特許 6485854 抗変異型プロテインＳ抗体、該抗体を含む診断用組成物、変異型ヒトプロテインＳの検出方法および該抗体を含むキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6485854

(24)【登録日】2019年3月1日

(45)【発行日】2019年3月20日

(54)【発明の名称】抗変異型プロテインＳ抗体、該抗体を含む診断用組成物、変異型ヒトプロテインＳの検出方法および該抗体を含むキット

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20190311BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20190311BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20190311BHJP

   C12N 5/18 20060101ALN20190311BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/18ZNA

   G01N33/53 D

   !C12N15/13

   !C12N5/18

【請求項の数】11

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2014-194080(P2014-194080)

(22)【出願日】2014年9月24日

(65)【公開番号】特開2016-65008(P2016-65008A)

(43)【公開日】2016年4月28日

【審査請求日】2017年9月21日

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01906

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01907

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01908

(73)【特許権者】

【識別番号】510094724

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立循環器病研究センター

(73)【特許権者】

【識別番号】504160781

【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和 清司

(72)【発明者】

【氏名】宮田 敏行

(72)【発明者】

【氏名】秋山 正志

(72)【発明者】

【氏名】丸山 慶子

(72)【発明者】

【氏名】森下 英理子

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−１９１８５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−０８３１６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５４３１１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０３−５０２７５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Maruyama K. et al.，Development of ELISA system for detection of protein S K196E (PS Tokushima) mutation.，臨床血液，２０１４年 ９月２２日，Vol.55 No.9，387(1381), 0S-3-70，国立国会図書館受入日

【文献】 KIMURA R. et al.，J Thromb Haemost.，4(9)(2006)，2010-2013

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／１８

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

Ｃ１２Ｎ １５／１３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗原として、ＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＫ（配列番号３）に対するよりも、ＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＥ（配列番号２）に対して有意に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体が、受領番号NITE AP-01906、NITE AP-01907、およびNITE AP-01908として夫々寄託されたハイブリドーマ４Ｂ１、１５Ｃ８、および１６Ｅ３のいずれかから産生されるモノクローナル抗体である、前記抗体またはその抗原結合断片。

【請求項2】

ＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＫ（配列番号３）が、配列番号１で表される野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列に含まれる、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項3】

少なくともＫ１９６Ｅの変異を有する変異型ヒトプロテインＳに特異的である、請求項２に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

受領番号NITE AP-01907として寄託されたハイブリドーマ１５Ｃ８から産生されるモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、免疫学的診断用組成物。

【請求項6】

血栓塞栓症を診断するための、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

血栓塞栓症が、静脈血栓塞栓症である、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

配列番号１で示されるアミノ酸配列の１９６番目のリジン（Ｋ）がグルタミン酸（Ｅ）に変異した非同義変異を少なくとも有する変異型ヒトプロテインＳを、被験者から採取された試料から検出する方法であって、前記試料を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、前記方法。

【請求項9】

変異型ヒトプロテインＳを、免疫比濁法、ラテックス凝集法、イムノクロマト法および固相免疫法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学的測定法により検出する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１９６番目のリジン（Ｋ）がグルタミン酸（Ｅ）に変異した非同義変異を少なくとも有する変異型ヒトプロテインＳを検出するための検出用キット。

【請求項11】

請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物を含む、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１９６番目のリジン（Ｋ）がグルタミン酸（Ｅ）に変異した非同義変異を少なくとも有する変異型ヒトプロテインＳを検出するための診断用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、特定のアミノ酸変異を有する変異型ヒトプロテインＳに特異的な抗体、該抗体を含む免疫学的診断用組成物、該抗体を用いて変異型ヒトプロテインＳを検出する方法、ならびに、該抗体を含む検出用キットおよび診断用キットに関する。

【背景技術】

【0002】

血栓症、例えば静脈血栓症等は、後天的な危険因子や環境因子の他に、単一遺伝子性かつ常染色体優性であって、様々な浸透率を有する多数の遺伝子変異または遺伝子多型によって、そのリスクが増大することがわかってきた。かかる遺伝子変異または遺伝子多型（まとめて「遺伝的欠陥」ともいう）の例としては、凝固促進タンパク質（フィブリノーゲン、プロトロンビン等）、抗凝固タンパク質（後述）、その他の血栓症関連タンパク質（アンジオテンシンＩ転換酵素等）をコードする遺伝子における遺伝的欠陥が挙げられる。
特に抗凝固タンパク質を代表するプロテインＣ、プロテインＳおよびアンチトロンビンＩＩＩの遺伝的欠陥は、静脈血栓症患者において高い割合で存在し、血栓症の素因の６０％超は遺伝的要因である（非特許文献１、特許文献５）。

【0003】

プロテインＳは、生体内の血液凝固系の制御機構において中心的に機能する血漿タンパク質である。血漿中に分泌された成熟型プロテインＳのタンパク質部分は６３５アミノ酸残基で構成され、分子内に１７個のジスルフィド結合を含むマルチドメイン型一本鎖ポリペプチドである。プロテインＳは、血液凝固第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、プロトロンビン、プロテインＣ等と同様、ビタミンＫ依存性タンパク質ファミリーに分類される。天然型プロテインＳはその分子内に４種類のドメイン構造を有しており、アミノ末端側から、γ−カルボキシルグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメイン、トロンビン感受性領域、４つの連続した上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）様ドメインおよび性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）様ドメインが存在する（特許文献６）。主に血液中に存在するプロテインＳは、活性化プロテインＣの補欠因子（補助因子）であり、活性化プロテインＣの活性を上昇させることができ、血液中での活性化プロテインＣの働きに欠かせないものである。活性化プロテインＣは、ヒトにおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第Ｖ因子（第Ｖａ因子）および活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩａ因子）を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担った因子である。プロテインＳは、Ｃ４ｂ結合タンパク質（補体第４因子ｂ結合タンパク質；Ｃ４ｂｐ）と１対１で特異的に結合し、複合体を形成する。すなわち、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、プロテインＳのリガンドとなる。通常、健常者の血液中（血漿中）のプロテインＳは、その約６０％が「プロテインＳ−Ｃ４ｂｐ複合体」（すなわち結合型）であり、その約４０％は「遊離状態のプロテインＳ」（すなわち遊離型）である。

【0004】

血栓症発症リスクを増大させるプロテインＳの遺伝的欠陥は、その量的欠損および質的異常に大別される。
プロテインＳの量的欠損を検出するには、ヒトプロテインＳを特異的に認識するモノクローナル抗体およびＣ４ｂｐとプロテインＳとの複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体（特許文献１および６）、Ｃ４ｂ結合タンパク質とプロテインＳとの結合を阻害する抗Ｃ４ｂｐ抗体（特許文献２）、遊離型とＣ４ｂｐ結合型とのヒトプロテインＳを２価金属イオンの存在下においてのみ認識する、いわゆる立体構造特異的モノクローナル抗体（特許文献３）、遊離型プロテインＳに特異的なモノクローナル抗体（特許文献４）、プロテインＳのＣ４ｂｐとの結合部位以外の部位に特異的に結合するモノクローナル抗体（特許文献７および８ならびに非特許文献２）等の抗体を使用して、血中の結合型／遊離型プロテインＳ濃度の測定を行う。

【0005】

他方、プロテインＳの質的異常については、試料中の総プロテインＳのタンパク質量および試料中の総プロテインＳの活性値を別々に測定し、この測定により得た総プロテインＳのタンパク質量と総プロテインＳの活性値とを、比活性を求める等により比較することによって、プロテインＳ徳島（Ｋ１５５Ｅ変異）を検出することができた（特許文献７および非特許文献２）。
また、市販のキット（STA試薬シリーズ プロテインＳ（クロット）、ロシュ・ダイアグノスティックス（株））等を使用する活性化プロテインＣの抗凝固活性を促進するコファクター活性測定または遺伝子検査によってもプロテインＳの質的異常を検出することができる。

【0006】

例えば日本人（主にモンゴロイド人種）である静脈血栓塞栓症患者１７３名において、プロテインＳ遺伝子とともにアンチトロンビン遺伝子およびプロテインＣ遺伝子を検査したところ、５５名（約３２％）から３９種のアミノ酸変異を伴う変異が同定された。かかるアミノ酸変異には、例えば、本発明者らが同定したプロテインＳ遺伝子のＫ１９６Ｅ変異（非特許文献３）の他に、プロテインＣのＫ１９３del変異や同Ｖ３３９Ｍ変異等が含まれていた。プロテインＳのＫ１９６Ｅ変異のヘテロ接合体について、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を指標にしてプロテインＳのコファクター活性を測定した結果、変異型プロテインＳのコファクター活性値は平均１６％の低下を示したが、変異型プロテインＳのコファクター活性値が大きくばらつき、健常者由来のプロテインＳのコファクター活性値と大きく重複することから、プロテインＳのコファクター活性を測定するだけでは当該変異の有無を判定することは困難であった（非特許文献３）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特公平７−１１７５３４号公報

【特許文献2】特許第２５３７０４５号公報

【特許文献3】特開２００３−９６０９４号公報

【特許文献4】特許第４２２４１３８号公報

【特許文献5】特表２００７−５２２８０４号公報

【特許文献6】再表２０１０／０１８８４７号公報

【特許文献7】特開２０１２−１９３９５９号公報

【特許文献8】国際公開第２０１２／１２４７９８号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Souto et al., Genetic Susceptibility to Thrombosis and Its Relationshipto Physiological Risk Factors: The GAIT Study, Am. J. Hum. Genet., 67(6), 1452-1459 (2000)

【非特許文献2】Tsuda et al., New quantitative total protein S-assay system for diagnosing protein S type II deficiency: clinical application of the screening system for protein S type II deficiency, Blood Coagul. Fibrinolysis, 23(1), 56-63 (2012).

【非特許文献3】Kimura et al., Plasma protein S activity correlates with protein S genotype but is not sensitive to identify K196E mutant carriers, J Thromb Haemost., 4, 2010-2013 (2006).

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

そこで、本発明は、前記の問題を解決する、Ｋ１９６Ｅ変異を有する変異型プロテインＳを正確かつ簡便に検出する手法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねる中で、いわゆる抗ペプチド抗体によるプロテインＳのＫ１９６Ｅ変異の検出に着眼し、そのための抗原として、１９６番目のグルタミン酸を含む所定の１１アミノ酸を選択し、かかる抗原をもとに、野生型ヒトプロテインＳに対するよりも、Ｋ１９６Ｅ変異の変異型プロテインＳに対して、特異的に結合する抗体の作製に成功し、本発明を完成するに至った。

【0011】

すなわち、本発明は、抗原として、ＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＫ（配列番号３）に対するよりも、ＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＥ（配列番号２）に対して有意に結合する抗体またはその抗原結合断片に関する。
ＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＫ（配列番号３）は、好ましくは、配列番号１で表される野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列に含まれる。
本発明の抗体またはその断片は、好ましくは、少なくともＫ１９６Ｅの変異を有する変異型ヒトプロテインＳに特異的である。
本発明の抗体またはその断片は、好ましくは、モノクローナル抗体である。

【0012】

また、本発明は、本発明の抗体またはその断片を含む、免疫学的診断用組成物に関する。
本発明の免疫学的診断用組成物は、好ましくは血栓塞栓症、例えば静脈血栓塞栓症を診断するためのものである。

【0013】

さらに、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１９６番目のリジン（Ｋ）がグルタミン酸（Ｅ）に変異した非同義変異を少なくとも有する変異型ヒトプロテインＳを試料から検出する方法であって、前記試料を、本発明の抗体またはその断片と接触させる工程を含む、前記方法に関する。
本発明の検出方法は、変異型ヒトプロテインＳを、免疫比濁法、ラテックス凝集法、イムノクロマト法および固相免疫法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学的測定法により検出する工程をさらに含むことが好ましい。

【0014】

さらにまた、本発明は、本発明の抗体またはその断片を含む、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１９６番目のリジン（Ｋ）がグルタミン酸（Ｅ）に変異した非同義変異を少なくとも有する変異型ヒトプロテインＳを検出するための検出用キット、および本発明の免疫学的診断用組成物を含む、該変異型ヒトプロテインＳを検出するための診断用キットに関する。

【発明の効果】

【0015】

本発明の抗体またはその抗原結合断片は、野生型ヒトプロテインＳに比してＫ１９６Ｅ変異に対する特異性が高いため、被験者に由来する例えば血液試料等から、当該変異型ヒトプロテインＳを、正確かつ簡便に検出することができる。
また、プロテインＳのＫ１９６Ｅ変異の検出には、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を指標にするプロテインＳのコファクター活性の測定が困難なため（非特許文献３）、例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ、Ｔａｑｍａｎ対立遺伝子識別法、パイロシーケンス法等の遺伝子検査を行うことも考えられるが、本発明にかかる手法によれば、プロテインＳのＫ１９６Ｅ変異をはるかに低コストで、正確かつ簡便に検出することができる。
本発明によって、プロテインＳの活性が低下し、血栓症のリスクが高まる例えば妊婦等に対し、血栓症のリスク判断のための診断薬として用いることが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、固相化抗原として配列番号２のペプチド、配列番号３のペプチド、配列番号２のペプチドにＫＬＨを結合させたもの、および、ＫＬＨ単独（図中、夫々、「Ｋ１９６Ｅ」、「Ｋ１９６」、「Ｋ１９６Ｅ−ＫＬＨ」および「ＫＬＨ」で表される）を用いて、実施例１で得られた血清に含まれる抗体との結合量をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す。

【0017】

【図2】図２は、固相化抗原として、配列番号１で表される野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列における４２〜６７６番目の配列からなる組み換え体のヒトプロテインＳ（「野生型プロテインＳ（42-676）」）と、配列番号１で表される野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列において１９６番目のリジン残基（Ｋ）がグルタミン酸残基（Ｅ）に変異した場合の４２〜６７６番目の配列からなる組み換え体のヒトプロテインＳ（「変異型プロテインＳ（42-676）」）とを用いて、実施例１で得られた３種のモノクローナル抗体（４Ｂ１、１５Ｃ８、１６Ｅ３）との結合量をＥＬＩＳＡにより夫々測定した結果を示す。

【0018】

【図3】図３は、固相化抗原として、配列番号１で表される野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列における１１７〜２８３番目の配列からなる組み換え体のヒトプロテインＳ（「野生型プロテインＳ（117-283）」）と、配列番号１で表される野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列において１９６番目のリジン残基（Ｋ）がグルタミン酸残基（Ｅ）に変異した場合の１１７〜２８３番目の配列からなる組み換え体のヒトプロテインＳ（「変異型プロテインＳ（117-283）」）とを用いて、実施例１で得られた３種のモノクローナル抗体（４Ｂ１、１５Ｃ８、１６Ｅ３）との結合量をＥＬＩＳＡにより夫々測定した結果を示す。

【0019】

【図4】図４は、実施例２および実施例３の夫々において調製した遺伝子組み換え体のヒトプロテインＳと実施例１で得られたモノクローナル抗体（１５Ｃ８）との結合を検出する、ウェスタンブロットによる画像を示す。左端から分子量マーカー（レーンＭ）、野生型プロテインＳ（42-676）（レーン１）、変異型プロテインＳ（42-676）（レーン２）、野生型プロテインＳ（117-283）（レーン３）および変異型プロテインＳ（117-283）（レーン４）である。

【0020】

【図5】図５は、実施例５において、ヒト血漿中プロテインＳと実施例１で得られた抗体とのＥＬＩＳＡ測定した結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、本発明について、本発明の好適な実施態様に基づき、詳細に説明する。
本発明における「プロテインＳ」（ＰＳ）またはＰＲＯＳ１タンパク質は、ヒト由来のあらゆるＰＳ遺伝子、ｃＤＮＡもしくはＲＮＡの産物、またはＰＳタンパク質が含まれ、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列やGenBankアクセッション番号AAH15801に開示されたアミノ酸配列等からなり、本明細書中「ヒトプロテインＳ」、または単に「プロテインＳ」とも記す。野生型のヒトプロテインＳの代表的なアミノ酸配列を配列番号１に示すが、本発明においては、配列番号１のアミノ酸配列の１９６番目に相当するアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換されたもののみを「変異型ヒトプロテインＳ」と定義する。この変異を有さなければ、これ以外のアミノ酸１個または複数個の欠失、置換および／または付加の変異を有していても、「野生型ヒトプロテインＳ」と定義する。この野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の配列同一性を有する。

【0022】

＜抗体またはその断片＞
本発明は、一態様において、抗原として、ＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＫ（配列番号３）に対するよりも、ＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＥ（配列番号２）に対して、例えばＥＬＩＳＡにより測定した抗体の結合定数等を指標として、有意に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供するものである。すなわち、本発明の抗体またはその抗原結合断片（単に「その断片」とも記す）は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドには特異的であって、かつ配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドには有意に結合しないともいえ、好ましくは配列番号２のペプチドと配列番号３のペプチドとに対し交差反応するものではない。

【0023】

本発明における「（抗体の）抗原結合断片」または単に「（抗体の）断片」とは、ＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＥ（配列番号２）のペプチドに対して有意に結合する抗体と同程度に該ペプチドに結合することができる抗体の断片であれば特に限定されるものではないが、かかる断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆ（ａｂ’）断片、二重特異性ｓｃＦｖ断片、Ｆｄ断片およびＦａｂ発現ライブラリーにより産生された断片、ペプチドアプタマーから選択されるその抗体の断片等が挙げられる。
本発明の抗体は、その由来として、特に限定されるものではなく、例えば、哺乳動物（マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ヒト等）または鳥類（ニワトリ、ウズラ、キジ、ダチョウ、アヒル等）などが挙げられる。

【0024】

本発明において、ＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＫ（配列番号３）は、好ましくは、配列番号１で表される野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列に含まれる（１８６〜１９６番目の配列に対応）。それと同時に、ＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＥ（配列番号２）は、配列番号１で表される野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列において、１９６番目のリジン残基（Ｋ）がグルタミン酸残基（Ｅ）に変異した場合の１８６〜１９６番目の配列に対応する。

【0025】

本発明の抗体またはその断片は、好ましくは、少なくともＫ１９６Ｅの変異を有する変異型ヒトプロテインＳ（以下、単に「変異型プロテインＳ」とも記す）に特異的である、すなわち、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する野生型ヒトプロテインＳに対するよりも、変異型プロテインＳに対して、有意に結合する。
ヒトプロテインＳは、野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列において４３５〜４６８番目の領域でＣ４ｂｐと結合するので（特許文献４）、本発明の抗体またはその断片は、遊離型のプロテインＳのみならず、プロテインＳ−Ｃ４ｂｐ複合体における結合型のプロテインＳにも結合することができる。

【0026】

本発明において「少なくともＫ１９６Ｅの変異を有する変異型ヒトプロテインＳ」とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１９６番目のリジン残基（Ｋ）がグルタミン酸残基（Ｅ）に置換している変異の他に、ミスセンス変異、ノンセンス変異、フレームシフト変異、スプライス部位変異およびアミノ酸欠損変異からなる群から選択される非同義変異を含むものであってもよいが、ＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＥ（配列番号２）のアミノ酸配列は保存されている。

【0027】

本発明の抗体またはその断片は、好ましくは、モノクローナル抗体である。ＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＫ（配列番号３）に対するよりも、ＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＥ（配列番号２）に対して有意に結合するモノクローナル抗体が複数種存在する場合、各モノクローナル抗体同士を混合した組成物（いわゆるポリクローナル抗体）であってもよい。
本発明の抗体の作製方法としては、例えば、ＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＥ（配列番号２）からなるペプチドを免疫原（抗原）として用いてマウス、好ましくは胚中心Ｂ細胞に核内タンパク質ＧＡＮＰを高発現するトランスジェニックマウス（ＧＡＮＰ(登録商標)マウス）等の前記哺乳動物または前記鳥類に免疫し、この動物の脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合して得られたハイブリドーマが産生する抗体をスクリーニングするとともに、特定の抗体を産生するハイブリドーマのクローニングを行う従来の方法等が挙げられる。具体例としての詳細は本実施例を参照。

【0028】

本発明の抗体のような、いわゆる抗ペプチド抗体を作製するのに際し、従来の方法においては、特定のタンパク質の中から特定のアミノ酸配列を選択して免疫原（合成ペプチド）として用いるが、通常、免疫原である合成ペプチドの中にシステイン残基が含まれないように選択することが知られている。システイン残基同士は、タンパク質の三次構造（立体構造）を保持するためジスルフィド結合を形成することがあり、システイン残基を含む選択ペプチドは、タンパク質の立体構造内部に埋もれやすく、その立体障害のため、抗ペプチド抗体が選択ペプチドを介してタンパク質に結合しづらい。
ただし、合成ペプチドを免疫原とするこのような場合、そのままでは免疫原として認識されづらいため、その合成ペプチドのＮ末端またはＣ末端にシステインをあえて加え、そのシステインを介して、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の抗原性刺激のあるキャリアタンパク質と合成ペプチドとを結合させることがある。

【0029】

本発明において使用するＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＥ（配列番号２）の先頭のシステイン残基（Ｃ）は、キャリアタンパク質との結合を目的として加えたものではなく、野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列（配列番号１）に含まれるもの（１８６番目のアミノ酸）であり、このシステイン残基は、配列番号１に含まれる他のシステイン残基（１９９番目のアミノ酸）とジスルフィド結合を形成することが確認されている。
当業者は通常、免疫抗原としての合成ペプチド内に、ジスルフィド結合に寄与するシステイン残基を含まないように選択するが、本発明は、あえてシステイン残基を含む配列をエピトープとする抗体を作製することで、抗原として認識されやすい抗体を作製することに成功した。

【0030】

＜免疫学的診断用組成物＞
また、本発明は、別の一態様において、本発明の抗体またはその断片を含む、免疫学的診断用組成物を提供するものであり、該組成物は、好ましくは血栓塞栓症、より好ましくは静脈血栓塞栓症、例えば、エコノミークラス症候群やロングフライト血栓症とも呼ばれる肺血栓塞栓症および深部静脈血栓症等の遺伝的素因があるか否かを判定するために使用するものである。
本発明の免疫学的診断用組成物には、本発明の抗体および／またはその断片の他に、例えば、緩衝液等を含んでもよい。
また、本発明の免疫学的診断用組成物の調製方法としては、例えば、本発明の抗体またはその断片の製造方法に準じ、本発明の抗体またはその断片が失活しなければ、従来公知の任意の方法を用いることができる。

【0031】

＜検出方法＞
さらに、本発明は、他の一態様において、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１９６番目のリジン（Ｋ）がグルタミン酸（Ｅ）に変異した非同義変異を少なくとも有する変異型ヒトプロテインＳを試料から検出する方法を提供するものであって、該方法は、
前記試料を、本発明の抗体またはその断片と接触させる工程
を含み、好ましくは、
変異型ヒトプロテインＳを、従来公知の免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス凝集（ＬＰＩＡ）法、イムノクロマト法（ＩＣ）および固相免疫法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学的測定法により検出する工程
をさらに含むものである。

【0032】

本発明の検出方法における「試料」とは、プロテインＳが存在する可能性があり、かつプロテインＳの存在の有無、または含有量（濃度）の測定を行おうとする対象を指し、かかる試料としては、例えば、ヒト由来の血液、血清、血漿、唾液、汗、尿、涙、髄液、羊水、腹水等の体液、または、肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織等の臓器、組織もしくは細胞等の抽出液など、プロテインＳが含まれる可能性のあるものが挙げられる。
ＥＬＩＳＡの原理を利用する固相免疫法としては、抗体への標識物質の種類により、例えば、放射性同位元素を標識するＲＩＡ、ユーロピウム等の蛍光発光物質を標識する蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ルミノール等の化学発光物質を標識する化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、ペルオキシダーゼ等の酵素を標識する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等が挙げられる。

【0033】

＜キット＞
さらにまた、本発明は、さらに他の一態様において、本発明の抗体および／またはその断片ならびに免疫学的診断用組成物を夫々含む、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１９６番目のリジン（Ｋ）がグルタミン酸（Ｅ）に変異した非同義変異を少なくとも有する変異型ヒトプロテインＳを検出するための検出用キットおよび診断用キットを提供するものである。
これらのキットには、例えば、緩衝液、抗体への標識物質、二次抗体、シグナルを検出するための検出用試薬、またはキットの使用説明書等がさらに含まれていてもよい。

【実施例】

【0034】

以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
［実施例１］抗体の作製
配列番号２で示されるＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＥのペプチドを免疫原として免疫したマウスから得られたマウス血清に含まれる抗体の希釈系列と、固相化抗原として夫々、配列番号２のペプチド、配列番号３のペプチド、ＫＬＨを結合した配列番号２のペプチドおよびＫＬＨのみとの抗体抗原反応をＥＬＩＳＡにより確認した。その結果を図１に示す。なお、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体を、ＨＲＰの基質としてオルトフェニレンジアミンを用いた。
次に、以下の常法に従って、前記の免疫したマウスからハイブリドーマを作製し、配列番号３のＣＫＮＧＦＶＭＬＳＮＫペプチドに対するより、配列番号２のペプチドに対して有意に結合するか否かを指標に、所望のモノクローナル抗ペプチド抗体のスクリーニングおよび抗体産生細胞のクローニングを行った。最終的に本発明では３種類のモノクローナル抗体（４Ｂ１、１５Ｃ８、１６Ｅ３）を得ることに成功した。

【0035】

＜常法＞
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ケーラーとミルシュタインの方法（Koehler & Milstein, Nature, 256, 495-497 (1975)）に準じて得ることができる。すなわち、配列番号２の合成ペプチドのシステイン残基にＫＬＨを結合させたものを用いてマウスを免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させる。得られたハイブリドーマをマイクロタイタープレートにまき込んで、抗体のスクリーニングと抗体産生細胞のクローニングを行い、このハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取した。
採取したハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することができ、また液体窒素中で半永久的に保存することができる。所望のモノクローナル抗体は、インビトロにおける培養法により大量調製することができる。インビトロ培養法は、ハイブリドーマを適当な血清培地若しくは無血清培地中で培養することにより実施でき、所望のモノクローナル抗体は培地中に産生される。この培養法によれば、比較的高純度の所望抗体を培養上清として得ることができる。
本実験においては、前記「マウス」として、ＧＡＮＰ(登録商標)マウスを使用した。

【0036】

なお、得られたハイブリドーマ４Ｂ１、１５Ｃ８および１６Ｅ３は、２０１４年７月３１日付で、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（〒２９２−０８１８）、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、受領番号NITE AP-01906、NITE AP-01907、およびNITE AP-01908として夫々受領された。

【0037】

［実施例２］プロテインＳ（42-676）と抗体とのＥＬＩＳＡ測定
固相化抗原として、配列番号１で表される野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列における４２〜６７６番目の配列からなる遺伝子組み換え体のヒトプロテインＳ（０．８ｍｇ／ｍｌ）と、配列番号１で表される野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列において１９６番目のリジン残基（Ｋ）がグルタミン酸残基（Ｅ）に変異した場合の４２〜６７６番目の配列からなる遺伝子組み換え体のヒトプロテインＳ（１．０ｍｇ／ｍｌ）の夫々に対し、実施例１で得られた３種のモノクローナル抗体（４Ｂ１、１５Ｃ８、１６Ｅ３）との抗体抗原反応をＥＬＩＳＡにより確認した。

【0038】

具体的な手順としては、ＰＢＳ（ナカライテスク社、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）製品番号27575−31）で希釈した遺伝子組み換え体のヒトプロテインＳを５０μｌ／ウェル添加し、室温で１時間静置した。ＥＬＩＳＡのサンプルプレートとして、ＮＵＮＣイムノモジュール（フレーム付）マキシソープ（製品番号467466）を使用した。
洗浄バッファー（ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）にてウェルを３回洗浄後、ブロッキングバッファー（０．５％ゼラチンＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を２００μｌ／ウェル添加し、４℃で終夜(約１６時間)静置した。
洗浄バッファーにてウェルを３回洗浄後、抗体希釈液（０．０５％ゼラチンＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した抗ヒトプロテインＳ−Ｋ１９６Ｅモノクローナル抗体（２μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェル添加し、室温で１時間静置した。

【0039】

洗浄バッファーにてウェルを３回洗浄後、抗体希釈液で２５００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体（KPL社(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.)）を５０μｌ／ウェル添加し、室温で１時間静置した。
洗浄バッファーにてウェルを３回洗浄後、ＴＭＢ（KPL社、SureBlue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate）を１００μｌ／ウェル添加し、室温で１０分間静置した。反応停止液（１ＮのＨＣｌ）を１００μｌ／ウェル添加し、Thermo Labsystems Multiskan Ascent（サーモバイオアナリシスジャパン社）を使用して吸光度を４５０／６５０ｎｍで夫々の試料について３回測定した。その結果を図２と表１に示す。

【0040】

【表1】

【0041】

なお、「プロテインＳ（42-676）」は、配列番号１で表される野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列における４２〜６７６番目の配列からなる遺伝子組み換え体のヒトプロテインＳを指し、さらにプロテインＳ（42-676）の１９６番目のアミノ酸がリジン残基のものを「野生型」とし、グルタミン酸残基のものを「変異型」とする。
また、プロテインＳ（42-676）は、当該分野において公知の方法に従い調製した。

【0042】

［実施例３］プロテインＳ（117-283）と抗体とのＥＬＩＳＡ測定
実施例２において、固相化抗原として、野生型プロテインＳ（42-676）の代わりに、配列番号１で表される野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列における１１７〜２８３番目の配列からなる遺伝子組み換え体の野生型ヒトプロテインＳ（９ｍｇ／ｍｌ）を、変異型プロテインＳ（42-676）の代わりに、配列番号１で表されるヒトプロテインＳのアミノ酸配列において１９６番目のリジン残基（Ｋ）がグルタミン酸残基（Ｅ）に変異した場合の１１７〜２８３番目の配列からなる遺伝子組み換え体のヒトプロテインＳ（５．３ｍｇ／ｍｌ）を用いた以外は、実施例２と同様にしてＥＬＩＳＡ測定を行った。その結果を図３と表２に示す。

【0043】

【表2】

【0044】

なお、「プロテインＳ（117-283）」は、配列番号１で表される野生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列における１１７〜２８３番目の配列からなる遺伝子組み換え体のヒトプロテインＳを指し、４つの連続した上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）様ドメインに対応する。また、プロテインＳ（117-283）の１９６番目のアミノ酸がリジン残基のものを「野生型」とし、グルタミン酸残基のものを「変異型」とする。
また、プロテインＳ（117-283）は、当該分野において公知の方法に従い調製した。

【0045】

［実施例４］ウェスタンブロット解析
通常の方法によりウェスタンブロットを行い、実施例２および実施例３の夫々において調製した遺伝子組み換え体のヒトプロテインＳと実施例１で得られたモノクローナル抗体（１５Ｃ８）との結合を検出した。
分子量マーカーとして、プレシジョンＰｌｕｓプロテイン２色スタンダード（BIO-RAD社、製品番号161-0374）を使用した。ゲルとして、スーパーセップエース１０−２０％ゲル（Wako社、製品番号198-15041）を使用した。メンブレンとして、Immun-Blot PVDFメンブレン（BIO-RAD社）を使用した。ブロッキングには５％スキムミルクを使用した。二次抗体として、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ−ＨＲＰ（KPL社、製品番号074-1806）を使用し、一次抗体および二次抗体夫々の反応の際は室温で１時間静置した。発色には、immobilon western Chemiluminescent HRP Substrate（ミリポア社）を使用した。画像解析には、LAS-3000を使用した。得られた結果を図４に示す。

【0046】

［実施例５］ヒト血漿中プロテインＳと抗体とのＥＬＩＳＡ測定
野生型プロテインＳおよび変異型プロテインＳを夫々含むヒト血漿サンプルをウェルに添加し、室温で静置した。
コーティングバッファー（５０ｍＭ 炭酸／炭酸水素バッファー、ｐＨ９．６）を、０．１５９ｇのＮａ_２ＣＯ_３および０．２９３ｇのＮａＨＣＯ_３を１００ｍｌの水に溶解させて調製した。このコーティングバッファーを用いて希釈した１０μｇ／ｍｌのPolyclonal Rabbit Anti-Human Protein S（DAKO社、製品番号A0348）を１００μｌ／ウェル添加し、４℃で終夜(約１６時間)静置した。洗浄バッファー（ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）にて３回洗浄後、ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ−ＴＢＳ）を２００μｌ／ウェル添加し、室温で２時間静置した。さらに洗浄バッファーにて３回洗浄後、試料希釈液（ＴＢＳ）で希釈した試料（ヒト血漿１／２０）を１００μｌ／ウェル添加し、室温で２時間静置した。洗浄バッファーにて３回洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトプロテインＳ−Ｋ１９６Ｅモノクローナル抗体（１５Ｃ８）を抗体希釈液（１％ＢＳＡ−ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェル添加し、室温で１時間静置した。洗浄バッファーにて５回洗浄後、ＴＭＢを１００μｌ／ウェル添加し、室温で１０分間静置した。反応停止液（１Ｎ ＨＣｌ）を１００μｌ／ウェル添加し、吸光度４５０／６５０ｎｍで測定した。その結果を図５と表３に示す。なお、ＨＲＰはPeroxidase Labeling Kit NH2（Dojindo社）を用いて標識した。また、１０×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）は６．０６ｇのＴｒｉｓおよび５．８ｇのＮａＣｌを１００ｍｌの水に溶解させて調製した。

【0047】

【表3】

【0048】

＜考察＞
実施例２および３のＥＬＩＳＡの結果から、実施例１で得られた３種類のモノクローナル抗体（４Ｂ１、１５Ｃ８、１６Ｅ３）のいずれも、Ｋ１９６Ｅの変異を有するヒトプロテインＳの遺伝子組み換え体と有意に結合することがわかった。
実施例４のウェスタンブロットの結果（図４）から、実施例１で得られたモノクローナル抗体１５Ｃ８は、ヒトプロテインＳの全長（42-676）およびＥＧＦ様ドメイン（117-283）のいずれにも同じように結合することがわかった。また、同結果から、モノクローナル抗体１５Ｃ８が、Ｋ１９６Ｅ変異を有するヒトプロテインＳのＥＧＦ様ドメイン（117-283）を標的とすることも確認することができた。
図４において、ヒトプロテインＳの全長（42-676）およびＥＧＦ様ドメイン（117-283）の各バンドのシグナル強弱が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した各タンパク質のモル数に差があること（ただし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした各タンパク質の重量は等しい）、分子量の大きいタンパク質ほどブロッティング効率が低くなる傾向にあること等が原因であることを本発明者らは突きとめている。

【0049】

本発明に係るアミノ酸配列（配列番号２）のＮ末端のシステイン残基は、ヒトプロテインＳのアミノ酸配列（配列番号１）中のＥＧＦ様ドメイン（117-283）に含まれる１８６番目のシステイン残基に相当するものであり、このシステイン残基は、配列番号１に含まれるＥＧＦ様ドメイン中の１９９番目のシステイン残基とジスルフィド結合を形成することが確認されている。当業者は通常、免疫抗原としての合成ペプチド内に、抗原性の低下をもたらすジスルフィド結合に寄与するシステイン残基を含まないように選択するものである。しかしながら、本発明では、敢えてシステイン残基を含む配列、すなわちＥＧＦ様ドメイン中の別のシステイン残基との間でジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む配列をエピトープとして選択したことで、驚くべきことに、ジスルフィド結合を含むネイティブコンフォメーション変異体を認識する抗体を分離することに成功した。

【0050】

また、実施例５のヒト血漿中のプロテインＳのＥＬＩＳＡの結果（表３、図５）から、実施例１で得られたモノクローナル抗体１５Ｃ８が、ヒト血漿中においてＫ１９６Ｅの変異を有するヒトプロテインＳと有意に結合することがわかった。したがって、本発明は、血液等の生体試料中であってもヒトプロテインＳを検出することが可能であることから、血液検査等の実用に耐え得ることが示された。
さらに、プロテインＳの変異を検出する従来法（特許文献７および非特許文献２）は、試料中の総プロテインＳのタンパク質量および試料中の総プロテインＳの活性値を別々に測定し、比活性を求めること等を特徴とするが、本発明においてはプロテインＳの変異を検出するためにプロテインＳの活性値の測定は不要であることから、簡便にプロテインＳの変異を検出することが可能である。

【産業上の利用可能性】

【0051】

本発明は、血栓症患者、例えば静脈血栓塞栓症患者の治療方針に遺伝性の素因情報を提供することができる。それによって、血栓症等の疾患の予防、診断および治療等に役立てることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]