特許 6481296 真核細胞の増殖方法および真核細胞の生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6481296

(24)【登録日】2019年2月22日

(45)【発行日】2019年3月13日

(54)【発明の名称】真核細胞の増殖方法および真核細胞の生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/16 20060101AFI20190304BHJP

   C12N 5/00 20060101ALI20190304BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/16 B

   C12N5/00

【請求項の数】5

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2014-181420(P2014-181420)

(22)【出願日】2014年9月5日

(65)【公開番号】特開2016-54657(P2016-54657A)

(43)【公開日】2016年4月21日

【審査請求日】2017年9月4日

(73)【特許権者】

【識別番号】599002043

【氏名又は名称】学校法人 名城大学

(73)【特許権者】

【識別番号】504139662

【氏名又は名称】国立大学法人名古屋大学

(74)【代理人】

【識別番号】100087723

【弁理士】

【氏名又は名称】藤谷 修

(74)【代理人】

【識別番号】100165962

【弁理士】

【氏名又は名称】一色 昭則

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 昌文

(72)【発明者】

【氏名】太田 貴之

(72)【発明者】

【氏名】村田 富保

(72)【発明者】

【氏名】堀 勝

(72)【発明者】

【氏名】橋爪 博司

【審査官】 池上 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／０９３４９７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 北崎 訓 他，酵母の成長特性に対する大気圧ＤＢＤ照射効果，応用物理学関係連合講演会講演予稿集 第５９回，２０１２年，０８−１８３， １７ａ−Ｂ８−８

【文献】 第６１回応用物理学会春季学術講演会 講演要旨集 (Mar-2014) p.08-154(19p-F2-17)

【文献】 松本 修，表面科学，１９８２年，第３巻, 第１号，p.２−１０

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＤＷＰＩ（Ｄｅｒｗｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ラジカルを真核細胞に照射するラジカル照射工程を有し、
前記ラジカル照射工程では、
ラジカルの照射量を予め定めた第１の照射量以下として、第１の周期でラジカルを真核細胞に周期的に照射して真核細胞を増殖させ、
前記第１の周期は、
真核細胞の細胞周期におけるＧ１期に同調していること
を特徴とする真核細胞の増殖方法。

【請求項2】

真核細胞をＧ１期のまま停止させる工程と、
ラジカルを真核細胞に照射するラジカル照射工程と、
を有し、
前記ラジカル照射工程では、
真核細胞をＧ１期のまま停止させた状態で、ラジカルの照射量を予め定めた第１の照射量以下として、ラジカルを真核細胞に照射し、
真核細胞を増殖させること
を特徴とする真核細胞の増殖方法。

【請求項3】

請求項１または請求項２に記載の真核細胞の増殖方法において、
前記ラジカル照射工程では、
三重項酸素原子と一重項酸素分子との少なくとも一方を真核細胞に照射すること
を特徴とする真核細胞の増殖方法。

【請求項4】

請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載の真核細胞の増殖方法において、
前記真核細胞を懸濁した懸濁液を作製する懸濁液作製工程を有し、
前記ラジカル照射工程では、
前記懸濁液に三重項酸素原子を照射し、
前記第１の照射量は、
前記懸濁液の容積に対して供給される三重項酸素原子の数である第１の体積照射量であり、
前記第１の体積照射量は、
３．０×１０¹⁷ｃｍ^-3であること
を特徴とする真核細胞の増殖方法。

【請求項5】

請求項１から請求項４までのいずれか１項に記載の真核細胞の増殖方法を用いて真核細胞の数を増加させること
を特徴とする真核細胞の生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書の技術分野は、真核細胞の増殖方法および真核細胞の生産方法に関する。さらに詳細には、プラズマを用いた真核細胞の増殖方法および真核細胞の生産方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

プラズマ技術は、電気、化学、材料の各分野に応用されている。プラズマの内部では、電子やイオン等の荷電粒子の他に、原子や分子等の中性粒子や紫外線が発生する。これらプラズマの内部で発生する生成物のうち、不対電子を有する粒子（原子、分子、イオンを含む）のことをラジカルという。このような紫外線やラジカルには、殺菌効果があることが知られている。

【0003】

例えば、特許文献１には、滅菌室内にプラズマを供給することにより、被滅菌物を滅菌させるプラズマ滅菌装置およびプラズマ滅菌方法が開示されている。このように、プラズマから発生するプラズマ生成物には、殺菌作用があることが広く知られている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００４−３５７８８８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明者らは、非平衡大気圧プラズマの内部で発生するプラズマ生成物を短い時間だけ真核細胞に照射することにより、真核細胞を増殖させることを発見した。これは、前述した従来の技術とは逆の結果であり、従来の技術からは予想できない効果である。

【0006】

本明細書の技術は、前述した従来の技術が有する問題点を解決するためになされたものである。すなわちその課題とするところは、プラズマを用いて真核細胞を効率よく増殖させる真核細胞の増殖方法および真核細胞の生産方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

第１の態様における真核細胞の増殖方法は、ラジカルを真核細胞に照射するラジカル照射工程を有する。ラジカル照射工程では、ラジカルの照射量を予め定めた第１の照射量以下として、第１の周期でラジカルを真核細胞に周期的に照射して真核細胞を増殖させる。第１の周期は、真核細胞の細胞周期におけるＧ１期に同調している。

【0008】

この真核細胞の増殖方法は、プラズマ発生装置によりプラズマ発生領域に発生させたプラズマから発生するラジカルを真核細胞に照射することにより、真核細胞を増殖させることができる。この真核細胞の増殖方法では、通常の真核細胞の培養方法よりも、真核細胞の増殖の速度は速い。

【0009】

第２の態様における真核細胞の増殖方法は、真核細胞をＧ１期のまま停止させる工程と、ラジカルを真核細胞に照射するラジカル照射工程と、を有する。ラジカル照射工程では、真核細胞をＧ１期のまま停止させた状態で、ラジカルの照射量を予め定めた第１の照射量以下として、ラジカルを真核細胞に照射し、真核細胞を増殖させる。

【0010】

【0011】

第３の態様における真核細胞の増殖方法において、ラジカル照射工程では、三重項酸素原子と一重項酸素分子との少なくとも一方を真核細胞に照射する。

【0012】

ここで、三重項酸素原子とは、Ｏ（³ Ｐ_j ）である。三重項酸素原子の照射量には、後述するように、面積照射量と体積照射量とがある。面積照射量は、照射する領域に照射される単位面積あたりの三重項酸素原子の数である。体積照射量は、真核細胞を含む懸濁液の容積に対して供給される三重項酸素原子の数である。そのため、寒天培地のように、平坦面の上に配置されている真核細胞に三重項酸素原子を照射する場合には、面積照射量を用いる。一方、懸濁液のように、体積のある溶液中に懸濁されている真核細胞に三重項酸素原子を照射する場合には、体積照射量を用いる。また、一重項酸素分子とは、Ｏ₂ （¹ Δ_g ）である。

【0013】

第４の態様における真核細胞の生産方法は、真核細胞を懸濁した懸濁液を作製する懸濁液作製工程を有する。ラジカル照射工程では、懸濁液に三重項酸素原子を照射する。第１の照射量は、懸濁液の容積に対して供給される三重項酸素原子の数である第１の体積照射量である。第１の体積照射量は、３．０×１０¹⁷ｃｍ^-3である。

【0014】

第５の態様における真核細胞の生産方法は、上記の真核細胞の増殖方法を用いて真核細胞の数を増加させる。

【発明の効果】

【0015】

本明細書では、プラズマを用いて真核細胞を効率よく増殖させる真核細胞の増殖方法および真核細胞の生産方法が提供されている。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】第１の実施形態に係るプラズマ発生装置の概略構成を示す図である。

【図2】第１の実施形態に係るプラズマ発生装置の照射部を示す斜視図である。

【図3】第１の実施形態に係るプラズマ発生装置の内部構造を示す図である。

【図4】真核細胞の細胞周期を説明するための図である。

【図5】実験に用いたプラズマ発生装置の概略構成を示す図である。

【図6】照射距離と三重項酸素原子の密度との関係を示すグラフである。

【図7】ラジカルの照射距離とラジカル密度との関係を示すグラフである。

【図8】プラズマガスにおける酸素ガスの混合比とラジカル密度との関係を示すグラフである。

【図9】ラジカルの照射時間と出芽酵母の増殖率との関係を示すグラフである。

【図10】ラジカルの照射時間と懸濁液中の出芽酵母の増殖率との関係を示すグラフである。

【図11】ラジカルの体積照射量と懸濁液中の出芽酵母の細胞数の変化率との関係を示すグラフである。

【図12】ラジカルの照射時間と懸濁液中の出芽酵母の増殖率との関係についての照射距離依存性を示すグラフである。

【図13】ラジカルを照射するときの酵母の細胞周期とラジカルの照射時間とを変化させた場合における細胞の生存数を比較するためのグラフである。

【図14】ラジカルの体積照射量とマウスの胎児皮膚細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞数の変化率との関係を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、具体的な実施形態について、真核細胞の増殖方法および真核細胞の生産方法を例に挙げて図を参照しつつ説明する。

【0018】

（第１の実施形態）
１．プラズマ発生装置
１−１．装置全体の構成
本実施形態の真核細胞の増殖方法および真核細胞の生産方法に用いられるプラズマ発生装置１００について説明する。プラズマ発生装置１００は、非平衡大気圧プラズマを発生させる装置である。図１は、プラズマ発生装置１００の概略構成を示す図である。図１に示すように、プラズマ発生装置１００は、チャンバー１１０と、載置台１２０と、ガス供給部１３０と、ガス排出部１４０と、プラスチックカバー１５０と、ラジカル照射部２００と、を有している。

【0019】

チャンバー１１０は、ラジカル照射部２００を収容するとともに、大気から遮断したガスを収容するためのものである。載置台１２０は、プラズマを照射する対象であるサンプルを載置するための台である。また、載置台１２０は、プラズマの照射方向に対して垂直な方向にスライドできるようになっている。そのため、プラズマ生成物を対象物に照射する際に、対象物に均等にプラズマ生成物を照射することができる。

【0020】

ガス供給部１３０は、チャンバー１１０の内部にガスを供給するためのものである。ガス排出部１４０は、チャンバー１１０の内部からガスを排出するためのものである。プラスチックカバー１５０は、ラジカルを照射している間に、プラスチックカバー１５０の内部に大気が入るのを防止するためのものである。そのため、外部の大気の影響を排除した状態で、ラジカルを好適に懸濁液に照射できる。

【0021】

ラジカル照射部２００は、プラズマ発生領域に発生するプラズマ生成物のうちラジカルを照射するためのものである。ここで、プラズマ生成物とは、プラズマ発生領域に発生する化学種等のことをいうものとする。つまり、プラズマ生成物として、イオン、電子、ラジカル、光等が挙げられる。ラジカル照射部２００は、これらのプラズマ生成物のうちラジカルを照射する。具体的には、ラジカル照射部２００は、三重項酸素原子と一重項酸素分子とを照射する。また、ラジカル照射部２００は、オゾンを照射することもある。なお、後述するように、ラジカル照射部２００は、紫外線等の光を照射することはない。また、ラジカル照射部２００は、電子やイオンを照射することもない。

【0022】

ここで、ラジカルとは、不対電子を備える中性粒子である。厳密には、三重項酸素原子は不対電子を有しない。しかし、本明細書では、ラジカルは、三重項酸素原子と一重項酸素分子とを含むこととする。

【0023】

図１に示すように、ラジカル照射部２００は、照射口２１０と、プラズマガス供給部２２０と、電力供給部２３０と、ロボットアーム２４０と、を有している。照射口２１０は、ラジカルをサンプルに照射するためのものである。プラズマガス供給部２２０は、ラジカル照射部２００にプラズマガスを供給するためのものである。電力供給部２３０は、ラジカル照射部２００の各部に電力を供給するためのものである。ロボットアーム２４０は、ラジカル照射部２００を移動させるためのものである。

【0024】

図２は、照射口２１０を示す斜視図である。照射口２１０は、２つのスリット２１１を有している。スリット２１１は、長さ１６ｍｍ、幅０．５ｍｍで開口している開口部である。スリット２１１から、ラジカルが照射される。照射口２１０は、スリット２１１の幅方向に移動することができるようになっている。サンプルにまんべんなくラジカルを照射するためである。

【0025】

１−２．ラジカル照射部
図３は、ラジカル照射部２００の内部構造を示す図である。ラジカル照射部２００は、照射口２１０の他に、放電部２５０と、中間構造部２６０と、ノズル部２７０と、を有している。

【0026】

放電部２５０は、その内部にプラズマ発生領域を有している。そのため放電部２５０は、対向する電極対を有している。そして、その電極対の間の空間でプラズマが発生する。そのプラズマは、イオン、電子、ラジカル、紫外線等を含んでいる。

【0027】

中間構造部２６０は、上記のプラズマから、イオンと、電子と、紫外線と、を除去する構造体である。そのため、プラズマから発生したもののうち、ラジカルを含む中性粒子がノズル部２７０に供給される。

【0028】

ノズル部２７０は、ラジカルを含む中性粒子を照射口２１０のスリット２１１に送出するためのものである。つまり、本実施形態のラジカル照射部２００は、サンプルに、プラズマ生成物のうち中性粒子を吹き付けるものである。この中性粒子には、ラジカルとアルゴン原子とが含まれている。

【0029】

２．ラジカルの照射量
２−１．面積照射量と体積照射量
ラジカルの照射量には、面積照射量と体積照射量とがある。面積照射量は、平坦面の上に配置されている真核細胞にラジカルを直接照射する場合に用いる。体積照射量は、液体中の真核細胞にラジカルを照射する場合に用いる。体積照射量については後述する。

【0030】

２−２．面積照射量の定義
ここで、ラジカルの面積照射量は、次式で表される。
ＤＶ ＝ ＲＤ × Ｖ１ × ＥＴ × Ｓ１ ／ Ｓ２
ＤＶ：ラジカルの面積照射量（ｃｍ^-2）
ＲＤ：ラジカル密度（ｃｍ^-3）
Ｖ１：ラジカルの流速（ｍ／ｓｅｃ）
ＥＴ：ラジカルの照射時間（ｓｅｃ）
Ｓ１：照射口の面積（ｃｍ² ）
Ｓ２：照射する領域の面積（ｃｍ² ）
面積照射量は、照射する領域に照射される単位面積あたりの三重項酸素原子の数である。ここで、ラジカル密度ＲＤは、三重項酸素原子の密度である。

【0031】

なお、ラジカルのフラックスは、次式で表される。
Ｆ１ ＝ ＲＤ × Ｖ１
Ｆ１：フラックス（ｃｍ^-2／ｓｅｃ）

【0032】

３．ラジカルの照射による真核細胞の増殖方法
本実施形態における真核細胞の増殖方法は、プラズマ発生装置１００により発生させたラジカルを真核生物に照射するラジカル照射工程を有する。そして、ラジカル照射工程では、ラジカルの照射量を予め定めた第１の照射量以下として、ラジカルを真核細胞に照射し、真核細胞を増殖させる。また、ラジカル照射工程では、三重項酸素原子と一重項酸素分子との少なくとも一方を真核細胞に照射する。実際には、三重項酸素原子と一重項酸素分子との両方を真核細胞に照射する。また、さらにオゾンを照射することとしてもよい。

【0033】

３−１．真核細胞準備工程
まず、真核細胞を準備する。例えば、寒天培地に真核細胞を培養する。または、その他の平坦面上に真核細胞を配置する。

【0034】

３−２．ラジカル照射工程
次に、プラズマ発生装置１００からラジカルを寒天培地の真核細胞に向けて照射する。本実施形態では、３．８×１０¹⁷ｃｍ^-2以下の三重項酸素原子を真核細胞に照射する。ここで、第１の面積照射量は、３．８×１０¹⁷ｃｍ^-2である。これにより、真核細胞は、増殖する。また、この照射に際して、一重項酸素分子も、真核細胞に照射される。

【0035】

４．本実施形態の効果
三重項酸素原子と一重項酸素分子とを含むラジカルを真核細胞に第１の照射量以下だけ照射すると、その真核細胞は増殖する。なお、ラジカルを真核細胞に第１の照射量より多い量だけ照射すると、その真核細胞は減少する。ラジカルの照射量の大小によって真核細胞が増殖したり減少する理由は、必ずしも明らかではない。実験結果については、後述する。

【0036】

５．真核細胞の生産方法
以上により説明した真核細胞の増殖方法を用いて、真核細胞を生産することができる。つまり、真核細胞の数を増加させて、短い時間で真核細胞を増産することができる。

【0037】

６．本実施形態のまとめ
以上詳細に説明したように、本実施形態の真核細胞の増殖方法は、第１の面積照射量として３．８×１０¹⁷ｃｍ^-2以下のラジカルを真核細胞に照射することにより、真核細胞を増殖させる。

【0038】

なお、本実施形態は単なる例示にすぎない。したがって当然に、その要旨を逸脱しない範囲内で種々の改良、変形が可能である。例えば、プラズマを発生させるガスはアルゴンに限らない。その他の希ガスであってもよい。

【0039】

また、プラズマ照射装置におけるプラズマ条件を、真空紫外吸収分光法を用いることによりフィードバックをかけることとするとなおよい。これにより、電子密度やガス温度、そしてラジカル密度を調整することができる。

【0040】

（第２の実施形態）
第２の実施形態について説明する。本実施形態では、第１の実施形態と同様に、真核細胞にラジカルを照射することに変わりない。ただし、本実施形態では、真核細胞を懸濁した懸濁液にラジカルを照射する。そのため、本実施形態では、懸濁液に供給されたラジカルは、液体中で真核細胞に作用することとなる。

【0041】

１．ラジカルの照射量
１−１．面積照射量と体積照射量
ラジカルの照射量には、面積照射量と体積照射量とがある。体積照射量は、液体中の真核細胞にラジカルを照射する場合に用いる。

【0042】

１−２．体積照射量の定義
液体に供給されるラジカルの体積照射量は、次式で表される。
ＳＶ ＝ ＲＤ × Ｖ１ × ＥＴ × Ｓ１ ／ Ｃ１
ＳＶ：ラジカルの体積照射量（ｃｍ^-3）
ＲＤ：ラジカル密度（ｃｍ^-3）
Ｖ１：ラジカルの流速（ｍ／ｓｅｃ）
ＥＴ：ラジカルの照射時間（ｓｅｃ）
Ｓ１：照射口の面積（ｃｍ² ）
Ｃ１：懸濁液の容積（ｃｍ³ ）
体積照射量は、真核細胞を含む液体（懸濁液）の容積に対して供給される三重項酸素原子の数である。ここで、ラジカル密度ＲＤは、三重項酸素原子の密度である。

【0043】

２．ラジカルの照射による真核細胞の増殖方法
本実施形態における真核細胞の増殖方法は、プラズマ発生装置１００により発生させたラジカルを真核生物に照射するラジカル照射工程を有する。そして、ラジカル照射工程では、ラジカルの照射量を予め定めた第１の照射量以下として、ラジカルを真核細胞に照射し、真核細胞を増殖させる。また、ラジカル照射工程では、三重項酸素原子と一重項酸素分子との少なくとも一方を真核細胞に照射する。実際には、三重項酸素原子と一重項酸素分子との両方を真核細胞に照射する。その際に、真核細胞は、懸濁液中に分散されている。

【0044】

２−１．懸濁液作製工程
寒天培地において真核細胞を培養する。そして、寒天培地から真核細胞を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））に懸濁する。このように、真核細胞を懸濁した懸濁液を作製する。

【0045】

２−２．ラジカル照射工程
次に、プラズマ発生装置１００からラジカルを懸濁液の真核細胞に向けて照射する。ここでは、第１の照射量以下の三重項酸素原子を真核細胞に照射する。第１の照射量は、懸濁液の容積に対して供給される三重項酸素原子の数である第１の体積照射量である。第１の体積照射量は、３．０×１０¹⁷ｃｍ^-3である。これにより、真核細胞は、増殖する。また、この照射に際して、一重項酸素分子も、真核細胞に照射される。

【0046】

３．本実施形態の効果
三重項酸素原子と一重項酸素分子とを含むラジカルを真核細胞に第１の照射量以下だけ照射すると、その真核細胞は増殖する。なお、ラジカルを真核細胞に第１の照射量より多い量だけ照射すると、その真核細胞は減少する。ラジカルの照射量の大小によって真核細胞が増殖したり減少する理由は、必ずしも明らかではない。実験結果については、後述する。

【0047】

４．真核細胞の生産方法
以上により説明した真核細胞の増殖方法を用いて、真核細胞を生産することができる。つまり、真核細胞の数を増加させて、短い時間で真核細胞を増産することができる。

【0048】

５．変形例
５−１．懸濁方法
または、液体培養しておいた真核細胞から、遠心分離機を用いて集菌する。そして、それらの真核細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））３ｍｌに懸濁してもよい。

【0049】

６．本実施形態のまとめ
以上詳細に説明したように、本実施形態の真核細胞の増殖方法は、第１の体積照射量として３．０×１０¹⁷ｃｍ^-3以下のラジカルを真核細胞を含む懸濁液に照射することにより、真核細胞を増殖させる。

【0050】

なお、本実施形態は単なる例示にすぎない。したがって当然に、その要旨を逸脱しない範囲内で種々の改良、変形が可能である。例えば、プラズマを発生させるガスはアルゴンに限らない。その他の希ガスであってもよい。

【0051】

また、プラズマ照射装置におけるプラズマ条件を、真空紫外吸収分光法を用いることによりフィードバックをかけることとするとなおよい。これにより、電子密度やガス温度、そしてラジカル密度を調整することができる。

【0052】

（第３の実施形態）
第３の実施形態について説明する。本実施形態では、第２の実施形態と同様に、懸濁液中の真核細胞にラジカルを照射する。第２の実施形態と異なる点について説明する。

【0053】

１．真核細胞と細胞周期
図４に、真核細胞の細胞分裂の細胞周期を示す。真核細胞は、いずれも、図４に示す細胞周期により細胞分裂を引き起こす。すなわち、図４に示す細胞周期は、あらゆる真核細胞に共通の事象である。

【0054】

図４に示すように、細胞周期には、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期、が、この順序で存在する。Ｓ期は、ＤＮＡを複製する期間である。Ｍ期は、倍加したＤＮＡおよび細胞内小器官を均等に分割する期間である。Ｇ１期、Ｇ２期は、これらの間に位置する期間である。

【0055】

ある容器内に多数の真核細胞がある場合には、それらの真核細胞は、一般に、異なる細胞周期にある。例えば、容器内の真核細胞のうち、ある真核細胞は、Ｇ１期を迎えており、別の真核細胞は、Ｍ期を迎えている。

【0056】

２．ラジカルの周期的な照射による真核細胞の増殖方法
ここで、本実施形態における真核細胞の増殖方法について説明する。本実施形態のラジカル照射工程では、第１の周期でラジカルを真核細胞に周期的に照射する。この第１の周期は、真核細胞の細胞周期におけるＧ１期に同調している。これにより、真核細胞がＧ１期にあるときに、ラジカルを真核細胞に照射することができる。後述するように、真核細胞のうち、Ｇ１期にあるものが増殖し、Ｇ１期にないものがわずかに減少する。その結果、全体としては、通常よりも早く、真核細胞が増殖する。

【0057】

２−１．懸濁液作製工程
寒天培地において真核細胞を培養する。そして、寒天培地から真核細胞を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））に懸濁する。このように、真核細胞を懸濁した懸濁液を作製する。

【0058】

２−２．ラジカル照射工程
次に、プラズマ発生装置１００からラジカルを懸濁液の真核細胞に向けて照射する。ここでは、第１の照射量以下の三重項酸素原子を真核細胞に照射する。第１の照射量は、懸濁液の容積に対して供給される三重項酸素原子の数である第１の体積照射量である。第１の体積照射量は、３．０×１０¹⁷ｃｍ^-3である。これにより、真核細胞は、増殖する。また、この照射に際して、一重項酸素分子も、真核細胞に照射される。

【0059】

なお、ここで、ラジカルの照射を周期的に行う。つまり、第１の周期でラジカルを真核細胞に周期的に照射する。この第１の周期は、真核細胞の細胞周期におけるＧ１期に同調している。そのため、第１の周期は、その真核細胞の細胞周期の平均値である。また、第１の周期は、その真核細胞の細胞周期の平均値の８０％以上１２０％以下の範囲内であってもよい。好ましくは、その真核細胞の細胞周期の平均値の９０％以上１１０％以下の範囲内である。より好ましくは、その真核細胞の細胞周期の平均値の９５％以上１０５％以下の範囲内である。また、ラジカルを照射する時間は、Ｇ１期に相当する期間内であればよい。つまり、Ｇ１期の少なくとも一部の期間であればよい。

【0060】

３．本実施形態の効果
後述するように、真核細胞は、Ｇ１期に第１の照射量以下のラジカルを照射されると、増殖する。真核細胞は、Ｇ１期に第１の照射量より多い量のラジカルを照射されると、減少する。また、Ｓ期、Ｍ期では、真核細胞は、第１の照射量以下のラジカルを照射されると、わずかに減少する。

【0061】

そのため、Ｇ１期の期間に相当する時間だけ、周期的にラジカルを照射すれば、真核細胞は増殖する。多数の真核細胞を培養している懸濁液等にラジカルを照射すると、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期のそれぞれに該当する真核細胞にラジカルが照射されることとなる。そのため、Ｇ１期の真核細胞は、増殖を促進される。Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の真核細胞は、わずかに減少する。これらの増殖する効果とわずかに減少する効果とを合わせて、真核細胞は全体として増殖する。

【0062】

４．真核細胞の生産方法
以上により説明した真核細胞の増殖方法を用いて、真核細胞を生産することができる。つまり、真核細胞の数を増加させて、短い時間で真核細胞を増産することができる。

【0063】

５．本実施形態のまとめ
以上詳細に説明したように、本実施形態の真核細胞の増殖方法では、真核細胞のＧ１期に合わせて周期的にラジカルを真核細胞に照射する。これにより、真核細胞を好適に増殖させることができる。

【0064】

（第１の実施形態から第３の実施形態までの効果）
上記の実施形態で説明したように、ラジカルを照射することにより、真核生物を増殖させることができる。真核生物は、真核細胞を有する生物である。真核細胞は、動物細胞と、植物細胞と、を含む。

【0065】

以上の実施形態で説明した真核細胞の増殖方法を用いることにより、農業、食品、薬品、医療などで用いられる有用な生物を効率よく増産できる。

【実施例】

【0066】

Ａ．ラジカルの測定
Ａ−１．測定装置
ラジカルと真核細胞との関係について説明する前に、プラズマ発生装置１００とそのプラズマ発生装置１００から照射されるラジカルとの関係について説明する。図５は、本実験で用いたプラズマ発生装置３００の概略構成を示す図である。本実験で用いるプラズマ発生装置３００は、図１で説明したプラズマ発生装置１００に、ラジカル等の中性粒子を測定する真空紫外吸収分光器３５０を付加したものである。なお、プラスチックカバー１５０については、図５では省略してある。また、既にプラズマ発生装置１００で説明した構成については、記載を省略する。

【0067】

真空紫外吸収分光器３５０は、真空紫外ランプ３１０と、ＭｇＦ₂ 窓３１１と、排気口３１２と、光電子増倍管３２０と、ＭｇＦ₂ 窓３２１と、排気口３２２と、を有している。真空紫外吸収分光器３５０は、真空紫外ランプ３１０から放出された光を、ＭｇＦ₂ 窓３１１と、ＭｇＦ₂ 窓３２１との間の吸収長Ｌで吸収させ、光電子増倍管３２０で検出された吸収スペクトルを解析することにより、ラジカル等の種類を特定するためのものである。そして、その吸収スペクトルの強度から、そのラジカル密度を測定することができる。

【0068】

Ａ−２．プラズマの条件
ここで、実験で用いた条件について説明する。表１に示すように、放電部２５０のプラズマ発生領域で発生したプラズマの密度は、２×１０¹⁶ｃｍ^-3であった。そして、照射距離、すなわち、照射口２１１からサンプルまでの距離を１０ｍｍとした。そして、その照射距離における三重項酸素原子の密度は、２．２５×１０¹⁴ｃｍ^-3であった。また、その照射距離におけるラジカルの流速は、１０．４ｍ／ｓであった。

【0069】

プラズマガスとして、Ａｒと酸素ガスとの混合ガスを用いた。このプラズマガスにおけるガスの総流量は、５．０ｓｌｍであった。プラズマガスに含まれるＯ₂ の含有率は、０．６％であった。なお、雰囲気ガスとしてＡｒガスを供給した。そのため、ラジカルは、酸素原子を含むもののみ生成される。ただし、Ａｒガス等を除く。例えば、窒素原子を含むものは生成されない。すなわち、発生するラジカルは、三重項酸素原子ラジカル（Ｏ（³ Ｐ_j ））および一重項酸素分子ラジカル（Ｏ₂ （¹ Δ_g ））である。また、オゾンが発生することもある。

【0070】

［表１］
プラズマ密度（発生領域） ２×１０¹⁶ｃｍ^-3
照射距離 １０ｍｍ
三重項酸素原子の密度（照射領域） ２．２５×１０¹⁴ｃｍ^-3
流速（照射領域） １０．４ｍ／ｓ
プラズマガス Ａｒ＋Ｏ₂
総流量 ５．０／ｍｉｎ
Ｏ₂ の含有率 ０．６％
雰囲気ガス Ａｒガス

【0071】

Ａ−３．ラジカル
図６は、スリット２１１からサンプルまでの照射距離と、三重項酸素原子の密度との関係を示すグラフである。図６に示すように、三重項酸素原子の密度は、照射距離が離れるにつれて、指数関数的に減少する。そして、スリット２１１からサンプルまでの照射距離が１０ｍｍのとき、三重項酸素原子の密度は、２．２５×１０¹⁴ｃｍ^-3である。

【0072】

図７は、ラジカルの照射距離と、ラジカル密度との関係を示すグラフである。図７の横軸は、ラジカルの照射距離である。図７の縦軸の一方は、ラジカル密度である。
図７の縦軸の他方は、Ｄ値である。Ｄ値については、後述する。三重項酸素原子の密度は、ラジカルの照射距離が大きくなるほど、指数関数的に減少する。一方、一重項酸素分子の密度は、ラジカルの照射距離が大きくなってもほぼ一定で変わらない。

【0073】

図８は、表１のプラズマガスにおけるＯ₂ の含有率とラジカル密度との関係を示すグラフである。図８の横軸は、プラズマガスにおける酸素濃度である。図８の縦軸の一方は、ラジカル密度である。図８の縦軸の他方は、Ｄ値である。Ｄ値については、後述する。図８に示すように、酸素濃度が０．６％の付近で三重項酸素原子の濃度が最も高い。そのため、表１に示すように、酸素濃度を０．６％程度とすると、三重項酸素原子の密度が高い中性粒子をサンプルに照射することができる。また、三重項酸素原子の濃度が高いほど、Ｄ値は低い。

【0074】

ここで、Ｄ値とは、プラズマを照射し続けることにより、菌数が初期の１０％以下となる時間を表したものである。この値が小さいほど、殺菌効果が強い。図７において、三重項酸素原子の密度が高いほど、Ｄ値は小さいという傾向が見られる。このように、出芽酵母の殺菌効果は、三重項酸素原子に由来すると考えられる。図８に示すように、三重項酸素原子の密度が高いほど、Ｄ値は小さい。すなわち、殺菌効果は高い。

【0075】

Ｂ．出芽酵母１
以下、ラジカルと真核細胞との関係について説明する。

【0076】

Ｂ−１．実験手順
まず、サンプルの作製方法について説明する。直径９０ｍｍのシャーレに寒天培地を作成した。この寒天培地は、酵母エキス、ペプトン、ブドウ糖を含むものであった。そして、この寒天培地に、出芽酵母を培養した。出芽酵母は、真核細胞のうちの一つである。このように形成したコロニーを爪楊枝で取り出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））３ｍｌに懸濁した。培養した出芽酵母の菌の濃度は、１００００００細胞／ｍｌ以上３００００００細胞／ｍｌ以下の範囲内であった。

【0077】

または、液体培養しておいた出芽酵母から、遠心分離機を用いて集菌した。そして、それらの出芽酵母をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））３ｍｌに懸濁した。

【0078】

次に、これらのサンプルに上記の条件でプラズマを所定時間だけ照射する。そして、出芽酵母の菌数を数えた。その際に、血球計算盤を用いた。出芽酵母の生菌数を次の式（１）に示す生菌率の変化量により評価した。
生菌率の変化量（％） ＝ （Ｎ−Ｎ₀ ）／Ｎ₀ × １００ ………（１）
Ｎ ：ラジカルを照射したサンプルの生菌数
Ｎ₀ ：ラジカルを照射していないサンプルの生菌数

【0079】

したがって、式（１）の生菌率の変化量が正の値であれば、出芽酵母の菌数は、ラジカルを照射することにより増加したことを示している。逆に、生菌率の変化量が負の値であれば、出芽酵母の菌数は、ラジカルを照射することにより減少したことを示している。

【0080】

Ｂ−２．実験結果
実験結果を図９に示す。図９の横軸は、サンプルにプラズマを照射した時間である。図９の縦軸は、その場合における式（１）の生菌率の変化量である。そして、例えば、生菌率の変化量が１０％であった場合には、ラジカルを照射することで出芽酵母の菌数が１０％増加したことを示唆している。

【0081】

図９に示すように、ラジカルの照射時間が３０秒から９０秒にかけて、出芽酵母の菌数は増加している。一方、ラジカルの照射時間が１２０秒から１８０秒にかけて、出芽酵母の菌数は減少している。このように、ラジカルの面積照射量を少ない照射量とした場合には、出芽酵母の菌数は増加し、ラジカルの面積照射量を多い照射量とした場合には、出芽酵母の菌数は減少する。

【0082】

図９より、ラジカルの照射時間が９０秒以下では、出芽酵母は増殖している。このときの三重項酸素原子の密度は、２．２５×１０¹⁴ｃｍ^-3である。また、流速は１０．４ｍ／ｓｅｃである。したがって、三重項酸素原子の面積照射量は、これらを掛け合わせて、３．８×１０¹⁷ｃｍ^-2以下の場合に、出芽酵母は増殖している。この範囲内では、出芽酵母の増殖率は１０％程度である。

【0083】

一方、ラジカルの照射時間が１２０秒以上では、出芽酵母は減少している。このときの三重項酸素原子の密度は、２．２５×１０¹⁴ｃｍ^-3である。また、流速は１０．４ｍ／ｓｅｃである。したがって、三重項酸素原子の面積照射量は、これらを掛け合わせて、２．８×１０¹⁹ｃｍ^-2以上の場合に、出芽酵母は減少している。

【0084】

Ｃ．出芽酵母２
Ｃ−１．実験手順
実験条件は、実験Ｂで用いた実験条件とほぼ同じである。

【0085】

まず、酵母をＹＰＤ培地で培養した。その後、集菌し、出芽酵母をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））３ｍｌに懸濁した。プラスチックカバー１５０を用いて、周囲の大気の影響を排除した上で、プラズマを懸濁液に照射した。その後、酵母を再びＹＰＤ培地で培養した。その後、２４時間ごとに、酵母の生菌数を数えた。

【0086】

Ｃ−２．実験結果
図１０は、プラズマの照射時間に対する酵母の生菌数を示すグラフである。図１０の横軸は、ラジカルの照射時間である。図１０の縦軸は、式（１）の生菌率の変化量である。ここでの、生菌率は、ラジカルを照射してから４８時間経過後の生菌数から算出したものである。図１０の領域Ｌ１は、酵母の生菌数が通常より多い場合を示す。領域Ｌ２は、酵母の生菌数が通常より少ない場合を示す。

【0087】

図１０では、図９と同様の傾向がみられる。すなわち、ラジカルの照射が少ない場合には、酵母の生菌数が多く、ラジカルの照射が多い場合には、酵母の生菌数が少ない。

【0088】

図１１は、ラジカルの体積照射量に対する細胞数の変化率を示すグラフである。このグラフを描くにあたって、図１０のデータを用いた。図１１の横軸は、ラジカルの体積照射量である。図１１の縦軸は、ラジカルを照射しなかった場合と比較した酵母の生菌率である。

【0089】

図１１に示すように、領域Ｒ１では、酵母の増殖が促進される。領域Ｒ２では、酵母の増殖が抑制される。領域Ｒ３では、酵母が不活性化される。領域Ｒ１と領域Ｒ２との境界は、２．７×１０¹⁷ｃｍ^-3である。そのため、第１の体積照射量は、２．７×１０¹⁷ｃｍ^-3である。つまり、第１の体積照射量は、３．０×１０¹⁷ｃｍ^-3程度である。領域Ｒ２と領域Ｒ３との境界は、１．５×１０¹⁸ｃｍ^-3である。そのため、第２の体積照射量は、１．５×１０¹⁸ｃｍ^-3である。

【0090】

図１２は、ラジカルの照射時間と懸濁液中の出芽酵母の増殖率との関係についての照射距離依存性を示すグラフである。図１２に示すように、出芽酵母を増殖させるピークは、照射口２１０からサンプルまでの距離が短いほど、照射時間の短い時間の側に位置している。一方、図６では、照射口２１０からサンプルまでの距離が短いほど、三重項酸素原子の密度は高い。これらのことから、三重項酸素原子の供給量が、ある一定値近傍である場合に、出芽酵母の増殖が促進されると考えられる。したがって、出芽酵母の増減に主要な役割を果たしているのは、酸素ラジカルのうちの三重項酸素原子であると推測される。

【0091】

Ｄ．出芽酵母３（細胞周期）
Ｄ−１．実験手順
まず、酵母をＹＰＤ培地で培養した。その後、集菌し、出芽酵母をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））３ｍｌに懸濁した。酵母の培地に、α−ｆａｃｔｏｒ、Ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ、Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅのそれぞれを処理した。α−ｆａｃｔｏｒを処理した酵母は、Ｇ１期のまま停止する。Ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａを処理した酵母は、Ｓ期のまま停止する。Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅを処理した酵母は、Ｍ期のまま停止する。これにより、Ｇ１期のみの酵母、Ｓ期のみの酵母、Ｍ期のみの酵母、を作製した。

【0092】

そして、Ｇ１期のみの酵母、Ｓ期のみの酵母、Ｍ期のみの酵母のそれぞれにラジカルを照射した。その後、酵母を再びＹＰＤ培地で培養した。その後、６０時間経過した後に、酵母の生菌数を数えた。

【0093】

Ｄ−２．実験結果
実験結果を図１３に示す。図１３に示すように、Ｇ１期において、ラジカルを１０秒照射した場合に、酵母は増殖した。その増加の割合は１０％程度であった。Ｇ１期において、ラジカルを２０秒照射した場合には、酵母は、減少した。ラジカルを照射しなかった場合に比べて、酵母の生菌数は、９０％程度であった。Ｇ１期において、ラジカルを３０秒照射した場合には、酵母は、減少した。ラジカルを照射しなかった場合に比べて、酵母の生菌数は、６０％程度であった。

【0094】

図１３に示すように、Ｓ期において、ラジカルを１０秒照射した場合に、酵母はわずかに減少した。ラジカルを照射しなかった場合に比べて、酵母の生菌数は、９７％程度であった。ラジカルを２０秒照射した場合には、ラジカルを照射しなかった場合に比べて、酵母の生菌数は、９６％程度であった。ラジカルを３０秒照射した場合には、ラジカルを照射しなかった場合に比べて、酵母の生菌数は、９０％程度であった。

【0095】

図１３に示すように、Ｍ期において、ラジカルを１０秒照射した場合に、酵母はわずかに減少した。ラジカルを照射しなかった場合に比べて、酵母の生菌数は、９８％程度であった。ラジカルを２０秒照射した場合には、ラジカルを照射しなかった場合に比べて、酵母の生菌数は、９３％程度であった。ラジカルを３０秒照射した場合には、ラジカルを照射しなかった場合に比べて、酵母の生菌数は、８０％程度であった。

【0096】

このように、Ｇ１期に、第１の照射量以下のラジカルを酵母に照射した場合に、酵母は増殖した。そのため、第３の実施形態で説明したように、酵母の細胞周期に合わせて、Ｇ１期に同期させた周期でラジカルを照射すれば、酵母は好適に増殖すると考えられる。Ｓ期やＭ期の酵母にラジカルを照射したとしても、わずかに減少するのみである。つまり、Ｓ期やＭ期の酵母に対しては、ラジカルの影響は十分に小さい。

【0097】

Ｅ．マウスの胎児皮膚細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）
Ｅ−１．培養細胞
本実験では、動物の真核細胞を用いた。つまり、マウスの胎児皮膚細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）である。

【0098】

Ｅ−２．実験手順
まず、マウスの胎児皮膚細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）をディッシュ上に培養する。その細胞を集めてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））３ｍｌに懸濁した。プラスチックカバー１５０を用いて、周囲の大気の影響を排除した上で、プラズマを懸濁液に照射した。その後、遠心分離機で培養細胞を集めた後、血清入り培養液中でＮＩＨ３Ｔ３を培養した。そして、６０時間経過後に、生存している細胞数を数えた。

【0099】

Ｅ−３．実験結果
図１４は、三重項酸素原子ラジカルのドーズ量と、マウスの胎児皮膚細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞増殖率と、の関係を示すグラフである。図１４に示すように、ラジカルの照射量が３．０×１０¹⁷ｃｍ^-3以下の範囲内では、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、増殖する。ラジカルの照射量が３．０×１０¹⁷ｃｍ^-3より大きい場合には、上記の実験との整合性から、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、減少するものと考えられる。

【0100】

つまり、第１の体積照射量が３．０×１０¹⁷ｃｍ^-3以下の場合に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、増殖する。特に、第１の体積照射量が２．０×１０¹⁷ｃｍ^-3以上２．７×１０¹⁷ｃｍ^-3以下の場合には、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、３０％以上も増殖した。ラジカルを照射していないものに比べて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の細胞数が１３５％程度であった。

【0101】

このように、ラジカルを照射することにより、動物細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞は増殖した。上記の実験Ｂ−Ｅより、実験した細胞に限らず、植物細胞に対しても、動物細胞に対しても、ラジカルを照射することにより、細胞を増殖させることができると考えられる。

【符号の説明】

【0102】

１００…プラズマ発生装置
１１０…チャンバー
１２０…載置部
１３０…ガス供給部
１４０…ガス排出部
２００…ラジカル照射部
２１０…照射口
２１１…スリット
２５０…放電部
２６０…中間構造部
２７０…ノズル部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】