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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6486836
(24)【登録日】2019年3月1日
(45)【発行日】2019年3月20日
(54)【発明の名称】遺伝子発現制御のための人工ミミックｍｉＲＮＡおよびその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20190311BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20190311BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20190311BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20190311BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20190311BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 110Z
A61K31/7105ZNA
A61K48/00
A61P43/00 111
A61P43/00 105
A61P35/00
【請求項の数】11
【全頁数】29
(21)【出願番号】特願2015-555042(P2015-555042)
(86)(22)【出願日】2014年12月26日
(86)【国際出願番号】JP2014084508
(87)【国際公開番号】WO2015099122
(87)【国際公開日】20150702
【審査請求日】2017年11月24日
(31)【優先権主張番号】特願2013-269599(P2013-269599)
(32)【優先日】2013年12月26日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】505457994
【氏名又は名称】学校法人東京医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100115255
【弁理士】
【氏名又は名称】辻丸 光一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100129137
【弁理士】
【氏名又は名称】中山 ゆみ
(74)【代理人】
【識別番号】100154081
【弁理士】
【氏名又は名称】伊佐治 創
(72)【発明者】
【氏名】黒田 雅彦
(72)【発明者】
【氏名】大野 慎一郎
【審査官】
関 景輔
(56)【参考文献】
【文献】
米国特許出願公開第２０１３／０１７９９９９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
特開２００８−２３９５９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２０１０−５２７６１６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００９／１２６５６３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１２／１６１１２４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
GUENNEWIG B. et al，Synthetic pre-microRNAs reveal dual-strand activity of miR-34a on TNF-α，RNA，２０１３年１１月１８日，Vol. 20，No.1 ，pp. 61-75
【文献】
MCMANUS M.T. et al.，Gene silencing using micro-RNA designed hairpins，RNA,2002,8(6),p.842-50
【文献】
WINTER J. et al.，Loop-miRs: active microRNAs generated from single-stranded loop regions，Nucleic Acids Res.,2013-May,41(10),p.5503-12
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ１５
Ａ６１Ｋ３１
Ａ６１Ｋ４８
Ａ６１Ｐ３５
Ａ６１Ｐ４３
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２５の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする人工ミミックｍｉＲＮＡ。
【請求項2】
前記ポリヌクレオチドの３’末端側に、オーバーハングを有する、請求項１記載の人工ミミックｍｉＲＮＡ。
【請求項3】
前記オーバーハングが、０〜４塩基長である、請求項２記載の人工ミミックｍｉＲＮＡ。
【請求項4】
標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項１から３のいずれか一項に記載の人工ミミックｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする発現抑制用組成物。
請求項１から３のいずれか一項に記載の人工ミミックｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする発現抑制用組成物。
【請求項5】
請求項１から３のいずれか一項に記載の人工ミミックｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項6】
標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
非ヒト動物に対し、請求項１から３のいずれか一項に記載の人工ミミックｍｉＲＮＡを使用することを特徴とする発現抑制方法。
非ヒト動物に対し、請求項１から３のいずれか一項に記載の人工ミミックｍｉＲＮＡを使用することを特徴とする発現抑制方法。
【請求項7】
請求項１から３のいずれか一項に記載の人工ミミックｍｉＲＮＡを、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項６記載の発現抑制方法。
【請求項8】
請求項１から３のいずれか一項に記載の人工ミミックｍｉＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで投与する、請求項６または７記載の発現抑制方法。
【請求項9】
請求項１から３のいずれか一項に記載の人工ミミックｍｉＲＮＡを、非ヒト動物に投与する、請求項６から８のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
【請求項10】
がんの治療方法であって、
請求項１から３のいずれか一項に記載の人工ミミックｍｉＲＮＡを、非ヒト動物に投与する工程を含むことを特徴とする治療方法。
請求項１から３のいずれか一項に記載の人工ミミックｍｉＲＮＡを、非ヒト動物に投与する工程を含むことを特徴とする治療方法。
【請求項11】
がんの治療に使用するための人工ミミックｍｉＲＮＡであって、
前記人工ミミックｍｉＲＮＡは、請求項１から３のいずれか一項に記載の人工ミミックｍｉＲＮＡであることを特徴とする人工ミミックｍｉＲＮＡ。
前記人工ミミックｍｉＲＮＡは、請求項１から３のいずれか一項に記載の人工ミミックｍｉＲＮＡであることを特徴とする人工ミミックｍｉＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子発現を抑制する人工ミミックｍｉＲＮＡおよびその用途に関する。【背景技術】
【0002】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子の発現を抑制する核酸分子として知られており、例えば、以下のような生成プロセスを経て、遺伝子がコードするタンパク質の転写を抑制すると報告されている。すなわち、まず、核内においてｍｉＲＮＡ転写産物（Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。前記Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、５’末端にキャップ構造、３’末端にポリ（Ａ）を有している。このＰｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ（Ｄｒｏｓｈａ）により切断され、ｍｉＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。前記Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ループ領域とステム領域とを有するヘアピン構造をとる。このＰｒｅ−ｍｉＲＮＡは、核外に移動した後、細胞質のＲＮａｓｅ（Ｄｉｃｅｒ）により分解され、二本鎖のｍｉＲＮＡ（成熟ｍｉＲＮＡ）が切り出される。前記成熟ｍｉＲＮＡは、各鎖の３’末端に１〜４塩基のオーバーハングを有する。この二本鎖のｍｉＲＮＡのうち、一方の鎖は、ガイド鎖と呼ばれ、他方の鎖は、パッセンジャー鎖と呼ばれ、前記ガイド鎖が、ＲＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）に類似した複合体に結合する。このｍｉＲＮＡ／ＲＩＳＣ複合体が、特定のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に結合することによって、前記ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳が抑制される。【0003】
ｍｉＲＮＡは、分化、細胞増殖、アポトーシス等の生命現象やウイルス感染症，ガン等の多くの疾患に深く関わっていることが明らかになってきている（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２）。このことから、特に医療分野における応用が期待されている。【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】ＷＯ ２０１０／０５６７３７ Ａ２
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Deiters, 2009, The AAPS Journal, 12, 51-60
【非特許文献2】Takeshita et al., 2010, Mol. Ther., 18, 181-187
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
前記ｍｉＲＮＡを応用するにあたっては、例えば、二本鎖の成熟ｍｉＲＮＡを使用する方法、前記成熟ｍｉＲＮＡが切り出される前のｍｉＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を使用する方法等がある。しかし、前者は、使用に先立って、二本の一本鎖核酸分子をアニーリングする必要があり、二本鎖を認識するＴＬＲ３等によって自己免疫を発生する可能性がある。また、後者は、一般的に、約５０〜１８０塩基長、主に約７０塩基長という長い核酸分子となるため、合成のコスト高が懸念される。【0007】
そこで、本発明は、ｍｉＲＮＡを利用した新たな人工ミミックｍｉＲＮＡの提供を目的とする。【課題を解決するための手段】
【0008】
前記目的を達成するために、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、Ｘ領域とＹ領域とが連結した一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域は、成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列またはその部分配列であり、前記Ｙ領域に対する連結側領域（ＸＢ）および非連結側領域（ＸＦ）からなり、
前記連結側領域（ＸＢ）は、その領域内で分子内アニーリングしない配列であり、
前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域の前記非連結側領域（ＸＦ）と、分子内アニーリングする配列であることを特徴とする。
【0009】
本発明の組成物は、遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。【0010】
本発明の組成物は、薬学的組成物であって、前記本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。【0011】
本発明の発現抑制方法は、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡを使用することを特徴とする。【0012】
本発明の疾患の治療方法は、前記本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡを、患者に投与する工程を含み、前記人工ミミックｍｉＲＮＡにおける前記ガイド鎖またはその部分配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖またはその部分配列であることを特徴とする。【0013】
本発明の核酸分子は、疾患の治療に使用するための人工ミミックｍｉＲＮＡであって、前記人工ミミックｍｉＲＮＡは、前記本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡであり、前記人工ミミックｍｉＲＮＡにおける前記ガイド鎖またはその部分配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖またはその部分配列であることを特徴とする。
【発明の効果】
【0014】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡによれば、容易に低コストで合成でき、且つ、前記遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制が可能である。【図面の簡単な説明】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。【0017】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、５’側に前記Ｘ領域が配置され、３’側に前記Ｙ領域が配置されている。【0018】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、前記Ｘ領域における前記連結側領域（ＸＢ）は、０〜１２塩基長である。【0019】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、前記非連結側領域（ＸＦ）において、０〜６個の塩基が、前記Ｙ領域に対して非相補的な塩基である。【0020】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と未連結の末端側に、オーバーハングを有する。【0021】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、前記オーバーハングが、０〜４塩基長である。【0022】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、前記ガイド鎖の部分配列が、前記ガイド鎖において３’末端側の塩基が欠失した配列である。【0023】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、前記ガイド鎖の部分配列が、前記ガイド鎖において３’末端側の１〜１０個の塩基が欠失した配列である。【0024】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、前記ガイド鎖の部分配列が、前記ガイド鎖において３’末端の１塩基が欠失した配列、または、前記ガイド鎖において３’末端から連続する２〜１０塩基長が欠失した配列である。【0025】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、前記成熟ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３４ａである。【0026】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、前記Ｘ領域が、１２〜２４塩基長であり、前記Ｙ領域が、６〜１８塩基長である。【0027】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、全長が、１８〜４２塩基長である。【0028】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記人工ミミックｍｉＲＮＡを、細胞、組織または器官に投与する工程を含む。【0029】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記人工ミミックｍｉＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで投与する。【0030】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記人工ミミックｍｉＲＮＡを、非ヒト動物に投与する。【0031】
（１）人工ミミックｍｉＲＮＡ本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、前述のように、
Ｘ領域とＹ領域とが連結した一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域は、成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列またはその部分配列であり、前記Ｙ領域に対する連結側領域（ＸＢ）および非連結側領域（ＸＦ）からなり、
前記連結側領域（ＸＢ）は、その領域内で分子内アニーリングしない配列であり、
前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域の前記非連結側領域（ＸＦ）と、分子内アニーリングする配列であることを特徴とする。
【0032】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、標的遺伝子の発現を抑制できる。発現抑制とは、例えば、前記標的遺伝子の翻訳の抑制、すなわち、前記標的遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制を意味し、より詳細には、前記標的遺伝子のｍＲＮＡからの前記タンパク質の翻訳の抑制を意味する。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質があげられる。【0033】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、前述の構造をとることで、例えば、Ｄｉｃｅｒ非依存またはＡｇｏ非依存で、発現抑制を行うことができる。一般的に、多くの腫瘍細胞ではＤｉｃｅｒまたはＡｇｏの発現が低下しているため、Ｄｉｃｅｒ依存またはＡｇｏ依存の分子では発現抑制が困難であるが、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ非依存またはＡｇｏ非依存であることから、例えば、ＤｉｃｅｒまたはＡｇｏの発現が低下している腫瘍細胞においても有効に機能できる。また、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、一本鎖の核酸分子であるため、例えば、成熟ｍｉＲＮＡのように、二本の一本鎖をアニーリングする必要もなく、安価に製造できる。さらに、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、一本鎖の核酸分子であるため、例えば、自己免疫に関与するＴＬＲ３、ＲＩＧ-Ｉ、ＭＤＡ５に認識されることも回避できる。【0034】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡについて、前記Ｘ領域および前記Ｙ領域の配置関係の概略を、図１に示す。なお、図１は、概略であって、例えば、各領域の長さ、形状等は、制限されない。本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、図１（Ａ）に示すように、５’側に前記Ｘ領域が配置され、３’側に前記Ｙ領域が配置されてもよいし、図１（Ｂ）に示すように、５’側に前記Ｙ領域が配置され、３’側に前記Ｘ領域が配置されてもよく、好ましくは、前者である。前者の場合、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、５’側から、前記Ｘ領域における前記非連結側領域（ＸＦ）と前記連結側領域（ＸＢ）と、前記Ｙ領域とが、この順序で配置されている。後者の場合、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、５’側から、前記Ｙ領域と、前記Ｘ領域における前記連結側領域（ＸＢ）と前記非連結側領域（ＸＦ）とが、この順序で配置されている。【0035】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡにおいて、前記連結側領域（ＸＢ）は、その領域内で分子内アニーリングしない配列であり、前記連結側領域（ＸＢ）の一端に位置する前記Ｙ領域は、前記連結側領域（ＸＢ）の他端に位置する前記非連結側領域（ＸＦ）に分子内アニーリングする配列である。このため、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｘ領域の前記連結側領域（ＸＢ）は、例えば、前記Ｙ領域と前記非連結側領域（ＸＦ）との分子内アニーリングによって、ループを形成するともいえる。分子内アニーリングとは、例えば、自己アニーリングともいう。本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、前記分子内アニーリングした領域において、二本鎖が形成されるともいう。【0036】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、その５’末端と３’末端とが未連結である、線状一本鎖核酸分子ということもできる。本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、両末端の未結合の維持のため、５’末端が非リン酸基であることが好ましい。【0037】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｘ領域は、前述のように、成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列またはその部分配列である。成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列は、例えば、各種データベースに登録されている（例えば、http://www.mirbase.org/等）。したがって、例えば、これらの公知の成熟ｍｉＲＮＡの情報に基づいて、前記Ｘ領域を設定できる。前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖とは、RNA-induced silencing complex（ＲＩＳＣ）のArgonaute（Ａｇｏ）タンパク質に取り込まれ、ターゲットのｍＲＮＡに結合する鎖である。【0038】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡにおいて、各領域の長さは、特に制限されない。以下に、条件を例示するが、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、これらの記載には限定されない。また、本発明において、塩基の数値範囲は、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、例えば、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。【0039】
前記Ｘ領域における前記連結側領域（ＸＢ）の長さ（ＸＢ）は、下限が、例えば、０塩基長、２塩基長、４塩基長であり、上限が、例えば、１２塩基長、１０塩基長、８塩基長であり、範囲が、例えば、０〜１２塩基長、２〜１０塩基長、４〜８塩基長、６塩基長である。【0040】
前記Ｘ領域における前記非連結側領域（ＸＦ）の長さ（ＸＦ）は、下限が、例えば、６塩基長、１０塩基長、１４塩基長であり、上限が、例えば、２２塩基長、２０塩基長、１８塩基長であり、範囲が、例えば、６〜２２塩基長、１０〜２０塩基長、１４〜１８塩基長である。【0041】
前記非連結側領域（ＸＦ）は、例えば、前記Ｙ領域とアライメントした際に、前記Ｙ領域に対して、全塩基が相補的でもよいし、非相補的な塩基を有してもよい。後者の場合、前記非連結側領域（ＸＦ）は、例えば、１個または数個の塩基が、前記Ｙ領域に対して非相補的な塩基である。前記非相補的な塩基の個数は、下限が、例えば、０塩基、１塩基、２塩基であり、上限が、例えば、６塩基、５塩基、３塩基であり、範囲が、例えば、０〜６塩基、１〜５塩基、２〜３塩基である。また、前記非相補的な塩基は、前記非連結側領域（ＸＦ）において、例えば、連続的に位置してもよいし、非連続的に位置してもよい。【0042】
前記非連結側領域（ＸＦ）が前記Ｙ領域に対して非相補的な塩基を有する場合、前記非連結側領域（ＸＦ）と前記Ｙ領域とにおいて非相補的な組合せになるそれぞれの塩基を、ミスマッチ塩基ともいう。他方、前記非連結側領域（ＸＦ）と前記Ｙ領域とにおいて相補的な組合せになるそれぞれの塩基を、マッチ塩基ともいう。【0043】
前記非連結側領域（ＸＦ）において、前記ミスマッチ塩基の箇所は、特に制限されない。本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｘ領域が５’側に位置する場合、前記非連結側領域（ＸＦ）における前記ミスマッチ塩基の箇所は、例えば、５’末端塩基を１番目の塩基として、１番目、６番目である。前記非連結側領域（ＸＦ）における前記ミスマッチ塩基の個数は、特に制限されない。前記ミスマッチ塩基の個数が１個の場合、例えば、１番目または６番目であり、２個以上の場合、例えば、少なくとも１番目および６番目を含む。【0044】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡにおける前記ミスマッチ塩基の位置の概略を図２に示す。なお、図２は、概略であって、例えば、各領域の長さ等は、制限されない。図２は、前記Ｘ領域が５’側に位置する人工ミミックｍｉＲＮＡの例であり、前記Ｘ領域の前記非連結側領域（ＸＦ）において、５’末端塩基を１番目として、１番目および６番目にミスマッチ塩基を有する形態である。図２において、Ｎは、塩基を示し、丸で囲んだＮは、ミスマッチ塩基を示し、四角で囲んだＮは、線で結んだ塩基間で相補的なマッチ塩基を示す。【0045】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｘ領域の長さ（Ｘ）は、特に制限されず、下限が、例えば、１２塩基長、１６塩基長、１８塩基長であり、上限が、例えば、２４塩基長、２２塩基長、２０塩基長であり、範囲が、例えば、１２〜２４塩基長、１６〜２２塩基長、１８〜２０塩基長である。【0046】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｙ領域の長さ（Ｙ）は、特に制限されず、下限が、例えば、６塩基長、９塩基長、１２塩基長であり、上限が、例えば、１８塩基長、１６塩基長、１４塩基長であり、範囲が、例えば、６〜１８塩基長、９〜１６塩基長、１２〜１４塩基長である。【0047】
前記Ｙ領域は、例えば、前記Ｘ領域の前記非連結側領域（ＸＦ）と分子内アニーリングする配列を含んでもよいし、前記配列のみからなってもよい。前者の場合、前記Ｙ領域は、例えば、前記分子内アニーリングする配列の他、さらに、前記Ｘ領域と未連結の末端側に、オーバーハングを有してもよい。この場合、前記Ｙ領域は、前記分子アニーリングする配列と前記オーバーハングとからなる。ここで、前記Ｙ領域のオーバーハングとは、例えば、前記Ｙ領域と前記非連結側領域（ＸＦ）とをアライメントした場合に、前記Ｙ領域が前記非連結側領域（ＸＦ）よりも過剰に有する末端の塩基である。オーバーハングの長さ（Ｏ）は、例えば、下記式で表すことができる。 オーバーハングの長さ（Ｏ）＝［Ｙ領域の全長の塩基数（Ｙ）］−［非連結側領域（ＸＦ）の塩基数（ＸＦ）］Ｏ＝Ｙ−ＸＦ
Ｏ：オーバーハングの長さ
Ｙ：Ｙ領域の全長の塩基数（Ｙ）
ＸＦ：非連結側領域（ＸＦ）の塩基数（ＸＦ）
【0048】
前記オーバーハングの長さ（Ｏ）は、特に制限されず、下限が、例えば、０塩基長、１塩基長であり、上限が、例えば、４塩基長、３塩基長であり、範囲が、例えば、０〜４塩基長、１〜３塩基長、２塩基長である。【0049】
前記オーバーハングの配列は、特に制限されず、例えば、３’側から、ＵＵ、ＣＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＡＡ、ＣＣ、ＵＧ、ＣＧ、ＡＵ、ＴＴ等が例示できる。前記オーバーハングは、例えば、ＴＴとすることで、ＲＮＡ分解酵素に対する耐性を付加できる。【0050】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｘ領域の非連結側領域（ＸＦ）と前記Ｙ領域とをアライメントした場合、両者の長さの差（Ｙ−ＸＦまたはＸＦ−Ｙ）は、特に制限されない。前記差は、下限が、例えば、０塩基長、２塩基長、３塩基長であり、上限が、例えば、１５塩基長、１０塩基長、５塩基長であり、範囲が、例えば、０〜１５塩基長、２〜１０塩基長、３〜５塩基長である。前記Ｙ領域は、例えば、前記オーバーハングを有する場合、前記非連結側領域（ＸＦ）よりも長い。【0051】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡにおいて、前記成熟ｍｉＲＮＡ由来の配列は、例えば、前記ガイド配列の全長でもよいし、前記ガイド配列の部分配列でもよい。前記ガイド鎖の部分配列は、例えば、前記ガイド鎖（全長）において３’末端側の塩基が欠失した塩基であり、具体例として、前記ガイド鎖において３’末端側の１個または数個の塩基が欠失した配列である。前記ガイド鎖全長から欠失した塩基の数は、特に制限されず、下限が、例えば、１塩基、２塩基、３塩基であり、上限が、例えば、１０塩基、７塩基、６塩基、５塩基であり、範囲が、例えば、１〜７塩基、２〜６塩基、３〜５塩基である。前記ガイド鎖の部分配列は、前記ガイド鎖において、３’末端の塩基（１個の塩基）が欠失した配列でもよいし、３’末端から連続する塩基が欠失した配列でもよく、後者の場合、例えば、前記ガイド鎖において３’末端から連続する塩基長（例えば、２〜１０塩基長）が欠失した配列である。【0052】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡの全長（Ｔ）は、特に制限されず、下限が、例えば、１８塩基長、２３塩基長、２８塩基長であり、上限が、例えば、４２塩基長、３８塩基長、３４塩基長であり、範囲が、例えば、１８〜４２塩基長、２３〜３８塩基長、２８〜３４塩基長である。【0053】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡにおいて、前記成熟ｍｉＲＮＡの種類は、特に制限されず、標的とする遺伝子の種類に応じて、適宜選択できる。【0054】
前記成熟ｍｉＲＮＡとしては、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（配列番号１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ（配列番号５）等の成熟ｍｉＲＮＡがあげられる。【0055】
ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（配列番号１）UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２）
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号３）
UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU
ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号４）
UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG
ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ（配列番号５）
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
【0056】
ｍｉＲ−３４ａのガイド鎖は、例えば、ＡＸＬ、ＭＥＴ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＳＩＲＴ１、ＣＣＮＤ１、ＳＩＲＴ１、ＢＣＬ−２等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、乳がん等の疾患を予防または治療できる。【0057】
ｌｅｔ−７ａのガイド鎖は、例えば、ＨＭＧＡ２（high mobility group AT-hook 2）、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、ＴＬＲ４等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、乳がん等の疾患を予防または治療できる。【0058】
ｌｅｔ−７fのガイド鎖は、例えば、ＨＭＧＡ２（high mobility group AT-hook 2）、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、ＴＬＲ４等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、乳がん等の疾患を予防または治療できる。【0059】
ｍｉＲ−１５０のガイド鎖は、例えば、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ４、ＳＭＡＤ２、ＳＰ１等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、肺線維症、肝線維症等の疾患を予防または治療できる。【0060】
ｍｉＲ−２９ｂのガイド鎖は、例えば、ＣＯＬ１Ａ１、ＭＣＬ１，ＤＮＭＴ３Ａ，ＤＮＭＴ３Ｂ，ＴＣＬ１Ａ，ＴＧＦｂ３等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、乳がん、肺線維症、肝線維症等の疾患を予防または治療できる。【0061】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡの構成単位は、特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡにおいて、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基があげられる。本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。【0062】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡが、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１個もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基であってもよい。本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡが、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個である。【0063】
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびＵ（ウラシル）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。【0064】
前記非修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、具体的には、例えば、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。【0065】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。【0066】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。前記代替物は、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等があげられる。【0067】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。【0068】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓがあげられる。【0069】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、前述のように、前記標的遺伝子の発現抑制ができる。このため、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡが、例えば、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖またはその部分配列を有する場合、例えば、前記標的遺伝子の発現抑制により、前記疾患を治療できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。前記疾患は、特に制限されず、例えば、目的の疾患に応じて前記発現抑制配列を適宜設定できる。前記疾患としては、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、大腸がん、肝がん、膵がん、食道がん、前立腺がん、胆嚢がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、骨肉腫、白血病等のがん、肺線維症、肝線維症等の疾患があげられる。【0070】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡの使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記人工ミミックｍｉＲＮＡを投与すればよい。【0071】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。【0072】
本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定できる。そして、前述のように、前記標的遺伝子の種類に応じて、前記成熟ｍｉＲＮＡを選択すればよい。【0073】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡの使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を参照できる。【0074】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬、、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。【0075】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡの合成方法は、特に制限されず、従来公知の核酸の製造方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイトおよびＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。【0076】
（２）組成物本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡを含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
【0077】
本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。【0078】
また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。本発明の薬学的組成物は、前記本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。【0079】
本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。【0080】
本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、遺伝子の発現が原因となる疾患があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子に応じて、前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖またはその部分配列を選択すればよい。【0081】
本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物（以下、組成物という）は、その使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記人工ミミックｍｉＲＮＡを投与すればよい。【0082】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。【0083】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。【0084】
本発明の組成物は、例えば、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡのみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。【0085】
本発明の組成物において、前記人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体形成により、例えば、前記人工ミミックｍｉＲＮＡを効率よくデリバリーすることができる。【0086】
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。【0087】
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤、賦形剤等があげられる。【0088】
（３）発現抑制方法本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡを使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡを使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【0089】
本発明の発現抑制方法において、前記遺伝子の発現抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、成熟ｍｉＲＮＡによる発現抑制があげられる。【0090】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記人工ミミックｍｉＲＮＡを投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記人工ミミックｍｉＲＮＡを接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。【0091】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記人工ミミックｍｉＲＮＡを単独で投与してもよいし、前記人工ミミックｍｉＲＮＡを含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。【0092】
（４）治療方法本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡを、患者に投与する工程を含み、前記人工ミミックｍｉＲＮＡにおける前記ガイド鎖またはその部分配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖またはその部分配列であることを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡを使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【0093】
本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法等を援用できる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与のいずれでもよい。【0094】
（５）人工ミミックｍｉＲＮＡの使用本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡの使用である。
【0095】
本発明の核酸分子は、疾患の治療に使用するための核酸分子であって、前記核酸分子は、前記本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡであり、前記人工ミミックｍｉＲＮＡにおける前記ガイド鎖またはその部分配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖またはその部分配列であることを特徴とする。【0096】
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【実施例】
【0097】
（実施例１）成熟ｍｉＲ−３４ａのガイド鎖に基づいて、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡを合成し、ＡＸＬおよびＭＥＴの発現抑制を確認した。
【0098】
（１）核酸サンプルの合成ポジティブコントロールのｍｉＲＮＡとして、以下に示すガイド鎖（配列番号１）およびパッセンジャー鎖（配列番号６）からなるヒト成熟ｍｉＲ−３４ａを合成した。
また、ネガティブコントロールとして、前記成熟ｍｉＲ−３４ａにおける前記ガイド鎖の塩基組成をスクランブルにしたガイド鎖スクランブル（配列番号７）およびそれに対応するパッセンジャー鎖（配列番号８）とからなる成熟ｍｉＲ−３４ａスクランブルを合成した。
【0099】
そして、実施例の人工ミミックｍｉＲＮＡとして、成熟ｍｉＲ−３４ａのガイド鎖（配列番号１）を有するガイドヘアピンＲＮＡ（以下、「ｇｈＲ」ともいう）を合成した。具体的には、ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ２２／Ｐ１８）（配列番号９）を合成した。ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ２２／Ｐ１８）の下記配列において、下線部が、前記ガイド鎖に対応する。また、実施例の人工ミミックｍｉＲＮＡに対するネガティブコントロールとして、前記ガイド鎖の塩基組成をスクランブルにしたｇｈＲ−３４ａスクランブル（配列番号１０）を合成した。ｇｈＲ−３４ａスクランブルの下記配列において、下線部が、成熟ｍｉＲ−３４ａスクランブルのガイド鎖に対応する。これらのｍｉＲＮＡの概略を、以下に示す。【0100】
成熟ｍｉＲ−３４ａガイド鎖（配列番号１）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’
パッセンジャー鎖（配列番号６）
5’-CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU-3’
成熟ｍｉＲ−３４ａスクランブル
ガイド鎖（配列番号７）
5’-UGUAUCGUUAUCGGGUCGGUUG-3’
パッセンジャー鎖（配列番号８）
5’-CAACCGACCCGAUAACGAUACA-3’
ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ２２／Ｐ１８）（配列番号９）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUAGCUAAGACAAUGCCCUC-3’
ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ２２／Ｐ１８）スクランブル（配列番号１０）
5’-UGUAUCGUUAUCGGGUCGGUUGACCCGAUAACGGUACCUC-3’
【0101】
【化1】
【0102】
（２） ｍＲＮＡの検出前記ｍｉＲＮＡを、ヒト非小細胞性肺がん細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１２９９）に導入し、ヒト成熟ｍｉＲ−３４ａがターゲットとするＡＸＬ ｍＲＮＡ、ＭＥＴ ｍＲＮＡおよびＣＤＫ６ ｍＲＮＡの検出を行った。
【0103】
前記ｍｉＲＮＡを、注射用蒸留水（大塚製薬、以下同様）で溶解し、１００μｍｏｌ／ＬのｍｉＲＮＡ溶液を調製した。ＡＸＬおよびＭＥＴ ｍＲＮＡの検出には、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞（ＡＴＣＣ社）を使用した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。【0104】
まず、細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、５００μＬずつ、１×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、前記ｍｉＲＮＡをトランスフェクション試薬ＲＮＡｉ ＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用い、添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。トランスフェクションは、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定した。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、（Ｃ）は、前記ＲＮＡ溶液であり、両者をあわせて４９μＬ添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記ｍｉＲＮＡの最終濃度は、５ｎｍｏｌ／Ｌ、５０ｎｍｏｌ／Ｌとした。トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を２日間培養した。【0105】
【表1】
【0106】
そして、得られた培養細胞について、ＩＳＯＧＥＮ ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、ニッポンジーン）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。【0107】
次に、逆転写酵素（商品名Ｍ−ＭＬＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲを行い、ＡＸＬ ｃＤＮＡの量およびＭＥＴ ｃＤＮＡの量を測定した。また、ＡＸＬ ｍＲＮＡおよびＣＤＫ６ ｍＲＮＡは、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを内部コントロールとし、そのｃＤＮＡの量をあわせて測定した。ＭＥＬ ｍＲＮＡは、β−アクチン ｍＲＮＡを内部コントロールとし、そのｃＤＮＡの量をあわせて測定した。【0108】
前記定量ＰＣＲは、試薬として、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、サーモサイクラーとしてＭＸ３０００Ｐ（商品名、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、解析機器としてＭｘＰｒｏ（商品名、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた（以下、同様）。前記ＡＸＬ ｃＤＮＡ、ＣＤＫ６ ｃＤＮＡおよびＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡ、前記ＭＥＴ ｃＤＮＡおよびβ−アクチン ｃＤＮＡの増幅には、それぞれ、下記プライマーセットを使用した。反応液の全量は２５μＬとして、それぞれ３回測定した。【0109】
AXL プライマーセット5’-CTCAACCAGGACGACTCCAT-3’ （配列番号１１）
5’-AGACCGCTTCACTCAGGAAA-3’ （配列番号１２）
CDK6 プライマーセット
5’-AAGTTCCAGAGCCTGGAGTG-3’ （配列番号１３）
5’-CGATGCACTACTCGGTGTGA-3’ （配列番号１４）
GAPDH プライマーセット
5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’ （配列番号１５）
5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’ （配列番号１６）
MET プライマーセット
5’-CAGGCAGTGCAGCATGTAGT-3’ （配列番号１７）
5’-TGTCCAACAAAGTCCCATGA-3’ （配列番号１８）
β−アクチン プライマーセット
5’-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3’ （配列番号１９）
5’-TGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3’ （配列番号２０）
【0110】
コントロールとして、前記ｍｉＲＮＡ未添加の細胞についても、同様の処理および測定を行った（ｍｏｃｋ）。また、ネガティブコントロールは、前記成熟ｍｉＲ−３４ａスクランブルおよび前記ｇｈＲ−３４ａスクランブルを使用した。【0111】
そして、ｍｉＲＮＡ未添加のコントール（ｍｏｃｋ）におけるＡＸＬ ｍＲＮＡまたはＭＥＴ ｍＲＮＡを１とした場合における、各トランスフェクション細胞でのＡＸＬ ｍＲＮＡ、ＭＥＴ ｍＲＮＡおよびＣＤＫ６ ｍＲＮＡの相対値を算出した。これらの結果を、図３、図４および図５に示す。図３は、ＡＸＬ ｍＲＮＡの結果、図４は、ＭＥＴ ｍＲＮＡの結果、図５は、ＣＤＫ６ ｍＲＮＡの結果であり、図３、図４および図５において、左のバーは、トランスフェクション時のｍｉＲＮＡの終濃度が５ｎｍｏｌ／Ｌの結果を示し、右のバーは、トランスフェクション時のｍｉＲＮＡの終濃度が５０ｎｍｏｌ／Ｌの結果を示す。【0112】
図３、図４および図５に示すように、実施例の人工ミミックｍｉＲＮＡであるｇｈＲ−３４ａ（Ｇ２２／Ｐ１８）を使用した場合、ＡＸＬ ｍＲＮＡの量、ＭＥＴ ｍＲＮＡの量およびＣＤＫ６ ｍＲＮＡの量は、いずれも、コントロールよりも減少し、成熟ｍｉＲ−３４ａと同等の結果を示した。このため、実施例の人工ミミックｍｉＲＮＡにより、ＡＸＬ ｍＲＮＡ、ＭＥＴ ｍＲＮＡおよびＣＤＫ６ ｍＲＮＡがそれぞれコードするタンパク質の転写も、抑制されているといえる。【0113】
さらに、実施例のｇｈＲ−３４ａ（Ｇ２２／Ｐ１８）は、二本鎖の成熟ｍｉＲＮＡ−３４ａとは異なり、一本鎖の核酸分子であるため、使用時に各一本鎖をアニーリングする必要がなく、また、自然免疫に関与するＴＬＲ３等に認識されることも回避できる。また、実施例のｇｈＲ−３４ａ（Ｇ２２／Ｐ１８）は、トータルの塩基数が、成熟ｍｉＲＮＡ−３４ａのトータル塩基数４４塩基よりも少ない４０塩基であるため、安価な合成が可能である。さらに、ＴＬＲ３等による認識を避けるために、生体に、一本鎖のステムループ構造であるｍｉＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を投与し、生体内で成熟ｍｉＲＮＡ−３４ａを生成させることも考えられる。しかし、ｍｉＲＮＡ−３４ａのＰｒｅ−ｍｉＲＮＡは、７２塩基長であり、非常に長いのに対して、実施例のｇｈＲ−３４ａ（Ｇ２２／Ｐ１８）は、前述のように４０塩基長と短いため、ＴＬＲ３以外の各種ＴＬＲにも認識され難い。このため、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡによれば、投与によるＴＬＲの影響も回避できる。【0114】
（実施例２）実施例１の人工ミミックｍｉＲＮＡであるｇｈＲ−３４ａ（Ｇ２２／Ｐ１８）について、ガイド鎖の３’末端側を欠失させ、ＡＸＬおよびＭＥＴの発現抑制を確認した。
【0115】
実施例１の人工ミミックｍｉＲＮＡであるｇｈＲ−３４ａ（Ｇ２２／Ｐ１８）（配列番号９）を基準として、ガイド鎖の３’末端を欠失させた小型化人工ミミックｍｉＲＮＡを合成した。下記配列において、下線部がガイド鎖に対応する。これらのｍｉＲＮＡの概略を、以下に示す。【0116】
ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ２２／Ｐ１８）（配列番号９）5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUAGCUAAGACAAUGCCCUC-3’
ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ２１／Ｐ１７）（配列番号２１）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGGCUAAGACAAUGCCCUC-3’
ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ２０／Ｐ１６）（配列番号２２）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUCUAAGACAAUGCCCUC-3’
ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１９／Ｐ１５）（配列番号２３）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUAAGACAAUGCCCUC-3’
ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１８／Ｐ１４）（配列番号２４）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGAAGACAAUGCCCUC-3’
ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）（配列番号２５）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGAGACAAUGCCCUC-3’
【0117】
【化2】
【0118】
前記ｍｉＲＮＡを使用する以外は、前記実施例１と同様にして、ヒト成熟ｍｉＲ−３４ａがターゲットとするＡＸＬ ｍＲＮＡおよびＭＥＴ ｍＲＮＡの検出を行った。なお、トランスフェクション時のｍｉＲＮＡの終濃度は、２５ｎｍｏｌ／Ｌとした。ネガティブコントロールは、前記実施例１におけるｇｈＲ−３４ａスクランブル（配列番号１０）とした。これらの結果を、図６および図７に示す。図６は、ＡＸＬ ｍＲＮＡの結果、図７は、ＭＥＴ ｍＲＮＡの結果である。【0119】
図６および図７に示すように、ガイド鎖の３’末端をさらに欠失させた小型化人工ミミックｍｉＲＮＡによっても、同様の結果が得られた。核酸分子を生体に投与した場合、その長さが短い程、自己免疫に関与するＴＬＲが認識し難く、例えば、自己免疫による炎症性サイトカイン等の産生を抑制できる。前記小型化人工ミミックｍｉＲＮＡは、全長が３８塩基長以下であり、ｍｉＲＮＡ−３４ａのＰｒｅ−ｍｉＲＮＡ（７２塩基長）と比較しても、格段に短い核酸分子である。このため、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡによれば、二本鎖を認識するＴＬＲ３等だけでなく、その他のＴＬＲの影響も回避できる。【0120】
（実施例３）実施例１の人工ミミックｍｉＲＮＡであるｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）（配列番号２５）の改変を行い、ＡＸＬの発現抑制を確認した。
【0121】
以下に、実施例１の人工ミミックｍｉＲＮＡであるｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）、および、これに基づいて改変した人工ミミックｍｉＲＮＡの概略を示す。G17/P13は、５’末端を１番目の塩基とした際、１番目と６番目にミスマッチ塩基を有し、３’末端に２塩基長のオーバーハングを有する人工ミミックｍｉＲＮＡである。そこで、改変した人工ミミックｍｉＲＮＡとして、２塩基長のオーバーハングをｄＴｄＴに変更したG17/P13 dTdT、６番目の塩基に対応する塩基をマッチ塩基に変更したG17/P13 Match1、２塩基長のオーバーハングをｄＴｄＴに変更し、６番目の塩基に対応する塩基をマッチ塩基に変更したG17/P13 dTdT Match1、１番目および６番目の塩基に対応する塩基をマッチ塩基に変更したG17/P13 Match2、１番目および６番目の塩基に対応する塩基をマッチ塩基に変更し、２塩基長のオーバーハングをｄＴｄＴに変更したG17/P13 dTdT Match2を合成した。下記配列において、下線部がガイド鎖の配列であり、配列内部における四角で囲んだ部分が、マッチ塩基であり、配列の３’末端における四角で囲んだ部分が、dTdTに変更したオーバーハングである。【0122】
【化3】
【0123】
【化4】
【0124】
前記ｍｉＲＮＡを使用する以外は、前記実施例１と同様にして、ヒト成熟ｍｉＲ−３４ａがターゲットとするＡＸＬ ｍＲＮＡの検出を行った。なお、トランスフェクション時のｍｉＲＮＡの終濃度は、２５ｎｍｏｌ／Ｌとした。ネガティブコントロールは、前記実施例１におけるｇｈＲ−３４ａスクランブル（配列番号１０）とした。【0125】
これらの結果を、図８に示す。図８は、ＡＸＬ ｍＲＮＡの結果である。図８に示すように、２塩基長のオーバーハングをｄＴｄＴに変更した場合、６番目の塩基に対応する塩基をマッチ塩基に変更してミスマッチを一カ所とした場合、１番目および６番目の塩基に対応する塩基をマッチ塩基に変更してミスマッチをなくした場合、これらの組合せの場合のいずれにおいても、ＡＸＬ ｍＲＮＡの量が減少し、G17/P13と同様の結果を示した。【0126】
（実施例４）成熟ｈｓａ ｌｅｔ−7ａ−１のガイド鎖について、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡを合成し、ＨＭＧＡ２の発現抑制を確認した。
【0127】
（１）ｍｉＲＮＡの合成ポジティブコントロールのｍｉＲＮＡとして、以下に示すガイド鎖（配列番号２）およびパッセンジャー鎖（配列番号３１）からなるヒト成熟ｌｅｔ−７ａ−１を合成した。また、ネガティブコントロールとして、データベース上、どのｍＲＮＡも標的としない配列（ノン−ターゲット）を合成した。そして、実施例の人工ミミックｍｉＲＮＡとして、成熟ｌｅｔ−７ａ−１のガイド鎖（配列番号２）を有するｇｈＲ−ｌｅｔ−７ａ G18/P14（配列番号３４）を合成した。ｇｈＲ−ｌｅｔ−７ａ G18/P14の下記配列において、下線部が、前記ガイド鎖の部分配列に対応する。これらのｍｉＲＮＡの概略を、以下に示す。
【0128】
成熟hsa-let-7a-1ガイド鎖（配列番号２）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’
パッセンジャー鎖（配列番号３１）
5’-CUAUACAAUCUACUGUCUUUC-3’
ノン−ターゲット コントロール
ガイド鎖（配列番号３２）
5’-UACUAUUCGACACGCGAAGTT-3’
パッセンジャー鎖（配列番号３３）
5’-CUUCGCGUGUCGAAUAGUATT-3’
ghR-let-7a G18/P14（配列番号３４）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUCCUACUACCUCCUC-3’
【0129】
【化5】
【0130】
（２） ｍＲＮＡの検出前記ｍｉＲＮＡを、ヒト肺がん細胞株Ａ５４９細胞株（ＡＴＣＣ社）に導入し、下記プライマーセットを使用した以外は、前記実施例１と同様にして、ヒト成熟ｌｅｔ−７ａがターゲットとするＨＭＧＡ２ ｍＲＮＡの検出を行った。なお、トランスフェクション時のｍｉＲＮＡの終濃度は、２５ｎｍｏｌ／Ｌとした。前記ノン−ターゲットは、ＲＮＡデータベース解析からヒトのＲＮＡに最も結合する可能性が低い、もしくはオフターゲット効果の最も低いと予測される配列とした。
【0131】
HMGA2 プライマーセット5’-GAAGCCACTGGAGAAAAACG-3’ （配列番号３５）
5’-CTTCGGCAGACTCTTGTGAG-3’ （配列番号３６）
【0132】
これらの結果を、図９に示す。図９は、ＨＭＧＡ２ ｍＲＮＡの結果である。図９に示すように、実施例の人工ミミックｍｉＲＮＡ ｇｈＲ−ｌｅｔ−7ａ G18/P14を使用した場合、ＨＭＧＡ２ ｍＲＮＡの量は、成熟ｌｅｔ−７ａと同等の結果を示した。【0133】
（実施例５）実施例１で作製したｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）（配列番号２５）をヒト非小細胞性肺がん細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１２９９）に導入して、ＡＸＬの発現抑制および細胞増殖の抑制を確認した。なお、ポジティブコントロールのｍｉＲＮＡとして、実施例１で合成したヒト成熟ｍｉＲ−３４ａを使用した。
【0134】
前記実施例１と同様の方法により、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞の培養、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）または前記ｍｉＲ―３４ａのトランスフェクション、トランスフェクション後の培養を行った。そして、トランスフェクションした日を０日とし、さらに培養を行った。なお、トランスフェクションから１日目には、細胞をＰＢＳで洗浄し、引き続き、同様にして培養を行った。前記実施例１と同様にして、トランスフェクションから所定日数（１、２、３、４、５日）後のＡＸＬ ｍＲＮＡの発現量を測定し、ＡＸＬ ｍＲＮＡの発現量の相対値を求めた。また、トランスフェクションから４日後の細胞数を確認した。なお、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）および前記ｍｉＲ−３４ａのそれぞれについて、コントロールとして、スクランブル配列に変更した前記実施例１と同じ前記ｇｈＲ３４ａスクランブルおよび前記成熟ｍｉＲ−４３ａスクランブルを使用し、同様に処理して、発現量を測定した。これらの結果を、図１０および図１１に示す。【0135】
図１０は、ＡＸＬ ｍＲＮＡの結果を示すグラフであり、縦軸が発現量の相対値を示し、横軸が日数を示す。図１０に示すように、ｍｉＲＮＡ未添加のコントールと比較して、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）は、ポジティブコントロールの前記ｍｉＲ−３４ａと同様に、トランスフェクションから５日後においても発現抑制能が確認できた。【0136】
図１１は、発現細胞数（×１０４個）を示すグラフである。図１１に示すように、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）をトランスフェクションした結果、前記ｍｉＲ−３４ａをトランスフェクションした場合と同程度にまで、細胞増殖を抑制できた。【0137】
（実施例６）実施例２で作製したｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）（配列番号２５）をヒト末梢血の単球に導入して、炎症性サイトカインの誘導を確認した。なお、ポジティブコントロールのｍｉＲＮＡとして、実施例１で合成したヒト成熟ｍｉＲ−３４ａを使用した。
【0138】
ヒト末梢血から単離した単球に、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）または前記ｍｉＲ−３４ａのトランスフェクション、トランスフェクション後の培養を行った。培養の条件は、２ｘ１０５ cells/well/96 well plateとし、トランスフェクションの条件は、Lipofectamin RNAiMAx transfection reagent 0.6μl/well/200μlとした。そして、トランスフェクションから２４時間後、培養した細胞からＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲによりサイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦα）のｍＲＮＡの発現量を測定した。また、前記２４時間後の培養上清を用いて、ＥＬＩＳＡ法によりサイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦα）のタンパク質発現量を測定した。また、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）について、コントロールとして、スクランブル配列に変更した下記ｇｈＲ３４ａスクランブル（Ｇ１７／Ｐ１３）を使用し、同様に処理して、発現量を測定した。前記ｍｉＲ−３４ａについて、コントロールとして、スクランブル配列に変更した前記成熟ｍｉＲ−４３ａスクランブルを使用し、同様に処理して、発現量を測定した。また、未処理の単球（Ｎｏｒｍａｌ）、および、ｍｉＲＮＡ未添加の細胞（ｍｏｃｋ）についても、同様に測定した。ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）スクランブル（配列番号３７）
5’-UGUAUCGUUAUCGGGUCAUAACGAUACCUU-3’
【0139】
そして、前記成熟ｍｉＲ−３４ａスクランブルの導入細胞の発現量を１とした場合における、各種細胞でのサイトカインｍＲＮＡの発現量の相対値を算出した。これらの結果を、図１２（Ａ）に示した。また、サイトカイン濃度の絶対量を（Ｂ）に示す。【0140】
図１２（Ａ）は、サイトカインのｍＲＮＡ発現量の相対値を示すグラフであり、図１２（Ｂ）は、サイトカインのタンパク質発現量の相対値を示すグラフである。図１２（Ａ）および（Ｂ）に示すように、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）を使用した場合、各サイトカインは、ｍＲＮＡおよびタンパク質のいずれについても、前記ｍｉＲ−３４ａよりも発現が著しく抑制された。これらの結果から、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡよりも、炎症性サイトカインを誘導しにくい核酸であることがわかった。【0141】
（実施例７）実施例２で作製したｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）（配列番号２５）について、成熟ｍｉ−Ｒ３４ａのパッセンジャー鎖と同様の副作用が生じるか否かを確認した。
【0142】
前記実施例１で示したように、成熟ｍｉ−Ｒ３４ａは、ガイド鎖とパッセンジャー鎖とからなる二本鎖であり、前記ガイド鎖は、ＡＸＬ ｍＲＮＡをターゲットｍＲＮＡとする。他方、成熟ｍｉ−Ｒ３４ａの前記パッセンジャー鎖（ｍｉＲ−３４ａ−３Ｐ）も、それに相補的なｍＲＮＡ（具体的には、ＣＡＢ３９ ｍＲＮＡ）に結合して、遺伝子発現抑制の働きを示す。しかし、前記パッセンジャー鎖による発現抑制は、望まない発現抑制であり、副作用と考えられる。そこで、前記成熟ｍｉ−Ｒ３４ａの前記パッセンジャー鎖による副作用、つまり、ＣＡＢ３９ ｍＲＮＡの発現抑制が、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）によっても生じるかを確認した。【0143】
前記実施例１と同様の方法により、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞の培養、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）または前記ヒト成熟ｍｉＲ−３４ａのトランスフェクション、トランスフェクション後の培養を行った。そして、前記実施例１と同様にして、トランスフェクションから２日後のＲＮＡを抽出し、ＣＡＢ３９ ｍＲＮＡの発現量を測定し、未処理細胞（Ｎｏｒｍａｌ）の発現量を１として、発現量の相対値を求めた。また、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）および前記ｍｉＲ−３４ａのそれぞれについて、スクランブル配列に変更した前記実施例６と同じ前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）スクランブルおよび前記実施例１と同じ前記成熟ｍｉＲ−４３ａスクランブルを使用し、同様に処理して、発現量の相対値を求めた。これらの結果を、図１３に示す。【0144】
図１３は、ＣＡＢ３９ ｍＲＮＡの発現量の相対値を示すグラフである。図１３に示すように、前記ｍｉＲ−３４ａを使用した場合、ＣＡＢ３９ ｍＲＮＡの発現抑制が確認されたが、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）を使用した場合、ＣＡＢ３９ ｍＲＮＡの発現抑制、つまり副作用はほとんどみられなかった。【0145】
また、前記抽出したＲＮＡについて、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商品名ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて、ｍＲＮＡの網羅的解析を行った。そして、前記成熟ｍｉ−３４ａの導入により発現が低下する遺伝子として、ベーススケールシグナルが１０００以上であり、且つ、発現が１／２に低下した１１５遺伝子を選択し、これらのうちで、前記パッセンジャー鎖のターゲット遺伝子としてｍｉＲＤＢ（ｍｉＲＮＡデータベース）アルゴリズムにより予測される１４遺伝子について、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）により発現抑制の有無を確認した。これらの結果を図１４に示す。【0146】
図１４は、トランスフェクションしたｍｉＲＮＡにより発現が抑制された遺伝子の有無を示すグラフであり、縦軸は、シグナル比（ｌｏｇ２）を示す。図１４に示すように、前記成熟ｍｉＲＮＡの導入により前記パッセンジャー鎖で発現抑制される１４遺伝子のうち、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）により発現抑制されるものはなかった。【0147】
（実施例８）実施例２で作製したｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）（配列番号２５）を、ＤＩＣＥＲ１欠損またはＡＧＯ２欠損の肺癌細胞株に導入し、ＤＩＣＥＲ非依存的またはＡＧＯ非依存的にＡＸＬ ｍＲＮＡの発現を抑制できるか確認した。
【0148】
ヒトの体内における生体由来のｍｉＲＮＡは、ヘアピン構造をとっており、これが、生体内において、ＤｉｃｅｒおよびＡｇｏで切断され、前述のような二本鎖の成熟型ｍｉＲＮＡとなり、遺伝子の発現抑制に関与する。このため、遺伝子の発現抑制について、生体由来のｍｉＲＮＡはＤｉｃｅｒ依存性およびＡｇｏ依存性であるといえる。そこで、本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡについて、ＤＩＣＥＲ非依存的またはＡＧＯ非依存的に遺伝子発現を抑制できるかを確認した。【0149】
（１）ＤＩＣＥＲ非依存性の確認ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、Ｈ１２９９から、ＤＩＣＥＲ１を欠損する肺癌細胞株を作成した。図１５に、ヒトＤｉｃｅｒ１ ｍＲＮＡにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ガイド鎖のハイブリダイゼーションの位置を示す。得られら２株（＃１、＃２）について、ＤＩＣＥＲ１のタンパク質発現をウェスタンブロットにより確認したところ、発現は見られず、また、内在性ｍｉＲＮＡであるｌｅｔ−7ａ、ｍｉＲ−18ａの発現も著しく減少した。前者の結果から、ＤＩＣＥＲ１がタンパク質レベルで欠損していること、後者の結果から、ＤＩＣＥＲ１が機能的に欠損していることが確認できた。
【0150】
ＤＩＣＥＲ１欠損細胞株（＃１、＃２）を使用した以外は、前記実施例１と同様の方法により、前記細胞株の培養、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）（配列番号２５）のトランスフェクション、トランスフェクション後の培養を行った。そして、前記実施例１と同様にして、トランスフェクションから２日後のＡＸＬ ｍＲＮＡの発現量を測定した。そして、未処理細胞（Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔ）の発現量を１とし、ＡＸＬ ｍＲＮＡの発現量の相対値を求めた。また、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）について、スクランブル配列に変更した前記実施例６と同じ前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）スクランブルを使用し、同様に処理して、発現量の相対値を求めた。これらの結果を、図１６に示す。【0151】
図１６は、ＡＸＬ ｍＲＮＡの結果を示すグラフであり、縦軸が発現量の相対値を示す。図１６に示すように、未処理細胞との比較により、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）は、ＤＩＣＥＲ１欠損細胞株においても、ＡＸＬ ｍＲＮＡの発現を抑制できることがわかった。つまり、本発明によれば、ＤＩＣＥＲ１非依存的に、ｍＲＮＡの発現を抑制できることがわかった。【0152】
（２）ＡＧＯ２非依存性の確認ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、Ｈ１２９９から、ＡＧＯ２を欠損する肺癌細胞株を作成した。図１７に、ヒトＡＧＯ２ ｍＲＮＡにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ガイド鎖のハイブリダイゼーションの位置を示す。得られた２株（＃１、＃２）について、ＡＧＯ２のタンパク質発現をウェスタンブロットにより確認したところ、発現は見られなかった。また、ＧＡＰＤＨに対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションして、ＧＡＰＤＨの発現を確認したところ、前記ｓｉＲＮＡのＧＡＰＤＨ発現抑制活性が著しく低下した。前者の結果から、ＡＧＯ２がタンパク質レベルで欠損していること、後者の結果から、ＡＧＯ２が機能的に欠損していることが確認できた。
【0153】
ＡＧＯ２欠損細胞株（＃１、＃２）を使用した以外は、前記実施例１と同様の方法により、前記細胞株の培養、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）または前記実施例１と同じ前記ｇｈＲ−３４ａスクランブルのトランスフェクション、トランスフェクション後の培養を行った。そして、前記実施例１と同様にして、トランスフェクションから２日後のＡＸＬ ｍＲＮＡの発現量を測定した。そして、Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔの発現量を１とし、ＡＸＬ ｍＲＮＡの発現量の相対値を求めた。これらの結果を、図１８に示す。【0154】
図１８は、ＡＸＬ ｍＲＮＡの結果を示すグラフであり、縦軸が発現量の相対値を示す。図１８に示すように、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）は、Ｈ１２９９細胞だけでなく、ＡＧＯ２欠損細胞株においても、ＡＸＬ ｍＲＮＡの発現を抑制できることがわかった。つまり、本発明によれば、ＤＩＣＥＲ１だけでなくＡＧＯ２非依存的に、ｍＲＮＡの発現を抑制できることがわかった。【0155】
（実施例９）実施例１で作製したｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）（配列番号２５）を、肺がんモデルマウスに導入し、治療効果を確認した。
【0156】
肺がんモデルマウスとして、活性化型ＫＲＡＳノックインマウス（johnson et al., Nature vol 410, p.1111, 26 April 2001参照）を使用した。６週齢のマウス（１投与群あたり８匹）に、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）（配列番号２５）またはまたは前記実施例６と同じ前記ｇｈＲ３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）スクランブルを、０．５ｍｇ／ｋｇ 体重の投与量、４日間隔，計７回の条件で、マウス用噴霧器を用いて、気管投与した。投与のキャリアーには、キトサンを用いた。そして、投与開始から２１日目、肺の重量の測定、肺全体積における腫瘍の体積割合、肺表面の腫瘍塊の数を測定した。これらの結果を図１９に示す。【0157】
図１９において、（Ａ）は、肺重量を示すグラフであり、（Ｂ）は、肺全体積における腫瘍の体積割合を示すグラフであり、（Ｃ）は、肺表面の腫瘍塊の数を示すグラフである。図１９（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、スクランブル配列を導入した核酸と比較して、前記ｇｈＲ−３４ａ（Ｇ１７／Ｐ１３）（配列番号２５）の投与により、肺重量の増加、体積割合、腫瘍塊の数は、有意に減少した。【0158】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。【0159】
この出願は、２０１３年１２月２６日に出願された日本出願特願２０１３−２６９５９９を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。【産業上の利用可能性】
【0160】
本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡによれば、容易に低コストで合成でき、且つ、前記遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制が可能である。本発明の人工ミミックｍｉＲＮＡは、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]