦを用いて５×１分間洗浄した。線形前駆体の合成後、アセチル化を、１５分間、ＤＭＦ／ＤＩＰＥＡ／Ａｃ２Ｏを用いた反応及びＤＭＦを用いた洗浄により実施し、Ａｃ−ＩＫ（Ｍｍｔ）−Ｐｑａ−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｙ（ｔＢｕ）ＬＮ（Ｔｒｔ）Ｗ（Ｂｏｃ）ＶＴ（Ｂｕｔ）Ｒ（Ｐｂｆ）Ｑ（Ｔｒｔ）−ＭｅＡｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｙ（ｔＢｕ）−ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂をもたらした。

【0694】

Ｍｍｔ基の除去のために、ペプチドを、ＤＣＭ／ＨＦＩＰ／ＴＦＥ／ＴＩＳ（６．５：２：１：０．５）で処理し（２×１時間）、ＤＭＦでの洗浄後、部分的にデブロックされた前駆体Ａｃ ＩＫ Ｐｑａ Ｒ（Ｐｂｆ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｙ（ｔＢｕ）ＬＮ（Ｔｒｔ）Ｗ（Ｂｏｃ）ＶＴ（Ｂｕｔ）Ｒ（Ｐｂｆ）Ｑ（Ｔｒｔ）−ＭｅＡｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｙ（ｔＢｕ）−TentaGel S RAM樹脂をもたらした。
Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｄｉｇ）／Ａｃ−ＩＫ（ＰＥＧ３−Ｄｉｇ）−Ｐｑａ−ＲＨＹＬＮＷＶＴＲＱ−ＭｅＡｒｇ−Ｙ−ＮＨ_２（配列番号１７７）

【0695】

合成、ＷＯ ２０１２／０９３０６８も参照のこと。

【0696】

水（５mL）中のペプチドＡｃ−ＩＫ（Ｈ２Ｎ−ＴＥＧ）−Ｐｑａ−ＲＨＹＬＮＷＶＴＲＱ（Ｎメチル）ＲＹ（１００mg、４０．６μmol）の溶液に、ＮＭＰ（１mL）に溶解したジゴキシゲニン−３−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２６．６mg、４８．８μmol）を加えた。トリエチルアミン（１３．６Ｌ、９７．６μmol）を加え、混合物を室温で２時間にわたり混転した。その後、ＮＭＰ（０．５mL）中に溶解した追加のジゴキシゲニン−３−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１３．３mg、２４．４μmol）、及びトリエチルアミン（６．８μL、４８．８μmol）を加え、溶液を１５時間にわたり混転した。粗生成物を、０．１%ＴＦＡ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）を含むアセトニトリル／水の勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣにより精製し、無色固体としてＤＩＧ ＰＹＹペプチド（２９mg、１０．０μmol、２５%）を提供した。ペプチド誘導体の分析的特徴付けのために、本発明者らは以下の条件を適用し、以下のデータを受けた：分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝１１．３分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×４．６mm、水＋０．１%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．１%ＴＦＡ８０：２０、２５分間）；ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：Ｃ_１４０Ｈ_２０７Ｎ_３５Ｏ_３２についての計算値：２８９２．４；検出：９６４．９［Ｍ＋２Ｈ］^２＋、計算値：９６５．１。抗体への複合体化のポイントまで、本発明者らは、ジゴキシゲニン化ペプチドを凍結乾燥物として４℃で保存する。図２Ｃは、ＤＩＧ−ｍｏＰＹＹの構造を示す。
ｉｉ） システイン含有リンカーを伴うジゴキシゲニン化ＰＹＹ（３−３６）由来ポリペプチドの生成
Ａｃ−ＩＫ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−ＮＨ２）−Ｐｑａ−ＲＨＹＬＮＷＶＴＲＱ−ＭｅＡｒｇ−Ｙ−ＮＨ_２（配列番号１７８）

【0697】

前駆体Ａｃ−ＩＫ−Ｐｑａ−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｙ（ｔＢｕ）ＬＮ（Ｔｒｔ）Ｗ（Ｂｏｃ）ＶＴ（Ｂｕｔ）Ｒ（Ｐｂｆ）Ｑ（Ｔｒｔ）−ＭｅＡｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｙ（ｔＢｕ）−ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂（配列番号１７６）を用いて開始し、ペプチド合成を、以下の工程を伴い継続した：

【0698】

２×３０分間にわたるＮＭＭ中での６６．５mg（３等量）Ｆｍｏｃ−１２−アミノ−４，７，１０−トリオキサドデカン酸（ＰＥＧ３スペーサー）、５７．０mg（３等量）のＨＡＴＵ及び１６．７μL（３等量）のＮＭＭを用いたマニュアル二重カップリング。ＤＭＦを用いた洗浄後（５×１分間）、Ｆｍｏｃ基を、３０%Ｐｉｐ／ＤＭＦを用いて切断し、樹脂を、標準プロトコールを使用し、ＤＭＦで洗浄した。

【0699】

Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−４−Ａｂｕ−ＯＨの以下の二重カップリングを、自動化マルチプルシンセサイザーでのＰＹＹ誘導体についての標準的なプロトコールに記載されている通りのプロトコールを用いて、ＳＹＲＯ１シンセサイザーにおいて自動的に実施した。最後に、樹脂を、ＤＭＦ、ＥｔＯＨ、ＭＴＢＥで洗浄し、乾燥した。

【0700】

樹脂からの切断を、４時間にわたり８mlのＴＦＡ／チオアニソール／チオクレゾール／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５：３）を用いて実施した。切断溶液を濾過し、１〜２mlに濃縮し、ペプチドを、ＭＴＢＥの添加により沈殿させた。白色固体を遠心分離により回収し、ＭＴＢＥで２回洗浄し、乾燥させた。

【0701】

粗生成物を分取逆相ＨＰＬＣにより精製し、無色固体を与えた。収量：２８．０mg
精製プロトコール
ＨＰＬＣ：UV-Vis検出器SPD-6Aを伴うShimadzu LC-8A
溶媒Ａ：水中の０．０５% ＴＦＡ
溶媒Ｂ：８０%アセトニトリル／水中の０．０５% ＴＦＡ
カラム：UltraSep ES, RP-18、１０μｍ、２５０×２０mM（SEPSERV, Berlin）
流速：１５ml/分
検出：２３０nm
勾配：２０−５０%Ｂ（３０分間）
分析データ：
ＨＰＬＣ：フォトダイオードアレイ検出器SPD-M6Aを伴うShimadzu LC-9A
溶媒Ａ：水中の０．０５% ＴＦＡ
溶媒Ｂ：８０%アセトニトリル／水中の０．０５% ＴＦＡ
カラム：UltraSep ES、RP-18、７μｍ，２５０×３mM（SEPSERV, Berlin）
流速：０．６ml/分
勾配：５−８０%Ｂ（３０分間）
ＭＳ：Shimadzu飛行時間形質量分析計AXIMA Linear（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）（分子量を質量平均として計算する）
ｍ／ｚ：Ｃ１２２Ｈ１８５Ｎ３７Ｏ２８Ｓの計算値＝２６５０．１３；検出：２６５０．３
Ａｃ−ＩＫ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−Ｄｉｇ）−Ｐｑａ−ＲＨＹＬＮＷＶＴＲＱ−ＭｅＡｒｇ−Ｙ−ＮＨ２（配列番号１７９）

【0702】

５０μLのＤＭＳＯ中のペプチドＡｃ−ＩＫ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−ＮＨ２）−Ｐｑａ−ＲＨＹＬＮＷＶＴＲＱ−ＭｅＡｒｇ−Ｙ−アミドの１５mgの溶液に、２５０μLのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、溶液を一晩撹拌した。二量体形成をＨＰＬＣにより制御した。１８時間の適用後、二量体の９０%が形成された。

【0703】

この溶液に、１００μLのＤＭＦ中に溶解した７．３mgのジゴキシゲニン−３−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｄｉｇ−ＯＳｕ）を加え、混合物を室温で５時間にわたり撹拌した。その後、１００μLのＤＭＦ中に溶解した追加の１６．９mgのＤｉｇ−ＯＳｕを加え、２時間にわたり撹拌した。１００μLのＤＭＦ中の６．９mgのさらなる量を加え、１８時間にわたり撹拌した。還元のために、二量体ＴＣＥＰを加え、３時間にわたり攪拌し、溶液を、分取逆相ＨＰＬＣを用いた精製のために直接的に使用した。
分析データ：
条件は、配列番号１７８について記載されてものと同じであった。
分取ＨＰＬＣ用の勾配：３８−５８%Ｂ（３０分間）
収量：５．３mg
ｍ／ｚ：Ｃ_１４７Ｈ_２１９Ｎ_３７Ｏ_３４Ｓの計算値＝３０８０．７；検出：３０７９．８
ＰＥＧ３−ＩＫ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−Ｄｉｇ）−Ｐｑａ−ＲＨＹＬＮＷＶＴＲＱ−ＭｅＡｒｇ−Ｙ−ＮＨ２（配列番号１８０）
樹脂結合ＰＹＹ配列の自動化固相合成：
ＰＥＧ２−ＩＫ（ｉｖＤｄｅ）−Ｐｑａ−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｙ（ｔＢｕ）ＬＮ（Ｔｒｔ）Ｗ（Ｂｏｃ）ＶＴ（ｔＢｕ）Ｒ（Ｐｂｆ）Ｑ（Ｔｒｔ）−ＭｅＡｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｙ（ｔＢｕ）−ＴｅｎｔａＧｅｌ−ＲＡＭ樹脂（配列番号１８１）

【0704】

ペプチド合成は、確立されたプロトコール（ＦａｓｔＭｏｃ ０．２５mmol）に従い、Ｆｍｏｃ化学を使用した自動化Applied Biosystems ABI 433Aペプチドシンセサイザーにおいて実施した。TentaGel RAM樹脂（ローディング：０．１８mmol/g；Rapp Polymers、Germany）を用いて、ペプチド配列を、対応するＦｍｏｃ−アミノ酸の連続的カップリング（スケール：０．２５mmol）により、反復サイクルにおいて組み立てた。すべてのカップリング工程において、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基は、Ｎメチルピロリドン（ＮＭＰ）中の２０%ピペリジンを用いた樹脂の処理（３×２．５分間）により除去した。カップリングは、ＤＭＦ中のＨＢＴＵ／ＨＯＢｔの（各々１mmol）及びＤＩＰＥＡ（２mmol）（４５〜６０分間ボルテックス）により活性化されたＦｍｏｃ保護アミノ酸（１mmol）を用いて行った。位置２、３、及び１４で、それぞれ、アミノ酸誘導体Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｑａ−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−ＯＨを合成配列中に組み込んだ。すべてのカップリング工程後、未反応のアミノ基を、ＮＭＰ中のＡｃ２Ｏ（０．５M）、ＤＩＰＥＡ（０．１２５M）、及びＨＯＢｔ（０．０１５M）の混合物を用いた処理によりキャップした（１０分間ボルテックス）。各々のステップの間で、樹脂をＮメチルピロリドン及びＭＦを用いて広範囲に洗浄した。立体障害アミノ酸の組み込みは、自動化された二重カップリングにおいて達成した。この目的のために、樹脂を、カップリングサイクルの間でのキャッピング工程を伴わず、１mmolの活性化された構築ブロックで２回処理した。標的配列の完了後、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を、ＮＭＰ中の２０%ピペリジンを用いて除去し、２−［２−（メトキシエトキシ）エトキシ］酢酸（４mmol）を、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ（それぞれ２mmol）及びＤＩＰＥＡ（それぞれ４mmol）を用いた活性化後にカップリングした。その後、樹脂を、さらなる操作のために、フリット固相リアクターに移した。
ＰＥＧ２−ＩＫ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−Ａｂｕ−ＮＨ２）−Ｐｑａ−ＲＨＹＬＮＷＶＴＲＱ−ＭｅＡｒｇ−Ｙ−ＮＨ２（配列番号１８２）

【0705】

ｉｖＤｄｅ基の除去のために、ペプチド樹脂（ＰＥＧ２−ＩＫ（ｉｖＤｄｅ）−Ｐｑａ−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｙ（ｔＢｕ）ＬＮ（Ｔｒｔ）Ｗ（Ｂｏｃ）ＶＴ（ｔＢｕ）Ｒ（Ｐｂｆ）Ｑ（Ｔｒｔ）−ＭｅＡｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｙ（ｔＢｕ）−ＴｅｎｔａＧｅｌ−ＲＡＭ樹脂；配列番号１８１）を、ＤＭＦで３０分間にわたり膨潤させ、その後、ＤＭＦ中のヒドラジン水和物の２%溶液（６０ml）で２時間にわたり処理した。樹脂を、イソプロパノール及びＤＭＦを用いて広範囲洗浄した後、ＤＭＦ（３mL）中のＦｍｏｃ−１２アミノ４，７，１０−トリオキサドデカン酸（ＰＥＧ３スペーサー）（８８７mg、２mmol）、ＨＢＴＵ（２mmol）、ＨＯＢｔ（２mmol）、及び２Ｍジイソプロピルエチルアミン（２ｍＬ、４mmol）を加え、混合物を３時間にわたり振盪した。樹脂を、ＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃ基を、ＤＭＦ中の混合物２０%ピリジンを用いて切断した。その後、樹脂を、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１．２ｇ；２mmol）、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ（各々２mmol）、及びＤＩＰＥＡ（４mmol）の混合物で２時間にわたり処理した。樹脂を、ＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃ基を、ＤＭＦ中の２０%ピリジンの混合物を用いて切断し、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ（各々２mmol）及びＤＩＰＥＡ（４mmol）を用いて活性化したＦｍｏｃ−４−アミノ酪酸（０．６５ｇ、２mmol）をカップリングした（２時間）。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を、ＮＭＰ中の２０%ピペリジンを用いて除去し、樹脂を、ＤＭＦを用いて繰り返し洗浄した。その後、樹脂を、トリフルオロ酢酸、水、及びトリイソプロピルシラン（１９mL：０．５mL：０．５mL）の混合物で２．５時間にわたり処理した。切断溶液を濾過し、ペプチドを、冷（０℃）ジイソプロピルエーテル（３００ml）の添加により沈殿させ、無色固体を提供し、それを、ジイソプロピルエーテルを用いて繰り返し洗浄した。粗生成物を、酢酸／水の混合物中に再溶解し、凍結乾燥し、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により精製した。

【0706】

分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝８．６分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×４．６ｍｍ、水＋０．１%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．１%ＴＦＡ８０：２０、２５分間）；ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：Ｃ１２７Ｈ１９５Ｎ３７Ｏ３１Ｓについての計算値：２７６８．３；検出：１３８５．０［Ｍ＋２Ｈ］^２＋、計算値：１３８５．１；９２３．７［Ｍ＋３Ｈ］^３＋、計算値：９２３．８；６９３．１［Ｍ＋４Ｈ］４＋、計算値：６９３．１。
ＰＥＧ２−ＩＫ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−Ｄｉｇ）−Ｐｑａ−ＲＨＹＬＮＷＶＴＲＱ−ＭｅＡｒｇ−Ｙ−ＮＨ２（ＰＥＧ２−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−Ｄｉｇ）（配列番号１８３）

【0707】

ＤＭＦ（３mL）中のペプチドＰＥＧ２−ＩＫ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−Ａｂｕ−ＮＨ２）−Ｐｑａ−ＲＨＹＬＮＷＶＴＲＱ−ＭｅＡｒｇ−Ｙ−ＮＨ２（配列番号１８２、４．１ｍｇ、１．４８μmol）の溶液に、ＮＭＰ（１ｍＬ）中に溶解したジゴキシゲニン−３−カルボキシメチルＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．８１mg、１．４８μmol）を加えた。ＤＭＦ中のトリエチルアミン（０．４１μL、９７．６μmol）を加え、混合物を室温で２時間にわたり混転した。粗生成物を、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣにより精製し（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）、無色固体としてＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−Ｄｉｇペプチド（１．２mg、０．３７５μmol、２５%）を提供した。

【0708】

分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝１０．２分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×４．６mm、水＋０．１%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．１%ＴＦＡ８０：２０、２５分間）；ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：Ｃ_１５２Ｈ_２２９Ｎ_３７Ｏ_３７Ｓについての計算値：３１９８．８；検出：１０６７．３［Ｍ＋３Ｈ］^３＋、計算値：１０６７．３。
ｉｉｉ）ビオチンを伴う、又はビオチン及びシステイン含有リンカーを伴うＰＹＹ（３−３６）由来ポリペプチドの生成：
Ａｃ−ＩＫ（ＰＥＧ２−ビオチン）−Ｐｑａ−ＲＨＹＬＮＷＶＴＲＱ−ＭｅＡｒｇ−Ｙ−アミド／Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔ）（配列番号１８４）

【0709】

共通の前駆体ペプチド樹脂（配列番号１７６）を用いて開始し、ペプチドを、１．２ｍｌのＤＭＦ中の５７．８mg（３等量）のＦｍｏｃ−８−アミノ−ジオキサオクタン酸（ＰＥＧ２スペーサー）、４８．２mg（３等量）のＴＢＴＵ、及び３３．３μL（６等量）のＮＭＭを用いて手動で２回コンジュゲーションし（各々３０分間）、ＤＭＦで洗浄した。Ｆｍｏｃ基を、配列番号１７６について記載される標準的なプロトコールを使用し、３０%Ｐｉｐ／ＤＭＦを用いて切断し、樹脂を、ＤＭＦで洗浄し、ＮＭＰ中のビオチンＯＢｔ溶液（１．２mlのＮＭＰ中の４８．９mgビオチン（４当量）、６４．２mgのＴＢＴＵ（４当量）、及び４４．４μLのＮＭＭ（８当量）、プレ活性化３分間）で２時間にわたり処理した。ＤＭＦ、ＥｔＯＨ、及びＭＴＢＥを用いた洗浄後、ペプチド樹脂を乾燥させた。

【0710】

最終的な切断を、上記に記載する通りに実施した。粗生成物を、３０分間の２２−５２%Ｂの勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣにより精製し、固体を与えた。収量：４２mg。
精製プロトコール
ＨＰＬＣ：ＵＶ−Ｖｉｓ検出器ＳＰＤ−６Ａを伴うShimadzu LC-8A
溶媒Ａ：水中の０．０５% ＴＦＡ
溶媒Ｂ：８０%アセトニトリル／水中の０．０５% ＴＦＡ
カラム：ＵｌｔｒａＳｅｐ ＥＳ，ＲＰ−１８，１０μm，２５０×２０mm（ＳＥＰＳＥＲＶ，Ｂｅｒｌｉｎ）
流速：１５ml/分
検出：２３０nm
分析データ：
ＨＰＬＣ：フォトダイオードアレイ検出器SPD-M6Aを伴うShimadzu LC-9A
溶媒Ａ：水中の０．０５% ＴＦＡ
溶媒Ｂ：８０%アセトニトリル／水中の０．０５% ＴＦＡ
カラム：UltraSep ES, RP-18、７μm、２５０×３mM（SEPSERV, Berlin）
流速：０．６ml/分
勾配：５−８０%Ｂ（３０分間）
ＭＳ：Shimadzu飛行時間形質量分析計AXIMA Linear
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、（分子量を質量平均として計算する）
ｍ／ｚ：Ｃ_１２２Ｈ_１８１Ｎ_３７Ｏ_２７Ｓの計算値＝２６３０．１０；検出：２６３１．５
Ａｃ−ＩＫ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−β−Ａｌａ−ビオチン）−Ｐｑａ−ＲＨＹＬＮＷＶＴＲＱ−ＭｅＡｒｇ−Ｙ−ＮＨ_２／Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−β−Ａｌａ−Ｂｉｏｔ）（配列番号１８５）

【0711】

前駆体Ａｃ−ＩＫ−Ｐｑａ−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｙ（ｔＢｕ）ＬＮ（Ｔｒｔ）Ｗ（Ｂｏｃ）ＶＴ（Ｂｕｔ）Ｒ（Ｐｂｆ）Ｑ（Ｔｒｔ）−ＭｅＡｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｙ（ｔＢｕ）−ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂（配列番号１７６）を用いて開始し、ペプチドを、１．２mlのＤＭＦ中の６６．５mg（３等量）のＦｍｏｃ−１２−アミノ−４，７，１０トリオキサドデカン酸（ＰＥＧ３スペーサー）、５７．０mg（３等量）のＨＡＴＵ、及び１６．７μL（３等量）のＮＭＭを用いて手動で２回３０分間コンジュゲーションした。ＤＭＦを用いた洗浄後、Ｆｍｏｃ基を、３０%Ｐｉｐ／ＤＭＦを用いて切断し、樹脂を、標準的なプロトコールを使用し、ＤＭＦで洗浄した。

【0712】

標準プロトコールを用いて、ＳＹＲＯ１シンセサイザーにおいて自動的に実施された、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨの二重カップリングに続き、ＮＭＰ中のビオチンＯＢｔ（４８．９mgのビオチン（４当量）から調製）、６４．２mgのＴＢＴＵ（４当量）、及び１．２mlのＮＭＰ中の４４．４μLのＮＭＭ（８当量）（プレ活性化３分）の溶液を手動で加え、室温で撹拌した。２時間後、樹脂を、ＤＭＦ、ＥｔＯＨ、ＭＴＢＥで洗浄し、乾燥させた。

【0713】

最終的な切断を、上記に記載する通りに実施した。粗生成物を、配列番号１８４について記載される通りの分取逆相ＨＰＬＣにより精製し、無色の固体を与えた。収量：４１．４mg
分析データ：
分取ＨＰＬＣ用の勾配：２８−５８%Ｂ（３０分間）
ｍ／ｚ：Ｃ_１３１Ｈ_１９７Ｎ_３９Ｏ_３０Ｓ_２の計算値＝２８６２．４；検出：２８６２．４
Ａｃ−ＩＫ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−ビオチン）−Ｐｑａ−ＲＨＹＬＮＷＶＴＲＱ−ＭｅＡｒｇ−Ｙ−ＮＨ_２／Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔ）（配列番号１８６）

【0714】

前駆体Ａｃ−ＩＫ−Ｐｑａ−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｙ（ｔＢｕ）ＬＮ（Ｔｒｔ）Ｗ（Ｂｏｃ）ＶＴ（Ｂｕｔ）Ｒ（Ｐｂｆ）Ｑ（Ｔｒｔ）−ＭｅＡｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｙ（ｔＢｕ）−ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂（配列番号１７６）を用いて開始し、ペプチド合成を、以下の工程を伴い継続した：
Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ３−ＯＨを用いた二重カップリング（標準的なプロトコールを用いる）、
Ｆｍｏｃ Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨの二重カップリング（標準的なプロトコールを用いる）、
１．２mlのＤＭＦ中の５７．８mg（３等量）のＦｍｏｃ−８−アミノ−ジオキサオクタン酸（ＰＥＧ２スペーサー）、４８．２mg（３等量）のＴＢＴＵ、及び３３．３μL（６等量）のＮＭＭを用いたＦｍｏｃ−ＰＥＧ２−ＯＨの二重カップリング（２×３０分間）、１．２ｍｌのＮＭＰ中の４８．９mgビオチン（４等量）、６４．２mgのＴＢＴＵ（４等量）、及び４４．４μLのＮＭＭ（８等量）の溶液を用いたビオチン化（プレ活性化３分間）、単一カップリング（２時間）。

【0715】

樹脂からの切断、精製、及び分析を、配列番号１８４について記載される通りに実施した。収量：４７．７mg
分析データ：
条件は、配列番号１８４について記載されてものと同じであった。
分取ＨＰＬＣ用の勾配：２５−４５%Ｂ（３０分間）。
ｍ／ｚ：Ｃ_１３４Ｈ_２０３Ｎ_３９Ｏ_３２Ｓ_２の計算値＝２９３６．５；検出：２９３７．８
ｉｖ）フルオレセインを用いた、又はフルオレセイン及びシステイン含有リンカーを用いたＰＹＹ（３−３６）由来ポリペプチドの生成。
Ａｃ−ＩＫ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４−Ａｂｕ−５−Ｆｌｕｏ）−Ｐｑａ−ＲＨＹＬＮＷＶＴＲＱ−ＭｅＡｒｇ−Ｙ−ＮＨ_２／Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４−Ａｂｕ−５−Ｆｌｕｏ）（配列番号１８７）

【0716】

前駆体Ａｃ−ＩＫ−Ｐｑａ−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｙ（ｔＢｕ）ＬＮ（Ｔｒｔ）Ｗ（Ｂｏｃ）ＶＴ（Ｂｕｔ）Ｒ（Ｐｂｆ）Ｑ（Ｔｒｔ）−ＭｅＡｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｙ（ｔＢｕ）−ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂（配列番号１７６）を用いて開始し、ペプチド合成を、配列番号１７９と同様に継続した。標識のために、ＤＭＦ中の５４．２mgの５カルボキシフルオレセイン、３３．１mgのＨＯＢｔ、及び３５．６μLのＤＩＣの溶液を加え、室温で１８時間にわたり撹拌した。

【0717】

樹脂からの切断、精製、及び分析を、配列番号１７９について記載される通りに実施した。収量：４１．６mg
分析データ：
分取ＨＰＬＣ用の勾配：２９−４９%Ｂ（３０分間）
ｍ／ｚ：Ｃ_１４３Ｈ_１９５Ｎ_３７Ｏ_３４Ｓの計算値＝３００８．４４；検出：３００７．２
Ａｃ−ＩＫ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−５−Ｆｌｕｏ）−Ｐｑａ−ＲＨＹＬＮＷＶＴＲＱ−ＭｅＡｒｇ−Ｙ−ＮＨ２／Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−５−Ｆｌｕｏ）（配列番号１８８）

【0718】

前駆体Ａｃ−ＩＫ−Ｐｑａ−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｈ（Ｔｒｔ）Ｙ（ｔＢｕ）ＬＮ（Ｔｒｔ）Ｗ（Ｂｏｃ）ＶＴ（Ｂｕｔ）Ｒ（Ｐｂｆ）Ｑ（Ｔｒｔ）−ＭｅＡｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｙ（ｔＢｕ）−ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂（配列番号１７６）を用いて開始し、ペプチド合成を、以下の工程を伴い継続した：
Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ３−ＯＨを用いた二重カップリング（標準的なプロトコールを用いる）、
Ｆｍｏｃ Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨの二重カップリング（標準的なプロトコールを用いる）、
二重カップリングＦｍｏｃ−ＰＥＧ２−ＯＨ（配列番号１８６を参照のこと）

【0719】

標識のために、ペプチド樹脂を、ＤＭＦ中の５６．７mgの５カルボキシフルオレセイン、３４．６mgのＨＯＢｔ、及び３７．３μLのＤＩＣの溶液で１８時間にわたり撹拌した。樹脂からの切断、精製、及び分析を、配列番号１８５において記載される通りに実施した。収量：４１．７mg
分析データ：
分取ＨＰＬＣ用の勾配：３４−６４%Ｂ（３０分間）。
ｍ／ｚ：Ｃ_１４５Ｈ_１９９Ｎ_３７Ｏ_３６Ｓ_１の計算値＝３０６８．５；検出：３０６９．２
ｂ）ハプテン標識蛍光色素：
ｉ）ジゴキシゲニン化Ｃｙ５の生成

【0720】

合成、ＷＯ ２０１２／０９３０６８を参照のこと。
ｉｉ）Ｄｉｇ−Ｃｙｓ−ＭＲ１２１の生成

【0721】

三角フラスコにおいて、１，２−ジアミノ−プロパントリチル樹脂（２５０mg、０．２２５mmol、ローディング０．９mmol/g）を、ＤＭＦ（５mL）で３０分間にわたり膨潤させた。その後、ＤＭＦ（２mL）中のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（３９５mg、０．６７５mmol）の溶液並びにＤＭＦ（８mL）中のＨＡＴＵ（４３３mg、１．２３７５mmol）及びＨＯＡｔ（１６４mg、１．２３７５mmol）の溶液を樹脂に加えた。この懸濁液に、ＤＩＰＥＡ（３８５μL、２．２５mmol）を加え、混合物を、周囲温度で１６時間にわたりかき混ぜ、濾過し、ＤＭＦを用いて繰り返し洗浄した。カップリング工程後、未反応アミノ基を、ＤＭＦ中のＡｃ２Ｏ（２０%）の混合物を用いた処理によりキャップし、ＤＭＦを用いた洗浄工程が続いた。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基の除去は、２時間にわたる、ＤＭＦ中のピペリジン（２０%）を用いた樹脂の処理により達成された。その後、樹脂を、ＤＭＦ及びイソプロパノール、並びに、再びＤＭＦを用いて完全に洗浄し、次に、ＤＭＦ（１０ml）中の１%ＤＩＰＥＡ中のＭＲ１２１（２５mg、０．０５mmol）の溶液で１６時間にわたり処理した。濾過及びＤＭＦを用いた洗浄後、樹脂を、トリフルオロ酢酸、水、及びトリイソプロピルシラン（９mL：９mL：１mL）の混合物で３時間にわたり処理した。切断溶液を濾過し、減圧下で濃縮し、結果として得られた固体を、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により精製し、凍結乾燥した。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝７．７分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×４．６mm、水＋０．１%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．１%ＴＦＡ８０：２０、２５分間。その後、この中間体の一部（１０．０mg、１７．６μmol）をＤＭＦ（１mL）中に溶解し、ＤＭＦ（１mL）中のジゴキシゲニン−３−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（９．６mg、１７．６μｍｏｌ）の溶液及びＤＭＦ（２ml）中の１%トリエチルアミンを加え、混合物を１６時間にわたり混転した。溶液をその後に濃縮し、標的化合物を、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により精製した。収量：１．０mg。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝１０．１分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×４．６mm、水＋０．１%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．１%ＴＦＡ８０：２０、２５分間ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：［Ｍ］についての計算値：９９６．３；検出：９９５．８［Ｍ］^１＋。
ｉｉｉ） ＤＩＧ−Ｃｙｓ−ＡＨＸ−Ｃｙ５の生成

【0722】

三角フラスコにおいて、１，２−ジアミノ−プロパントリチル樹脂（２５０mg、０．２２５mmol、ローディング０．９mmol/g）を、ＤＭＦ（５mL）で３０分間にわたり膨潤させた。その後、ＤＭＦ（２mL）中のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（３９５mg、０．６７５mmol）の溶液並びにＤＭＦ（８mL）中のＨＡＴＵ（４３３mg、１．２３７５mmol）及びＨＯＡｔ（１６４mg、１．２３７５mmol）の溶液を樹脂に加えた。この懸濁液に、ＤＩＰＥＡ（３８５μL、２．２５mmol）を加え、混合物を、周囲温度で１６時間にわたりかき混ぜ、濾過し、ＤＭＦを用いて繰り返し洗浄した。カップリング工程後、未反応アミノ基を、ＤＭＦ中のＡｃ２Ｏ（２０%）の混合物を用いた処理によりキャップし、ＤＭＦを用いた洗浄工程が続いた。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基の除去は、ＤＭＦ中のピペリジン（２０%）を用いた樹脂の処理により達成された。その後、樹脂を、ＤＭＦ及びイソプロパノール、並びに、再びＤＭＦを用いて完全に洗浄し、次に、ＤＭＦ（１０ml）中の１%ＤＩＰＥＡ中のＣｙ５モノＮＨＳエステル（２５mg、０．０３１６mmol）の溶液で１６時間にわたり処理した。濾過及びＤＭＦを用いた洗浄後、樹脂を、トリフルオロ酢酸、水、及びトリイソプロピルシラン（９mL：９mL：１mL）の混合物で３時間にわたり処理した。切断溶液を濾過し、減圧下で濃縮し、結果として得られた固体を水中で再溶解し、凍結乾燥した。中間体の精製は、０．１% ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により達成し、凍結乾燥後に青色固体をもたらした。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝６．２分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×４．６mm、水＋０．１%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．１%ＴＦＡ８０：２０、２５分間。その後、この中間体の一部（６．５mg、７．９μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１mL）中のＤｉｇ−Ａｍｃａｐ−ＯＳｕ（５．２mg、７．９μｍｏｌ）の溶液及びＤＭＦ（２ml）中の１%トリエチルアミンを加え、混合物を１６時間にわたり混転した。溶液をその後に濃縮し、標的化合物を、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により精製した。収量：３mg。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝８．７分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×４．６mm、水＋０．１%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．１%ＴＦＡ８０：２０、２５分間ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：［Ｍ］についての計算値：１３６０．０；検出：１３６０．７［Ｍ］^１＋。
ｉｖ）ビオチンｅｄａ−Ｄｙ６３６の生成

【0723】

０．１M Ｋ_３ＰＯ_４緩衝液（ｐＨ ８．０、５００μL）中のビオチンエチレンジアミン臭化水素酸塩（２．１４mg、５．８３μmol）の溶液に、０．１M Ｋ_３ＰＯ_４緩衝液（ｐＨ８．０、５００μL）中のＤｙ６３６−ＯＳｕ（５mg、５．８３μmol）の溶液を加え、結果として得られた混合物を、周囲温度で２時間にわたり混転し、濾過し、標的化合物を、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により単離した。凍結乾燥後、Ｄｙ６３６−エチレンジアミン（Ｅｔｈｙｌｅｎｄｉａｍｉｎ）Ｂｉコンジュゲートを無色固体（２．８mg、４８%%）として得た。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝８．５分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×４．６mm、水＋０．１%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．１%ＴＦＡ８０：２０、２５分間）；ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：Ｃ_５０Ｈ_６５Ｎ_６Ｏ_１０Ｓ_３についての計算値：１００６．３；検出：１００７．３［Ｍ＋Ｈ］^＋。
ｖ）ビオチン−Ｓｅｒ−Ｄｙ６３６の生成
工程１：ビオチン−Ｏ_２Ｏｃ−Ｓｅｒ−Ｏ_２Ｏｃ−ＤＡＤＯＯ−ＮＨ_２

【0724】

Ｏ−ビス−（アミノエチル）エチレングリコールトリチル樹脂（１７６mg、０．１２５mmol、ローディング０．７１mmol/g、Novabiochem）上に、ＦｍｏＣ−Ｏ_２Ｏｃ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、ＦｍｏＣ−Ｏ_２Ｏｃ−ＯＨ（全てＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、及びＤＭＴｒ−Ｄ−ビオチン（Roche）を連続的にコンジュゲーションさせた。ペプチド合成は、確立されたプロトコール（ＦａｓｔＭｏｃ ０．２５mmol）に従い、Ｆｍｏｃ化学を使用した自動化Applied Biosystems ABI 433Aペプチドシンセサイザーにおいて実施した（配列番号１８０について記載する通り）。

【0725】

合成後、樹脂を、ＤＭＦ、メタノール、ジクロロメタンを用いて完全に洗浄し、真空下で乾燥させた。次に、樹脂を三角フラスコに入れ、トリフルオロ酢酸、水、及びトリイソプロピルシラン（９．５mL：２５０μL：２５０μL）の混合物を用いて、室温で２時間にわたり処理した。切断溶液を濾過し、ペプチドを、冷（０℃）ジイソプロピルエーテル（８０ml）の添加により沈殿させ、無色固体を提供し、それを、ジイソプロピルエーテルで洗浄した。粗生成物を水中に再溶解し、凍結乾燥し、その後、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により精製し、凍結乾燥後に無色固体をもたらした。収量：５６mg（６０%）。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝４．５分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×３mM、水＋０．１% ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．１%ＴＦＡ８０：２０、２５分間。ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：［Ｍ］についての計算値：７５１．９；検出：７５２．４［Ｍ＋Ｈ］^＋；３７６．９［Ｍ＋２Ｈ］^２＋。
工程２：ビオチン−Ｏ_２Ｏｃ−Ｓｅｒ−Ｏ_２Ｏｃ−ＤＡＤＯＯ−Ｄｙ−６３６（Ｂｉ−Ｓｅｒ−Ｄｙ−６３６）

【0726】

ペプチド（５．３mg、７．０μmol）を、２００mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５（５８３μL）中に溶解した。ＤＹ−６３６−ＮＨＳエステル（４mg、４．７μmol、Ｄｙｏｍｉｃｓ）を水（５８３μL）中に溶解し、ペプチド溶液に加えた。反応溶液を、室温で２時間にわたり撹拌し、その後、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により精製し、凍結乾燥後に青色固体をもたらした。収量：３．９mg（５５%）。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝８．３分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×３mM、水＋０．０２５%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．０２３%ＴＦＡ８０：２０、２５分間。ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：［Ｍ］についての計算値：１４７２．８；検出：［Ｍ＋Ｈ］^＋；７３７．０［Ｍ＋２Ｈ］^２＋。
ｖｉ）ビオチン−Ｃｙｓ−Ｄｙ６３６の生成
工程１：ビオチン−Ｏ_２Ｏｃ−Ｃｙｓ−Ｏ_２Ｏｃ−ＤＡＤＯＯ−ＮＨ_２

【0727】

Ｏ−ビス−（アミノエチル）エチレングリコールトリチル樹脂（３５２mg、０．２５mmol、ローディング０．７１mmol/g、Novabiochem）上に、ＦｍｏＣ−Ｏ_２Ｏｃ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、ＦｍｏＣ−Ｏ_２Ｏｃ−ＯＨ（全てIris Biotech）、及びＤＭＴｒ−Ｄ−ビオチン（Roche）を連続的にコンジュゲーションさせた。ペプチド合成は、確立されたプロトコール（ＦａｓｔＭｏｃ ０．２５mmol）に従い、Ｆｍｏｃ化学を使用した自動化Applied Biosystems ABI 433Aペプチドシンセサイザーにおいて実施した（配列番号１８０について記載する通り）。

【0728】

合成後、樹脂を、ＤＭＦ、メタノール、ジクロロメタンを用いて完全に洗浄し、真空下で乾燥させた。次に、樹脂を三角フラスコに入れ、トリフルオロ酢酸、水、及びトリイソプロピルシラン（９．５mL：２５０μL：２５０μL）の混合物を用いて、室温で２時間にわたり処理した。切断溶液を濾過し、ペプチドを、冷（０℃）ジイソプロピルエーテル（１００ml）の添加により沈殿させ、無色固体を提供し、それを、ジイソプロピルエーテルで洗浄した。粗生成物を水中に再溶解し、凍結乾燥し、その後、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により精製し、凍結乾燥後に無色固体をもたらした。収量：７９mg（４１%）。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝５．３分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×３mM、水＋０．１% ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．１%ＴＦＡ８０：２０、２５分間。ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：［Ｍ］についての計算値：７６７．９；検出：７６８．４ ［Ｍ＋Ｈ］^＋；３８４．８ ［Ｍ＋２Ｈ］^２＋。
工程２：ビオチン−Ｏ_２Ｏｃ−Ｃｙｓ（ＴＮＢ）−Ｏ_２Ｏｃ−ＤＡＤＯＯ−ＮＨ_２

【0729】

ペプチド（３０mg、３９μmol）を、１００mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５（４ｍＬ）中に溶解し、５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（７７mg、１９５μmol）を加えた。混合物を、室温で３０分間にわたり撹拌し、その後、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により精製し、凍結乾燥後に黄色固体をもたらした。収量：３１ｍｇ（８３%）。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝５．４分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×３mM、水＋０．０２５%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．０２３%ＴＦＡ８０：２０、２５分間。ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：［Ｍ］についての計算値：９６５．１；検出：９６５．４［Ｍ＋Ｈ］^＋；４８３．３［Ｍ＋２Ｈ］^２＋。
工程３：ビオチン−Ｏ_２Ｏｃ−Ｃｙｓ（ＴＮＢ）−Ｏ_２Ｏｃ−ＤＡＤＯＯ−Ｄｙ−６３６

【0730】

ＴＮＢ保護ペプチド（１．３５mg、１．４μmol）を、２００mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５（２９１μL）中に溶解した。ＤＹ−６３６−ＮＨＳエステル（１mg、１．２μmol、Dyomics）を水（２９１μL）中に溶解し、ペプチド溶液に加えた。反応液を室温で１時間にわたり撹拌し、その後、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により精製し、凍結乾燥後に青色固体をもたらした。収量：１mg（５０%）。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝９．０分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×３mM、水＋０．０２５%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．０２３% ＴＦＡ ８０：２０、２５分間ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：［Ｍ］についての計算値：１６８６．０；検出：１６８６．７［Ｍ＋Ｈ］^＋；８４４．２［Ｍ＋２Ｈ］^２＋。
工程４：ビオチン−Ｏ_２Ｏｃ−Ｃｙｓ−Ｏ_２Ｏｃ−ＤＡＤＯＯ−Ｄｙ−６３６（Ｂｉ−Ｃｙｓ−Ｄｙ−６３６）

【0731】

ＴＮＢ保護ペプチド及び色素標識ペプチド（１mg、０．６μmol）を、２００mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５（２５０μL）及び水（１９２μL）の混合物中に溶解した。１００mMＴｒｉｓ（２カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液（５８μL）を加え、反応混合物を室温で３０分間にわたり撹拌した。精製を、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により実施し、凍結乾燥後に青色固体をもたらした。収量：０．７mg（７９%）。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝８．６分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×３mM、水＋０．０２５%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．０２３% ＴＦＡ ８０：２０、２５分間ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：［Ｍ］についての計算値：１４８８．９；検出：１４８８．６［Ｍ＋Ｈ］^＋；７４５．１［Ｍ＋２Ｈ］^２＋。
ｖｉｉ） ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５の生成
工程１：ビオチン−Ｏ_２Ｏｃ−Ｃｙｓ−Ｏ_２Ｏｃ−ＤＡＤＯＯ−ＮＨ_２

【0732】

Ｏ−ビス−（アミノエチル）エチレングリコールトリチル樹脂（３５２mg、０．２５mmol、ローディング０．７１mmol/g、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）上に、ＦｍｏＣ−Ｏ_２Ｏｃ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、ＦｍｏＣ−Ｏ_２Ｏｃ−ＯＨ（全てＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、及びＤＭＴｒ−Ｄ−ビオチン（Ｒｏｃｈｅ）を連続的にコンジュゲーションさせた。ペプチド合成は、確立されたプロトコール（ＦａｓｔＭｏｃ ０．２５mmol）に従い、Ｆｍｏｃ化学を使用した自動化Applied Biosystems ABI 433Aペプチドシンセサイザーにおいて実施した（配列番号１８０について記載する通り）。

【0733】

合成後、樹脂を、ＤＭＦ、メタノール、ジクロロメタンを用いて完全に洗浄し、真空下で乾燥させた。次に、樹脂を三角フラスコに入れ、トリフルオロ酢酸、水、及びトリイソプロピルシラン（９．５ｍＬ：２５０μL：２５０μL）の混合物を用いて、室温で２時間にわたり処理した。切断溶液を濾過し、ペプチドを、冷（０℃）ジイソプロピルエーテル（１００ml）の添加により沈殿させ、無色固体を提供し、それを、ジイソプロピルエーテルで洗浄した。粗生成物を水中に再溶解し、凍結乾燥し、その後、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により精製し、凍結乾燥後に無色固体をもたらした。収量：７９mg（４１%）。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝５．３分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×３mM、水＋０．１% ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．１%ＴＦＡ８０：２０、２５分間。ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：［Ｍ］についての計算値：７６７．９；検出：７６８．４［Ｍ＋Ｈ］^＋；３８４．８［Ｍ＋２Ｈ］^２＋。
工程２：ビオチン−Ｏ_２Ｏｃ−Ｃｙｓ（ＴＮＢ）−Ｏ_２Ｏｃ−ＤＡＤＯＯ−ＮＨ_２

【0734】

ペプチド（３０mg、３９μmol）を、１００mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５（４ｍＬ）中に溶解し、５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（７７mg、１９５μmol）を加えた。混合物を、室温で３０分間にわたり撹拌し、その後、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により精製し、凍結乾燥後に黄色固体をもたらした。収量：３１ｍｇ（８３%）。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝５．４分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×３mM、水＋０．０２５%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．０２３%ＴＦＡ８０：２０、２５分間。ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：［Ｍ］についての計算値：９６５．１；検出：９６５．４［Ｍ＋Ｈ］^＋；４８３．３［Ｍ＋２Ｈ］^２＋。
工程３：ビオチン−Ｏ_２Ｏｃ−Ｃｙｓ（ＴＮＢ）−Ｏ_２Ｏｃ−ＤＡＤＯＯ−Ｃｙ５

【0735】

ＴＮＢ保護ペプチド（９．９mg、１０．３μmol）を、２００mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５（１０２６μL）中に溶解した。Ｃｙ５−モノＮＨＳエステル（６．５mg、８．２μmol、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を水（１０２６μL）中に溶解し、ペプチド溶液に加えた。反応液を室温で２時間にわたり撹拌し、その後、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により精製し、凍結乾燥後に青色固体をもたらした。収量：１０mg（８０%）。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝７．２分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×３mM、水＋０．０２５%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．０２３% ＴＦＡ ８０：２０、２５分間ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：［Ｍ］についての計算値：１６０３．９；検出：１６０４．９［Ｍ＋Ｈ］^＋；８０３．１［Ｍ＋２Ｈ］^２＋。
工程４：ビオチン−Ｏ_２Ｏｃ−Ｃｙｓ−Ｏ_２Ｏｃ−ＤＡＤＯＯ−Ｃｙ５（Ｂｉ−Ｃｙｓ−Ｃｙ５）

【0736】

ＴＮＢ保護ペプチド及び色素標識ペプチド（１０mg、６．１μmol）を、２００mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５（１５２２μL）及び水（１２１８μL）の混合物中に溶解した。１００mMＴｒｉｓ（２カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液（３０４μL）を加え、反応混合物を室温で３０分間にわたり撹拌した。精製を、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により実施し、凍結乾燥後に青色固体をもたらした。収量：７．６mg（８６%）。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝６．４分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×３mM、水＋０．０２５%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．０２３% ＴＦＡ ８０：２０、２５分間ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：［Ｍ］についての計算値：１４０６．８；検出：１４０６．８［Ｍ＋Ｈ］^＋；７０４．０［Ｍ＋２Ｈ］^２＋。
ｖｉｉｉ） ビオチン−Ｓｅｒ−Ｃｙ５の生成
工程１：ビオチン−Ｏ_２Ｏｃ−Ｓｅｒ−Ｏ_２Ｏｃ−ＤＡＤＯＯ−ＮＨ_２

【0737】

Ｏ−ビス−（アミノエチル）エチレングリコールトリチル樹脂（１７６mg、０．１２５mmol、ローディング０．７１mmol/g、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）上に、ＦｍｏＣ−Ｏ_２Ｏｃ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、ＦｍｏＣ−Ｏ_２Ｏｃ−ＯＨ（全てＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、及びＤＭＴｒ−Ｄ−ビオチン（Ｒｏｃｈｅ）を連続的にコンジュゲーションさせた。ペプチド合成は、確立されたプロトコール（ＦａｓｔＭｏｃ ０．２５mmol）に従い、Ｆｍｏｃ化学を使用した自動化Applied Biosystems ABI 433Aペプチドシンセサイザーにおいて実施した（配列番号１８０について記載する通り）。

【0738】

合成後、樹脂を、ＤＭＦ、メタノール、ジクロロメタンを用いて完全に洗浄し、真空下で乾燥させた。次に、樹脂を三角フラスコに入れ、トリフルオロ酢酸、水、及びトリイソプロピルシラン（９．５ｍＬ：２５０μL：２５０μL）の混合物を用いて、室温で２時間にわたり処理した。切断溶液を濾過し、ペプチドを、冷（０℃）ジイソプロピルエーテル（８０ml）の添加により沈殿させ、無色固体を提供し、それを、ジイソプロピルエーテルで洗浄した。粗生成物を水中に再溶解し、凍結乾燥し、その後、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により精製し、凍結乾燥後に無色固体をもたらした。収量：５６mg（６０%）。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝４．５分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×３mM、水＋０．１% ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．１%ＴＦＡ８０：２０、２５分間。ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：［Ｍ］についての計算値：７５１．９；検出：７５２．４［Ｍ＋Ｈ］^＋；３７６．９［Ｍ＋２Ｈ］^２＋。
工程２：ビオチン−Ｏ_２Ｏｃ−Ｓｅｒ−Ｏ_２Ｏｃ−ＤＡＤＯＯ−Ｃｙ５（Ｂｉ−Ｓｅｒ−Ｃｙ５）

【0739】

ペプチド（５．７mg、７．６μmol）を、２００mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５（７８９μL）中に溶解した。Ｃｙ５−モノＮＨＳエステル（５mg、６．３μmol、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を水（７８９μL）中に溶解し、ペプチド溶液に加えた。反応溶液を、室温で２時間にわたり撹拌し、その後、０．１%ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の勾配を用いた分取逆相ＨＰＬＣ（Merck Chromolith prep RP-18eカラム、１００×２５mm）により精製し、凍結乾燥後に青色固体をもたらした。収量：６mg（５８%）。分析用ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝６．１分間（Merck Chromolith Performance RP-18e、１００×３mM、水＋０．０２５%ＴＦＡ→アセトニトリル／水＋０．０２３%ＴＦＡ８０：２０、２５分間。ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ：［Ｍ］についての計算値：１３９０．７２；検出：１３９１．２［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0740】

実施例９
ビオチン標識化合物（ハプテン化化合物）への組換えヒト化抗ビオチン抗体の結合

【0741】

ヒト化手順及びその後のシステイン変異の導入が、完全な結合活性を保持していた誘導体をもたらしたか否かを決定するために、以下の実験を実施した。

【0742】

組換え抗ビオチン抗体誘導体の結合特性を、Octet QK機器（Fortebio Inc.）を使用した生体層干渉法（ＢＬＩ）技術により分析した。このシステムは、分子相互作用の試験のために十分に確立されている。ＢＬｉ技術は、バイオセンサーチップの表面及び内部参照から反射された白色光の干渉パターンの測定に基づく。バイオセンサーチップへの分子の結合は、測定することができる干渉パターンのシフトをもたらす。上記に記載するヒト化手順によって、ビオチンに結合する抗ビオチン抗体の能力が減弱されるか否かを分析するために、ビオチン化タンパク質に結合するそれらの能力における、抗体のキメラ及びヒト化バージョンの特性を、直接的に比較した。結合試験は、抗ｈｕＩｇＧ Ｆｃ抗体Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＨＣ）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Fortebio）上に抗ビオチン抗体を捕捉することにより実施した。最初に、バイオセンサーを、２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中の０．５mg/mlの濃度を伴う抗体溶液中で１分間にわたりインキュベートした。その後、バイオセンサーを、１×ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）中で１分間にわたりインキュベートし、安定したベースラインに達した。結合を、２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中の０．０６mg/mlの濃度を伴うビオチン化タンパク質を含む溶液中で、抗体コーティングされたバイオセンサーを５分間にわたりインキュベートすることにより測定した。解離を、５分間にわたり１×ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）中でモニターした。キメラ及びヒト化抗ビオチン抗体について、結果として得られた結合曲線を、直接的に比較した。

【0743】

抗体のヒト化バージョンは、キメラ抗体と等しい、又はそれよりも更に良好な、ビオチン化抗原の結合を示した。同じことが、Ｋａｂａｔ位置ＶＨ５３にＣｙｓ変異を伴うヒト化抗体について該当する。ビオチン化タンパク質は、バイオセンサーが、ビオチンに結合しないハーセプチンを用いてコーティングされた場合、低下したバイオセンサーへの残留の非特異的結合を示した。このように、抗ビオチン抗体の機能性は、そのヒト化バリアント（それらは、配列番号４４及び４８、配列番号６０及び６４において描写される配列により定義される）において保持された。
表面プラズモン共鳴

【0744】

表面プラズモン共鳴測定を、BIACORE（登録商標）Ｔ２００機器（GE Healthcare Biosciences AB、スウェーデン）で、２５℃で実施した。捕捉システム（Human Antibody Capture Kit、ＢＲ−１００８−３９、GE Healthcare Biosciences AB、Ｓｗｅｄｅｎからの１０μg/ml Anti-human Capture（ＩｇＧ Ｆｃ））の約４３００共鳴単位（ＲＵ）を、GE Healthcare により供給される標準的なアミンカップリングキット（ＢＲ−１０００−５０）を使用することにより、ＣＭ３チップ（GE Healthcare、ＢＲ−１００５−３６）上にｐＨ５．０でカップリングさせた。アミンカップリング用の泳動緩衝液は、ＨＢＳ−Ｎ（１０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、１５０mM ＮａＣｌ、GE Healthcare、ＢＲ−１００６−７０）であった。泳動及び希釈用緩衝液は、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５% Tween20を含む１０mMリン酸緩衝生理食塩水）（ｐＨ７．４）であった。ヒト化抗ビオチン抗体を、５μL/分の流速で、６０秒間にわたり２nM溶液を注射することにより捕捉した。ビオチン化ｓｉＲＮＡを、ＰＢＳ−Ｔを用いて、０．１４‐１００nM（１：３希釈系列）の濃度で希釈した。結合を、３０μL/分の流速、解離時間６００秒で、１８０秒間にわたり、各々の各濃度を注入することにより測定した。表面を、５μL/分の流速で、３mMｇＣｌ_２溶液を用いた３０秒間の洗浄により再生した。データを、BIAevaluationソフトウェア（GE Healthcare Biosciences AB、Sweden）を使用して評価した。バルク屈折率の差を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ表面から得られた応答を減算することにより補正した。ブランク注射も減算する（＝二重参照）。ＫＤ及び動力学的パラメーターの計算のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。

【0745】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による動態結合分析を、ヒト化抗ビオチン抗体の配列番号４４及び４８、並びにヒト化抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃの配列番号６０及び６４について実施した。２nMの濃度での抗ビオチン抗体を、ＣＭ３センサーチップに結合させた抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体により捕捉した。ビオチン化ｓｉＲＮＡ（Ｍｗ：１３８６８Ｄａ）の結合を、濃度０．４１、１．２３、３．７、１１．１、３３．３、１００、及び３００nMで記録した。測定は、二通り行った。ヒト化抗ビオチン抗体及びヒト化抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃについての、計算されたＫ_Ｄは、それぞれ０．６３３ｎＭ及び０．６５４ｎＭであった。

【0746】

実施例１０
抗ハプテン抗体を伴うハプテン化化合物の非共有結合複合体の生成
一般的な方法：

【0747】

ハプテン化化合物を伴う抗ハプテン抗体の複合体（＝ペイロードにコンジュゲーションされたハプテン）の生成は、定義された複合体をもたらすものとし、これらの複合体中の化合物（＝ペイロード）が、その活性を保持することを保証しなければならない。それぞれの抗ハプテン抗体を伴うハプテン化化合物の複合体の生成のために、ハプテン化化合物を、１mg/mlの最終濃度までＨ_２Ｏ中に溶解した。抗体を、２０mMヒスチジン緩衝液、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ ＝６．０）中で、１mg/ml（４．８５μM）の最終濃度まで濃縮した。ハプテン化ペイロード及び抗体を、１：２のモル比（化合物対抗体）まで、上下のピペッティングにより混合し、１５分間にわたり室温でインキュベートした。

【0748】

或いは、ハプテン化化合物は、１０mg/mlの最終濃度まで１００%ＤＭＦ中に溶解した。抗体を、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．２）中で、１０mg/mlの最終濃度まで濃縮した。ハプテン化化合物及び抗体を、２．５：１のモル比（化合物対抗体）まで、上下のピペッティングにより混合し、６０分間にわたり室温及び３５０rpmでインキュベートした。
ハプテン化蛍光色素及び抗ハプテン抗体の複合体の形成のための例示的な方法−非共有結合ジゴキシゲニンＣｙ５複合体

【0749】

ヒト化及びマウス抗ジゴキシゲニン抗体又は二重特異性抗ジゴキシゲニン抗体誘導体を、抗体成分として使用した。抗ジゴキシゲニン抗体を伴うジゴキシゲニン化Ｃｙ５の複合体の生成のために、Ｃｙ５ジゴキシゲニンコンジュゲートを、０．５mg/mlの最終濃度までＰＢＳ中に溶解した。抗体を、２０mMヒスチジン及び１４０mM ＮａＣｌで構成される緩衝液（ｐＨ６）中で１mg/ml（約５μM）の濃度で使用した。ジゴキシゲニン化Ｃｙ５及び抗体を、２：１モル比（ジゴキシゲニン化Ｃｙ５対抗体）で混合した。この手順によって、定義された組成の複合体の均質な調製物がもたらされた。

【0750】

複合体形成反応は、サイズ排除カラム上の抗体会合フルオロフォアの蛍光（６５０／６６７nm）を決定することによりモニターすることができる。これらの実験の結果は、抗体が、ジゴキシゲニンについての結合特異性を含む場合、複合体形成だけが生じることを実証する。ジゴキシゲニンについての結合特異性を伴わない抗体は、ジゴキシゲニンＣｙ５コンジュゲートに結合しない。増加シグナルが、ジゴキシゲニンＣｙ５コンジュゲート対抗体比２：１まで、二価抗ジゴキシゲニン抗体について観察することができる。その後、組成依存性蛍光シグナルが、プラトーに達する。
ハプテン化蛍光色素及び抗ハプテン抗体の複合体の形成のための例示的な方法−ビオチンＣｙ５／キメラ抗ビオチン抗体（ヒトＩｇＧサブクラス）複合体

【0751】

システイン化リンカーを含むビオチン誘導体化Ｃｙ５（ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５）の複合体の生成のために、０．１６mgのビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５を、１０mg/mlの濃度まで、１００%ＤＭＦ中に溶解した。１ｍｇの抗体を、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡで構成される緩衝液（ｐＨ ８．２）中に、１０．１mg/ml（約６９μM）の濃度で使用した。ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５及び抗体を、２．５：１モル比（ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５対抗体）で混合し、３５０rpmで振盪しながら、６０分間にわたり室温でインキュベートした。結果として得られたコンジュゲートを、実施例１１ａに記載する通りに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。蛍光の検出を、実施例１１ａに記載する通りに行った。
ビオチン化蛍光色素及び抗ビオチン抗体のコンジュゲートの形成のための例示的な方法−ビオチン−Ｓｅｒ−Ｃｙ５／ヒト化抗ビオチン抗体：

【0752】

リンカー内にセリン残基を含むビオチン誘導体化Ｃｙ５（ビオチン−Ｓｅｒ−Ｃｙ５の）の複合体の生成のために、０．６１ｍｇのビオチン−Ｓｅｒ−Ｃｙ５を、１０mg/mlの濃度まで、２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中に溶解した。１８．５mgのヒト抗ビオチン抗体を、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡで構成される緩衝液（ｐＨ８．２）中で、１０mg/ml（約６９μM）の濃度で使用した。ビオチン−Ｓｅｒ−Ｃｙ５及び抗体を、２．５：１モル比（ビオチン−Ｓｅｒ−Ｃｙ５対抗体）で混合し、３５０rpmで振盪しながら、６０分間にわたり室温でインキュベートした。サンプルを、次に、１．５ml/分の流速及び移動相として２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）を伴う、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０ハイロードプレップグレードカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーに供した。ピーク画分を回収し、純度について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。色素対抗体比を、（１）波長２８０ｎｍ（タンパク質）及び６５０ｎｍ（Ｃｙ５）でサンプルの吸光度を測定するにより；（２）式：（標識タンパク質／ε（Ｃｙ５）＊タンパク質濃度（Ｍ）のＡ_６５０＝モル色素／モルタンパク質（式中、ε（Ｃｙ５）＝２５００００Ｍ^−１ｃｍ^−１、複合体のＡ_６５０＝４７．０、及びタンパク質濃度は８６．６７μMである）を使用することにより計算した。結果として得られる抗体分子への色素の比率は２．１７であったが、それは、全ての抗体パラトープが、ビオチン−Ｃｙ５分子で飽和されていることを示す。
ハプテン化ポリペプチド及び抗ハプテン抗体の複合体の形成のための例示的な方法−ジゴキシゲニンＰＹＹ（３−３６）／抗ジゴキシゲニン抗体複合体

【0753】

抗ジゴキシゲニン抗体を伴うジゴキシゲニン化ポリペプチドの非共有結合複合体の生成のために、マウスハイブリドーマ由来抗体（１０mM ＫＰＯ_４、７０mM ＮａＣｌからの凍結乾燥物；ｐＨ７．５）を、１２mlの水中に溶解し、２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ ６．０）を含む溶液に対して透析し、１１mlの緩衝液中で、３００mg（２×１０^−６モル）をもたらした（ｃ＝２７．３mg/ml）。ジゴキシゲニンＰＹＹ（３−３６）コンジュゲート（１１．５７mg、４×１０^−６モル、２当量）を、１時間以内に２．８５mgの４部分で加え、１時間にわたり室温でインキュベートした。複合体化反応の完了後、複合体を、Superdex20026/60 GLカラム（３２０ml）を介したサイズ排除クロマトグラフィーにより、２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中で２．５ml/分の流速で精製した。溶出された複合体は、４ｍｌの画分中に回収し、プールし、０．２μMフィルター上で滅菌し、１４．３mg/mlの濃度で２３４mgの複合体を与えた。同様の様式で、ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体の複合体の生成のために、抗体を、２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中で、１０．６mg/ml（０．９３ｍｌ中の９．８１ｍｇ、６．５×１０^−８モル）の濃度に調整した。０．５７mg＝１．９７×１０^−７モル＝３．０３等量のジゴキシゲニン化ポリペプチド（ＤＩＧ−ＰＹＹ）を、凍結乾燥物として抗体溶液に加えた。ポリペプチド及び抗体を、１．５時間にわたり室温でインキュベートした。過剰なポリペプチドを、Superose 6 10/300 GLカラムを介したサイズ排除クロマトグラフィーにより、２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中で０．５ml/分の流速で除去した。溶出された複合体を、０．５mlの画分中に回収し、プールし、０．２μMフィルター上で滅菌し、１．８６mg/mlの濃度で４．７mgの複合体を与えた。

【0754】

結果として得られたハプテン化ポリペプチド−抗ハプテン抗体複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて単一のピークの発生を介した単量体ＩｇＧ様分子として定義した。結果として得られた複合体は、抗体分子当たり２つのジゴキシゲニンＰＹＹ誘導体を保有する、単量体ＩｇＧ様分子として定義した。これらのペプチド複合体の定義された組成は、サイズ排除クロマトグラフィーにより確認されたが、それは、また、タンパク質凝集体の非存在を示した。これらの二重特異性ペプチド複合体の定義された組成（及び２：１ポリペプチド対タンパク質比率）は、さらに、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ（サイズ排除クロマトグラフィー−多角度光散乱）により確認された。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析のために、１００〜５００μgのそれぞれのサンプルを、移動相として１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて、０．２５〜０．５ml/分の流速でSuperdex 20010/300 GLサイズ排除カラムに適用した。光散乱を、Wyatt MiniDawn TREOS/QELS検出器を用いて検出し、屈折率を、Wyatt Optilab rEX検出器を用いて測定した。結果として得られたデータを、ソフトウェアＡＳＴＲＡ（バージョン５．３．４．１４）を使用して分析した。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析の結果は、複合体の質量、半径、及びサイズに関する情報を提供する。これらのデータを、対応する非複合体化抗体のデータと比較した。これらの実験の結果は、抗ジゴキシゲニン抗体へのジゴキシゲニン−ＰＹＹの曝露によって、１つの抗体分子当たり２つのジゴキシゲニンＰＹＹ誘導体を含む複合体がもたらされることを実証する。このように、ジゴキシゲニン化ＰＹＹは、定義された部位（結合領域）で、定義された化学量論を伴い、抗ジゴキシゲニン抗体と複合体化することができる。

【0755】

表面プラズモン共鳴試験による複合体の特徴付けによって、複合体化反応が、定義された、完全に複合体化された分子を生成するとの追加の証拠が提供された。抗ジゴキシゲニン抗体は、シグナル増加をもたらすＳＰＲチップに結合させることができる。ジゴキシゲニンＰＹＹコンジュゲートのその後の添加によって、全ての結合部位が完全に占有されるまで、さらなるシグナル増加がもたらされる。これらの条件で、より多くのジゴキシゲニンＰＹＹの添加によって、シグナルは更に増加されない。これは、複合体化反応が特異的であること、及び、そのシグナルが、ジゴキシゲニン化ポリペプチドの非特異的粘着性により起こされないことを示す。
ハプテン化ポリペプチド及び抗ハプテン抗体の複合体の形成のための例示的な方法−Ａｃ−ＰＹＹ−ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−β−Ａｌａ−Ｂｉｏｔ／キメラ抗ビオチン抗体複合体

【0756】

システイン化リンカーを含むビオチン化ＰＹＹポリペプチドの非共有結合複合体の生成のために、０．１９mgのＡＣ−ＰＹＹ−ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＳＳ−ＡＬＡ−Ｂｉｏｔを、１０mg/mlの濃度で、１００%ＤＭＦ中に溶解した。抗体を、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．２）で構成される緩衝液中に、１０．７mg/ml（約７３μM）の濃度で使用した。Ａｃ−ＰＹＹ−ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−β−Ａｌａ−Ｂｉｏｔ及び抗体を２．５：１モル比（Ａｃ−ＰＹＹ−ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−β−Ａｌａ−Ｂｉｏｔ対抗体）で混合し、室温及び３５０rpmで、６０分間にわたりインキュベートした。結果として得られた複合体を、サイズ排除クロマトグラフィーにおける単一ピーク（９５%単量体）の発生を介した単量体ＩｇＧ様分子として定義した。結果として得られた複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びその後のウエスタンブロット分析により更に分析した。１０μgの複合体を、４×ＬＤＳサンプル緩衝液（Invitrogen）と混合し、５分間にわたり９５℃でインキュベートした。サンプルを、４〜１２%ビス−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（NuPAGE、Invitrogen）に適用し、それは、２００V及び１２０mAで、３５分間にわたり泳動された。ポリアクリルアミドゲル中で分離された分子を、２５V及び１６０mAで、４０分間にわたりＰＶＤＦメンブレン（０．２μM孔径、Invitrogen）にトランスファーした。メンブレンを、１×ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ＋０．１%Tween20）中の１%（ｗ／ｖ）スキムミルク中で、室温で１時間にわたりブロックした。メンブレンを、１×ＰＢＳＴ中で５分間にわたり３回洗浄し、その後、ストレプトアビジン‐ＰＯＤコンジュゲート（２９００Ｕ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ）（１：２０００希釈で使用した）とインキュベートした。メンブレン上のビオチンに結合したストレプトアビジン‐ＰＯＤの検出は、Lumi-Light Western Blotting Substrate（Roche）を使用して行った。
ハプテン化ポリペプチド及び抗ハプテン抗体の複合体の形成のための例示的な方法−Ａｃ−ＰＹＹ−ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔ／キメラ抗ビオチン抗体複合体

【0757】

システイン化リンカーを含むビオチン化ＰＹＹポリペプチドの非共有結合複合体の生成のために、０．１６mgのＡｃ−ＰＹＹ−ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔを、１０mg/mlの濃度に、１００%ＤＭＦ中で溶解した。抗体を、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．２）で構成される緩衝液中で、１０．７mg/ml（約７３μM）の濃度で使用した。ＡＣ−ＰＹＹ−ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔ及び抗体を２．５：１のモル比（Ａｃ−ＰＹＹ−ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔ対抗体）で混合し、室温及び３５０rpmで、６０分間にわたりインキュベートした。結果として得られた複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーを介した、６３%単量体ＩｇＧ様分子及び３７%二量体可溶性凝集体として定義した。結果として得られた複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びその後のウエスタンブロット分析により更に分析した。１０μgの複合体を、４×ＬＤＳサンプル緩衝液（Invitrogen）と混合し、５分間にわたり９５℃でインキュベートした。サンプルを、４〜１２%ビス−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（ＮｕＰＡＧＥ、Invitrogen）に適用し、それは、２００Ｖ及び１２０ｍＡで、３５分間にわたり泳動された。ポリアクリルアミドゲル中で分離された分子を、２５Ｖ及び１６０ＭＡで、４０分間にわたりＰＶＤＦメンブレン（０．２μM孔径、Invitrogen）にトランスファーした。メンブレンを、１×ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ＋０．１%Tween20）中の１%（ｗ／ｖ）スキムミルク中で、室温で１時間にわたりブロックした。メンブレンを、１×ＰＢＳＴ中で５分間にわたり３回洗浄し、その後、ストレプトアビジン‐ＰＯＤコンジュゲート（２９００U/ml、Roche）（１：２０００希釈で使用した）とインキュベートした。メンブレン上のビオチンに結合したストレプトアビジン‐ＰＯＤの検出は、Lumi-Light Western Blotting Substrate（Roche）を使用して行った。
ハプテン化ポリペプチド及び抗ハプテン抗体の複合体の形成のための例示的な方法−Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−５−Ｆｌｕｏ）／キメラ抗フルオレセイン抗体複合体

【0758】

システイン化リンカーを含むフルオレセイン結合−ＰＹＹポリペプチドの非共有結合複合体の生成のために、０．３３mgのＡＣ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−５−Ｆｌｕｏ）を、１０mg/mlの濃度に、１００%ＤＭＦ中に溶解した。抗体を、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡで構成される緩衝液（ｐＨ ８．２）中に、９．９９mg/ml（約６８μM）の濃度で使用した。Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−５−Ｆｌｕｏ及び抗体を、２．５：１モル比（Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−５−Ｆｌｕｏ）対抗体）で混合し、室温及び３５０rpmで、６０分間にわたりインキュベートした。結果として得られた複合体を、サイズ排除クロマトグラフィーを介した７６%単量体ＩｇＧ様分子及び２４%二量体可溶性凝集体として定義した。結果として得られた複合体を、ポリアクリルアミドゲル中でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びフルオレセイン関連蛍光のその後の検出により、更に分析した。８μｇの複合体を、４×ＬＤＳサンプル緩衝液（Invitrogen）と混合し、５分間にわたり９５℃でインキュベートした。フルオレセイン関連蛍光を、６４５ｎｍの励起波長でＬｕｍｉＩｍａｇｅｒ Ｆ１装置（Ｒｏｃｈｅ）を使用して記録した。

【0759】

実施例１１
酸化還元剤の存在における抗ハプテン抗体ＶＨ５２ｂＣ／ＶＨ５３Ｃを伴う、ハプテン化色素又はポリペプチドの定義された共有結合コンジュゲートの生成
ハプテン化蛍光色素及び抗ハプテン抗体のコンジュゲートの形成のための例示的な方法−Ｄｉｇ−Ｃｙｓ−Ａｈｘ−Ｃｙ５／抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣ

【0760】

システイン−リンカーを含む、抗ハプテン抗体及びハプテン化蛍光色素の共有結合コンジュゲートの生成によって、定義されたコンジュゲートがもたらされ、それにおいて、ジスルフィド架橋が、抗ハプテン抗体のＣＤＲ２中のＶＨ５２ｂＣと、ハプテンと蛍光色素の間のリンカー中のシステインの間の特定の位置で形成される。コンジュゲーション反応は、酸化還元試薬の存在において行った。Ｄｉｇ−Ｃｙｓ−Ａｈｘ−Ｃｙ５を、２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中に溶解した。可溶化は、１０%（ｖ／ｖ）酢酸の滴下添加により促進された。最終濃度を０．４mg/mlに調整した。２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中の抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣを、１０mg/mlの濃度にした。抗ジゴキシゲニン抗体を、対照として使用し、抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣと同じ方法で処理した。４．７ｎｍｏｌの各々の抗体を、２．５モル当量のＤｉｇ−Ｃｙｓ−Ａｈｘ−Ｃｙ５と混合した。これは、１１．７ｎｍｏｌのこの物質を、４部分（各々２．９ｎｍｏｌ）中に１５分毎に加えることにより達成した。これらの添加の間に、サンプルを、穏やかに振盪しながら、２５℃でインキュベートした。最後の部分の添加後、０．６４ｎｍｏｌの各々の抗体−Ｄｉｇ−Ｃｙｓ−Ａｈｘ−Ｃｙ５複合体を、以下の酸化還元試薬を含む緩衝液に移した：３mM ＤＴＥ（ジチオエリスリトール）＋１０mM ＧＳＳＧ（酸化グルタチオン）、０．３mM ＤＴＥ＋１mM ＧＳＳＧ、及び０．０３mM ＤＴＥ＋０．１mM ＧＳＳＧ。全てのサンプルを、これらの条件において１５分間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを半分に分け（各々０．３４ｎｍｏｌ）、ＳＤＳゲル電気泳動のために調製した。このために、４×ＬＤＳサンプル緩衝液（Invitrogen）を加えた。各々のサンプルについて、また、還元バージョンを、１０×ＮｕＰＡＧＥサンプル還元剤（Invitrogen）を加えることにより調製した。全てのサンプルを、１×ＭＯＰＳ緩衝液（Invitrogen）を用いた４〜１２%ビス−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（ＮｕＰＡＧＥ、Invitrogen）での電気泳動の前に、５分間にわたり７０℃でインキュベートした。ゲル中のＣｙ５関連蛍光を、６４５ｎｍの励起波長で、ＬｕｍｉＩｍａｇｅｒ Ｆ１装置（Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出した。蛍光の検出後、ゲルを、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Invitrogen）を用いて染色した。ゲルを図８に示す。

【0761】

部位特異的なジスルフィド結合形成が、ＣＤＲ２中のシステインを伴わない抗ジゴキシゲニン抗体を使用した場合（レーン２ Ａ〜Ｃ）、低バックグラウンドの蛍光シグナルを伴い、抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣについて示された（図８、上部のゲル、レーン１ Ａ〜Ｃ）。対照反応におけるバックグラウンドシグナルは、通常、抗体−鎖間ジスルフィド結合の形成において含まれるシステインへのＤｉｇ−Ｃｙｓ−Ａｈｘ−Ｃｙ５のカップリングにより説明することができる。酸化還元試薬の増加量によって、抗体の重鎖及び軽鎖を接続するジスルフィド架橋が実質的に低下され、主に3/4抗体（− １ｘ ＬＣ）、ＨＣ二量体（− ２ｘ ＬＣ）、及び1/2抗体（１ｘ ＨＣ ＋ １ｘ ＬＣ）を産生する。ゲルの下部では、抗体に共有結合的に連結されていないＤｉｇ−Ｃｙｓ−Ａｈｘ−Ｃｙ５の蛍光を検出することができる。図８の下部のゲルは、そのサンプルの還元時に、Ｃｙ５関連蛍光は、抗体の重鎖及び軽鎖の近くに検出可能ではなく、共有結合的な連結がジスルフィド架橋により実際に形成されたことを示す。各々のゲルのクーマシー染色は、各々のレーンにおけるタンパク質の総量が等しかったことを示す。
ハプテン化蛍光色素及び抗ハプテン抗体のコンジュゲートの形成のための例示的な方法−Ｄｉｇ−Ｃｙｓ−Ｃｙ５／抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣ

【0762】

Ｄｉｇ−Ｃｙｓ−Ｃｙ５を、３．２５mg/mlの最終濃度に、８．３mM ＨＣｌ、１０%（ｖ／ｖ）ＤＭＦ中に溶解した。２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ ６．０）中の抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣ抗体を、１５mg/mlの濃度にした。抗ジゴキシゲニン抗体を、対照として使用し、抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣと同じ方法で処理した。１３．３ｎｍｏｌの各々の抗体を、１０mg/mlの最終抗体濃度で、１mM ＧＳＨ（還元型グルタチオン）及び５mm ＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）の存在において、２モル当量のＤｉｇ−Ｃｙｓ−Ｃｙ５と混合した。これは、２６．６ｎｍｏｌのこの物質を、２部分中に５分毎に加えることにより達成した。これらの添加の間に、サンプルを、穏やかに振盪しながら、室温でインキュベートした。最後の部分の添加後、サンプルを室温で１時間にわたりインキュベートした。カップリング反応の効率を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣｙ５関連蛍光シグナルのその後の記録により評価した。５、１０、及び２０μgの各々のサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために調製した。このために、４×ＬＤＳサンプル緩衝液（Invitrogen）を加えた。全てのサンプルを、１×ＭＯＰＳ緩衝液（Invitrogen）を用いた４〜１２%ビス−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（ＮｕＰＡＧＥ、Invitrogen）での電気泳動の前に、５分間にわたり７０℃でインキュベートした。ゲル中のＣｙ５関連蛍光を、６４５ｎｍの励起波長で、ＬｕｍｉＩｍａｇｅｒ Ｆ１装置（Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出した。蛍光の検出後、ゲルを、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Invitrogen）を用いて染色した。
ハプテン化ポリペプチド及び抗ハプテン抗体のコンジュゲートの形成のための例示的な方法−ＰＥＧ３−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−Ｄｉｇ）／ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣ

【0763】

システイン化リンカーを含むジゴキシゲニン誘導体化ＰＹＹポリペプチドのコンジュゲートの生成のために、１．４mgのＰＥＧ３−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−ＤＩＧ）を、１０mg/mlの濃度に１００%ＤＭＦ中に溶解した。１ｍｇの抗体を、５mm ＴｒｉｓＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＧＳＨ、５mm ＧＳＳＧ（ｐＨ８．２）で構成される緩衝液中に１０mg/ml（約６８μM）の濃度で使用した。ＰＥＧ３−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−Ｄｉｇ）及び抗体を、２：１モル比（ＰＥＧ３−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−Ｄｉｇ）対抗体）で混合し、１００rpmで撹拌しながら、室温で６０分間にわたりインキュベートした。結果として得られたコンジュゲートを質量分析により分析した。検出された種の４３%が、２つのポリペプチド分子にカップリングされた抗体として同定され、４６%が、１つのポリペプチド分子にカップリングされた抗体であり、１１%が、非カップリング抗体として同定された。

【0764】

実施例１２
酸化還元剤の非存在における抗ハプテン抗体ＶＨ５２ｂＣ／ＶＨ５３Ｃを伴うハプテン色素及びポリペプチドの定義された共有結合コンジュゲートの生成

【0765】

共有結合抗ハプテン抗体／ハプテン化ポリペプチド又はハプテン化色素ジスルフィド連結コンジュゲートの生成のために、（ｉ）ハプテン（例、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ビオチン、又はテオフィリン）を、リンカーを含む適切な反応基（例えばシステイン、マレイミドなど）を介して、抗体表面上に曝露され、それが保持されることを可能にするポリペプチド又は色素にカップリングさせ、及び（ｉｉ）ポリペプチドの生物学的活性が保持されているシステイン変異を伴う抗ハプテン抗体（＝抗体ＶＨ５２ｂＣ／ＶＨ５３Ｃ）を用いて、ハプテン化ポリペプチドの共有結合性の部位特異的コンジュゲートを生成し、及び（ｉｉｉ）抗体鎖間ジスルフィド架橋の還元を避けるために、還元剤の非存在において反応を行うことが必要である。
一般的な方法：

【0766】

ハプテン化化合物を伴う抗ハプテン抗体のコンジュゲートの生成によって、定義された化学量論を伴うコンジュゲートがもたらされるものとし、これらのコンジュゲート中の化合物が、その活性を保持することを保証しなければならない。それぞれの抗ハプテン抗体を伴うハプテン化化合物のコンジュゲートの生成のために、ハプテン化化合物を、１０mg/mlの最終濃度に、１００%ＤＭＦ中に溶解した。抗ハプテン抗体ＶＨ５２ｂＣ／ＶＨ５３Ｃを、５０mMＴｒｉｓＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．２）中で１０mg/mlの濃度にした。ハプテン化化合物及び抗ハプテン抗体ＶＨ５２ｂＣ／ＶＨ５３Ｃを、２．５：１モル比（化合物対抗体）で、上下のピペッティングにより混合し、６０分間にわたり室温及び３５０rpmでインキュベートした。

【0767】

システインを含むリンカーを介してハプテンにコンジュゲーションされたポリペプチドを、以下においてハプテン−Ｃｙｓポリペプチド又はポリペプチドＣｙｓ−ハプテンと呼ぶ。ポリペプチドは、遊離Ｎ末端又はキャップＮ末端のいずれかを有し得る（例、アセチル基（ＡＣ−ポリペプチドＣｙｓ−ハプテン）又はＰＥＧ残基（ＰＥＧポリペプチドＣｙｓ−ハプテンを伴う）。

【0768】

システイン含有リンカーを介してハプテンにコンジュゲーションされた蛍光色素は、以下において、色素Ｃｙｓハプテン又はハプテンＣｙｓ色素と呼ぶ。
ハプテン化蛍光色素及び抗ハプテン抗体のコンジュゲートの形成のための例示的な方法−Ｄｉｇ−Ｃｙｓ−Ａｈｘ−Ｃｙ５／抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣ

【0769】

サンプルを、実施例１１ａに記載する通りに正確に調製し、抗体Ｄｉｇ−Ｃｙｓ−Ａｈｘ−Ｃｙ５複合体を、酸化還元化合物、０．１mM ＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）、又は１mM ＧＳＳＧのいずれかを含まない緩衝液に移すという差を伴った。結果として得られた蛍光スキャンされ、クーマシー染色されたポリアクリルアミドゲルを図９に示す。全ての３つの条件が、部位特異的なジスルフィド結合形成について、類似の特異性を示し（図９、上部ゲル、レーン１ Ａ〜Ｃ）、低レベルのバックグラウンド反応を伴う（図９、レーン２Ａ〜Ｃ）。これによって、ジスルフィド結合の形成が、還元剤の必要を伴わずに達成することができることが確認される。これによって、抗体が有意に安定化される／抗体崩壊が低下される。なぜなら、3/4抗体（− １×ＬＣ）、ＨＣ二量体（− ２×ＬＣ）、及び1/2抗体（１ｘ ＨＣ ＋ １ｘ ＬＣ）の残留量だけが、実施例１１との比較において検出される。
ハプテン化蛍光色素及び抗ハプテン抗体のコンジュゲートの形成のための例示的な方法−Ｄｉｇ−Ｃｙｓ−Ｃｙ５／抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣ

【0770】

サンプルを、実施例１１ｂに記載する通りに正確に調製し、１３．３ｎｍｏｌの抗体を、２モル等量のＤｉｇ−Ｃｙｓ−Ｃｙ５と１０mg/mlの最終抗体濃度で、酸化還元試薬の非存在において混合するという差を伴った。
ハプテン化蛍光色素及び抗ハプテン抗体のコンジュゲートの形成のための例示的な方法−ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５／キメラ抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃ

【0771】

システイン化リンカーを含むビオチン誘導体化Ｃｙ５のコンジュゲートの生成のために、０．１６mgのビオチンＣｙｓ−Ｃｙ５を、１０mg/mlの濃度に、１００%ＤＭＦ中に溶解した。１ｍｇの抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃを、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．２）で構成される緩衝液中で、９．７mg/ml（約６８μM）の濃度で使用した。ビオチンＣｙｓ−Ｃｙ５及び抗体を、２．５：１モル比（ＡＣ−ビオチンＣｙｓ−Ｃｙ５対抗体）で混合し、３５０rpmで振盪しながら、室温で６０分間にわたりインキュベートした。結果として得られたコンジュゲートを、実施例１１ａに記載する通り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。蛍光の検出を、実施例１１ａに記載する通りに行った。
ハプテン化蛍光色素及び抗ハプテン抗体のコンジュゲートの形成のための例示的な方法−ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５／ヒト化抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃ

【0772】

システイン化リンカーを含むビオチン誘導体化Ｃｙ５のコンジュゲートの生成のために、０．１６mgのビオチンＣｙｓ−Ｃｙ５を、１０mg/mlの濃度に、１００%ＤＭＦ中に溶解した。１ｍｇのヒト抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃを、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．２）で構成される緩衝液中で７．４mg/ml（約５１μM）の濃度で使用した。ビオチンＣｙｓ−Ｃｙ５及び抗体を、２．５：１のモル比（ＡＣ−ビオチンＣｙｓ−Ｃｙ５対抗体）で混合し、３５０rpmで振盪しながら、室温で６０分間にわたりインキュベートした。結果として得られたコンジュゲートを、実施例１１ａに記載する通り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。蛍光の検出を、実施例１１ａに記載する通りに行った。
ハプテン化ポリペプチド及び抗ハプテン抗体のコンジュゲートの形成のための例示的な方法−Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−Ｄｉｇ）／ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣ

【0773】

システイン化リンカーを含むジゴキシゲニン誘導体化ＰＹＹポリペプチドのコンジュゲートの生成のために、２．４mgのＡＣ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−ＤＩＧ）を、５mg/mlの濃度に、２０%酢酸中に溶解した。１０mgのヒト化抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣ（６８．４ｎｍｏｌ）を、２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）で構成される緩衝液中に１９．５mg/ml（約１３３μM）の濃度で使用した。Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−Ｄｉｇ）及び抗体を、２：１モル比（Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−Ｄｉｇ）対抗体）で混合し、１００rpmで撹拌しながら、室温で６０分間にわたりインキュベートした。結果として得られたコンジュゲートを質量分析により分析した。検出された種の７．４%が、２つのペプチド分子にカップリングされた抗体として同定され、４０%が、１つのペプチド分子にカップリングされた抗体であり、５２%が、非カップリング抗体として同定された。
ハプテン化ポリペプチド及び抗ハプテン抗体のコンジュゲートの形成のための例示的な方法−Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−βＡｌａ−Ｂｉｏｔ）／キメラ抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃ

【0774】

システイン化リンカーを含むビオチン誘導体化ＰＹＹポリペプチドのコンジュゲートの生成のために、０．１９mgのＡｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−βＡｌａ−Ｂｉｏｔ）を、１０mg/mlの濃度に、１００%ＤＭＦ中に溶解した。１mgのキメラ抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃを、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．２）で構成される緩衝液中に９．７mg/ml（約６７μM）の濃度で使用した。Ａｃ−ＰＹＹ［ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−βＡｌａ−Ｂｉｏｔ及び抗体を、２．５：１モル比（Ａｃ−ＰＹＹ［ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−βＡｌａ−Ｂｉｏｔ］対抗体）で混合し、３５０rpmで撹拌しながら、室温で６０分間にわたりインキュベートした。結果として得られたコンジュゲートを質量分析により分析した。検出された種の８７．７%が、２つのペプチド分子にカップリングされた抗体として同定され、１２．３%が、１つのペプチド分子にカップリングされた抗体として同定された。
ハプテン化ポリペプチド及び抗ハプテン抗体のコンジュゲートの形成のための例示的な方法−Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔ）／キメラ抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃ

【0775】

システイン化リンカーを含むビオチン誘導体化ＰＹＹポリペプチドのコンジュゲートの生成のために、０．１６mgのＡｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔ）を、１０mg/mlの濃度に、１００%ＤＭＦ中に溶解した。１ｍｇのキメラ抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃを、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．２）で構成される緩衝液中に９．９mg/ml（約６８μM）の濃度で使用した。Ａｃ−ＰＹＹ［ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔ及び抗体を、２．５：１モル比（Ａｃ−ＰＹＹ［ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔ対抗体）で混合し、３５０rpmで撹拌しながら、室温で６０分間にわたりインキュベートした。結果として得られたコンジュゲートを質量分析により分析した。検出された種の１００%が、２つのペプチド分子にカップリングされた抗体として同定された。
ハプテン化ポリペプチド及び抗ハプテン抗体のコンジュゲートの形成のための例示的な方法−Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−βＡｌａ−Ｂｉｏｔ）／ヒト化抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃ

【0776】

システイン化リンカーを含むビオチン誘導体化ＰＹＹポリペプチドのコンジュゲートの生成のために、０．０６mgのＡｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−βＡｌａ−Ｂｉｏｔ）を、１０mg/mlの濃度に、１００%ＤＭＦ中に溶解した。０．８ｍｇのヒト化抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃを、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．２）で構成される緩衝液中に９mg/ml（約６２μM）の濃度で使用した。Ａｃ−ＰＹＹ［ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−βＡｌａ−Ｂｉｏｔ及び抗体を、２．５：１モル比（Ａｃ−ＰＹＹ［ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−βＡｌａ−Ｂｉｏｔ対抗体）で混合し、３５０rpmで撹拌しながら、室温で６０分間にわたりインキュベートした。結果として得られたコンジュゲートを質量分析により分析した。検出された種の６２．２%が、２つのペプチド分子にカップリングされた抗体として同定され、３３．９%が、１つのペプチド分子にカップリングされた抗体であり、３．９%が、非カップリング抗体として同定された。
ハプテン化ポリペプチド及び抗ハプテン抗体のコンジュゲートの形成のための例示的な方法−Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔ）／ヒト化抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃ

【0777】

システイン化リンカーを含むビオチン誘導体化ＰＹＹポリペプチドのコンジュゲートの生成のために、０．０８mgのＡｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔ）を、１０mg/mlの濃度に、１００%ＤＭＦ中に溶解した。０．８mgのヒト化抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃを、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．２）で構成される緩衝液中に９mg/ml（約６２μM）の濃度で使用した。Ａｃ−ＰＹＹ［ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔ及び抗体を、２：１モル比（Ａｃ−ＰＹＹ［ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔ対抗体）で混合し、３５０rpmで撹拌しながら、室温で６０分間にわたりインキュベートした。結果として得られたコンジュゲートを質量分析により分析した。検出された種の７１．４%が、２つのペプチド分子にカップリングされた抗体として同定され、２６%が、１つのペプチド分子にカップリングされた抗体であり、２．５%が、非カップリング抗体として同定された。
ハプテン化ポリペプチド及び抗ハプテン抗体のコンジュゲートの形成のための例示的な方法−Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｆｌｕｏ）／抗フルオレセイン抗体ＶＨ５２ｂＣ

【0778】

システイン化リンカーを含むビオチン誘導体化ＰＹＹポリペプチドのコンジュゲートの生成のために、０．３３mgのＡｃ−ＰＹＹ［ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｆｌｕｏを、１０mg/mlの濃度に、１００%ＤＭＦ中に溶解した。１mgの抗フルオレセイン抗体ＶＨ５２ｂＣを、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．２）で構成される緩衝液中に９．３mg/ml（約６３μM）の濃度で使用した。Ａｃ−ＰＹＹ［ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｆｌｕｏ及び抗体を、２．５：１モル比（Ａｃ−ＰＹＹ［ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｆｌｕｏ対抗体）で混合し、３５０rpmで撹拌しながら、室温で６０分間にわたりインキュベートした。結果として得られたコンジュゲートを質量分析により分析した。検出された種の９５%が、２つのペプチド分子にカップリングされた抗体として同定され、５%が、１つのペプチド分子にカップリングされた抗体として同定された。
ハプテン化ポリペプチド及び抗ハプテン抗体のコンジュゲートの形成のための例示的な方法−Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｆｌｕｏ）／抗フルオレセイン抗体ＶＨ２８Ｃ

【0779】

システイン化リンカーを含むビオチン誘導体化ＰＹＹポリペプチドのコンジュゲートの生成のために、０．３３mgのＡｃ−ＰＹＹ［ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｆｌｕｏを、１０mg/mlの濃度に、１００%ＤＭＦ中に溶解した。１mgの抗フルオレセイン抗体ＶＨ２８Ｃを、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．２）で構成される緩衝液中に９．５mg/ml（約６３μM）の濃度で使用した。Ａｃ−ＰＹＹ［ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｆｌｕｏ及び抗体を、２．５：１モル比（Ａｃ−ＰＹＹ［ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２−Ｆｌｕｏ］対抗体）で混合し、３５０rpmで撹拌しながら、室温で６０分間にわたりインキュベートした。結果として得られたコンジュゲートを質量分析により分析した。検出された種の１００%が、２つのペプチド分子にカップリングされた抗体として同定された。

【0780】

実施例１３
共有結合テオフィリン抗テオフィリン抗体複合体の生成

【0781】

テオフィリン及びテオフィリン結合抗体をハプテン認識システムとして利用する共有結合抗体複合体の形成を評価するために、テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５を、一般的に、ジゴキシゲニンＣｙｓ−Ｃｙ５又はビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５について記載されている合成及び精製技術を適用し（ハプテンが、テオフィリンに対して交換されていることを除く）、蛍光ペイロードとして生成した（実施例８並びに図１３、１４、及び２２を参照のこと）。合成されたテオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５誘導体の組成を、図４３ａ）に示す。共有結合ジスルフィドの形成を実証するために、テオフィリン結合抗体を生成し、それらは、重鎖可変領域の位置５４又は５５で、設計されたＣｙｓを含んだ（抗テオフィリン抗体Ｃｙｓ）。これらの抗体の純度を、図４３ｂ）において、Ｙ５４Ｃバリアントについて例示的に示す。これらの抗体誘導体を、テオフィリン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５と複合体化し、その後、実施例１２に記載する通り、非還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。非還元条件下で、ジスルフィド連結抗テオフィリン抗体複合体化Ｃｙ５を、実施例１２に記載するのと同じ様式で、ゲル内のそのＨ鎖関連蛍光により検出した。これを図４３ｃに描写し、それは、抗体間の共有結合複合体が、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、又はビオチンをハプテンとして使用した場合に観察されたジスルフィドと同じ様式で、単純なローディング反応の結果として形成されていたことを実証する。これらの複合体は、還元時に予測通りに会合し、即ち、ジスルフィドが還元された時だけ、Ｈ鎖からペイロードを放出した（図４３ｃ）。

【0782】

実施例１４
インビボ様条件下での共有結合ハプテン−抗体複合体の生成、及びインビボでの有向ジスルフィド形成についての証拠

【0783】

インビボ様条件下で共有結合ハプテン−抗体複合体の形成を評価するために、抗ビオチン抗体−Ｃｙｓを、ビオチンＣｙｓ−Ｃｙ５を伴うマウス血清中で、６０分間にわたり、３７℃でインキュベートした。その後、抗体を、プロテインＡによりマウス血清から捕捉した。その後、捕捉抗体を、実施例１２に記載する通り、非還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ジスルフィド連結抗体複合体化Ｃｙ５を、実施例１２に記載するのと同じ様式で、ゲル内でＨ鎖関連蛍光により検出した。図４４は、抗体間の共有結合複合体が、３７℃の血清中で、即ち、インビボの条件に似た条件下で形成することを実証する。これらの複合体は、予測通りに、還元時に解離する、即ち、ペイロードは、ジスルフィドが還元された時だけ、Ｈ鎖から放出される（図４４）。ハプテン位置決め時に、抗体とペイロードの間での有向ジスルフィド結合が、血清の存在においてでさえ形成することができるとの観察は、予想外である。なぜなら、血清は、多量のタンパク質、ペプチド、及び他の化合物（それらは、ジスルフィド形成反応に干渉し得る）を含むからである。ハプテン位置決め時に、抗体とペイロードの間での有向ジスルフィド結合が、３７℃の血清中で形成することができるとの観察は、また、プレターゲティング設定において、このＰＫ調節システムを適用する可能性を開く：抗体及びハプテン‐ペイロードの別々の適用、それに続く、抗体複合体のインビボでの組立及びその後のジスルフィド形成。

【0784】

潜在的なインビボでの「プレターゲティング」適用を更に評価するために、ビオチン−Ｃｙ５の薬物動態を、プレターゲティング条件下で、実施例１９に記載する通りの、動物の眼の非侵襲的な光学イメージングにより決定した。これらの実験において、Ｃｙ５の存在を、動物の眼の光学イメージングにより、非侵襲的に決定し、それによって、毛細血管中のＣｙ５の蛍光が明らかになった。本発明者らが、マウスの眼において、ビオチン−Ｃｙ５の注射後１０分に検出したＣｙ５媒介性蛍光値を、１００%値として設定し、その後の時点に測定した蛍光値を、それに対して表した。この実験において、１ｍｇの抗体（抗ビオチン抗体又は抗ビオチン抗体−Ｃｙｓ（＝抗ビオチン抗体のＣｙｓ変異体）のいずれか）を、ビオチン−Ｃｙ５の注射及び眼イメージングの開始前２４時間に適用した。対照群は、抗ビオチン抗体を用いて事前に注射しなかった。

【0785】

これらの実験の結果を図４５に示す：事前に注射された抗体を受けなかった動物中へのビオチン−Ｃｙ５の注射は、低い血清中半減期及び低い曝露レベル（ダイヤモンド）を伴って排除された。抗ビオチン抗体（Ｃｙｓ変異を伴わない）の２４時間の事前の注射を伴う動物中に注射されたビオチン−Ｃｙ５の血清中レベル及び半減期が、大幅に増加した。これは、抗体が、循環中のその抗原（ペイロードを伴う）を捕捉し、抗原の（及び、コンジュゲーションされたペイロードも同様）血清中半減期を延長することを示す。抗ビオチン抗体Ｃｙｓ（即ち、共有結合ペイロードカップリングのための、本明細書において報告するＣｙｓ変異を含む抗体）を用いて２４時間事前に注射された動物中に注射されたビオチンＣｙｓ−Ｃｙ５の相対的な血清中レベル及び半減期が、更に増加された。これらのサンプル中で、相対的なＣｙ５レベルは、非複合体化化合物のものより高いだけでなく、しかし、また、複合体化（しかし、ジスルフィド結合ではない）Ｃｙ５のレベルより高かった。このように、ハプテン複合体化ジスルフィド連結ペイロード（それらは、インビボでのプレターゲティング条件下で形成される）は、循環中で、非共有結合複合体化ペイロードよりも安定であり、より高い曝露レベルに達することができる。

【0786】

実施例１５
抗ハプテン抗体を伴う、コンジュゲート中、及び複合体中のポリペプチドは、機能性を保持する。

【0787】

本発明者らは、非共有結合ハプテン−ポリペプチドコンジュゲートの部分であるポリペプチドが、抗ハプテン抗体を伴う複合体中で機能性を保持することを以前に示している（ＷＯ２０１１／００３５５７、ＷＯ ２０１１／００３７８０、及びＷＯ ２０１２／０９３０６８）。カップリングされたペプチドが、共有結合的なジスルフィドカップリング時にも機能性を保持することを実証するために、抗ジゴキシゲニン抗体複合体化ポリペプチドと、抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣを伴うそれらのジスルフィドコンジュゲートの生物活性を比較した。

【0788】

ＰＹＹ由来ペプチドの治療的に望ましい機能性は、その同族受容体ＮＰＹ２に結合し、そのシグナル伝達に干渉することである。ＮＰＹ２受容体を介したシグナル伝達は、代謝プロセス中に含まれる、及び／又はそれを調節する。

【0789】

抗ジゴキシゲニン抗体を伴うポリペプチドＤｉｇ−ＰＹＹの複合体化若しくはＳＳコンジュゲーション又は抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣを伴うポリペプチドＤｉｇ−Ｃｙｓ−ＰＹＹのコンジュゲーションが、それぞれ、その活性に影響するか否かを評価するために、本発明者らは、ＮＰＹ２受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞におけるフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積を阻害するその能力を評価した（ｃＡＭＰアッセイ）。

【0790】

以下の表６は、ＰＹＹ（３−３６）、そのＹ２受容体特異的改変類似体ｍｏＰＹＹ、その抗体複合体化Ｄｉｇバリアント、及びそのジスルフィドでコンジュゲーションされたＤｉｇ−Ｃｙｓ誘導体の生物学的活性を評価するために実施されたｃＡＭＰアッセイの結果を示す。

【表7】

【0791】

ｃＡＭＰアゴニストアッセイのために、以下の材料を使用した：３８４ウェルプレート、Tropix cAMP-Screen Kit；ｃAMP ELISA System（Applied Biosystems、カタログ＃Ｔ１５０５；ＣＳ２００００）；フォルスコリン（Calbiochemカタログ＃３４４２７０）；細胞：ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＹ２Ｒ；成長培地：ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ、Gibco）；１０%ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Gibco）、熱不活性化；１%ペニシリン／ストレプトマイシン（ペニシリン１００００単位／ｍＬ：ストレプトマイシン１００００mg/ml、Gibco）；５００μg/ml Ｇ４１８（Geneticin、Gibcoカタログ＃１１８１１−０３１）；及びプレーティング培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ｗ／ｏフェノールレッド（Ｇｉｂｃｏ）；１０%ＦＢＳ（Gibco、カタログ＃１００８２−１４７）；熱不活性化；１%ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco、カタログ＃１５１４０−１２２）；５００μg/ml Ｇ４１８（Geneticin、Gibco、カタログ＃１１８１１−０３１）。

【0792】

アッセイを実施するために、最初の日に、培地を捨て、単層細胞を、フラスコ当たり１０mlのＰＢＳ（Ｔ２２５）で洗浄した。ＰＢＳを用いたデカントした後、５ｍＬのＶＥＲＳＥＮＥ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０４００６）を使用し、細胞を除去した（５分間＠３７℃）。フラスコを穏やかにタッピングし、細胞懸濁液をプールした。各々のフラスコを１０mlのプレーティング培地で洗浄し、５分間にわたり１０００rpmで遠心分離した。懸濁液をプールし、カウントした。懸濁液をＨＥＫ２９３／ｈＮＰＹ２Ｒのための２．０×１０^５個細胞/mLの密度でプレーティング培地中に再懸濁した。５０マイクロリットルの細胞（ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＹ２Ｒ − １０，０００個細胞／ウェル）を、マルチドロップディスペンサーを使用して、３８４ウェルプレート中に移した。プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。２日目に、細胞を、７５%〜８５%コンフルエンスについてチェックした。培地及び試薬を室温に戻した。希釈液を調製する前に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Sigma、カタログ＃Ｄ２６５０）中の刺激化合物のストック溶液を、５〜１０分間にわたり３２℃まで温めた。希釈液は、０．５mm ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（IBMX、Calbiochem、カタログ＃４１０９５７）及び０．５mg/ml ＢＳＡを用いてＤＭＥＭ／Ｆ１２中で調製した。刺激培地中の最終ＤＭＳＯ濃度は、５μMのフォルスコリン濃度を伴い、１．１%であった。細胞培地を、ペーパータオル上での細胞プレートの穏やかな反転を伴い、タップオフした。５０μLの刺激培地を、１ウェル当たりに置いた（各々の濃度が４連で行われた）。プレートを室温で３０分間にわたりインキュベートし、細胞を、毒性について顕微鏡下でチェックした。３０分間の治療後、刺激培地を捨て、５０μL/ウェルのAssay Lysis Buffer（Tropixキット中で提供される）を加えた。プレートを、３７℃で４５分間にわたりインキュベートした。２０μLの溶解液を、刺激プレートから、Tropixキットからのプレコーティング抗体プレート（３８４ウェル）中に移した。１０μLのＡＰコンジュゲート及び２０μLの抗ｃＡＭＰ抗体を加えた。プレートを、１時間にわたり振盪しながら、室温でインキュベートした。プレートを、次に、洗浄緩衝液（各々の洗浄について１ウェル当たり７０μL）を用いて５回洗浄した。プレートをタップし、乾燥させた。３０μL／ウェルのＣＳＰＤ／Ｓａｐｐｈｉｒｅ−ＩＩ ＲＴＵ基質／エンハンサー溶液を加え、室温で４５分間にわたりインキュベートした（振盪）。Luminometer（VICTOR-V）中の１秒／ウェルについてのシグナルを測定した。

【0793】

これらのアッセイの結果（表６）は、改変ペプチド誘導体ｍｏＰＹＹが、野生型ＰＹＹよりも無視できる低い活性を有することを示す。ｃＡＭＰアッセイのＩＣ_５０値は、野生型ＰＹＹについて０．０９ｎＭ及び改変類似体について０．１４ｎＭであった。共有結合ジスルフィドコンジュゲーションは、生物学的活性のわずかな低下をもたらした。ＩＣ_５０値は、コンジュゲートについて５〜３６nMであった。驚くべきことに、共有結合ジスルフィドコンジュゲートは、１０．９１nMのＩＣ_５０値を伴う非共有結合複合体よりも２倍活性である。

【0794】

実施例１６
ヒト化抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃを伴うビオチン化Ｃｙ５の共有結合コンジュゲートと比較した、ヒト化抗ビオチン抗体を伴うビオチン化Ｃｙ５の複合体の血清中安定性。

【0795】

記載されるペプチド改変技術の目的は、ペプチドの治療的適用性を改善することある。ペプチドの治療的適用のための主要なボトルネックは、現在、インビボでの限定された安定性並びに／或いは短い血清中半減期及び速いクリアランスである。フルオロフォアの抗体コンジュゲートのＰＫパラメーターを、インビボで決定し、非共有結合抗体−蛍光複合体のＰＫと比較した。したがって、（ｉ）抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃを、共有結合ビオチン化フルオロフォアＢｉｏｔ−Ｃｙｓ−Ｃｙ５に共有結合的にコンジュゲーションし、（ｉｉ）ビオチン化フルオロフォアＢｉｏｔ−Ｃｙｓ−Ｃｙ５を伴う抗ビオチン抗体の非共有結合複合体を生成し、（ｉｉｉ）共有結合及び非共有結合複合体化化合物を動物に投与し、及び（ｉｖ）これらの動物における経時的な化合物の血清中濃度を、Ｃｙ５（Ａ６５０）の蛍光の決定により測定し、対応する抗体の血清中濃度を、ヒト化抗体を特異的に検出するＥＬＩＳＡ方法により測定した。

【0796】

実験手順
小さな蛍光基質の抗体複合体化又は抗体コンジュゲーションのＰＫパラメーターに対する影響を分析するために、１３nmolのＣｙ５−ビオチン／ヒト化抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃコンジュゲート、又は対応する抗体非共有結合複合体化化合物、又は蛍光化合物単独（２０mMヒスチジン／１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ ６．０）中）を、各々の物質について６匹の雌マウス（ＮＭＲＩ系統）に投与した。約０．１mlの血液サンプルを以下の時点後に回収した：第１群におけるマウス１、２、及び３について０．０８時間、４時間、及び４８時間並びに第２群におけるマウス１、２、及び３について０．０８時間、２４時間、及び４８時間。約５０μLの血清サンプルを、１時間後、室温で遠心分離（９３００ ｘ ｇで３分間、４℃）により得た。血清サンプルを−８０℃で保存した。

【0797】

所与の時点での血清中の化合物（フルオロフォア）の量を決定するために、Ｃｙ５の蛍光特性を使用する：血清サンプル中のＣｙ５蛍光は、ケアリーエクリプス蛍光分光光度計（Varian）を使用し、室温で、１２０μL石英キュベット中で測定した。励起波長は６４０nmであり、発光を６６７nmで測定した。血清サンプルを１×ＰＢＳ中で希釈し、発光強度の適切な範囲に達した。それぞれのサンプルとして、１×ＰＢＳ中での同じ希釈における未処置マウスの血清を、ブランクプローブとして使用し、任意の蛍光シグナルを示さなかった。

【0798】

所与の時点での血清中のヒトＩｇＧ抗体の量を決定するために、以下のアッセイ原理を使用した：血清サンプル中のヒトＩｇＧ１抗体を、抗ヒトカッパ鎖モノクローナルＩｇＧ抗体を用いてコーティングされた固相（Maxisorb（登録商標）マイクロタイタープレート、NUNC Immuno（商標））上に捕捉した。血清サンプルを１：１０^５及び１：１０^６希釈し、これらの希釈物の１００μLをウェルに加えた。インキュベーション後、ウェルを、各々、３００μLのＰＢＳ／０．０５%Tween20で３回洗浄した。ヒトＩｇＧ抗体の検出は、０．２５μg/mlの濃度のＣ末端でジゴキシゲニン化された、１００μLの抗ヒトＣ_Ｈ１ドメインＩｇＧを加えることにより行った。各々、３００μLの１×ＰＢＳ／０．０５%Tween20で３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲーションさせた１００μLの抗ジゴキシゲニン抗体Ｆａｂフラグメントを、２５ｍＵ／ｍｌの濃度で加えた。最後に、１ウェル当たり１００μLのＡＢＴＳ（登録商標）を加えた。周囲温度での３０分間のインキュベーション後、吸光度（ＯＤ）を、商業的マイクロタイタープレートＥＬＩＳＡリーダー（例、Tecan Sunrise）において、４０５nm及び４９２nm［４０５／４９２］で測定した。

【0799】

図３４は、抗体−ビオチン-Ｃｙ５複合体及びコンジュゲートで処置したマウスにおけるＢｉｏ−Ｃｙ５血清レベル並びにヒトＩｇＧの血清レベルを示す。データを、注射後５分目の（ピーク）血清レベルに対して標準化された、相対的な（%）ヒトＩｇＧ又は蛍光レベルとして示す。抗体−ハプテン複合体及びコンジュゲートの両方の相対的なヒトＩｇＧ血清レベルは、抗体−ハプテンコンジュゲートについて測定された相対蛍光に沿っている。このように、ビオチン-Ｃｙｓ−Ｃｙ５化合物は、それがコンジュゲートされた抗体と類似のインビボ安定性を示し、それは、抗体−ハプテンコンジュゲートが、インビボで、インタクトで留まることを意味する。これは、明らかに、抗体−ハプテン複合体については該当せず、それについては、相対的なＣｙ５媒介性蛍光が、相対的なヒトＩｇＧ血清レベルよりも速く減少する。これは、複合体が、インビボで、経時的にペイロードを放出することを意味する。

【0800】

要約すると、ハプテン化化合物のインビボでの安定性は、抗ハプテン抗体により結合された場合、有意に増加する。しかし、抗体−ハプテン複合体は、インビボで完全に安定ではない。なぜなら、ハプテン−Ｃｙ５血清レベルの減少は、抗体血清レベルの減少よりも速いからである。これは、抗体−ハプテン−Ｃｙ５コンジュゲートについては該当せず、それは、通常のＩｇＧ抗体と同様のインビボでの挙動を示す。

【0801】

実施例１７
ヒト化抗ジコキシゲニン抗体を伴うジゴキシゲニンＣｙｓ−Ｃｙ５の共有結合コンジュゲートと比較した、ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体を伴うジゴキシゲニン−Ｃｙ５の複合体の血清中安定性。

【0802】

抗体複合体又は抗体コンジュゲートの薬物動態に対する異なるハプテンの影響を分析するために、ジゴキシゲニンＣｙ５を用いて複合体化された、又はジゴキシゲニンＣｙｓ−Ｃｙ５を用いて共有結合的にコンジュゲーションされた抗ジゴキシゲニン抗体のＰＫパラメーターを、インビボで測定した。ビオチンＣｙ５又はビオチンＣｙｓ−Ｃｙ５について記載したのと同じ様式において（実施例１６を参照のこと）、ジゴキシゲニンＣｙ５若しくは抗体−複合体化又は抗体−Ｃｙｓ連結ジゴキシゲニン（Ｃｙｓ）−Ｃｙ５を雌ＮＭＲＩマウスに投与し、０．０８時間、２時間、４時間、及び２４時間での血液の回収が続いた。ジゴキシゲニン（Ｃｙｓ）−Ｃｙ５レベルを、その蛍光を測定することにより決定し、対応する抗体濃度を、実施例１６において記載する通り、ＥＬＩＳＡにより決定した。データを、注射後５分目の（ピーク）血清レベルに対して標準化された、相対的な（%）ヒトＩｇＧ又は蛍光レベルとして図４１に示す。

【0803】

これらの実験の結果によって、ジゴキシゲニンＣｙ５について、適用した蛍光（５分値）の１０%未満が、注射後２時間目に検出可能であったことが実証される。後の時点（それぞれ注射後４時間及び２４時間）で、非複合体化ジゴキシゲニンＣｙ５シグナルは検出可能ではなかった（図４１を参照のこと。両方のグラフ中の灰色の三角）。非複合体化化合物とは対照的に、抗体−複合体化化合物は、ずっと高いレベルで、後の時点で検出可能であった（図４１、上のグラフ）。これは、抗体の複合体形成が、非常に小さい化合物ジゴキシゲニン-Ｃｙ５の血清半減期を増加させることを示す。さらに、共有結合的に連結されたペイロードは、非共有結合的に連結された複合体に比較し、より大きな血清安定性を示す。ジゴキシゲニン-Ｃｙ５レベル及び抗体レベルの直接的な比較によって、経時的な抗体からの複合体化ペイロードの喪失が示され、Ｃｙ５レベルは、抗体レベルよりも早く減少する。対照的に、共有結合的に連結されたジゴキシゲニン-コンジュゲートは、ほぼ同一のＣｙ５及びＩｇＧ血清半減期を示した（図４１、下のグラフ）。これは、ジスルフィド連結ペイロードが、抗体に安定的に接続したままであり、非共有結合複合体が、経時的に解離することを示す。

【0804】

実施例１８
ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体と複合体化したジゴキシゲニン化ポリペプチドの血清中安定性。

【0805】

ジゴキシゲニン化ポリペプチドの抗体複合体化のＰＫパラメーターに対する影響を分析するために、３２．１nmolのポリペプチド、又はジゴキシゲニン化ポリペプチドと対応する抗ジゴキシゲニン抗体の間での３２．１nmolの非共有結合複合体（２０mMヒスチジン／１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ ６．０））を、２匹の雌マウス（ＮＭＲＩ系統）に各々投与した。約０．１mlの血液サンプルを、以下の時点後に回収した：マウス１について０．０８時間、２時間、及び２４時間並びにマウス２について０．０８時間、４時間、及び２４時間。約５０μLの血清サンプルを、１時間後に室温で遠心分離（９３００×ｇ、３分間、４℃）により得た。血清サンプルは−８０℃で保存した。

【0806】

所与の時点での血清中のジゴキシゲニン化ペプチドの量の決定は、Ｄｉｇ−Ｃｙ５の検出に比較し、困難であった。なぜなら、血清サンプル中のポリペプチドを検出するための直接的な手段が、利用可能でなかったためである。したがって、血清中のジゴキシゲニン化ペプチドを検出するためのウエスタンブロット関連アッセイが確立された。第１の工程において、血清サンプルを、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。サンプル調製は、高濃度のＳＤＳ及び還元剤への血清の曝露を含んだため、複合体化Ｄｉｇポリペプチドコンジュゲートは、（完全に変性された／アンフォールドされた）抗ジゴキシゲニン抗体から放出されることができるのに対し、共有結合コンジュゲートは結合したままであった。非共有結合抗体複合体からのポリペプチドの放出を媒介し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより個々の成分を分離するために、２μLの各々の血清サンプルを、１８μLの２０mMヒスチジン／１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中に希釈し、６．７μLの４×ＬＤＳサンプル緩衝液及び３μLの１０×サンプル還元剤（NuPAGE、Invitrogen）と９５℃で５分間にわたり混合した。対照として、同系統の未処置マウスの２μLの血清を使用した。サンプルを、４〜１２%Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（NuPAGE、Invitrogen）に適用し、それを、泳動緩衝液として１×ＭＥＳ（Invitrogen）を使用し、２００V／１２０mAで２０分間にわたり泳動した。その後、分離されたポリペプチドを、XCell Sure Lock（登録商標）Mini-Cellシステム（Invitrogen）を使用し、２５V／１３０mAで４０分間にわたりＰＶＤＦメンブレン（０．２２μM孔径、Invitrogen）上にブロットした。メンブレンを、１×ＰＢＳ ＋ １ %Tween20（ＰＢＳＴ）中の１%スキムミルク中で、室温で１時間にわたりブロッキングした。ジゴキシゲニン化ポリペプチドを、その後、抗ジゴキシゲニン抗体を用いて、メンブレン上で検出した。そのために、抗ジゴキシゲニン抗体を、１０mlの１%脱脂乳／ＰＢＳＴ中の１３μg/mlの濃度で、室温で２時間にわたりメンブレンに適用した。メンブレンを、１×ＰＢＳＴ中で３×５分間にわたり洗浄した。LumiLightPLUSウェスタンブロッティングキット（Roche）からのＰＯＤにカップリングした抗マウスＩｇＧのＦａｂフラグメントを、１０mlの１%スキムミルク／ＰＢＳＴ中の１：２５希釈で、室温で１時間にわたり適用した。メンブレンを、３×５分間、１×ＰＢＳＴで洗浄した。検出を、メンブレンを、４mlのLumiLightウェスタンブロッティング基質中で、室温で５分間にわたりインキュベートすることにより行った。化学発光を、LumiImager F1（Roche）で２０分の曝露時間で検出した。

【0807】

これらの分析の結果を、図３５Ａ及びＢに示す。異なる時点でのマウス血清中のジゴキシゲニンポリペプチドの存在／量を決定している。抗体複合体化ペプチドを受けたマウス（図３５左）が、最も早い時点（投与後５分間）で強いシグナルを示した。これらのシグナルは、対照のブロット上でのサイズ及び位置により示される通り、明らかに割り当て可能であった。抗体−複合体化ポリペプチドで処置したマウスの血清において、ポリペプチド関連シグナルは、早期の時点で最も強く、経時的に減少した。それにもかかわらず、ポリペプチドは、依然として、全ての時点で、及び投与後２４時間でさえ、良好なシグナルを伴い検出可能であった。

【0808】

非複合体ポリペプチドを受けたマウスにおいて、小さなポリペプチドに関連する任意のシグナルは、最も早い時点でさえ、ほとんど検出可能ではなかった。図３５は、右に、通常の曝露条件下で、遊離ポリペプチドが、ブロット上に見えないことを示す。ブロットのコントラスト強調によって、投与後５分で、一部のポリペプチドの存在が（微量だけ）明らかになった。後の時点では、定義されたポリペプチドバンドは、検出可能ではなかった。

【0809】

非複合体ハプテン−Ｃｙ５と同様に、非複合体化ポリペプチドは、マウスの血清中で非常に短い半減期を有することを見ることができる。同じポリペプチドを（しかし、抗体複合体形態において）受けたマウスは、増加した期間にわたり、血清中で、これらのポリペプチドの存在を示す。注射後２４時間、ポリペプチドは、依然として、これらのマウスの血清中で決定することができる。

【0810】

実施例１９
共有結合的に連結されたハプテン−抗体コンジュゲート及び非共有結合複合体の血清中半減期及び曝露レベルのインビボでのリアルタイム測定

【0811】

共有結合的に連結されたハプテン化合物に比較した、非共有結合的に複合体化されたハプテン化合物の薬物動態学的特性を更に分析するために、ビオチンＣｙ５又はビオチンＣｙｓ−Ｃｙ５と対応する抗ビオチン抗体の間での、注射された複合体又はコンジュゲートのインビボ動態を、非侵襲的な光学イメージング技術を通じて決定し、それによって、動物の眼の毛細血管中のＣｙ５蛍光が明らかになった。値を、１０分目の値（１００%として設定した）に対して標準化した。これらの実験の結果を図４２に示す：非複合体化ビオチンＣｙ５は、それ自体が、短い血清中半減期及び低曝露レベルを有する。共有結合的に連結されていなかった抗体複合体化ビオチン−Ｃｙ５は、ずっと高いレベルで、延長した半減期を伴い検出可能であった。共有結合的に連結されたペイロードは、非共有結合的に連結された複合体に比較し、より高い血清レベルにより示される、更に大きな血清中安定性を示した。これらの実験によって、共有結合的にジスルフィド連結されたペイロードが、非共有結合的に複合体化されたペイロードよりも、循環中でより安定であり、より高い曝露レベルに達することができることが確認される。

【0812】

実施例２０
異なるハプテンに結合する抗体のペプチド複合体化及び共有結合的なコンジュゲーション

【0813】

ハプテン化合物（＝ペイロード）を標的化媒体にカップリングさせるためのハプテン結合モジュールの適用は、ハプテン媒介送達を実現することができる１つの技術的可能性である。その概念は、化合物を捕捉し、それらを標的化モジュールに接続する追加のハプテン又は他の実体に拡張することができる。例えば、ポリペプチドの送達又は安定化のために、ジゴキシゲニン又は他のハプテンに結合する単一又は二重特異性抗体を適用し、治療用ポリペプチドを安定化及びＰＫ最適化することができる。

【0814】

ポリペプチド捕捉モジュールとしての適用のための前提条件は、（ｉ）ハプテンへの化合物のカップリングが、ポリペプチド活性に重度に干渉しないこと、及び（ｉｉ）ハプテン化化合物への抗体の効果的な結合／複合体化の可能性である。

【0815】

ハプテン定方向性結合は、抗ハプテンシステイン化抗体を伴う、ハプテン化色素又はポリペプチドの効率的な共有結合的カップリングのための前提条件である。

【0816】

抗ハプテン抗体を伴う、ハプテン化合物の親和性駆動型の複合体化を示すことは、効率的なジスルフィド結合形成のための前提条件であり、ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５を、ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体及びヒト化抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５３Ｃとインキュベートした。ヒト抗ビオチン抗体及びヒト化抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃを伴う、ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５のインキュベーションを、対照反応として行った。

【0817】

０．１３mgのビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５を、１０mg/mlの濃度に、１００%ＤＭＦ中に溶解した。０．７mgの各々の抗体を、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．２）で構成される緩衝液中で、６．７mg/ml（約４６μM）の濃度で使用した。ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５及び抗体を、２．５：１モル比（ＡＣ−ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５対抗体）で混合し、３５０rpmで振盪しながら、室温で６０分間にわたりインキュベートした。結果として得られた複合体／コンジュゲートを、ポリアクリルアミドゲル中でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣｙ５関連蛍光のその後の検出により更に分析した。１５μｇの複合体／コンジュゲートを、４×ＬＤＳサンプル緩衝液（Invitrogen）と混合し、５分間にわたり９５℃でインキュベートした。Ｃｙ５関連蛍光を、６４５nmの励起波長で、LumiImager F1装置（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を使用して記録した。

【0818】

非還元サンプルは、ＣＤＲ２においてシステインを伴わないヒト化抗ビオチン抗体を使用した場合、非常に低いバックグラウンド蛍光シグナルを伴うヒト化抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃ（図３６、レーン４）について、共有結合的な部位特異的ジスルフィド結合形成を示す（図３６、レーン３）。ビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５は、また、ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体を使用した場合（図３６、レーン２）、低いバックグラウンドシグナルを伴い、しかし、有意に低い効率を伴い、ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣ（図３６、レーン２）に共有結合的にカップリングされた。これは、ゲルの下部で検出される過剰なビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５から推定することができる（矢印）。ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣの場合において、ヒト化抗ビオチン抗体ＶＨ５３Ｃ（レーン４）を用いるよりも、有意に多い非カップリングビオチン−Ｃｙｓ−Ｃｙ５を検出することができる（レーン２）。サンプルの還元時、Ｃｙ５関連蛍光は、抗体重鎖及び軽鎖の近くでは検出可能ではなく、共有結合がジスルフィド架橋により実際に形成されたことを示す。各々のゲルのクーマシー染色は、各々のレーンにおけるタンパク質の総量が等しかったことを示す。

【0819】

実施例２１
ハプテン定方向性結合は、抗ハプテンシステイン化抗体を伴う、ハプテン化色素又はポリペプチドの効率的な共有結的カップリングのための前提条件である。

【0820】

抗ハプテン抗体を伴う、ハプテン化合物の親和性駆動型の複合体化を示すことは、効率的なジスルフィド結合形成のための前提条件であり、非ハプテン化ペプチドＡｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−ＮＨ２）（Biosynthan 1763.1、配列番号１７８）を、ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣ及びヒト化抗ジゴキシゲニン抗体とインキュベートした。１．４mgのＡｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−ＮＨ２）を、１０mg/mlの濃度に、１００%ＤＭＦ中に溶解した。２mgの各々の抗体を、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．２）で構成される緩衝液中で、１１〜１３mg/ml（約７５〜８９μM）の濃度で使用した。ＡＣ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−ＮＨ２）及び抗体を、２．１：１モル比（ＡＣ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−ＮＨ２）対抗体）で混合した。ペプチドを、溶液を、攪拌棒を用いて５００rpmで攪拌しながら、３部分で加えた。各々の添加の間に、サンプルを、２００rpmで５分間にわたりインキュベートした。最後の部分の添加後、サンプルを、１時間にわたり、室温及び２００rpmでインキュベートした。

【0821】

結果として得られた複合体／コンジュゲートは、サイズ排除クロマトグラフィーを介して、Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−ＮＨ２）：ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣコンジュゲートについて９７%単量体ＩｇＧ様分子及び３%二量体可溶性凝集体として、並びにＡｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−ＮＨ２）：ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体複合体について１００%単量体として定義した。さらに、結果として得られた複合体／コンジュゲートを質量分析により分析した。Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−ＮＨ２）：ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体ＶＨ５２ｂＣコンジュゲートについて、検出種の１７%が、２つのペプチド分子にカップリングした抗体として同定され、５１%が、１つのペプチド分子にカップリングされた抗体として同定され、３２%が、カップリングペプチドを伴わない抗体として同定された。Ａｃ−ＰＹＹ（ＰＥＧ３−Ｃｙｓ−４Ａｂｕ−ＮＨ２）：ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体複合体について、抗体の１００%が非カップリングであった。

【0822】

実施例２２
共有結合的ペイロードカップリングのためのシステイン変異を伴う、適切に折り畳まれた機能的ハプテン結合抗体の生成のために要求されるジスルフィドパターン

【0823】

共有結合性化合物／ペイロードカップリングのためのハプテン結合モジュールは、ハプテン化化合物／ペイロードの共有結合的な付着を可能にする余分なシステインを含む「標準的な」抗体（例えばＩｇＧなど）で構成され得る。本明細書において報告する方法によって、構造及び配列が抗体機能性のための基礎を提供する、折り畳まれたドメイン内に、要求される官能基（システイン）が導入される。抗体のドメイン内、並びにその間での定義されたジスルフィド結合の正しい形成は、正しい構造及び機能性の形成及び維持のために不可欠である。図３７（Ａ）は、機能的結合アーム（例えば未改変抗体のＦａｂなど）を形成するために要求されるジスルフィドパターンを示し、図３７（Ｂ）は、ＶＨ５２ｃＢ／ＶＨ５３Ｃ変異抗体誘導体の構造及び機能性を維持するために必要であるジスルフィドパターンを示す。適切なジスルフィドパターンを維持するために、ＶＨドメイン中に導入された追加のシステインは、非占有でなくてはならず、隣接システインに干渉する、又はそれと反応してはならない。図３７（Ｃ）及び図３７（Ｄ）は、余分なシステインの添加によって、そのような分子の生合成の間に、ＶＨドメイン内に正しくないジスルフィドを形成する可能性が生成されることを示す。ＶＨ５２ｂＣ／ＶＨ５３Ｃ位置が、ＶＨドメイン内に（及び他のシステインに非常に近く）位置付けられるという事実によって、正しくないジスルフィドが、重鎖の生合成の間に形成され得るリスクが悪化する。別の潜在的な問題は、ＶＨ及びＶＬドメインが、１つのＦｖフラグメントへの分泌経路内で組み立てられることである。分泌経路は、酸化還元シャッフリング条件並びにジスルフィド形成及びシャフリング酵素を含む。したがって、ＶＨ５２ｂＣ／ＶＨ５３Ｃ変異の添加により正しくないジスルフィドを導入する可能性が、軽鎖のジスルフィドにも「拡大」し得る（図３７（Ｅ）に例示的に示す）。これによって、不適切に折り畳まれた非機能性分子を取得／生成するリスクが更に増強される。これらのリスクにもかかわらず、ＶＨ５２ｂＣ／ＶＨ５３Ｃ変異を含む均質な機能的抗体誘導体の良好な量が発現され、得られ、それらを、ハプテン化化合物／ペイロードに共有結合的に接続することが可能であることは、非常に驚くべきことである。

【0824】

実施例２３
共有結合カップリングのためのシステイン変異を有する抗ハプテンジスルフィド安定化一本鎖Ｆｖ断片の組成と生成

【0825】

共有結合的な化合物／ペイロードカップリングのためのハプテン結合モジュールは、「標準的な」抗体（例えばＩｇＧなど）からなり得る。或いは、それらは、改変実体（例えば組換えＦｖ又はＦａｂフラグメントなど）、又はそれらの誘導体であり得る。一本鎖Ｆｖフラグメントは、特に小モジュールサイズが要求される、又は、追加の結合モジュールが、二重又は多特異性抗体誘導体を生成することが望まれる用途において、完全長抗体の代替物として頻繁に適用される。生成された抗ハプテンＦｖ由来実体の一例は、ジゴキシゲニン化化合物／ペイロードに結合する、又は共有結合的に接続されるジスルフィド安定化一本鎖Ｆｖである。Ｄｉｇ結合特異性を伴うジスルフィド安定化一本鎖Ｆｖは、互いに、可動性のＧｌｙ及びＳｅｒリッチリンカーを介して、互いに抗ジゴキシゲニン抗体のＶＨ及びＶＬドメインを連結することにより生成した。これらのＶＨ及びＶＬドメインは、追加的に、ＶＨの位置４４及びＶＬの位置１００（Ｋａｂａｔらに従った位置）においてシステイン変異を持つ。これらの追加のシステインは、ＶＨとＶＬの間の安定した分子間ジスルフィド結合を形成する。これによって、以前に記載された通り、ｓｃＦｖが安定化される（例、Reiter, Y., et al., Nature Biotechnology 14 (1996) 1239-1245）。

【0826】

それに加えて、別のシステインが、Ｋａｂａｔナンバリングに従った、それぞれ、位置５２ｂ又は５３で、ＶＨ中に導入され、Ｆｖフラグメントに共有結合的な連結機能を加えた。

【0827】

しかし、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント中にそのような変異を導入することは、それらを完全長抗体中に配置するよりもずっと困難である。一本鎖Ｆｖフラグメントは、本質的に、完全長ＩｇＧ又はＦａｂフラグメントよりも安定している。なぜなら、それらは、安定化及びヘテロ二量体化強制実体としての定常ドメインを欠くためである。安定性は、追加のシステイン変異（例えばＶＨ４４−ＶＬ１００ジスルフィドなど）をＦｖ中に配置することにより付与することができる。しかし、この安定化の原則は、ジスルフィドが、正しいシステイン間の正しい位置で形成される場合でだけ作動する。このように、定義されたドメイン内ジスルフィド（ＶＨ中の１つ、及びＶＬ中の１つ）に加えて、１つの単一の定義された正しいドメイン間ジスルフィドが形成される必要がある。非マッチングシステイン間のジスルフィド接続によって、ミスフォールドした不安定で非機能的な実体が生成される。ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメントが、６つのシステインを含むことを考慮すると、２１の異なるジスルフィド接続が、理論上、形成することができるが、しかし、３つの定義されたジスルフィドの正しい組み合わせだけが、機能的な安定化ｄｓｓｃＦｖを形成する。この課題は、ＶＨドメイン中への別のフリーなシステインの付加時に悪化する。望まれる安定化ｄｓｓｃＦｖは、２つの定義されたドメイン内ジスルフィド（ＶＨ及びＶＬにおける各々１つ）、１つの定義されたドメイン間ジスルフィド（ＶＨとＶＬの間）、及びハプテン化化合物／ペイロードカップリングのための更に１つのフリーなシステイン（位置５２ｂ／５３での、ＶＨ中）。共有結合的カップリングのための余分なシステイン変異を伴うジスルフィド安定化Ｆｖフラグメントが、７つのシステインを含むことを考慮すると、多くの異なるジスルフィド接続が、理論上、形成することができるが、しかし、３つの定義されたジスルフィドの正しい組み合わせ（ＶＨ５２ｂ／ＶＨ５３で厳密なフリーなシステイン位置を伴う）は、機能的な、安定化された共有結合カップリング能のあるｄｓｓｃＦｖをもたらす。１つの追加の課題は、追加のフリーなシステイン（ＶＨ５２ｂ／ＶＨ５３）が、天然システインではなく、しかし、ジスルフィド安定化のために導入された変異であるＶＨ４４システインに近接して位置するという事実である。ＶＨ４４Ｃは、正しいドメイン間ジスルフィド結合を形成するために必要であり、このジスルフィドは、この理論に拘束されないが、ＶＨ及びＶＬの独立した折り畳み及び組み立て後に形成する可能性が最も高い。ＶＨ４４ＣとＶＨ５２ｂＣ／ＶＨ５３Ｃの近接によって、ドメイン内ジスルフィドが、正しい様式で形成しないというリスクが悪化される。しかし、ジゴキシゲニンに結合し、ジゴキシゲニン化ペイロードに同時に共有結合的に接続することが可能である機能的なジスルフィド安定化一本鎖Ｆｖモジュールを産生することができることが見出されている。正しい位置において正しいジスルフィド及びフリーなシステインを含む、ジスルフィド安定化された短鎖Ｆｃ分子の組成、並びに非所望の正しくなく折り畳まれた分子とのその比較を図３８に示す。ＶＨ５２ｂＣ変異Ｆｖ抗体誘導体を伴う、このＤｉｇ結合ｄｓｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び改変重鎖可変領域をコードする配列が、配列番号１９０（ＶＨ）下に、及び、対応するＶＬが配列番号１８９下に列挙されている。二重特異性抗体誘導体の生成のためのモジュールとしての、そのようなｄｓｓｃＦｖの成功裏の生成が、実施例２４（下）において、並びに図４０（Ａ）、図４０（Ｂ）、及び図４０（Ｃ）において記載されている。

【0828】

実施例２４
共有結合的にカップリングされた化合物／ペイロードの標的化送達のための二重特異性抗ハプテン抗体誘導体の組成、発現、及び精製

【0829】

共有結合化合物／ペイロードカップリングのためのハプテン結合抗体モジュールを含む二重特異性抗体を生成した。これらの抗体は、追加的に、他の抗原への標的化を可能にする結合モジュールを含む。そのような二重特異性抗体の適用は、標的抗原を保有する細胞又は組織へのハプテン化化合物／ペイロードの特異的標的化を含む。生成されたそのような分子についての１つの例は、腫瘍関連糖抗原ＬｅＹを認識する結合領域を伴う、及び、同時に、ジゴキシゲニン化化合物／ペイロードに結合し、共有結合的にそれを接続するジスルフィド安定化Ｆｖを伴う二重特異性抗体である。したがって、ジスルフィド安定化一本鎖Ｆｖは、可動性のＧｌｙ及びＳｅｒリッチコネクターペプチドを介して、ＬｅＹ抗体のＣＨ３ドメインのＣ末端に接続され、２つのＬｅＹ結合アーム及び、追加的に、２つのジゴキシゲニン結合実体を伴う四価分子をもたらした。ジゴキシゲニン結合実体は、以前に記載されたＶＨ４４−ＶＬ１００ジスルフィド結合を持っていた（例、Reiter, Y., et al., Nature Biotechnology 14 (1996) 1239-1245）。ジゴキシゲニン結合実体は、追加で、共有結合カップリングのためのＶＨ５２ｂＣ変異を含んでいた。このＬｅＹ−Ｄｉｇ抗体誘導体の軽鎖及び改変重鎖をコードする配列を、配列番号１９１及び配列番号１９２下に列挙する。共有結合的にカップリングされた化合物／ペイロードのための送達媒体としてのＬｅＹ−Ｄｉｇ二重特異性抗体誘導体の組成を、図３９に模式的に示す。

【0830】

二重特異性分子を、分子生物学的技術により生成し、培養細胞からの分泌により発現させ、その後、上記に記載するのと同じ様式で、培養上清から精製した。図４０（Ａ）は、細胞培養上清中のこのＬｅＹ−Ｄｉｇ（５２ｂＣ）二重特異性抗体の改変Ｈ鎖及びＬ鎖の存在を示し、抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を検出するウエスタンブロット分析において可視化されている。図４０（Ｂ）は、還元剤の存在における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製後のこれらの抗体の均質性を実証する。クマシーブリリアントブルーを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの染色によって、それらの計算された分子量と類似の見掛け上の分子サイズを伴うＩｇＧに関連したポリペプチド鎖が可視化される。図４０（Ｃ）は、プロテインＡ精製後のＬｅＹ−Ｄｉｇ（５２ｂＣ）二重特異性抗体のＳＥＣプロファイルを示し、タンパク質調製物中での凝集体の均質性及び欠如を実証する。このように、標的化モジュール並びにハプテン化化合物／ペイロードの共有結合的カップリングのためのモジュールを含む二重特異性抗体を生成し、均質にまで精製することができる。

【0831】

実施例２５
ビオシチンアミドとの複合体中のマウス抗ビオチン抗体ＦａｂフラグメントのＸ線構造決定

【0832】

マウス抗ビオチン抗体のＦａｂフラグメントのタンパク質構造を、ビオシチンアミドとの複合体中で測定した。したがって、Ｆａｂフラグメントの結晶を０．８Mコハク酸中で成長させ、ビオシチンアミドを用いた抗体結晶の負荷が続いた（結晶化液滴中の結晶に適用される、結晶化溶液中の１０mM作業濃度に希釈）。結晶を、２μLの１０mMビオシチンアミド溶液で３回洗浄し、最後に１６時間にわたり、ビオシチンアミドと２１℃でインキュベートし、凍結保護剤として１５%グリセロールを用いて収集し、液体窒素中で急速凍結した。処理された回折像によって、２．５Aの分解能でのタンパク質構造が得られた。ビオチン結合可変領域の構造と電荷組成を図４６に示す：ビオチンは、ＣＤＲ領域からのアミノ酸で構成される荷電領域に隣接した表面ポケット中に特異的に結合する。複合体化ハプテンは、アミノ酸の負荷電クラスターに近接して位置付けられる。ハプテンとして、そのカルボキシ基でのペイロードカップリングのために誘導体化されるビオチンは、良好な有効性を伴い結合する。なぜなら、この位置では電荷反発（ＣＯＯＨ基の欠如に起因する）がないからである。対照的に、遊離（正常）ビオチンは、効率的に抗体に結合することはできない。なぜなら、そのカルボキシル基は、この負荷電クラスターに近接し、故に、反発し得るからである。

【0833】

実施例２６
血液脳関門シャトルモジュールの操作

【0834】

ハプテン結合二重特異性血液脳関門シャトルモジュールを、ジスルフィド安定化ハプテン結合一本鎖Ｆｖを、抗ＴｆＲ抗体のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合することにより生成した。類似の設計及び技術を、以前に記載された通りに適用した（例、ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０６４１００を参照のこと）。これらの血液脳関門シャトルモジュールの組成についての例を、図４７に示す。

【0835】

血液脳関門シャトルモジュールは、血液脳関門の内皮細胞上のトランスサイトーシス可能な細胞表面標的（血液脳関門受容体）を認識する。例示的に、本発明者らは、異なる親和性を伴い、トランスフェリン受容体に結合する２つの異なる抗体を使用した。抗体ＴｆＲ１は、高親和性を伴い、トランスフェリン受容体に結合し、抗体ＴｆＲ２は、低下した親和性を伴い、トランスフェリン受容体に結合する（例、ＷＯ ２０１２／０７５０３７を参照のこと）。これらの抗ＴｆＲ抗体に由来するＴｆＲ結合部位を、無変化Ｆａｂアームとして二重特異性抗体中に設定し、二価の完全長ＩｇＧモジュールを得た。ジスルフィド安定化ハプテン結合一本鎖Ｆｖを、短いＧＳリンカーを介して、生成された二重特異性抗体のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合した。例示的には、抗ハプテン結合部位として、以前に記載された、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）又はビオチン（Ｂｉｏ）の誘導体に結合する実体を使用した（配列については、上を参照のこと）。

【0836】

これらのシャトル媒体の配列組成についての例は、配列番号１９３（ＬＣ抗ＴｆＲ１抗体）、配列番号１９４（ｓｃＦｖ抗ジゴキシゲニン抗体フラグメントにコンジュゲーションされたＨＣ抗ＴｆＲ１抗体）、配列番号１９５（ｓｃＦｖ抗ビオチン抗体フラグメントにコンジュゲーションされたＨＣ抗ＴｆＲ１抗体）、配列番号１９６（ＬＣ抗ＴｆＲ２抗体）、配列番号１９７（ｓｃＦｖ抗ジゴキシゲニン抗体フラグメントにコンジュゲーションされたＨＣ抗ＴｆＲ２抗体）、配列番号１９８（ｓｃＦｖ抗ビオチン抗体フラグメントにコンジュゲーションされたＨＣ抗ＴｆＲ２抗体）として列挙される。

【0837】

実施例２７
二重特異性抗体（血液脳関門シャトルモジュール）の発現及び精製

【0838】

血液脳関門シャトルモジュール二重特異性抗体を、以前に記載された通りに（上記参照）、定義された無血清培地中の哺乳動物細胞において産生した。ＨＥＫ２９３懸濁細胞を、Ｌ鎖及びＨ鎖をコードする発現プラスミドを用いて一過性にトランスフェクトし、血液脳関門シャトルモジュール二重特異性抗体を発現する培養物を生成した。

【0839】

高親和性を伴いＴｆＲに結合するジゴキシゲニン化ペイロード結合血液脳関門シャトルモジュールを生成するために、配列番号１９３コード核酸／発現カセットを含む発現プラスミドを、配列番号１９４コード核酸／発現カセットを含む発現プラスミドを用いてコトランスフェクトした。

【0840】

高親和性を伴いＴｆＲに結合するビオチン化ペイロード結合血液脳関門シャトルモジュールを生成するために、配列番号１９３コード核酸／発現カセットを含む発現プラスミドを、配列番号１９５コード核酸／発現カセットを含む発現プラスミドを用いてコトランスフェクトした。

【0841】

低下した親和性を伴いＴｆＲに結合するジゴキシゲニン化ペイロード結合血液脳関門シャトルモジュールを生成するために、配列番号１９６コード核酸／発現カセットを含む発現プラスミドを、配列番号１９７コード核酸／発現カセットを含む発現プラスミドを用いてコトランスフェクトした。

【0842】

低下した親和性を伴いＴｆＲに結合するビオチン化ペイロード結合血液脳関門シャトルモジュールを生成するために、配列番号１９６コード核酸／発現カセットを含む発現プラスミドを、配列番号１９８コード核酸／発現カセットを含む発現プラスミドを用いてコトランスフェクトした。

【0843】

二重特異性抗体を、Ｌ及びＨ鎖をコードする発現プラスミドを用いて一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３懸濁細胞の上清から、プロテインＡクロマトグラフィー（上記参照）により精製した。その後、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を適用し、凝集体又は混入物のない二重特異性抗体を得た。精製された血液脳関門シャトルモジュールの純度及び組成についての例を、ＳＥＣプロファイル及びＳＤＳ−ＰＡＧＥとして図４８において示す。

【0844】

実施例２８
二重特異性ハプテン結合血液脳関門シャトルモジュールは、ハプテン化ペイロード及び血液脳関門受容体に同時に結合する。

【0845】

二重特異性抗体の血液脳関門−シャトル機能性を可能にするためには、それらが、血液脳関門の内皮細胞上の血液脳関門受容体に、及び、往復するハプテン化ペイロードに同時に結合しなければならない。本明細書において報告するハプテン結合二重特異性抗体のこの機能を評価するために、同時細胞表面及びペイロード結合を、ＦＡＣＳ分析により取り組んだ。これらの分析のために、血液脳関門シャトルモジュール（＝二重特異性抗体）の細胞結合を、二次抗体を認識するフィコエリトリン（ｐｈｙｔｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）標識ＩｇＧにより検出した。同時のペイロード結合を、ハプテン化蛍光ペイロード（ジゴキシゲニン化Ｃｙ５；ＤＩＧ−Ｃｙ５（上記参照））の適用により検出した。ＴｆＲ発現ＢＢＢ由来細胞株としてのｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞及び蛍光ペイロードとしてのＤｉｇ−Ｃｙ５を使用したＦＡＣＳ分析の結果を図４９に示す：両方のトランスフェリン受容体結合二重特異性抗体が、抗ＩｇＧ−ＰＥ関連シグナルにより示される通り、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３に結合する。同様に、両方の二重特異性抗体は、細胞関連Ｃｙ５に起因するシグナルにより示される通り、また、同時にＤｉｇ−Ｃｙ５に結合する。（高親和性）ＴｆＲ１二重特性抗体と（低下親和性）ＴｆＲ２二重特性抗体の間でのシグナル強度の比較によって、（予想通り）、中親和性二重特異性抗体に比較し、高親和性を伴い、細胞上でより高いシグナル強度が示された。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３（ＣＤ３３−Ｄｉｇ）上に検出可能な量で存在しない抗原を認識する対照二重特異性抗体は、（予想通り）、抗ＩｇＧ抗体との、又はＤｉｇ−Ｃｙ５との関連シグナルを生成しなかった。

【0846】

これらの結果は、二重特異性ハプテン結合血液脳関門シャトルモジュールが、内皮細胞の表面上のそれらの標的に特異的に結合することを示している。さらに、これらの二重特異性抗体は、ハプテン化ペイロードに同時に結合し、それにより、それらを、血液脳関門の内皮細胞に向けることができる。

【0847】

実施例２９
血液脳関門シャトルモジュールの受容体結合モードは、脳内皮細胞からの放出に影響する。

【0848】

本発明者らは、脳内皮細胞（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３）を使用し、本明細書において報告するシャトルモジュールの細胞結合及びトランスサイトーシスを研究した。以前の試験（Crepin et al., 2010；Lesley et al., 1989、ＷＯ ２０１２／０７５０３７、ＷＯ ２０１４／０３３０７４）では、ＴｆＲ結合抗体の価数及び親和性が、血液脳関門の内皮細胞への結合、それを通じたトランスサイトーシス、及びそこからの放出の有効性に影響することが報告された。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３における細胞結合及びトランスサイトーシスを研究するために、フィルタインサート上で培養したｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を、二重特異性抗体又は親抗体（対照としてハプテン結合ｓｃＦｖを伴わない）を用いて、頂端で、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。細胞単層は、無血清培地中で、頂端（４００μL）及び側底（１６００μL）を、各々３〜５分間にわたり３回、室温で洗浄した。全ての洗浄容積を回収し、非結合リガンド又は抗体の除去の効率をモニターした。予め温めておいた培地を頂端チャンバーに加え、フィルターを、１６００μLの予め温めておいた培地を含む新しい１２ウェルプレート（１%ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて一晩ブロッキングした）に移した。この時点で、特異的な取り込みを決定するために、フィルターの一部の細胞を、５００μLのＲＩＰＡ緩衝液（Sigma, Munich, Germany, ＃Ｒ０２７８）中で溶解した。残りのフィルターを、３７℃でインキュベートし、細胞の、並びに側底及び頂端培地のサンプルを、種々の時点で回収し、頂端又は側底の放出を決定した。サンプル中の抗体の含量を、高感度ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを使用して定量した。これらの分析結果を図５０に示す：高親和性二価抗ＴｆＲ抗体（ＴｆＲ１）は、効率的に細胞に結合するが、しかし、頂端又は側底コンパートメントには放出されない。同じ様式において、高親和性ＴｆＲ結合部位（ＴｆＲ１−Ｄｉｇ、ＴｆＲ１−Ｂｉｏ）を含む二重特異性抗体は、効率的に細胞に結合するが、しかし、頂端又は側底コンパートメントには放出されない。対照的に、低下した親和性を伴う二価抗ＴｆＲ抗体（ＴｆＲ２）は、効率的に細胞に結合し、その後、頂端又は側底コンパートメントに経時的に放出される。低下した親和性二価ＴｆＲ結合部位（ＴｆＲ２−Ｄｉｇ、ＴｆＲ２−Ｂｉｏ）を含む二重特異性抗体も、効率的に細胞に結合し、親抗体と同じ程度で頂端又は側底コンパートメントに放出される。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３上に存在しない抗原に結合する対照の二重特異性抗体（ＣＤ３３−Ｄｉｇ、ＣＤ３３−Ｂｉｏ）は、これらの細胞に結合せず、したがって、また、頂端又は側底コンパートメントに経時的に放出されない。

【0849】

実施例３０
内皮細胞向を横切るＴｆＲシャトルに対する低下した親和性を伴う血液脳関門シャトルモジュールは、ハプテン化ペイロードのトランスサイトーシス及び放出を支持する。

【0850】

脳内皮細胞（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３）を使用し、ハプテン結合血液脳関門シャトルモジュールと非共有結合複合体を形成するハプテン化ペイロードの細胞結合及びトランスサイトーシスを研究した。ペイロードのトランスサイトーシスが、非共有結合複合体ペイロードについて本明細書において報告するハプテン結合性血液脳関門シャトルモジュール（二重特異性抗体）を介して達成することができるか否かを評価するために、トランスウェルシステム中のｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を、本明細書において報告する二重特異性抗体により複合体化したハプテン化ペイロード（例示的な構築物については、前の実施例を参照のこと）に１時間にわたり曝露し、ＴｆＲ結合を可能にした。洗浄によるシャトル及びペイロードの除去に続き（実施例２８を参照のこと）、結合分子、内在化、細胞内選別、トランスサイトーシス及びペイロードの放出を、シャトルモジュールについて実施例２８において記載する同様の様式で、経時的に（実験の開始後０〜５時間＝洗浄工程）モニターした。本実施例において使用したペイロードは、モノハプテン化ＤＮＡであったが、それは、本明細書において報告する二重特異性抗体を用いたインキュベーション時に、２：１（モル）比で非共有結合的に複合体化する（図５１Ａにおいて示す通り）。ペイロードの存在は、細胞抽出物、頂端及び側底コンパートメント中で、ｑＰＣＲにより検出及び定量化することができる。例示的に、Roche LightCyclerで、２つのＰＣＲプライマーＰｒＦｏｒ（配列番号２００）及びＰｒＲｅｖ（配列番号２０１）を使用した、ペイロードとしての末端モノビオチン化又はモノジゴキシゲニン化一本鎖ＤＮＡ ５０ｍｅｒ（配列番号１９９）の定量化を、図５１Ａに示す。これらの分析の結果（図５１Ｂ）によって、非共有結合的に付着されたハプテン化ペイロードが、細胞に結合し、内在化され、その後、頂端及び側底コンパートメント中に放出されることが実証される。結合及びその後の放出は、ＴｆＲ結合血液脳関門シャトルモジュールにより媒介される。なぜなら、細胞への結合又は放出は、ＣＤ３３結合対照二重特異性抗体を適用する場合、検出されないからである。さらに、細胞への結合又は放出は、二重特異性抗体を伴わないハプテン化ペイロードを適用する場合において検出されない。非共有結合複合体化ペイロードのトランスサイトーシスが、ジゴキシゲニン結合部位について、並びに二重特異性抗体及び対応するハプテン化ペイロードを含むビオチン結合部位について観察された。これは、異なるハプテンを使用し、非共有結合二重特異性抗体の血液脳関門シャトルモジュールを設計することができることを示す。このように、血液脳関門を横切るペイロードトランスサイトーシスは、非共有結合複合体化ハプテン化ペイロードのためのハプテン結合二重特異性抗体を使用して達成することができる。

【0851】

実施例３１
ＴｆＲに対して高親和性を伴う結合部位を伴う血液脳関門シャトルモジュールは、内皮細胞に結合するが、しかし、そこから放出されず、しかし、依然として、ハプテン化ペイロードのトランスサイトーシス及び放出を支持する。

【0852】

脳内皮細胞（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３）を使用し、前の実施例３０に記載するのと同じ様式において、ハプテン結合血液脳関門シャトルモジュールと非共有結合複合体を形成することができるハプテン化ペイロードの細胞結合及びトランスサイトーシスを研究した。トランスウェルシステムにおけるＨＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を、血液脳関門シャトルモジュール（二重特異性抗体）により複合体化されたハプテン化ペイロードに１時間にわたり曝露させ、ＴｆＲ結合、内在化及び細胞内選別、並びにトランスサイトーシスを可能にした。ペイロードは、モノハプテン化ＤＮＡであったが、それは、二重特異性抗体とのインキュベーション時に、２：１（モル比）で非共有結合的に複合体化される（図５１Ａに示す通り）。モノビオチン化又はモノジゴキシゲニン化一本鎖ＤＮＡ ５０ ｍｅｒペイロード（配列番号１９９）の存在は、細胞抽出物、頂端及び側底コンパートメント中で、ｑＰＣＲにより定量化した（前の実施例３０において記載する通り）。

【0853】

これらの分析の結果（図５２）によって、非共有結合的に複合体化されたハプテン化ペイロードが、細胞に結合し、内在化され、その後、頂端及び側底コンパートメント中に放出されることが実証される。これは驚くべき知見である。なぜなら、二価高親和性シャトルモジュールは、それ自体、細胞から放出されないからである。結合及びその後のペイロード放出は、ＴｆＲ 結合二重特異性抗体血液脳関門シャトルモジュールにより媒介される。なぜなら、細胞への結合又は放出は、ＣＤ３３結合対照二重特異性抗体を適用する場合、検出されないからである。さらに、細胞への結合又は放出は、二重特異性抗体血液脳関門シャトルモジュールを伴わないハプテン化ペイロードを適用する場合において検出されない。非共有結合複合体化ペイロードのトランスサイトーシス及び放出が、ジゴキシゲニン結合部位、並びに二重特異性抗体及び対応するハプテン化ペイロードを含むビオチン結合部位について観察された。これは、異なるハプテンを使用し、二重特異性抗体血液脳関門シャトルモジュールを伴うハプテン化ペイロードの非共有結合複合体を設計することができることを示す。血液脳関門を含む細胞を横切るペイロードトランスサイトーシスは、血液脳関門シャトルモジュール（二重特異性抗体）により非共有結合的に複合体化されたハプテン化ペイロードを介して達成することができる。驚くべきことに、トランスサイトーシスは、シャトル媒体自体の放出に頼らない。なぜなら、ペイロードは、放出されないシャトルモジュールを適用する場合でさえ、放出されるからである。

【0854】

実施例３２
ハプテン化ペイロードは、小胞コンパートメント内の血液脳関門シャトルモジュールから分離する。

【0855】

内皮細胞に結合するが、しかし、これらの細胞（ＴｆＲ１）からそれら自体が放出されない血液脳関門シャトルモジュールを含む高親和性ＴｆＲ結合部位を用いたトランスサイトーシスアッセイは、驚くべき結果を示した：ハプテン化ペイロードは、細胞を横切り往復し、頂端及び側底コンパートメント中に放出されたが、シャトルモジュール自体は、細胞に付着した／細胞中に含まれたままであった。二重特異性抗体媒介性細胞結合、取り込み、及びペイロードの分布を、共焦点顕微鏡により分析した。したがって、脳内皮細胞（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３）を、二重特異性抗体複合体化ハプテン化蛍光ペイロード（ハプテン−Ｃｙ５又はハプテン−ＤＮＡ−Ｃｙ５）に曝露し、共焦点蛍光顕微鏡により分析した。したがって、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を、顕微鏡グレードのガラスカバースリップ上に播種し、細胞培養培地中で、３７℃で３時間にわたり、５０nM二重特異性抗体複合体化ハプテン化蛍光ペイロードとインキュベートした。細胞を、次に、洗浄し、固定し（４%パラホルムアルデヒド）、シャトルモジュールのＩｇＧ部分を、抗カッパ軽鎖特異的抗体、続いて、ALEXA Fluor 488にコンジュゲーションされた二次抗体を用いた対比染色により検出した。画像を、ALEXAFluor488（ＩｇＧ）及びＣｙ５（ハプテン−ＤＮＡ−ＣＹ５ペイロード）のための適切なバンドパスフィルター設定を使用し、１００×／１．４６ＮＡ対物レンズを使用したＬＥＩＣＡ ＳＰ５ｘ共焦点顕微鏡で撮った。これらの分析の結果を図５３に示す。蛍光標識ハプテン化ペイロード（ＤＮＡ−Ｃｙ５）を伴う高親和性二重特異性抗体の複合体は、ＴｆＲに結合し、最初は細胞表面上に位置する。その後、それらは、それらの同族受容体と共内在化し、細胞内で、小胞コンパートメント、即ち、エンドソーム及びリソソーム中に現れる。内在化後、間もなく（３時間）、本発明者らは、ハプテン化ペイロードに起因するものからのシャトルモジュールに起因する蛍光シグナルの実質的な分離を観察した。このように、本明細書において報告する血液脳関門シャトルモジュールの非共有結合複合体及びハプテン化ペイロードは、細胞内部の異なる小胞コンパートメント中に解離することができる。それにより、ペイロードは、シャトルモジュールから放出され、シャトルモジュールが、細胞に結合した／細胞中に保持されたままである場合でさえ、トランスサイトーシスを介して、内皮細胞から出ることができる。非共有結合複合体化ハプテン化ペイロードの細胞内分離が、ジゴキシゲニン結合並びにビオチン結合血液脳関門シャトルモジュール（二重特異性抗体）及び対応するハプテン化ペイロードについて観察された。このように、異なるハプテンを使用し、ペイロードのトランスサイトーシスを可能にする、ハプテン化ペイロード及び血液脳関門シャトルモジュールの非共有結合複合体を設計することができる。

【0856】

実施例３３
ペプチドＹＹを含むヘリカーモチーフのアミノ酸配列

【0857】

ペプチドＹＹは、摂食に応答して、回腸及び結腸中の細胞により放出される短い（３６アミノ酸）ペプチドである。ヒトにおいて、それは、食欲を低下させるように見える。循環ＰＹＹの最も一般的な形態は、ＰＹＹ_３−３６であり、それは、受容体のＹファミリーのＹ２受容体（Ｙ２Ｒ）に結合する。ＰＹＹは、胃腸管の粘膜中、特に回腸及び結腸中のＬ細胞において見出される。また、ＰＹＹの少量（約１〜１０%）が、食道、胃、十二指腸、及び空腸において見出される。循環において、ＰＹＹ濃度が、食物摂取後に増加し、絶食時に減少する。ＰＹＹは、ＮＰＹ受容体を通じてその作用を発揮する；それは、胃の運動性を阻害し、結腸における水分及び電解質の吸収を増加させる。ＰＹＹ及びＰＹＹ模倣体は、肥満に対処するために使用されてきた。

【0858】

ＰＹＹは、抗体の薬物動態学的特性の利点を得るために、及び、ＰＹＹの内因性の不安定性を回避するために、ヘリカーモチーフのアミノ酸配列を含むように改変し、抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体により複合体化した。

【0859】

非共有結合性複合体の形成
ＰＹＹ３−３６ペプチドの構造研究（Nygaard, R., et al., Biochem. 45 (2006) 8350-8357；配列番号２１１）によって、中心アミノ酸についてのヘリカルモチーフ（ヘリカー様モチーフのアミノ酸配列）が明らかになる。Ｎ末端イソロイシン及び改変Ｃ末端が、ペプチドの機能的活性のために必須であると記載されてきたように、中心ヘリックスを、ヘリカーモチーフのアミノ酸配列中のアミノ酸を反映するために改変した。

【表8】

【0860】

完全ＩｇＧ１の抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体を、定常ヒトＩｇＧ１及び定常ヒトラムダドメインをそれぞれ含むベクターにおいて挿入された重鎖及び軽鎖の可変領域を含む２つのプラスミドをトランスフェクトすることにより、ＨＥＫ２９３細胞中で産生させた。抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体（００１９）を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用した標準的な手順により精製した。質量分析実験によって、抗体００１９の同一性が確認された。

【0861】

抗体００１９と改変ＰＹＹペプチドＰＹＹ＿ヘリカーの間の複合体は、抗体溶液に小過剰のペプチドを適用することにより、インビトロで得られた。複合体００５２が形成された。複合体の化学量論は、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析実験により、１つの二価抗体で複合体化した１．６のペプチドであることが決定された。

【0862】

抗体００１９、ＰＹＹ（３−３６）野生型、ＰＹＹ＿ヘリカー、及び複合体００５２を、Ｙ２受容体ファミリーに対するそれらの効果について試験した。

【表9】

【0863】

実証されている通り（Hoffmann, E., et al., J. Cont. Rel. 171 (2013) 48-56.）、抗体により複合体化されたペプチドは、インビボで延長した半減期を有する。さらに、驚くべきことに、複合体では、非複合体ペプチドと比較し、ＮＰＹ２Ｒ受容体について、わずかに良好な親和性が実証されている；抗体は、ポリペプチドを安定化し、その固定された生物学的に活性な立体構造においてペプチドを提示する。

【0864】

共有結合的な複合体の形成（共有結合的なジスルフィド結合）
抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体とヘリカーモチーフのアミノ酸配列を含む化合物の間での複合体のインビトロ及びインビボでの安定性を増加させるために、結合時でのジスルフィド架橋の形成が使用されてきた。

【0865】

第１工程は、特異的な認識工程（高親和性相互作用）、即ち、ヘリカーモチーフのアミノ酸配列を含む化合物−抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体複合体の形成である。これは、安定性が改善した共有結合的な複合体を形成するための、ジスルフィド架橋の自発シャッフリングによる第２工程において続く。

【0866】

１２−ｍｅｒペプチド（ヘリカーモチーフのアミノ酸配列）は、比較的剛性の実体であるため（少なくとも、特異的抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体により複合体化された場合）、ジスルフィド架橋のための構造的に特異的な設計を使用しなければならないことが見出されている。複合体形成及びその後にもたらされる共有結合的カップリングが、２つの組換え産生された実体の間であるため、共有結合的なジスルフィド結合の形成のために導入された人工システイン残基は、必ずしも、フリーなシステイン残基として産生されないが、しかし、還元形態で（即ち、フリーなシステイン又はホモシステインアミノ酸にコンジュゲーションされて）発現される。

【0867】

人工のフリーなシステイン残基が導入される、抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体の可変ドメインのアミノ酸配列中での位置が重要である。抗体可変ドメインのアミノ酸配列中の非曝露システインは、フリーなシステイン（コンジュゲーションされていない）として発現されるより多い可能性を有するのに対し、結合ポケットに近い曝露システイン残基によって、フリーなシステインなどの追加部分へのシステインコンジュゲーションにより誘導される立体障害に起因して、１２ｍｅｒペプチド（ヘリカーモチーフのアミノ酸配列）の結合を消失させることができる。
ａ）蛍光化合物を含むヘリカーモチーフのアミノ酸配列を伴う複合体。

【0868】

立体障害及び大きな親和性低下のリスクが最小である適切な位置を同定するために、ヘリカーモチーフのアミノ酸配列における人工システイン残基の導入のための異なる位置がテストされた。システイン残基は、パラトープの大部分を不変にするために、１２ｍｅｒ（ヘリカーモチーフのアミノ酸配列）のＣ末端に導入されている。ペプチドを合成し、蛍光モチーフに融合している。

【表10】

【0869】

抗体上で、構造設計が行われ、異なる３Ｄ環境において各々のシステインを含む両方の設計ペプチドについてジスルフィド架橋の形成を可能にしている。

【0870】

１２ｍｅｒのヘリカルペプチドＡＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫ（ヘリカーモチーフのアミノ酸配列）が、ＶＨ及びＶＨドメインにモデル化される。ペプチドのＣ末端で、残基Ｌ１０及びＫ１１が、可能な位置として同定され、軽鎖可変ドメインにおいて、Ｋａｂａｔの軽鎖ナンバリングに従った位置Ｎ５５及びＧ５１が同定される。

【0871】

抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体（００１９）の重鎖可変ドメインは、以下のアミノ酸配列を有する：

【表11】

【0872】

抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体（００１９）の軽鎖可変ドメインは、以下のアミノ酸配列を有する：

【表12】

【0873】

抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体（０１５５）の軽鎖可変ドメインＮ５５Ｃは、以下のアミノ酸配列を有する：

【表13】

【0874】

抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体（０１５７）の軽鎖可変ドメインＮ５１Ｃは、以下のアミノ酸配列を有する：

【表14】

ｉ）抗体０１５５を伴う化合物を含むヘリカーモチーフのアミノ酸配列の共有結合コンジュゲート

【0875】

二価抗体０１５５は、フリーなシステインを伴わないその親分子Ｙ２Ｒ（ｂｃｋ）−００１９と同様に、ＨＥＫ２９３細胞において発現される。改変抗体を、抗体００１９について使用されるのと同じプロトコールを使用して精製する。質量分析によって、脱グリコシル化抗体の実験的に決定された質量が、１４２，００１Daであることが示される。これは、計算された質量を２５９Daだけ超えている。還元鎖は、４８，１６７Da（完全重鎖、計算値４８，１６８Da、Ｃｙｓ＝ＳＨ，Ｃ−Ｔｅｒｍ＝−Ｋ）及び２２，７２０Ｄａ（完全軽鎖、Ｎ５５Ｃ、計算値２２，７２０Da、Ｃｙｓ＝ＳＨ）の実験的に決定された質量を有する。鎖の配列を、還元後に確認した。

【0876】

抗体０１５５は、１００%ＤＭＦ中の化合物を含むヘリカーモチーフのアミノ酸配列の２．５モル過剰を使用し、ヘリカーモチーフのアミノ酸配列システインバリアント２にカップリングさせ、共有結合複合体０１５６を形成した。

【0877】

ＳＤＳ ＰＡＧＥ（変性条件、図５４を参照のこと）上で、蛍光は、抗体０１５５上だけで見られる；還元条件において、小ペプチドだけが目に見える。
結果：

【0878】

抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体への、蛍光化合物を含むヘリカーモチーフのアミノ酸配列の共有結合的なコンジュゲーションに成功した。抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体の合計約４３%が、２つのヘリカーモチーフのアミノ酸配列に共有結合的にコンジュゲーションされ、抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体の約４０%が、１つのヘリカーモチーフのアミノ酸配列に共有結合的にコンジュゲーションされ、抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列の約１７%がコンジュゲーションされなかった。

【0879】

２つのヘリカーモチーフのアミノ酸配列を含むコンジュゲートは、約５０%まで改変される。この種は、定量化のために考慮されてこなかった。出発原料について既に決定されている通り、ヘリカーモチーフのアミノ酸配列を伴わない抗体は、約１２８Daの２つの改変を含む。１つのヘリカーモチーフのアミノ酸配列にコンジュゲーションされた抗体は、約１２８Daの１つだけの改変を有する。
ｉｉ）抗体０１５７を伴う化合物を含むヘリカーモチーフのアミノ酸配列の共有結合コンジュゲート

【0880】

抗体０１５５と同様に、抗体０１５７は、大部分がシステイン化形態として発現される。質量分析によって、脱グリコシル化抗体の実験的に決定された質量が、１４１，８６３Ｄａであることが示される。これは、計算された質量を３Ｄａだけ超えている。抗体は、単一又は二重ホモシステイン化形態として主に存在する。還元鎖は、４８，１６８Ｄａ（完全重鎖、計算値４８，１６８Da、Ｃｙｓ＝ＳＨ，Ｃ−Ｔｅｒｍ＝−Ｋ）及び２２，７７７Da（完全軽鎖、Ｎ５１Ｃ、計算値２２，７７７Da、Ｃｙｓ＝ＳＨ）の実験的に決定された質量を有する。鎖の配列を、還元後に確認した。

【0881】

ヘリカーモチーフのアミノ酸配列システインバリアント１を伴う抗体０１５７のカップリングは、予想される共有結合複合体をもたらさなかった。蛍光が、予想されるレーンではなく、この実験において陰性であるはずの参照で見られた（図５５を参照）。

【0882】

抗体０１５７を、ヘリカーモチーフのアミノ酸配列システインバリアント１とインキュベートした。対照抗体として、００１９を、同じヘリカーモチーフのアミノ酸配列システインバリアント１とインキュベートした。
結果：

【0883】

抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体への、蛍光化合物を含むヘリカーモチーフのアミノ酸配列の共有結合的なコンジュゲーションは成功しなかった。この理論に束縛されないが、この場合において、抗体システイン化は、結合ポケットにおいて、蛍光化合物を含むヘリカーモチーフのアミノ酸配列が、Ｃ５１を攻撃する適切な位置において、求核性チオール基に効率的に結合し、送達することを可能にするには深すぎると仮定される。
ｂ）組換えポリペプチドを含むヘリカーモチーフのアミノ酸配列を伴う複合体

【0884】

ヘリカーベースの方法論は、ポリペプチドを含む組換え的に産生されたヘリカーモチーフのアミノ酸配列を伴う共有結合複合体の形成を考慮する場合、特に魅力的になる。

【0885】

ヘリカーモチーフのアミノ酸配列システインバリアント１（ＡＨＬＥＮＥＶＡＲＬＣＫ；配列番号２０３）を伴うＶＬ−Ｎ５５Ｃ変異を含む抗体０１５５のコンジュゲーションが、代替物（ヘリカーモチーフのアミノ酸配列システインバリアント２（ＡＨＬＥＮＥＶＡＲＣＫＫ；配列番号２０４）を伴うＶＬ上のＧ５１Ｃ）と比較し、良好に実施されているため、ヘリカーモチーフのアミノ酸配列システインバリアント１を含むポリペプチドを用いた０１５５のコンジュゲーションを、更に研究した。ポリペプチドは、Ｎ末端に融合されたヘリカーモチーフのアミノ酸配列システインバリアント１（ＡＨＬＥＮＥＶＡＲＬＣＫ；配列番号２０３）を含んだ。

【0886】

欠失されたＣ末端リジン残基を伴うシュードモナス外毒素分子ＬＲ８Ｍを含むヘリカーモチーフのアミノ酸配列システインバリアント１（０２３６；配列番号２１３）が、大腸菌中で産生され、陰イオン交換クロマトグラフィー及びＳＥＣの組み合わせを使用して精製されている（例、ＷＯ ２０１１／０３２０２２を参照のこと）。

【0887】

抗体０１５５を、配列番号２１３の欠失されたＣ末端リジン残基を伴うシュードモナス外毒素分子ＬＲ８Ｍを含むヘリカーモチーフのアミノ酸配列システインバリアント１と共有結合的にコンジュゲーションさせる。ＳＥＣクロマトグラムを図５６に示す。コンジュゲーション効率は、非還元サンプルについて、ＳＤＳ−ＣＥ、キャリパーにより分析する（図５７を参照のこと）。

【0888】

抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体の合計約４%が、配列番号２１３の２つのポリペプチドに共有結合的にコンジュゲーションされ、抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体の約４１%が、配列番号２１３の１つのポリペプチドに共有結合的にコンジュゲーションされ、抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列の約５５%が、コンジュゲーションされなかった。

【0889】

結論として、抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列モノクローナル抗体を使用し、１２ｍｅｒのヘリカーモチーフのアミノ酸配列の高親和性認識を介して、ペプチド、ペプチドリンカーを伴う小分子、及び組換えタンパク質を複合体化することができる。ヘリックスとしてフォールドする傾向を伴うペプチドを改変し、元の１２ｍｅｒのヘリカーモチーフのアミノ酸配列ＡＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫ（配列番号２０２）を模倣することができ、その後、抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列モノクローナル抗体と複合体化可能である。高親和性複合体形成に加えて、共有結合的なコンジュゲーションは、システインを含む配列番号２０２のシステインバリアント及び、安定したジスルフィド結合の形成を介して、ＣＤＲ中にシステインを含む改変された抗ヘリカーモチーフのアミノ酸配列抗体を用いて可能になる。異なるシステムにより発現される組換えタンパク質は、特定の反応条件を伴わず、しかし、自発的なジスルフィド架橋シャッフリングを介して、インビトロで、その後にコンジュゲーションさせることができる。

【0890】

実施例３４
ＢｒｄＵ含有ペイロードを伴う複合体からのＢｒｄＵ結合二重特異性抗体

【0891】

ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析を適用し、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）及びブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）結合二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）が、ＢＲＤＵ含有ペイロードに結合することが可能であるのか否か、及びどの程度可能であるのかを評価した。したがって、ＢＲＤＵ−ＤＮＡを、２：１の化学量論比（３５０μg、２．５mg/ml）でＴｆＲ−ＢＲＤＵ ｂｓＡｂに加えて、ｂｓＡｂ／ペイロード−複合体の形成のために、３０分間にわたり室温でインキュベートした。対照試薬として、本発明者らは、遊離二重特異性抗体（２．５mg/ml）及び遊離ＢＲＤＵ−ＤＮＡ（３．２mg/ml）を調製した。ＢＲＤＵ−ＤＮＡ（ＢＲＤＵ−ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＣＴ ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＡＣ ＡＡＣ ＡＧＴ ＡＣＡ ＴＡＴ ＣＧＣ ＧＴＧ ＧＴＡ ＡＧＣ ＧＴ；配列番号２２８）は、ＤＮＡの５’末端に、ＤＮＡ分子当たり１つのＢＲＤＵを含んだ。複合体及び対照試薬を、分析まで−８０℃で保存した。

【0892】

それにより生成された複合体及び対照試薬をＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析を供し、遊離の二重特異性抗体、遊離のペイロード、及び両方の複合体を同定し、特徴付けした。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析は、Wyatt miniDawnTREOS/QELS検出器及びOptilab rEX検出器を備えたDionex Ultimate 3000 HPLCで実施した。分析物を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で１mg/mlで溶解し、０．５ml/分の流速でSuperdex200 10/300GLカラムに適用し、６０分間にわたり、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて溶出した。

【0893】

これらの分析の結果（図５８に示す）は、ＢＲＤＵ含有ＤＮＡが、二重特異性抗体を伴う、定義された複合体を形成することを示す。これらの複合体は、２４４．９kDaのＭＷでカラムから溶出し（図５８Ａ）、６．８nmの流体力学半径を示し（図５８Ｂ）、二重特異性抗体当たり約２つ（１．８）のＤＮＡ分子の化学量論比の計算を可能にする。それに比較し、遊離の二重特異性抗体は、２１５．４kDaのＭＷで検出され、その流体力学的半径は６．２nMで決定された。遊離のＢＲＤＵ−ＤＮＡは、１６．４kDaのＭＷで検出された。

【0894】

このように、ＢＲＤＵ含有ＤＮＡは、抗ＴｆＲ／ＢＲＤＵ二重特異性抗体により効果的及び化学量論的に結合され、２：１モル比の複合体がもたらされることが示された。

【0895】

実施例３５
ビオチン結合二重特異性抗体は、ビオチン含有ＩｇＧに結合する

【0896】

ＴｆＲ／ビオチン二重特異性抗体が、モノビオチン化完全長ＩｇＧに結合することが可能であるのか否かを、及び、それがどの程度までかを分析するために、ｐＴａｕに特異的に結合するＩｇＧアイソタイプのモノビオチン化抗体（ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体、ＢＩＯ−ｐＴａｕ）を、抗ＴｆＲ／ビオチン二重特異性抗体に２：１化学量論比（３００μg、１．３mg/ml）で加え、混合物を、室温で３０分間にわたりインキュベートした（二重特異性抗体ペイロード複合体の形成）。モノビオチン化ＩｇＧは、ＩｇＧアイソタイプのノブインツーホールヘテロ二量体抗体の１つの鎖のＣ末端でＡｖｉタグを伴うＩｇＧ誘導体を産生することにより生成した。Ａｖｉタグは、定義された様式において、１つのビオチンに酵素的にコンジュゲーションされる。

【0897】

複合体形成の特異性についての対照として、抗ＴｆＲ／ジゴキシゲニン二重特異性抗体をＢＩＯ−ｐＴａｕと混合した。さらなる対照試薬として、遊離の二重特異性抗体及び遊離のＢＩＯ−ｐＴａｕの両方のアリコートを調製した。複合体及び対照試薬は、分析まで−８０℃で保存した。

【0898】

生成された複合体をＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析を供し、遊離の二重特異性抗体、遊離のＢＩＯ−ｐＴａｕ、及びそれらの複合体を同定し、特徴付けした。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析は、Wyatt miniDawnTREOS/QELS検出器及びOptilab rEX検出器を備えたDionex Ultimate 3000 HPLCで実施した。分析物を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で１〜２mg/mlで溶解し、０．５ml/分の流速でSuperose610/300GLカラムに適用し、６０分間にわたり、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて溶出した。

【0899】

これらの分析の結果（図５９に示す）は、ＢＩＯ−ｐＴａｕが、二重特異性抗体を伴う、定義された複合体を形成することを示す。これらの複合体は、５０１kDaのＭＷでカラムから溶出し（図５９Ａ）、８．０nmの流体力学半径を示す（図５９Ｂ）。それに比較し、遊離の二重特異性抗体は、２０５kDaのＭＷで検出され、その流体力学的半径は６．２nMで決定された。遊離のＢＩＯ−ｐＴａｕは、１５０kDaのＭＷで検出され、その流体力学的半径は５．５ｎｍで測定された。

【0900】

複合体は、ビオチンと二重特異性抗体のビオチン結合部分の間での相互作用により特異的に形成される。なぜなら、ジゴキシゲニン結合二重特異性抗体は、ＢＩＯ−ｐＴａｕと複合体を形成しないためである（図５９Ｃ）。

【0901】

実施例３６
ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体のトランスサイトーシス

【0902】

抗ＴｆＲ／ビオチン二重特異性抗体が、完全長抗体ペイロードのトランスサイトーシスを促進するのか否かを、及び、それがどの程度までかを分析するために、抗ＴｆＲ／ビオチン二重特異性抗体（抗ＴｆＲ／ビオチンｂｓＡｂ−１及び抗ＴｆＲ／ビオチンｂｓＡｂ−２）及びＢＩＯ−ｐＴａｕの複合体を形成し（実施例３５において記載する通り）、トランスサイトーシスアッセイに供した（例、実施例３１において上記に記載する通り）。非特異的トランスサイトーシスについての対照として、抗ＣＤ３３／ビオチン二重特異性抗体及びＢＩＯ−ｐＴａｕ並びに遊離ＢＩＯ−ｐＴａｕの複合体を並行で試験した。頂端及び側底コンパートメントの、並びに細胞溶解物のサンプルを、細胞のロード後０、１、２、３、４、及び５時間に採取した。ロード濃度は常に３．８μg/mlであった。

【0903】

ビオチン標識抗ｐＴａｕ抗体の量をＥＬＩＳＡにより測定した。したがって、ｐＴａｕタンパク質は、NUNC Maxisorb White 384ウェルプレート上に、５００ng/mlで、一晩２〜８℃で、又は室温で１時間にわたりコーティングした。プレートを、２%ＢＳＡ及び０．０５%Tween20を含むＰＢＳを用いて、少なくとも１時間にわたりブロックした。０．５%ＢＳＡ及び０．０５%Tween20を含むＰＢＳ中の１／７２９までのサンプル希釈物を、１．５〜２時間にわたり適用し、３０分間にわたるPoly-HRP40-Streptavidin（Fitzgerald）及び１０分間にわたるSuper Signal ELISA Pico substrate（Thermo Scientific）が続いた（全て室温で）。ＢＩＯ−ｐＴａｕ抗体の標準希釈液（１００ng/ml〜０．５pg/ml）を、同じプレート上でアッセイした。プレートを、連続的なインキュベーション工程の間に、０．１%Tween20を含むＰＢＳで洗浄した。

【0904】

これらのトランスサイトーシスアッセイの結果（図６０）は、抗ＴｆＲ／ビオチンｂｓＡｂ−１又は抗ＴｆＲ／ビオチンｂｓＡｂ−２のいずれかにＢＩＯ−ｐＴａｕを複合体化させることによって、側底コンパートメント中へ、並びに頂端コンパートメント中に戻す、ＢＩＯ−ｐＴａｕの効果的なエンドサイトーシス及びその後の輸送が媒介されることを示す。対照的に、抗ＣＤ３３／ビオチン二重特異性抗体又は遊離ＢＩＯ−ｐＴａｕへのＢＩＯ−ｐＴａｕの複合体のいずれも、効果的にエンドサイトーシス又はトランスサイトーシスされず、観察されたトランスサイトーシスが、細胞の表面上での、ＴｆＲへの抗ＴｆＲ／ビオチン二重特異性抗体の特異的な結合により起こされることを示す。

【0905】

実施例３７
ハプテン結合血液脳関門−シャトルによって、短いオリゴヌクレオチドのトランスサイトーシス及び放出が可能になる

【0906】

この実施例において、血液脳関門を形成する内皮細胞を横切る核酸のトランスサイトーシスが、小核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドなど）又は改変核酸誘導体（例えば「ロックド」核酸など）について達成することができることを示す。一本鎖核酸ペイロード（実施例３０及び３１において記載するＤＮＡフラグメントよりも小さい）が生成されている。これらのペイロード（ハプテンカップリング形式において生成される）は、治療的アンチセンスオリゴヌクレオチド又はロックド核酸に密接に似ており、それにより、前記実体の代理としての役割を果たすことができる。ハプテン化（例、モノ−ビオチン化又はモノ−ジゴキシゲニン化）一本鎖３４ｍｅｒ又は２８ｍｅｒオリゴヌクレオチド（それぞれ配列Ｓ１又はＳ２）の正確な検出は、実施例３０に記載されるものと類似のｑＰＣＲアッセイにより達成された。特異的な検出を、ＰＣＲプライマーＰｒＦｏｒ（配列番号２００）及びＰｒＲｅｖ（配列番号２０１）を使用し、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３培地中及び細胞抽出物中でのＳ１及びＳ２ ＤＮＡの連続希釈物を分析することにより検証した。頂端若しくは側底細胞上清コンパートメント中又は細胞抽出物中のオリゴヌクレオチドＳ１又はＳ２の存在を検出するためのｑＰＣＲアッセイのための条件は、以下の通りである：９５℃で１０分間にわたる変性；１０秒間にわたる９５℃、１５秒にわたる５４℃、１０秒間にわたる７２℃の４５サイクル；高解像度融解及び冷却が続く。アッセイは、Roche LightCycler 480 IIで実施した。

【0907】

脳内皮細胞（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３）を使用し、実施例３０及び３１に記載するのと同じ様式において、ハプテン結合血液脳関門シャトルモジュールを伴う非共有結合複合体を形成することができるハプテン化ペイロードの細胞結合及びトランスサイトーシスを研究した。トランスウェルシステムにおけるＨＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を、血液脳関門シャトルモジュール（二重特異性抗体）により複合体化されたハプテン化ペイロードに１時間にわたり曝露させ、ＴｆＲ結合、内在化及び細胞内選別、並びにトランスサイトーシスを可能にした。ペイロードは、モノハプテン化オリゴヌクレオチドＳ１又はＳ２であったが、それらは、二重特異性抗体とのインキュベーション時に、２：１（モル）比で非共有結合的に複合体化される（図５１Ａに示す通り）。モノビオチン化又はモノジゴキシゲニン化オリゴヌクレオチドＳ１又はＳ２の存在を、細胞抽出物、頂端及び側底コンパートメント中で、ｑＰＣＲにより定量化した（前の実施例３０及び３１において記載する通り）。同じ抽出物、頂端及び側底コンパートメント中での血液脳関門シャトルモジュール（二重特異性抗体）の存在を、ヒトＩｇＧについて特異的なＥＬＩＳＡにより定量化した（実施例２９において記載する通り）。

【0908】

これらの分析の結果（図６１〜６３）は、非共有結合的に付着されたハプテン化ペイロードＳ１及びＳ２が、細胞に結合し、内在化され、その後、頂端及び側底コンパートメント中に放出されるようになることを実証する。実施例３１における５０ｍｅｒのＤＮＡペイロードについての場合と同様に、それ自体により細胞から放出されない二価高親和性シャトルモジュールが、それにもかかわらず、ペイロードＳ１及びＳ２の両方のトランスサイトーシスを促進することが観察された。結合及びその後の放出は、ＴｆＲ結合血液脳関門シャトルモジュールにより媒介される。なぜなら、細胞への結合又は放出は、ＣＤ３３結合対照二重特異性抗体が適用される場合、検出されないためである。非共有結合的に複合体化されたペイロードＳ１及びＳ２のトランスサイトーシスが、ジゴキシゲニン結合シャトルについて、並びに二重特異性抗体及び対応するハプテン化ペイロードを含むビオチン結合シャトルについて観察された。逆に、細胞への有意な特異的な結合又は有意な放出は、二重特異性抗体を伴わないハプテン化ペイロードが適用される、又はハプテン化ペイロードが、非対応ハプテンを認識する二重特異性抗体と一緒に適用される場合において検出されない。これは、短いオリゴヌクレオチド由来ペイロードが、非共有結合二重特異性抗体の血液脳関門シャトルモジュールにより、脳内皮細胞を横切って送達されることを示す。このように、血液脳関門を形成する細胞を横切った短い核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド又は「ロックド」核酸など）のトランスサイトーシスは、血液脳関門シャトルモジュール（二重特異性抗体）により非共有結合的に複合体化されたハプテン化ペイロードを介して達成することができる。実施例３１において記載されるのと同じ様式において、短い核酸誘導体のトランスサイトーシスは、シャトル媒体自体の放出に頼らない。なぜなら、ペイロードは、放出されないシャトルモジュールを適用する場合でさえ、シャトル実体から放出されるようになるからである。

【0909】

実施例３８
血液脳関門を横切ったペイロード送達のためのハプテン及びトランスフェリン受容体結合シャトル媒体のインビボでの機能性の評価

【0910】

動物実験を適用し、二重特異性ハプテン及びトランスフェリン受容体結合シャトル媒体が、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切ったペイロード送達をインビボでどの程度可能にするかを評価する。輸送され、脳中で検出されるペイロードは、モノビオチン化リン酸化Ｔａｕ結合抗体誘導体である。この抗体（Ｔａｕタンパク質）の標的は、脳中に位置付けられる。そのため、抗体は、その標的にアクセスするために、血液脳関門を通過する必要がある。この抗体は、したがって、インビボ実験のためのペイロードとして適用される。ペイロードと組み合わされるシャトル媒体は、記載されているものと同じ、又は類似の方法で構成されており、上に提示する実施例におけるインビトロ実験のために適用されるが、しかし、ヒトの対応物の代わりに、マウストランスフェリン受容体に結合する結合領域を有する。特異性を切り替える理由は、培養ＢＢＢトランスサイトーシス解析システム（トランスウェルアッセイ、上記を参照のこと）では、ヒトＴｆＲを伴うヒト細胞が適用され、動物実験が、ＢＢＢでマウスＴｆＲを持つマウスにおいて実施されることである。

【0911】

マウスＴｆＲ認識ハプテン（例、ビオチン）結合シャトル媒体を、ビオチン化ｐＴａｕ結合抗体と複合体化し、その後、ＴａｕＰＳ２ＡＰＰマウスに適用する。或いは、マウスＴｆＲ認識ハプテン（例、ビオチン）結合シャトル媒体は、また、ＴａｕＰＳ２ＡＰＰマウス中に注射することができ、その後、後の時点でのビオチン化ｐＴａｕ結合抗体の注射が続く（＝標的化前設定）。

【0912】

マウスの群を、抗ＣＤ４の単一用量で１日目に処置して免疫寛容を誘導し、その後、１０〜１２週間にわたる試験物質の毎週の静脈内注射が続く：
Ａ群：無処置
Ｂ群：（ビオチン化）ｐ−Ｔａｕ結合抗体のみ
Ｃ群：二重特異性抗ＴｆＲ／ビオチン抗体（シャトル媒体）と複合体化されたビオチン化ｐ−Ｔａｕ結合抗体
Ｄ群：抗ＴｆＲ抗体に共有結合的に連結されたｐ−Ｔａｕ結合抗体

【0913】

Ａ群のマウスを０日目に屠殺し、ベースライン群を与える。残りの群は、合計１２週間にわたり、それぞれの化合物の静脈内投与を毎週受け、最後の投与後１週間に屠殺する。

【0914】

ＢＢＢを横切ったペイロード抗体の移動を決定するために、各々のマウス脳を２つの半球に矢状に切開し、以下の通りに使用する：
（１）右半球：ｐＴａｕ含有凝集体の免疫組織化学
（２）左半球：特異的ＡｌｐｈａＬＩＳＡによるリン酸化Ｔａｕタンパク質及び全Ｔａｕタンパク質の測定のための脳ホモジネートの調製。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34-1】

【図34-2】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43-1】

【図43-2】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51-1】

【図51-2】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59-1】

【図59-2】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]