特許 6483220 豚の肉質形質判断用遺伝子マーカー及びその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6483220

(24)【登録日】2019年2月22日

(45)【発行日】2019年3月13日

(54)【発明の名称】豚の肉質形質判断用遺伝子マーカー及びその利用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20190304BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20190304BHJP

   C12Q 1/6827 20180101ALI20190304BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALI20190304BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20190304BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20190304BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 ZZNA

   C12Q1/6806 Z

   C12Q1/6827 Z

   C12Q1/6837 Z

   C12Q1/686 Z

   C12Q1/6876 Z

【請求項の数】12

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2017-214510(P2017-214510)

(22)【出願日】2017年11月7日

(65)【公開番号】特開2018-78889(P2018-78889A)

(43)【公開日】2018年5月24日

【審査請求日】2017年11月7日

(31)【優先権主張番号】10-2016-0152247

(32)【優先日】2016年11月15日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】516373203

【氏名又は名称】リパブリック オブ コリア（マネージメント ルーラル デベロップメント アドミニストレーション）

(73)【特許権者】

【識別番号】505448855

【氏名又は名称】コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

(73)【特許権者】

【識別番号】517389469

【氏名又は名称】チェジュ ナショナル ユニバーシティ インダストリー−アカデミック コオペレイション

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チョ インチョル

(72)【発明者】

【氏名】パク ヒボク

(72)【発明者】

【氏名】イ チョンウン

(72)【発明者】

【氏名】アン ジンソプ

(72)【発明者】

【氏名】ハン サンヒュン

【審査官】 飯室 里美

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１６−０１３０９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２１３４３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１９５９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５０４８４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Genetics Selection Evolution, 2015, Vol.47, 7

【文献】 Mamm Genome, 2015, Vol.26, p.181-190

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

豚の肉質形質判断のための、配列番号１で表されるポリヌクレオチドにおいて１５２４番目〜１５２７番目の塩基を含む５〜３００個の連続した塩基で構成されるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを含む遺伝子マーカーの使用。

【請求項2】

前記肉質形質が、豚肉の筋内脂肪含量、肉色、保水力及びせん断力からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

配列番号１で表されるポリヌクレオチドにおいて１５２４番目〜１５２７番目の塩基を含む５〜３００個の連続した塩基で構成されるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを含む遺伝子マーカーを検出することができる製剤を含む、豚の肉質形質判断用組成物。

【請求項4】

前記製剤が、前記遺伝子マーカーに特異的に結合するプライマーまたはプローブである、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

前記プライマーが、配列番号６５及び６６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

請求項３に記載の組成物を含む、豚の肉質形質判断用キット。

【請求項7】

前記キットが、ＲＴ-ＰＣＲキットまたはＤＮＡチップキットである、請求項６に記載のキット。

【請求項8】

（ａ）個体から分離された試料のＤＮＡから、配列番号１で表されるポリヌクレオチドにおいて１５２４番目〜１５２７番目の塩基を含む５〜３００個の連続した塩基で構成されるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを含む遺伝子マーカーを増幅させる段階；及び
（ｂ）前記（ａ）段階の増幅産物の塩基配列を決定する段階を含む、豚の肉質形質を判断する方法。

【請求項9】

前記増幅産物にＡＣＧＴの連続した塩基が含まれている場合、豚の肉質形質が外来豚のものより優れると判断する（ｃ）段階をさらに含むものである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

配列番号１で表されるポリヌクレオチドにおいて１５２４番目〜１５２７番目の塩基を含む５〜３００個の連続した塩基で構成されるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを含む遺伝子マーカーを検出することができる製剤を含む、韓国土種豚の判別用組成物。

【請求項11】

（ａ）個体から分離された試料のＤＮＡから、配列番号１で表されるポリヌクレオチドにおいて１５２４番目〜１５２７番目の塩基を含む５〜３００個の連続した塩基で構成されるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを含む遺伝子マーカーを増幅させる段階；及び
（ｂ）前記（ａ）段階の増幅産物の塩基配列を決定する段階を含む、韓国土種豚の判別方法。

【請求項12】

前記増幅産物にＡＣＧＴの連続した塩基が含まれている場合、韓国土種豚であると判断する（ｃ）段階をさらに含むものである、請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、豚の肉質形質判断用遺伝子マーカー及びその利用に関するもので、具体的には配列番号１で表されるポリヌクレオチドにおいて１５２４番目〜１５２７番目の塩基を含む５〜３００個の連続した塩基で構成されるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを含む、豚の肉質形質判断用遺伝子マーカー組成物、前記遺伝子マーカーを検出することができる製剤を含む、豚の肉質形質判断用組成物及び韓国土種豚の判別用組成物、キット、マイクロアレイ、豚の肉質形質を判断する方法及び韓国土種豚を判別する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

豚は約２００余種の品種が存在し、その中でヨーロッパの品種が約３３％、アジア品種は約３０％存在すると一般的に知られている。これらの豚品種は毛色、サイズ、体型などの表現型の違いを通じて簡便に識別されるが、赤身の場合は、時間の経過に応じて色度、保水力、せん断力などが異なるため、一般人だけでなく専門家のレベルでも豚肉を介して肉眼で品種を区別するのは難しい点があった。

【0003】

最近、豚肉の品質を向上するための努力が多くなされている。豚を一定の規格で飼育したり、科学的なシステムを介して管理し、そこから得られた土種豚の豚肉をブランド化しており、すでに様々なブランドの豚肉が商業的に販売されている。

【0004】

これらの研究の一環として、様々なＤＮＡ分析手法を用いて豚肉の品種を判別する方法を開発及び発展させようとする方向に活発な研究が行われている。例えば、特許文献１には、豚の一日当増体量、背中脂肪厚さ、肉質形質に関連する特異ＤＮＡマーカーを利用して、豚の形質が優れた豚を選抜することができる遺伝子検定方法が開示されており、特許文献２には、豚の筋細胞分化に関与することが知られているミオゲニン遺伝子の５’プロモーター部位の単一塩基配列の違いによる変異（ＳＮＰ）を利用した豚筋細胞数の増加確認用ＤＮＡ標識因子が開示されている。しかし、それでも豚の肉質形質レベルを正確に判断するための方法は開発されていない状態であり、また、ＭＹＨ３遺伝子を利用して、豚の肉質形質レベルを判断する方法は開発されていない。

【0005】

このような背景の下、本発明者らは、遺伝形質を通じて豚肉の品質を判断することができる方法を開発するために鋭意研究努力した結果、ＭＹＨ３遺伝子が豚の肉質形質を決定する遺伝子であることを究明し、これを利用すれば、遺伝的に決定される豚の肉質形質を簡便に判断することができることを確認することにより、本発明を完成した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】韓国公開特許公報第１０-２００４-００３９０５９号

【特許文献2】韓国公開特許公報第１０-２００７-０１１３３３６号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の一つの目的は、配列番号１で表されるポリヌクレオチドにおいて１５２４番目〜１５２７番目の塩基を含む５〜３００個の連続した塩基で構成されるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを含む、豚の肉質形質判断用遺伝子マーカー組成物を提供することにある。

【0008】

本発明の他の一つの目的は、前記遺伝子マーカーを検出することができる製剤を
含む、豚の肉質形質判断用組成物を提供することにある。

【0009】

本発明のもう一つの目的は、前記組成物を含む、豚の肉質形質判断用キットを提供することにある。

【0010】

本発明のもう一つの目的は、前記遺伝子マーカーを含む、豚の肉質形質判断用ＤＮＡマイクロアレイを提供することにある。

【0011】

本発明のもう一つの目的は、（ａ）個体から分離された試料のＤＮＡから請求項１または２に記載の遺伝子マーカーを増幅させる段階；及び（ｂ）前記（ａ）段階の増幅産物の塩基を決定する段階を含む、豚の肉質形質を判断する方法を提供することにある。

【0012】

本発明のもう一つの目的は、前記遺伝子マーカーを検出することができる製剤を含む、韓国土種豚の判別用組成物を提供することにある。

【0013】

本発明のもう一つの目的は、（ａ）個体から分離された試料のＤＮＡから請求項１または２に記載の遺伝子マーカーを増幅させる段階；及び（ｂ）前記（ａ）段階の増幅産物の塩基を決定する段階を含む、韓国土種豚の判別方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0014】

前記目的を達成するために、本発明の一つの態様は、配列番号１で表されるポリヌクレオチドにおいて１５２４番目〜１５２７番目の塩基を含む５〜３００個の連続した塩基で構成されるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを含む、豚の肉質形質判断用遺伝子マーカー組成物を提供する。

【0015】

本発明では、ＭＹＨ３遺伝子によって豚の筋内脂肪含量及び赤色度の肉質形質が決定されることを確認し、肉質形質が優れた在来種と優れない外来種間には前記遺伝子に変異が存在するため、前記変異を含む遺伝子マーカーを検出することにより、豚の肉質形質を判断することができるだけでなく、外来豚と韓国在来種豚を区別することができることを確認して、本発明を完成した。

【0016】

本発明の用語、「遺伝子マーカー」は、遺伝子座位の突然変異または変形によってできた多様性を識別するために使用される短いＤＮＡ配列を意味する。

【0017】

本発明の目的上、前記遺伝子マーカーは、豚の品種間に塩基変異が示される遺伝子を意味してもよい。

【0018】

本発明の用語、「配列番号１で表されるポリヌクレオチド」は、ＭＹＨ３遺伝子
を意味する。前記用語、「ＭＹＨ３遺伝子」は、動物の筋肉を構成するミオシンに含まれる重鎖タンパク質の一つであるミオシン重鎖３（myosin heavy chain 3）をコードする遺伝子を意味し、この塩基配列はＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなど公知のデータベースから得ることができる（GenBank Accession No. KX549312）。具体的な例として、前記遺伝子は豚から由来した遺伝子であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0019】

本発明の遺伝子マーカーは、これに限定されないが、配列番号１で表されるポリヌクレオチドにおいて１５２４番目〜１５２７番目の塩基を含む、ＡＣＧＴの連続した塩基であってもよい。

【0020】

また、前記遺伝子マーカーは、これに限定されないが、前記塩基を含む５〜３００個、具体的に５〜２８０個、さらに具体的に５〜２６０個の連続した塩基で構成されるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0021】

本発明の用語、「肉質形質」は、豚から得られた骨を除いた屠畜物の状態を示す様々な表現形質を意味するが、前記表現形質は、特にこれに制限されないが、筋内脂肪含量、肉色、保水力、せん断力などであってもよく、さらに具体的に筋内脂肪含量または肉色であってもよい。筋内脂肪含量は、筋肉内に含まれた脂肪の含量、肉色は、肉眼で判断される肉の色、保水力は、畜肉が水分を保持する能力、せん断力は、肉を裂くときの固い程度であって、筋内脂肪含量は高いほど、肉色は赤色を示すほど、保水力及びせん断力は低いほど肉質の品質が高いものと判断することができる。

【0022】

本発明で、前記マーカーが検出される場合、検出されない場合と対比するとき、筋内脂肪含量は高く、肉色は赤色度が増加したと判断することができる。

【0023】

本発明の具体的な一実施例では、済州在来豚とランドレース（landrace）またはデュロック（duroc）豚を交配して得られた子孫を対象に、豚の肉質形質についてＱＴＬ解析及びＬＡＬＤ（Linkage and linkage disequilibrium）マッピングを行った結果、豚の肉質形質に関与する遺伝子は、１２番染色体に存在するＭＹＨ３遺伝子であることを確認した（図２〜４）。

【0024】

また、ＭＹＨ３遺伝子の遺伝型を分析した結果、肉質が良くない外来種であるランドレースと肉質が良い在来種である済州在来豚の間で塩基変異（QTN: i.e., MYH3-1805_-1810delGGACTG）が存在することを確認しており（図１１）、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ制限酵素を用いて前記原因塩基変異を切断した結果、両豚の遺伝子切断様相が異なることを確認した（図１２）。

【0025】

これは、本発明の遺伝子マーカーは、外来豚と在来豚の判別だけでなく、種の区別による肉質形質も判断することができることを示唆しているものである。したがって、本発明の遺伝子マーカーを利用すれば、肉質形質のレベルを正確に判断することができると期待され、前記遺伝子マーカーは、本発明者らによって初めて究明されたものである。

【0026】

もう一つの態様は、前記遺伝子マーカーを検出することができる製剤を含む、豚の肉質形質判断用組成物を提供する。

【0027】

本発明の用語、「遺伝子マーカーを検出することができる製剤」は、本発明の遺伝子マーカーに特異的に結合して認識したり、前記遺伝子マーカーを増幅させることができる製剤として、具体的な例として、前記遺伝子マーカーに特異的に結合するプライマーまたはプローブであってもよい。

【0028】

本発明の用語、「プローブ」（probe）は、ｍＲＮＡと特異的結合をすることができる、短い場合は数塩基から長い場合は数百塩基に対応するＲＮＡまたはＤＮＡなどのラベルリング（labeling）されている核酸断片を意味する。プローブは、オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）プローブ、単一鎖ＤＮＡ（single stranded ＤＮＡ）プローブ、二重鎖ＤＮＡ（double stranded ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブなどの形態で製作されることができる。

【0029】

本発明で、遺伝子マーカーに結合及び認識するプローブは、遺伝子マーカーを含むポリヌクレオチド配列に対して相補的な配列を含み、これに限定されないがＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド（hybrid）形態であってもよい。また、肉眼で認識可能にするために、プローブの５’または３’末端に蛍光標識因子、放射線標識因子などを追加で取り付けてもよい。

【0030】

本発明の用語、「プライマー」とは、短い自由３’末端水酸基（free 3'hydroxyl group）を有する塩基配列であり、相補的なテンプレート（template）と塩基対（base pair）を形成することができ、鋳型鎖のコピーのための出発点としての機能をする短い配列を意味する。本発明で、遺伝子マーカーの増幅に使用されるプライマーは、適切なバッファー中の適切な条件（例えば、４つの異なるヌクレオシドトリホスフェイト及びＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合剤）及び適切な温度下で鋳型-指示ＤＮＡ合成の開始点として作用することができる一本鎖オリゴヌクレオチドになることができるが、前記プライマーの適切な長さは、使用目的に応じて異なってもよい。前記プライマー配列は、前記遺伝子マーカーを含むポリヌクレオチドまたはこの相補的なポリヌクレオチドと完全に相補的である必要はなく、混成化する程度に十分相補的であれば使用可能である。

【0031】

さらに、プライマーは変形させることができるが、具体的な例として、メチル化、キャップ化、ヌクレオチドの置換またはヌクレオチド間の変形、例えば、荷電されてない連結体（例：メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カーバメートなど）または荷電された連結体（例：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）への変形がありうる。

【0032】

本発明では、前記プライマーは、配列番号６５及び６６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0033】

本発明の具体的な一実施例では、配列番号６５及び６６のプライマーを用いて外来豚と在来豚の間に存在する塩基の変異部分を増幅した後、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ制限酵素で前記塩基変異の塩基配列の中から「ＡＣＧＴ」の部分を切断して切断様相を確認した結果、肉質が良くない外来種であるランドレースと肉質が良い在来種である済州在来豚の制限酵素切断様相が明確に区別されることを確認した（図１２）。

【0034】

これは、本発明の豚の肉質形質判断用組成物は、外来豚と在来豚の判断だけではなく、種の区別による肉質形質を判断するのに有用に使用することができることを示唆するものである。

【0035】

もう一つの態様は、前記組成物を含む豚の肉質形質判断用キットを提供する。

【0036】

本発明のキットは、本発明の遺伝子マーカーを増幅することにより確認するか、前記遺伝子マーカーのｍＲＮＡ発現レベルを確認することにより、豚の肉質形質レベルを判断することができる。具体的な例として、前記キットは、ＲＴ-ＰＣＲキットまたはＤＮＡチップキットであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0037】

さらに具体的な例として、前記キットは、ＲＴ-ＰＣＲを実行するために必要な必須要素を含むキットであってもよい。例えば、ＲＴ-ＰＣＲキットは、前記遺伝子マーカーに対する特異的なそれぞれのプライマーの他、テストチューブまたは他の適切な容器、反応緩衝液（ｐＨ及びマグネシウム濃度は多様）、ジオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、ジジオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑポリメラーゼ及び逆転写酵素のような酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮＡｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ水（DEPC-water）、滅菌水などを含んでもよい。。また、定量対照群として使用される遺伝子に特異的なプライマー対を含んでもよい。

【0038】

別の具体的な例として、本発明のキットはＤＮＡチップを実行するために必要な
必須要素を含むＤＮＡチップキットであってもよい。

【0039】

本発明の用語、「ＤＮＡチップ」は、数十万個のＤＮＡの各塩基を一度に確認することができるＤＮＡマイクロアレイのいずれかを意味する。前記ＤＮＡチップキットは、一般的に平らな固体支持板、典型的には顕微鏡用スライドより大きくないガラス表面に核酸種を格子状配列（gridded array）に付着したもので、チップ表面に核酸が一定に配列され、ＤＮＡチップ上の核酸とチップ表面に処理された溶液に含まれた相補的な核酸の間に多重の混成化（hybridization）反応が起き、大量の並列分析を可能にするツールである。

【0040】

本発明のもう一つの態様は、前記の遺伝子マーカーを含む、豚の肉質形質判断用マイクロアレイを提供する。

【0041】

前記マイクロアレイは、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含むものであってもよい。前記マイクロアレイは、プローブポリヌクレオチドに本発明のポリヌクレオチドを含むことを除いては、 通常のマイクロアレイからなってもよい。

【0042】

プローブポリヌクレオチドを基板上に固定化してマイクロアレイを製造する方法は、当業界によく知られている。前記プローブポリヌクレオチドは、混成化することができるポリヌクレオチドを意味するもので、核酸の相補鎖に配列特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドを意味する。本発明のプローブは、対立遺伝子特異的プローブとして、同じ種の二つの構成員から由来した核酸断片中に多形成部位が存在して、一構成員から由来したＤＮＡ断片は混成化するが、他の構成員から由来した断片は、混成化しない。この場合、混成化条件は対立遺伝子間の混成化強度において有意な差を示し、対立遺伝子のいずれかのみ混成化するように十分厳格でなければならない。これにより、他の対立遺伝子形態間で良い混成化の違いを誘発することができる。本発明の前記プローブは、対立遺伝子を検出して豚の肉質形質判断方法などに使用することができる。前記識別方法には、サザンブロットなどの核酸の混成化に基づく検出方法が含まれており、ＤＮＡチップを利用した方法でＤＮＡチップの基板に予め結合された形態で提供されてもよい。前記混成化とは、厳しい条件、例えば、１Ｍ以下の塩濃度及び２５℃以上の温度下で行われてもよい。

【0043】

本発明の豚の肉質形質レベルの判断と関連付けられたプローブポリヌクレオチドを基板上に固定化する過程もまた、このような従来技術を使用して容易に行うことができる。また、マイクロアレイ上での核酸の混成化及び混成化結果の検出は、当業界でよく知られている。前記検出は、例えば、核酸試料を蛍光物質、例えば、Ｃｙ３及びＣｙ５のような物質を含む検出可能な信号を発生させることができる標識物質で標識した後、マイクロアレイ上で混成化して前記標識物質から発生する信号を検出することにより、混成化結果を検出することができる。

【0044】

もう一つの態様は、（ａ）個体から分離された試料のＤＮＡから前記遺伝子マーカーを増幅させる段階；及び（ｂ）前記（ａ）段階の増幅産物の塩基を決定する段階を含む、豚の肉質形質を判断する方法を提供する。

【0045】

本発明では、前記（ｂ）段階の増幅産物にＡＣＧＴの連続した塩基が含まれた場合、豚の肉質形質が外来豚のものより優れると判断する（ｃ）段階をさらに含むことができる。

【0046】

本発明の用語、「個体」は、肉質形質レベルを確認しようとする対象である豚を意味し、前記豚から得られた検体を用いて、前記遺伝子マーカーに含まれた遺伝子型を分析することにより、前記豚の肉質形質を判断することができる。前記検体には毛、尿、血液、各種体液、分離された組織、分離された細胞または唾液のような試料などがなってもよいが、前記遺伝子を検出することができる限り、これに特に制限されない。

【0047】

本発明の用語、「外来豚」は、韓国土種豚に反対する概念で、韓国以外の国から持ち込んだ豚の品種を意味する。一般的に、外来豚は韓国在来豚に比べて病気に弱く、筋内脂肪、多汁性、柔度などの肉質特性が良くないと知られている。具体的な例として、バークシャー（berkshire）種、ヨークシャー（yorkshire）種、デュロックジャージー（duroc jersey）種、ハンプシャー（hampshire）種、ランドレース（landrace）種などがあり、本発明の目的上、前記外来豚は外来豚と交雑されたすべての品種を意味することができる。

【0048】

本発明で、前記（ａ）段階のＤＮＡから本発明の遺伝子マーカーを増幅する段階は、当業者に知られているあらゆる方法が使用可能である。具体的な例として、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅（transcription amplification）、自己維持配列複製、核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）などが使用されてもよいが、これに制限されるものではない。

【0049】

また、前記（ｂ）段階の増幅産物に含まれた遺伝子マーカーの塩基を決定する段階も当業者に知られているあらゆる方法でも使用可能である。具体的な例として、シーケンシング、ミニシーケンシング、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（allele specific ＰＣＲ）、ダイナミック対立遺伝子混成化（dynamic allele-specifichybridization; DASH）、ＰＣＲ延長分析（例えば、単一塩基延長（single base extension; SBE）、ＰＣＲ-ＳＳＣＰ、ＰＣＲ-ＲＦＬＰ分析またはＴａｑＭａｎ法、ＳＮＰｌｅｘプラットフォーム（Applied Biosystems）、質量分析法（例えば、SequenomのMassARRAYシステム）、Ｂｉｏ-Ｐｌｅｘシステム（BioRad）、制限酵素切断法などを利用して行うことができるが、前記増幅産物に含まれたＡＣＧＴの連続した塩基を検出することができる限り、これに制限されるものではない。

【0050】

本発明の具体的な一実施例では、配列番号６５及び６６のプライマーを用いて外来豚と在来豚の間に存在する塩基の変異部分を増幅した後、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ制限酵素で前記増幅された塩基配列の中から「ＡＣＧＴ」の部分を切断して切断様相を確認した結果、肉質が良くない外来種であるランドレースと肉質が良い在来種である済州在来豚の切断様相が明確に区別されることを確認した（図１２）。

【0051】

これは、本発明の豚の肉質形質を判断する方法は、外来豚と在来豚の種を識別することができるのみならず、種の区別による肉質形質も判断することができることを示唆するものである。

【0052】

もう一つの態様は、前記遺伝子マーカーを検出することができる製剤を含む、韓国土種豚の判別用組成物を提供する。

【0053】

このとき、前記「遺伝子マーカーを検出することができる製剤」の定義は、前述した通りである。

【0054】

本発明の用語、「韓国土種豚」は、外来豚に反対となる概念で、伝統的に韓国で飼育された豚の品種を意味する。一般的に、韓国土種豚は外来豚に比べて病気に強く、筋内脂肪、多汁性、柔度などの肉質特性に優れたものとして知られている。具体的な例として、チュクジンチャム豚、江原道のサンウリ在来豚、済州在来黒豚、済州糞豚などのいくつかの名前で呼ばれる済州在来豚などがあり、さらに具体的には、済州在来豚であってもよいが、これらに限定されない。本明細書では、前記韓国土種豚は、「土種豚」、「韓国在来豚」または「在来豚」と混用されて命名されうる。

【0055】

本発明で、前記マーカーが検出される場合、検出されない場合と対比すると韓国土種豚であると判別することができる。

【0056】

もう一つの態様は、（ａ）個体から分離された試料のＤＮＡから請求項１または２に記載の遺伝子マーカーを増幅させる段階；及び（ｂ）前記（ａ）段階の増幅産物の塩基を決定する段階を含む、韓国土種豚の判別方法を提供する。

【0057】

本発明では、前記（ｂ）段階の増幅産物にＡＣＧＴの連続した塩基が含まれている場合、韓国土種豚であると判断する（ｃ）段階をさらに含むことができる。

【0058】

このとき、前記「個体」及び「韓国土種豚」の定義は、前述した通りである。

【0059】

本発明で、前記（ａ）段階のＤＮＡから本発明の遺伝子マーカーを増幅する段階は、当業者に知られているあらゆる方法でも使用可能である。具体的な例として、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅（transcription amplification）、自己維持配列複製、核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）などが使用されてもよいが、これに限定されるものではない。

【0060】

また、前記（ｂ）段階の増幅産物に含まれた遺伝子マーカーの塩基を決定する段階も当業者に知られているあらゆる方法でも使用可能である。具体的な例として、シーケンシング、ミニシーケンシング、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（allele specific ＰＣＲ）、ダイナミック対立遺伝子混成化（dynamic allele-specifichybridization; DASH）、ＰＣＲ延長分析（例えば、単一塩基延長（single base extension; SBE）、ＰＣＲ-ＳＳＣＰ、ＰＣＲ-ＲＦＬＰ分析またはＴａｑＭａｎ法、ＳＮＰｌｅｘプラットフォーム（Applied Biosystems）、質量分析法（例えば、SequenomのMassARRAYシステム）、Ｂｉｏ-Ｐｌｅｘシステム（BioRad）、制限酵素切断法などを利用して行うことができるが、前記増幅産物に含まれたＡＣＧＴの連続した塩基を検出することができる限り、これに制限されるものではない。

【0061】

本発明の具体的な一実施例では、配列番号６５及び６６のプライマーを用いて外来豚と在来豚間に存在する塩基の変異部分を増幅した後、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ制限酵素で前記増幅された塩基配列の中で「ＡＣＧＴ」の部分を切断して切断様相を確認した結果、肉質が良くない外来種であるランドレースと肉質が良い在来種である済州在来豚の切断様相が明確に区別されることを確認した（図１２）。

【0062】

これは、本発明の豚の肉質形質を判断する方法は、外来豚と在来豚の種を識別することができることを示唆するものである。

【発明の効果】

【0063】

本発明の遺伝子マーカーは、豚の肉質形質を判断する特異的なマーカーとして、肉眼で区別されない豚の肉質形質の客観的な評価だけでなく、外来豚と韓国土種豚を判別することができる手段として使用されるため、豚肉の流通秩序の確立に寄与することができるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0064】

【図1】導入種であるランドレース（ａ）と在来種である済州在来豚（ｂ）の外観とロース写真を比較したイメージである。

【図2】肉質形質決定遺伝子のＱＴＬ（quantitative trait locus）領域確認によるＬＤＬＡ（linkage-linkage disequilibrium analysis）の結果を示すグラフである。ａは、済州在来豚とランドレース豚を交配して得られた子孫（ＬＫ畜群）、ｂは済州在来豚とデュロック豚を交配して得られた子孫（ＤＫ畜群）に関する。

【図3】肉質形質決定遺伝子のＱＴＬ領域に存在する遺伝子を示しているＬＡＬＤ マッピング結果である。

【図4】ＱＴＬ領域に存在する遺伝子のｍＲＮＡ発現量を比較したグラフである。ａはロース（最長筋、longissimus）、ｂは後肢（大腿四頭筋、quadriceps）に関する。

【図5】ＣＡＧＧＳ-ＥＧＦＰ-Ｐｕｒｏベクターの開裂マップを示す。

【図6】ＭＹＨ３遺伝子が組換えされたＣＡＧＧＳ-ＭＹＨ３-Ｆｌａｇ発現ベクターの開裂マップ及び前記ベクター内遺伝子の順序を示す。

【図7】ＭＹＨ３遺伝子が組換えされたベクターで形質転換されたマウスのＭＹＨ３遺伝子活性及び発現を示す。ａはＭＹＨ３遺伝子の転写活性を示すイメージである。Ｐ/Ｃは、陽性対照群（positive control）、赤で示された数字（２１、２４、２６、２７、２８）は、ＭＹＨ３遺伝子転写活性を示す形質転換マウス、黒で示された数字（１９、２０、２２、２３、２５）は、形質転換はされたが、ＭＹＨ３遺伝子の転写活性がないマウスを意味する。ｂはＭＹＨ３遺伝子のタンパク質発現量を分析したウエスタンブロットの結果を示すイメージである。

【図8】豚ＭＹＨ３遺伝子が挿入された形質転換マウスの姿である。

【図9】野生型マウス（ＷＴ）及び形質転換マウス（ＴＧ）の後肢筋肉外観（ａ）及び筋肉組織（ｂ、ｃ）の姿を示すイメージである。ｂは後肢筋肉組織をミオシンＡＴＰａｓｅで組織化学染色したイメージであって、赤色の矢印は赤色筋の一種であるＴｙｐｅ１/ｏｘｉｄａｔｉｖｅ/ｓｌｏｗ ｆｉｂｅｒｓ、青色の矢印は白色筋の一種であるＴｙｐｅ ２ａ及び青色の三角形は白色筋の一種であるＴｙｐｅ ２ｂのＴｙｐｅ ２/ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ/ｆａｓｔ ｆｉｂｅｒｓを指す。スケールバー（Scale bar）は５０μｍを意味する。ｃは後肢筋肉組織をＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色したイメージである。スケールバーは１００μｍを意味し、長方形内に存在する領域を拡大して、その下に示した。

【図10】豚ＭＹＨ３遺伝子が挿入された形質転換マウスの筋肉内遺伝子発現パターンを確認した結果を示す。ａは筋繊維ｔｙｐｅと関連した遺伝子のｍＲＮＡとタンパク質発現をｑＲＴ-ＰＣＲ及びウエスタンブロットを通じて分析した結果を示す。 ４ヵ月齢の野生型マウス（n = 3）と形質転換マウス（n = 5）を用いた。ｂは後肢筋肉のｓｌｏｗ-ｔｙｐｅ（左）及びｆａｓｔ-ｔｙｐｅ（右）筋肉に関連した遺伝子のｍＲＮＡ発現量をｑＲＴ-ＰＣＲを使用して分析した結果を示す。４ヵ月齢の野生型マウス（n = 3）と形質転換マウス（n = 4）を用いた。結果値は、独立的な３回の実験を通じて得たもので、これを平均±ＳＥＭで示した（*Ｐ<０．０５、**Ｐ<０．０１）。ｃは後肢筋肉をヘマトキシリン及びエオシンで染色した結果を示す。矢印は、筋周膜（perimysium）、三角形は筋内膜（endomysium）を指す。ｄは脂肪分化遺伝子のｍＲＮＡ発現量をｑＲＴ-ＰＣＲを使用して分析した結果を示す。

【図11】豚ＭＹＨ３遺伝子の構造及びＱＴＮ（quantitative trait nucleotide）を示すイメージである。

【図12】肉質に影響を与える原因塩基変異をＨｐｙＣＨ４ＩＶ制限酵素を用いて切断したパターンを示すイメージである。ＬＡＮＤＲＡＣＥ品種（ｑ/ｑ）から由来した１/１は非切断型、ランドレースと済州在来豚の交配品種（ｑ/Ｑ）から由来し１/２は切断型、済州在来豚の品種（Ｑ/Ｑ）から由来した２/２は切断型を示す。

【発明を実施するための形態】

【0065】

以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

【0066】

実施例１．豚の肉質形質肉眼比較
済州在来黒豚とランドレース豚の肉質形質（筋内脂肪含量及び赤身肉）を比較するために、ロースの形状を分析した。

【0067】

その結果、図１に示すように、導入種であるランドレースのロース肉は白色でありながら薄いが、済州在来豚のロース肉は黒毛色でありながら赤身肉であり、特にマーブリング沈着が優れていることを確認した。

【0068】

前記結果を通じて、済州在来豚はランドレースに比べて肉質が優れていることが分かった。

【0069】

実施例２．豚の肉質形質量的特性座（quantitative trait locus; QTL）分析
実施例２-１．肉質遺伝子のＱＴＬ領域確認
豚の肉質形質を決定する遺伝子を究明するために、済州在来豚とランドレースの豚を交配して得られた子孫（ＬＫ畜群）、及び済州在来豚とデュロック豚を交配して得られた子孫（ＤＫ畜群）を対象に、豚の肉質形質（赤色度（ａ*）、筋内脂肪含量（ＩＭＦ））についての量的特性座（quantitative trait locus; QTL）分析を行なった。

【0070】

その結果、図２のａに示すように、ＬＫ畜群で垂直の点線は、１２番染色体の６６１ｋｂの領域上に位置することを確認しており、また、図２のbに示すように、ＫＤ畜群でも垂直の点線は、１２番染色体の６６１ｋｂの領域上に位置することを確認した。

【0071】

前記結果を通じ、赤身肉（赤色度）と筋内脂肪含量を決定する遺伝子は、豚の品種に関係なく、同じ場所に存在することを確認し、これは１２番染色体の６６１ｋｂの領域内に存在することが分かった。

【0072】

実施例２-２．豚の肉質形質遺伝子究明
前記実施例２-１を介して豚の肉質形質を決定する遺伝子は、１２番染色体の６６１ｋｂの領域内に存在することを確認したことにより、前記領域内に存在する遺伝子をＬＡＬＤマッピング により確認した。

【0073】

その結果、図３に示すように、ＭＹＨ３、ＭＹＨ１、ＭＹＨ２、ＭＹＨ１３、ＡＤＰＲＭ、ＳＣＯ１、ＴＭＥＭ２２０、ＥＮＳＳＳＣＧ００００００２９４４１、ＥＮＳＳＳＣＧ００００００１８００６の９つの遺伝子が前記肉質形質遺伝子領域内に存在することを確認した。

【0074】

実施例２-３.豚の肉質形質関連遺伝子の選抜
前記実施例２-２を介して肉質形質を決定する９つの遺伝子を確認することにより、前記遺伝子の中でも肉質形質の決定に最も関連性の高い遺伝子を選抜しようとした。

【0075】

ランドレース（ＬＡＮＤＲＡＣＥ）と在来豚（ＫＮＰ）のロース（最長筋、longissimus）及び後肢（大腿四頭筋、quadriceps）において、前記９つの遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を分析した。

【0076】

具体的には、在来豚（ＫＮＰ）とランドレースからロースと後肢を筋肉組織を採取し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ambion）を用いてＲＮＡを分離した。各組織別ＲＮＡ濃度を５μｇに同一に合わせた後、ＴＯＰｓｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Enzynomics）を利用してｃＤＮＡ（complement DNA）を合成した。以後、各組織別ｃＤＮＡを用いてｑＲＴ-ＰＣＲ実験を行った。ｑＲＴ-ＰＣＲ実験は、９５℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２０秒を４０回繰り返し、ｑＲＴ-ＰＣＲ実験を行うためにＱｕａｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Qiagen）を使用して、Ｒｏｔｅｒ-Ｇｅｎｅ Ｑ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Qiagen）装置を用いてリアルタイムで分析した。合計９つの遺伝子分析のために用いたプライマーは下記の表１に並べた。

【0077】

【表1】

【0078】

その結果、図４のａ及びbに示すように、ランドレースに比べて、在来豚のロース及び後肢でＭＹＨ３遺伝子のｍＲＮＡ発現がはるかに高いことを確認した。

【0079】

前記結果により、ＭＹＨ３遺伝子が豚の肉質形質の中でも、特に、赤色度と筋内脂肪含量を決定する主要な遺伝子であることが分かった。

【0080】

実施例３．豚ＭＹＨ３遺伝子が挿入された形質転換マウスの製作
前記実施例２を介してＭＹＨ３遺伝子が豚の肉質形質の中でも、特に、赤色度と筋内脂肪含量を決定する遺伝子であることが究明されることにより、前記遺伝子の生体内（in vivo）活性を確認するために、下記３-１〜３-２に沿った方法で豚ＭＹＨ３遺伝子が挿入された形質転換マウスを製作し、これを用いた。

【0081】

実施例３-１．形質転換ベクターの製作
まず、豚ＭＹＨ３遺伝子が挿入された形質転換マウスを製作しようと、ＭＹＨ３遺伝子が挿入された組換えＣＡＧＧＳ-ＭＹＨ３-Ｆｌａｇ発現ベクターを製造した。

【0082】

具体的に、豚のＭＹＨ３を過発現するベクターを製作するために、豚ＭＹＨ３遺伝子のｍＲＮＡ全体の塩基配列を確認した後、合計４つの部分に分けてＤＮＡ断片を、それぞれ人為的に合成した。１番目の断片は１，４１７ｂｐであって、両側にＸｂａＩとＢｇｌＩＩ酵素部位を両端断面に追加して人為的合成した。２番目の断片は１，７４５ｂｐであって、ＢｇｌＩＩとＳａｌＩを合成し、３番目の断片は１，７７７ｂｐでＳａｌＩとＳａｃＩＩを合成し、最後の４番目は９４４ｂｐであって、ＳａｃＩＩとＥｃｏＲＩで合成した。完成された４つのＤＮＡ断片を末端に人為的に結合させた酵素部位を利用して結合（Ligation）させ、最終的に豚ＭＹＨ３遺伝子の全体ｍＲＮＡを含む遺伝子断片を完成することができた。

【0083】

以降過発現ベクターに導入するために、図５に示すようなＣＡＧＧＳ-ＥＧＦＰ-ＰｕｒｏベクターをＸｂａＩとＥｃｏＲＩで切断した後、先に製作した豚ＭＹＨ３遺伝子ｍＲＮＡの全体断片を挿入することにより、最終的に豚ＭＹＨ３形質転換ベクターの製作を完了した（図６）。

【0084】

前記ベクターの構造は、図６に示し、ベクターの塩基配列は、配列番号２で表示した。

【0085】

実施例３-２．形質転換マウスの製作
実施例３-２-１．形質転換マウスの製作方法
前記実施例３-１を介して製作したベクターを用いて形質転換マウスを製作した。

【0086】

具体的に、Ｃ５７ＢＬ/６ｎマウスの受精卵を獲得した後、微細注入技法（microinjection）を使用して前記に製作された形質転換ベクターを受精卵の核の中に導入した。

【0087】

その結果、４７匹のＦ０ ｆｏｕｎｄｅｒを確認した。

【0088】

実施例３-２-２．ｍＲＮＡ発現分析を通じた外来遺伝子導入有無確認
前記実施例３-２-１を介して製作した形質転換マウスにＭＹＨ３遺伝子が導入されているかを確認するためには、前記遺伝子のｍＲＮＡ発現有無を分析した。

【0089】

具体的には、ＰＣＲ実験条件は、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒を４０回繰り返し、用いたプライマーは下記の表２に並べた。

【0090】

【表2】

【0091】

その結果、図７のａに示すように、ＭＹＨ３遺伝子が挿入されてｍＲＮＡを発現する形質転換マウス（２１、２４、２６、２７、２８番）を確認できた。

【0092】

実施例３-２-３．タンパク質発現分析を通じた外来遺伝子導入有無確認
前記実施例３-２-１を介して製作した形質転換マウスにＭＹＨ３遺伝子が導入されているかを確認するために、前記遺伝子のタンパク質発現有無を分析した。

【0093】

具体的には、野生型マウス（ＷＴ）と形質転換マウス（ＴＧ）の後肢筋肉組織を採取した後、ＲＩＰＡバッファーにタンパク質分解抑制剤を添加して、超音波粉砕することにより、組織を分解した。以後、低温遠心分離器を介して組織とタンパク質を分離し、上清液でタンパク質を回収した。回収したタンパク質はＢＳＡタンパク質アッセイ試薬（bio-rad）を用いて定量した後、４ｘタンパク質ローディングバッファー（１ｘ）で１００℃で約１０分間加熱した。用意されたタンパク質を用いてウエスタンブロットを行うために、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルに約２時間前記タンパク質を泳動した。以降、泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した後、５％スキムミルクを利用して、１時間ブロッキングし、実験の目的に合った一次抗体（Anti-Flag M2（F1804、Sigma-Aldrich）及びｂ-アクチン（＃4970、Cell signaling））を添加して、４℃で一晩反応させた。翌日ＴＢＳＴ溶液で洗浄した後、二次抗体を２時間反応させた後、ＥＣＬ試薬を処理し、ＬＡＳ-３００ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Fujifilm）を用いて、タンパク質に結合した抗体の信号を確認した。実験に使用された二次抗体は、一次抗体に応じて別様使用した。

【0094】

その結果、図７のbに示すように、形質転換マウスの中でも２４番でＭＹＨ３遺伝子のタンパク質発現量が最も高いのが確認できた。これにより、形質転換遺伝子のタンパク質の発現度が最も高かった２４番マウスを活用して、交配後に繁殖させ、その姿は、図８に示した。

【0095】

実施例３-３．形質転換マウスの筋肉形態確認
肉質形質決定に関するＭＹＨ３遺伝子の機能を確認するために、前記実施例３-２を介して製作した形質転換マウスの肉質形質を調査した。

【0096】

まず、図９のａに示すように、豚ＭＹＨ３遺伝子が形質転換されたマウス（右；ＴＧ）の後肢筋肉は野生型マウス（左；ＷＴ）に比べて、より赤い色を帯びていることを確認できた。

【0097】

以降、筋肉形態をさらに詳しく確認するために、ＡＴＰａｓｅ染色を行なった。野生型及び形質転換マウスの後肢筋肉を回収して、３０％スクロース（sucrose）溶液に一晩処理した後、ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄを利用して、-２５℃で１０μｍ大きさに組織切片（tissue-section）した後、４％ＰＥＡで１時間固定した。以後、流れる水で１０分間の洗浄し、６０％イソプロパノール（isopropanol）を利用して洗浄した後、ＡＴＰａｓｅ染色キット（ATPase stain lyopilized powder for histoenzymatic reaction kit、Bio optica社）を利用して、製造社で提示した方法に従って実験を行なった。

【0098】

その結果、図9のbに示すように、野生型マウス（左；ＷＴ）に比べて、前記遺伝子が挿入された形質転換マウス（右；ＴＧ）は、後肢筋肉に赤色筋がより多く分布していることを確認した。

【0099】

さらに、筋肉組織内の脂肪の分布を確認するためにＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色を行った。具体的には、前記の組織切片を０．３％ Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ溶液に１時間反応
させた。

【0100】

その結果、図９のｃに示すように、野生型マウス（左；ＷＴ）に比べて、形質転換マウス（右；ＴＧ）で染色程度がより強いことを確認することにより、形質転換マウスの後肢筋肉には、脂肪の含量がより多いことが確認できた。

【0101】

これを総合すれば、ＭＹＨ３遺伝子は赤色筋を蓄積させて赤色度を向上させ、筋内脂肪含量を蓄積させる原因遺伝子であることが分かった。

【0102】

実施例３-４．形質転換マウスの筋肉内遺伝子発現パターン確認
実施例３-４-１．白色筋/赤色筋形成遺伝子の発現パターン確認
肉質形質決定に関するＭＹＨ３遺伝子の機能を確認するために、前記実施例３-２を介して製作した形質転換マウスの白色筋/赤色筋形成遺伝子の発現パターンを調査した。

【0103】

具体的には、野生型マウス（ＷＴ）と形質転換マウス（ＴＧ）の後肢筋肉組織を採取し、前記実施例２-３に係る方法でｑＲＴ-ＰＣＲを行った。この時用いたプライマーは下記表３に並べた。

【0104】

【表3】

【0105】

また、前記実施例３-２-３に係る方法にウェスタンブロットを行い、この時使用した一次抗体は以下の通りである：抗Ｆｌａｇ Ｍ２（F1804、Sigma-Aldrich）、ＭＹＨ７（SC-53089、Santa cruz biotechnology）、ＭＹＨ４（H00004622-B01P、Abnova）及びｂ-アクチン（＃4970、Cell signaling）。

【0106】

その結果、図１０のａに示すように、野生型マウスに比べて形質転換マウスでは、赤色筋の一種でｓｌｏｗ ｔｙｐｅ遺伝子であるＭＹＨ７遺伝子のｍＲＮＡとタンパク質の発現が急激に増加することを確認した。

【0107】

また、図１０のbに示すように、野生型マウスに比べて形質転換マウスでは、白色筋の一種であるｆａｓｔ ｔｙｐｅ遺伝子（Ａｌｄｏａ、Ｐｖａｌｂ、Ｔｎｎｆ３、Ｔｎｎｉ２、Ｔｎｎｃ２）は発現量の有意な差がないが、赤色筋の一種であるｓｌｏｗ ｔｙｐｅに影響を与える遺伝子（ミオグロビン、Ｔｎｎｔ１、Ｔｎｎｉ１、Ｔｎｎｃ１）はすべてｍＲＮＡ発現量が増加することを確認した。

【0108】

実施例３-４-２．脂肪蓄積パターン及び関連遺伝子の発現パターン確認
また、肉質形質決定に関するＭＹＨ３遺伝子の機能を確認するために、前記実施例３-２を介して製作した形質転換マウスの脂肪蓄積パターン及び関連遺伝子の発現パターンを調査した。

【0109】

まず、脂肪蓄積パターンを確認するために、組織上の形態を確認しようとし、そのため、Ｈ＆Ｅ（Hematoxylin and eosin）染色を行った。野生型マウス（ＷＴ）と形質転換マウス（ＴＧ）の筋肉組織を利用して、パラフィン包埋（Paraffin embedding）した後、４μｍの厚さで組織を切片した。以後、キシレン（xylene）を利用してパラフィンを除去し、１００％、９５％、７５％、５０％のアルコールを順番に用いて脱水した後、流水で５分間洗浄した。以後、Ｍｙｙｅｒ'ｓヘマトキシリン（hematoxylin）溶液に１分間処理した後、流水で２０分間洗浄し、エオシン（esoin）に１分間処理した後、脱水及びクリアリング（clearing）過程を実行した後、顕微鏡上で組織の染色状態を確認した。

【0110】

また、形質転換マウスの筋肉組織で脂肪蓄積遺伝子の発現パターンを確認するために、前記実施例２-３に係る方法にｑＲＴ-ＰＣＲを行った。この時、用いたプライマーは下記の表４に並べた。

【0111】

【表4】

【0112】

その結果、図１０のc及びｄに示すように、野生型マウスに比べて形質転換マウスでは、筋細胞間の間隔が大きく、その間に脂肪が沈着されるが、脂肪分化遺伝子の発現も有意に増加することを確認した。

【0113】

前記結果により、ＭＹＨ３遺伝子は赤色筋関連遺伝子の発現増加に影響を与えるだけでなく、筋肉内脂肪の形成を向上させる原因遺伝子であることが分かった。

【0114】

実施例４． ＭＹＨ３遺伝子の遺伝型分析
ＭＹＨ３遺伝子の遺伝型を分析するために、豚ＭＹＨ３遺伝子の転写開始点（transcription start site; TSS）ないし５’-ＵＴＲ ３ｋｂ、及び終止コドン（stop codon）から３’-ＵＴＲ １ｋｂまでの塩基配列を解読した。

【0115】

その結果、図１１に示すように、肉質に影響を与えるＭＹＨ３遺伝子においてＱＴＮ（i.e., MYH3-1805_-1810delGGACTG）を確認した（赤点で表示）。また、ランドレース（ＬＡＮＤＬＡＣＥ）と済州在来豚（ＫＮＰ）の間に塩基変異が存在し、これはエキソン（exon）３の開始コドン（ＡＴＧ）から５’-ＵＴＲに位置することを確認した。済州在来豚の場合-１８０５ｂｐから-１８１０ｂｐの部位が欠損したことを確認し、これは筋肉形成調節因子（myogenesis regulatory factor; MRF）の結合部位であることを確認した。

【0116】

実施例５． ＭＹＨ３遺伝子の遺伝型確認を通じた豚の品種判断
前記実施例３を介してランドレース及び済州在来豚のＭＹＨ３遺伝子間の塩基変異が存在することを確認したことにより、前記塩基変異を利用して豚の肉質を判断しようとした。

【0117】

具体的には、プライマー（フォワード：5'-TGG TCT TTC CTA ATT GGT GAC AT-3 '（配列番号６５）、リバース：５'-AGT TTT GAG CAA GGC TTT TGT T-３ '（配列番号６６））を用いて前記塩基変異を含む部分を増幅した。各豚の血液から分離した１００ｎｇ/μｌのＤＮＡを鋳型とし、１０ｘ反応緩衝液、２０ｍＭ ｄＮＴＰは、それぞれ２００ｍＭの正方向及び逆方向プライマー、１．５ｕｎｉｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（TaKaRa、Japan）に滅菌した脱イオン水を添加して、２５μｌ容量でＰＣＲ反応を行った。

【0118】

ＰＣＲ増幅は、ＰＴＣ-２００（MJ Research、USA）を利用して、合計３０回を実行し、プライマーのアニーリング温度は６０℃で行った。増幅産物は、ＥｔＢｒ（ethidium bromide）が含有された２％アガロースゲル上で電気泳動した後、ＵＶ下で遺伝子が増幅するか否かを確認した。

【0119】

以降、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ制限酵素を用いて前記原因塩基変異の塩基配列中で「Ａ▼ＣＧＴ」の部分を切断した。前記増幅したＰＣＲ産物を制限酵素（HpyCH4IV）を利用して切断し、制限酵素反応条件は供給者の指示に従ってＰＣＲ増幅産物３μｌと１０ｘバッファー１μｌ、制限酵素０．３μｌ、ＤＷ５．７μｌを混合して３７℃で一晩反応した。ＥｔＢｒ（ethidium bromide）が含有された２％アガロースゲル上で電気泳動して、制限酵素によるランドレース及び済州在来豚ＭＹＨ３遺伝子の切断様相を確認した。

【0120】

その結果、図１２に示すように、肉質が良くないランドレース（ＬＡＮＤＬＡＣＥ）豚は、遺伝子が切断されず、２５０ｂｐで一つのバンドに示されることを確認し（１/１；非切断型）、肉質に優れた済州在来豚（ＫＮＰ）は、遺伝子が切断されて１６７及び７７ｂｐの２つのバンドに示されることを確認した（２/２;切断型）。また、ランドレースと済州在来豚の交配品種は２５０と１６７ｂｐの２つのバンドに示されることを確認した（１/２；切断型）。

【0121】

前記結果により、豚の肉質形質を決定する遺伝子であるＭＹＨ３の変異を確認することにより、外来豚と土種豚を区別することができるだけでなく、それによって豚の肉質を判断することができることを確認した。

【0122】

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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