特許 6483250 エルゴチオネインおよび関連化合物の合成方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6483250

(24)【登録日】2019年2月22日

(45)【発行日】2019年3月13日

(54)【発明の名称】エルゴチオネインおよび関連化合物の合成方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 17/10 20060101AFI20190304BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20190304BHJP

   C07D 233/84 20060101ALN20190304BHJP

   C07B 61/00 20060101ALN20190304BHJP

【ＦＩ】

   C12P17/10

   C12N9/00

   !C07D233/84

   !C07B61/00 300

【請求項の数】19

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2017-515766(P2017-515766)

(86)(22)【出願日】2015年9月22日

(65)【公表番号】特表2017-536086(P2017-536086A)

(43)【公表日】2017年12月7日

(86)【国際出願番号】IB2015001668

(87)【国際公開番号】WO2016046618

(87)【国際公開日】20160331

【審査請求日】2018年9月20日

(31)【優先権主張番号】1416678.9

(32)【優先日】2014年9月22日

(33)【優先権主張国】GB

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】504425406

【氏名又は名称】ユニバーシティ・オブ・ケープ・タウン

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＡＰＥ ＴＯＷＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100100158

【弁理士】

【氏名又は名称】鮫島 睦

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100122297

【弁理士】

【氏名又は名称】西下 正石

(72)【発明者】

【氏名】モーガマット・アンウォー・ジャーディン

(72)【発明者】

【氏名】ルテテ・ペギー・コンデ

【審査官】 関 景輔

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１００７５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０４２４８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Erdelmeier I. et al.，Green Chem.，２０１２年，Vol. 14，pp.2256-2265

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ１−４１

Ｃ０７Ｄ２３３

Ｃ０７Ｂ６１

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｖ

【化1】

（式中、
ｎは０、１または２であり、
ＲはＨまたは

【化2】

である）の化合物、
またはその生理学的に許容される塩、互変異性体、立体異性体、もしくは立体異性体の混合物の合成方法であって、
ａ）式１１のＮ−ベンジル保護ヒスチジンを脱保護して式１２のＮ−ベンジルヒスチジンを形成する工程、

【化3】

ｂ）化合物１２を式１３の（Ｓ）−３−（１−ベンジル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−（ジメチルアミノ）プロパン酸に変換する工程、

【化4】

ｃ）化合物１３を式１４の（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−２−トリメチルエタンアミニウム−３−（１−ベンジル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパン酸に変換する工程、

【化5】

ｄ）式１４の化合物のイミダゾール環を臭素化して５−ブロモへルシニンラクトンを形成する工程、および

【化6】

ｅ）工程（ｄ）の５−ブロモへルシニンラクトンを式１５の（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィドに変換する工程を含み、

【化7】

要すれば、工程（ｆ）〜（ｈ）：
ｆ）式１５の化合物を式ＩＩのスルホキシドに変換する工程

【化8】

、または
ｇ）式１５の化合物を式ＩＩＩのスルホンに変換する工程

【化9】

、または
ｈ）式１５の化合物を式ＩＶのエルゴチオネイン（ＥＳＨ）に変換する工程、

【化10】

のいずれか１工程をさらに含む、方法。

【請求項2】

ｎは０であり、
Ｒは

【化11】

である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ｎは１であり、
Ｒは

【化12】

である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ｎは２であり、
Ｒは

【化13】

である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

ｎは０であり、
ＲはＨである、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

式Ｖの化合物が、以下からなる群から選択される、請求項１に記載の方法：

【化14】

、

【化15】

、

【化16】

、および

【化17】

。

【請求項7】

式１１の化合物が、Ｎ^α−Ｂｏｃ−Ｎ（ｉｍ）−ベンジル保護Ｌ−ヒスチジンである、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

工程（ｄ）において、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）を使用して５−ブロモへルシニンラクトンを形成する、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

工程（ｄ）において、化合物１４に対して少なくとも２モル当量のＮＢＳを使用する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

５−ブロモへルシニンラクトンが、工程（ｅ）を実施する前に、工程（ｄ）の間に形成される反応性中間体である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

工程（ｅ）において、システインを使用して式１５の化合物を形成する、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

工程（ｄ）および（ｅ）がワンポット合成で行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

工程（ｈ）において、ピリドキサール−５リン酸（ＰＬＰ）を使用して式ＩＶのエルゴチオネインを形成する、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

工程（ｆ）で形成された式ＩＩのスルホキシドをさらに式ＩＶのエルゴチオネインに変換する、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

式ＩＩのスルホキシドをｅｇｔＥ遺伝子によってコードされる酵素と接触させて式ＩＶのエルゴチオネインを形成する、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

式ＩＩのスルホキシドをＥｇｔＥ酵素と接触させて式ＩＶのエルゴチオネインを形成する、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

工程（ｅ）で形成された式１５のスルフィド、または工程（ａ）〜（ｄ）で形成された化合物のいずれか１つが、安定同位体で標識されている、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記同位体が重水素である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

標識されている化合物が５−ブロモヘルシニンラクトンである、請求項１７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

エルゴチオネインおよび式Ｖの関連化合物の合成方法を記載する。

【背景技術】

【0002】

結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などのグラム陽性細菌の多くは、保護小分子チオールとしてエルゴチオネイン（ＥＳＨ）を産生する。^{１、２、３} ＥＳＨは、イミダゾール環のＣ２原子（ε位）にチオール基を有するチオヒスチジンベタイン誘導体である（スキーム１）。近年、ＥＳＨはスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）によって培地中に活発に分泌されることが見出され^４、現在の知識によると、ＥＳＨがマイコバクテリアのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ生存に重要な役割を果たす可能性があることが示されている。

【0003】

ＥＳＨの構造変異体であるオボチオールＡも、ウニ卵中であっても、病原体であるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒおよびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉにおいても抗酸化物質として作用する。^５

【0004】

ヒトはＥＳＨを合成しないが、能動輸送系、すなわちその食物源からの摂取に対して高い特異性を有するカチオントランスポーター（ＯＣＴＮ１）を有する。^６、７

【0005】

１９５６年に、Ｈｅａｔｈらは、麦角菌（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）におけるＥＳＨの生合成を解明した。Ｈｅａｔｈは、ヒスチジンまたはヒスチジンと密接に関連した化合物がＥＳＨの前駆体である可能性があることを実証し、その後の出版物には、放射性同位体標識（^１４Ｃおよび^３５Ｓ）を用いて、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓなどの生物を利用したＥＳＨの生合成集合が開示された。^{８、９、１０}

【0006】

Ｍｅｌｖｉｌｌｅらはさらに、Ｏ_２およびＦｅ^２＋の存在下でＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａの無細胞抽出物中でヘルシニンをインキュベートすることにより、ＥＳＨ合成における中間体としてのＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシドの関与を立証した。^１１

【0007】

このスルホキシドは、マイコバクテリア酵素ＥｇｔＥに対する基質である。しかし、このスルホキシドの絶対キラリティーは、天然基質または合成基質についてはわかっていない。中間体（ＩＩ）の事前合成は１９７４年に報告されたが、手が込んでいて再現性がなく、得られた全収率は８．５％と低かった。^１５ 著者らは芳香族プロトン共鳴の位置のみを報告し、それ以上の構造確定を行わなかった。旋光度［α］_Ｄ＋７４．４（ｃ＝０．５、Ｈ_２Ｏ）が報告されたが、本物の天然物［α］_Ｄ＋９．１（ｃ＝０．５、Ｈ_２Ｏ）と一致させることはできなかった。しかし、天然物と合成物の両方とも融点は１８８〜１９０℃であると記録された。それにもかかわらず、合成Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）が、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ Ｃｒａｓｓａの粗無細胞抽出物によってＥＳＨへと広範囲に切断されたと主張された。

【0008】

現在では、ＥＳＨは、遺伝子ｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤおよびｅｇｔＥによってコードされる５つの酵素の逐次作用によって合成されることが立証されている（スキーム１）。^１２ ＥｇｔＡはγ−グルタミルシステインリガーゼであると考えられ、γ−グルタミルシステインの形成を触媒する。ヒスチジンは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性メチルトランスフェラーゼであるＥｇｔＤによってメチル化されて、トリメチルアンモニウムベタイン、すなわちヘルシニンを生じる。次いで、ヘルシニンは、γ−グルタミルシステイニルヘルシニン（Ｉ）を産生するために酸素およびγ−グルタミルシステインを必要とする鉄（ＩＩ）依存性オキシダーゼ（ＥｇｔＢ）を介して、Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）に変換される。後者の変換、特にスルホキシド形成の正確な性質は、依然として研究中である。続いて、クラスＩＩのグルタミンアミドトランスアミダーゼであると想定されるＥｇｔＣは、Ｎ末端グルタミン酸の加水分解を媒介し、Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）を生じる。最後に、ＥｇｔＥ、すなわちピリドキサール５−リン酸（ＰＬＰ）依存性β−リアーゼが最終生成物であるＥＳＨを生じる。

【0009】

近年、これらのメルカプトヒスチジンに関する研究は、イミダゾール環のδ位またはε位におけるＣ−Ｓ結合形成の機序に焦点を当ててきた。^１３ ＯｖｏＡは、オボチオールＡ合成の第１工程を触媒する鉄（ＩＩ）依存性スルホキシドシンターゼであり、ＥｇｔＢの相同体である。興味深いことに、ＥｇｔＢとＯｖｏＡは、Ｃ−Ｓ結合形成を成し遂げる上で基質特異性が著しく異なる。ＯｖｏＡはその硫黄供与体基質に対して非常に選択的であり、Ｌ−システインを受容するだけである一方で、補助基質としてヒスチジンを好む。しかしながら、ＥｇｔＢは、硫黄供与体としてγ−グルタミル−Ｌ−システインを必要とする。さらに、ＥｇｔＢは、ヒスチジンのα−Ｎ，Ｎ，Ｎ−メチル化、すなわち補助基質としてのヘルシニンに対して選択的である。驚くべきことに、ＯｖｏＡは、α−Ｎ−メチル化のレベルに応じて、ヒスチジン環の硫化パターンをδ−炭素からε−炭素に切り替える。^１４ このように、ＯｖｏＡは、α−Ｎ，Ｎ−ジメチルヒスチジンを補助基質として使用する場合には、ヘルシニンをＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）に直接変換し、δ−スルホキシド（オボチオール置換パターン）を少量しか産生しない（スキーム１）。

【0010】

【化1】

【0011】

酵素ＥｇｔＢおよびＥｇｔＣは機能的な形で発現されているが、ＥｇｔＥは依然として分かりにくく、容易に入手可能な基質中間体がないために、これらの酵素はいずれも十分には研究されていない。

【0012】

スーパーアンチオキシダント分子としてのＥＳＨに対する最近の商業的関心により、この分子の合成方法の開発の価値がさらに高くなっている。しかし、既知のＥＳＨの合成方法は、非常に高コストで低〜中程度の収率しか達成することができなかった。したがって、ＥＳＨを合成的に製造する方法を改善する必要が依然として存在する。

【発明の概要】

【0013】

本発明の第１の実施形態によれば、式Ｖ

【0014】

【化2】

【0015】

（式中、
ｎは０、１または２であり、
ＲはＨまたは

【0016】

【化3】

【0017】

である）の化合物、
またはその生理学的に許容される塩、互変異性体、立体異性体、もしくは立体異性体の混合物の合成方法であって、
ａ）式１１のＮ−ベンジル保護ヒスチジンを脱保護して式１２のＮ−ベンジルヒスチジンを形成する工程、

【0018】

【化4】

【0019】

ｂ）化合物１２を式１３の（Ｓ）−３−（１−ベンジル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−（ジメチルアミノ）プロパン酸に変換する工程、

【0020】

【化5】

【0021】

ｃ）化合物１３を式１４の（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−２−トリメチルエタンアミニウム−３−（１−ベンジル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパン酸に変換する工程、

【0022】

【化6】

【0023】

ｄ）式１４の化合物のイミダゾール環を臭素化して５−ブロモへルシニンラクトンを形成する工程、および

【0024】

【化7】

【0025】

ｅ）工程（ｄ）の５−ブロモへルシニンラクトンを式１５の（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィドに変換する工程を含み、

【0026】

【化8】

【0027】

要すれば、工程（ｆ）〜（ｈ）：
ｆ）式１５の化合物を式ＩＩのスルホキシドに変換する工程

【0028】

【化9】

【0029】

、または
ｇ）式１５の化合物を式ＩＩＩのスルホンに変換する工程

【0030】

【化10】

【0031】

、または
ｈ）式１５の化合物を式ＩＶのエルゴチオネイン（ＥＳＨ）に変換する工程、

【0032】

【化11】

【0033】

のいずれか１工程をさらに含む方法が提供される。

【0034】

例えば、
ｎが０の場合、
Ｒは

【0035】

【化12】

【0036】

であってよく、または
ｎが１の場合、
Ｒは

【0037】

【化13】

【0038】

であってよく、または
ｎが２の場合、
Ｒは

【0039】

【化14】

【0040】

であってよく、または
ｎが０の場合、
ＲはＨであってよい。

【0041】

式Ｖの化合物は、以下からなる群から選択され得る：

【0042】

【化15】

、

【0043】

【化16】

、

【0044】

【化17】

【0045】

、および

【0046】

【化18】

。

【0047】

式１１の化合物は、Ｎ^α−Ｂｏｃ−Ｎ（ｉｍ）−ベンジル保護Ｌ−ヒスチジンであってよい。

【0048】

工程（ｄ）において、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）を使用して５−ブロモへルシニンラクトンを形成することができる。化合物１４に対して少なくとも２モル当量、好ましくは少なくとも２．５モル当量のＮＢＳを使用することができる。工程（ｅ）を実施する前に、工程（ｄ）で形成された他の生成物、例えば２，５−ブロモヘルシニンから５−ブロモへルシニンラクトンを単離することができる。

【0049】

工程（ｅ）では、システインまたはチオ酢酸を使用して式１５の化合物を形成することができる。

【0050】

工程（ｄ）および（ｅ）は、ワンポット合成で一緒に実施することができる。

【0051】

工程（ｈ）において、ピリドキサール−５リン酸（ＰＬＰ）を使用して式ＩＶのエルゴチオネインを形成することができる。

【0052】

工程（ｆ）の後、式ＩＩのスルホキシドをさらに式ＩＶのエルゴチオネインに変換することができる。式ＩＩのスルホキシドをｅｇｔＥ遺伝子によってコードされる酵素、好ましくはＥｇｔＥ酵素と接触させて式ＩＶのエルゴチオネインを形成することができる。

【0053】

工程（ｅ）で形成された式１５のスルフィド、または上記方法で形成された中間体化合物のいずれか１つ、例えば５−ブロモヘルシニンラクトンは、安定同位体、例えば重水素で標識されていてよい。標識された化合物または中間体は、エルゴチオネインの生合成経路の研究や、外部刺激または薬物治療中の経路代謝産物の定量における内部標準として使用することができる。

【0054】

本発明の第２の実施形態によれば、式ＩＶのエルゴチオネイン（ＥＳＨ）、またはその生理学的に許容される塩、互変異性体、立体異性体、もしくは立体異性体の混合物の合成方法であって、

【0055】

【化19】

【0056】

式１５の化合物をｅｇｔＥ遺伝子によってコードされる酵素と接触させる工程を含む、方法が提供される

【0057】

【化20】

【0058】

例えば、式１５の化合物をＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの粗酵素抽出物またはＥｇｔＥと接触させることができる。

【0059】

本発明の第３の実施形態によれば、式ＩＶのエルゴチオネイン（ＥＳＨ）、またはその生理学的に許容される塩、互変異性体、立体異性体、もしくは立体異性体の混合物の合成方法であって、

【0060】

【化21】

【0061】

式１５の化合物をピリドキサールリン酸と接触させる工程を含む、方法が提供される

【0062】

【化22】

【図面の簡単な説明】

【0063】

【図1】ＥＳＨのｉｎ ｖｉｔｒｏ再構築；２０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．２ＭｍのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５ｍＭのメルカプトエタノール、８３μｌの粗Ｍ．ｓｍｅｇ酵素、および５０ｍＭの（ａ）Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィド（１５）、（ｂ）Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）および（ｃ）対照のいずれかを含む１００μｌの反応物。粗酵素反応物を３７℃で１日間インキュベートした後、ＬＣ／ＭＳで分析した。

【図2】ＰＬＰによって触媒されるＥＳＨの非酵素的産生。Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィド（１５）、Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）およびＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホン（ＩＩＩ）を使用してＥＳＨおよびＰＬＰについて抽出されたＴＩＣ。Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィド（１５）のみがかなりの量のＥＳＨ（９６．３４ｎｇ／ｍＬ）を産生したが、スルホキシド（ＩＩ）およびスルホン（ＩＩＩ）はＥＳＨを全く産生しなかった。

【図3】ＥＳＨの非酵素的産生のグラフには、それぞれ２０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）、２０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭの（１）スルフィド（１５）プラスＰＬＰ、（２）スルホキシド（ＩＩ）プラスＰＬＰ、（３）スルホン（ＩＩＩ）プラスＰＬＰのいずれかを含む１００μｌの反応物を含む。反応時間：２４時間。

【図4】４００ＭＨｚにおけるＤＭＳＯ中の（１２）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。

【図5】１０１ＭＨｚにおけるＤＭＳＯ中の（１２）の^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。

【図6】４００ＭＨｚにおけるＤ_２Ｏ中の（１４）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。

【図7】１０１ＭＨｚにおけるＤ_２Ｏ中の（１４）の^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。

【図8】３００ＭＨｚにおけるＤ_２Ｏ中の（Ａ）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。

【図9】３００ＭＨｚにおけるＤ_２Ｏ中の（Ｂ）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。

【図10】４００ＭＨｚにおけるＤ_２Ｏ中の（１５）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。

【図11】３００ＭＨｚにおけるＤ_２Ｏ中の（ＩＩ）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。

【図12】３００ＭＨｚにおけるＤ_２Ｏ中の（ＩＩＩ）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。

【図13】Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質濃度検量線。

【図14A】Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィド（１５）のＴＩＣ。

【図14B】正イオンモードにおけるＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィド（１５）のＥＳＩ／ＱＴＯＦ質量スペクトル。

【図15A】Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）のＴＩＣ。

【図15B】正イオンモードにおけるＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）のＥＳＩ／ＱＴＯＦ質量スペクトル。

【図16A】Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホン（ＩＩＩ）のＴＩＣ。

【図16B】正イオンモードにおけるＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホン（ＩＩＩ）のＥＳＩ／ＱＴＯＦ質量スペクトル。

【図17】ＥＳＨの検量線。

【図18】エルゴチオネインのオーバーレイＴＩＣ。１．５分の保持時間。

【図19】正イオンモードにおけるＥＳＨ標準のＥＳＩ／ＱＴＯＦ質量スペクトル。

【図20】基質：（ａ）基質としてのＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィド（１５）、（ｂ）基質としてのＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）、および（ｃ）基質としてのＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホン（ＩＩＩ）を使用したＥＳＨのｉｎ ｖｉｔｒｏ再構築実験について抽出されたＴＩＣ。

【図21】４００ＭＨｚにおけるＤＭＳＯ中の（１３）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。

【発明の詳細な説明】

【0064】

本発明は、式Ｖ

【0065】

【化23】

【0066】

（式中、
ｎは０、１または２であり、
ＲはＨまたは

【0067】

【化24】

【0068】

である（式中、波線は、式Ｖの分子の残りの部分へのＲの結合点を示す））の化合物、
またはその生理学的に許容される塩、互変異性体、立体異性体、もしくは立体異性体の混合物の合成方法を提供する。

【0069】

この方法は、式Ｖの化合物、例えばエルゴチオネイン、（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィド、（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド、および（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホンを形成するための既知の方法によって使用される保護されていない形態のヒスチジンではなく、Ｎ−ベンジル保護ヒスチジンを利用する。

【0070】

本発明の方法は、
ａ）式１１のＮ−ベンジル保護ヒスチジンを脱保護して式１２のＮ−ベンジルヒスチジンを形成する工程、

【0071】

【化25】

【0072】

ｂ）化合物１２を式１３の（Ｓ）−３−（１−ベンジル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−（ジメチルアミノ）プロパン酸に変換する工程、

【0073】

【化26】

【0074】

ｃ）化合物１３を式１４の（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−２−トリメチルエタンアミニウム−３−（１−ベンジル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパン酸に変換する工程、

【0075】

【化27】

【0076】

ｄ）式１４の化合物のイミダゾール環を臭素化して反応性中間体としての５−ブロモへルシニンラクトンを形成し、この５−ブロモへルシニン誘導体（この反応の主要生成物）を２，５−ブロモヘルシニンから単離する工程、および

【0077】

【化28】

【0078】

ｅ）工程（ｄ）の５−ブロモへルシニンラクトンを式１５の（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィドに変換する工程を含み、

【0079】

【化29】

【0080】

要すれば、工程（ｆ）〜（ｈ）：
ｆ）式１５の化合物を式ＩＩのスルホキシドに変換する工程

【0081】

【化30】

【0082】

、または
ｇ）式１５の化合物を式ＩＩＩのスルホンに変換する工程

【0083】

【化31】

【0084】

、または
ｈ）式１５の化合物を式ＩＶのエルゴチオネイン（ＥＳＨ）に変換する工程、

【0085】

【化32】

【0086】

のいずれか１工程をさらに含む。

【0087】

適切なＮ−ベンジル保護ヒスチジンは、Ｎα−Ｂｏｃ−Ｎ（ｉｍ）−ベンジル−Ｌ−ヒスチジンの商品名でＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。あるいは、この方法は、適切にブロックされたヒスチジンを形成する工程を含み得る。

【0088】

合成されたＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィドまたはＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）から酵素的にエルゴチオネインを産生するために、細菌、特にマイコバクテリア（またはその酵素抽出物）を使用することができる。適切な細菌はＥｇｔＥ酵素を産生するものであり、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓが挙げられる。

【0089】

本発明の方法に従って製造されたエルゴチオネインは、栄養補助食品、薬用化粧品、ヘアケア製品、スポーツ後の回復を補助する製品などとして使用することができる。この製品は、局所適用または経口投与用に製剤化することができる。式ＩＩＩのスルホンは、エルゴチオネイン合成の阻害剤として、またはエルゴチオネイン合成経路における阻害剤の同定または設計において使用され得る。

【0090】

本出願人は、本発明の方法を思いつく前に、目的化合物であるＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）に至る２つの異なる経路を試みた。第１のアプローチでは、Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）の逆合成切断により、β−クロロ−アラニンメチルエステルおよびＥＳＨが得られた（スキーム２、Ｓ１）。したがって、セリンに由来する保護されたクロロメチルアラニンエステル（２）のＳ−アルキル化により、コア構造（３）が得られた。得られたスルフィド（３）をｍＣＰＢＡまたはＨ_２Ｏ_２のいずれかを使用して酸化した。

【0091】

Ｉｓｈｉｋａｗａらは、この反応が、β−クロロアラニン（２）の分子内Ｓ_Ｎ２反応によって生じた環状エチレンイミンカルボン酸中間体の形成と、その後のＥＳＨの硫黄原子の求核攻撃によって引き起こされる開環によって起こる可能性があり、主要生成物Ｎ−Ｂｏｃメチルエステル（３ａ）が生じることを示唆した。

【0092】

Ｉｓｈｉｋａｗａらによって以前に研究されたＨ_２Ｏ_２を用いたスルホキシド化反応条件は、本出願人の実験においてスルホン（ＩＩＩ）に対する過酸化をもたらし、分析的証拠は提供されなかった。スルホキシドの過酸化を防止するために、ｍＣＰＢＡを用いた。過酸化水素と比較して、その穏やかな性質や制御されたスルホキシド化の能力は有利である。１当量のｍＣＰＢＡを使用してスルフィドメチルエステル（３ａ）をＳ酸化させてスルホキシドメチルエステル（４ａ）を得た。合成生成物は、Ｒ_ｃＳ_ｓジアステレオマーとＲ_ｃＲ_ｓジアステレオマーとの混合物である可能性が最も高い。スルフィドメチルエステル（３ａ）の立体エネルギーが最も低い配座（全エネルギー：３４．３７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は、スルホキシド化に対する潜在的な面選択性を示し、これにより主にＳ_Ｒジアステレオ異性体スルホキシド誘導体に至る可能性があった。スルホキシドメチルエステル（４ｂ）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、ジアステレオ選択性の証拠を示した（約３：１の比）。しかしながら、ＣＤ（円二色性）スペクトルによって裏付けられた結晶構造のみが、主要なキラルスルホキシドおよび天然スルホキシド（ＩＩ）の絶対配置を確立するのに役立つであろう。スルフィド（３ｂ）、（４ｂ）またはスルホキシド（５ａ）のスルホン（ＩＩＩ）への意図的な酸化は過剰の酸化剤で成し遂げられた。

【0093】

最後に、Ｂｏｃ基の全体的な脱保護、および水性酸性条件下でのメチルエステルの加水分解を試みることにより、（３ａ）および（４ａ）からそれぞれメチルエステルスルフィド（３ｂ）またはメチルエステルスルホキシド（４ｂ）のみが得られた。酸、塩基またはエステラーゼが媒介したエステル加水分解が成功しなかったことから、合成経路を再考せざるを得なかった。安定なアミノ酸メチルエステルは、以前に報告されている。^{１７、１８} β−クロロセリンのアリルエステル誘導体は、Ｓ−アルキル化後にＮ−Ｂｏｃアリルエステルスルフィド（３ｃ）を生じた。スルホキシド化に続いて緩やかなＲｈＣｌ（ＰＰｈ_３）_３が触媒するアリルエステル切断^１９および酸によるＢｏｃ保護基の除去を行うことにより、６３％という適度な全収率で目的のＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）が得られた。

【0094】

第２の逆合成アプローチでは、Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（３）のヒスチジン部分の切断により、システインおよびブロモへルシニン誘導体が得られた（スキーム２）。この経路は、ヒスチジンの必要な硫化を提供して商業的に重要なＥＳＨを提供するので、最も注目を集めてきた。Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィド（５ａ）を、わずかに変更したＥｒｄｅｌｍｅｉｅｒ法によって合成した^２０（スキーム２）。しかしながら、多量の塩副生成物を除去しなければならず、それにより精製が妨げられた。Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィド（５ａ）を３−メルカプトプロピオン酸で９０℃で１８時間処理するとＥＳＨが得られた。スルフィド（５ａ）のビス−ベンジルオキシＮ−Ｂｏｃ保護エステル（５ｂ）への変換により、有機抽出および塩の除去が可能となり、清浄なベンジルエステル（５ｂ）が得られた。Ｎ−Ｂｏｃベンジルエステル（５ｂ）の全体的な脱保護は、５０ｐｓｉの水素圧下でＴＦＡの存在下での水素化（Ｐｄ／Ｃ）によって成し遂げられ、純粋なＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィド（５ａ）が得られた。ＤＣＭ／水混合物中でのｍＣＰＢＡを用いたスルフィド（５ａ）の二相性スルホキシド化により、３６％の低い全収率でＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）が得られた。

【0095】

【化33】

スキーム２

【0096】

試薬および条件：（ｉ）Ｅｔ_３Ｎ／Ｈ_２Ｏ ３０℃で５時間、（３ａ）；（ｉｉ）Ｎ−Ｂｏｃ脱保護：ＴＦＡ、ＤＣＭ／Ｈ_２Ｏ、０〜５℃ （３ｂ）、（４ｂ）または（ＩＩ） （ｉｉｉ）ａ）ＲｈＣｌ（ＰＰｈ_３）_３、ＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏ（１：１）還流 ｂ）ＴＦＡ、ＤＣＭ／Ｈ_２Ｏ、０〜５℃（５ａ）；（ｉｖ）ｍＣＰＢＡ、Ｈ_２Ｏ／ＤＣＭ １：１、２５℃で５時間 （４ａ）または（ＩＩ） （ｖ）ａ）Ｂｏｃ_２Ｏ／ＮａＯＨ、Ｈ_２Ｏ／ＣＨ_３ＣＮ、室温で一晩 ｂ）ＢｎＢｒ／ＤＭＦ、室温で一晩 （ｖｉ）Ｐｄ／Ｃ、３当量のＴＦＡ、Ｈ_２ ５０ｐｓｉ、室温で１２時間；Ｈ_２Ｏ_２、室温で３時間 （ｖｉｉ）ａ）ＣＨ_２Ｏ、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム／ＣＨ_３ＣＮ、室温で１８〜２４時間（６）、ｂ）ＮＨ_４ＯＨ、ＣＨ_３ＩまたはＣＤ_３Ｉ／ＭｅＯＨ、室温で２４時間、（７）；（ｖｉｉｉ）ａ）ｔ−ＢｕＯＨ／ＨＣｌ、３〜４時間還流、Ｓ−ｔ−ブチルメルカプトヒスチジン；ｂ）ＣＨ_２Ｏ、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム／ＴＨＦ、１０℃で６〜８時間、（９）；（ｉｘ）ａ）ＮＨ４ＯＨ、ＣＤ_３Ｉ／ＭｅＯＨ ２４時間、室温；ｂ）ＨＣｌ、２−メルカプトプロピオン酸 ２１時間還流（定量的）；（ｘ）Ｂｒ_２、システインＨＣｌ、Ｈ_２Ｏ ０℃で１時間、（５ａ）；（ｘｉ）３−メルカプトプロピオン酸、ＨＣｌ／Ｈ_２Ｏ、１９時間還流。

【0097】

本発明によるＥＳＨの合成方法
本出願人は、Ｎ−ベンジル保護ヘルシニン中間体を１当量のＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）で臭素化することにより、溶媒としてＤＭＦを使用して、より安定なＮ−ベンジル脱保護５−ブロモへルシニンラクトン誘導体が収率９０％（ｗ／ｗ）で得られることを見出した。この方法の成功は、他の既知の方法と比較して、位置選択的Ｃ−５臭素化にある。しかしながら、さらに驚くべきことに、反応物に対して２モル当量のＮＢＳ試薬を使用すると、Ｎ−ベンジル基の前例のない脱保護が起こり、その結果、Ｎ−ベンジル基の新たなｉｎ ｓｉｔｕ脱保護が起こる。その後の方法工程は、この後者の中間体を介して進行する場合、ほぼ定量的であり、比較的簡単であり、すべて室温で、短縮され、８０％（ｗ／ｗ）の全合成収率が可能になる。したがって、本発明の方法は、以前に公開されたいずれの方法よりも少なくとも２倍優れた全収率を提供することができる。最終工程は、化学的、生合成的または微生物的手段のいずれかで成し遂げることができる。化学変換は熱分解Ｃ−Ｓ切断を伴う。^２０ あるいは、スルフィド基質またはスルホキシド基質の生体模倣ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）媒介切断や、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの粗酵素抽出物によってもＥＳＨが得られた。（スキーム３および４）。

【0098】

【化34】

【0099】

スキーム３。スルホキシド（ＩＩ）、スルホン（ＩＩＩ）およびＥＳＨの改善された合成：（ｉ）ＴＦＡ、ＤＣＭ、室温で一晩；（ｉｉ）ＣＨ_２Ｏ、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３、ＣＨ_３ＣＮ、室温で２４時間；（ｉｉｉ）ＭｅＩ、ＴＨＦ、室温で２４時間；（ｉｖ）（ａ）ＮＢＳ（２．５当量）、ＤＭＦ、室温で暗所、ｂ）Ｌ−システインＨＣｌ。Ｈ_２Ｏ（２．５当量）、ＤＭＦ、室温で２４時間；（ｖ）ｐ−トルエンスルホン酸（ｃａｔ）、Ｈ_２Ｏ_２（２．４当量）；（ｖｉ）ホウ酸（ｃａｔ）、Ｈ_２Ｏ_２（４．８当量）；（ｖｉｉ）Ｃ−Ｓ酵素リアーゼまたはＰＬＰ非酵素的切断。

【0100】

【化35】

【0101】

スキーム４：システインの代わりにチオ酢酸を用いる本発明の方法

【0102】

合成スルホキシド（ＩＩ）からのＥＳＨの酵素的および非酵素的ＰＬＰ媒介合成を比較した。この目的のために、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ細胞を含まない粗抽出物を、高い酵素活性を特徴とする、増殖して後期指数期に採取された培養物から単離した。^１０

【0103】

ＥＳＨ生合成経路前駆体（異種のスルフィドおよびスルホキシドを含む）の粗酵素変換を、ＬＣＭＳによって決定された基礎レベルを超えるＥＳＨの同時産生によって評価した。ＥＳＨ前駆体代謝産物（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィド（１５）および（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）を３７℃、ｐＨ＝７．４で１日間、粗無細胞抽出物でインキュベートし、ＬＣＭＳにより分析した。

【0104】

Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ細胞を含まない粗抽出物のみを含有する対照反応物も、代謝産物と同じ条件下で処理した。このようにして得られたＥＳＨの濃度は５．７０（±０．３０）ｎｇ／ｍｌであり、これは内因性ＥＳＨのものと同等であるとみなされた。この濃度は検出限界（０．７８ｎｇ／ｍｌ）を超えており、したがって、実験において１ｎｇ／ｍｌを超えるＥＳＨの濃度増加がみられれば、基礎レベルであるか、またはＥＳＨ経路の粗内因性酵素による、各基質の生体内変換であるとみなすのに十分顕著であると考えられる。

【0105】

（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）は、ＥＳＨを最も高い濃度（２２．６ｎｇ／ｍｌ）で生合成的に産生した（図１）。（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィド（１５）は、（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）とほぼ同程度に良好な基質であるようであった（１９．２ｎｇ／ｍｌ ＥＳＨ）。ＰＬＰ依存性の変換は、はるかに遅い速度と特異性を有するものの、酵素なしで変換することができることがよく知られている。^２２ したがって、３７℃で５０ｍＭのＰＬＰを用いたスルフィド（１５）の非酵素処理により、効率的にＥＳＨ（９６．３ｎｇ／ｍｌ）が形成された（図２）。しかし、同じ条件下で、スルホキシド（ＩＩ）はＥＳＨを全く産生しなかった（図３）。

【0106】

本発明の方法によって得られる収率の増加により、同位体標識のために回収される中間体の量も増加するであろう。また、中間生成物の収率が高いことにより、実行可能な同位体標識工程を実施することが可能になる。同位体は、通常、非常に高価であるため、高収率の変換は有利である。

【0107】

以前は、ＥＳＨの生合成経路を解明するために、放射標識された中間体が使用されてきた。本出願人は、安定同位体を組み込んだ同じ中間体を合成することが可能であることを見出し、重水素化ヘルシニンからのＥＳＨ−ｄ_３（１０）の合成を以下にさらに詳細に記載する。

【0108】

安定同位体標識を有するこれらの中間体は、例えば、ＥＳＨ経路のさらなる研究のために、または外部刺激もしくは薬物治療中の経路代謝産物の定量における内部標準として使用することができる。

【0109】

先に言及したようにＥｇｔＥ酵素の媒介によるＣ−Ｓ切断に対して安定であるＳ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホンは、ＥＳＨ合成の阻害剤として機能し得るか、またはＥＳＨ経路における酵素（特にＥｇｔＥ）の他の阻害剤の設計もしくはスクリーニングにおいて有用であり得ると考えられる。ＥＳＨ生合成酵素の阻害剤は、新たな目的タンパク質の開発、および治療計画に対する結核菌の感受性を高めるための薬物の開発につながる可能性がある。

【0110】

本発明を以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に説明する。

【実施例】

【0111】

１．一般手順
すべての溶媒は適切な技法によって乾燥させ、使用前に新たに蒸留した。市販の試薬はすべてＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＭｅｒｃｋから購入し、さらに精製することなく使用した。

【0112】

別途明記しない限り、反応はオーブン乾燥したガラス容器中で窒素の不活性雰囲気下で行い、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０−Ｆ_２５４シート（０．２ｍｍ層）で予めコーティングしたプレート上で行った薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によりモニタリングし、生成物を２５４ｎｍのＵＶ光下で、またはニンヒドリンのエタノール溶液（２％ｖ／ｖ）をプレートに噴霧し、続いて加熱することによって可視化した。

【0113】

カラムクロマトグラフィーは、Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌシリカゲル６０（０．０４０〜０．０６３ｍｍ）を使用して行い、適切な溶媒混合物で溶離した。すべての化合物を真空下で乾燥してから収率を測定した。

【0114】

核磁気共鳴スペクトル（^１Ｈおよび^１３Ｃ）を、Ｖａｒｉａｎ Ｍｅｒｃｕｒｙ ３００ＭＨｚ（^１３Ｃでは７５ＭＨｚ）、Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ ４００ＭＨｚ（^１３Ｃでは１０１ＭＨｚ）、Ｂｒｕｋｅｒ ｕｎｉｔｙ ４００ＭＨｚ（^１３Ｃでは１０１ＭＨｚ）、またはＢｒｕｋｅｒ ｕｎｉｔｙ ６００ＭＨｚ（^１３Ｃでは１５１ＭＨｚ）で記録し、別途明記しない限り、溶媒としてＣＤＣｌ_３、ＤＭＳＯ−ｄ_６およびＤ_２Ｏ中で実施した。化学シフトは、内部標準として使用したテトラメチルシラン（ＴＭＳ、δ＝０．００ｐｐｍ）に対してｐｐｍ単位で得られる。必要に応じて、帰属をＣＯＳＹ、ＡＰＴおよびＨＳＱＣ分析によって確認した。カップリング定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）単位で報告される。スピン多重度は、記号ｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｄｄ（二重線の二重線）、ｔ（三重線）、ｍ（多重線）、ｑ（四重線）およびｂｒ（幅広）で示される。

【0115】

旋光度は、Ｐｅｒｋｉｎｇ Ｅｌｍｅｒ １４１旋光計を使用して２０℃で得た。濃度ｃはｇ／１００ｍｌを意味する。

【0116】

融点はＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ Ｔｈｅｒｍｏｖａｒホットプレート顕微鏡を使用して測定し、補正していない。赤外線スペクトルは、４０００ｃｍ^−１から４５０ｃｍ^−１までＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＦＴ−ＩＲ分光計（ｃｍ^−１単位）で記録した。

【0117】

質量スペクトルは、ＪＥＯＬ ＧＣ ＭＡＴＥ ＩＩ磁気セクター質量分析計で記録し、基準ピークを得た、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｔｏｗｎ。

【0118】

ＬＣＭＳ分析は、ＵＨＰＬＣ Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ（ドイツ）、すなわちＡｇｉｌｅｎｔジェット流イオン化源（正イオン化モード）（ＥＳＩ^＋）およびカラム（Ｅｃｌｉｐｓｅ＋Ｃ_１８ ＲＲＨＤ １．８μｍ ２．１×５０、Ａｇｉｌｅｎｔ、ドイツ）を備えた正確な質量分析計Ａｇｉｌｅｎｔ ６５３０ Ｑｒａｄｒｕｐｏｌｅ Ｔｉｍｅ Ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ（ＱＴＯＦ）で行った。

【0119】

酵素反応物をＮｕａｉｒｅインキュベーター（ＤＨ Ａｕｔｏｆｌｏｗ ＣＯ_２ Ａｉｒ−ｊａｒｃｋｅｔｅｄ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）中でインキュベートさせ、Ｅｐｐｅｎｄｈｏｒｆ遠心分離機（Ｍｏｄｅｌ ５８１０Ｒ、ドイツ）で遠心分離した、Ｔｙｇｅｒｂｅｒｇ Ｓｔｅｌｌｅｎｂｏｓｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ケープタウン、南アフリカ。

【0120】

２．エルゴチオネイン基質とスルホンの合成

【0121】

【化36】

【0122】

スキーム５：スルホキシド（ＩＩ）とスルホン（ＩＩＩ）の合成

【0123】

Ｎ−ベンジル−Ｌ−ヒスチジン（１２）

【0124】

【化37】

【0125】

Ｎα−Ｂｏｃ−Ｎ（ｉｍ）−ベンジル−Ｌ−ヒスチジン１１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（７５０ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に懸濁させ、続いて氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を加えた。得られた均質溶液を、完全に脱保護されたことが薄層クロマトグラフィーで示されるまで室温で撹拌させた。溶媒を除去し、Ｅｔ_２Ｏ（１５ｍＬ）で粉砕し、乾燥して、生成物１２を白色結晶（７００ｍｇ、定量的）として得た。Mp: 230-233 °C, (Lit. 240 °C)¹; ¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.01 (s, 1H, H-2'), 7.50 (s, 1H, H-5'), 7.39 (m, 5H, フェニル), 5.37 (s, 2H, H-1''), 4.22 (t, J = 7.0 Hz, 1H, H-2), 3.22 (dd, J = 15.6, 7.0 Hz, 1H, H-3a), 3.14 (dd, J = 15.6, 7.0 Hz, 1H, H-3b); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ 170.1 (C-1), 136.3 (C-2''), 135.8 (C-2'), 130.0 (C-4'), 129.4 (C-5'' C-6''), 129.0 (C-7''), 128.6 (C-3''C-4''), 120.6 (C-5'), 51.7 (C-1''), 51.6 (C-2), 26.3 (C-3)（図４および図５）。

【0126】

（Ｓ）−３−（１−ベンジル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−（ジメチルアミノ）プロパン酸（１３）

【0127】

【化38】

【0128】

ＣＨ_３ＣＮ（２０ｍＬ）に１２（１．３１ｇ、５．３４ｍｍｏｌ）を懸濁させ、続いてホルムアルデヒド（１．２ｍＬ、１５．５ｍｍｏｌ、３７％）を加えた。得られた均質溶液にＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３（３．２ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で２４時間撹拌させた。望ましくない塩をセライトを通してろ過し、溶媒を蒸発させ、乾固して粗ジメチル生成物１３を黄色油状物（１．８０ｇ、定量的）として得た。液液抽出法でこの生成物を単離しようとしたが、分子の双性イオン性の性質のために成功しなかった。しかしながら、この生成物は十分に純粋であり、それ以上精製することなく次の工程で使用した（図２１）。

【0129】

（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−２−トリメチルエタンアミニウム−３−（１−ベンジル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパン酸（１４）

【0130】

【化39】

【0131】

乾燥テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中に粗ジメチル生成物１３（８７０ｍｇ、３．１６ｍｍｏｌ）を溶解し、続いてＭｅＩ（０．４１ｍＬ、９４２ｍｇ、６．６４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で暗所で１〜２日間撹拌させた。溶媒を除去して、生成物１４を黄色油状物（８２２ｍｇ、９３％）として得た。無水エタノール中での結晶化により、生成物１４を白色固体として得た。Mp: 156 °C (dec), ¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 8.65 (d, J = 1.6 Hz, 1H, H-2'), 7.39 - 7.29 (m, 5H, Ph), 7.28 - 7.24 (m, 1H, H-5'), 5.27 (s, 2H, H-1'), 4.26 (dd, J = 9.7, 4.7 Hz, 1H, H-2), 3.47 - 3.36 (m, 2H, H-3), 2.88 (s, 9H, H-1''H-2''H-3''); ¹³C NMR (101 MHz, D₂O) δ 169.0 (C-1), 134.9 (C-2'), 134.7 (C-2''), 133.5 (C-4'), 129.3 (C-3'' C-4''), 128.4 (C-5'' C-6''), 127.5 (C-7''), 121.0 (C-5'), 81.8 (C-2), 65.4 (C-1''), 52.7 (C-1'''C-2'''C-3'''), 21.8 (C-3); LRMS (EI⁺) m/z C₁₆H₂₁N₃O₂について計算 287.2 [M-1]⁺ 実測値287.1 ([M]⁺, 1 %), C₁₄H₁₇N₃⁺について計算 227.1 [M-CO₂および-CH₃]⁺ 実測値227.1 ([M-CO₂および-CH₃]⁺, 100 %)（図６および図７）。

【0132】

イミダゾール環の選択的かつ穏やかな臭素化

【0133】

【化40】

【0134】

スキーム６：イミダゾール環の選択的かつ穏やかな臭素化

【0135】

臭素化条件を非常に選択的であるように最適化した。２つの臭素化中間体が、逆相Ｃ１８クロマトグラフィーによって単離するのに十分安定であることが見出されている。モノ臭素化中間体である５−ブロモヘルシニン（Ａ）（図８）は非常に高収率（９０％）で単離されたが、２，−５ジブロモヘルシニン中間体（Ｂ）（図９）は１０％の低い収率で単離された。

【0136】

ヘルシニルシステインチオエーテル（１５）（ワンポット合成）

【0137】

【化41】

【0138】

ジメチルホルムアミド（８ｍＬ）に１４（７００ｍｇ、２．４３ｍｍｏｌ）を溶解し、続いてＮ−ブロモスクシンイミド（１．８ｇ、６．０８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を、出発材料が完全に消失するまで室温で撹拌させたところ（薄層クロマトグラフィーによるモニタリング）、溶液は赤橙色になった。これは、良好に臭素化されたことを示している。

【0139】

良好な臭素化の後、システインＨＣｌ。Ｈ_２Ｏ（１．０７ｇ、６．０８ｍｍｏｌ）を一度に加え、得られた溶液を室温で２４時間撹拌させた。逆相クロマトグラフィーＣ１８により、酢酸塩形態の黄色の吸湿性固体（６９５ｍｇ、９０％）として単離された生成物１５を得た。¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 7.41 (m, 1H), 4.54 (dd, J = 7.7, 4.4 Hz, 1H, H-2''), 4.42 (t, J = 5.0 Hz, 1H, H-2), 3.50 (dd, J = 15.2, 4.4 Hz, 1H, H-3a''), 3.36 (dd, J = 15.2, 7.7 Hz, 1H, H-3b''), 3.19 (m, 2H, H-3), 2.80 (s, 9H, H-1''H-2''H-3''), 2.75 (s, 3H,アセテート); ¹³C NMR (101 MHz, D₂O) δ 170.3 (C-1''), 170.0 (C-1), 129.4 (C-2'), 128.9 (C-4'), 120.9 (C-5'), 61.0 (C-2), 54.4 (C-2''), 51.7 (C-1'''C-2'''C-3'''), 36.3 (C-3''), 23.9 (C-3); HRMS (ESI⁺): m/z 317.1284 [M]⁺. C₁₂H₂₁N₄O₄S⁺についての計算値は317.1277 [M]⁺であった（図１０）。

【0140】

ヘルシニルシステインスルホキシド（ＩＩ）およびスルホン（ＩＩＩ）の合成
Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシドまたは（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−２−トリメチルアンモニウム−３−［２−（（２Ｒ）−２−アミノ−２−ヒドロキシカルボニル）エチルスルフィニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］プロパン酸（ＩＩ）^２６

【0141】

【化42】

【0142】

Ｈ_２Ｏ_２（３０％、２２４ｍｇ、６．５８ｍｍｏｌ、２．４当量）の溶液に１５（８７０ｍｇ、２．７４ｍｍｏｌ）およびパラトルエンスルホン酸（１５ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で２４時間撹拌させた。最後に、Ｈ_２Ｏ（１０ｍＬ）の添加により反応を停止させ、高真空下で蒸発させて粗生成物を得、これをＣ１８逆相により精製して、生成物ＩＩを黄色固体（６４０ｍｇ、７０％）として得た。¹H NMR (300 MHz, D₂O) δ 8.01 (s, 1H, H-5'), 4.49 (dd, J = 8.6, 3.3 Hz, 1H, H-2''), 3.90 (dd, J = 16.1, 9.3 Hz, 1H, H-2), 3.65 (dd, J = 15.0, 3.3 Hz, 2H, H-1''), 3.52 (dd, J = 9.3, 4.9 Hz, 1H, H-3a), 3.44 (dd, J = 9.3, 4.9 Hz, 1H, H-3b), 2.86 (s, 9H, NMe₃), 2.79 (s, 3H,アセテート); ¹³C NMR (101 MHz, D₂O) δ 171.8 (C-3''), 170.1 (C-1), 156.6 (C-2'), 129.5 (C-4'), 125.5 (C-5'), 72.5 (C-2), 49.5 (NMe₃), 49.1 (C-1''), 43.5 (C-2''), 20.8 (C-3); HRMS (ESI⁺): m/z 334.1306 [MH]⁺. C₁₂H₂₂N₄O₅S²⁺についての計算値は334.1321 [MH]⁺であった（図１１）。

【0143】

Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホンまたは（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−２−トリメチルアンモニウム−３−［２−（（２Ｒ）−２−アミノ−２−ヒドロキシカルボニル）エチルスルホニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］プロパン酸（ＩＩＩ）^２７

【0144】

【化43】

【0145】

Ｈ_２Ｏ_２（３０％、４１６ｍｇ、１２．２４ｍｍｏｌ、４．８当量）とホウ酸（５ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）との溶液に１５（８１０ｍｇ、２．５５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２４時間撹拌させた。最後に、Ｈ_２Ｏ（１０ｍＬ）の添加により反応を停止させ、高真空下で蒸発させて粗生成物を得、これをＣ１８逆相により精製して、生成物ＩＩＩを黄色固体（５４５ｍｇ、６１％）として得た。¹H NMR (300 MHz, D₂O) δ 8.01 (s, 1H, H-5'), 4.52 (dd, J = 8.3, 3.1 Hz, 1H, H-2''), 3.89 (dd, J = 16.1, 9.3 Hz, 1H, H-2), 3.65 (dd, J = 15.0, 2.8 Hz, 2H, H-1''), 3.59 - 3.43 (m, 2H. H-3), 2.85 (s, 9H, NMe₃), 2.79 (s, 3H,アセテート); ¹³C NMR (101 MHz, D₂O) δ 171.7 (C-3''), 170.0 (C-1), 159.8 (C-2'), 156.6 (C-4'), 132.9 (C-5'), 64.3 (C-2), 56.7 (C-1''), 49.4 (NMe₃), 49.1 (C-2''), 34.7 (C-3); HRMS (ESI⁺): m/z 349.1177 [M]⁺. C₁₂H₂₁N₄O₆S⁺についての計算値は349.1192 [M]⁺であった（図１２）。

【0146】

３．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓからの総タンパク質の抽出および精製
Ｍｃ^２１５５（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の増殖条件
Ｍ．ｓｍｅｇ培養液（８００ｍｌ）を指数期まで増殖させた後、乾燥させて乾燥菌体１０ｇを得た。得られたＭ．ｓｍｅｇ細胞のペレットを、その後、必要になるまで−８０℃で保存した。

【0147】

総タンパク質の抽出
Ｍ．ｓｍｅｇ細胞を４℃で３５分間超音波処理し（２５台のパルサー）、続いてリン酸カリウム緩衝液（６０ｍｌ；ｐＨ７）を加えた。この溶液を４℃で１０分間撹拌させ、その後３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を回収し、測定し、次いで適切な量の硫酸アンモニウムを４℃で一晩撹拌しながら徐々に加えて６０〜７０％飽和させた。^２８

【0148】

総タンパク質が沈殿した後、懸濁液を４℃で３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、−２０℃で保存した。

【0149】

総タンパク質の精製
ピリドキサールリン酸（１０ｍｌ；２０μＭ）、リン酸カリウム緩衝液（８ｍｌ；５０ｍＭ；ｐＨ７）および（２ｍｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ）を含有する緩衝液混合物（２０ｍｌ；ｐＨ７）に、複合総タンパク質アンモニウム塩沈殿物を再懸濁させた。

【0150】

タンパク質検量線
総タンパク質濃度を決定するために、タンパク質ＤｃアッセイおよびＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用した。Ｂｒａｄｆｏｒｄの検量線は、この場合にはタンパク質Ｄｃよりも正確であることが判明した（図１３）。

【0151】

計算されたＭ．Ｓｍｅｇ総タンパク質濃度は１０．３３μｇ／μｌであることが判明した。

【0152】

４．ＨＰＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ（ＱＴＯＦ）分析
材料および方法
分析は、ＵＨＰＬＣ Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ（ドイツ）、すなわちＡｇｉｌｅｎｔジェット流イオン化源（正イオン化モード）（ＥＳＩ^＋）およびカラム（Ｐｏｌａｒｉｓ ３ Ｃ_１８ Ｅｔｈｅｒ １００×２ｍｍ、粒子サイズ３μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ドイツ）を備えた正確な質量分析計Ａｇｉｌｅｎｔ ６５３０ Ｑｒａｄｒｕｐｏｌｅ Ｔｉｍｅ Ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ（ＱＴＯＦ）で行った。

【0153】

１５μＬの濃縮試料をＬＣＭＳに注入した。分析物の分離を、０．１％ギ酸ミリＱ水（溶媒Ａ）溶液、および９０％のアセトニトリル、０．１％のギ酸、１０％のミリＱ水（溶媒Ｂ）の混合物を移動相として、イソクラティック流速０．３ｍＬ／分で試みた。

【0154】

システムは、Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒワークステーションソフトウェア（ＱｕａｌｉｔａｔｉｖｅおよびＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅバージョンＢ．０５．００；Ｂｕｉｌｄ ５．０．５１９．０、Ａｇｉｌｅｎｔ ２０１１、ドイツ）のソフトウェアパッケージで制御した。

【0155】

実験用ＬＣＭＳ
すべての代謝産物中に存在する第四級アンモニウム基の極性および電荷のために、ＵＨＰＬＣ（Ｅｃｌｉｐｓｅ＋Ｃ１８ ＲＲＨＤ １．８μｍ、２．１×５０）カラム上でＥＳＨが良好に保持されないことが観察された（保持時間＝０．８分）。これ以降の分析はすべて、セクションＳ３．１に記載されているように、改善されたカラムを使用して行った（保持時間＝１．５分）（図１４〜図１６）。

【0156】

Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｍｅｇｍａｔｉｓにおけるエルゴチオネインのｉｎ ｖｉｔｒｏで再構築した生合成^１２
実験を三連で行い、数回（４回以上）繰り返したところ、これらの結果は再現可能であることが判明した。

【0157】

ＥＳＨの検量線
ＥＳＨの定量のための検量線を作成するために、８つの異なる濃度（０．７８、１．５６、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌ）のＥＳＨを三連調製し、ＥＳＨについて０．７８ｎｇ／ｍｌの定量限界（ＬＯＱ）を得た。これは、Ｌ−Ｚ Ｗａｎｇらが見出したものと同様であった。^１５ ＥＳＨの検出限界（ＬＯＤ）は９ｐｇ／ｍＬであった。ＥＳＨの保持時間は１．５分であった。良好な対称ピークが、ＥＳＨ標準試料および分析された反応試料の両方で得られた（図１７〜図１９）。

【0158】

Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの粗酵素調製物を用いた基質のエルゴチオネインへの生体内変換
２０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．２ＭｍのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５ｍＭのメルカプトエタノール、８３μｌの粗酵素、および５０ｍＭの（１）Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィド（１５）、（２）Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）、（３）Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホン（ＩＩＩ）または（４）対照（粗酵素のみ基質なし）のいずれかを含む１００μｌの反応物（１〜４）３セット。粗酵素反応物を３７℃で１日間インキュベートした。混合物を９０℃で２分間加熱することによって反応を停止させ、続いて凍結乾燥し、その後ＬＣ緩衝液中で再構築してからＬＣ／ＭＳによる分析を行った（図２０）。

【0159】

ＰＬＰによって触媒されるＣ−Ｓ結合の非酵素的切断
２０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）、ならびに５０ｍＭの（１）Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルフィド（１５）およびＰＬＰ、（２）Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホキシド（ＩＩ）およびＰＬＰ、または（３）Ｓ−（β−アミノ−β−カルボキシエチル）エルゴチオネインスルホン（ＩＩＩ）およびＰＬＰのいずれかを含む１００μｌの反応物（１〜３）３セット。非酵素反応物を３７℃で１日間インキュベートし、続いて凍結乾燥し、その後ＬＣ緩衝液中で再構築してからＬＣ／ＭＳによる分析を行った（図２および図３）。

【0160】

５．同位体標識
ヘルシニン−ｄ_３（７）は、市販のＬ−ヒスチジンから出発する２段階反応で合成した（スキーム２）。第１段階は、ホルムアルデヒド水溶液およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを使用してＮ，Ｎ−ジメチルヒスチジン（６）を得る還元的アミノ化を含んだ。第２段階は、塩基性条件下でｄ_３ヨウ化メチルを使用して粗Ｎ，Ｎ−ジメチルヒスチジン（６）を四級化してヘルシニン−ｄ_３（７）を得ることを含んだ。

【0161】

ＥＳＨ−ｄ_３（１０）は、メルカプトヒスチジン（８）に由来するＳ−ｔｅｒｔ−ブチル保護２−メルカプト−ヒスチジン（９）から出発して連続した２つの反応工程で合成した。^２１ ｄ_３ヨウ化メチルを用いた選択的Ｎ−メチル化、続いて２−メルカプトプロピオン酸（ｔｅｒｔ−ブチルスカベンジャー）のＨＣｌ溶液を用いたＳ−ｔｅｒｔ−ブチル脱保護を行うことによりＥＳＨ−ｄ_３（１０）を得た。

【0162】

【化44】

【0163】

参考文献
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１５．Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｙ．；Ｉｓｒａｅｌ Ｓ．Ｅ．；Ｍｅｌｖｉｌｌｅ Ｄ．Ｂ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９７４、２４９、４４２０−４４２７。
１６．Ｓｃｈｗｉｍｍｅｒ Ｓ．；Ｒｙａｎ Ｃ．Ａ．；Ｗｏｎｇ Ｆ．Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９６４、２３９、７７７−７８２。
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１９．Ｓａｔｏ，Ｋ．；Ｏｍｏｔｅ，Ｍ．；Ａｎｄｏ，Ａ．；Ｋｕｍａｄａｋｉ，Ｉ． Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、２００４、６、４３５９−４３６１。
２０．Ｅｒｄｅｌｍｅｉｅｒ，Ｉ．；Ｄａｕｎａｙ，Ｓ．；Ｌｅｂｅｌ，Ｒ；Ｆａｒｅｓｃｏｕｒ，Ｌ．；Ｙａｄａｎ Ｊ−Ｃ．Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍ．、２０１２、１４、２２５６−２２６５。
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２８．Ａｓｈｒａｆ，Ｓ．Ａ．、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１１、１３０−１４０

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】