特許 6486837 腸疾患の予防および治療のための、微生物の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6486837

(24)【登録日】2019年3月1日

(45)【発行日】2019年3月20日

(54)【発明の名称】腸疾患の予防および治療のための、微生物の使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20190311BHJP

   A61K 35/747 20150101ALI20190311BHJP

   A61P 1/14 20060101ALI20190311BHJP

   A61P 1/10 20060101ALI20190311BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20190311BHJP

   A21D 8/04 20060101ALI20190311BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20190311BHJP

   A61K 31/221 20060101ALI20190311BHJP

   C12P 13/00 20060101ALN20190311BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 E

   A61K35/747

   A61P1/14

   A61P1/10

   A23L33/135

   A21D8/04

   A61K45/00

   A61K31/221

   !C12P13/00

【請求項の数】15

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2015-555745(P2015-555745)

(86)(22)【出願日】2014年2月4日

(65)【公表番号】特表2016-508368(P2016-508368A)

(43)【公表日】2016年3月22日

(86)【国際出願番号】EP2014052129

(87)【国際公開番号】WO2014122119

(87)【国際公開日】20140814

【審査請求日】2017年1月25日

(31)【優先権主張番号】13153996.7

(32)【優先日】2013年2月5日

(33)【優先権主張国】EP

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 23090

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 23091

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 23200

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 23092

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 23093

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 23201

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 23174

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 23121

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 26024

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】515109115

【氏名又は名称】ラドウィッグ ストッカー ホフフェイステレイ ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100113376

【弁理士】

【氏名又は名称】南条 雅裕

(74)【代理人】

【識別番号】100179394

【弁理士】

【氏名又は名称】瀬田 あや子

(74)【代理人】

【識別番号】100185384

【弁理士】

【氏名又は名称】伊波 興一朗

(74)【代理人】

【識別番号】100137811

【弁理士】

【氏名又は名称】原 秀貢人

(72)【発明者】

【氏名】メイヤー ユルゲン

(72)【発明者】

【氏名】ハラー ダーク

(72)【発明者】

【氏名】チェンチャク アナ

(72)【発明者】

【氏名】ホフマン トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ダンケル アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】シェーマン マイケル

(72)【発明者】

【氏名】クルーガー ダグマー

【審査官】 鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５４３５７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１６−５０２４０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 BIOPSYCHOSOCIAL MEDICINE，２０１２年，Vol. 6, No. 1，pp. 1/8-8/8

【文献】 Appl. Environ. Microbiol.，２００９年，Vol. 75, No. 4，pp. 1099-1109

【文献】 MICROBIAL CELL FACTORIES，２０１１年，Vol. 10, No. SUPPL.1，S6(pp. 1-11)

【文献】 INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY，２００７年，Vol. 114, No. 1，pp. 69-82

【文献】 J. Appl. Microbiol.，２００７年，Vol. 103，pp. 821-835

【文献】 J. Gen. Microbiol.，１９４７年，Vol. 1, No. 3，pp. 279-298

【文献】 Appl. Environ. Microbiol.，１９７７年，Vol. 34, No. 2，pp. 237-239

【文献】 BIOESSAYS，２０１１年，Vol. 33, No. 8，pp. 574-581

【文献】 WORLD JOURNAL OF GASTROENTEROLOGY，２０１２年，Vol. 18, No. 30，pp. 4012-4018

【文献】 Am. J. Physiol.，１９６９年，Vol. 216, No. 2，pp. 343-347

【文献】 Br. J. Pharmacol.，２００６年，Vol. 149，pp. 463-479

【文献】 Int. Med. J.，２００９年，Vol. 39, No. 2，pp. 103-109

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／２０−１／２１

Ｃ１２Ｐ １３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

腸疾患の予防および／または治療、および／または、腸疾患のリスク低減のための医薬を製造するための、
アセチルコリン産生微生物の使用であって、
前記微生物は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ株、または、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ株である、
使用。

【請求項2】

腸内健康の維持および／または改善するための機能性食品または機能性飲料の製造における、アセチルコリン産生微生物の非医療的使用であって、
前記微生物は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ株、または、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ株である、
但し、前記微生物から、ＤＳＭ２３０９０株、ＤＳＭ２３０９１株、ＤＳＭ２３２００株、ＤＳＭ２３０９２株、ＤＳＭ２３０９３株、ＤＳＭ２３２０１株、ＤＳＭ２３１７４株、ＤＳＭ２３１２１株およびＤＳＭ２６０２４株のいずれか１つから選択される、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を除く、
使用。

【請求項3】

請求項１または２に記載の使用であって、
健康な腸管内菌叢を維持および／または促進するため、および／または、消化プロセスの毒性作用を低減するため、および／または、消化器系を刺激するため、および／または、腸調節を改善するための、
使用。

【請求項4】

請求項１または３に記載の使用であって、
前記腸疾患は、機能性腸疾患および／または腸神経系により制御される腸壁の分泌と関連する疾患である、
使用。

【請求項5】

請求項４に記載の使用であって、
前記腸疾患は、機能性便秘、機能性下痢および／または過敏性腸症候群（ＩＢＳ）である、
使用。

【請求項6】

請求項４に記載の使用であって、
前記腸疾患は、便秘が主であるＩＢＳ、交互のＩＢＳ、または下痢が主であるＩＢＳである、
使用。

【請求項7】

請求項１、３、４、５または６に記載の使用であって、
前記腸疾患は炎症性腸疾患である、
使用。

【請求項8】

請求項７に記載の使用であって、
前記腸疾患は、潰瘍性大腸炎および／またはクローン病である、
使用。

【請求項9】

請求項１から８のいずれか一項に記載の使用であって、
前記微生物は、適切な培養条件下で、３０ｍｇ／ｋｇ以上のアセチルコリンを産生する、
使用。

【請求項10】

請求項１、４、５または６に記載の使用であって、
前記乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）は、ＤＳＭ２６０２４株、ＤＳＭ２３０９０株、ＤＳＭ２３０９１株、ＤＳＭ２３２００株、ＤＳＭ２３０９２株、ＤＳＭ２３０９３株、ＤＳＭ２３２０１株、ＤＳＭ２３１７４株およびＤＳＭ２３１２１株、またはそれらから培養される株、のいずれか１つから選択される、
使用。

【請求項11】

請求項１０に記載の使用であって、
前記乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）は、ＤＳＭ２３０９０株およびＤＳＭ２３０９３株、のいずれか１つから選択される、
使用。

【請求項12】

請求項１、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１に記載の使用であって、
製剤の剤形中の、
使用。

【請求項13】

請求項２に記載の使用であって、
前記機能性食品がサワードウブレッドである、
使用。

【請求項14】

請求項１２または１３に記載の使用であって、
好ましい腸管内菌叢を維持および／または回復するための少なくとも１つのさらなる細菌をさらに含む、
使用。

【請求項15】

請求項１２または１３に記載の使用であって、
腸疾患の治療のための少なくとも１つのさらなる薬剤をさらに含む、
使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腸疾患の予防および／または治療、および／または、腸疾患のリスク軽減、および／または、腸内健康の改善、ならびに、健康な腸管内菌叢の促進における使用のための、アセチルコリン産生微生物に関する。アセチルコリン産生微生物は、製剤の剤形として、または、機能性食品または補助食品への添加剤として、提供され得る。また、乳酸菌を使用してアセチルコリンを産生する方法も含まれる。さらに本発明は、腸疾患の治療および／または予防における使用のための、微生物によって産生されるアセチルコリンに関する。

【背景技術】

【0002】

数多くの患者が、下部の小腸および／または大腸と関連する胃腸障害を患っている。これらの障害は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、または痙攣性結腸、特発性変質性大腸炎（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、粘液性大腸炎、コラーゲン形成大腸炎、クローン病、一般的な炎症性腸疾患、顕微鏡的大腸炎、抗生物質関連の大腸炎、特発性または単なる便秘、憩室性疾患、およびエイズ腸症を含む。

【0003】

過敏性腸症候群は、全ての胃腸障害の中で最も一般的であり、成人の１１〜１４％が患い、消化不調を有する全患者の５０％超を占める（Ｇ．Ｔｒｉａｄａｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｗｅｌ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ，Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓ．，Ｓｃｉ．３６（１）：５９−６４［１９９１］；Ｗ．Ｇ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｉｒｒｉｔａｂｌｅ Ｂｏｗｅｌ Ｓｙｎｄｒｏｍ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ｌａｎｃｅｔ，３４１：１５６９−１５７２［１９９３］）。実際に薬物療法を求めているのはＩＢＳを有する人々のほんの一部であると考えられる。ＩＢＳを有する患者は、異なる症状、例えば、排便、交互の下痢および便秘、腹部の膨張、ガス、および、排泄物中の過剰粘液に主に関連する、腹痛を示す。３つのグループのＩＢＳが存在する：便秘が主であるＩＢＳ（Ｃ−ＩＢＳ）、交互のＩＢＳ（Ａ−ＩＢＳ）、および、下痢が主であるＩＢＳ（Ｄ−ＩＢＳ）。ＩＢＳは、慢性の状態として認識され、患者の生活の質に重大な影響を有し得る。

【0004】

ＩＢＳに関するいくつかの可能性のある原因は、例えば、繊維質の少ない洋食、腸運動の機能不全、腹痛感受、異常な心理または行動、または、ストレスに対する精神心理学的応答が提唱されている。しかしながら、それらの原因のいずれも、完全には認められていない（上記Ｗ．Ｇ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ［１９９３］）。

【0005】

ＩＢＳを患っている患者は、正常な腸活動を痛みとして感じるように思われる。例えば、ＩＢＳ患者は、正常よりも少量の直腸膨張で痛みを経験し、または、移動性運動群（ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｍｏｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ）のフェーズＩＩＩ活動を認知する閾値が正常よりも低い（Ｗ．Ｅ．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｆｏｒ Ｒｅｃｔｏｓｉｇｍｏｉｄ Ｄｉｓｔｅｎｔｉｏｎ ｉｎ Ｉｒｒｉｔａｂｌｅ Ｂｏｗｅｌ Ｓｙｎｄｒｏｍ，Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９８：１１８７−９２［１９９０］；Ｊ．Ｅ．Ｋｅｌｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｒｒｉｔａｂｌｅ Ｂｏｗｅｌ Ｓｙｎｄｒｏｍ，Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０１（６）：１６２１−２４［１９９１］）。

【0006】

ＩＢＳ患者における腸管運動は、薬、ホルモン、食品、および精神的ストレスなどの様々な刺激に対する正常な制御応答とは異なる（Ｄ．Ｇ．Ｗａｎｇｅｌ ａｎｄ Ｄ．Ｊ． Ｄｅｌｌｅｒ，Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｍａｎ，ＩＩＩ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉａｒｒｈｅａ ｗｉｔｈ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｒｒｉｔａｂｌｅ Ｂｏｗｅｌ，Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．４８：６９−８４［１９６５］；Ｒ．Ｆ．Ｈａｒｖｅｙ ａｎｄ Ａ．Ｅ．Ｒｅａｄ，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ ａｎｄ Ｃｏｌｏｎ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｏｎ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｉｒｒｉｔａｂｌｅ Ｂｏｗｅｌ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｌａｎｃｅｔ ｉ：１−３［１９７３］；Ｒ．Ｍ．Ｖａｌｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ“Ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃ ｄｒｕｇｓ”ｏｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｆａｓｔｉｎｇ Ｍｏｔｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ，Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９０：１８９０−９００［１９８６］）。

【0007】

Ｅｖａｎｓら、および、ＧｏｖａｔｈおよびＦａｒｔｈｉｎｇは、過敏性腸症候群は乱れた胃腸運動と関連することが多いと認識した（Ｐ．Ｒ．Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｐａｒｅｓｉｓ ａｎｄ Ｓｍａｌｌ Ｂｏｗｅｌ Ｄｙｓｍｏｔｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｉｒｒｉｔａｂｌｅ Ｂｏｗｅｌ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．４２（１０）：２０８７−９３［１９９７］；Ｄ．Ａ． Ｇｏｒａｒｄ ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｆａｒｔｈｉｎｇ，Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｉｒｒｉｔａｂｌｅ Ｂｏｗｅｌ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．１２（２）：７２−８４［１９９４］）。ＩＢＳにおける腸運動障害に向けられた治療は、セロトニンアンタゴニスト（Ｄ．Ｐ．Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｓｏ−ａｚａｃｙｃｌｉｃ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｉｄｅｓ Ａｎｄ Ｅｓｔｅｒｓ ａｓ Ｓｅｒｏｔｏｎｅｒｇｉｃ Ａｇｅｎｔｓ，米国特許第５，６１２，３６６号；Ｍ．Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，米国特許第５，５４７，９６１号）、および、コレオシトキニン（Ｃｈｏｌｅｏｃｙｔｏｋｉｎｉｎ）アンタゴニスト（Ｙ． Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，米国特許第４，９７０，２０７号；Ｈ．Ｋｉｔａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｉｅｎｙｌａｚｏｌｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ａｎｄ Ｔｈｉｅｎｏｔｒｉａｚｏｌｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ，米国特許第５，７６０，０３２号）の使用を含む。結腸運動指数は、結腸および小腸運動障害における筋電活動を変えたが、それらはＩＢＳ特異的でないので、信頼性のある診断手法であるとは証明されていない（上記のＷ．Ｇ．Ｔｈｏｍｓｏｎ［１９９３］）。

【0008】

ＩＢＳの治療のためのプロバイオティクスの投与の試みがなされている。例えば、Ａｌｌａｎらは、症状を緩和するためにＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ株の使用を開示した（Ｗ．Ｄ．Ａｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＮＣＩＭＢ ４０３７１ 米国特許第５，７２８，３８０号、および、Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ，米国特許第５，５８９，１６８号）。Ｂｏｒｏｄｙは、疾患スクリーニングされたヒトドナー由来の糞便種菌によって導入される新しい細菌群集を用いた置換および洗浄による、または、バクテリオイド（Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｓ）および大腸菌の種を含む組成物による、腸内細菌叢の少なくとも部分的な除去によって過敏性腸症候群を治療する方法を教示した（Ｔ．Ｊ．Ｂｏｒｏｄｙ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏ−Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ Ｆｅｃａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｓ ａｎｄ Ｅ．ｃｏｌｉ，米国特許第５，４４３，８２６号）。

【0009】

人々の健康および幸福が、消化管（具体的には大腸）に生息する微生物によってプラスまたはマイナスに影響され得ることは、多くの科学者たちの論争である。これらの微生物は、毒素、代謝副産物、および単鎖脂肪酸などの産生を介して、宿主の生理学的状態に影響を及ぼす。

【0010】

腸内細菌叢の構成および量は、疾患、生活様式、旅行および他の因子により誘導される状態またはストレスにより、影響され得る。個人の健康および幸福にプラスに影響する微生物が大腸内に生息するのを促進することが可能な場合、それは宿主の心理的幸福を改善するであろう。

【0011】

有益な微生物またはプロバイオティクスの導入は、飲料、ヨーグルト、カプセル、および、生菌が大腸に到達することを可能にする他の形態での、微生物の摂取により達成され得る。

【0012】

しかしながら、現在までに、十分な形で上皮層の分泌機能および腸便通の制御を行なう腸神経系（ＥＮＳ）を刺激する信頼性のある方法は見つかっておらず、または、開発されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

したがって、本発明の課題は、上皮層の分泌機能および腸便通の制御に十分な形で介入して、それにより腸疾患の進行に作用する方法を提供することであった。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明の発明者らは、鋭意研究を行なった結果、アセチルコリン産生微生物によって、腸機能を調節することができるということを見いだした。それにより、アセチルコリン産生微生物（具体的には乳酸菌）の選択および特異的な投与を介した、腸内のアセチルコリンによる、運動および分泌の標的化された二重の刺激に関する方法が提供される。この治療方法は、慢性のＩＢＳ、および、正常に機能しない腸の運動および分泌に関連する他の疾患のための公知の治療に対する有望な代替または付加である。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】サワードウ、サワードウブレッドおよび類似ブレッドの水抽出物中の代謝産物プロファイル。Ａ：トリプリケートでのサワードウ（ＳＤ）、サワードウブレッド（ＢＲ）および類似ブレッド（ＡＮ）由来の水抽出物中の絶対的な代謝産物（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）の濃度のヒートマップ。水抽出物は、合計ドウまたはブレッド乾燥質量の５〜１０％を構成する。Ｂ：代謝産物の主成分分析（ＰＣＡ）は、サワードウ（ＳＤ）、サワードウブレッド（ＢＲ）および類似ブレッド（ＡＮ）の間の代謝産物の濃度において有意差を示す。

【図2】サワードウ抽出物は、ムスカリン性アセチルコリン受容体（ｍＡＣＨＲ）に直接作用することにより、胃の筋肉運動を効果的に刺激する。Ａ：アセチルコリン（ＡＣＨ）（２．５μＭ）、または、サワードウ（ＳＤ）、サワードウブレッド（ＢＲ）または類似ブレッド（ＡＮ ＢＲ）の抽出物（０．０２％）の、いずれかにより誘導される筋緊張の変化。類似ブレッドの抽出物以外では、緊張の増大が、刺激付加の際に直ちに観察された（矢印記号）。Ｂ：示差的な治療における、筋緊張変化のメジアン（ｎ＞４）。アセチルコリン（ＡＣＨ）、および、サワードウ（ＳＤ）、サワードウブレッド（ＢＲ）または類似ブレッド（ＡＮ ＢＲ）の抽出物の、運動促進性作用は、ｍＡＣＨＲ特異的アンタゴニスト（アトロピン）により、完全に無効にされる。これは、抽出物中のアセチルコリンが、ｍＡＣＨＲに直接作用することを示す。

【図3】テトロドトキシン（ＴＴＸ）は、サワードウ（ＳＤ）由来のアセチルコリン（ＡＣＨ）による筋収縮の刺激に有意な効果はない。図は、アセチルコリン（２．５μＭ）、または、サワードウ（ＳＤ）、サワードウブレッド（ＢＲ）または類似ブレッド（ＡＮ ＢＲ）の０．０２％抽出物のいずれかにより刺激される筋緊張の変化、および、ＴＴＸ事前処理の効果を示す。ＴＴＸは、サワードウＡＣＨにより誘導される筋収縮に有意な効果を示さず、神経を仲介せずに筋肉ｍＡＣＨＲに直接作用することにより、刺激が誘導されることが示された。

【図4】サワードウおよびサワードウブレッドの抽出物は、腸の粘膜の漿膜または粘膜のいずれか側から適用すると、塩化物イオンの分泌を刺激する。Ａ：２つのチャンバーを分離する粘膜小片を具備するウッシングチャンバー（Ｕｓｓｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ）。電極の下部セットは経上皮電圧（Ｖ_ＴＥ）を測定し、側部セットは短絡電流（Ｉ_ＳＣ）を測定する。分泌は、Ｖ_ＴＥを０ｍＶに維持するのに必要なＩ_ＳＣの変化により見積って測定される。Ｂ：アセチルコリン（ＡＣＨ）、サワードウ（ＳＤ）、サワードウブレッド（ＳＤ ＢＲ）または類似ブレッド（ＡＮ ＢＲ）の抽出物により刺激される、代表的なＩ_ＳＣトレース。曲線下面積は、積分（μＡ^＊ｓ／ｃｍ^２）を用いて計算し、青色は抽出物に対する応答を示し、赤ストライプは、電場刺激（ＥＦＳ）に対する応答を示す。図Ｃは、モルモット結腸粘膜の粘膜側（ＭＵＣ）または漿膜側（ＳＥＲ）のいずれかの処理の際の、Ｉ_ＳＣの変化のメジアン（ｎ＞４）値を示す。アセチルコリン（ＡＣＨ）およびサワードウ（ＳＤ）およびサワードウブレッド（ＳＤ ＢＲ）の抽出物は、粘膜のいずれか側に適用すると、分泌を明らかに刺激する一方で、類似ブレッドの抽出物は効果がない。サワードウおよびサワードウブレッド中のアセチルコリンが刺激に関与していることを示す。

【図5】アトロピンは、サワードウ（ＳＤ）およびサワードウブレッド（ＳＤ ＢＲ）分泌物により刺激される塩化物イオンの分泌を、完全に無効にする。アトロピン事前処理（１μＭ）をした、およびしていない、モルモット結腸粘膜の、粘膜側（Ａ）または漿膜側（Ｂ）のいずれかに対する、アセチルコリン（ＡＣＨ）（１０μＭ）および抽出物（０．１％）の適用における、経時的な短絡電流（Ｉ_ＳＣ）の変化の平均（ｎ＞４）値を示す。アトロピンは、分泌刺激を完全に無効にし、サワードウ抽出物の分泌効果におけるｍＡＣＨＲの役割を示した。

【図6】アトロピンは、粘膜ではなく漿膜に適用すると、ＡＣＨ、および、サワードウ（ＳＤ）、サワードウブレッド（ＢＲ）または類似ブレッド（ＡＮ ＢＲ）の抽出物による分泌刺激を完全に無効にする。アトロピン（１μＭ）で事前処理をして、およびせずに、ＡＣＨおよび抽出物で粘膜側を処理した後の、経時的な短絡電流（Ｉ_ＳＣ）の変化の平均（ｎ＞４）値を示す。アトロピンは、漿膜または粘膜のいずれか側に添加した。アトロピンは、粘膜側ではなく漿膜に適用した場合に分泌を完全に無効にした。

【図7】サワードウ乳酸菌の代謝プロファイル。Ａ：乳酸菌接種の２４時間後のＭＲＳブロス中の絶対的な代謝産物の値のヒートマップ（３回の実験の平均）。Ｂ：代謝産物のＰＣＡプロットは、試験したサワードウ細菌およびＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ（ＬＣ）の間の明らかな区別を示す。Ｃ：Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉはアセチルコリンを少しも産生しないので、アセチルコリン（ＡＣＨ）は、ＰＣＡプロットに見られる区別において最も強い役割を果たす。

【図8】乳酸菌を用いたインキュベーション２４時間における、ＭＲＳ培地中のアセチルコリン濃度。Ａ：０．２５×１０^７細菌／ｍＬを用いた接種２４時間における、ＭＲＳブロス中のアセチルコリン濃度。Ｂ：ＭＲＳ中１０^６／ｍＬの細菌数に調節した、アセチルコリン（ＡＣＨ）濃度。濃度は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、公知濃度のアセチルコリンを有する溶液の面積に対してピーク面積を比較することにより決定した。

【図9】サワードウ乳酸菌の濃縮馴化培地は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−活性化腸上皮細胞（ＩＥＣ）によるインターフェロン誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）の分泌を有意に阻害する。ＥＬＩＳＡにより測定した、Ｍｏｄｅ−ｋ細胞の培養培地中のＩＰ−１０の濃度を示す。細胞を、濃縮馴化培地（ｃＣＭ）（黒いバー）およびｃＣＭ＋１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ（灰色バー）とともに、２４時間インキュベートした。Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ（Ｌ．ｐ．）は、効率的にＩＰ−１０を分解することが可能なＬａｃｔｏｃｅｐｉｎ ＰｒｔＰを発現し、予想通りに、最も高い阻害活性を有する。サワードウ乳酸菌のｃＣＭは、程度はより少ないが、ＩＰ−１０分泌を有意に阻害する。Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＤＳＭ２３１７４株およびＤＳＭ２３２００株は、ＩＰ−１０分泌の阻害において、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉの次に最も効率的である。

【図10】ホルムアルデヒドで固定したサワードウ乳酸菌は、ＴＮＦ活性化腸上皮細胞によるインターフェロン誘導タンパク質（ＩＰ−１０）の分泌を、有意に阻害する。ＥＬＩＳＡにより測定した、Ｍｏｄｅ−ｋ細胞の培養培地中のＩＰ−１０の濃度を示す。２０ ＭＯＩの固定化乳酸菌（黒いバー）および２０ ＭＯＩの固定化乳酸菌＋１０ｎｇ／ｍＬの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（灰色バー）とともに、細胞を２４時間インキュベートした。固定化Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ（Ｌ．ｐ．）は、固定化Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＤＳＭ２３０９０株およびＤＳＭ２３０９２株と同様に、ＴＮＦ活性化コントロールと比較して、ＴＮＦ活性化腸上皮細胞によるＩＰ−１０分泌に対して、最も高い阻害活性を有する（灰色バー）。

【発明を実施するための形態】

【0016】

したがって、本発明の第１の態様は、腸疾患の予防および／または治療、および／または、腸疾患を発症するリスクの軽減における使用のための、アセチルコリン産生微生物である。

【0017】

本発明のさらなる態様は、腸内健康の維持および／または改善のための、特に、腸内健康の改善のための、アセチルコリン産生微生物の非医療的使用である。

【0018】

アセチルコリン産生微生物は生菌であり、好ましくは、腸領域で増殖可能である。

【0019】

本明細書において用いられる用語「腸領域」は、小腸および大腸を含むことを意図する。大腸は、結腸および直腸を含むことを意図し、ヒトでは、結腸、直腸および盲腸を含むことを意図する。

【0020】

本明細書において用いられる用語「腸疾患を発症するリスクの軽減」は、本発明のアセチルコリン産生微生物を用いて治療される個体が、治療されていない個体と比較して、外部刺激または生理学的プロセスに起因する腸疾患のより低い発症リスクを示すことを意味する。

【0021】

本明細書において用いられる用語「腸内健康の維持および／または改善」は、アセチルコリン産生微生物を用いた治療の際に、個体が、ヒトまたは動物の健康に有益でありかつ前記個体の消化の維持および／または改善に合理的な、異なる腸管内菌叢を示すことを意味する。さらに、腸管内菌叢の改善は、有害細菌を除外競争して（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ）、正常な便通を刺激することにより、腸疾患を発症する対象の耐性増大をもたらし得る。

【0022】

本明細書において用いられる用語「微生物」は、細菌および酵母を含む。細菌は、好ましくは、乳酸杆菌科、例えば、乳酸菌株、具体的には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍである（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｂｙ ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ，

【0023】

特定の実施態様では、微生物は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ株ではなく、具体的には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ２９９ｖ株（ＤＳＭ ９８４３）またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ株（ＡＴＣＣ １０２４１）ではない。特定の実施態様では、微生物は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ株ではなく、具体的には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧではない。

【0024】

腸疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、コラーゲン形成大腸炎、リンパ性大腸炎、虚血性大腸炎、ベーチェット病、不定の大腸炎、空置大腸炎（ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ ｃｏｌｉｔｉｓ）、嚢炎または顕微鏡的大腸炎および／または大腸癌および／または微生物と関連する疾患、例えば、カンジダ症、小腸細菌の過剰増殖、急性または慢性の腸感染および／または硫酸還元細菌により誘導される疾患、および／または腸憩室、および／または腸癌腫、および／または機能性腸疾患（ＦＢＤ）、例えば過敏性腸症候群、および／または、腸神経系により制御される腸壁の分泌と関連する疾患を含む。

【0025】

用語「機能性腸疾患」（ＦＢＤ）は、慢性または半慢性である胃腸疾患を指し、それは、腸の痛み、腸機能障害、および社会的混乱（ｓｏｃｉａｌ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）と関連する。症状の特定の組み合わせおよび有病率を、「ローマ基準（Ｒｏｍｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ）」として知られる分類体系に従って定義される以下の７つのＦＢＤサブグループで特徴付ける：１）Ｃ１：便秘が主である過敏性腸症候群；２）Ｃ１：下痢が主である過敏性腸症候群；３）Ｃ３：機能性便秘；４）Ｃ４：機能性下痢；５）Ｃ２：機能性腹部膨満；６）Ｆ３ａ：骨盤底の共同運動障害；７）Ｆ３ｂ：内肛門括約筋機能障害。

【0026】

より具体的には、腸疾患は、機能性腸疾患、および／または、腸神経系により制御される腸壁の分泌と関連する疾患、具体的には、機能性便秘、機能性下痢および／または過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、例えば、具体的には、便秘が主であるＩＢＳ、交互のＩＢＳ、または下痢が主であるＩＢＳであり得る。

【0027】

本発明のアセチルコリン産生微生物は、好ましくは、健康な腸管内菌叢の維持および／または促進、および／または消化プロセスの毒性作用の低減、および／または消化器系の刺激、および／または腸調節の改善に有用である。健康な腸管内菌叢の促進は、腸内（具体的には大腸、より具体的には結腸）の有害細菌の除外競争をもたらし、それにより、消化プロセスの毒性作用を低減し、消化器系を刺激し、腸調節を改善する。

【0028】

本発明のアセチルコリン産生微生物は、好ましくは、有益な方法で炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の進行を調節して、炎症促進性ケモカインＩＰ−１０の分泌の阻害によりＩＢＤ患者の症状を軽減するのに有用である。

【0029】

別の実施態様では、腸疾患は、炎症性腸疾患であり得る。当該疾患は、好ましくは潰瘍性大腸炎、クローン病、コラーゲン形成大腸炎、リンパ性大腸炎、虚血性大腸炎、ベーチェット病、不定の大腸炎、空置大腸炎および／または顕微鏡的大腸炎である。当該疾患は、より好ましくは、潰瘍性大腸炎および／またはクローン病である。

【0030】

本発明の微生物は、アセチルコリンを産生することが可能である。好ましくは、アセチルコリン産生微生物は、記載される適切な培養条件下で、２０、２５、３０、３５または４０ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは４０ｍｇ／ｋｇ以上、さらにより好ましくは３５ｍｇ／ｋｇ以上のアセチルコリンを産生する。乳酸菌培養に適切な任意の培養培地を、アセチルコリン産生微生物の培養に用いてよい。好ましくは、ＭＲＳ−ブロスを培養培地として用いる。好ましくは、アセチルコリン濃度は、１０^６／ｍｌの細菌数に調節する。

【0031】

アセチルコリン産生微生物は、好ましくは細菌である。より好ましくは、細菌は、乳酸杆菌科、例えば、乳酸菌株、具体的には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ株、または、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ株であり、それらは、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の閲覧用目録から一般に利用可能である。

【0032】

より好ましい実施態様では、乳酸菌株は、ＤＳＭ２６０２４株、ＤＳＭ２３０９０株、ＤＳＭ２３０９１株、ＤＳＭ２３２００株、ＤＳＭ２３０９２株、ＤＳＭ２３０９３株、ＤＳＭ２３２０１株、ＤＳＭ２３１７４株およびＤＳＭ２３１２１株のいずれか１つ、またはそれらから培養される株、より具体的には、ＤＳＭ２３０９０株またはＤＳＭ２３０９３株、またはそれらから培養される株から選択される。これらの株は、ブダペスト条約に従って、Ｌｅｉｂｎｉｔｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託されている。新規の乳酸菌株は、以下のアクセッションナンバーおよび寄託日を有する：ＤＳＭ２３０９０（２０１２−０６−２１）、ＤＳＭ２３０９１（２０１２−０６−２１）、ＤＳＭ２３２００（２０１２−０６−２１）、ＤＳＭ２３０９２（２０１２−０６−２１）、ＤＳＭ２３０９３（２０１２−０６−２１）、ＤＳＭ２３２０１（２０１２−０６−２１）、ＤＳＭ２６０２４（２０１２−０６−０４）、ＤＳＭ２３１７４（２０１２−０６−２１）、ＤＳＭ２３１２１（２０１２−０６−２１）。

【0033】

本明細書において用いられる用語「それらから培養される株」は、原株の培養により得られる子孫株を指す。

【0034】

アセチルコリン産生微生物は、好ましくは、アセチルコリン分泌微生物である。本明細書において用いられる用語「アセチルコリン分泌微生物」は、その微生物が、アセチルコリンを培養培地中に分泌することを意味する。

【0035】

本発明は、アセチルコリン産生微生物の医療的使用に関する。好ましくは、微生物は、薬学的に許容できる剤形として、または栄養の形態（例えば食品または飲料）で提供される。

【0036】

一実施態様では、アセチルコリン産生微生物は、医薬組成物で提供される。また、アセチルコリン産生微生物は、機能性食品中または機能性飲料中の添加剤としても提供され得る。微生物を取り込んだ医薬組成物、食品または飲料は、安全に摂取することができ、胃腸の機能障害または器質性障害または疾患、例えばＩＢＤまたはＩＢＳと関連する状態または症状のリスクがあるとされる対象または患っている対象に、特に推奨される。それらは、アセチルコリン産生微生物を、好ましくは、前記障害または疾患を治療または予防するのに有効量で含む。

【0037】

本明細書において用いられる、用語「有効量」は、所望の治療効果を達成する（例えば、ＩＢＳまたはＩＢＤに関連する疾患、状態および症状を、治療および／または予防する）のに効果的な量を指す。

【0038】

アセチルコリン産生微生物の有効量は、好ましくは、１０^６〜１０^１２ｃｆｕ／剤形（コロニー形成単位／剤形）の範囲の用量、より好ましくは、１０^７〜０．５×１０^１２ｃｆｕ／剤形の範囲、さらにより好ましくは、１０^９〜１０^１１ｃｆｕ／剤形の範囲を含む。剤形は、１日に１回または数回、例えば、２回、３回、またはそれ以上、投与してよい。

【0039】

医薬組成物は、液体または固体の形状であってよい。組成物は、少なくとも１つのアセチルコリン産生微生物またはそれらの混合物、および場合により薬学的に許容できる担体を含む。

【0040】

医薬組成物中に取り込まれる微生物などの量は、組成物の全重量に基づいて、約０．１〜約１００重量％、好ましくは約２〜約２０重量％、さらにより好ましくは約４〜約１０重量％に変化させてよい。

【0041】

本発明の医薬組成物は、文献で知られる通常の製剤形態、例えば錠剤、コーティング錠、カプセル、パケット、溶液、懸濁液、エマルション、坐薬、ペレット、シロップ、膣坐薬、軟膏、クリームなどに作ることができる。好ましくは、組成物は、腸溶性コーティングを含む。それらは、通常の様式で、活性成分を賦形剤および／または担体と混合し、場合により、アジュバントおよび／または分散剤を添加することにより、調製することができる。希釈剤としては水を用いるべきであり、他の有機溶媒をアジュバントの形態で用いることもできる。アジュバントは、例えば、水、非毒性の有機溶媒、例えば、パラフィン、植物油（ピーナッツ油またはゴマ油）、アルコール類（例えば、エタノール、グリセロール）、グリコール類（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）であってよい。固形担体は、例えば、天然鉱物粉末（カオリン、タルク）、合成鉱物粉末（例えばシリケート）、糖（例えばショ糖）であってよい。乳化剤は、スルホン酸アルキルまたはスルホン酸アリールなど、分散剤、例えばリグニン、メチルセルロース、スターチおよびポリビニルピロリジン、および、潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、ラウリルスルホン酸ナトリウムであってよい。

【0042】

組成物は、腸領域（例えば経口、直腸または鼻−十二指腸）に投与される薬学的に許容できる液体担体に場合により再構成するための、凍結乾燥され、粉砕され、および粉末化された、アセチルコリン産生微生物を含んでよい。投与は、通常の様式で、好ましくは経口／直腸経路で行なう。浣腸剤として、その結果、生理食塩水などに溶解して注入されてよい。粉末としては、飲用に再構成するために、好ましくは味の良い形態で提供することができる。粉末は、鼻−十二指腸注入により注入されるように再構成してもよい。

【0043】

この目的を達成するために適応される製剤形態は、通常の賦形剤、例えばラクツロース、デキストロース、ラクトースに加えて、他の添加剤、例えばクエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カルシウムを、いくつかのさらなる物質、例えばスターチ、ゼラチンなどと合わせて含んでよい。液体形態の場合、適合する着色剤または風味物質を添加してよい。

【0044】

アセチルコリン産生微生物を含む組成物のさらなる構成要素は、活性剤、例えばグルタミン／グルタメートまたはそれらの前駆体、マンナン、ガラクツロン酸オリゴマー、ハーブ抽出物、例えばＲｅｇｕｌａｔ（登録商標）（Ｄｒ Ｎｉｅｄｅｒｍａｙｅｒ Ｐｈａｒｍａの登録商標）およびＩｂｅｒｏｇａｓｔ（登録商標）（Ｓｔｅｉｇｅｒｗａｌｄ Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｗｅｒｋ ＧｍｂＨの登録商標）、チョークベリービール酵母、潰瘍性大腸炎の治療に有用な薬、例えばスルファサラジン、５−ＡＳＡ剤、コルチコステロイド、例えば副腎皮質ステロイド、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、またはブデソニド、または、痛み、下痢、感染、またはＩＢＳに対して用いられる薬剤、例えばセロトニン−４受容体アゴニスト、例えばテガセロッドを含んでよい。組成物は、他のアジュバント、例えば、胃での細菌の不活性化を弱める制酸剤と組み合わせることができる。胃での酸分泌は、Ｈ２アンタゴニストまたはオメプラゾールを用いて薬理学的に抑制することもできる。

【0045】

本発明の組成物は、個別に連続的に、または、本明細書で上記に記載したような活性剤とともに同時に投与する、キットの形態で提供してよい。これらの活性剤は、本発明の組成物とともに標準的な製剤の剤形で、例えば、少なくとも１つの薬学的に許容できる担体と組み合わせて、好適に製剤化してよい。

【0046】

別の好ましい実施態様では、アセチルコリン産生微生物を含む組成物は、少なくとも１つのさらなる微生物、すなわち、非アセチルコリン産生微生物、例えば、好ましい腸管内菌叢を維持および／または回復するための細菌を含んでよい。さらなる細菌は、好ましくは、プロバイオティック細菌である。

【0047】

本発明の別の実施態様では、アセチルコリン産生微生物は、好ましくは、プロバイオティックとして、好ましくは機能性食品または機能性飲料への添加剤として、提供することができる。

【0048】

栄養添加剤としての微生物の量は、約０．０００１〜約２０重量％、好ましくは約０．０１〜約１０重量％、さらにより好ましくは約０．１〜約５重量％に変化してよい。

【0049】

別の好ましい実施態様では、アセチルコリン産生微生物は、食材、好ましくは食品−または飼料製品、例えば穀類、具体的にはオート麦フレークまたはパン、飲料または乳製品、具体的にはヨーグルト、ザウアークラウトジュース、植物抽出物、例えばＲｅｇｕｌａｔ（登録商標）、発酵飲料またはＢｒｏｔｔｒｕｎｋ（登録商標）に適用することができる。食材への適用は、好ましくは微生物を食材上に噴霧することにより、前記材料をアセチルコリン産生微生物でコーティングすることにより達成され得る。また、アセチルコリン産生微生物は、食材、例えばパン、ヨーグルト、またはチーズ、好ましくはサワードウブレッド中に、それらを注入することにより適用することもできる。

【0050】

本明細書において用いられる用語「機能性食品」は、その栄養上および感覚上の機能に加えて、代謝にプラスの効果があり、バランスのとれた栄養の範囲内で、健康の改善、幸福の増大および／または健康リスクの低減に貢献する食品である。機能性食品は、自然食品、または、構成要素を追加または除去することにより改変された食品であってよい。

【0051】

好ましい実施態様では、機能性食品は発酵製品であり、より好ましくは、機能性食品はサワードウまたはサワードウブレッドである。

【0052】

本発明のサワードウブレッドは、アセチルコリン産生株を含むだけでなく、さらに、高い含有量の他のアセチル化化合物、例えばＮ−アセチル−グリシン、ホモセリン、カナバニンなども含み得るという利点を有する。

【0053】

本明細書において用いられる用語「機能性飲料」は、その栄養上および感覚上の機能に加えて、代謝にプラスの効果があり、バランスのとれた栄養の範囲内で、健康の改善、幸福の増大および／または健康リスクの低減に貢献する飲料である。消費に一般的な量で、正常の食習慣の範囲内で、その効果が得られる。

【0054】

機能性飲料は、さらなる構成要素、例えばハーブ類、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸類、またはさらなる他の食品または飲料成分（一般の栄養を超える特定の健康利益を提供する）を含んでよい。あるいは、刺激物、例えばタウリン、グルコロノラクトン（ｇｌｕｃｏｒｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ）、カフェイン、Ｂ−ビタミン、ガラナ、朝鮮人参、銀杏、Ｌ−カルニチン、糖類、抗酸化剤、マテ、クレアチン、オオアザミなどを含んでよい。好ましい実施態様では、本発明のアセチルコリン産生微生物により消化されるのに適切なプレバイオティックをさらに含む。

【0055】

好ましい機能性飲料は、飲用ヨーグルト、発酵穀物飲料、アルコールフリーのビール、Ｂｒｏｔｔｒｕｎｋ（登録商標）、果汁ベースの飲料、または、植物またはハーブの抽出物を含む飲料、例えばＩｂｅｒｏｇａｓｔ（登録商標）である。

【0056】

また、機能性食品または機能性飲料は、好ましくは、腸疾患の治療のための、少なくとも１つのさらなる活性剤とともに投与することもできる。さらなる活性剤は、上述の薬剤群から選択することができる。

【0057】

別の実施態様では、活性剤は、好ましくは、好ましい腸管内菌叢を維持および／または回復するための、少なくとも１つのさらなる細菌であってよい。さらなる細菌は、プロバイオティック細菌の群から選択することができる。

【0058】

好ましいプロバイオティック細菌は、乳酸菌およびビフィズス菌由来の株、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、および／または、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓを含む群から選択することができる。

【0059】

場合により、組成物は、プレバイオティックを含むこともできる。本明細書において用いられる「プレバイオティック組成物」は、結腸に既に生息する限られた数の微生物種のうちの１つの増殖、活性または両方を、選択的に刺激することにより、宿主に有利に作用する、少なくとも非消化性の食品成分である。プレバイオティックは、好ましくは、非消化性オリゴ糖、例えば、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ラクトロース（ｌａｃｔｏｌｏｓｅ）、キシロオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、グルコオリゴ糖、フルクタン、ラクトスクロース（ｌａｃｔｏｓｕｃｃｒｏｓｅ）、単鎖フラクトオリゴ糖、およびそれらの混合物である。

【0060】

また、本発明は、乳酸菌を使用してアセチルコリンを産生する方法も提供する。好ましくは、単一の乳酸菌株を用い、または、乳酸菌株または乳酸菌株の組成物の組み合わせを用いる。したがって、用いられる乳酸菌株は、具体的には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ株、または、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ株、より具体的には、ＤＳＭ２６０２４株、ＤＳＭ２３０９０株、ＤＳＭ２３０９１株、ＤＳＭ２３２００株、ＤＳＭ２３０９２株、ＤＳＭ２３０９３株、ＤＳＭ２３２０１株、ＤＳＭ２３１７４株およびＤＳＭ２３１２１株、またはそれらから培養される株、さらにより具体的には、ＤＳＭ２３０９０株またはＤＳＭ２３０９３株である。

【0061】

本発明の別の態様は、上述の腸疾患の治療および／または予防における使用のための、微生物によって産生されるアセチルコリンである。アセチルコリンは、好ましくは、本発明の微生物によって産生され得る。微生物は、好ましくは乳酸杆菌科、例えば、乳酸菌株、具体的には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ株、または、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ株である。腸疾患は、上述の腸疾患、例えば、炎症性腸疾患または機能性腸疾患を含む。好ましくは、疾患は、過敏性腸症候群および／または腸神経系により制御される腸壁の分泌と関連する疾患である。微生物によって産生されるアセチルコリンは、例えば食品および／または飼料製品に添加されて経口で投与され得る。添加は、本発明の微生物を用いた食品および／または飼料製品の製造の間に、食品および／または飼料製品の発酵のために行なってもよい。そのような発酵食品の製品は、サワードウブレッドであってよく、ここで、生きた微生物は、熱によるベーキングの段階中に死滅し、微生物により産生されたアセチルコリンを含むサワードウブレッドをもたらす。微生物によって産生されるアセチルコリンの含有量は、約５〜１０００ｍｇアセチルコリン／ｋｇ食品または飼料製品の範囲であり、好ましくは約２０〜５００ｍｇアセチルコリン／ｋｇ飼料製品または食品製品の範囲、より好ましくは約４０〜２００ｍｇアセチルコリン／ｋｇ飼料製品または食品製品の範囲である。好ましくは、アセチルコリンの量は、推奨される１日の用量と同等とみなされる。

【0062】

さらに、本発明は、以下の実施例によって、より詳細に説明される。

【実施例】

【0063】

１）方法および材料
１．１）サワードウおよびブレッド
サワードウ（Ｖｏｌｌｓａｕｅｒ）を、乳酸菌ＤＳＭ２６０２４株、ＤＳＭ２３０９０株、ＤＳＭ２３０９１株、ＤＳＭ２３２００株、ＤＳＭ２３０９２株、ＤＳＭ２３０９３株、ＤＳＭ２３２０１株、ＤＳＭ２３１７４株およびＤＳＭ２３１２１株を含む、Ｉ型サワードウライ麦スターターの伝統的な増殖により調製した。サワードウおよびサワードウブレッドの組成は：７１％ライ麦粉、２５％小麦粉、１．８％塩および２％パン粉（ｐＨ４．５、酸性度９〜１０）である。生地を２９８℃で１．５時間焼いた。類似ブレッドは、２．５％炭酸水素ナトリウム、０．１３％酢酸および１．２％乳酸でサワードウスターターを置き換えて、サワードウブレッドと同一であった。

【0064】

１．２）代謝産物の分析
サワードウ、サワードウブレッドおよび類似ブレッドの水抽出物（＜１０ｋＤａ）、ならびに、乳酸菌のＭＲＳ増殖培地を、代謝産物の定量化のために、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。分析前に、ＭＲＳ培地を、１０ｋＤａ Ｖｉｖａｓｐｉｎ ５００フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて濾過した。

【0065】

以下を用いてサンプルを測定した：
Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｒａ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ＵｌｔｉＭａｔｅ（登録商標）３０００（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｉｄｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
−ポンプ−ＨＰＧ−３４００ＳＤ
−脱ガス装置−ＳＲＤ−３４００
−オートサンプラー−ＷＰＳ−３０００ＴＳＬ
−カラムオーブン−ＴＣＣ−３０００ＳＤ
ＡＰＩ ４０００ ＱＴＲＡＰ、線形イオントラップ四重極質量分析計（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）：
−イオン化型−エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）
−機器制御−Ａｎａｌｙｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＡｂＳｃｉｅｘ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
−固定相：ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０ ３μｍ（１５０×２ｍｍ，Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
−固定相温度：４０℃
−移動相：

【表1】

【0066】

クロマトグラムはＭｕｌｔｉｑｕａｎｔ ２．０（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分析し、サンプル中の濃度は標準スペクトルに従って計算した。

【0067】

１．３）抽出
サワードウ、サワードウブレッドおよび類似ブレッドを、凍結乾燥し、粉末にすり砕いた。１００ｇの粉末化されたブレッドまたはサワードウを、５００ｍＬの蒸留水中に可溶化し、５０℃で３時間、常時撹拌して抽出した。懸濁液を９０００ｒｐｍで２０分遠心分離した。上清を回収して４℃に保持した。ペレットを再度５００ｍＬの蒸留水中に再懸濁し、３時間抽出を繰り返した。遠心分離後、ペレットを再度５００ｍＬの蒸留水中に再懸濁し、一晩抽出した。３回の抽出ステップ後の上清（合計容量は約１．５Ｌ）を一緒にプールし、０．２μｍ、除外閾値１００ｋＤａおよび１０ｋＤａの、Ｖｉｖａｆｌｏｗ ２００カセット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、段階的に濾過した。除外閾値１００ｋＤａおよび１０ｋＤａの濾液を凍結乾燥し、インビトロ分析のために、蒸留水中で２５％に再懸濁した。１０ｇの＜１０ｋＤａ画分を、１００ｇの凍結乾燥したブレッドおよびサワードウから抽出した。

【0068】

１．４）エンドトキシンの測定および除去
サワードウ、サワードウブレッドおよび類似ブレッド由来の水抽出物中の、エンドトキシン濃度の測定を、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｅｎｄｐｏｉｎｔ Ａｓｓａｙ（Ｈｙｃｕｌｔ ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて決定した。アッセイは、製造業者の説明書に従って行なった。溶液からパイロジェンを結合して除去する、固定化ポリミキシンＢを有する樹脂を含む、Ｄｅｔｏｘｉ−ＧｅｌＴＭ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｍｏｖｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を用いて、サワードウ、サワードウブレッドおよび類似ブレッド由来の水抽出物中の、エンドトキシン混入を除去した。エンドトキシンの除去は、製造業者の説明書に従って行なった。

【0069】

１．５）ＥＬＩＳＡ
細胞培養上清中の、インターフェロン誘導タンパク質（ＩＰ−１０）（ミューリン／ヒト）および（ミューリン）濃度を、適切なＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｅｕｒｏｐｅ，Ａｂｉｎｇｔｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて製造業者の説明書に従って決定した。ＥＬＩＳＡは、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ ＧｍｂＨ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行なった。手短には、９６ウェルプレートを、一晩室温で、適切な捕捉抗体を用いてコーティングした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いてプレートを３回洗浄し、ＰＢＳ中１％のウシ血清アルブミンでブロッキングし、細胞培養上清とともに室温で１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄し、適切な検出抗体とともに室温で１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄し、検出酵素とともにインキュベートした。プレートを洗浄し、基質溶液とともにインキュベートした。基質と検出酵素の反応の測光分析により、タンパク質濃度を決定した。

【0070】

１．６）細菌培養
サワードウから分離したＬ．ｒｏｓｓｉａｅ（ＤＳＭ２６０２４）およびＬ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ株（ＤＳＭ２３０９０、ＤＳＭ２３０９１、ＤＳＭ２３０９２、ＤＳＭ２３０９３、ＤＳＭ２３１７４、ＤＳＭ２３２００、ＤＳＭ２３２０１）、Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ基準株ＤＳＭ２０４５１（ＤＳＭＺ ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＦＵＡ ３０３８、および、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ３１１３（カナダ・アルバータ大学のＧａｎｚｌｅ教授より提供）、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＶＳＬ＃３（イタリア・Ｌ’ＡｑｕｉｌａのＤｅＳｉｍｏｎｅ博士より提供）を、３０℃にて、Ａｎａｅｒｏｇｅｎ ｐａｃｋａｇｅｓ（Ａｎａｅｒｏｇｅｎ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｏｘｏｉｄ，ＵＫ）を用いて、嫌気的条件下で、新しく添加した０．１５％のＬ−システインを含むＭＲＳブロス（ｐＨ５．４）中で増殖させた。固定化細菌（５％ホルムアルデヒド、４時間、４℃）を、使用前に滅菌ＰＢＳを用いて３回洗浄した。一晩（ａｎｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）の培養からの細菌（５×１０^７ｃｆｕ／ｍｌ）を、ＤＭＥＭ（１％グルタミン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）および嫌気的（ａｎｅｒｏｂｉｃａｌ）培養に３０℃で一晩移行させることにより、濃縮された馴化培地（ＣＭ）を作製した。細菌および細菌上清（ＣＭ）を、遠心分離（４５００ｇ、１０分、室温）の後に分離した。ＣＭをｐＨ７．４に調節し、フィルター滅菌し（０．２２μｍ）、そして、１００ｋＤａの排除サイズを有するＶｉｖａｃｅｌｌフィルターシステム（Ｓａｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて濃縮した（１００×）。濃縮馴化培地を、細胞培養刺激実験において、１×希釈した。上述のそれぞれの培地に１．５％の寒天を添加することにより、寒天プレートを得た。

【0071】

１．７）運動性
Ｄｕｎｋｉｎ Ｈａｒｄｌｅｙモルモット（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ ａｎｄ Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ ＧｍｂＨ，Ｂｏｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）由来のコーパス環状筋調製物を用いて、運動性測定を行なった。ＬａｂＣｈａｒｔ ５ソフトウェア（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｐｅｃｈｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、浴槽（ｏｒｇａｎ ｂａｔｈ）中で、力変換器を用いて筋肉の収縮力を測定した。手短には、胃の筋組織を粘膜層から切断して、続いて、氷冷調製Ｋｒｅｂｓ溶液（ｐＨ７．４）（ＭｇＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ １．２ｍＭ、ＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ ２．５ｍＭ、ＮａＨ_２ＰＯ_４ １．２ｍＭ、ＮａＣｌ １１７ｍＭ、ＮａＨＣＯ_３ ２５ｍＭ、Ｃ_６Ｈ_１２Ｏ_６ １１ｍＭ、ＫＣｌ ４．７ｍＭ）を灌流した。コーパス環状筋の１．５ｃｍ^２片を切り取り、３７℃で、２つの電極間に、ポリアミドスレッドを用いて、両端から、２０ｍＬの実験用Ｋｒｅｂｓ溶液（ＮａＨＣＯ_３が２０ｍＭである点を除き調製Ｋｒｅｂｓと同一）中の浴槽中へ載せて、カルボゲン（９５％Ｏ_２および５％ＣＯ_２）を用いて連続的に通気した。４５分の平衡期間後、筋肉調製物を電場刺激（ＥＦＳ）により刺激し、バイタリティを試験した。実験的処理と同様にＥＦＳの間の収縮力の変化を力変換器により測定した。任意の処理間のタイムラプスは常に２０分であった。

【0072】

１．８）ウッシングチャンバー
腸管上皮を横切るイオンの動きを、ウッシングチャンバー技術（Ｅａｓｙ ｍｏｕｎｔ ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）および、ＬａｂＣｈａｒｔ ５ソフトウェア（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｐｅｃｈｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。手短には、Ｄｕｎｋｉｎ Ｈａｒｄｌｅｙ モルモット（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ ａｎｄ Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ ＧｍｂＨ，Ｂｏｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の遠位結腸片を切断し、筋肉層を除去し、粘膜／粘膜下組織の調製物を、記録領域０．５ｃｍ^２を有するスライダーに載せた。頂端側および基底側を、５ｍＬのＫｒｅｂｓ溶液中に別々に浸した。実験手順の間、浴槽は３７℃に維持し、カルボゲン（９５％Ｏ_２および５％ＣＯ_２）を用いて連続的に通気した。４５分の平衡期間後、組織を電気刺激して（パラメータ：刺激強度６Ｖ、持続時間１０秒、周波数１０Ｈｚ、単一パルス持続時間０．５ｍｓ）、組織バイタリティを評価した。能動イオン輸送の評価のために、短絡電流（Ｉ_ＳＣ）を適用することにより、組織を横切る受動イオン輸送によって形成される自然発生の経上皮電圧（Ｖ_ＴＥ）を０ｍＶに設定した。能動的な（ａｃｔｉｖｅ）塩化物イオン分泌が誘導されると、Ｖ_ＴＥを０ｍＶに維持するためにＩ_ＳＣの増加が必要であることが分かる。Ｉ_ＳＣの変化は、アニオン分泌またはカチオン吸引により生じる電流に等しい。各実験の最初および最後に組織の経上皮抵抗性（ＴＥＲ＝Ｖ_ＴＥ／Ｉ_ＳＣ×１０００／２）を測定して、組織の完全性を評価した。

【0073】

１．９）統計分析
データを平均値±標準偏差（ＳＤ）として示す。全ての統計的計算は、処理群と、対応するコントロール群とを比較する、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｒを用いて行ない、独立ｔ検定を用いて分析した。様々な処理群と、対応するコントロール群とを比較するデータを、Ｏｎｅ−Ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いて分析し、その後、適切な多重比較の手順を行なった。データが正規分布に従わない、または不連続なデータを含む場合は、ノンパラメトリック検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ／順位和検定、順序に基づく（ｏｎ ｒａｎｋｓ）ＡＮＯＶＡ）を用いた。ｐ値が０．０５未満（^＊）または０．０１未満（^＊＊）である場合に、有意差とみなした。主成分分析（ＰＣＡ）をピアソン，Ｋ（Ｏｎ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌａｎｅｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｅｓｔ Ｆｉｔ ｔｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ Ｐｏｉｎｔｓ ｉｎ Ｓｐａｃｅ，Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ Ｍａｇａｚｉｎｅ（１９０１），２（１１），５５９−５７２、および、Ｔｈｅｏｄｏｒｉｄｉｓ，Ｇ．，Ｇｉｋａ，Ｈ．Ｇ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ｄ．；ＬＣ−ＭＳ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｇｌｏｂａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ／ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ，ＴｒＡＣ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８），２７（３），２５１−２６０）で記載する。

【0074】

２．）結果
２．１）サワードウ、サワードウブレッドおよび類似ブレッド由来の抽出物中の、代謝産物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
サワードウおよび生のサワードウ（ｒａｗ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ）のサワードウブレッドの水可溶性抽出物（＜１０ｋＤａ、トリプリケート）に対する発酵の効果を比較するために、３つの異なるバッチから調製したサワードウブレッドおよび類似ブレッドをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。抽出物中の代謝産物濃度は、公知濃度の代謝産物を有する標準溶液に対する比較により決定した。

【0075】

主成分分析（ＰＣＡ）は、サワードウ、サワードウブレッドおよび類似ブレッドから分離された代謝産物において、有意差を示した（図１）。生のサワードウは、有意により多量のフリーのアミノ酸を有し、内在性の小麦粉の酵素（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｆｌｏｕｒ ｅｎｚｙｍｅ）および乳酸菌プロテアーゼの、タンパク質分解活性を反映する。焼く前に、新しい未発酵の小麦粉をサワードウに添加して、類似ブレッドとサワードウブレッドとの間に、フリーのアミノ酸含有量の違いがない理由を説明する。アセチルコリンは、サワードウおよびサワードウブレッドには一貫して存在するが類似ブレッドには存在しない、代謝産物である（表１）。サワードウ細菌による発酵は、サワードウブレッドと類似ブレッドとの間の唯一の違いであり、アセチルコリンは、サワードウ中に存在する微生物により産生されることを示唆する。

【0076】

【表2】

【0077】

２．２）サワードウ由来のアセチルコリンは、インビトロで筋収縮を引き起こす。
アセチルコリン（ＡＣＨ）は神経伝達物質であり、筋細胞上のムスカリン性（ｍＡＣＨＲ）またはニコチン性ＡＣＨ受容体（ｎＡＣＨＲ）のいずれかを刺激することにより胃腸管内の運動性を活性化するのに関与する。サワードウ由来のアセチルコリンが、この活性を模倣するかどうか判定するために、モルモットの分離したコーパス筋を、サワードウ、サワードウブレッドおよび類似ブレッドの抽出物を用いて刺激し、収縮刺激を測定した。サワードウおよびサワードウ抽出物の両方とも、アセチルコリンと同様に、同等の濃度で筋収縮を誘導したが、類似ブレッド抽出物では誘導しなかった（図２）。アトロピン（ｍＡＣＨＲ特異的アンタゴニスト）を用いて、ムスカリン性またはニコチン性ＡＣＨＲを活性化することにより抽出物が収縮を刺激するかどうか判定した。アトロピンを用いた筋条片の事前処理は、ＡＣＨならびにサワードウおよびサワードウブレッドの抽出物による刺激を完全に無効にし、サワードウ由来のアセチルコリンがｍＡＣＨＲを介して作用していることを示した。

【0078】

さらに、サワードウ由来のＡＣＨが、神経の活性化（その結果として筋細胞を刺激する）を介して作用するかどうかを明確にするために、筋肉調製物をテトロドトキシン（ＴＴＸ）で事前処理した。ＴＴＸは、神経により生じる活動電位を阻害し、下流のシグナル伝達を無効にする。ＴＴＸの事前処理は、アセチルコリンおよび抽出物により誘導される筋収縮に有意な効果がなく、両方とも、筋細胞上のｍＡＣＨＲを直接活性化することを示した（図３）。運動性は、ＧＩ管の極めて重要な機能の一つである。セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）受容体のアゴニストおよびアンタゴニストは、運動性（およびその結果として、ＩＢＳ患者の便通）を調節するための一般的な処置選択肢である（Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ，Ｍ．ａｎｄ Ｖ．Ａｎｄｒｅｓｅｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｒｒｉｔａｂｌｅ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｄｉｇ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ，２００９．４１（１２）：ｐ．８５４−６２）。これらの知見は、局所でのＡＣＨの外部適用を用いてＥＮＳ仲介の運動性を調節することも可能であることを示す。

【0079】

２．３）サワードウ由来のアセチルコリンは、管腔側由来の腸粘膜による分泌を刺激する。
腸神経により腸壁の漿膜側へ放出されるアセチルコリン（ＡＣＨ）は、粘膜による塩化物イオンの分泌を刺激し、続いて、管腔中への水の受動輸送を行なう。この作用は、アセチルコリンエステラーゼによるアセチルコリンの迅速な分解のため一過的である。腸の分泌機能に対するサワードウ由来のＡＣＨの効果を、モルモット結腸において試験した。サワードウ、サワードウブレッド、類似ブレッドの抽出物、ならびに、（純粋な）ＡＣＨを、モルモット遠位結腸由来の腸粘膜／粘膜下組織調製物の、管腔（粘膜）側または漿膜側のいずれかに適用した。実験はウッシングチャンバー内で行ない、短絡電流（Ｉ_ＳＣ）の変化を測定した。このシステムでは、能動イオン輸送のみが測定されるように、調製物にわたって電気的で浸透性の流体静力学的および化学的勾配のバランスを取ることにより、組織または上皮細胞層を横切るイオンの受動流動を除外する。ウッシングチャンバー中で、組織の各側付近に電極を置き、能動イオン輸送の結果として産生される、上皮にわたる自然発生の電位差（ＰＤ）の検出を可能にする（Ｈｉｒｏｔａ，Ｃ．Ｌ．ａｎｄ ＭｃＫａｙ Ｄ．Ｍ．，Ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００６，１４９（５）：ｐ．４６３−７９）。驚くことに、粘膜側および漿膜側からの両方とも、ＡＣＨおよびＡＣＨ含有抽出物（類似ブレッド抽出物は効果がなかった）により調製物を刺激すると、Ｉ_ＳＣの増加が見られ（図４）、サワードウおよびサワードウブレッド中のアセチルコリンは、刺激に適切であることが示された。

【0080】

組織をアトロピンで事前処理し、分泌に対する抽出物の効果を再度測定した（図５）。アトロピンは、応答を完全に無効にして、サワードウ抽出物の分泌促進効果におけるｍＡＣＨＲの役割を確証した。

【0081】

以前の研究は、基底側上の腸上皮細胞におけるＡＣＨＲの発現の証拠を示すが、細胞層の頂端側上ではない（Ｈｉｒｏｔａ，Ｃ．Ｌ．ａｎｄ ＭｃＫａｙ Ｄ．Ｍ．，Ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００６，１４９（５）：ｐ．４６３−７９）。したがって、頂端側から適用されるＡＣＨは、細胞層を横切って、基底側上の受容体を刺激する可能性が高い。この仮説は、ＡＣＨを頂端（すなわち粘膜または管腔側）に適用すると、アトロピンを粘膜側ではなく漿膜側に適用した場合に分泌効果が有意に阻害されるという事実により確認された（図６）。漿膜側に適用したアトロピンは、基底側上の全てのｍＡＣＨＲを阻害し、ＡＣＨ活性を無効にした。しかしながら、アトロピンを粘膜側に適用すると、これは、基底側に到達する量をより少量にして、したがって、部分的にのみＡＣＨ活性を阻害する。アトロピンが上皮層を横切って、基底側のｍＡＣＨＲを阻害することができるという知見は、ＡＣＨを漿膜に、そしてアトロピンを粘膜に適用すると、分泌が阻害されるという事実により確認された（データ示さず）。

【0082】

これらの知見は、局所でＡＣＨの外部適用を用いて、ＥＮＳが仲介する液分泌を調節することもできることを示す。腸内への液分泌は、酵素消化に理想的な環境を提供し、腸管を通した排泄物の通過を促進すると仮定されるので、これは特に重要である。さらに、最近の研究は、急性で局所的に標的化された水分泌が、特定の機械的ストレスの箇所における上皮損傷に対する防護手段としての役割を果たすことを示唆する（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｋ．Ｅ．ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｋｅｅｌｙ，Ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｓｐｅｃｔｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０００．６２：ｐ．５３５−７２、および、Ｓｉｄｈｕ，Ｍ．ａｎｄ Ｈ．Ｊ．Ｃｏｏｋｅ，Ｒｏｌｅ ｆｏｒ ５−ＨＴ ａｎｄ ＡＣｈ ｉｎ ｓｕｂｍｕｃｏｓａｌ ｒｅｆｌｅｘｅｓ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｃｏｌｏｎｉｃ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９５．２６９（３ Ｐｔ １）：ｐ．Ｇ３４６−５１）。

【0083】

２．４）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、サワードウ乳酸菌の増殖培地中の、アセチルコリンの存在を明らかにした。
サワードウから単離したＬ．ｒｏｓｓｉａｅ（ＤＳＭ２６０２４）およびＬ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓの７株（ＤＳＭ２３０９０〜ＤＳＭ２３２０１）、別のサワードウから単離したＬ．ｂｒｅｖｉｓ ３１１３およびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＦＵＡ ３０３８、および、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ（ＶＳＬ＃３）を、ＭＲＳ培地中で２４時間増殖させた。増殖培地を回収して濾過し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。

【0084】

ＰＣＡ分析は、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉと比較して、全てのサワードウ単離細菌の代謝産物プロファイルにおいて有意差を示す。その違いは、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ培地中には存在しないがサワードウ細菌増殖培地中に存在する、アセチルコリンの影響に主に起因する（図７）。２４時間にわたってＡＣＨを最も多く産生するのは、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ３１１３であり、さらに、それは増殖速度が最も高い（図８Ａ）。しかしながら、濃度を細菌数（例えば培地中、１０^６／ｍｌ）に合わせると、Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓＤＳＭ２３０９０株およびＤＳＭ２３０９３株が、細菌細胞あたり最も多くＡＣＨを産生する（図８Ｂ）。

【0085】

２．５）サワードウ乳酸菌は、ＴＮＦ活性化腸上皮細胞によるケモカインＩＰ−１０の分泌を阻害する。
Ｌａｃｔｏｃｅｐｉｎ ＰｒｔＰ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ（ＶＳＬ＃３）で発現されるセリンプロテアーゼ）は、炎症促進性ケモカインインターフェロン誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）を選択的に分解する。ＰｒｔＰが本発明の乳酸菌中にも存在するかどうか調べるために、サワードウ８株：Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ（ＤＳＭ２３０９０、ＤＳＭ２３０９１、ＤＳＭ２３０９２、ＤＳＭ２３０９３、ＤＳＭ２３１７４、ＤＳＭ２３２００、ＤＳＭ２３２０１）およびＬ．ｒｏｓｓｉａｅ（ＤＳＭ２６０２４）、ならびに、陽性コントロールとしてＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉから、全ての細菌ＤＮＡを分離した。Ｌａｃｔｏｃｅｐｉｎ ＰｒｔＰ特異的なプライマーを用いてＤＮＡを増幅し、アガロースゲル上で可視化した。サワードウから単離した乳酸菌中には、検出可能な量のｌａｃｔｏｃｅｐｉｎ ＰｒｔＰ遺伝子は存在しなかった。サワードウ乳酸菌８株およびＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉを、無刺激およびＴＮＦ活性化Ｍｏｄｅ−Ｋ細胞による、炎症促進性ケモカインＩＰ−１０の分泌に対するそれらの効果に関して試験した。興味深いことに、Ｌａｃｔｏｃｅｐｉｎ ＰｒｔＰ遺伝子は検出されなかったという事実にもかかわらず、馴化培地（図９）および固定化乳酸菌（図１０）の両方とも、ＩＰ−１０阻害活性を示した。このことは、サワードウ乳酸菌により産生される、炎症促進性ケモカインＩＰ−１０の分泌を阻害するのに適切な分泌型および細胞表面結合型の両方の因子が存在することを示唆する。この結果は、ＩＢＤ患者において再度押し寄せる腸炎症にＩＰ−１０が関与しているので、ＩＢＤの潜在的な治療およびそれらの症状の軽減の基礎を提供する。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】