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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6483139
(24)【登録日】2019年2月22日
(45)【発行日】2019年3月13日
(54)【発明の名称】増強した安定性のＥＭＤの製造方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/16 20060101AFI20190304BHJP
A61K 8/64 20060101ALI20190304BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20190304BHJP
A61K 8/73 20060101ALI20190304BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20190304BHJP
A61Q 11/00 20060101ALI20190304BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20190304BHJP
A61K 47/18 20060101ALI20190304BHJP
【ＦＩ】
A61K38/16
A61K8/64
A61K47/36
A61K8/73
A61P1/02
A61Q11/00
A61P17/02
A61K47/18
【請求項の数】28
【全頁数】33
(21)【出願番号】特願2016-546927(P2016-546927)
(86)(22)【出願日】2015年1月19日
(65)【公表番号】特表2017-502995(P2017-502995A)
(43)【公表日】2017年1月26日
(86)【国際出願番号】EP2015000079
(87)【国際公開番号】WO2015106970
(87)【国際公開日】20150723
【審査請求日】2016年11月30日
(31)【優先権主張番号】1450046-6
(32)【優先日】2014年1月17日
(33)【優先権主張国】SE
(31)【優先権主張番号】1450546-5
(32)【優先日】2014年5月8日
(33)【優先権主張国】SE
(73)【特許権者】
【識別番号】506415207
【氏名又は名称】ストラウマン ホールディング アーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】アレッサンドラ・アピチェッラ
(72)【発明者】
【氏名】ペギー・ホイヌマン
【審査官】
横田 倫子
(56)【参考文献】
【文献】
特表２００２−５０４５２０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００２−５３８２１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２０１２−５２２８０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１２／１６６６２６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２００８−５２３０４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
J Struct Biol., 2007, Vol.160 No.1, p.57-69
【文献】
Langmuir, 2006, Vol.22, p.2227-2234
【文献】
Jpn J Oral Biol., 2001, Vol.43, p.175-183
【文献】
J Struct Biol., 1998, Vol.122, p.320-327
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３８／００
Ａ６１Ｋ ８／００
Ａ６１Ｋ ４７／００
Ａ６１Ｐ
Ａ６１Ｑ １１／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法であって、以下の工程：
ａ．エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質を発育中の哺乳類の歯から単離する工程、
ｂ．前記単離物を好適な医薬担体に溶解する工程、
ｃ．前記製剤のｐＨを最初にｐＨ４未満まで下げる工程、および
ｄ．前記製剤を４０〜１００℃の間に少なくとも１０分間加熱する工程
を含み
ただし、前記哺乳類はヒトではない、
前記製造方法。
ａ．エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質を発育中の哺乳類の歯から単離する工程、
ｂ．前記単離物を好適な医薬担体に溶解する工程、
ｃ．前記製剤のｐＨを最初にｐＨ４未満まで下げる工程、および
ｄ．前記製剤を４０〜１００℃の間に少なくとも１０分間加熱する工程
を含み
ただし、前記哺乳類はヒトではない、
前記製造方法。
【請求項2】
工程ｃ．において、前記製剤のｐＨを、２までのように、最高で３．５までのように、３．５未満まで下げる、請求項１に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項3】
工程ｄ．において、工程ｃ．の前記製剤を、少なくとも８０℃に少なくとも３時間加熱する、請求項１または２に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項4】
工程ｄ．において、工程ｃ．の前記製剤を、少なくとも５０℃に少なくとも１時間加熱する、請求項１または２に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項5】
前記好適な医薬担体は、ユニバーサル緩衝液である、請求項１または２に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパ
ク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
ク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項6】
前記好適な医薬担体は、酢酸水溶液、クエン酸水溶液、または水である、請求項３に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項7】
前記エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質は、１８〜２５ｋＤａの間、２０〜２４ｋＤａの間、２０〜２２ｋＤａの間、および２０ｋＤａからなる群から選択される平均分子量を有するアメロゲニンを少なくとも６０〜７０％含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項8】
工程ｄ．の前記製剤を好適な粘度調節剤と混合する工程を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項9】
前記製剤を好適な粘度調節剤と混合する前に、工程ｄ．の前記製剤のｐＨを少なくともｐＨ５に調節する工程を更に含む、請求項６に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項10】
前記粘度調節剤は、ＰＧＡである、請求項６または７のいずれか１項に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項11】
前記ＰＧＡは、電子ビーム殺菌されたＰＧＡであり、かつ前記製剤は、少なくともｐＨ５のｐＨを有する、請求項８に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項12】
前記ＰＧＡは、１３０ｋＤａより大きい重量平均分子量を有する殺菌されたアルギン酸プロピレングリコール（ＰＧＡ）である、請求項８または９に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項13】
工程ｄ．の前記製剤のｐＨを最高でｐＨ５に調節する工程を更に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項14】
前記製剤のｐＨをｐＨ２．５のような、ｐＨ２．５〜ｐＨ４．５の間のような、ｐＨ２〜ｐＨ５の間に調節する、請求項１３に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項15】
前記製剤を好適な粘度調節剤と混合する、請求項１３または１４のいずれか１項に記載
のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項16】
前記粘度調節剤は、ヒアルロン酸である、請求項１３または１５のいずれか１項に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項17】
前記ヒアルロン酸は、電子ビーム殺菌されている、請求項１６に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法。
【請求項18】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法で製造される、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤。
【請求項19】
アルギニンを更に含む、請求項１８に記載のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤。
【請求項20】
前記アルギニンは、最高で５００ｍＭの濃度を有する、請求項１９に記載の医薬、歯科用および／または化粧品製剤。
【請求項21】
２℃〜室温で少なくとも１２か月の貯蔵寿命および／または耐久性を特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の医薬、歯科用および／または化粧品製剤。
【請求項22】
室温で少なくとも１２か月の期間にわたる貯蔵寿命および／または耐久性を特徴とする、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の医薬、歯科用および／または化粧品製剤。
【請求項23】
好適なボーンセラミックおよび／または骨移植片を更に含む、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の医薬、歯科用および／または化粧品製剤。
【請求項24】
前記エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質は、前記製剤１ｍｌ当たり５〜３５ｍｇの間の濃度を有する請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の医薬、歯科用および／または化粧品製剤。
【請求項25】
前記エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質は、前記製剤１ｍｌ当たり少なくとも２９ｍｇの濃度を有する請求項２４に記載の医薬、歯科用および／または化粧品製剤。
【請求項26】
医薬品に用いられる、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の医薬、歯科用および／または化粧品製剤。
【請求項27】
創傷治療ならびに／またはインプラント周囲疾患および／もしくは歯周炎の治療に用いられる、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の医薬、歯科用および／または化粧品製剤。
【請求項28】
請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の医薬、歯科用および／または化粧品製剤、ならびに顆粒、ボーンセラミック、足場、骨移植片、天然骨材料、骨ブロック、義歯、およ
びインプラントからなる群から選択される少なくとも１つの更なる成分を含むキット。
びインプラントからなる群から選択される少なくとも１つの更なる成分を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、精製されたエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質を含む、医薬、歯科用および／または化粧品製剤であって熱安定性な製剤の製造方法に関する。特に、本発明は、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質の安定な製剤の製造方法であって、上記タンパク質および／または誘導体を、熱処理工程を施す前に低ｐＨ製剤に溶解する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
エナメルマトリックス内に存在するエナメルマトリックスタンパク質は、エナメル質の前駆体として最も周知である。セメント質形成前に、エナメルマトリックスタンパク質を発育中の歯根の先端部の歯根の表面に付着させる。付着したエナメルマトリックスがセメント質形成の開始因子であるという証拠がある。更に、セメント質の形成自体が歯周靱帯および歯槽骨の発育と関係がある。それゆえエナメルマトリックスタンパク質は、歯における自然な付着物の成長を模倣して歯周再生を促進することができる（非特許文献１）。
【0003】
単離されたエナメルマトリックスタンパク質は、エナメルマトリックスに隣接して発育する組織に天然にみられる１つの因子だけでなく変性されたカスケードの因子を誘導することができる。それらは、発育中の組織の自然環境に類似しており、従って組織再生、細胞分化および／または細胞の成熟のための天然の刺激を模倣することができる。
【0004】
エナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）は、ブタエナメルマトリックス由来の精製されたタンパク質の酸抽出物の形態で、重度の歯の付着喪失に罹患している患者において機能性の歯周靱帯、セメント質および歯槽骨を回復させるためにすでに成功裏に使用されてきた（非特許文献２）。
【0005】
更に、培養された歯周靱帯細胞（ＰＤＬ）に関する研究において、ＥＭＤが培養物中に存在する場合、これらの細胞の付着速度、成長および代謝が著しく増加することが示された。更に、ＥＭＤに曝露された細胞では、対照と比較した場合、細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達および成長因子の自己分泌産生を増加することが示された。他方で、上皮細胞では、ＥＭＤが存在した場合にｃＡＭＰシグナル伝達および成長因子分泌を増加させるが、増殖および成長いずれも阻害された（非特許文献３）。
【0006】
エナメルマトリックスタンパク質およびエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）は、すでに硬組織形成の誘導（すなわちエナメル質の形成、特許文献１）、硬組織間結合の確保（特許文献２および特許文献３）、皮膚および粘膜などの開口創治癒の促進、感染症および炎症性疾患の治療の際有益な効果の保有（特許文献４および特許文献５）、象牙質再生の誘導（特許文献６）、移植片定着の促進（特許文献７）、腫瘍処置におけるアポトーシスの誘導（特許文献８）、全身性感染または炎症に対する免疫応答不均衡の制御（特許文献９）、および腫瘍縮小術などの処置および／または外傷後の創腔および／または組織欠陥の充填促進（特許文献１０）を可能にすることが特許文献に記載されている。
【0007】
ＥＭＤは、多くのタンパク質、例えば、アメロゲニン、エナメリン、タフトタンパク質、プロテアーゼ、およびアルブミンから構成されている。アメロゲニンは、少なくとも６０％〜９０％まで、例えば、７０〜９０％であるＥＭＤの主成分であり、選択的スプライシングおよび制御された分泌後プロセッシングにより単一遺伝子から誘導可能な一群の疎水性タンパク質である。それらは、脊椎動物の進化を通して高度に保存されており、また調べたすべての高等脊椎動物間で全体に高いレベルの配列相同性を示す（８０％）。実際、ブタとヒトのアメロゲニン遺伝子転写物の配列は、塩基の４％しか異ならない。従って、エナメルマトリックスタンパク質および／またはＥＭＤタンパク質は、ブタ起源であっても、人体に接触した時に「自己」であるとみなされ、またアレルギー反応または他の望まない反応を引き起こすことなくヒトの歯の再生を促進できる。エナメルマトリックス誘導体タンパク質（ＥＭＤ）は、最も周知なエナメル質の前駆体である。ＰＧＡで増粘したその水溶液は、商標Ｓｔｒａｕｍａｎｎ（登録商標）、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）の下で商品化されている。
【0008】
ＥＭＤはＳｔｒａｕｍａｎｎ Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）ゲルの有効成分であり、歯周病患者のための再生治療に使用される。この製剤において、アルギン酸プロピレングリコール（ＰＧＡ）は、患部組織上にＥＭＤを放出するための担体として働く。Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）が、ＥＭＤの等電点（ｐＨ６．８）に近い、すなわち、ほぼ中性ｐＨの条件下で、適用されると、ＥＭＤは、沈殿し、細胞増殖および靭帯伸長を促進する緻密層を形成し、結果として比較的迅速に組織を再成長させる。Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）で処理された個体は、著しい骨の増加、および臨床付着の回復を経験し、また歯槽骨は、治療後１年を超えて持続を示している。しかし、ＥＭＤが安定であり続けることまたは適用前の沈殿が回避された場合、保管の間、ＥＭＤが特性において予測可能な進化を示すことが重要である。
【0009】
水溶液中にＥＭＤを保持するためには、溶液は、タンパク質の等電点（ＩＥＰ）をはるかに下回るｐＨを有するべきである。ＥＭＤに関して、ＩＥＰはｐＨ６．５であり、従ってより好ましくは、溶液のｐＨは約５．０である。一般的に、溶液の耐久性は、ＥＭＤが歯の表面上にまだ沈殿できるｐＨ値によって決定される。沈殿は、生理的な条件、すなわち、ＩＥＰに近いｐＨで生じることが考えられる。従ってまた、容易な適用のためには、溶液は、ＰＧＡで増粘させる。歯根環境およびＥＭＤ−ＰＧＡ混合物両方のｐＨおよび緩衝能が、ＥＭＤタンパク質の沈殿挙動に影響する。
【0010】
化学的に、ＰＧＡは、ケルプ（海藻）に由来するアルギン酸のエステルである。カルボキシル基の一部がプロピレングリコールによりエステル化され、一部は適切なアルカリにより中和され、また一部は遊離のままである。ＰＧＡ自体は酸性であり、従って、ＥＭＤ溶液に溶解した後、ＥＭＤ溶液のｐＨは低下する。更に、酸性条件下では、ＰＧＡの自然な分解により、ｐＨは時間と共に低下し続ける。従って、添加されるＰＧＡの固有な特性のために、製品のより長い貯蔵寿命を可能とするためには、溶液の比較的高いｐＨで開始することが必要である。
【0011】
アルギン酸プロピレングリコールは、２５℃で、１年後に約４０％の粘度減少を示し、また更に溶解しにくくなる。アルギン酸アンモニウムは、一般に上記のいずれよりも安定性が低い。アルギン酸は、上記製品の中で最も安定性が低く、周囲温度下で数か月以内に、いかなる長鎖材料もより短鎖に分解する。しかし、短鎖材料を含むアルギネートは、安定であり、また、鎖あたり約４０単位のウロン酸の重合度（ＤＰ）を有するアルギン酸は、２０℃で、１年間にわたって非常に小さい変化しか示さない。しかし、医薬錠剤における崩壊剤のとしてのアルギン酸の主な用途は、湿ったときの膨潤能に依存し、これは、ＤＰの変化に影響されない。従って、市販のアルギネートは、冷所、すなわち２５℃またはそれ以下の温度で中性のｐＨで保存されるべきであり、その理由は、高温および酸性ｐＨは、かなりの脱重合を引き起こし、商業的に有用な特性、例えば、粘度およびゲル強度に影響を及ぼすからである。上記アルギネートは、通常水分１０〜１３％を含み、また水分の比率が増加するに従って脱重合速度は増加し、従って、保管場所は、乾燥しているべきである。
【0012】
先述のように、ＥＭＤタンパク質は、以前よりＰＧＡ水溶液の形態で製剤化されてきており、ＰＧＡの分解は、酸性生成物をもたらし、これによりｐＨを時間と共に順々に低下させる。高温において、分解が加速される。生成物の加速される酸性化を防ぐためにまた、よってこの効果を制限するために、生成物を低温、すなわち、２〜８℃の温度範囲に移動および保存しなくてはならない。
【0013】
更に、市販のＳｔｒａｕｍａｎｎ Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）製剤中、エナメルマトリックスタンパク質（ＥＭＤ）をその単離の後、３時間約８０℃で加熱して、残りのプロテアーゼを不活性化する。この必要な熱−処理は、最近、ＥＭＤ自体の不可逆分解および変性をもたらす主要な因子であることが分かってきており、順々に製剤のより短い貯蔵寿命および／またはより低い活性に寄与する。
【0014】
その相対的に高いアメロゲニン含量を前提とすると、ＥＭＤ自己組織化は、ナノスケールの球状の凝集物、「ナノ球体」と言及されるものにもとづいて階層的な構造を含むことが予想される。しかし、そのような構造は、一般的にわずかにだけ安定であり、従って、環境的ストレス、例えば、温度またはｐＨの変化に敏感である。これらは、その自然なフォールディング状態において一般的に最も安定なタンパク質の溶解性の増加を順々に導く不可逆的アンフォールディングとなってよい。いずれにしても、タンパク質は、もはやその機能を実行できず、また最終的には早々沈殿する。更に、時々、凝集は、部分的にアンフォールディングな種間でも生じてもよく、生成物の制限的効果を誘導する。疎水性接触は、タンパク質の分子間相互作用および凝集の大いなる原因となると知られるが、荷電した残基もまた、重要な役割を担ってよい。従って、これらの後者の正に荷電したアミノ酸との相互作用は、アンフォールディングおよび／または早期の沈殿を制限する手段をもたらす。明らかに、いかなるそのような凝集抑制因子も、タンパク質の立体構造およびＥＭＤの再生特性に干渉すべきでない。更に、添加剤の選択は歯科用用途の臨床条件に適合すべきである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0015】
【特許文献1】米国特許第４，６７２，０３２号（Ｓｌａｖｋｉｎ）
【特許文献2】ＥＰ−Ｂ−０３３７９６７
【特許文献3】ＥＰ−Ｂ−０２６３０８６
【特許文献4】ＥＰ−１０５９９３４
【特許文献5】ＥＰ−０１２０１９１５．４
【特許文献6】国際特許公開第０１／９７８３４号
【特許文献7】国際特許公開第００／５３１９７号
【特許文献8】国際特許公開第００／５３１９６号
【特許文献9】国際特許公開第０３／０２４４７９号
【特許文献10】国際特許公開第０２／０８０９９４号
【非特許文献】
【0016】
【非特許文献1】Ｇｅｓｔｒｅｌｉｕｓ Ｓ、Ｌｙｎｇｓｔａｄａａｓ ＳＰ、Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ Ｌ．Ｅｍｄｏｇａｉｎ−ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂｉｏｍｉｍｉｃｒｙ．Ｃｌｉｎ ｏｒａｌ Ｉｎｖｅｓｔ４：１２０〜１２５頁（２０００）
【非特許文献2】Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍら、１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ２４、６５８〜６６８頁
【非特許文献3】Ｌｙｎｇｓｔａｄａａｓら、２００１、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ２８、１８１〜１８８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0017】
実験項で明らかに示されるように、水溶液環境中のＥＭＤ安定性を、タンパク質の凝集およびアンフォールディングを加速させるためにｐＨ変化および熱ストレスを用いて研究した（Ｃａｓａｌ ＨＬ、Ｋｏｈｌｅｒ Ｕ、Ｍａｎｔｓｃｈ ＨＨ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ β−ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｂ：ａｎ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐＨ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９９８；９５７（１）：１１〜２０頁．）。次いで結果をアルギニン存在下で得られる結果と更に比較して、ＥＭＤ分子間相互作用を制限するｐＨおよび／またはアルギニンの効果および従って変性、凝集、沈殿、アンフォールディングおよび／またはリフォールディングの程度を評価した。最後に、ＥＭＤおよびＥＭＤ／ＰＧＡの沈殿速度論におけるアルギニンの影響をストップトフロー（ＳＦ）濁度法を用いて評価した。この結論は、ＥＭＤのアンフォールディング／リフォールディング過程への新しくかつ驚くべき見通しをもたらしおよびＥＭＤベース生成物に対する低いｐＨおよび／または安定化添加剤としてのアルギニンの使用は、これらの効果的な貯蔵寿命を著しく延ばすための可能性を有する証拠をもたらした。
【課題を解決するための手段】
【0018】
従って、本発明は、改良された安定性、すなわち保管中ＥＭＤ製剤の延長された再生能を有するＥＭＤ製剤の製造方法を初めて記載する。
【0019】
本発明は、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法を初めて記載し、この製剤は、２℃〜室温で少なくとも１２か月、例えば室温で１２か月の貯蔵寿命および／または耐久性を有することを特徴とする。
【0020】
エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む上記製剤の製造方法は、一般的に以下の工程、ａ．発育中の哺乳類の歯に由来のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質を単離する工程、
ｂ．上記単離物を好適な医薬担体に溶解する工程、
ｃ．上記製剤のｐＨを最初にｐＨ４未満または最高でｐＨ４まで下げる工程、および、
ｄ．上記製剤を２０〜１００℃の間に少なくとも１０分間加熱する工程
を含む。
【発明を実施するための形態】
【0021】
一つの実施形態において、本発明の製剤のｐＨを、工程ｃ．において、ｐＨ４、３．９、３．８、３．７、３．６未満、または３．５未満まで、または最高で４まで、例えば２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９または４まで下げる。
【0022】
あるいは、工程ｃ．における本発明の製剤のｐＨを、別にｐＨ４〜ｐＨ２の間まで、例えば、ｐＨ４〜ｐＨ３．５の間まで、または例えばｐＨ３．５〜ｐＨ２の間まで下げることができる。
【0023】
工程ｃ．の製剤を、工程ｄ．において、少なくとも１０分間、２０〜１００℃に、例えば、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００℃に加熱する。一つの実施形態において、工程ｃ．の製剤を、工程ｄ．において、少なくとも８０℃に少なくとも１〜３時間、例えば、少なくとも８０℃に少なくとも３時間、または少なくとも５０℃に少なくとも１時間、または少なくとも２０℃に少なくとも１時間加熱する。
【0024】
工程ｄ．は、製剤中の内在するプロテアーゼおよび／または残渣汚染物質の不活性化の所望の結果を達成するために、必要であれば一回または数回繰り返すことができる。
【0025】
実験項において明らかに示されるように（図２Ａを参照）、熱処理および１２時間、２５℃でのインキュベーションの後、ＥＭＤは、α−へリックスの立体配座の著しい変化を示し、一方で、ネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）のβ−シートは、熱処理により大きく影響を受けることはなく、すなわち、ＥＭＤのかなりの凝集を観察することができた。
【0026】
ｐＨ２でのアルギニンの添加は、α−へリックスに関連した立体配座が熱処理後でさえ安定のままであること示す知見を導いた。更にβ−シートは、熱処理の後、不変のままであり、これは、露出面の立体配座の限定的な変化が生じたことを示唆する。従って、アルギニンは、ＥＭＤタンパク質の外部凝集部位であって、β−ターンを含んでよい部位に結合すると推論された。更に、ＥＭＤ結合部位を中和する間、アルギニンは、ナノ球体のサイズの増加にも見られる、タンパク質構造の緊密さを促進すると予想される。これらをまとめると、これらの結果は、熱処理に関して、アルギニンがｐＨ２でＥＭＤ構造を安定化することを暗示する。
【0027】
アルギニン非存在下、ｐＨ２でのＥＭＤ粒径分布（図２Ｃを参照）は、７０℃までの熱処理と２０℃への冷却が配座変化を導くことを示した（図３Ａ〜ＢにおけるＴＥＭ顕微鏡写真も参照）。そのネイティブ状態（７）のアメロゲニン特有の約７０ｎｍまたはそれ以下の直径のナノフィラメントおよびナノ球体が、図３Ａで見られるが、図３Ｂで見られるように、これらは、熱処理後部分的に凝集していた。ｐＨ２、アルギニン存在下では、熱処理後の凝集はなかった。アルギニン存在下ではＥＭＤの変性が生じなかったとすれば、熱誘導アンフォールディングは、ｐＨ２において存在しなかったと結論づけられる。従って、ＥＭＤのナノ球体構造は、実質的に元のままであった（図３Ｃ〜Ｄ）。
【0028】
それにもかかわらず、低いｐＨ、例えば、ｐＨ２で溶解され、２０および９０℃で、および熱処理後２０℃で測定されたＥＭＤは、温度−誘導される凝集は、冷却の間大いに逆進したことを示唆する（実験は示されない）。
【0029】
図４Ａに示されるように、ｐＨ５でのＥＭＤ製剤の熱処理により、結果として著しく改変したＥＭＤの分子組織となった。
【0030】
図４Ｃに見られるように、ｐＨ５でのＥＭＤ製剤の熱処理は、結果として凝集を増加させた（図５Ａ〜Ｂも参照）。ナノフィラメントおよび単離されたナノ球体は、最初に存在したが（図５Ａ）、熱処理の後広範囲の凝集が観察された。（図５Ｂ）。調製されたままの（ａｓ−ｐｒｅｐａｒｅｄ）ＥＭＤの大きさがアメロゲニン特有のものと更に一致するナノ球体は、熱処理の間凝集するものとみなされた。図４Ｄから分かるように、アルギニンは、この凝集を制限する。
【0031】
従って、ｐＨ２で観測されるように、ｐＨ５でのＥＭＤ製剤の熱処理は、結果として部分的にナノ球体の解離を生じることがある。このことは、図５Ｃ〜Ｄにおいて反映され、検体に最初存在するナノフィラメントは、熱処理後ナノ球体および更に小さい断片に分裂したことを示唆する。
【0032】
対照的に、ｐＨ１０において、タンパク質の立体配座は、より低いｐＨで見られるネイティブの立体配座に対して強力に改変される（図６Ａ）。更に、高いｐＨとイオン電荷の組み合わせは、アルギニン非存在下、熱処理の間二次構造を安定化する。他方で、アルギニン存在下、熱処理の前後で得られるスペクトルは、もはや重ならず；ランダムコイルの割合は減り、またβ−ターン構造に対応するピークは、再び区別できる（図６Ｂ）。
【0033】
図７は、高いｐＨにおけるＥＭＤの形態が、より低いｐＨで観察されるものと非常に異なり、広範囲なアモルファスゲル様凝集物を特徴とすることを確認する。
【0034】
好適な医薬担体は、一般的にユニバーサル緩衝液、例えば、ブリトン−ロビンソン緩衝液、カーモディ（Ｃａｒｍｏｄｙ）緩衝液、酢酸緩衝液（酢酸／酢酸ナトリウム）、生理食塩水緩衝液、クエン酸緩衝液（クエン酸／クエン酸ナトリウムおよび／またはＨＣｌ／クエン酸ナトリウム）、または物理的にナトリウムの緩衝液である。
【0035】
好適な医薬担体は、更に酢酸水溶液、クエン酸水溶液および水からなる群から選択される。
【0036】
一つの実施形態において、酢酸を、ｐＨ２〜ｐＨ８、例えばｐＨ５で使用する。
【0037】
特に、実験的試験において、ブリトン−ロビンソン緩衝液を使用する。
【0038】
本発明は、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法に関し、ここでエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質は、１８〜２５ｋＤａの間、例えば２０〜２４ｋＤａの間、２０〜２２ｋＤａの間および２０ｋＤａからなる群から選択される平均分子量を有するアメロゲニンを少なくとも６０〜１００％、例えば少なくとも６０〜７０、６０〜８０、７０〜９０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９７％、例えば少なくとも９９％含む。
【0039】
本発明は、更にエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む医薬、歯科用および／または化粧品製剤の製造方法であって、工程ｄ．の製剤を好適な粘度調節剤と混合することを更に含む方法に関する。
【0040】
一つの実施形態において、上記方法は、上記製剤を好適な粘度調節剤、例えばＰＧＡと混合する前に、工程ｄ．の製剤のｐＨを少なくともｐＨ５に調節することを更に含む。上記ＰＧＡは、電子ビーム殺菌されたＰＧＡでもよい。好ましくは、上記ＰＧＡは、１３０ｋＤａを超える重量平均分子量を有する殺菌されたアルギン酸プロピレングリコール（ＰＧＡ）である。
【0041】
別の実施形態において、上記方法は、上記製剤を好適な粘度調節剤と混合する前に、工程ｄ．の製剤のｐＨを最高でｐＨ５に調節することを更に含む。上記製剤のｐＨは、一般的にｐＨ２〜ｐＨ５の間に、例えばｐＨ２．５〜ｐＨ４．５の間に、または、ｐＨ２〜ｐＨ４の間に、例えばｐＨ２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．３、３．５、３．８、４．０、４．３、または４．５に調節される。
【0042】
上記別の実施形態において、粘度調節剤は、ヒアルロン酸からなる群から選択される。ヒアルロン酸は電子ビーム殺菌することができる。
【0043】
さらに別の実施形態において、本発明の方法は、上記製剤をいかなる好適な粘度調節剤とも混合せずに、工程ｄ．の製剤のｐＨを最高でｐＨ５に調節することを含む。上記製剤のｐＨは、一般的にｐＨ２〜ｐＨ５の間に、例えばｐＨ２．５〜ｐＨ４．５の間に、またはｐＨ２〜ｐＨ４の間に、例えばｐＨ２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．３、３．５、３．８、４．０、４．３、または４．５に調節される。
【0044】
本発明は、本発明に従う方法により製造されたエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む医薬、歯科用および／または化粧品製剤にも関する。
【0045】
従って、本発明は、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む医薬、歯科用および／または化粧品製剤であって、２℃〜室温で少なくとも１２か月、例えば室温で少なくとも１２か月の貯蔵寿命および／または耐久性を特徴とする製剤に関し、この製剤は以下の工程：ａ．発育中の哺乳類の歯に由来のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質を単離する工程、
ｂ．上記単離物を好適な医薬担体に溶解する工程、
ｃ．上記製剤のｐＨを最初にｐＨ４未満または最高でｐＨ４まで下げる工程、および
ｄ．上記製剤を２０〜１００℃の間に少なくとも１０分間加熱する工程、
を含む方法により製造される。
【0046】
本発明の方法で製造されたエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む医薬、歯科用および／または化粧品製剤は、一般的にエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質を上記製剤１ｍｌ当たり５〜３５ｍｇの間の濃度、例えば上記製剤１ｍｌ当たり少なくとも５、１０、１５、２０、２５、２９、３０、３１、３２または３５ｍｇの濃度で含む。
【0047】
別の実施形態において、本発明の方法で製造されたエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む医薬、歯科用および／または化粧品製剤は、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質を製剤１ｍｌ当たり１００μ〜５ｍｇの間、例えば、製剤１ｍｌ当たり少なくとも１００、１５０、２５０、５００μｇｌまたは、例えば、製剤１ｍｌ当たり少なくとも１、２、３、４、または５ｍｇの濃度で含む。
【0048】
本発明の方法で製造されたエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む医薬、歯科用および／または化粧品製剤は、更にアルギニンを含むことができる。一つの実施形態において、上記アルギニンは、上記製剤に添加される場合、１〜５００ｍＭの濃度、例えば、少なくとも１、１０、１００、２５０、３００、４００または５００ｍＭの濃度を有する。別の実施形態において、上記アルギニンは、１、１０、１００、２５０、３００、４００、４５０、または５００ｍＭの濃度を有する。一般的に、製剤中のアルギニン濃度は、最高で５００ｍＭである。
【0049】
アルギニンは、一般的な天然のアミノ酸である。その構造、Ｈ結合を形成するその能力および生理的な条件の下でのその電荷分布によって、アルギニンが容易に負に荷電した基と結合し、また極性環境、例えば水と強く相互作用もできる。アルギニンは、実際にタンパク質の凝集阻害のための添加剤として有効であることが証明され、また多くの場合ネイティブの構造の安定性において相対的に小さい効果を有することも知られており、よって非変性試薬とみなされる。
【0050】
本発明者らは、ｐＨ変化および熱ストレスを使用して、タンパク質の凝集およびアンフォールディングを加速させて、水性環境中でのＥＭＤの安定性を研究した。次いで、その結果を低いｐＨおよび／またはアルギニン存在下で得られた結果と比較して、ＥＭＤ分子間相互作用を制限するそれらの効果および従って変性、凝集、沈殿、アンフォールディングおよび／またはリフォールディングの程度を評価した。最後に、ＥＭＤおよびＥＭＤ／ＰＧＡの沈殿速度論に対する低いｐＨおよびアルギニンの影響をストップトフロー（ＳＦ）濁度法を用いて評価した。
【0051】
本発明を導くこの知見は、ＥＭＤアンフォールディング／リフォールディング方法への新しくまた驚くべき見通しおよび低いｐＨおよび／またはＥＭＤベース生成物に対する安定化添加剤としてのアルギニンの使用は、その有効貯蔵寿命を著しく延長する可能性を有するという証拠をもたらす。
【0052】
様々な分析技術の使用により、本発明は、ＥＭＤ水溶液へのアルギニンの添加が酸性ｐＨでのＥＭＤの変性を制限できることを初めて示し、更に、ＥＭＤ水溶液へのアルギニンの添加により、高いｐＨでの大規模の凝集を逆転できることも立証した。ＥＭＤの等電点に近いｐＨ７へのｐＨの段階状（ａ ｓｔｅｐ−ｌｉｋｅ）の増加に続くＥＭＤの放出速度論の研究は、アルギニンが水溶液またはＰＧＡゲル担体からの沈殿速度に対して不利な影響を有さないことも示した。実際に、初期ｐＨ５を有しアルギニンを伴う系の応答は、アルギニンの有無両方でｐＨ２での応答と同様であり、更にＥＭＤにおけるアルギニンの安定化効果を反映する。従って、実験１に示される結果は、アルギニンは、適用部位でのＥＭＤの放出を損なうことまく、再生治療で使用されるＥＭＤ／ＰＧＡベースゲルの貯蔵寿命を著しく改良する能力を有することを示す。
【0053】
本発明は、更に本発明の方法で製造されたエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む医薬、歯科用および／または化粧品製剤であって、好適なボーンセラミックおよび／または骨移植片を更に含む該製剤に関する。
【0054】
本発明は、医薬用途の、本発明の方法で製造されたエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む医薬、歯科用および／または化粧品製剤に関する。
【0055】
特に、本発明の方法で製造されたエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む医薬、歯科用および／または化粧品製剤は、創傷治療ならびに／またはインプラント周囲疾患および／もしくは歯周炎の治療または石灰化組織の形成を誘導するための用途の医薬の製造における使用することが意図される。
【0056】
創傷治癒のための方法ならびに／またはインプラント周囲疾患および／もしくは歯周炎の治療のための方法または石灰化組織の形成を誘導するための方法もまた、本発明において想定される。ここで、それを必要とする患者は、本発明の方法で製造されたエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質ならびに好適な医薬担体を含む医薬、歯科用および／または化粧品製剤で治療されるかまたは製剤を投与される。
【0057】
請求項１８〜２８のいずれか１項に記載の医薬、歯科用および／または化粧品製剤、ならびに顆粒、ボーンセラミック、足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）、骨移植片、天然骨材料、骨ブロック、義歯、およびインプラントからなる群から選択される少なくとも１つの更なる成分を含むキットが記載される。
【0058】
定義「軟組織」、（すなわち、非石灰化組織）は、本文脈において、歯肉組織と互換的に使用することができ、またコラーゲンまたは上皮含有組織として定義されてもよく、皮膚および粘膜、筋肉、血液およびリンパ管、神経組織、腺、腱、眼および軟骨が挙げられる。一般に、本発明の製剤は、それを必要とする患者の皮膚および粘膜だけでなくすべての歯肉組織の創傷の治癒を促進するために使用できる。
【0059】
用語「石灰化組織」における「硬組織形成」は、酵素アルカリホスファターゼ活性および良好な血液供給を前提条件として、ミネラル受容できる有機マトリックスの細胞による産生であると要約することができる。一般的に、本発明の製剤は、それを必要とする患者における硬組織形成の促進に用いることができる。
【0060】
活性エナメル物質本明細書で用いられるとき、「エナメルマトリックス」は、エナメル質の前駆体を意味し、またいかなる関連した自然源から、すなわち、歯が発育中の哺乳動物から得ることができる。好適な源は、屠畜された動物、例えば仔牛、ブタまたは子羊に由来する発育中の歯である。別の源は、例えば、魚の皮である。本文脈において、用語「活性エナメル物質」は、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質を起源無差別に包含するために用いられる。
【0061】
エナメルマトリックスは、前に記載のように発育中の歯から調製することができる（ＥＰ−Ｂ−０３３７９６７およびＥＰ−Ｂ−０２６３０８６）。エナメルマトリックスを、削り取り、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質を、例えば、緩衝液、希酸もしくは塩基または水／溶媒混合物のような水溶液で抽出し、次いでサイズ排除、脱塩または他の精製工程、或いは続く、凍結乾燥により調製される。酵素は、熱または溶媒処理により選択的に失活させてもよく、その場合、その誘導体は、凍結乾燥なしで、液体形態で保存することができる。
【0062】
エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質の代わりの源として、一般的に当業者に周知な適用できる合成経路も使用しても良く、または、ＤＮＡ−技術により修飾された真核生物および／または原核生物の培養細胞を使用してよい。エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質は、従って組み換え体の源の、或いは遺伝学的および／または化学的に修飾されたものでもよい（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照）。
【0063】
本文脈において、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質は、選択的スプライシングもしくはプロセシングにより、または自然長タンパク質の酵素的もしくは化学的開裂のいずれかにより、またはｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでのポリペプチドの合成により（例えば、組み換えＤＮＡ法および／または二倍体細胞の培養）によって自然に製造された、１つまたはいくつかのエナメルマトリックスタンパク質またはそのようなタンパク質の部分もしくは断片を含む。エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質は、更にエナメルマトリックスに関連するポリペプチドまたはタンパク質を含む。ポリペプチドまたはタンパク質は、好適な生分解性の担体分子、例えば、ポリアミン酸もしくは多糖、またはそれらの組み合わせと結合していてよい。更に、用語のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質は、また、合成の類似物質を包含する。
【0064】
タンパク質は、ペプチド結合により共に連結したアミノ酸残基により構成される生体高分子である。アミノ酸の線状ポリマーとしてのタンパク質は、ポリペプチドとも呼ばれる。一般的に、タンパク質は、５０〜８００アミノ酸残基を有し、従って、約６，０００〜約数十万ダルトンまたはそれ以上の範囲の分子量を有する。小さいタンパク質は、ペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチドと呼ばれる。本発明の文脈において、本発明に従って用いられるための「ポリペプチド断片」は、これに限定されないが、長さで、１〜５０アミノ酸、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０アミノ酸のポリペプチドに言及する。そのようなポリペプチドは、更に５０アミノ酸より長くてもよい。
【0065】
エナメルマトリックスタンパク質は、エナメルマトリックスに通常存在するタンパク質、すなわちエナメル質の前駆体（Ｔｅｎ Ｃａｔｅ：Ｏｒａｌ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ、１９９４；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊａｎ．１９９８、１０６Ｓｕｐｐｌ．１：２８２−９１）、またはそのようなタンパク質の切断により得ることができるタンパク質である。一般的にそのようなタンパク質は、１２０，０００ダルトンより低い分子量を有し、またアメロゲニン、非アメロゲニン、プロリンリッチ非アメロゲニンおよびタフテリンを含む。
【0066】
本発明に従って使用されるタンパク質の例は、アメロゲニン、プロリンリッチ非アメロゲニン、タフテリン、タフトタンパク質、血清タンパク質、唾液タンパク質、アメロブラスティン、シースリン、およびそれらの誘導体、ならびにそれらの混合物である。更に、本発明に従って使用される他のタンパク質は、市販品ＥＭＤＯＧＡＩＮ（登録商標）（スウェーデン、ビオラＡＢ）に見られる。
【0067】
ＥＭＤＯＧＡＩＮ（登録商標）（スウェーデン、ビオラＡＢ、Ｓ−２０５ １２Ｍａｌｍｏ）は、残留するプロテアーゼを不活化するために約８０℃で３時間加熱された３０ｍｇエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質、およびタンパク質およびビヒクルを別々に試験しない場合には適用前に混合される１ｍｌのビヒクル溶液（アルギン酸プロピレングリコール）を含む。重量比は、２０、１４および５ｋＤａの主なタンパク質のピークの間においてそれぞれ約８０／８／１２である。
【0068】
一般的に、エナメルマトリックスの主要なタンパク質は、アメロゲニンとして知られる。それらは、生理学的条件下で凝集物を形成する著しく疎水性の物質である。それらは、他のタンパク質またはペプチドを有してもよく、またはそれらのための担体であってもよい。
【0069】
それにもかかわらず、アメロゲニンが、進化の非常に保存的なタンパク質であり、またその種の間のホモロジーは高いと記録されているという周知の事実の観点で、類似配列がラット、ヒト、またはマウスのエナメルマトリックスタンパク質で、例えば類似の生物学的効果、例えば造骨活性を発するアメロゲニン中において見られることが現に想定される。従って、本発明は、更にブタアメロゲニンの類似配列も包含し、これらは、ヒトアメロゲニンに少なくとも８０〜９５％同一であり、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であり、また類似の生物活性を示す。
【0070】
本発明において、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質は、哺乳類組織から単離すること、精製された組み換えポリペプチド断片であること、または合成的に製造されたポリペプチド断片であることができる。当業界で周知なように、組み換え技術により製造されたポリペプチドは、特に、原核生物系で製造される場合、内因性の鋳型タンパク質とわずかに異なる。本発明は、組み換え技術により製造されたポリペプチド断片を包含し、これらは、内因性ヒトアメロゲニンに少なくとも９５％同一、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であり、また類似の生物活性を示す。
【0071】
他方で、合成的に製造されるポリペプチドは、当業界で周知なように、当然、その本来の生物学的活性、例えば、その抗炎症、またはその血管新生促進効果に妨害および／または影響を及ぼさないような化学的順列の多様性を持たせて設計することができる。従って、本発明は、更に合成的に並び替えされたポリペプチド断片であって、ヒトアメロゲニンに対して少なくとも８０〜９５％同一である断片、その同族体、類似物または医薬的に許容されるそれらの塩を包含し、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であり、また類似の生物活性を示す。
【0072】
更に、ポリペプチド断片の配列の任意の保存的変異体であって、ヒトアメロゲニンに少なくとも８０〜９５％同一であり、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であり、また類似の生物活性を示す変異体は、上記配列との機能的な関係により本発明の範囲内であるとみなされる。
【0073】
配列の保存的変異体は、本文脈において異なる種間の同一のアミノ酸配列の変異体を比較した場合、それは、少なくとも例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％に保持されたアミノ酸配列として定義される。この分野で周知なように、変異体の保持の度合いは、ＰＡＭ（Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ、ａｎｄ Ｏｒｃｕｔｔ（１９７８）Ａｔｌａｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑ．Ｓｔｒｕｃ．５：３４５−３５２参照）の誘導に従って、またはＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８９（２２）：１０９１５−９に記載のようにブロックスのデータベースに由来のブロックスの配列の比較にもとづいて算出することができる。
【0074】
エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質は、実質的に単離された形態であってよい。それらを、好適な担体または希釈剤と混合してよく、それらの企図された目的を妨げなることはなく、実質的に単離されたとみなされていると理解されるであろう。
【0075】
本発明において、ローカルアルゴリズムプログラムは、同一性を決定するのに最も好適である。ローカルアルゴリズムプログラム、（例えばＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）は、１つの配列の部分列と次の配列の部分列を比較し、また部分列の組み合わせおよびそれらの部分列のアラインメントを見つけ出し、それにより最も高い全体的な類似スコアを生み出す。内部ギャップがあれば、ペナルティーになる。ローカルアルゴリズムは、単一ドメインまたはちょうど共通の結合部位を有する２つのマルチドメインタンパク質の比較に有効である。
【0076】
同一性および類似性を決定する方法は、公に利用可能なプログラム中に成文化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊら（１９９４））ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら（１９９０））が挙げられるが、これに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の出所（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら（１９９０））から公に利用可能である。それぞれの配列解析プログラムは、デフォルト・スコアリング・マトリックスおよびデフォルト・ギャップ・ペナルティを有する。一般的に、分子生物学者は、使用するソフトウェアプログラムにより確立したデフォルトの設定を使用することが予想される。
【0077】
エナメルマトリックスのタンパク質は、一般的に高分子量部分と低分子量部分に分けることができ、それらのフラクションは、一般的にアメロゲニンと言及される酢酸抽出可能なタンパク質を含む（ＥＰ−Ｂ−０３３７９６７およびＥＰ−Ｂ−０２６３０８６を参照せよ）。
【0078】
一般的に、エナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体およびエナメルマトリックスタンパク質は、疎水性物質であり、すなわち水に、特に上昇した温度下で溶解しにくい。一般的に、これらのタンパク質は、非生理学的ｐＨ値および低温、例えば約４〜２０℃、一般的にほぼ４〜８℃で水溶性であり、一方で、体温（３５〜３７℃）および天然のｐＨ（約ｐＨ７）では凝集して沈殿するであろう。
【0079】
特に好ましい実施形態において、本発明に従って使用できる製剤は、従って、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質であって、ｉｎ ｖｉｖｏの適用の後凝集物またはオリゴマーを形成できまた沈殿するタンパク質を含む。沈殿しやすい上記凝集物の粒径は、７０ｎｍ未満であり、一般的に１ｎｍ〜７０ｎｍの間の範囲であり（アメロゲニンナノ球体）例えば約１μｍ〜約２０ｎｍ、例えば１μｍ〜２０ｎｍの間、１μｍ〜１０ｎｍの間、５μｍ〜１０ｎｍの間、１０μｍ〜１ｎｍの間、１００μｍ〜１０ｎｍの間、１００μｍ〜１ｎｍの間、１μｍ〜１ｎｍの間、１μｍ〜５ｎｍの間、１μｍ〜１５ｎｍの間である。
【0080】
医薬製剤本発明に従う医薬製剤は、ユニバーサル緩衝液、例えば、ブリトン−ロビンソン緩衝液、カーモディ緩衝液、酢酸緩衝液（酢酸／酢酸ナトリウム）、生理食塩水緩衝液、クエン酸緩衝液（クエン酸／クエン酸ナトリウムおよび／またはＨＣｌ／クエン酸ナトリウム）、または物理的ナトリウム緩衝液、酢酸水溶液、クエン酸水溶液および水からなる群から選択される好適な医薬担体を含む。
【0081】
アルギニンが製剤に添加する場合、アルギニンを緩衝液に添加し、また緩衝液とＥＭＤを混合する前にｐＨを調節する。
【0082】
ブリトン−ロビンソン緩衝液（ａｋａ ＢＲＢ ａｋａ ＰＥＭ）は、ｐＨ２〜ｐＨ１２の範囲で用いられる「ユニバーサル」ｐＨ緩衝液である。一般的に、ＮａＯＨを使用してｐＨをより高い値に調節する。ユニバーザル緩衝液は、強度を減少させる（ｐＫａを増加させる）酸の混合物からなり、ｐＨの変化は添加したアルカリの量におよそ比例する。それは、０．０４Ｍ Ｈ３ＢＯ３、０．０４Ｍ Ｈ３ＰＯ４および０．０４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＨの混合物からなり、ＮａＯＨで所望のｐＨに滴定される。ブリトンおよびロビンソンは、ｐＨ２．５からｐＨ９．２（またｐＨ１２への緩衝液）まで添加されるアルカリに対応して本質的に線形なｐＨ応答を与える第二の製剤を更に提案した。この混合物は、０．２Ｍ ＮａＯＨで滴定された０．０２８６Ｍクエン酸、０．０２８６Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．０２８６Ｍ Ｈ３ＢＯ３、０．０２８６Ｍ ベロナールおよび０．０２８６Ｍ ＨＣｌからなる。
【0083】
一つの実施形態において、クエン酸をｐＨ２のあたりで製剤に使用し、またトリス塩酸をｐＨ８あたりで製剤に使用した。
【0084】
本発明の文脈において、製剤は、医薬および／または治療用のおよび／または化粧品の製剤でよい。実際に、医薬および／または治療用製剤は更に化粧品製剤およびいわゆる医薬と化粧品の間の中間領域、すなわち薬用化粧品に属する製剤を含むように企図される。
【0085】
個体（例えば動物またはヒト）への投与のために、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質は、好ましくは、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体、および場合により１つまたはそれ以上の好適な医薬担体を含む医薬製剤に製剤化される。
【0086】
投与される本発明に従うエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質を含む製剤は、投与のために好適な任意の経路、例えば患者への導管、注射器、スプレーまたはドレインデバイスを用いて全身投与により適応してよい。
【0087】
更に、製剤は、例えば血液、リンパ球、腹水、もしくは髄液への注入による、または吸入による全身投与として、手術に関連する投与に適合させてもよい。全身適用用に、本発明の製剤は、従来、本発明に従う非毒性の医薬的に許容される担体および賦形剤を含むことができ、小球体およびリポソームなどを含むことができる。
【0088】
本発明に従う製剤の投与は、例えば、限定されないが、経口、非経口、静脈内の、頬の、耳の、直腸の、膣の、腹腔内の、局所（真皮）、もしくは鼻の経路のような任意の他の従来型の投与経路によってまたは、例えば、歯根もしくは歯根管のような体腔への投与により更に行うことができる。
【0089】
他の適用はもちろん、例えば、義歯、プロテーゼ、インプラントへの適用、および体腔、例えば口腔、鼻の、および膣腔への適用に更に関連してよい。粘膜は、口腔、頬、鼻、耳、直腸および膣粘膜から選択してよい。更に適用は、創傷または他の軟組織損傷の直接的に上にまたは上に向けることができる。
【0090】
更に、歯科／歯科学領域内の適用は、非常に重要である。関連する例は、歯周（歯科）ポケット、歯肉もしくは歯肉創傷または口腔内に位置する創傷または口腔外科に関する適用である。
【0091】
本発明に従って用いられる製剤は、限定されないが、例えば、流体、半固体または固体製剤であり、例えば、限定されないが、例えば、無菌生理食塩水、リンガー溶液、グルコース溶液、リン酸緩衝生理食塩水、血液、血漿、水などに溶解した輸液液体、粉末、マイクロカプセル、生体吸収性パッチ、飲薬、シート、包帯、膏薬、インプラント、ピル、スプレー、石鹸、坐薬、膣剤、練歯磨き、ローション、洗口液、シャンプー、微粒子、ナノ粒子、スプレー、エーロゾル、吸入器、溶液、分散剤、湿潤剤、懸濁液、エマルジョン、ペースト、軟膏、親水性軟膏、クリーム、ゲル、ハイドロゲル（例えば、ポリエチレングリコール）、包帯材、デバイス、鋳型、スマートゲル、グラフト、溶液、エマルジョン、懸濁液、粉末、フィルム、発泡体、パッド、スポンジ（例えば、コラーゲンスポンジ）、経皮送達システム、顆粒、粒状体、カプセル、アガロースまたはキトサンビーズ、錠剤、マイクロカプセル、凍結乾燥粉末、顆粒、粒状体またはペレット、およびそれらの混合物の形態であってよい。
【0092】
好適な沈殿防止剤は、例えば、天然ゴム、例えば、アラビアガム、キサンタンガム、またはタラカントガム；セルロース例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＲＣ５９１、メチルセルロース）；アルギネートおよびキトサン、例えば限定されないが、アルギン酸ナトリウムなどである。
【0093】
本発明に従って用いられる液体製剤は、例えば、限定されないが、医療用インプラントもしくはデバイス、または骨置換材料の表面上に適用される溶液、分散液、懸濁液でよい。いったん適用されると、製剤は、凝固でき、例えば乾燥により固体または少なくとも高い粘性の製剤となり、保存中またはインプラントもしくはデバイスが使用されている場合に溶解しない。
【0094】
そのような製剤は、好ましくは、殺菌条件で適用されおよび／または適用後、照射もしくはエチレンオキサイドガスへの曝露により殺菌される。製剤が液体製剤の形態の場合、製剤は、医療用インプラントもしくはデバイス、または骨置換材料が体に導入される少し前に更に適用してもよい。エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質を含む製剤を医療用インプラントもしくはデバイス、または骨置換材料に適用する代替案として、上記製剤を、医療用インプラントもしくはデバイスまたは骨置換材料、例えば先述の通りかなりの割合の上皮細胞を含む組織に接触する組織表面に適用してよい。更に、上記製剤を、医療用インプラントもしくはデバイス、または骨置換材料の両方に、およびそれらに接触する組織上に適用してよい。
【0095】
本発明に従う製剤は、本明細書にすでに開示されているものに加えて更に従来型の医薬実務例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」および「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ，Ｊ．＆Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８．に従って製剤化してよい。
【0096】
好適な医薬担体は、上記製剤が投与される個体に実質的に無害の物質である。そのような賦形剤は、通常国営保健医療機構により与えられる条件を満たす。公式な薬局方、例えば、英国薬局方、アメリカ合衆国薬局方およびヨーロッパ薬局方が、好適な医薬担体に対して基準を設定する。
【0097】
好適な医薬担体は、溶媒、緩衝剤、防腐剤、湿潤剤、キレーティング剤、酸化防止剤、安定剤、乳化剤、沈殿防止剤、ゲル形成剤、軟膏基材、浸透促進剤、香料、粉末および皮膚保護剤を含んでもよい。しかし、本発明はそれらに限定されないことを強調すべきである。
【0098】
本発明において、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質を含む製剤を、ポリマーマトリックスに取り込むことができ、ポリマーマトリックスの崩壊により、酵素作用により、および／または拡散により放出される。上記ポリマーマトリックスは、細胞の内殖に好適なまたは細胞−閉塞性のいずれかである。従って本発明において、特に製剤内の低い全濃度でエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質の医薬および／または化粧品製剤が構成され、ここで上記エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質の空間的なおよび／または選択的な放出制御により、大割合のエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質が、適切な細胞活性の時に放出されることが可能となる。
【0099】
従って、本発明の一つの局面は、本発明に従うエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質を投与する医薬および／または治療用製剤に関し、細胞の成長、内殖および／もしくは移動に好適なまたは細胞−閉塞性のいずれかのポリマーマトリックスならびにフラクションおよび／またはポリペプチド断片を含み、ここで、上記マトリックスは、強力な求核剤と共役不飽和結合との間、または共役不飽和基との間の求核付加反応により形成される。
【0100】
練歯磨きまたは洗口液製剤または、歯または歯根に適用される他の製剤において、本発明に従うエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質は、わずかに酸のｐＨのビヒクル中溶解した状態で存在するかまたは中性ｐＨのビヒクル中分散液として存在するかいずれかでよい。本発明に従うエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質は、歯の表面に保護層を形成し、それによりカリエスを生じさせるバクテリアの付着を防ぐことが予期される。そのようなデンタルケア調製液において、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質は、１つまたはそれ以上のカリエス予防効果のある他の成分、特にフッ素または別の微量元素、例えばバナジウムまたはモリブデンと共に製剤化することができる。中性のｐＨにおいて、微量元素は、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質と結合し（例えばイオン結合により）または埋め込まれると信じられており、エナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）タンパク質が例えばカリエスを生じさせるバクテリアによる酸生成物のために約５．５またはそれ以下のｐＨで溶解する場合、そのカリエス予防効果を発揮するために微量元素を放出する。
【0101】
本発明に従って用いられる医薬製剤において、本発明に従うエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体は、一般的に約０．０１％〜約９９．９％ｗ／ｗの範囲の濃度で存在する。適用される製剤量は、通常約０．００５ｍｇ／ｍｍ２〜約５ｍｇ／ｍｍ２例えば、約０．０１ｍｇ／ｍｍ２〜約３ｍｇ／ｍｍ２に対応する歯髄の面積ｃｍ２あたりの全タンパク質の量となる。
【0102】
本発明に従うエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体が、液体製剤の形態で投与されるこれらの場合、製剤中の本発明に従うエナメルマトリックスタンパク質および／またはエナメルマトリックス誘導体の濃度は、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．１〜約３５ｍｇ／ｍｌ、例えば３０ｍｇ／ｍｌに対応する範囲である。いくつかの場合、より高い濃度が望ましく、また例えば少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌの濃度も更に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0103】
【図2-1】ｐＨ２および２５℃でのＥＭＤ（Ａ）およびＥＭＤ／アルギニン（Ｂ）の二次微分ＦＴ−ＩＲスペクトル、９０℃での熱処理前（立体曲線）および後（ハッチド曲線（ｈａｔｃｈｅｄ ｃｕｒｖｅｓ））。ｐＨ２および２０℃での３Ｄ−ＤＬＳスペクトルＥＭＤ（Ｃ）およびＥＭＤ／アルギニン（Ｄ）、７０℃での熱処理前（青）および後（赤）。
【図3】ｐＨ２および２０℃でのＥＭＤおよびＥＭＤ／アルギニンの透過型電子顕微鏡写真、９０℃での熱処理前（Ａ〜Ｃ）および後（Ｂ〜Ｄ）。
【図4-1】ｐＨ５および２５℃下ＥＭＤ（Ａ）およびＥＭＤ／アルギニン（Ｂ）の二次微分ＦＴ−ＩＲスペクトル、９０℃での熱処理前（立体曲線）および後（ハッチド曲線）。ｐＨ５および２０℃での３Ｄ−ＤＬＳスペクトルＥＭＤ（Ｃ）およびＥＭＤ／アルギニン（Ｄ）、７０℃での熱処理前（青）および後（赤）。
【図5】２０℃でおよびｐＨ５でのＥＭＤおよびＥＭＤ／アルギニンの透過型電子顕微鏡写真、９０℃での熱処理前（Ａ〜Ｃ）および後（Ｂ〜Ｄ）。
【図6-1】ｐＨ１０および２５℃でのＥＭＤ（Ａ）およびＥＭＤ／アルギニン（Ｂ）の二次微分ＦＴ−ＩＲスペクトル、９０℃での熱処理前（立体曲線）および後（ハッチド曲線）。ｐＨ１０および２０℃でのＥＭＤ（Ｃ）およびＥＭＤ／アルギニン（Ｄ）の３Ｄ−ＤＬＳスペクトル、７０℃での熱処理前（青）および後（赤）。
【図7】ｐＨ１０および２０℃でのＥＭＤおよびＥＭＤ／アルギニンの透過型電子顕微鏡写真、９０℃での熱処理前（Ａ〜Ｃ）および後（Ｂ〜Ｄ）。
【図8】ＢＲ−緩衝液中（Ａ）ＥＭＤおよび（Ｂ）ＰＧＡ／ＥＭＤにおけるストップトフロー測定由来のＴ（ｔ）（ｐＨ２またはｐＨ５）、アルギニン存在下または非存在下、水酸化ナトリウムを混合してそのｐＨを７へ上げた。
【図10】検体のｐＨを７すなわちＥＭＤ等電点（ｐＨ６．８）近くに上げた後、時間ｔの関数として、透過率、Ｔのストップトフロー測定により反映されるようなＥＭＤ水溶液およびＳｔｒａｕｍａｎｎ Ｅｍｄｏｇａｉｎ（商標）（ＥＭＤ／ＰＧＡ）ゲル由来の過渡な（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）沈殿速度論を示す。
【図11】４本の注射器、Ｂｅｒｇｅｒ ｂａｌｌミキサー（ＢＢ）および高濃度ミキサー（ＨＤＳ）（２９）を備えるＢｉｏＬｏｇｉｃ ＳＦＭ−４００ストップトフロー分光光度計を含むストップトフロー測定用の実験配置。
【実施例】
【0104】
実験項本発明の実験例は、低ｐＨでの使用および／または凝集抑制剤としてのアルギニンの使用を通して、安定性を改良し、従って、低ｐＨでの保存の間Ｅｍｄｏｇａｉｎ（商標）ゲルの再生能を伸ばすための努力を記載する。低ｐＨおよび／またはアルギニンの有無によらずＥＭＤ検体を、フーリエ変換赤外分光分析、紫外可視吸収分光法、３次元動的光散乱法および透過電子顕微法により分析した。これらの結果は、アルギニンが、低ｐＨでの熱循環の間ＥＭＤのネイティブ構造を安定化するだけでなく、高ｐＨでリフォールディングも更に誘導してよいことを示した。更に、ストップトフロー分光光度法は、アルギニンの存在がｐＨの段階状増加に続いて、水溶液またはゲル錯体由来のＥＭＤの沈殿に影響しないことを示した。
【0105】
実験１材料および方法
ＥＭＤ
１０ｍｇ／ｍｌ酢酸水溶液中２９ｍｇ／ｍｌの濃度で２０１２ＥＭＤ溶液（Ｂｉｏｒａ／Ｓｔｒａｕｍａｎｎ）を−８℃で操作された凍結乾燥機を用いて凍結乾燥した。ＥＭＤ溶液１００〜１５０ｇを２つの２５０ｍｌ三角フラスコに入れ、これらを液体窒素に浸し、４８時間凍結乾燥した。凍結乾燥した材料を回収し、またスパチュラ、乳鉢および乳棒で静かに撹拌して均質化した。次いで、室温（ＲＴ）下、ブリトン−ロビンソン緩衝液（０．１Ｍの純粋なＨ３ＢＯ３、Ｈ３ＰＯ４、ＣＨ３ＣＯＯＨ）中、および２、２．５および１０に調節されたｐＨで、２９ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ濃度で、ＥＭＤを再溶解した。ＥＭＤの添加前に５００ｍＭの濃度のアルギニンを緩衝液に添加した。アルギニンを含むまたは含まない検体を、安定化させるために、特性評価の前に４℃で終夜保存した。
【0106】
ＰＧＡＦＭＣ ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒに由来のＰＧＡをＳｔｅｒｉｇｅｎｉｃｓ、サンディエゴにより２０ｅＶ電子加速器（１００ｇポーチあたり３０ｋＧｙ）を用いて殺菌した。それは、Ｂｉｏｒａ ＡＢ（ストローマンＡＧ、バーゼル）により提供され、また使用前に冷蔵庫中４℃で保存した。
タンパク質−担体（ＥＭＤ／ＰＧＡ）親水コロイド複合体をＥＭＤ水溶液のＰＧＡ粉末への添加により調製した（ＥＭＤ／ＰＧＡ１：２）。この混合物を、ポリマーが室温で完全に溶解し、次いで安定化のため４℃で終夜保存されるまで、磁石撹拌子で撹拌した。すべての検体を二重に脱イオン化されたｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて調製した。
【0107】
伝送モードのフーリエ変換赤外分光分析（ＦＴ−ＩＲ）伝送モードの赤外分光分析を使用して熱処理（１７）後ＥＭＤの二次構造における変化を観察した。様々なｐＨで調製されたＥＭＤ溶液のアリコート２００μｌを２５℃で１時間インキュベートした。次いで、温度を９０℃に２℃／分で上昇させまたこの温度で更に１時間アリコートをインキュベートした。次いで、それらを２５℃へ２℃／分で冷却しまたこの温度で１２時間インキュベートしてそれらの安定性を改良した。熱処理の前後に、それぞれの検体の１０μｌドロップを研磨したＣａＦ２ＩＲ窓に置きまたそれを乾燥させることによりＩＲ吸光測定を実施した。捕捉の後、二次微分解析および標準化を用いてアミドＩ領域にスペクトルの詳細構造を決定した。
【0108】
紫外−可視吸収分光法ＥＭＤ水溶液を１ｍｍクオーツキュベットに置きまたＶ−６７０バリアン社製分光計で２８０ｎｍの固定波長で分析した。この値は、タンパク質の疎水性中心に存在するアミノ酸、トリプトファンの吸収に対応する。ＥＭＤの溶解性を反映する吸収強度、すなわち、溶媒へのトリプトファンの曝露を２０〜８０℃の間の温度で測定した（Ｓｃｈｍｉｄ、２００１）。
【0109】
動的光散乱法高度にモジュール化した３次元相互相関動的光散乱法（ＤＬＳ）技術は、ＥＭＤ凝集寸法を研究するために用いられた。Ｈｅ−Ｎｅレーザーを発散する６３２．８ｎｍ波長の偏光光線を備えるＬＳ装置を用いて測定を行った。検体を１０ｍｍ直径のガラス管に置き、また２０〜７０℃の間で１０℃ずつの段階の温度で測定を行った。サンプルセルを所望の温度の＋／−０．１℃以内にプログラム制御されたサーモスタットを用いて維持した。分散強度の変動をそれぞれ６００秒の３ランを平均化することにより９０°の固定角で集めた。分散強度の時間相関関数（ＴＣＦ）をＣＯＮＴＩＮ法の使用により分析した（Ｂｌｏｃｋ、Ｉ．Ｄ．＆Ｓｃｈｅｆｆｏｌｄ，Ｆ．Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ３Ｄｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｕｒｂｉｄ ｓａｍｐｌｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、２０１０；８１：１２３１０７−７．）。
【0110】
透過電子顕微法（ＴＥＭ）アルギニン有および無のＥＭＤの形態学を、様々な緩衝液中および様々なｐＨで８０ｋＶ Ｔｅｃｎａｉ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴＷＩＮ透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて明視野モードで研究した。選択した検体を９０℃で熱処理し、２５℃で冷却し、１２時間インキュベートした。ＴＥＭ分析用の検体を、論文に記載のように二滴のシーケンシャル方法によりネガティブ染色を用いて調製した。（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｐａｔｈ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／〜ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ／ｂｉｔｍ／ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ＿ａｎｄ＿ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ＥＭ／ｎｅｇ＿ｓｔａｉｎ．ｐｄｆ）。
【0111】
ストップトフロー分光光度法ＥＭＤ水溶液およびＥＭＤ／ＰＧＡ由来の放出速度論、およびそれらのアルギニン−安定化された対照物を、２９０ｎｍの波長の光を発するＭＯＳ−２５０分光計ユニットに結合したバイオロジックＳＦＭ４００／Ｓデバイスで迅速速度論ストップトフロー（ＳＦ）分光光度法により研究した。アルギニン有および無の、１ｍｇ／ｍｌＥＭＤ検体をブリトン−ロビンソン緩衝液中ｐＨ２および５で調製した。次いで、初期ｐＨ２の検体に２５０ｍＭ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加しおよび５０ｍＭＮａＯＨを初期ｐＨ５の検体に添加することによりｐＨを７（すなわち生理的なｐＨ）に上げた。６ｍｌ／ｓの全流量および約３５１μｌの全フローセル容積をすっかり用いた。これらの条件の下で、透過率の検出のためのＦＣ−１５フローセルの使用は、１０ｍｓの不感時間を意味した。緩衝液付き検体およびＮａＯＨ溶液を高性能注射器中に保存し、また高密度ミキサーを経由して観測フローセルに（１．５ｍｍ光路長）等価な容量で注入した（１：１）。検体透過率を約１５秒の時間を通して測定し４回の測定を繰り返すことにより変化した再現性を測定した。方法および実験準備を図１１に図式的に示した（Ｂａｒｔｈ，Ｉ．Ｇｒｉｌｌｏ，ａｎｄ Ｍ．Ｇｒａｄｚｉｅｌｓｋｉ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈｌｙ ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｓｔｏｐｐｅｄ−ｆｌｏｗ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｔｅｎｓｉｄｅ Ｓｕｒｆ．Ｄｅｔ．、２０１０、４７：３００〜３０６頁）。
【0112】
結果と考察アルギニンを含むまたは含まない、様々なｐＨでのＥＭＤ溶液の構造分析
ＥＭＤは、４℃で最も溶解性が高いことは当業界で周知である。従って、ＥＭＤは、４℃で溶解し、また次いでそれぞれＴ＝８０、７０および１００℃での熱処理の前後において２５℃（室温）で分析し、強温ストレス後でさえ室温周辺でその安定性を研究した。
【0113】
ＥＭＤの立体配座および凝集挙動図１（ａ）に示されるように、ｐＨ２でのＢＲ緩衝液中ＥＭＤの紫外可視吸収は、温度が２０から３０℃に上がったとき、増加し、ＥＭＤタンパク質がアンフォールドする傾向を示し、それらの内部残基を緩衝液に曝露した。この傾向は、高温で逆転したが、吸収は、その初期レベルから徐々に減少し、およそ４０℃からＥＭＤが沈殿をし始めることを意味した。２つの主な差をアルギニン存在下観察した（図１（ｂ））：２０℃におけるベースライン強度は、増加し、アルギニン非存在下の場合よりも、低温で、より広範囲の凝集を示し、また高温における吸収の減少は、ほとんど示さなく、減少した沈殿速度を示唆した。ｐＨ５で得られた結果を図１（ｃ）および１（ｄ）に示した。この挙動は、定性的にｐＨ２で観察されたものと似ているが、吸収は、この場合３０℃で飽和に達し、アルギニンの存在下でさえｐＨ５で、可溶化するＥＭＤの増加する傾向を反映するが、アルギニンは再び高温での沈殿速度を低下させると推測された。
【0114】
図２Ａは、アミドＩ領域に対応する波数範囲におけるｐＨ２でのブリトン−ロビンソン緩衝液中のＥＭＤの二次微分ＦＴ−ＩＲスペクトルを示す。２５℃で、調製されたままのＥＭＤ検体のスペクトルは１６５２および１６６０ｃｍ−１でのピークを示し、これは、α−へリックスに帰属された。天然のβ−シートのピークは、更に１６２０、１６３３および１６４３ｃｍ−１で見え、同様に分子間β−シートのピークは、１６９８ｃｍ−１であった（Ｌａｍｂｒｉｇｈｔ ＤＧ、Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ｓ、ＢｏｘｅｒＳＧ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ
ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ、１９９１．１５８：２４９〜２６０頁）。熱処理および１２時間２５℃でのインキュベーションの後、１６６０ｃｍ−１でのピーク強度は、減少し、１６５２ｃｍ−１でのピークは、１６５４ｃｍ−１でのピークと置き換わり、これは、乱れた立体配座と以前から関係しており（Ｂａｒｔｈ Ａ、Ｚｓｃｈｅｒｐ Ｃ．Ｗｈａｔ ｖｉｂｒａｔｉｏｎｓ ｔｅｌｌ ｕｓ ａｂｏｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２００２；３５（４）：３６９〜４３０頁）、α−へリックスの著しい立体配座変化を示唆する。一方、１６３３ｃｍ−１での天然β−シートのピークは、上記熱処理により大いには影響を受けず、残りのピークは、修正された強度および位置を示した。従って、１６２０ｃｍ−１でのピークは、１６１７ｃｍ−１でのより強いピークと置き換わり、１６９８ｃｍ−１での分子間β−シートのピークは、約１６９７ｃｍ−１へシフトし、また追加のピークは１６８８ｃｍ−１に現れた。これは、１６２０〜１６１５ｃｍ−１の範囲および高い波数での強いピークである限り、アミドＩ領域の制限が、分子間接触の顕示を示すことは重要である（Ｂａｒｔｈ Ａ、Ｚｓｃｈｅｒｐ Ｃ．Ｗｈａｔ ｖｉｂｒａｔｉｏｎｓ ｔｅｌｌ ｕｓ ａｂｏｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２００２；３５（４）：３６９〜４３０頁）。１６６８、１６７５および１６８２ｃｍ−１での更なる３つのピークは、β−ターンに帰属され、これは、タンパク質構造の緊密さの指標でありまた凝集部位に関連してよいと考えられており、なぜならそれらがタンパク質の外部表面でも現れるからである。熱処理の後、１６８２ｃｍ−１での主なβ−ターンピークは、約１６８０ｃｍ−１にシフトし、再び凝集を示す可能性がある（Ｂａｒｔｈ Ａ、Ｚｓｃｈｅｒｐ Ｃ．Ｗｈａｔ ｖｉｂｒａｔｉｏｎｓ ｔｅｌｌ ｕｓ ａｂｏｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２００２；３５（４）：３６９〜４３０頁）。熱処理は、更に結果として１６６８ｃｍ−１でのβ−ターンピークの強度のわずかな増加および１６７５ｃｍ−１でのピーク強度のより実質的な減少となった。
【0115】
ｐＨ２でのアルギニンの添加は、熱処理の前におよそ１６６０ｃｍ−１で中央ピークのα−へリックスピークの強度の減少を導き、また更に熱処理後の小さい減少を導き、一方で、１６５２ｃｍ−１でのピークは、熱処理の前後ともに存在し（図２Ｂ）、α−へリックスと関係した立体配座は安定なままであることを示した。更に、約１６２０ｃｍ−１でのβ−シートのピークは、熱処理後不変のままであり、これは、曝露された表面の限定的な立体配座変化が生じていたことを示唆する。熱処理の前および後でのスペクトル中の最も強いピークは、約１６８１ｃｍ−１でのβ−ターンピークであった。このピークの位置は、アルギニン非存在下での熱処理後に観察されるものと同一であり、そのような場合、１６８２ｃｍ−１から１６８１ｃｍ−１へのそのオリジナル値由来のシフトは、凝集に起因した。これは、１６８１ｃｍ−１でのβ−ターンピークの高い強度により、タンパク質−タンパク質相互作用が、タンパク質構造の緊密さを促進することが予測されるアルギニンの存在により阻害されないことを示唆する。まとめると、これらの結果は、アルギニンが、熱処理に関してｐＨ２でＥＭＤ構造を安定化させることを意味する。しかし、アルギニンが熱誘導アンフォールディングおよび／または変性を阻害するのかどうか、またはそれが、高温での変性に続く２５℃でのリフォールディングをただ支持するのかは明らかでない。これを更に研究するために、従って、３Ｄ−ＤＬＳおよび紫外−可視吸収実験をｉｎ ｓｉｔｕで行った。
【0116】
アルギニン非存在下、ｐＨ２でブリトン−ロビンソン緩衝液中のＥＭＤ粒径分布は、ＤＬＳで決定されるように、熱処理前に約８および８０ｎｍで２つの主なピークを示した（図２Ｃ）。７０℃までの熱処理および２０℃への冷却の後、粒径分布は、より高い値で生じるピークを有するはるかなブロードになった。従って、ＦＴ−ＩＲの結果と一致し、立体配座の変化は、この場合、図３Ａ〜ＢでＴＥＭ顕微鏡写真によっても反映されるように優位に立った。約７０ｎｍまたはそれ以下の直径のナノフィラメントおよびナノ球体、その天然の状態の一般的なアメロゲニンは、（Ｆａｎｇａ ＰＡ、Ｃｏｎｗａｙｂ ＪＦ、Ｍａｒｇｏｌｉｓｃ ＨＣ、Ｓｉｍｍｅｒｄ ＪＰ、Ｂｅｎｉａｓｈａ Ｅ．Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｎａｎｏｓｃａｌｅ．Ｐｎａｓ２０１１；１０８（３４）：１４０９７〜１４１０２頁）、図３Ａで目に見えるが、図３Ｂで示されるように、これらは熱処理後部分的に沈殿した。ｐＨ２でのアルギニンの存在は、ＥＭＤに緊密さを、ＦＴ−ＩＲの結果にも一致した図２Ｄにより示唆されるように与える。ＦＴ−ＩＲは、アルギニンの存在下ＥＭＤの変性は生じないことを示すので、熱誘導アンフォールディングは、ｐＨ２で存在しなかったことを結論づける。従って、ＥＭＤのナノ球体構造は、実質的に完全なままであり続けた（図３Ｃ〜Ｄ）。
【0117】
更に、３３０ｎｍでのピークに関連した熱誘導された立体配座変化が依然存在した一方、それらは、ほとんど印を付けなかった。実際に、検体の初期状態は、低波長での吸収カーブの形態により反映されるように、続く冷却および２０℃でのインキュベーションの後大いに回収され、おそらくＥＭＤの成分タンパク質の疎水性領域に結合することによりアルギニンが構造上の再編成を制限する証拠を更にもたらした。
【0118】
ｐＨ５で調製されたままのＥＭＤのＦＴ−ＩＲスペクトル（図２Ａ）は、１６５２ｃｍ−１で特に強いα−へリックスのピークを示し、一方１６６０ｃｍ−１でのα−へリックスのピークの強度は、ｐＨ２で観察されたものと同様であった（図２Ａ）。より低い波数において、天然のβ−シートのピーク特性は、１６３３、１６２３および１６１５ｃｍ−１で観察され、この後者のピークは、ｐＨ２で存在しない（図２Ａ）。β−ターンピークは、更に１６６８および１６８２ｃｍ−１で存在するが、およそ１６７５ｃｍ−１でのピークは、１６３ｃｍ−１での主なピークと融合されｐＨ２でよりもはるかに弱く、少ない緊密さの構造を示唆する。最後に、分子間β−シートバンドに対応するおよそ１６８８ｃｍ−１および１６９５ｃｍ−１でのスペクトルの高い波数領域でのピークの低い強度は、相対的に弱い分子間接触を示した。熱処理は、これらのピークの強度にいくつかの変化となるが、それぞれ１６４３ｃｍ−１および１６９５ｃｍ−１での天然のおよび分子間β−シートピークを除いて、二次構造への主な定性的な修飾とならず、より低い波数へとシフトした。従って、ＥＭＤの分子組織が、ｐＨを上げることで著しく修正される一方で、熱処理後更なる主な変化を受けなかった。
【0119】
ｐＨ５でのＥＭＤへのアルギニンの添加の主な結果は、高い波数領域、すなわちβ−ターンおよび分子間βシートバンドに対応する立体配座での変化であった（図４Ｂ）。熱処理の前に、アルギニン非存在下およそ１６７５ｃｍ−１で観察されるβ−ターンピークが、１６６８ｃｍ−１で中心の主なピークと併合し、また１６９５ｃｍ−１で分子間β−シートピークは強度において増加した。アルギニンの存在下、両方のβ−ターン成分が、区別できた。本発明をこの特定の仮説に限定することを望まないが、この効果は、アルギニンおよび溶媒との相互作用からタンパク質を排除する緩衝液中のイオンとの間の複合体の形成に起因してよい。更に、アルギニンは、ＥＭＤの外部結合部位とも相互作用してよい。熱処理は、１６６８ｃｍ−１および１６７５ｃｍ−１での２つのピークの再発により、また強度が減少した高い波数での分子間β−シートピークにより反映されるように、結果としてβ−ターンの改変となる。しかし、アルギニンの存在下、熱処理が分子間相互作用に関係するピークに影響する一方で、天然のα−へリックス（１６５２および１６６０ｃｍ−１）は、アルギニンの非存在下よりもより安定に現れ、対応するピークは、強度における著しい変化を示した。
【0120】
図４ＣにおけるＤＬＳの結果は、ｐＨ５で約８０ｎｍとなる、調製されたままのＥＭＤの粒径分布の最大値を示した。熱処理は、ピークの拡大および５００ｎｍへのシフトによりおよびＴＥＭ画像により更に示されるように、増加した凝集を導く。（図５Ａ〜Ｂ）。ナノフィラメントおよび単離されたナノ球体が、最初に存在するが（図５Ａ）、熱処理後、広範囲の凝集が観察された（図５Ｂ）。ＦＴ−ＩＲが、ほとんどアンフォールディングを示さないとすれば、調製されたままのＥＭＤでの寸法が再びアメロゲニンの典型的なものと一致するナノ球体は、（Ｆａｎｇａ ＰＡ、Ｃｏｎｗａｙｂ ＪＦ、Ｍａｒｇｏｌｉｓｃ ＨＣ、Ｓｉｍｍｅｒｄ ＪＰ、Ｂｅｎｉａｓｈａ Ｅ．Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｎａｎｏｓｃａｌｅ．Ｐｎａｓ２０１１；１０８（３４）：１４０９７〜１４１０２頁）、熱処理の間、凝集すると想定された。図４Ｄに見られるように、アルギニンはこの凝集を限定した。実際、アルギニン存在下熱処理の後、約１００ｎｍでの主なＤＬＳピークは、８０ｎｍ以下にシフトし、また強度において、わずかに減少し、また追加のピークが約６ｎｍで生じた。従って、ｐＨ２で観察されるように、熱処理は、結果としてより大きい凝集物の沈殿となってよい。これは、図５Ｃ〜ＤにおけるＴＥＭ画像により反映され、検体に存在する初期ナノフィラメントが、熱処理中および／または熱処理後に凝集および沈殿してナノ球体だけが画像化されたことを示唆した。
【0121】
ｐＨ１０において、タンパク質の立体配座は、ＦＴＩＲスペクトルにより支持されるように、より低いｐＨで見られる天然の立体配座に関して強く改変され（図６Ａ）、これは、相対的に例えばランダムコイル構造の高い割合を示した。更に、高いｐＨとイオン電荷の組み合わせが、アルギニン非存在下での熱処理の間、二次構造を安定化した。アルギニンの存在下、他方で、熱処理の前後で得られるスペクトルは、もはや重なりあってなく、ランダムコイルの割合は減少し、またβ−ターン構造に対応するピークは、再び区別できた（図６Ｂ）。
【0122】
ＤＬＳの結果（図６Ｃ〜Ｄ）が追加の洞察をほとんど与えなかった一方で、図７のＴＥＭ顕微鏡写真は、ＥＭＤの形態がより低いｐＨで観察されるものと非常に異なるということを確認し、広範囲のアモルファスゲル様凝集物により特徴づけられた。
【0123】
ＥＭＤ溶液およびＥＭＤ／ＰＧＡゲルからの放出速度論：アルギニンの役割図８は、検体のｐＨを７、すなわちＥＭＤ等電点（ｐＨ６．８）近くに上げた後、時間ｔの関数として、透過率、Ｔのストップトフロー測定により反映されるように、ＥＭＤ水溶液およびＥＭＤ／ＰＧＡからの過渡放出速度論を示した。
これらの結果はまた、初期ｐＨの２への低下またはアルギニンの添加が天然ＥＭＤ立体配座の安定化させることを示した。これは、ＥＭＤおよびＥＭＤ／ＰＧＡゲル両方に対して明らかであり、それぞれのデータセットを重ねる限りにおいて、ｐＨ５でアルギニンなしで調製される検体を除いて類似の放出動力学を示し、（図８Ａ〜Ｂ）、これは、与えられたｔでの著しくより大きい濁り（すなわちより低いＴ）を示し、また従って、大きい沈殿物を形成するためのより大きな傾向を示した。ＰＧＡとの複合体化は、ＥＭＤの内在的応答を修正しないという結果となった。それにもかかわらず、おそらくＰＧＡマトリックスによるＥＭＤの物理的制限のためにＴは、最も長いｔで、ＥＭＤよりも、ＥＭＤ／ＰＧＡゲルで数１０％大きく、図８Ａおよび図８Ｂの比較は、ＰＧＡがＥＭＤの沈殿を制限することを示唆した。これは、ただ可能ならばＰＧＡが少なくとも部分的に溶媒媒体により溶解される、完全なＥＭＤの沈殿を意味する。ＰＧＡの効果は、二次指数減衰関数
【数1】
【0124】
式１は、タンパク質の沈殿物の形成における２つの段階、振幅Ａ１を伴う高速過程および減衰定数Τ１、および振幅Ａ２を伴うスロー重力依存過程（ｓｌｏｗ ｇｒａｖｉｔｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ）および減衰定数Τ２を記載する。表１が示すように、スロー過程における減衰定数は、ＥＭＤよりＥＭＤ／ＰＧＡで著しく大きい。これらの結果は、アルギニンの添加が、外科的な手順におけるその用途に対する代表的な条件の下で、沈殿における不利な影響を持たないことを示し、またＰＧＡの存在下ｐＨ５で凝集に関するＥＭＤにおけるアルギニン分子を安定化する効果を確認する。更に、ＰＧＡは、そのような安定化効果はなく、ＥＭＤ／ＰＧＡゲル由来のよりゆっくりで効果的な放出速度は、ＰＧＡヒドロゲルネットワーク中のＥＭＤの物理的取り込みに起因し、沈殿の後者の段階において、大規模凝集を遅らせる。
【0125】
ＥＭＤ溶液およびＥＭＤ／ＰＧＡゲル由来の沈殿速度論：アルギニンの役割図１０は、検体のｐＨを７へすなわちＥＭＤ等電点（ｐＨ６．８）近くに上げた後、時間ｔの関数として透過率Ｔのストップトフロー測定により反映されるように、ＥＭＤ水溶液およびＳｔｒａｕｍａｎｎ Ｅｍｄｏｇａｉｎ（商標）（ＥＭＤ／ＰＧＡ）ゲル由来の過渡的沈殿速度論を示す。これらの結果は初期ｐＨの２への低下またはアルギニンの添加が、結果としてＥＭＤ立体配座の安定化となることを再び示した。これは、重ね合されたそれぞれのデータセットである限りＥＭＤおよびＥＭＤ／ＰＧＡゲル両方に対して明らかであり、ｐＨ５、アルギニン非存在下で調製された検体を除いて類似の放出動力学を示し（図１０（ａ）〜（ｂ）および表１）、これは、与えられたｔでの著しくより大きい濁り（すなわちより低いＴ）、また従って大きい沈殿物を形成するより大きな傾向を示した。ＰＧＡとの複合体形成は、損傷した歯周組織へのその適用の代表的な条件の下ＥＭＤの内在的応答を修正しなかったという結果となる。
【0126】
結論様々な分析的技術を使用して、ＥＭＤ水溶液へのアルギニンの添加が酸性ｐＨでのＥＭＤの変性を制限することが示され、また、添加が高いｐＨで大規模なアンフォールディングを逆転させることができるという証拠も存在する。ｐＨにおけるＥＭＤの等電点近くであるｐＨ７への段階状の増加に続くＥＭＤの放出速度論の研究は、更にアルギニンが水溶液またはＰＧＡゲル担体からの沈殿速度における不利な影響を有しないことも示した。実際に、初期ｐＨ５を有しアルギニンを伴う系の応答はアルギニンの有無両方でｐＨ２での応答と同様であり、更にＥＭＤにおけるアルギニンの安定化効果を反映する。従って、これらの結果は、歯科治療のための製品への使用がすでに有効と確認されているアルギニン（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｒ、Ｎｉｓｈｉｋｏｒｉ Ｓ、Ｓｈｉｒａｋｉ Ｋ．Ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｒｅｄｕｃｅｄ ｌｙｓｏｚｙｍｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｆｏｌｄｉｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｌ．Ｐｒｏｇ２００４；２０：１１２８〜１１３３頁．１５．Ｐｅｔｒｏｕ Ｉ、 Ｈｅｕ Ｒ、 Ｓｔｒａｎｉｃｋ Ｍ、Ｌａｖａｎｄｅｒ Ｓ、Ｚａｉｄｅｌ Ｌ、Ｃｕｍｍｉｎｓ Ｄら。Ａ ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｄｅｎｔｉｎ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ：ｈｏｗ ｄｅｎｔａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ８％ａｒｇｉｎｉｎｅ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｗｏｒｋ ｔｏ ｄｅｌｉｖｅｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｌｉｅｆ ｏｆ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｅｅｔｈ．Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ２００９；２０（１）：２３〜３１頁）が、適用部位でＥＭＤの放出を損なうことなく、再生治療において用いられるＥＭＤ／ＰＧＡベースゲルの保存寿命を著しく改良する可能性を有することを示す。
【0127】
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