特許 6486908 肝細胞増殖因子に結合する設計アンキリン反復タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6486908

(24)【登録日】2019年3月1日

(45)【発行日】2019年3月20日

(54)【発明の名称】肝細胞増殖因子に結合する設計アンキリン反復タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/46 20060101AFI20190311BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20190311BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20190311BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20190311BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190311BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190311BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20190311BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/46ZNA

   C12N15/09 Z

   A61K38/16

   A61K48/00

   A61P43/00 111

   A61P35/00

   A61K31/7088

【請求項の数】21

【全頁数】42

(21)【出願番号】特願2016-516198(P2016-516198)

(86)(22)【出願日】2014年6月2日

(65)【公表番号】特表2016-521688(P2016-521688A)

(43)【公表日】2016年7月25日

(86)【国際出願番号】EP2014061368

(87)【国際公開番号】WO2014191574

(87)【国際公開日】20141204

【審査請求日】2017年4月5日

(31)【優先権主張番号】13170056.9

(32)【優先日】2013年5月31日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】515146556

【氏名又は名称】モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】トレッシュ ガビー

(72)【発明者】

【氏名】バッカー タリッサ

(72)【発明者】

【氏名】フィリップス ダグラス

(72)【発明者】

【氏名】メルツ フリーデル ヴェー

(72)【発明者】

【氏名】ビンツ カスパル ハー

【審査官】 植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５２７８７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０６９５５７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Drug Discov. Today，２００８年，Vol.13, No.15/16，pp.695-701

【文献】 Nat. Biotechnol.，２００４年，Vol.22, No.5，pp.575-582

【文献】 生物学辞典，２０１０年，第1版，第826頁

【文献】 Drug Delivery System，２００５年，Vol.20, No.2，pp.110-117

【文献】 Clin. Cancer Res.，２００８年，Vol.14, No.19，pp.5941-5946

【文献】 J. Mol. Biol.，２００３年，Vol.332，pp.489-503

【文献】 Curr. Opin. Drug Discov. Devel.，２００７年，Vol.10, No.2，pp.153-159

【文献】 J. Mol. Biol.，２００７年，Vol.369，pp.1015-1028

【文献】 J. Biol. Chem.，２００６年，Vol.28, No.46，pp.35167-35175

【文献】 Proc. Natl. Acad. Sci. USA，２００３年，Vol.100, No.4，pp.1700-1705

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アンキリン反復ドメインを含む組換えタンパク質であって、
前記アンキリン反復ドメインが、特異的に、ＨＧＦに結合し、そして、
前記アンキリン反復ドメインが、配列番号３３〜６１のアンキリン反復ドメインの任意の１つと、少なくとも９２％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記アンキリン反復ドメインの１番目のＧおよび／または２番目のＳが欠失していてもよく、そして、
前記アンキリン反復ドメインの末端から２番目のＬおよび／または末端のＮがＡと置換されていてもよい、組換えタンパク質。

【請求項2】

請求項１に記載の組換えタンパク質であって、
前記アンキリン反復ドメインが、
（１）配列番号１８〜２１；および
（２）配列番号１８〜２１の２個までのアミノ酸が、任意のアミノ酸に置換された配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、アンキリン反復モジュールを含む、組換えタンパク質。

【請求項3】

請求項１に記載の組換えタンパク質であって、
前記アンキリン反復ドメインが、
（１）ＫＤＲＹＧＤＴＰＬＨＬＡＡＤＩＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１８）、および、
（２）配列番号１８の２個までのアミノ酸が、任意のアミノ酸に置換された配列
からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する、アンキリン反復モジュールを含み、そして、
１番目のＫが、Ｑ、Ｈ、Ｉ、Ｖと置換されていてもよく、
３番目のＲが、Ａ、ＴまたはＮと置換されていてもよく、
４番目のＹが、ＦまたはＷと置換されていてもよく、
６番目のＤが、Ｎと置換されていてもよく、
１４番目のＤが、Ｓと置換されていてもよく、
１５番目のＩが、ＹまたはＡと置換されていてもよく、そして
１９番目のＥが、Ｋと置換されていてもよい、
組換えタンパク質。

【請求項4】

請求項１に記載の組換えタンパク質であって、
前記アンキリン反復ドメインが、
（１）ＥＤＹＦＧＮＴＰＬＨＬＡＡＳＹＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１９）、および、
（２）配列番号１９の２個までのアミノ酸が、任意のアミノ酸に置換された配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、アンキリン反復モジュールを含み、そして、
１番目のＥが、Ｄ、Ｆ、Ａ、またはＬと置換されていてもよく、
３番目のＹが、Ｗ、Ｓ、またはＶと置換されていてもよく、
４番目のＦが、Ｙと置換されていてもよく、
６番目のＮが、Ｄと置換されていてもよく、
１５番目のＹが、Ｍ、Ｌ、Ｓ、またはＡと置換されていてもよい、組換えタンパク質。

【請求項5】

請求項１に記載の組換えタンパク質であって、
前記アンキリン反復ドメインが、
（１）ＫＤＤＹＧＮＴＰＬＨＬＡＡＮＴＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号２０）、および、
（２）配列番号２０の２個までのアミノ酸が、任意のアミノ酸に置換された配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、アンキリン反復モジュールを含み、そして、
１番目のＫが、Ｍ、Ｄ、Ｌ、Ｑ、またはＶと置換されていてもよく、
３番目のＤが、Ｙ、またはＴと置換されていてもよく、
４番目のＹが、Ａ、またはＮと置換されていてもよく、
１５番目のＴが、Ｓと置換されていてもよく、
１７番目のＨが、Ｒと置換されていてもよく、および
１９番目のＥが、Ｋと置換されていてもよい、組換えタンパク質。

【請求項6】

請求項１に記載の組換えタンパク質であって、
前記アンキリン反復ドメインが、
（１）ＫＤＲＹＧＤＴＰＬＨＬＡＡＤＩＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１８）および
（２）配列番号１８の９個までのアミノ酸が、任意のアミノ酸に置換された配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、アンキリン反復モジュールを含み、そして、
１番目のＫが、Ｑ、Ｈ、Ｉ、Ｖと置換されていてもよく、
３番目のＲが、Ａ、ＴまたはＮと置換されていてもよく、
４番目のＹが、ＦまたはＷと置換されていてもよく、
６番目のＤが、Ｎと置換されていてもよく、
１４番目のＤが、Ｓと置換されていてもよく、
１５番目のＩが、ＹまたはＡと置換されていてもよく、そして
１９番目のＥが、Ｋと置換されていてもよく、そして、
前記アンキリン反復ドメインが、さらに、
（１）ＥＤＹＦＧＮＴＰＬＨＬＡＡＳＹＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１９）および
（２）配列番号１９の９個までのアミノ酸が、任意のアミノ酸に置換された配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、アンキリン反復モジュールを含み、そして、
１番目のＥが、Ｄ、Ｆ、Ａ、またはＬと置換されていてもよく、
３番目のＹが、Ｗ、Ｓ、またはＶと置換されていてもよく、
４番目のＦが、Ｙと置換されていてもよく、
６番目のＮが、Ｄと置換されていてもよく、
１５番目のＹが、Ｍ、Ｌ、Ｓ、またはＡと置換されていてもよい、組換えタンパク質。

【請求項7】

請求項１に記載の組換えタンパク質であって、
前記アンキリン反復ドメインが、配列番号３３〜６１のアンキリン反復ドメインの任意の１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記アンキリン反復ドメインの１番目のＧおよび／または２番目のＳが欠失していてもよく、そして、
前記アンキリン反復ドメインの末端から２番目のＬおよび／または末端のＮが、Ａと置換されていてもよい、組換えタンパク質。

【請求項8】

請求項１に記載の組換えタンパク質であって、
前記アンキリン反復ドメインが、配列番号５１のアンキリン反復ドメインと少なくとも９２％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記アンキリン反復ドメインの１番目のＧおよび／または２番目のＳが欠失していてもよく、そして、
前記アンキリン反復ドメインの末端から２番目のＬおよび／または末端のＮがＡと置換されていてもよい、組換えタンパク質。

【請求項9】

請求項１に記載の組換えタンパク質であって、
前記アンキリン反復ドメインが、配列番号３３〜６１からなる群から選択され、
前記アンキリン反復ドメインの１番目のＧおよび／または２番目のＳが欠失していてもよく、そして、前記アンキリン反復ドメインの末端から２番目のＬおよび／または末端のＮが、Ａと置換されていてもよい、組換えタンパク質。

【請求項10】

請求項１に記載の組換えタンパク質であって、
前記アンキリン反復ドメインが、配列番号３３〜６１のアンキリン反復ドメインの任意の１つと少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記アンキリン反復ドメインの１番目のＧおよび／または２番目のＳが欠失していてもよく、そして、
前記アンキリン反復ドメインの末端から２番目のＬおよび／または末端のＮが、Ａと置換されていてもよい、組換えタンパク質。

【請求項11】

アンキリン反復ドメインを含む、組換えタンパク質であって、
前記アンキリン反復ドメインは、ＨＧＦに対する結合特異性を有し、そして、
前記アンキリン反復ドメインが、配列番号５１のアミノ酸配列を有し、
前記アンキリン反復ドメインの１番目のＧおよび／または２番目のＳが欠失していてもよく、そして、
前記アンキリン反復ドメインの末端から２番目のＬおよび／または末端のＮが、Ａと置換されていてもよい、組換えタンパク質。

【請求項12】

アンキリン反復ドメインを含む、組換えタンパク質であって、
前記アンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中でＨＧＦに結合し、そして、
前記アンキリン反復ドメインは、
（１）ＫＤＲＹＧＤＴＰＬＨＬＡＡＤＩＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１８）、および、
（２）配列番号１８の９個までのアミノ酸が、他のアミノ酸に置換された配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、第一のアンキリン反復モジュールを含み、そして、
１番目のＫが、Ｑ、Ｈ、Ｉ、Ｖと置換されていてもよく、
３番目のＲが、Ａ、ＴまたはＮと置換されていてもよく、
４番目のＹが、ＦまたはＷと置換されていてもよく、
６番目のＤが、Ｎと置換されていてもよく、
１４番目のＤが、Ｓと置換されていてもよく、
１５番目のＩが、ＹまたはＡと置換されていてもよく、および
１９番目のＥが、Ｋと置換されていてもよく、そして、
前記アンキリン反復ドメインは、さらに、
（１）ＥＤＹＦＧＮＴＰＬＨＬＡＡＳＹＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１９）、および、
（２）配列番号１９の９個までのアミノ酸が、他のアミノ酸に置換された配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、第二のアンキリン反復モジュールを含み、そして、
１番目のＥが、Ｄ、Ｆ、Ａ、またはＬと置換されていてもよく、
３番目のＹが、Ｗ、Ｓ、またはＶと置換されていてもよく、
４番目のＦが、Ｙと置換されていてもよく、
６番目のＮが、Ｄと置換されていてもよく、そして
１５番目のＹが、Ｍ、Ｌ、Ｓ、またはＡと置換されていてもよく、そして、
前記アンキリン反復ドメインは、さらに
（１）ＫＤＤＹＧＮＴＰＬＨＬＡＡＮＴＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号２０）、および、
（２）配列番号２０の９個までのアミノ酸が、他のアミノ酸に置換された配列、
からなる群より選択される、アンキリン反復配列を有する、第三のアンキリン反復モジュールを含み、そして、
１番目のＫが、Ｍ、Ｄ、Ｌ、Ｑ、またはＶと置換されていてもよく、
３番目のＤが、Ｙ、またはＴと置換されていてもよく、
４番目のＹが、Ａ、またはＮと置換されていてもよく、
１５番目のＴが、Ｓと置換されていてもよく、
１７番目のＨが、Ｒと置換されていてもよく、および
１９番目のＥが、Ｋと置換されていてもよく、そして、
前記第二のアンキリン反復モジュールは、前記アンキリン反復ドメイン中の前記第一のアンキリン反復モジュールに直接続き、そして、前記第三のアンキリン反復モジュールは、前記アンキリン反復ドメイン中で、前記第二のアンキリン反復モジュールに直接続く、
組換えタンパク質。

【請求項13】

配列番号１２〜２５および３３〜６２の配列のいずれか１つのペプチドを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の、組換えタンパク質。

【請求項14】

前記アンキリン反復ドメインが、１０^−７Ｍ未満の乖離常数（ＫＤ）を有する、ＰＢＳ中でＨＧＦに結合する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。

【請求項15】

請求項１〜１４のいずれか１項に記載の、組換えタンパク質をコードする核酸。

【請求項16】

請求項１〜１４のいずれか１項に記載の、組換えタンパク質、または請求項１５の核酸、および薬学上許容される担体および／または希釈剤を含む医薬組成物。

【請求項17】

癌、血管障害、または病的血管新生から選択される疾患の治療のための、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺高血圧、炎症性関節疾患、眼疾患、網膜疾患、および線維性疾患から選択される疾患の治療のための、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項19】

癌が、神経膠腫、肉腫、骨肉腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、上皮癌および骨転移から選択される、癌の治療のための、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項20】

多発性骨髄腫の治療のための、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項21】

上皮癌の治療のための、請求項１６に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）への結合特異性を持つ設計アンキリン反復タンパク質ならびにそのようなＨＧＦ結合タンパク質をコードしている核酸、そのようなタンパク質を含んでいる医薬組成物および疾患の治療におけるそのようなタンパク質の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＭＥＴ癌原遺伝子は、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ；ヒトＨＧＦＲのユニプロットＫＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）／スイスプロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）番号はＰ０８５８１である）としても知られている胚発生および創傷治癒に必須の受容体チロシンキナーゼ（ＭＥＴまたはｃ−Ｍｅｔ）をコードしている。肝細胞増殖因子（ＨＧＦは分散因子としても知られ、ヒトＨＧＦのユニプロットＫＢ／スイスプロット番号はＰ１４２１０であるは）は唯一知られているｃ−Ｍｅｔのリガンドである。受容体は通常上皮由来の細胞によって発現されるが、ＨＧＦの発現は間葉由来の細胞に限定される。ＨＧＦによって刺激されると、ｃ−Ｍｅｔはいくつかの生体反応を誘導し、これらの反応は共に、浸潤性増殖として知られるプログラムを引き起こす。癌における異常なｃ−Ｍｅｔ活性化は予後不良に関連しており、異常に活性化したｃ−Ｍｅｔは腫瘍の成長、腫瘍細胞の生存、血管形成および転移を引き起こす。ｃ−Ｍｅｔは腎臓癌、肝臓癌、胃癌、乳癌および脳腫瘍など多種のヒト悪性腫瘍で脱制御されており、他の標的療法への耐性を引き起こす主要因である（ボッタロＤ．Ｐ．、ルビンＪ．Ｓ．、ファレットＤ．Ｌ．、チャンＡ．Ｍ．、クミシックＴ．Ｅ．、ヴァンデウーデＧ．Ｆ．およびアーロンソンＳ．Ａ．、サイエンス２５１（４９９５）、８０２〜８０４、１９９１；コモグリオＰ．Ｍ、ジョルダーノＳ．およびトルソリーノＬ．、ネイチャー・レビュー・ドラッグディスカバリー（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．）７（６）、５０４〜５１６、２００８）。

【0003】

ＨＧＦは単一の不活化一本鎖前駆体ポリペプチド（ｓｃ−ＨＧＦ；ｐｒｏ−ＨＧＦと呼ぶ場合もある）として分泌され、セリンプロテアーゼによって６９ｋＤａのアルファ鎖と３４ｋＤａのベータ鎖に切断される。活性型ＨＧＦは、ジスルフィド結合したアルファとベータ鎖からなるヘテロ二量体である。ＨＧＦはアルファ鎖がプラスミノゲン様の「クリングル」構造モチーフを含み、かつ、ベータ鎖がセリンプロテアーゼに相同するドメインを含むが酵素力は持っていないという点で凝固因子との相同性が高い（ナルディニＬ．、ヴァイドナーＫ．Ｍ．、ヴィグナＥ．、ガウディノＧ．、ヴァルデリＡ．、ポンツェットＣ．、ナーシマンＲ．Ｐ．、ハートマンＧ．、ツァルネガーＲ．、ミカロポロスＧ．Ｋ．ら、欧州分子生物学機構雑誌（ＥＭＢＯ Ｊ）１０、２８６７−２８７８、１９９１）。

【0004】

ＨＧＦはその受容体に結合することによって、種々の細胞型の分散、細管および内腔の形成、上皮間充織転換、血管形成、肝再生、創傷治癒、および胚発生などの複数の細胞応答に介在する。ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路が種々の疾患の一因となることも知られており、多くのヒト固形腫瘍において腫瘍成長、浸潤、および転移に関わっている。ヒトの癌では、ＨＧＦによるｃ−Ｍｅｔの傍分泌および自己分泌型の活性化ともに、腫瘍におけるこれら分子の発現量および血中ＨＧＦ濃度の上昇が予後不良および腫瘍転移リスクの増加に関わるとされている（コモグリオら、２００８、前掲文献）。

【0005】

癌および他の疾患の発展にＨＧＦが積極的に関わっていることから、ＨＧＦの活性化を阻止する薬剤がこの影響を弱めるのに有用な可能性がある。現時点では、種々の抗ＨＧＦ（ａＨＧＦ）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、例えばＡＭＧ１０２（すなわちリロツムマブ）、アムジェン社によるヒト化抗ヒトＨＧＦ ＩｇＧ２、シェリング／アヴェオ（Ａｖｅｏ）のＡＶ−２９９、およびミレニアム社のＴＡＫ−７０１などが臨床開発中である。

【0006】

抗体以外にも、標的分子に特異的に結合させるために使用することができ、その結果、拮抗剤として作用する新規な結合タンパク質または結合ドメインがある（例えばビンズＨ．Ｋ．、アムシュトゥッツＰ．およびプルクスンＡ．、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）２３、１２５７〜１２６８、２００５）。Ｆｃをもたないそのような結合タンパク質または結合ドメインの新規な分類の１つに、設計反復タンパク質または設計反復ドメインに基づくものがある（国際公開第２００２／０２０５６５号；ビンズＨ．Ｋ．、アムシュトゥッツＰ．、コールＡ．、ストゥンプＭ．Ｔ．、ブリヨンＣ．、フォアーＰ．、グルッターＭ．Ｇ．、およびプルクスンＡ．、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）２２、５７５〜５８２、２００４；ストゥンプＭ．Ｔ．、ビンズＨ．ＫおよびアムシュトゥッツＰ．、ドラッグ・ディスカバリー・トゥデイ（Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ）１３，６９５〜７０１，２００８）。国際公開第２００２／０２０５６５号に、反復タンパク質の大規模なライブラリーを構築する方法と、それらの一般的な用途についてとが記載されている。しかし、国際公開第２００２／０２０５６５号にはＨＧＦに対する結合特異性を有する反復ドメインの選抜は開示されておらず、ＨＧＦに特異的に結合する反復ドメインの反復モジュールまたは反復配列モチーフの具体例も開示されていない。さらに国際公開第２００２／０２０５６５号では、ＨＧＦに対する結合特異性を有する反復ドメインを使ってＨＧＦ介在性のシグナル伝達経路を制御し、疾患の治療を成功させることの可能性については示唆されていない。そのような設計反復ドメインは反復タンパク質の構成単位（モジュール）としての性質を利用するもので、また、ドメインの疎水性コアを遮蔽することで設計反復ドメイン同士が凝集するのを防ぐＮ末端およびＣ末端キャッピングモジュールを有する場合がある（フォアーＰ．、ストゥンプＭ．Ｔ．、ビンズＨ．Ｋ．およびプルクスンＡ．、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９、２〜６、２００３）。

【0007】

本発明の根底にある技術的課題は、ＨＧＦに対する結合特異性を有する新規な結合タンパク質（例えばアンキリン反復タンパク質またはドメインなど）の同定によってＨＧＦ介在性シグナル伝達経路を制御し、特定の癌、血管障害、血管形成に関連した疾患およびその他の病理学的状態の治療を改善することである。この技術的課題は特許請求の範囲に特徴付けられる態様の提供によって解決することができる。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、ＰＢＳ中でＨＧＦに１０⁷Ｍ未満のＫｄで結合するアンキリン反復ドメインを少なくとも１つ含む組換え結合タンパク質に関する。

【0009】

本発明はより詳細には、配列番号３３〜６１からなる群から選択されるアンキリン反復ドメインのＨＧＦとの結合に競合するアンキリン反復ドメインを少なくとも１つ含む組換え結合タンパク質に関する。

【0010】

本発明はさらに、ＨＧＦに対する結合特異性を有し、配列番号１２〜２５からなる群より選択されるアミノ酸配列および配列番号１２〜２５の９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられた配列を有するアンキリン反復モジュールを有するアンキリン反復ドメインを少なくとも１つ含む組換え結合タンパク質に関する。

【0011】

本発明は特に、アンキリン反復ドメインを少なくとも１つ含む組換え結合タンパク質に関し、前記アンキリン反復ドメインは配列番号３３〜６１からなる群より選択される１つのアンキリン反復ドメインと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記アンキリン反復ドメインの１番目のＧおよび／または２番目のＳは欠失していてもよく、前記アンキリン反復ドメインの最後尾から２番目のＬおよび／または末端のＮはＡと交換されていてもよい。

【0012】

本発明は具体的には、配列番号１２〜２５および３３〜６２のいずれか１つの配列のペプチドを含む組換えＨＧＦ結合タンパク質に関する。

【0013】

本発明はさらに、本発明の結合タンパク質をコードする核酸分子、および前述の結合タンパク質または核酸分子を１つ以上含む医薬組成物に関する。

【0014】

本発明はさらに、本発明の結合タンパク質を使った病理学的状態の治療方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】選抜されたＤＡＲＰｉｎの表面プラズモン共鳴解析。ＨＧＦに結合するＤＡＲＰｉｎ（ＤＡＲＰｉｎ＃５１を例に挙げる）の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析による解析。ヒトＨＧＦを固定したフローセルに様々な濃度（１．６、３．１、６．３、１２．５および２５ｎＭ）のＤＡＲＰｉｎを１２０秒間入れた後、緩衝液で洗浄した。追跡結果の大域的（グローバル）フィッティングの結果、ＤＡＲＰｉｎ＃５１とヒトＨＧＦとの相互作用のＫｄ値は５１ｐＭであった。ＲＵはレゾナンスユニット（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔ）を示し、ｓは時間（秒）を示す。ＤＡＲＰｉｎ＃５１の定義については下記参照のこと。

【図2】競合的表面プラズモン共鳴解析。ヒトＨＧＦに結合するＤＡＲＰｉｎ（ＤＡＲＰｉｎ＃５１、ＤＡＲＰｉｎ＃５７およびＤＡＲＰｉｎ＃４３を例に挙げる）のＳＰＲ解析。ヒトＨＧＦを固定したフローセルに１００ｎＭのＤＡＲＰｉｎ＃５１（すなわちＤ１）を１２０秒間入れた後、１００ｎＭの第２のＤＡＲＰｉｎ（ＤＡＲＰｉｎ＃５７またはＤＡＲＰｉｎ＃３３のいずれか、すなわちＤ２またはＤ３）を６０秒間注入した。したがって、Ｄ１およびＤ３はＨＧＦとの結合に関して競合し、Ｄ１およびＤ２はＨＧＦとの結合に競合しない。ＲＵはレゾナンスユニット、ｓは時間（秒）、Ｄ１はＤＡＲＰｉｎ＃５１、Ｄ２はＤＡＲＰｉｎ＃５７、Ｄ３はＤＡＲＰｉｎ＃３３を示す。ＤＡＲＰｉｎ＃５１、ＤＡＲＰｉｎ＃５７、およびＤＡＲＰｉｎ＃４３の定義については下記参照のこと。

【図3】ＨＧＦ刺激性ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害。ヒトＨＧＦに対する特異性を有する様々な濃度のＤＡＲＰｉｎ（ＤＡＲＰｉｎ＃４２および＃４８を例に挙げる）による、Ａ５４９細胞のＨＧＦ刺激性ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害、および対応するあてはめた阻害曲線を示す。ＤＡＲＰｉｎ＃４２のＩＣ₅₀値は０．３２ｎＭ、ＤＡＲＰｉｎ＃４８のＩＣ₅₀値は０．１ｎＭと決定した。ＯＤは４５０〜６２０ｎｍの光学濃度、ＣはＤＡＲＰｉｎの濃度（ｎＭ）、Ｄ１はＤＡＲＰｉｎ＃４８、Ｄ２はＤＡＲＰｉｎ＃４２、ＭＡは最大活性、ＭＩは最小活性を示す。Ｘ軸は対数で表される。ＤＡＲＰｉｎ＃５２およびＤＡＲＰｉｎ＃４８の定義については下記参照のこと。

【図4】Ｕ８７細胞の増殖阻害。ＨＧＦに対する特異性を有する様々な濃度のＤＡＲＰｉｎ（ＤＡＲＰｉｎ＃５１および＃４３によって例示される）によるＵ８７膠芽腫細胞の増殖の阻害および対応するあてはめた阻害曲線を示す。ＤＡＲＰｉｎ＃４３のＩＣ₅₀値は７２ｎＭ、ＤＡＲＰｉｎ＃５１のＩＣ₅₀値は１１６ｎＭと決定した。ＯＤは４５０〜６２０ｎｍの光学濃度、ＣはＤＡＲＰｉｎの濃度（ｎＭ）、Ｄ１はＤＡＲＰｉｎ＃５１、Ｄ２はＤＡＲＰｉｎ＃４３を示す。Ｘ軸は対数で表される。ＤＡＲＰｉｎ＃５１およびＤＡＲＰｉｎ＃４３の定義については下記参照のこと。

【図5】ｃ−Ｍｅｔ競合アッセイ。それぞれ個別の単独実験に関して、ヒトＨＧＦに対する特異性を有する様々な濃度のＤＡＲＰｉｎによるＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとの結合の阻害と、対応するあてはめた阻害曲線を示す。その後、ＤＡＲＰｉｎ＃４３のＩＣ₅₀値は約１．３６ｎＭ、ＤＡＲＰｉｎ＃５１のＩＣ₅₀値は約０．６２ｎＭと計算された。ＯＤは４５０〜６２０ｎｍの光学濃度、ＣはＤＡＲＰｉｎの濃度（ｎＭ）、Ｄ１はＤＡＲＰｉｎ＃５１、Ｄ２はＤＡＲＰｉｎ＃４３を示す。Ｘ軸は対数で表される。ＤＡＲＰｉｎ＃５１およびＤＡＲＰｉｎ＃４３の定義については下記参照のこと。

【図6】Ｕ８７腫瘍異種移植モデルにおける抗ＨＧＦ ＤＡＲＰｉｎ対溶媒の効力。Ｕ８７−ＭＧ腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注入した。腫瘍が成長した動物を無作為に４群に分け、異なる濃度のペグ化ＤＡＲＰｉｎで治療した（週に３回静脈内注入し、合計７回、動物への投与を行った）。ペグ化ＤＡＲＰｉｎは実施例６に記載のように生成した。 Ｔは腫瘍の体積（ｍｍ³）、ｄは時間（日）、Ｖは溶媒（すなわちＰＢＳ）、Ｄ１はペグ化ＤＡＲＰｉｎ＃６２（一回あたりの投与量０．１１ｍｇ／ｋｇ）、Ｄ２はペグ化ＤＡＲＰｉｎ＃６２（一回あたりの投与量１．１ｍｇ／ｋｇ）、Ｄ３はペグ化ＤＡＲＰｉｎ＃６２（一回あたりの投与量１１ｍｇ／ｋｇ）を示す。

【図7】配列番号１２〜２８の配列を整列させたもの。配列番号１２〜２８を残基の位置に応じて整列させた。一番上にアンキリン反復残基の位置を記す。２、５、７〜１３番目および１６〜３３番目の残基は一般的に骨格残基を含む位置に対応する。１、３、４、６、１４、および１５番目の残基は標的相互作用残基を含みうる位置に対応する。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明による組換え結合タンパク質またはドメインは哺乳類のＨＧＦに特異的なものである。本発明による組換え結合ドメインはマウス、ラット、イヌ、ウサギ、サル、またはヒト由来のＨＧＦに特異的なものであることが好ましく、本発明による組換え結合ドメインはヒト由来のＨＧＦに特異的なものであることがさらに好ましい。

【0017】

「タンパク質」という用語はポリペプチドを指し、ここでそのポリペプチドの少なくとも一部は、規定された三次元配置を有するか、またはそのポリペプチド鎖の中におよび／またはそのポリペプチド鎖の間に二次、三次、もしくは四次構造を形成することで、規定された三次元配置を獲得することができる。あるタンパク質が２つ以上のポリペプチドを含む場合、個々のポリペプチド鎖は非共有的にまたは共有的に、例えば２つのポリペプチド間のジスルフィド結合によって結合されている場合がある。個別に規定された三次元配置を有するか、または二次もしくは三次構造を形成することで規定された三次元配置を獲得することができるタンパク質の一部分は「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。このようなタンパク質またはタンパク質ドメインは当業者によく知られている。

【0018】

組換えタンパク質、組換えタンパク質ドメイン、組換え結合タンパク質などに関して使用される「組換え」という用語は、前記ポリペプチドが、関連分野の当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を用いて生産されたものであることを意味している。例えば、ポリペプチドをコードしている組換えＤＮＡ分子（例えば遺伝子合成によって生成された分子）を、細菌性の発現プラスミド（例えばｐＱＥ３０、キアゲン）、酵母の発現プラスミドまたは哺乳類の発現プラスミドにクローニングすることができる。例えば、構築したそのような組換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば大腸菌）に挿入すると、この細菌はこの組換えＤＮＡによってコードされているポリペプチドを生産することができる。このようにして生産されたポリペプチドは組換えポリペプチドと呼ばれる。

【0019】

本発明において「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合で繋がれた複数の、すなわち２個以上のアミノ酸を含む１本以上の鎖からなる分子に関する。ポリペプチドは、ペプチド結合によって繋がれた９個以上のアミノ酸からなることが好ましい。

【0020】

「ポリペプチドタグ」という用語はポリペプチド／タンパク質に付加されたアミノ酸配列を指し、ここで前記アミノ酸配列は、精製、検出もしくは前記ポリペプチド／タンパク質の標的化に有用なアミノ酸配列であるか、そのポリペプチド／タンパク質の物理化学的な挙動を改善するアミノ酸配列であるか、またはエフェクター機能を有するアミノ酸配列である。結合タンパク質のそれぞれのポリペプチドタグ、部分および／またはドメインは、直接またはポリペプチドリンカーを介して互いに連結していてもよい。これらのポリペプチドタグは当該分野でよく知られており、当業者であれば十分に利用できる。ポリペプチドタグの例としては、ヒス（Ｈｉｓ、例えば配列番号９のヒスタグ）、ミック（ｍｙｃ）、フラグ（ＦＬＡＧ）、またはストレプ（Ｓｔｒｅｐ）タグなどの短いポリペプチド配列、または前記ポリペプチド／タンパク質の検出を可能にする酵素（例えばアルカリホスファターゼのような酵素）などの部分、もしくは標的化するのに使用できる部分（例えば免疫グロブリンまたはその断片）および／またはエフェクター分子として使用できる部分がある。

【0021】

「ポリペプチドリンカー」という用語は、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインとポリエチレングリコールなどの非ポリペプチド部分、または２つの配列タグを繋ぐことができるアミノ酸配列を指す。そのような付加的なドメイン、タグ、非ポリペプチド部分およびリンカーは、関連分野の当業者に知られている。例を一覧にしたものが、特許出願国際公開第２００２／０２０５６５号の明細書中に示されている。そのようなリンカーの具体例としては、様々な長さのグリシン−セリン−リンカーやプロリン−トレオニン−リンカーがあり、好ましくは、前記リンカーの長さは２〜２４アミノ酸、より好ましくは前記リンカーの長さは２〜１６アミノ酸である。グリシン−セリン−リンカーの例を配列番号１０に、およびプロリン−トレオニン−リンカーの例を配列番号１１に示す。配列番号１１のプロリン−トレオニン−リンカーの前および／または後にＧＳがあることが好ましい。

【0022】

「ポリマー部分」という用語は、タンパク質性のポリマー部分または非タンパク質性のポリマー部分のいずれかを指す。「タンパク質性のポリマー部分」は、安定な三次構造をとらないポリペプチドであることが好ましい。タンパク質性のポリマー部分の例としては、ＸＴＥＮ（登録商標）（アムニクス（Ａｍｕｎｉｘ）の登録商標；国際公開第２００７／１０３５１５号）ポリペプチド、または国際公開第２００８／１５５１３４号に記載されている、プロリン、アラニンおよびセリン残基を含んでいるポリペプチドが挙げられる。そのようなタンパク質性のポリマー部分を、例えば、標準的なＤＮＡクローニング技術によって遺伝的に融合させたポリペプチドを生成し、その後、それらを標準的に発現・精製することで、本発明の結合ドメインに共有結合することができる。「非タンパク質性のポリマー部分」とは、ポリペプチドから構成されていないポリマー部分である。非タンパク質性ポリマー部分の例としては、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンが挙げられる。「ペグ化」という用語は、ペグ（ＰＥＧ）部分が、例えば本発明のポリペプチドに共有結合していることを意味する。本発明のポリマー部分の分子量は大きく変わり得る。前記ポリマー部分がポリペプチドリンカーによって結合ドメインに連結されていることが好ましい。

【0023】

具体的な態様では、ペグ部分または他の任意の非タンパク性ポリマーを、例えば本明細書に記載するように、システインがペプチドリンカーを介して結合ドメインのＮ末端またはＣ末端に結合している状態で、マレイミドリンカーを介してシステインチオールに結合させることができる。

【0024】

「結合タンパク質」という用語は、さらに詳しく後述するように、１つ以上の結合ドメイン、１つ以上の生理活性化合物および１つ以上のポリマー部分を含んでいるタンパク質を指す。好ましくは、前記結合タンパク質は４つまでの結合ドメインを含む。さらに好ましくは、前記結合タンパク質は２つまでの結合ドメインを含む。最も好ましくは、前記結合タンパク質は結合ドメインを１つだけ含む。さらに、そのような結合タンパク質はいずれも、結合ドメインではない付加的なタンパク質ドメイン、多量体化部分、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカーおよび／または１つ以上のシステイン残基を含む場合がある。多量体化部分の例としては、対合して機能性の免疫グロブリンＦｃドメインとなる免疫グロブリンの重鎖定常領域およびロイシンジッパーまたは遊離チオールを含んでいるポリペプチド（遊離チオールは、２つのそのようなポリペプチド間の分子間ジスルフィド結合を形成する）が挙げられる。ポリペプチドに他の部分を抱合させるために、例えば、当業者に公知のマレイミド化学によって抱合させるために、システイン残基を１つ使用することもできる。好ましくは、前記結合タンパク質は組換え結合タンパク質である。また好ましくは、結合タンパク質の結合ドメインは異なる標的特異性を有する。

【0025】

「生理活性化合物」という用語は、疾患を患っている哺乳動物に使用したときに、前記疾患の性質を部分的に変化させる化合物を指す。生理活性化合物は拮抗的な性質または作用性の性質を有していてもよく、また、タンパク質性の生理活性化合物である場合もまたは非タンパク質性の生理活性化合物である場合もある。そのようなタンパク質性の生理活性化合物を、例えば、標準的なＤＮＡクローニング技術によって遺伝的に融合させたポリペプチドを生成し、その後、それらを標準的に発現・精製することで、本発明の結合ドメインに共有結合することができる。そのような非タンパク質性の生理活性化合物を、例えば、化学的な手段によって、例えば本明細書に記載するように、マレイミドリンカーを介してシステインチオールに結合させることで、ペプチドリンカーを介してシステインが結合ドメインのＮ末端またはＣ末端に結合している状態で、本発明の結合ドメインに共有結合することができる。タンパク質性の生理活性化合物の例としては、別個の標的特異性を有する結合ドメイン（例えば、成長因子に結合することでそれを中和する）、サイトカイン（例えばインターロイキン）、成長因子（例えばヒト成長ホルモン）、抗体およびその断片、ホルモン（例えばＧＬＰ−１）、毒物（例えば緑膿菌外毒素Ａ）、ならびに生産可能なあらゆるタンパク質性の薬剤が挙げられる。非タンパク質性の生理活性化合物の例には、毒物（例えばイムノゲン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）社のＤＭ１）、ＧＰＣＲを標的とする低分子、抗生物質および生産可能なあらゆる非タンパク質性の薬剤がある。

【0026】

「結合ドメイン」という用語は、以後で定義するように、タンパク質足場と同じ「折り畳み構造」（三次元の配置）を示し、予め決められた特性を有するタンパク質ドメインを意味する。このような結合ドメインは合理的に、最も一般的なところでは、当該分野で公知のコンビナトリアルなタンパク質改変技術によって得ることができる（ビンズら、２００５、前掲文献）。例えば、予め決められた特性を有する結合ドメインは、（ａ）以後でさらに定義するタンパク質足場と同じ折り畳み構造を示すタンパク質ドメインの多様なコレクションを提供する工程；および（ｂ）前記予め決められた特性を有する少なくとも１つのタンパク質ドメインを得るために、前記多様なコレクションをスクリーニングする工程および／または前記予め決められた特性を有する少なくとも１つのタンパク質ドメインを前記多様なコレクションから選抜する工程、を含む方法によって得ることができる。タンパク質ドメインの多様なコレクションは、使用されるスクリーニングおよび／または選抜の系に応じて複数の方法によって提供することができ、また、ファージディスプレーまたはリボソームディスプレーなどの当業者に公知の方法の使用が含まれ得る。好ましくは、前記結合ドメインは組換え結合ドメインである。

【0027】

「タンパク質足場」という用語は、アミノ酸の挿入、置換または欠失を多く許容することができる露出した表面を有するタンパク質を意味する。本発明の結合ドメインの生成に用いることができるタンパク質足場の例としては、抗体またはその断片（１本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片など）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡ、オオモンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）由来のビリン結合タンパク質もしくは他のリポカリン類、アンキリン反復タンパク質もしくは他の反復タンパク質類、およびヒトのフィブロネクチンがある。タンパク質足場は当業者に知られている（ビンズら、２００５、前掲文献；ビンズら、２００４、前掲文献）。

【0028】

「標的」という用語は、核酸分子、ポリペプチドもしくはタンパク質、炭水化物または他のあらゆる天然に存在する分子などの個々の分子およびそのような個々の分子の一部、または２つ以上のそのような分子の複合体を指す。標的は細胞全体または組織試料であってもよく、または標的は任意の非天然の分子もしくは部分であってもよい。好ましくは、標的は、天然に存在するもしくは非天然のポリペプチドであるか、あるいは化学修飾、例えば天然のもしくは非天然のリン酸化、アセチル化、またはメチル化による修飾を含有しているポリペプチドである。本発明の特定の用途では、標的はＨＧＦである。

【0029】

「予め決められた特性」という用語は、標的との結合、標的の遮断、標的介在性反応の活性化、酵素活性、および関連するさらなる特性などの特性を指す。所望される特性の種類によって、当業者は、所望の特性を有する結合ドメインのスクリーニングおよび／または選抜を実施するための形式およびその実施に必要な工程を確認することができる。好ましくは、前記予め決められた特性は標的との結合である。

【0030】

以降の反復タンパク質に関する定義は、特許出願の国際公開第２００２／０２０５６５号に記載されている定義に基づくものである。特許出願の国際公開第２００２／０２０５６５号はさらに、反復タンパク質の特徴、技術および用途の一般的な説明も含んでいる。

【0031】

「反復タンパク質」という用語は、１つ以上の反復ドメインを含んでいるタンパク質を指す。好ましくは、前記反復タンパク質はそれぞれ、４つまでの反復ドメインを含む。より好ましくは、前記反復タンパク質はそれぞれ、２つまでの反復ドメインを含む。最も好ましくは、反復タンパク質はそれぞれ、反復ドメインを１つだけ含む。さらに前記反復タンパク質は、付加的な非反復タンパク質ドメイン、ポリペプチドタグおよび／またはポリペプチドリンカーを含んでいてもよい。

【0032】

「反復ドメイン」という用語は、２つ以上の連続した反復単位（モジュール）を構造単位として含んでいるタンパク質ドメインを指し、ここで前記構造単位はそれぞれ同じ折り畳み構造を有し、密に積み重なって、疎水性の結合コアを有する高次らせん構造を形成している。好ましくは、反復ドメインは、Ｎ末端および／またはＣ末端にキャッピング単位（またはモジュール）をさらに含む。一層好ましくは、前記Ｎ末端および／またはＣ末端のキャッピング単位（またはモジュール）はキャッピング反復である。

【0033】

「設計反復タンパク質」および「設計反復ドメイン」という用語はそれぞれ、特許出願の国際公開第２００２／０２０５６５号で説明されている発明的な手順の結果として得られた反復タンパク質または反復ドメインを指す。設計反復タンパク質および設計反復ドメインは合成されたもので、天然由来のものではない。これらはそれぞれ、それに応じて設計された核酸を発現させることによって得られた人工のタンパク質またはドメインである。真核細胞または細菌細胞などの原核細胞の中で発現させるか、細胞を使わないインビトロの発現系を用いて発現させることが好ましい。従って、設計アンキリン反復タンパク質（すなわちＤＡＲＰｉｎ）は、少なくとも１つのアンキリン反復ドメインを含んでいる本発明の組換え結合タンパク質に相当する。

【0034】

「構造単位」という用語は、ポリペプチドのうちの局所的に構造が整っている部分を指し、これは、ポリペプチド鎖に沿って隣接している２つ以上の二次構造セグメント間の三次元的な相互作用によって形成されている。このような構造単位は構造モチーフを表している。「構造モチーフ」という用語は、少なくとも１つの構造単位中に存在する、二次構造の構成要素の三次元的な配置を指す。構造モチーフは当業者によく知られている。構造単位だけでは規定の三次元配置を取ることはできないが、それらが、例えば反復ドメインの中の反復モジュールとして、連続して配置されることで隣り合った単位が相互に安定化し、その結果、高次らせん構造がもたらされる。

【0035】

「反復単位」という用語は、１種以上の天然に存在する反復タンパク質の反復配列モチーフを含んでいるアミノ酸配列を指し、ここで前記「反復単位」は複数のコピーに見られ、前記モチーフの全てに共通している規定の折り畳み位相構造を示すことで、タンパク質の折り畳み構造を決定している。このような反復単位は、フォアーら（２００３、前掲文献）に記載されている、反復タンパク質の「反復している構造単位（反復）」またはビンズら（２００４、前掲文献）に記載されている、反復タンパク質の「連続した相同の構造単位（反復）」に相当する。このような反復単位は骨格残基と相互作用残基とを含んでいる。このような反復単位の例としては、アルマジロ反復単位、ロイシン・リッチ反復単位、アンキリン反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、ＨＥＡＴ反復単位、およびロイシン・リッチ変異型反復単位が挙げられる。このような反復単位を２つ以上含有している天然に存在するタンパク質は、「天然に存在する反復タンパク質」と呼ばれる。反復タンパク質の個々の反復単位のアミノ酸配列には、それぞれを比較した場合に、有意な数の変異、置換、付加および／または欠失が入っている場合があるが、それでもなお、反復単位の基本的なパターン、すなわちモチーフを実質的に保持している。

【0036】

従って、「アンキリン反復単位」という用語は反復単位を意味し、これは、例えばフォアーら、２００３、前掲文献に記載されているアンキリン反復である。アンキリン反復は当業者によく知られている。「アンキリン反復ドメイン」という用語は、２つ以上の連続したアンキリン反復単位（モジュール）を構造単位として含み、好ましくは、Ｎ末端および／またはＣ末端にキャッピング単位（またはモジュール）も含む反復ドメインを指す。

【0037】

「骨格残基」と言う用語は反復単位のアミノ酸残基、すなわち反復モジュールの相当するアミノ酸残基に関するもので、骨格残基は折り畳みの位相構造、すなわち前記反復単位（またはモジュール）の折り畳み構造に寄与するか、または隣り合った単位（またはモジュール）間の相互作用に寄与する。このような寄与は反復単位（またはモジュール）中の他の残基との相互作用となるか、またはαヘリックスもしくはβシート、または直線状のポリペプチドもしくはループを形成している一定の長さのアミノ酸に見られるようなポリペプチド骨格の高次構造に影響を与えるものであり得る。

【0038】

「標的相互作用残基」という用語は、反復単位のアミノ酸残基、すなわち反復モジュールの相当するアミノ酸残基に関するもので、これは、標的物質との相互作用に寄与するものである。このような寄与は標的物質との直接的な相互作用となるか、または直接相互作用している他の残基に、例えば反復単位（またはモジュール）のポリペプチドの高次構造を安定化し、前記標的と直接相互作用している残基の相互作用を可能にするまたは向上させることで影響を与えるものであり得る。そのような骨格残基および標的相互作用残基は、Ｘ線結晶学、ＮＭＲおよび／またはＣＤ分光法などの物理化学的な方法によって得られたデータを解析すること、あるいは構造生物学および／またはバイオインフォマティクス分野の当業者に公知の、既知のおよび関連する構造情報を比較することによって同定することができる。

【0039】

反復配列モチーフの推定に用いられる反復単位は、好ましくは、同じ構造モチーフを有する反復単位で、前記反復単位の骨格残基が７０％を超えて互いに相同な、相同な反復単位である。前記反復単位のうち、８０％を上回る骨格残基が相同であることが好ましく、前記反復単位のうち、９０％を上回る骨格残基が相同であることが最も好ましい。ポリペプチド間の相同性（パーセンテージ）を決定するためのコンピュータープログラム、例えばＦａｓｔａ、ＢｌａｓｔまたはＧａｐが当業者に知られている。さらに好ましくは、反復配列モチーフの推定に用いられる反復単位は、規定の標的に関して選択された反復ドメインから得られる相同な反復単位である。

【0040】

「反復配列モチーフ」という用語は、１つ以上の反復単位または反復モジュールから推定されたアミノ酸配列を指す。好ましくは、前記反復単位または反復モジュールは同じ標的に対する結合特異性を有する反復ドメインに由来するものである。そのような反復配列モチーフは、骨格残基位置と標的相互作用残基位置を含む。前記骨格残基位置は反復単位（またはモジュール）の骨格残基の位置に相当する。一般的に、アンキリン反復の２、５、７〜１３番目および１６〜３３番目の位置に骨格残基が含まれている。アンキリン反復の位置番号は図７に示している。同様に、前記標的相互作用残基位置は、反復単位（またはモジュール）の標的と相互作用する残基の位置に相当する。一般的に、アンキリン反復の１、３、４、６、１４、および１５番目の位置は標的相互作用残基を含みうる。反復配列モチーフは、定位置および無作為な位置を含む。「定位置」という用語は反復配列モチーフ中のアミノ酸の位置を指し、ここで前記位置には特定のアミノ酸が存在する。たいていの場合、そのような定位置は、骨格残基の位置および／または特定の標的に特異的な標的相互作用残基の位置に相当する。「無作為な位置」という用語は反復配列モチーフ中のアミノ酸の位置を指し、この場合、前記アミノ酸の位置には２種類以上のアミノ酸のいずれが存在してもよい。例えば、一般的な２０種類の天然に存在するアミノ酸のいずれが存在してもよく、または２０種類の天然に存在するアミノ酸の多くが、例えばシステイン以外のアミノ酸が、もしくはグリシン、システインおよびプロリン以外のアミノ酸が存在してもよい。ほとんどの場合、そのような無作為な位置は標的相互作用残基の位置に相当するが、骨格残基のいくつかの位置が無作為な場合もある。

【0041】

「折り畳みの位相構造」という用語は、前記反復単位または反復モジュールの三次構造を指す。折り畳みの位相構造は、αヘリックスまたはβシートの少なくとも一部を形成している一定の長さのアミノ酸、または直線状ポリペプチドもしくはループを形成している一定の長さのアミノ酸によって決定されるか、あるいはαヘリックス、βシートおよび／または直線状ポリペプチド／ループの任意の組み合わせによって決定される。例えば、アンキリン反復単位／モジュールはβターン、それに続く２つの逆平行αヘリックス、そして次の反復単位／モジュールのターンに達しているループからなる。

【0042】

「連続した」という用語は、反復単位または反復モジュールが直列に配置されている配置を指す。設計反復タンパク質では、少なくとも２個、一般的には約２〜６個、具体的には少なくとも約６個、しばしば２０個以上の反復単位（またはモジュール）が連続している。ほとんどの場合、反復ドメインの反復単位同士（またはモジュール同士）は、高レベルの配列同一性（対応する位置に同じアミノ酸残基がある）または配列相同性（アミノ酸残基は異なるが、同様の物理化学的特性を有する）を示し、いくつかのアミノ酸残基は重要な残基であり、高度に保存されている。しかしながら、アミノ酸の挿入および／または欠失、および／または反復ドメインの異なる反復単位（またはモジュール）間における置換による高度な配列の変動も、その反復単位（またはモジュール）に共通の折り畳みの位相構造が維持される限りにおいて可能である。

【0043】

Ｘ線結晶学、ＮＭＲまたはＣＤ分光法などの物理化学的な手段によって、反復タンパク質の折り畳みの位相構造を直接決定するための方法は当業者によく知られている。反復単位もしくは反復配列モチーフを同定および決定するための方法、またはそのような反復単位もしくはモチーフを含んでいる関連するタンパク質のファミリーを決定および同定するための方法、例えば相同性検索（ＢＬＡＳＴなど）は、バイオインフォマティクスの分野において十分に確立されており、かつ、当業者によく知られている。最初の反復配列モチーフを改良する工程には過程を繰り返すことが含まれる場合がある。

【0044】

「反復モジュール」という用語は、設計反復ドメインのうちの反復しているアミノ酸配列を指し、これは元々は天然に存在する反復タンパク質の反復単位に由来するものである。反復ドメインに含まれているそれぞれの反復モジュールは、天然に存在する反復タンパク質のファミリーまたはサブファミリー、例えばアルマジロ反復タンパク質もしくはアンキリン反復タンパク質ファミリーの１つ以上の反復単位に由来する。さらに好ましくは、反復ドメインに含まれるそれぞれの反復モジュールは、例えば実施例１に記載するように、同じ標的（例えばＨＧＦ）に関して選択された反復ドメインより得られた相同の反復単位から推定された反復配列モチーフを含む。

【0045】

従って、「アンキリン反復モジュール」という用語は、元々は天然に存在するアンキリン反復タンパク質の反復単位由来の反復モジュールを意味する。アンキリン反復タンパク質は当業者によく知られている。

【0046】

「反復モジュール」は、対応している反復モジュールの全コピーに存在しているアミノ酸残基が入っている位置（「定位置」）と、異なるまたは「無作為な」アミノ酸残基が存在する位置（「無作為な位置」）を含んでいてもよい。

【0047】

「キャッピングモジュール」という用語は、反復ドメインのＮ末端またはＣ末端の反復モジュールに融合させたポリペプチドを指し、ここで前記キャッピングモジュールは前記反復モジュールと密な三次元相互作用（すなわち三次元構造相互作用）を形成し、それによって、連続した反復モジュールに接触していない側の前記反復モジュールの疎水性コアを溶媒から保護するキャップを構成している。前記Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングモジュールは、反復単位に隣接している天然に存在する反復タンパク質中に見られるキャッピング単位または他の構造単位であってよく、あるいはそれらに由来するものであってもよい。「キャッピング単位」という用語は、反復単位のＮ末端またはＣ末端に融合させた特定の構造単位を規定する天然に存在する折り畳まれたポリペプチドを指し、ここで前記ポリペプチドは、前記反復単位と密な三次元構造相互作用を形成し、それによって、前記反復単位の片方にある疎水性コアを溶媒から保護している。好ましくは、キャッピングモジュールまたはキャッピング単位はキャッピング反復である。「キャッピング反復」という用語は、前記隣接している反復単位（またはモジュール）と同様のもしくは同じ折り畳み構造を有する、および／または前記隣接している反復単位（またはモジュール）と同様の配列を有するキャッピングモジュールもしくはキャッピング単位を指す。キャッピングモジュールおよびキャッピング反復については国際公開第２００２／０２０５６５号、国際公開第２０１２／０６９６５５号、およびインターランディら、２００８（前掲文献）による記載がある。Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュール（すなわちＮ末端キャッピング反復）の例としては配列番号１〜３が、アンキリンＣ末端キャッピングモジュール（すなわちＣ末端キャッピング反復）の例としては配列番号４〜８が挙げられる。

【0048】

例えば、配列番号３３のＮ末端アンキリンキャッピングモジュールは１〜３２番目のアミノ酸によってコードされており、配列番号３３のＣ末端キャッピングモジュールは１３２〜１５９番目のアミノ酸によってコードされている。

【0049】

本発明による組換え結合タンパク質は少なくとも１つのアンキリン反復ドメインを含み、ここで前記アンキリン反復ドメインは哺乳類のＨＧＦに対する結合特異性を有する。

【0050】

「標的に対する結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」または「標的特異性」などの用語は、ある結合タンパク質または結合ドメインが、ＰＢＳ中で、関連のないタンパク質、例えば大腸菌の麦芽糖結合タンパク質（ＭＢＰ）よりも低い平衡解離定数で標的に結合することを意味する。好ましくは、標的に対するＰＢＳ中での平衡解離定数は、対応するＭＢＰの平衡解離定数の少なくとも１０分の１、より好ましくは少なくとも１００分の１、さらに好ましくは少なくとも１，０００分の１、最も好ましくは少なくとも１０，０００分の１よりも小さい。

【0051】

ＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を実施例に記載する。

【0052】

特に、本発明はアンキリン反復ドメインを少なくとも１つ含む本発明で定義した組換え結合タンパク質に関し、ここで前記アンキリン反復ドメインはＨＧＦ（肝細胞増殖因子）に特異的に結合する。

【0053】

そのような特異的結合は、本発明によるアンキリン反復ドメインのＨＧＦに対する選択的親和性を指す。ＨＧＦまたはそのエピトープに結合するアンキリン反復ドメインはすべて、その実体に特異的に結合すると考えられる。したがってＨＧＦに結合するアンキリン反復ドメインはすべて後者（ＨＧＦのエピトープ）に対する結合特異性を有する。

【0054】

好ましくは、前記アンキリン反復ドメインはＰＢＳ中で、１０^-7Ｍ未満の平衡解離定数（Ｋｄ）でＨＧＦに結合する。さらに好ましくは、１０^-8Ｍ未満、１０^-9Ｍ未満、または１０^-10Ｍ未満、最も好ましくは１０^-11Ｍ未満のＫｄで結合する。

【0055】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた技術（例えばＳＰＲ平衡解析または動態解析）または等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）などのタンパク質間相互作用の平衡解離定数を決定する方法が当業者に良よく知られている。異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定すれば、測定された特定のタンパク質間相互作用のＫｄ値は変わる可能性がある。従って、Ｋｄ値の測定は、標準化されたタンパク質溶液と標準化された緩衝液、例えばＰＢＳを使って行われるのが好ましい。

【0056】

実施例２にＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとの結合を阻害するアンキリン反復のＩＣ₅₀値の求め方と、ＰＢＳ中で１０^-7Ｍ未満のＫｄでＨＧＦに結合するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質とを示す。

【0057】

ヒトＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質が好ましい。

【0058】

７０から３００個のアミノ酸、特に９０から２００個のアミノ酸を含んでいる組換え結合タンパク質を含むアンキリン反復ドメインがさらに好ましい。

【0059】

好ましくは、本発明の結合ドメインは、国際公開第２００２／０２０５６５に記載のアンキリン反復ドメイン、つまり設計アンキリン反復ドメインである。ＨＧＦに結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインの例を実施例に示している。

【0060】

さらなる態様において本発明は、哺乳類のＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを少なくとも１つ含む組換え結合タンパク質に関し、ここで前記アンキリン反復ドメインはＰＢＳ中で、１０^-7Ｍ未満のＩＣ₅₀値でＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとの結合を阻害する。好ましくは、前記アンキリン反復ドメインはＰＢＳ中で、１０^-8Ｍ未満のＩＣ₅₀値でＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとの結合を阻害し、さらに好ましくは１０^-9Ｍ未満または１０^-10Ｍ未満のＩＣ₅₀値で、最も好ましくは１０^-11Ｍ未満のＩＣ₅₀値でＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとの結合を阻害する。

【0061】

半数阻害濃度（ＩＣ₅₀）とは、化合物、例えば本発明の結合ドメインが、生物学的、生化学的、または生物物理学的機能を阻害する作用に関する有効性の基準である。競合的ＥＬＩＳＡなど、タンパク質間相互作用の阻害に関するＩＣ₅₀値の決定方法が当業者によく知られている。異なる条件（例えば塩濃度、ｐＨ）で測定すれば、測定されたタンパク質間相互作用の特定の阻害剤のＩＣ₅₀値は変わる可能性がある。したがって、ＩＣ₅₀値の測定は標準化されたタンパク質溶液と標準化された緩衝液、例えばＰＢＳを使って行われるのが好ましい。

【0062】

実施例５にＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとの結合を阻害するアンキリン反復のＩＣ₅₀値の求め方と、ＰＢＳ中で１０^-7Ｍ未満のＩＣ₅₀値でＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとの結合を阻害するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質とを示す。

【0063】

さらなる態様において本発明は、ＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを少なくとも１つ含む組換え結合タンパク質に関し、前記アンキリン反復ドメインは、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＣＬ−１８５）内のｃ−ＭｅｔのＨＧＦ刺激性リン酸化を阻害する。Ａ５４９細胞を２４時間栄飢餓状態におき、その後、様々な濃度（a titration）の、ＨＧＦ対する特異性を有するアンキリン反復ドメイン存在下で、ＨＧＦによって刺激した。本発明の化合物がＡ５４９細胞内でｃ−ＭｅｔのＨＧＦ刺激性リン酸化を阻害する能力を、当業者によく知られている標準的な手段で評価した。実施例４に、そのようなアンキリン反復ドメインまたはｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害するタンパク質のＩＣ₅₀値を決定する方法、およびＡ５４９細胞内でのｃ−Ｍｅｔのリン酸化を１０^-7Ｍ未満のＩＣ₅₀値で阻害するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を示す。

【0064】

前記反復ドメインは、好ましくは、Ａ５４９細胞内でｃ−ＭｅｔのＨＧＦ刺激性リン酸化を１０^-8Ｍ未満のＩＣ₅₀値で阻害し、さらに好ましくは１０^-9Ｍ、１０^-10Ｍ未満のＩＣ₅₀値で、最も好ましくは１０^-11Ｍ未満のＩＣ₅₀値で阻害する。

【0065】

さらなる態様において本発明は、ＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを少なくとも１つ含む組換え結合タンパク質に関し、前記アンキリン反復ドメインは、１０^-6Ｍ未満のＩＣ₅₀値でＨＧＦ刺激性Ｕ８７細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＨＴＢ−１４）の増殖を阻害する。前記反復ドメインは、好ましくは、ＨＧＦ刺激性Ｕ８７細胞の増殖を１０^-7Ｍ未満のＩＣ₅₀値で阻害し、さらに好ましくは１０^-8Ｍ、１０^-9Ｍ、１０^-10Ｍ未満で、最も好ましくは１０^-11Ｍ未満のＩＣ₅₀値で阻害する。

【0066】

Ｕ８７細胞は生育する際ＨＧＦに反応するため、本発明の化合物の機能的阻害能力の測定に使用できる。Ｕ８７細胞を培地中で生育し、１％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ（アッセイ培地）に播種する。細胞を２４時間培養した後、ＨＧＦおよび様々な濃度の抗ＨＧＦ ＤＡＲＰｉｎを加える。本発明の化合物のＨＧＦ阻害能力を、当業者によく知られている標準的な手段を用いてＵ８７細胞の増殖能力を測定することで評価する。実施例４にＵ８７細胞の増殖を阻害するそのようなアンキリン反復タンパク質のＩＣ₅₀値を決定する方法、およびＨＧＦ刺激性Ｕ８７細胞の増殖を１０^-6Ｍ未満のＩＣ₅₀値で阻害するアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を示す。

【0067】

本発明はＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを少なくとも１つ含む組換え結合タンパク質に関し、ここで前記結合タンパク質および／またはアンキリン反復ドメインがＰＢＳ中で熱変性する際の変性中点温度（Ｔｍ）は４０℃より高く、１０ｇ／Ｌまでの濃度、ＰＢＳ中、３７℃で１日間インキュべートした際、不溶性の凝集体は５（重量）％未満しか形成されない。

【0068】

「ＰＢＳ」という用語は、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸、および２．７ｍＭのＫＣｌを含有し、ｐＨが７．４のリン酸緩衝水溶液を意味する。

【0069】

好ましくは、前記組換え結合タンパク質および／または結合ドメインがｐＨ７．４のＰＢＳ中で熱変性する際の変性中点温度（Ｔｍ）は４５℃より高く、より好ましくは５０℃より高く、より好ましくは５５℃より高く、最も好ましくは６０℃より高い。本発明の結合タンパク質または結合ドメインは、生理学的条件では規定された二次構造および三次構造を有する。そのようなポリペプチドが熱変性するとその三次構造および二次構造が失われるが、これは例えば円二色性（ＣＤ）測定によって追うことができる。結合タンパク質または結合ドメインが熱変性する際の変性中点温度は、生理学的な緩衝液中で温度を１０℃から約１００℃に徐々に上げていくことで前記タンパク質を熱変性させた際に、共同して構造転移を起こす温度の中間点に相当する。熱変性の際の変性中点温度の決定は当業者によく知られている。結合タンパク質または結合ドメインが熱変性する際のこの変性中点温度は、前記ポリペプチドの熱安定性の指標である。

【0070】

２０ｇ／Ｌまで、好ましくは４０ｇ／Ｌまで、より好ましくは６０ｇ／Ｌまで、さらにより好ましくは８０ｇ／Ｌまで、および最も好ましくは１００ｇ／Ｌまでの濃度で、ＰＢＳ中３７℃で５日間以上、好ましくは１０日間以上、より好ましくは２０日間以上、より好ましくは４０日間以上、および最も好ましくは１００日間以上インキュベートしたときに、不溶性の凝集体を５（重量）％未満しか形成しない組換え結合タンパク質および／またはアンキリン反復ドメインもまた好ましい。不溶性凝集体の形成は、目に見える沈殿の様子、ゲル濾過または不溶性の凝集体が形成されると非常に高まる動的光散乱によって検出することができる。不溶性の凝集体は、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離することでタンパク質試料から除去することができる。好ましくは、組換え結合タンパク質および／またはアンキリン反復ドメインは、前述のインキュベート条件で、ＰＢＳ中、３７℃でインキュベートした時に、２％未満、より好ましくは１％、０．５％、０．２％、０．１％未満、または最も好ましくは０．０５（重量）％未満しか不溶性の凝集体を形成しない。不溶性凝集体のパーセンテージは、不溶性の凝集体を可溶性タンパク質から分離し、その後、可溶性および不溶性画分に含まれるタンパク質量を標準的な定量法によって測定することで決定することができる。

【0071】

また、１００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有するＰＢＳ中、３７℃で１時間または１０時間インキュベートした際に、その天然の三次元構造を失わない組換え結合タンパク質および／またはアンキリン反復ドメインが好ましい。

【0072】

特定の一態様において本発明は、ＨＧＦに特異的に結合し、かつ、示したまたは好ましい変性中点温度および前段で定義した非凝集特性を有するアンキリン反復ドメインを含んでいる組換え結合タンパク質に関する。

【0073】

さらなる態様において本発明は、哺乳類のＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを少なくとも１つ含む組換え結合タンパク質に関し、前記アンキリン反復ドメインは、哺乳類のＨＧＦと、配列番号３３〜６１から、好ましくは配列番号３３、３７、４１、４２、４３、４８、５１、５２、５７、５８、５９、６０および６１から、さらに好ましくは配列番号３７、４２、４３、５１、５２および６０から、一層さらに好ましくは３７、４３、５１および６０から、特に配列番号５１および６０からなる群から選択されるアンキリン反復ドメインとの結合に競合する。

【0074】

また好ましくは、前記アンキリン反復ドメインは、哺乳類のＨＧＦと、ＤＡＲＰｉｎ＃３３〜６１の群から選択される結合タンパク質との結合に競合する。前記反復ドメインは、好ましくは、哺乳類のＨＧＦとＤＡＲＰｉｎ＃２４、４５および５０の群から選択される結合タンパク質との結合に競合する。さらに好ましくは、前記アンキリン反復ドメインは哺乳類ＨＧＦと結合タンパク質であるＤＡＲＰｉｎ＃２４または５０との結合に競合する。

【0075】

「との結合に競合する"compete for binding"」という用語は、本発明の２つの異なる結合ドメインは同時に同じ標的には結合できないが、両方の結合ドメインはそれぞれ同じ標的に結合可能であることを意味している。従ってこのような２つの結合ドメイン同士が前記標的との結合に競合する。好ましくは、前記２つの競合する結合ドメインは、前記標的上の重複しているまたは同じ結合エピトープに結合する。２つの結合ドメインが標的との結合に関して競合するか否かを決定するための方法、例えば競合的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）または競合的ＳＰＲ測定（例えばバイオ・ラッドのプロテオン（ＰｒｏｔｅＯｎ）装置を使った測定）は当業者によく知られている。競合的ＳＰＲ測定の例を実施例２に示す。

【0076】

さらなる態様において本発明は哺乳類のＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを少なくとも１つ含む組換え結合タンパク質に関し、前記アンキリン反復ドメインは配列番号３３〜６１からなる群より選択される１つのアンキリン反復ドメインと少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、
前記アンキリン反復ドメインの１番目のＧおよび／または２番目のＳが欠失していてもよく、および
前記アンキリン反復ドメインの最後尾から２番目のＬおよび／または最後尾のＮがＡと交換されていてもよい。

【0077】

好ましくは、本発明の組換え結合タンパク質に含まれるそのようなアンキリン反復ドメインは、配列番号３３、３７、４１、４２、４３、４８、５１、５２、５７、５８、５９、６０および６１からなる群より選択される１つのアンキリン反復ドメインと、さらに好ましくは配列番号３７、４２、４３、５１、５２および６０と、より好ましくは３７、４３、５１および６０と、特に配列番号５１および６０と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0078】

好ましくは、本発明の組換え結合タンパク質に含まれるそのようなアンキリン反復ドメインは、配列番号３３〜６１からなる群より選択されるアンキリン反復ドメインのＮ末端キャッピングモジュールおよびＣ末端キャッピングモジュールとの間にある１、２または３つのアンキリン反復モジュールと少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0079】

好ましくは、そのようなアンキリン反復ドメインまたはそのような１、２もしくは３つの反復モジュールは少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0080】

好ましくは、配列番号３３〜６１の反復ドメインに含まれる３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個までのアミノ酸は別のアミノ酸と交換されている。

【0081】

配列番号１〜８のキャッピングモジュール、配列番号１２〜２５の反復モジュール、または配列番号３３〜６１の反復ドメインに含まれるアミノ酸が置き換えられている場合には、これらのアミノ酸は、好ましくは、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＹからなる群由来のアミノ酸と交換される。また好ましくは、アミノ酸は相同のアミノ酸で置き換えられる。つまりアミノ酸は、生物物理学的な特性が似ている側鎖を有するアミノ酸と交換される。例えば、負に帯電しているアミノ酸Ｄは負に帯電しているアミノ酸Ｅに置き換えてもよく、または、Ｌなどの疎水性のアミノ酸をＡ、ＩまたはＶに置き換えてもよい。ポリペプチド中のアミノ酸を別のアミノ酸と交換する技術は当業者によく知られている。

【0082】

さらなる態様において本発明は哺乳類のＨＧＦに対する結合特異性を有する少なくとも１つのアンキリン反復ドメインからなる組換え結合タンパク質に関し、ここで前記アンキリン反復ドメインは配列番号３３〜６１からなる群より選択され、
前記アンキリン反復ドメインの１番目のＧおよび／または２番目のＳは欠失していてもよく、および
前記アンキリン反復ドメインの最後尾から２番目のＬおよび／または最後尾のＮがＡと交換されていてもよい。

【0083】

好ましくは、そのようなアンキリン反復ドメインは配列番号３３、３７、４１、４２、４３、４８、５１、５２、５７、５８、５９、６０および６１から、さらに好ましくは配列番号３７、４２、４３、５１、５２および６０から、より好ましくは配列番号３７、４３、５１および６０から、特に配列番号５１および６０からなる群から選択される。

【0084】

さらなる態様において本発明は、哺乳類のＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを少なくとも１つ含む組換え結合タンパク質に関し、前記アンキリン反復ドメインは、配列番号１２〜２５からなる群から選択されるアミノ酸配列および配列番号１２〜２５の９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含むアンキリン反復モジュールを含む。

【0085】

好ましくは、そのような組換え結合タンパク質は少なくとも、配列番号１２〜２５からなる群から選択されるアミノ酸配列および配列番号１２〜２５の９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含むアンキリン反復モジュールを含み、その９個までのアミノ酸置換のうち、６個まで、好ましくは５個まで、より好ましくは４個まで、より好ましくは３個まで、より好ましくは２個まで、最も好ましくは１個までのアミノ酸置換が配列番号１２〜２５の１、３、４、６、１４および／または１５番目に位置する。

【0086】

好ましくは、そのような前記アンキリン反復ドメインのアンキリン反復モジュールは、配列番号１２、１５、１９、２１および２４からなる群から選択され、さらに好ましくは配列番号１９および２１からなる群から選択される。

【0087】

さらに好ましくは、そのような前記アンキリン反復ドメインのアンキリン反復モジュールは、配列番号１２、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、および２２からなる群から選択され、さらに好ましくは配列番号１２、１５、１８、１９、２０、２１および２４からなる群から選択され、より好ましくは１８、１９、２０、および２１からなる群から選択される。

【0088】

好ましくは、配列番号１２〜２５の反復モジュールの８個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられており、さらに好ましくは７個までのアミノ酸、さらに好ましくは６個までのアミノ酸、さらに好ましくは５個までのアミノ酸、より好ましくは４個までのアミノ酸、さらに好ましくは３個までのアミノ酸、さらに好ましくは２個までのアミノ酸、最も好ましくは１個までのアミノ酸が置き換えられている。

【0089】

さらなる態様では、本発明は組換え結合タンパク質に関し、ここでＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインはアンキリン反復配列ＫＤＲＹＧＤＴＰＬＨＬＡＡＤＩＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１８）の反復モジュールおよび配列番号１８に含まれている９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列からなり、ここで、
１番目のＫはＱ、Ｈ、Ｎ、Ｉ、Ｔ、Ｙ、Ｖ、Ｆ、Ｄ、Ｒ、ＬまたはＳと交換されていてもよく、好ましくはＱ、Ｈ、Ｎ、Ｉ、Ｔ、Ｙ、ＶまたはＦ、また好ましくはＱ、Ｈ、Ｉ、Ｔ、Ｙ、Ｖ、最も好ましくはＱまたはＨと交換されていてもよく、
３番目のＲはＡ、Ｔ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｙ、Ｆ、ＳまたはＤと交換されていてもよく、好ましくはＡ、Ｔ、Ｋ、ＨまたはＮ、最も好ましくはＡと交換されていてもよく、
４番目のＹはＦ、Ｗ、Ｒ、Ｌ、ＳまたはＴと交換されていてもよく、好ましくはＦまたはＷと交換されていてもよく、
６番目のＤはＬ、Ａ、Ｎ、Ｅ、Ｓ、Ｔと交換されていてもよく、好ましくはＬまたはＡと交換されていてもよく、
１４番目のＤはＳ、Ｎ、Ｍ、Ｔ、Ｆと交換されていてもよく、好ましくはＳまたはＮと交換されていてもよく、
１５番目のＩはＹ、Ａ、Ｎ、Ｔ、Ｒ、Ｖ、Ｋ、Ｄ、Ｌ、Ｓと交換されていてもよく、好ましくはＹ、Ａ、Ｎ、Ｔ、ＲまたはＶ、最も好ましくはＹまたはＡと交換されていてもよく、および
１９番目のＥはＫと交換されていても良い。

【0090】

好ましい組換え結合タンパク質において、ＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインはアンキリン反復配列ＫＤＲＹＧＤＴＰＬＨＬＡＡＤＩＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１８）の反復モジュールおよび配列番号１８に含まれている９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含み、ここで、
１番目のＫはＱ、Ｈ、Ｉ、Ｖと交換されていてもよく、
３番目のＲはＡ、ＴまたはＮと交換されていてもよく、好ましくはＡに交換されていてもよく、
４番目のＹはＦまたはＷと交換されていてもよく
６番目のＤはＮと交換されていてもよく、
１４番目のＤはＳと交換されていてもよく、
１５番目のＩはＹまたはＡと交換されていてもよく、および
１９番目のＥはＫと交換されていてもよい。

【0091】

さらなる態様では、本発明は組換え結合タンパク質に関し、ここでＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインはアンキリン反復配列ＥＤＹＦＧＮＴＰＬＨＬＡＡＳＹＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１９）の反復モジュールおよび配列番号１９に含まれている９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含み、ここで、
１番目のＥはＤ、Ｈ、Ｎ、Ｆ、Ａ、Ｌ、Ｑ、Ｉと交換されていてもよく、好ましくはＤ、Ｈ、Ｎ、最も好ましくはＤまたはＨと交換されていてもよく、
３番目のＹはＷ、Ｓ、Ｈ、Ｖ、Ｆ、ＡまたはＤと交換されていてもよく、好ましくはＷ、Ｓ、Ｈ、Ｖ、ＡまたはＦ、最も好ましくはＷまたはＳと交換されていてもよく、
４番目のＦはＹ、ＡまたはＷと交換されていてもよく、好ましくはＹまたはＡと交換されていてもよく、
６番目のＮはＤ、Ｈ、ＩまたはＭと交換されていてもよく、好ましくはＤまたはＨ、最も好ましくはＤと交換されていてもよく、
１４番目のＳはＮまたはＨと交換されていてもよく、および
１５番目のＹはＭ、Ｗ、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ａ、ＩまたはＮと交換されていてもよく、好ましくはＭ、Ｗ、Ｌ、Ｔ、ＡまたはＶ、また好ましくはＭ、ＡまたはＷ、最も好ましくはＡと交換されていてもよい。

【0092】

好ましい組換え結合タンパク質において、ＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインはアンキリン反復配列ＥＤＹＦＧＮＴＰＬＨＬＡＡＳＹＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１９）の反復モジュールおよび配列番号１９に含まれている９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含み、ここで、
１番目のＥはＤ、Ｆ、Ａ、またはＬと交換されていてもよく、最も好ましくはＤまたはＡと交換されていてもよく、
３番目のＹはＷ、Ｓ、またはＶと交換されていてもよく、
４番目のＦはＹと交換されていてもよく、
６番目のＮはＤと交換されていてもよく、および
１５番目のＹはＭ、Ｌ、Ｓ、またはＡと交換されていてもよく、好ましくはＭ、ＡまたはＬ、最も好ましくはＡまたはＬと交換されていてもよい。

【0093】

前記アンキリン反復ドメインが配列番号１８の前記アンキリン反復モジュールおよび配列番号１９の前記アンキリン反復モジュールを含む組換え結合タンパク質が好ましい。好ましくは、前記アンキリン反復ドメインの中で、配列番号１９の前記アンキリン反復モジュールは配列番号１８の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。例えば、ＤＡＲＰｉｎ＃５１のアンキリン反復ドメインにおいて、配列番号１９の前記アンキリン反復モジュールは配列番号１８の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。

【0094】

さらに別の態様では、本発明は組換え結合タンパク質に関し、ここでＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインはアンキリン反復配列ＫＤＤＹＧＮＴＰＬＨＬＡＡＮＴＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号２０）の反復モジュールおよび配列番号２０に含まれている９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含み、ここで、
１番目のＫはＭ、Ｉ、Ｄ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、Ｒ、ＴまたはＨと交換されていてもよく、好ましくはＭ、ＩまたはＤ、最も好ましくはＩまたはＤと交換されていてもよく、
３番目のＤはＨ、Ｙ、Ｔ、ＷまたはＦと交換されていてもよく、好ましくはＨまたはＹと交換されていてもよく、
４番目のＹはＳ、Ｎ、Ａ、Ｇ、ＦまたはＲと交換されていてもよく、好ましくはＳ、Ｎ、ＡまたはＧ、最も好ましくはＳと交換されていてもよく、
６番目のＮはＳ、Ｔ、ＬまたはＹと交換されていてもよく、好ましくはＳと交換されていてもよく、
１４番目のＮはＬ、Ｆ、ＭまたはＩと交換されていてもよく、好ましくはＬまたはＩと交換されていてもよく、
１５番目のＴはＳ、Ｗ、Ｖ、Ｅ、ＦまたはＡと交換されていてもよく、好ましくはＳと交換されていてもよく、
１７番目のＨはＲと交換されていてもよく、および
１９番目のＥはＫと交換されていてもよい。

【0095】

好ましい組換え結合タンパク質においてＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、アンキリン反復配列ＫＤＤＹＧＮＴＰＬＨＬＡＡＮＴＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号２０）の反復モジュールおよび配列番号２０に含まれている９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含み、ここで、
１番目のＫは、Ｍ、Ｄ、Ｌ、Ｑ、またはＶと交換されていてもよく、
３番目のＤは、ＹまたはＴと交換されていてもよく、
４番目のＹは、ＡまたはＮと交換されていてもよく、
１５番目のＴは、Ｓと交換されていてもよく、
１７番目のＨは、Ｒと交換されていてもよく、および
１９番目のＥは、Ｋと交換されていてもよい。

【0096】

また、前記アンキリン反復ドメインが配列番号１９の前記アンキリン反復モジュールおよび配列番号２０の前記アンキリン反復モジュールを含む組換え結合タンパク質も好ましい。好ましくは、前記アンキリン反復ドメインの中で配列番号２０の前記アンキリン反復モジュールは配列番号１９の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。例えば、ＤＡＲＰｉｎ＃５１のアンキリン反復ドメインにおいて、配列番号２０の前記アンキリン反復モジュールは配列番号１９の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。

【0097】

また、前記アンキリン反復ドメインが配列番号１８の前記アンキリン反復モジュール、配列番号１９の前記アンキリン反復モジュール、および配列番号２０の前記アンキリン反復モジュールを含む組換え結合タンパク質も好ましい。好ましくは、前記アンキリン反復ドメインの中で、配列番号１９の前記アンキリン反復モジュールは配列番号１８の前記アンキリン反復モジュールに直接続き、配列番号２０の前記アンキリン反復モジュールは配列番号１９の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。例えば、ＤＡＲＰｉｎ＃５１のアンキリン反復ドメインにおいて、配列番号２０の前記アンキリン反復モジュールは、配列番号１８の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている配列番号１９の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。

【0098】

さらに別の態様において本発明は組換え結合タンパク質に関し、ここでＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインはアンキリン反復配列ＨＤＹＳＧＦＴＰＬＨＬＡＡＹＹＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＨＧＡＤＶＮＡ（配列番号１２）の反復モジュールおよび配列番号１２に含まれている９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含み、ここで、
１番目のＨはＴ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｉ、Ｋ、Ｆ、ＹまたはＶと交換されていてもよく、好ましくはＴ、Ｓ、Ｎ、ＱまたはＩ、最も好ましくはＴまたはＳと交換されていてもよく、
３番目のＹはＲ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、Ｗ、Ｅ、Ａ、ＱまたはＬと交換されていてもよく、好ましくはＲ、ＮまたはＤ、最も好ましくはＲまたはＮと交換されていてもよく、
４番目のＳはＮ、ＴまたはＷと交換されていてもよく、好ましくはＮまたはＴと交換されていてもよく、
６番目のＦはＩと交換されていてもよく、
１４番目のＹはＦと交換されていてもよく、
１５番目のＹはＷまたはＨと交換されていてもよく、および
２０番目のＩはＶまたはＬと交換されていてもよい。

【0099】

さらに別の態様では、本発明は組換え結合タンパク質に関し、ここでＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは配列ＦＤＤＷＧＨＴＰＬＨＬＡＡＲＹＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡ（配列番号１３）のＣ末端キャッピングモジュールおよび配列番号１３に含まれている９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含み、ここで、
１番目のＦはＴ、Ｈ、Ｌ、Ｄ、Ｙ、ＫまたはＥと交換されていてもよく、好ましくはＴ、Ｈ、ＬまたはＤ、最も好ましくはＴまたはＨと交換されていてもよく、
３番目のＤはＲ、Ｋ、Ａ、Ｎ、Ｙ、Ｓ、Ｌ、ＴまたはＦと交換されていてもよく、好ましくはＲ、Ｋ、ＡまたはＮ、最も好ましくはＡ、ＲまたはＫと交換されていてもよく、
４番目のＷはＦ、ＹまたはＲと交換されていてもよく、好ましくはＦと交換されていてもよく、
６番目のＨはＬ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＫと交換されていてもよく、好ましくはＬまたはＩと交換されていてもよく、
１４番目のＲはＨ、Ｙ、Ｓ、Ｆ、Ａ、ＮまたはＩと交換されていてもよく、好ましくはＨ、ＹまたはＳ、最も好ましくはＨと交換されていてもよく、および
１５番目のＹはＦ、Ｌ、Ｔ、ＫまたはＲと交換されていてもよく、好ましくはＦ、ＬまたはＴ、最も好ましくはＦと交換されていてもよい。

【0100】

また、前記アンキリン反復ドメインが配列番号１２の前記アンキリン反復モジュールおよび配列番号１３の前記アンキリン反復モジュールを含む組換え結合タンパク質も好ましい。好ましくは、前記アンキリン反復ドメインの中で、配列番号１３の前記アンキリン反復モジュールは配列番号１２の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。例えば、ＤＡＲＰｉｎ＃３３のアンキリン反復ドメインにおいて、配列番号１３の前記アンキリン反復モジュールは、配列番号１２の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。

【0101】

さらに別の態様では、本発明は組換え結合タンパク質に関し、ここでＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは配列ＫＹＥＤＧＬＴＰＬＨＬＡＡＦＹＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＲＨＧＡＤＶＮＡ（配列番号１５）のＣ末端キャッピングモジュールおよび配列番号１５に含まれている９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含み、ここで、
１３番目のＡはＶと交換されていてもよく、および
２６番目のＲはＫと交換されていてもよい。

【0102】

さらに別の態様では、本発明は組換え結合タンパク質に関し、ここでＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは配列ＴＤＡＷＧＨＴＰＬＨＬＡＡＹＬＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡ（配列番号１６）のＣ末端キャッピングモジュールおよび配列番号１６に含まれている９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含み、ここで、
８番目のＰはＴと交換されていてもよく、
１２番目のＡはＴと交換されていてもよく、
１４番目のＹはＳ、ＨまたはＡと交換されていてもよく、好ましくはＳまたはＨと交換されていてもよく、
１５番目のＬはＹ、ＮまたはＳと交換されていてもよく、好ましくはＹまたはＮと交換されていてもよく、および
３３番目のＡはＴと交換されていてもよい。

【0103】

また、前記アンキリン反復ドメインが配列番号１５の前記アンキリン反復モジュールおよび配列番号１６の前記アンキリン反復モジュールを含む組換え結合タンパク質も好ましい。好ましくは、前記アンキリン反復ドメインにおいて、配列番号１６の前記アンキリン反復モジュールは配列番号１５の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。例えば、ＤＡＲＰｉｎ＃４１のアンキリン反復ドメインにおいて、配列番号１６の前記アンキリン反復モジュールは、配列番号１５の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。

【0104】

さらに別の態様において本発明は組換え結合タンパク質に関し、ここでＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインはアンキリン反復配列ＨＤＴＷＧＬＴＰＬＨＬＡＡＦＨＧＨＱＥＩＶＥＶＬＬＫＨＧＡＤＶＮＡ（配列番号２１）の反復モジュールおよび配列番号２１に含まれている９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含む。

【0105】

さらに別の態様では、本発明は組換え結合タンパク質に関し、ここでＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインはアンキリン反復配列ＱＤＦＹＧＫＴＰＬＨＬＡＡＬＲＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡ（配列番号２２）の反復モジュールおよび配列番号２２に含まれている９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含む。

【0106】

また、前記アンキリン反復ドメインが配列番号２１の前記アンキリン反復モジュールおよび配列番号２２の前記アンキリン反復モジュールを含む組換え結合タンパク質も好ましい。好ましくは、前記アンキリン反復ドメインの中で、配列番号２２の前記アンキリン反復モジュールは配列番号２１の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。例えば、ＤＡＲＰｉｎ＃６０のアンキリン反復ドメインにおいて、配列番号２２の前記アンキリン反復モジュールは、配列番号２１の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。

【0107】

さらに別の態様では、本発明は組換え結合タンパク質に関し、ここでＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインはアンキリン反復配列ＨＤＹＬＧＬＴＰＬＨＬＡＡＳＤＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＨＧＡＤＶＮＡ（配列番号２３）の反復モジュールおよび配列番号２３に含まれている９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含み、ここで
１番目のＨはＮ、Ｌ、Ｋ、Ｒ、Ｆ、ＱまたはＤと交換されていてもよく、好ましくはＮ、ＬまたはＫ、最も好ましくはＮと交換されていてもよく、
３番目のＹはＦ、Ｑ、Ｔ、Ｒ、Ｎ、ＳまたはＤと交換されていてもよく、好ましくはＦ、ＱまたはＴ、最も好ましくはＦまたはＱと交換されていてもよく、
４番目のＬはＶ、Ｔ、Ｑ、Ｙ、ＤまたはＦと交換されていてもよく、好ましくはＶまたはＴと交換されていてもよく、
６番目のＬはＤと交換されていてもよく、
１４番目のＳはＡ、ＮまたはＦと交換されていてもよく、好ましくはＡまたはＮと交換されていてもよく、および
１５番目のＤはＩ、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ａ、ＹまたはＭと交換されていてもよく、好ましくはＩ、Ｔ、ＳまたはＲ、最も好ましくはＩまたはＴと交換されていてもよい。

【0108】

さらに別の態様では、本発明は組換え結合タンパク質に関し、ここでＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインはアンキリン反復配列ＹＤＹＮＧＬＴＰＬＨＬＡＡＮＮＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡ（配列番号２４）の反復モジュールおよび配列番号２４に含まれている９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含み、ここで
１番目のＹはＳ、Ｉ、Ｔ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、Ｋ、ＤまたはＶと交換されていてもよく、好ましくはＳ、ＩまたはＴ、最も好ましくはＳまたはＩと交換されていてもよく、
３番目のＹはＡ、Ｆ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｔ、ＲまたはＱと交換されていてもよく、好ましくはＡ、Ｆ、ＶまたはＭ、最も好ましくはＡまたはＶと交換されていてもよく、
４番目のＮはＹ、Ｆ、ＴまたはＷと交換されていてもよく、好ましくはＹと交換されていてもよく、
６番目のＬはＦ、Ｈ、Ｙ、ＮまたはＷと交換されていてもよく、好ましくはＦ、Ｈ、ＹまたはＮ、最も好ましくはＦまたはＨと交換されていてもよく、
１０番目のＨはＹと交換されていてもよく、
１２番目のＡはＴまたはＶと交換されていてもよく、
１４番目のＮはＳと交換されていてもよく、
１５番目のＮはＶ、ＭまたはＴと交換されていてもよく、好ましくはＶと交換されていてもよく、および
２０番目のＩはＶまたはＬと交換されていてもよい。

【0109】

さらに別の態様では、本発明は組換え結合タンパク質に関し、ここでＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインはアンキリン反復配列ＦＤＶＡＧＹＴＰＬＨＬＡＡＹＦＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡ（配列番号２５）の反復モジュールおよび配列番号２５に含まれている９個までのアミノ酸が任意のアミノ酸に置き換えられている配列を含み、ここで
１番目のＦはＩ、Ｍ、Ｔ、Ｄ、Ｙ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、ＡまたはＳと交換されていてもよく、好ましくはＩ、Ｍ、Ｔ、Ｄ、ＹまたはＱ、また好ましくはＩ、Ｔ、Ｄ、またはＹ、最も好ましくはＩまたはＹと交換されていてもよく、
３番目のＶはＩ、Ｈ、Ｓ、Ａ、Ｄ、またはＷと交換されていてもよく、好ましくはＩ、ＨまたはＳ、最も好ましくはＩまたはＳと交換されていてもよく、
４番目のＡはＦ、Ｙ、Ｖ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｔ、ＨまたはＩと交換されていてもよく、好ましくはＦ、Ｙ、ＶまたはＭ、最も好ましくはＦまたはＹと交換されていてもよく、
６番目のＹはＦ、Ｈ、Ｔ、Ｗ、Ｍ、Ｎ、ＱまたはＳと交換されていてもよく、好ましくはＦ、Ｈ、ＴまたはＷ、最も好ましくはＦまたはＴと交換されていてもよく、
１４番目のＹはＨ、Ｍ、Ｌ、Ｎ、Ｉ、Ｒ、ＷまたはＴと交換されていてもよく、好ましくはＨ、Ｌ、Ｎ、Ｉ、ＲまたはＴ、最も好ましくはＨまたはＬと交換されていてもよく、および
１５番目のＦはＹ、Ｈ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｌ、ＮまたはＩと交換されていてもよく、好ましくはＹ、Ｈ、ＴまたはＶ、最も好ましくはＴまたはＶと交換されていてもよい。

【0110】

前記アンキリン反復ドメインが配列番号２３の前記アンキリン反復モジュールおよび配列番号２４の前記アンキリン反復モジュールを含む組換え結合タンパク質が好ましい。好ましくは、前記アンキリン反復ドメインの中で、配列番号２４の前記アンキリン反復モジュールは配列番号２３の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。例えば、ＤＡＲＰｉｎ＃５７のアンキリン反復ドメインにおいて、配列番号２４の前記アンキリン反復モジュールは、配列番号２３の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。

【0111】

また、前記アンキリン反復ドメインが配列番号２４の前記アンキリン反復モジュールおよび配列番号２５の前記アンキリン反復モジュールを含む組換え結合タンパク質も好ましい。好ましくは、前記アンキリン反復ドメインの中で、配列番号２５の前記アンキリン反復モジュールは配列番号２４の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。例えば、ＤＡＲＰｉｎ＃５７のアンキリン反復ドメインにおいて、配列番号２５の前記アンキリン反復モジュールは、配列番号２４の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。

【0112】

また、前記アンキリン反復ドメインが配列番号２３の前記アンキリン反復モジュール、配列番号２４の前記アンキリン反復モジュール、および配列番号２５の前記アンキリン反復モジュールを含む組換え結合タンパク質も好ましい。好ましくは、前記アンキリン反復ドメインの中で、配列番号２４の前記アンキリン反復モジュールは配列番号２３の前記アンキリン反復モジュールに直接続き、配列番号２５の前記アンキリン反復モジュールは配列番号２４の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。例えば、ＤＡＲＰｉｎ＃５７のアンキリン反復ドメインにおいて、配列番号２５の前記アンキリン反復モジュールは、配列番号２３の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている配列番号２４の前記アンキリン反復モジュールに直接続いている。

【0113】

Ｎ末端またはＣ末端アンキリンキャッピング反復をそれぞれ含んでいるＮ末端またはＣ末端アンキリンキャッピングモジュールがさらに好ましく、ここで前記キャッピング反復中に存在する１つ以上のアミノ酸残基は、対応するアンキリンキャッピング単位またはアンキリン反復単位を整列させたときに相当する位置に見られるアミノ酸残基に置き換えられている。

【0114】

アミノ酸置換は、最も多く天然に存在する２０種類のアミノ酸のいずれによる置換であってもよく、好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸によって置き換えられ；およびより好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＹからなる群より選択されるアミノ酸によって置き換えられる。また好ましくは、アミノ酸置換は相同のアミノ酸によるものである。つまり、アミノ酸は類似の生物物理学的特性をもつ側鎖を有するアミノ酸によって置き換えられる。例えば、負に帯電しているアミノ酸Ｄは負に帯電しているアミノ酸Ｅで置換することができ、またはＬなどの疎水性のアミノ酸はＡ、ＩまたはＶで置換することができる。相同なアミノ酸によるアミノ酸置換は当業者によく知られている。

【0115】

また、配列番号４〜８に基づく前述のＣ末端キャッピングモジュールのいずれかの、２７番目および２８番目の位置のＡのアミノ酸を含んでいるＣ末端アンキリンキャッピングモジュールも好ましい。

【0116】

また、配列番号４〜８に基づく前述のＣ末端キャッピングモジュールのいずれかの、１〜２６番目または１〜２７番目の位置のアミノ酸を含んでいるＣ末端キャッピングモジュールも好ましい。

【0117】

配列番号１〜３の１番目のＧおよび／または２番目のＳアミノ酸は、その特性に何ら明白な影響を及ぼすことなく、Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュールから除去することができる。これら２個のアミノ酸は、アンキリン反復ドメインを別のアミノ酸およびタンパク質と連結するためのリンカーとして役立つ。本発明はまた、１番目のＧおよび／または２番目のＳが除去されているＮ末端アンキリンキャッピングモジュールを含んでいるそのようなアンキリン反復ドメインも含む。当然のことながら、本発明で定義したアンキリン反復ドメイン中のアミノ酸の位置（例えば「３３番目」）は状況に応じて、例えば１個のアミノ酸が欠失している場合には「３３番目」は「３２番目」に、または、２つのアミノ酸が欠失している場合には「３３番目」は「３１番目」に番号が変わる。

【0118】

本発明のアンキリン反復ドメインのアンキリンキャッピングモジュールを、当業者に知られているアミノ酸配列の整列、突然変異生成および遺伝子合成などの技術を組み合わせることによってアンキリンキャッピングモジュールと交換することができる。例えば、（ｉ）配列番号８の配列と整列させることで、配列番号３３のＣ末端キャッピング反復（すなわち１３２〜１５９番目の配列）を決定すること、（ｉｉ）決定した配列番号３３のＣ末端キャッピング反復の配列を、配列番号８の配列で置換すること、（ｉｉｉ）交換したＣ末端キャッピングモジュールをコードしている反復ドメインをコードしている遺伝子を生成すること、（ｉｖ）改変した反復ドメインを大腸菌の細胞質内で発現させること、および（ｖ）改変した反復ドメインを標準的な手段によって精製することによって、配列番号３３のＣ末端キャッピング反復を配列番号８のＣ末端キャッピング反復と置換することができる。別の例としては、（ｉ）配列番号２の配列と整列させることで、配列番号３３のＮ末端キャッピング反復（すなわち１〜３２番目の配列）を決定すること、（ｉｉ）決定した配列番号３３のＮ末端キャッピング反復の配列を、配列番号２の配列で置換すること、（ｉｉｉ）交換したＮ末端キャッピングモジュールをコードしている反復ドメインをコードしている遺伝子を生成すること、（ｉｖ）改変した反復ドメインを大腸菌の細胞質内で発現させること、および（ｖ）改変した反復ドメインを標準的な手段によって精製することによって、配列番号３３のＮ末端キャッピング反復を配列番号２のＮ末端キャッピング反復と置換することができる。

【0119】

さらに、本発明のアンキリン反復ドメインを、Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュール（例えば配列番号２のＮ末端キャッピング反復）、その後に１つ以上の反復モジュール（例えば配列番号３３の３３〜１３１番目のアミノ酸残基を含んでいる３つのアンキリン反復モジュール）さらにその後にＣ末端キャッピングモジュール（例えば配列番号８のＣ末端キャッピング反復）を配置することで、遺伝子合成によって遺伝的に構築することができる。その後、遺伝的に構築した反復ドメイン遺伝子を本明細書に記載したように大腸菌内で発現させることができる。

【0120】

Ｃ、ＭまたはＮのアミノ酸を含まないアミノ酸配列を有する組換え結合タンパク質、反復ドメイン、反復モジュール、Ｎ末端キャッピングモジュールまたはＣ末端キャッピングモジュールがさらに好ましい。

【0121】

Ｄ、Ｅ、またはＮの次にＧが続くアミノ酸を含まないアミノ酸配列を有する組換え結合タンパク質、反復ドメイン、反復モジュール、Ｎ末端キャッピングモジュールまたはＣ末端キャッピングモジュールがさらに好ましい。

【0122】

そのようなＮ末端またはＣ末端キャッピングモジュールのいずれかを含んでいる組換え結合タンパク質または反復ドメインがさらに好ましい。

【0123】

本発明によるアンキリン反復ドメインを含んでいる組換え結合タンパク質のさらに好ましい態様では、前記反復ドメインのＮ末端キャッピングモジュールに含まれている１つ以上のアミノ酸残基が、Ｎ末端キャッピング単位を整列させた場合に対応する位置に見られるアミノ酸残基で交換されている。好ましくは、３０％までのアミノ酸残基が交換されており、より好ましくは２０％まで、一層好ましくは１０％までのアミノ酸残基が交換されている。そのようなＮ末端キャッピング単位が天然に存在するＮ末端キャッピング単位であることが最も好ましい。

【0124】

本発明によるアンキリン反復ドメインを含んでいる組換え結合タンパク質のさらに好ましい態様では、前記反復ドメインのＣ末端キャッピングモジュールに含まれている１つ以上のアミノ酸残基が、Ｃ末端キャッピング単位を整列させた場合に対応する位置に見られるアミノ酸残基で交換されている。好ましくは３０％までのアミノ酸残基が交換されており、より好ましくは２０％まで、一層好ましくは１０％までのアミノ酸残基が交換されている。そのようなＣ末端キャッピング単位が天然に存在するＣ末端キャッピング単位であることが最も好ましい。

【0125】

さらに別の特定の態様では、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％までのアミノ酸残基が、反復単位、Ｎ末端キャッピング単位、またはＣ末端キャッピング単位の対応する位置に見られないアミノ酸で交換されている。

【0126】

「共通配列」という用語は、複数の反復単位を構造によっておよび／または配列によって整列することで得られるアミノ酸配列を指す。構造によっておよび／または配列によって整列させた２つ以上の反復単位を用いて、また、整列中にギャップを入れることを許容することで、各位置で最も頻度の高いアミノ酸残基を決定することが可能になる。共通配列とは、各位置で最も出現頻度の高いアミノ酸を含む配列である。同じ位置に平均より高い頻度で２個以上のアミノ酸が現れる場合には、共通配列はそれらアミノ酸の小集団を含む場合がある。前記２つ以上の反復単位は、単一の反復タンパク質に含まれる複数の反復単位から得られるものであっても、２つ以上の異なる反復タンパク質から得られるものであってもよい。

【0127】

共通配列およびそれらの決定方法は当業者によく知られている。

【0128】

「共通アミノ酸残基」とは、共通配列の特定に位置に見られるアミノ酸である。前記２つ以上の反復単位中に同様の確率で２個以上、例えば３、４または５個のアミノ酸残基が見られる場合には、最も高い頻度で見られるアミノ酸を、または前記２個以上のアミノ酸残基の組み合わせを共通アミノ酸とすることができる。

【0129】

天然に存在しないキャッピングモジュール、反復モジュール、結合タンパク質または結合ドメインがさらに好ましい。

【0130】

「天然に存在しない」という用語は、合成のものであることまたは天然に由来しないことを意味し、より具体的には、この用語は、人工のものであることを意味する。「天然に存在しない結合タンパク質」または「天然に存在しない結合ドメイン」という用語は、前記結合タンパク質または前記結合ドメインが合成されたもの（すなわちアミノ酸を使った化学合成によって生産されたもの）または組換えられたものであり、天然に由来しないことを意味する。「天然に存在しない結合タンパク質」または「天然に存在しない結合ドメイン」はそれぞれ、それに応じて設計した核酸を発現させることで得られる人工のタンパク質またはドメインである。真核細胞または原核細胞の中で発現させるか、細胞を使わないインビトロの発現系を用いて発現させることが好ましい。この用語はさらに、前記結合タンパク質または前記結合ドメインの配列が、配列データベース、例えばジェンバンク、ＥＭＢＬバンクまたはスイスプロットに非人為的な配列として登録されていないことも意味している。これらのデータベースおよび他の同様の配列データベースは当業者によく知られている。

【0131】

特定の一態様において本発明は、ＨＧＦに特異的に結合するアンキリン反復ドメインを含んでおり、さらに血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）に特異的に結合するアンキリン反復ドメインを含んでいる組換え結合タンパク質に関する。ＨＧＦに対する特異性を有するアンキリン反復ドメインの例は本明細書に記載しており、ＶＥＧＦ−Ａに対する特異性を有するアンキリン反復ドメインの例は国際公開第２０１０／０６０７４８号または国際公開第２０１１／１３５０６７号に記載されている。また好ましくは、そのような組換え結合タンパク質は、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有するアンキリン反復ドメインを１つ以上、好ましくは１つまたは２つ含んでいる。ヒト血清アルブミンに対する特異性を有するアンキリン反復ドメインの例は国際公開第２０１２／０６９６５４号に記載されている。このようなヒト血清アルブミン、ＶＥＧＦ−Ａ、またはＨＧＦに対する特異性を有する反復ドメイン同士を当業者に知られている方法によって、ポリペプチドリンカー（例えば配列番号１０または１１）を使った遺伝的な手段で連結させることができる。

【0132】

別の好ましい態様は、ＨＧＦに対する結合特異性を有し、ＨＧＦとの結合に関与する内部反復モジュールを１つ、２つ、３つまたはそれ以上含んでいるアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質である。好ましくは、そのようなアンキリン反復ドメインはＮ末端キャッピングモジュール、２〜４個の内部反復モジュール、およびＣ末端キャッピングモジュールを含む。好ましくは、前記キャッピングモジュールはキャッピング反復である。また好ましくは、前記キャッピングモジュールはＨＧＦとの結合に関与する。

【0133】

ＨＧＦに対する結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインを２つ以上含んでいる組換え結合タンパク質がさらに好ましい。前記結合タンパク質は、前記反復ドメインを２つまたは３つ含んでいることが好ましい。前記２つ以上反復ドメインは同じまたは異なるアミノ酸配列を有する。

【0134】

本発明によるアンキリン反復ドメインを含んでいる組換え結合タンパク質のさらに好ましい態様では、前記アンキリン反復ドメインの反復モジュールに含まれている１つ以上のアミノ酸残基が、反復単位を整列させた時に対応する位置に見られるアミノ酸残基で交換されている。好ましくは３０％までのアミノ酸残基が交換されており、より好ましくは２０％まで、一層好ましくは１０％までのアミノ酸残基が交換されている。そのような反復単位が天然に存在する反復単位であることが最も好ましい。

【0135】

その上さらに別の特定の態様では、３０％までのアミノ酸残基、より好ましくは２０％まで、一層好ましくは１０％までのアミノ酸残基が、反復単位の対応する位置に見られないアミノ酸で交換されている。

【0136】

さらなる態様では、本明細書に記載の組換えＨＧＦ結合タンパク質またはドメインをいずれも、１つ以上の付加的な部分、例えば、異なる標的に結合して二重特異性結合剤を作り出す部分、生理活性化合物、標識部分（例えばフルオレセインなどの蛍光標識または放射性追跡子）、タンパク質の精製を促進する部分（例えばヒスタグまたはストレプタグなどの小さいペプチドタグ）、治療効果を改善するためのエフェクター機能をもたらす部分（例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用をもたらすための抗体のＦｃ部分、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ（ＥＴＡ）などの有毒なタンパク質部分またはメイタンシノイドもしくはＤＮＡアルキル化剤などの低分子毒物）または薬物動態を向上させる部分などに共有結合させることができる。薬物動態の向上は、認知されている治療の必要性に応じて評価することができる。可能であれば、投与後にタンパク質が利用可能な状態で血清中に維持される時間を長くすることで、生物学的利用能が高まることおよび／または投与間隔が長くなることが望まれることが多い。時には、タンパク質の血清濃度の経時的な持続性を改善する（例えば、タンパク質の血清濃度について、投与直後の濃度と次の投与直前の濃度との差を小さくする）ことが望まれる。血中からのタンパク質の排出を遅くする傾向のある部分としては、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖類（例えばシアル酸）、耐用性の高いタンパク質部分（例えばＦｃ断片または血清アルブミン）、および結合ドメインまたは大量の血清タンパク質、例えば抗体のＦｃ断片もしくは血清アルブミンに対する特異性および親和性を有するペプチドが挙げられる。血清アルブミンに対して親和性を有するそのような結合ドメインの例が国際公開第２０１２／０６９６５４号に挙げられている。本発明の組換え結合タンパク質を、哺乳動物中での（例えばマウス、ラット、またはヒトでの）ポリペプチドの排出速度を、未改変ポリペプチドの３分の１未満に低下させる部分と結合させてもよい。

【0137】

さらなる態様では、本発明は特定の組換え結合タンパク質、特定のアンキリン反復ドメイン、特定のアンキリン反復モジュール、および特定のキャッピングモジュールをコードする核酸分子に関する。さらに、前記核酸分子を含むベクターについても検討する。

【0138】

さらに、１つ以上の前述の組換え結合タンパク質、特に反復ドメインを含む結合タンパク質を含んでいる医薬組成物、または特定の結合タンパク質をコードしている核酸分子、および必要に応じて薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤についても検討する。薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤は当業者に知られており、詳細は後述する。さらには、前述の組換え結合タンパク質、具体的には反復ドメインを含む結合タンパク質を１つ以上含んでいる診断用組成物についても検討する。

【0139】

医薬製剤は、前述の組換え結合タンパク質、および薬学上許容可能な担体、賦形剤または安定剤（例えば、レミントンの薬学、第１６版、オソルＡ．編［１９８０］に記載の）を含む。当業者に知られている好適な担体、賦形剤または安定剤には、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、ハンクス液、固定油、オレイン酸エチル、生理食塩水に溶解した５％デキストロース、等張性や化学的な安定性を高める物質、緩衝剤および防腐剤がある。他の好適な担体としては、その組成物、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸およびアミノ酸共重合体の投与を受けている個人に有害な抗体をその担体自体が産生しない、いずれもの担体が含まれる。医薬組成物は抗癌剤または抗血管形成剤などの追加の活性薬剤を含む混合製剤であってもよい。

【0140】

インビボ投与に用いられる製剤は、無菌的すなわち滅菌されたものでなくてはならない。このことは、無菌的な濾過膜を介して濾過することで容易に達成される。

【0141】

医薬製剤は、当業者が知り得るいずれの好適な方法によっても投与することができる。

【0142】

さらに、前述した医薬組成物はいずれも、障害の治療に関して検討される。

【0143】

本発明はさらに、治療方法を提供する。この方法は、それを必要とする患者に、治療上有効量の本発明の組換え結合タンパク質を投与することを含む。

【0144】

さらに、それを必要とする患者に有効量の前述した医薬組成物を投与することを含む、ヒトなどの哺乳動物における病理学的状態の治療方法についても検討する。

【0145】

そのような病理学的状態の例は、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺高血圧症、炎症性関節疾患、眼および網膜の疾患ならびに、肺線維症、肝硬変およびその他の肝臓障害、強皮症、糸球体硬化症および心線維症を含む繊維性疾患などである。
さらに、抗ＨＧＦ療法は、固形癌および血液腫瘍などの腫瘍性の病理学的状態にも有用である。例えば、骨への転移を含む、神経膠腫、肉腫、骨肉腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、および上皮癌などにも有用である。

【0146】

本発明による組換え結合タンパク質またはアンキリン反復ドメインを、バクテリオファージ（国際公開第１９９０／００２８０９号、同第２００７／００６６６５号）もしくは細菌細胞（国際公開第１９９３／０１０２１４号）表面での提示、リボソームディスプレー（国際公開第１９９８／０４８００８号）、プラスミドを使ったディスプレー（国際公開第１９９３／００８２７８号）もしくはＲＮＡ−反復タンパク質交雑構築物を使ったディスプレー（国際公開第２０００／０３２８２３号）、または例えばタンパク質相補性検定（国際公開第１９９８／３４１１２０号）による細胞内での発現と選抜／スクリーニングなどの複数の方法によって得てもよく、および／またはそれをさらに発展させてもよい。このような方法は当業者には知られている。

【0147】

本発明による組換え結合タンパク質またはアンキリン反復ドメインの選抜／スクリーニングに用いられるアンキリン反復タンパク質のライブラリーを、当業者に知られている手法に従って得てもよい（国際公開第２００２／０２０５６５号、ビンズＨ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３３２、４８９〜５０３、２００３、およびビンズら、２００４、前掲文献）。ＨＧＦに対する特異性を有するアンキリン反復ドメインを選抜するためのそのようなライブラリーの使用を実施例１に例示する。さらに、本発明のアンキリン反復ドメインは、本発明のアンキリン反復モジュールや適切なキャッピングモジュールまたはキャッピング反復（フォアーＰ．ら、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９、２〜６、２００３）から、標準的な組換えＤＮＡ技術によって（例えば国際公開第２００２／０２０５６５号、ビンズら、２００３、前掲文献およびビンズら、２００４、前掲文献）、規格単位（モジュール）を使った方式で組み立てることができる。

【0148】

本発明は実施例で説明した特定の態様に限定されるものではない。以降で説明する一般的な概要に従って、他の供給源を使用および処理してもよい。

【実施例】

【0149】

これ以後に開示する出発材料および試薬は全て当業者によく知られているものであり、市販されているか、またはよく知られている技術によって準備することができる。

【0150】

材料
化学物質はシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）から、オリゴヌクレオチドはミクロシンス（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ、スイス）から購入した。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素および緩衝液はニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、米国）またはフェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、リトアニア）より購入した。クローニングおよびタンパク質の産生には、大腸菌ＸＬ１−ブルー（ストラタジーン、米国）またはＢＬ２１（ノバジェン、米国）株を用いた。組換えヒトＨＧＦはペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、米国、製品番号１００−３９）から、組換えマウスＨＧＦはＲ＆Ｄシステムズ（米国、製品番号２２０７−ＨＧ／ＣＦ）から購入した。ビオチン化ＨＧＦは、標準的なビオチン化試薬と方法（ピアス、米国）により、ビオチン部分をタンパク質の一級アミンにカップリングさせることで化学的に得た。

【0151】

細胞株は、ＬＧＣ／ＡＴＣＣ（フランス／米国；カタログ番号：Ａ５４９−ＣＣＬ−１８５、Ｕ８７ＭＧ−ＨＴＢ−１４）から購入した。細胞用培地はインビトロジェン／ルビオ（Ｌｕｂｉｏ、スイス）から、ウシ胎仔血清はプロモセル（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、ドイツ；Ｃ−３７３５０）から、細胞増殖検出用、細胞増殖ＥＬＩＳＡ用、ＢｒｄＵ用（発色）（カタログ番号１１６４７２２９００）の検定試薬はロシュ（スイス）から購入した。Ｐ−ｃ−Ｍｅｔ検出用の検定試薬はＲ＆Ｄシステムズ（ヒト リン酸ＨＧＦ Ｒ／ｃ−ＭＥＴ デュオセットＩＣ；カタログ番号ＤＹＣ２４８０−５；濃縮試薬希釈剤２；ＤＸＣ００２）から購入した。細胞検定用のヒトＨＧＦはペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号１００−３９）から購入し、１０％のＦＢＳを含む細胞用培地にて再構成した。

【0152】

分子生物学
特に明記しない限り、方法は記載されている手法に従って実施される（サンブルックＪ．、フリッチＥ．Ｆ．およびマニアティスＴ．、分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）コールド・スプリング・ハーバー研究所、１９８９、ニューヨーク）。

【0153】

設計アンキリン反復タンパク質のライブラリー
設計アンキリン反復タンパク質のライブラリーを生成するための方法については記載がある（国際公開第２００２／０２０５６５号；ビンズら、２００３、前掲文献；ビンズら、２００４、前掲文献）。そのような方法により、無作為化したアンキリン反復モジュールおよび／または無作為化したキャッピングモジュールを有する設計アンキリン反復タンパク質のライブラリーを構築することができる。従って、例えばそのようなライブラリーは、決まったＮ末端キャッピングモジュール（例えば配列番号２のＮ末端キャッピングモジュール）または配列番号２９に従って無作為化したＮ末端キャッピングモジュール、配列番号２６、２７、または２８の配列モチーフに従って無作為化した１つ以上の反復モジュール、および決まったＣ末端キャッピングモジュール（例えば配列番号８のＣ末端キャッピングモジュール）または配列番号３０に従って無作為化したＣ末端キャッピングモジュールを用いて構築してもよい。そのようなライブラリーは、好ましくは、反復またはキャッピングモジュールの無作為な位置に、Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前のＮ）またはＰアミノ酸を含まないように構築される。加えて、配列番号２６、２７、または２８の配列モチーフに従って無作為化した反復モジュールの１０番目および／または１７番目の位置をさらに無作為化してもよく、配列番号２９の配列モチーフに従って無作為化したＮ末端キャッピングモジュールの７番目および／または９番目の位置をさらに無作為化してもよく、および、配列番号３０の配列モチーフに従って無作為化したＣ末端キャッピングモジュールの１０、１１および／または１７番目の位置をさらに無作為化してもよい。

【0154】

さらに、そのようなライブラリーに含まれているそのような無作為化したモジュールには、アミノ酸の無作為な位置を有するポリペプチドループがさらに挿入されている場合がある。そのような挿入されているポリペプチドループの例としては、抗体の補体決定領域（ＣＤＲ）ループのライブラリーまたはデノボで合成されたペプチドのライブラリーが挙げられる。例えば、そのようなループ挿入物は、ヒトリボヌクレアーゼＬのＮ末端アンキリン反復ドメインの構造を手本として利用することで設計してもよい（タナカＮ．、ナカニシＭ、クサカベＹ、ゴトウＹ、キタデＹ、ナカムラＫ．Ｔ、ＥＭＢＯ Ｊ．２３（３０）、３９２９〜３９３８、２００４）。２つのアンキリン反復の境界近くに存在するβターンに１０個のアミノ酸が挿入されているこのアンキリン反復ドメインと同様、アンキリン反復タンパク質ライブラリーでも、アンキリン反復ドメインのβターンの１つ以上に、様々な長さの（例えば１〜２０アミノ酸の）無作為化されたループ（定位置と無作為な位置を含む）が挿入される場合がある。

【0155】

そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリーのＮ末端キャッピングモジュールはいずれも、好ましくは、ＲＩＬＬＡＡモチーフ（例えば、配列番号２９の２１〜２６番目にあるモチーフ）の代わりにＲＥＬＬＫＡまたはＲＩＬＫＡＡモチーフを有し、そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリーのＣ末端キャッピングモジュールはいずれも、好ましくは、ＫＬＮモチーフ（例えば、配列番号３０の最後の３アミノ酸）の代わりにＫＡＡまたはＫＬＡモチーフを有する。

【0156】

そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリーは、標的と相互作用する既知のアンキリン反復ドメインの構造を手本として設計することができる。そのような構造の例としては、タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、ＰＤＢ）でのそれらの固有の受入番号または識別コード（ＰＤＢ−ＩＤ）で同定される、１ＷＤＹ、３Ｖ３１、３Ｖ３０、３Ｖ２Ｘ、３Ｖ２Ｏ、３ＵＸＧ、３ＴＷＱ−３ＴＷＸ、１Ｎ１１、１Ｓ７０および２ＺＧＤがある。

【0157】

Ｎ２ＣおよびＮ３Ｃ設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーなどの設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーの例については記載がある（国際公開第２００２／０２０５６５号；ビンズら、２００３、前掲文献；ビンズら、２００４、前掲文献）。Ｎ２ＣおよびＮ３Ｃの中の数字は、Ｎ末端キャッピングモジュールとＣ末端キャッピングモジュールとの間に存在する無作為化された反復モジュールの数を表している。

【0158】

反復単位およびモジュール内部の位置を定義するには、ビンズら、２００４（前掲文献）に基づく命名法を、アンキリン反復モジュールとアンキリン反復単位の境界をアミノ酸位置1つ分ずらすという変更を加えて用いた。例えば、ビンズら、２００４（前掲文献）のアンキリン反復モジュールの１番目は、本開示のアンキリン反復モジュールの２番目に対応し、その結果、ビンズら、２００４（前掲文献）のアンキリン反復モジュールの３３番目は、本開示では、次のアンキリン反復モジュールの１番目に対応する。

【0159】

ＤＮＡの配列は全て配列決定によって確認し、また、記載の全タンパク質について計算した分子量は、質量分析によって確認した。

【0160】

実施例１：ＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含んでいる結合タンパク質の選抜
リボソームディスプレー（ヘインズＪ．およびプルクスンＡ．、ＰＮＡＳ ９４、４９３７〜４２、１９９７）により、ＨＧＦに対する結合特異性を有する複数の設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を、ビンズら、２００４（前掲文献）に記載されているように、ＤＡＲＰｉｎライブラリーから選抜した。選抜されたクローンの、特異的な（ＨＧＦ）標的および非特異的な（ＭＢＰ、大腸菌の麦芽糖結合タンパク質）標的への結合を、粗抽出物を使ったＥＬＩＳＡにより評価した。ＥＬＩＳＡの結果は、数百ものＨＧＦ特異的結合タンパク質が正常に選抜されたことを示している。例えば、配列番号３３〜６１のアンキリン反復ドメインは、ＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含んでいる選抜された結合タンパク質のアミノ酸配列である。ＨＧＦに対する結合特異性を有するそのようなアンキリン反復ドメイン由来の個別のアンキリン反復モジュールを、配列番号１２〜２５に示す。

【0161】

リボソームディスプレーによるＨＧＦ特異的アンキリン反復タンパク質の選抜
ＨＧＦ特異的アンキリン反復タンパク質の選抜を、標的タンパク質としてのヒトおよび／またはマウスＨＧＦと前述の設計アンキリン反復タンパク質のライブラリーを用い、確立されている手法（ザーンドＣ．、アムシュトゥッツＰ．およびプルクスンＡ．、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４、６９〜７９、２００７）を用いたリボソームディスプレー（ヘインズおよびプルクスン、前掲文献）によって行った。選抜の過程をそれぞれ１巡した後には、結合剤の濃縮に起因する収率に合わせて、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲのサイクル数を常に４５回から２５回に減らした。選抜の最初の４巡では、標準的なリボソームディスプレーによる選抜を行った。このとき、１巡目から４巡目にかけて標的濃度を下げ、かつ、洗浄の強度を上げることで、選択圧を高めていった（ビンズら、２００４、前掲文献）。高親和性の抗ＨＧＦ ＤＡＲＰｉｎを濃縮するために、４巡目の標準的なリボソームディスプレー選抜（前記）から選抜されたものを、１回または２回の選抜強度の高い解離速度選抜（ザーンド、２００７、前掲文献）に供した。それぞれの解離速度選抜の後、標準的な選抜過程の最後の一巡を実施して、解離速度によって選抜されてきた結合タンパク質を増幅および回収した。ヒトおよびマウスＨＧＦに交差反応性を持つ選抜された結合剤の発現率を増やすために、ヒトＨＧＦに関する解離速度選抜を１回実施した後、マウスＨＧＦに関する選抜をさらに１回実施した。

【0162】

粗抽出物を使った受容体競合的ＥＬＩＳＡで示される、ＨＧＦに特異的に結合するクローンの選抜
ＤＡＲＰｉｎを発現している大腸菌の粗抽出物を使った標準的な手法による受容体競合的酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）で、ＨＧＦに特異的に結合する選抜したＤＡＲＰｉｎを個別に同定した。リボソームディスプレーで選抜したＤＡＲＰｉｎを、ｐＱＥ３０（キアゲン）発現ベクターにクローニングし、大腸菌ＸＬ１−ブルー株（ストラタジーン）に形質転換し、その後、１．２ｍｌの成長培地（１％のグルコースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有しているＴＢ）を入れた９６ウェルの深型プレート中、３７℃で一晩生育させた（それぞれのクローンを１つのウェルに入れた）。新しい９６ウェルの深型プレートに、５０μｌの一晩培養と、０．９ｍｌの新しいＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有）を播種した。３７℃で６０〜９０分間インキュベートした後、ＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で発現を誘導し、これを３〜４時間継続した。細胞を回収し、５０μｌのＢ−ＰＥＲＩＩ（ピアス）に再懸濁して、撹拌しながら室温で１５分間インキュベートした。その後、９５０μｌのＰＢＳを加え、遠心分離して細胞残渣を取り除いた。溶解したクローン抽出物をそれぞれ、ＰＢＳＴＣ（０．１％のツイーン２０（登録商標）および０．２５（重量体積）％のカゼインを添加したＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５０倍希釈し、１ｎＭのビオチン化ヒトまたはマウスＨＧＦとともに、ヒトまたはマウスｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ融合体のいずれかが入った、プロテインＧでコーティングしてあるマキシソープ（ＭａｘｉＳｏｒｐ）プレートのウェルにいれ、室温で１０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ（０．１％のツイーン２０（登録商標）を添加したＰＢＳ、ｐＨ７．４）でしっかりと洗浄した後、標準的なＥＬＩＳＡの手順およびストレプトアビジンＨＲＰ複合体（１１ ０８９ １５３ ００１、ロシュ）を使ってプレートを展開し、その後、ＰＯＤ基質（ロシュ）で結合を検出した。呈色を４０５ｎｍで測定した。このような細胞の粗抽出物を使ったＥＬＩＳＡによって数百個のクローンをスクリーニングした結果、ＨＧＦに対する特異性を有する１００を上回る種々のＤＡＲＰｉｎが明らかになった。ヒトＨＧＦに特異的に結合する選抜したアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列の例を、配列番号３３〜６１に示す。

【0163】

これらのＨＧＦに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインと、ＨＧＦに対する結合特異性をもたない陰性対照のＤＡＲＰｉｎ（すなわちＤＡＲＰｉｎ＃２８および＃２９）を、後述するように、単純なタンパク質の精製を促進するためのＮ末端ヒス−タグを提供するｐＱＥ（キアゲン、ドイツ）を基礎とする発現ベクターにクローニングした。例えば下記のＤＡＲＰｉｎをコードしている発現ベクターが構築された。
ＤＡＲＰｉｎ＃３３（配列番号３３、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３４（配列番号３４、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３５（配列番号３５、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３６（配列番号３６、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３７（配列番号３７、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３８（配列番号３８、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３９（配列番号３９、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４０（配列番号４０、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４１（配列番号４１、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４２（配列番号４２、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４３（配列番号４３、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４４（配列番号４４、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４５（配列番号４５、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４６（配列番号４６、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４７（配列番号４７、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４８（配列番号４８、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４９（配列番号４９、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５０（配列番号５０、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５１（配列番号５１、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５２（配列番号５２、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５３（配列番号５３、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５４（配列番号５４、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５５（配列番号５５、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５６（配列番号５６、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５７（配列番号５７、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５８（配列番号５８、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５９（配列番号５９、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃６０（配列番号６０、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃６１（配列番号６１、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）；および
ＤＡＲＰｉｎ＃６２（配列番号６２、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号９）を融合させたもの）。

【0164】

ＤＡＲＰｉｎの高レベルかつ可溶性での発現
さらなる解析のために、上述のように細胞の粗抽出物を使ったＥＬＩＳＡの結果、ＨＧＦに対する特異的結合を示した選抜されたクローンを、大腸菌のＢＬ２１またはＸＬ１−ブルー細胞中で発現させ、そのヒスタグを利用して、標準的な手法によって精製した。静置一晩培養２５ｍｌ（ＴＢ、１％グルコース、１００ｍｇ／ｌのアンピシリン；３７℃）を、５００ｍｌ培養（同培地）に接種した。６００ｎｍの吸光度が１．０になった時点で、この培養をＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）で誘導し、３７℃で４〜５時間インキュベートした。培養を遠心し、得られた沈殿物を４０ｍｌのＴＢＳ５００（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）に再懸濁し、超音波処理した。溶解物を再度遠心し、得られた上清にグリセロール（最終濃度１０体積％）とイミダゾール（最終濃度２０ｍＭ）を加えた。タンパク質をニッケル−ニトリロ三酢酸カラム（カラム容積２．５ｍｌ）に負荷し、製造業者（キアゲン、ドイツ）の説明に従って精製した。あるいは、６×ヒス−タグを欠いたＤＡＲＰｉｎまたは選抜した反復ドメインは、標準的な樹脂と当業者に知られている手法による陰イオン交換クロマトグラフィーと、その後のサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。大腸菌の１リットル培養から最大２００ｍｇの高度に可溶化された、ＨＧＦに対する結合特異性を有するＤＡＲＰｉｎを、９５％を超える純度で（ＳＤＳ−１５％ＰＡＧＥで予測）精製することができる。このような精製したＤＡＲＰｉｎを以降の解析に使用する。

【0165】

実施例２：ＨＧＦに対する結合特異性を有するＤＡＲＰｉｎの表面プラズモン共鳴解析による解析
ヒトＨＧＦ分子をフローセル内に直接固定し、選抜した様々なＤＡＲＰｉｎとの相互作用を解析した。

【0166】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析によるＫｄの決定
ＳＰＲはプロテオン装置（バイオラッド）を使用して測定し、また、測定は当業者に知られている標準的な手順に従って行った。泳動用緩衝液としては、０．００５％のツイーン２０（登録商標）含有のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使った。ヒトＨＧＦをＧＬＣチップ（バイオラッド）に、約５０００レゾナンスユニット（ＲＵ）のレベルまで共有的に固定した。その後、段階希釈したＤＡＲＰｉｎ（２５、１２．５、６．２６、３．１３および１．６７ｎＭの濃度）を含む泳動用緩衝液（０．００５％のツイーン（登録商標）含有ＰＢＳ）２００μＬを注入し（会合速度測定）、次いで泳動用緩衝液を一定の流速（１００μｌ／分）で２５分間流すことで（解離速度測定）、ＤＡＲＰｉｎとＨＧＦの相互作用を測定した。内部標準のスポットおよび参照注入（つまり泳動用緩衝液のみの注入）のシグナル（つまりレゾナンスユニット（ＲＵ）の値）を、ＤＡＲＰｉｎを注入した後に得られたＲＵの追跡結果から差し引いた（二重参照）。会合速度と解離速度の測定から得られたＳＰＲの追跡結果から、対応するＤＡＲＰｉｎ−ＨＧＦ間相互作用の会合速度と解離速度を決定することができる。図１にＤＡＲＰｉｎ＃５１のＳＰＲの追跡結果を例示する。平衡解離定数（Ｋｄ）は当業者に知られている標準的な手順を用いて予測された会合速度と解離速度から算出した。選抜したＤＡＲＰｉｎのＫｄ値は１０ｐＭ〜２０ｎＭの範囲であることが分かった。例として、選抜したいくつかのＤＡＲＰｉｎのＫｄ値を表１にまとめた。

【0167】

【表1】

【0168】

競合的ＳＰＲ分析
本発明の結合タンパク質がアンキリン反復ドメインとＨＧＦとの結合に競合するかどうか確認するため、第一のＤＡＲＰｉｎをヒトＨＧＦに飽和するまで結合させ、続いて第二のＤＡＲＰｉｎを注入することにより競合的ＳＰＲ解析を行った。第二のＤＡＲＰｉｎを注入した際にシグナルの増加が見られなかった場合、第一のＤＡＲＰｉｎと第二のＤＡＲＰｉｎはＨＧＦとの結合に競合すると定義した。シグナルの増加が見られた場合、第一のＤＡＲＰｉｎと第二のＤＡＲＰｉｎはＨＧＦとの結合に関して競合しないと定義した。ＨＧＦとの結合に競合する２つのＤＡＲＰｉｎおよびＨＧＦとの結合に競合しない２つのＤＡＲＰｉｎの解析の例をそれぞれ図２に示す。

【0169】

実施例３：ＨＧＦに対する結合特異性を有するＤＡＲＰｉｎによるＨＧＦ誘導性ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害
９６ウェルプレートに完全培地（ＤＭＥＭ；１０％ＦＢＳ）を入れ、１ウェル当たり５０，０００個のＡ５４９細胞を播種した。２４時間後、培地を無血清培地に取り替えた。細胞をさらに２４時間インキュべートし、ＤＡＲＰｉｎありおよびＤＡＲＰｉｎなしの条件で１ｎＭのヒトＨＧＦで刺激した。ＨＧＦおよびＤＡＲＰｉｎは細胞に加える前に室温で少なくとも３０分間プレインキュべートした。細胞培養の条件で細胞を１０分間刺激した。細胞上清を（指で軽くはじいて）除去し、細胞溶解緩衝液（ＲＩＰＡ；濃縮試薬希釈剤２；Ｒ＆Ｄシステムズ）を加えることで、刺激を終了した。細胞溶解物におけるリン酸化ｃ−Ｍｅｔ（Ｐ−ｃＭｅｔ）のレベルは、ヒトリン酸ＨＧＦ Ｒ／ｃ−ＭＥＴデュオセットＩＣ（Ｒ＆Ｄシステムズ）を製造業者による手順に従って使用して決定した。データは、グラフパッド・プリズムソフトウェア（グラフパッドソフトウェア社、カリフォルニア、米国）を使って解析した。リン酸化の阻害率（％）は、刺激していない対照から得られた光学濃度（ＯＤ）を阻害率１００％と設定し、阻害剤なしの対照から得られた光学濃度（ＯＤ）を阻害率０％と設定して算出した。阻害アッセイでは、データを対数（阻害剤）対応答／変数勾配に当てはめた。

【0170】

例示的な結果を表３にまとめている。ＩＣ₅₀値は、前述のようにして得た滴定曲線から、当業者に知られている標準的な手順を使用して算出した。阻害率は上述のように算出した。ＤＡＲＰｉｎ＃５１およびＤＡＲＰｉｎ＃４３に関する滴定曲線の例を図３に示す。

【0171】

【表2】

【0172】

実施例４：ＨＧＦに対する結合特異性を有するＤＡＲＰｉｎによるＵ８７細胞の増殖阻害
Ｕ８７細胞を１０％のＦＢＳ（プロモセル−サイトカイン−低濃度）を含むＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。細胞を１：３の割合で週に二回分配した。９６ウェルに１％のＦＢＳを含むＤＭＥＭを１００μｌ入れ、２５００個の細胞を播種し、一晩インキュべートした。翌日、ＤＡＲＰｉｎ（１０×最終濃度のものを１０μｌ）を添加し、さらに５日間インキュべートした。４日目に、ＢｒｄＵ標識液を１ウェルあたり１０μｌ添加した（１０μｌ、１：１０００希釈）。５日目に、製造業者の手順に従ってアッセイを行った。ＤＡＲＰｉｎを１０００ｎＭから２ｎＭの範囲で滴定した。本実験はグラフパッド・プリズムソフトウェアを使用して解析した。ＩＣ₅₀を得られた滴定曲線の非線形解析から算出した。

【0173】

例示的な結果を表４にまとめている。ＩＣ₅₀値を前述のようにして得た滴定曲線から、当業者に知られている標準的な手順を使用して算出した。ＤＡＲＰｉｎ＃５１およびＤＡＲＰｉｎ＃４３に関する滴定曲線の例を図４に示す。

【0174】

【表3】

【0175】

実施例５：ＨＧＦに対する結合特異性を有するＤＡＲＰｉｎの受容体競合アッセイによる解析
ヒトＨＧＦとその受容体であるｃ−Ｍｅｔとの結合を抗ＨＧＦ ＤＡＲＰｉｎが阻害する効果を、受容体競合的ＥＬＩＳＡを使用して決定した。ｃ−Ｍｅｔ（Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄシステムズ、米国、３５８−ＭＴ−１００／ＣＦ）を予めマイクロプレートに塗布しておいた。ＤＡＲＰｉｎおよびＨＧＦをＰＢＳＴＣ中で混合し、室温で０．５時間インキュべートした。これらの予めインキュべートしておいた混合物を、ｃ−Ｍｅｔを塗布しておいたウェルに移した。ＤＡＲＰｉｎによる阻害を受けなかったＨＧＦは、固定しておいた受容体に結合した。結合しなかった物質を洗い流した後、ＨＧＦ特異的なポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ、米国、ＡＦ−２９４−ＮＡ）をウェルに添加した。結合しなかった物質を洗い流した後、ＨＧＦ特異的ポリクローナル抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合抗体（ノバス バイオロジカルス、米国、ＮＢ７３５７）をウェルに加えた。結合していない抗体−酵素試薬を洗浄して除去した後、基質溶液（ロシュ、スイス、１１４８４２８１００１）をウェルに加えた。ＨＧＦ結合量に比例して呈色反応を示した。呈色反応を停止させ、色の濃度を４０５ｎｍで測定した。本アッセイにおいて、実験に用いたＤＡＲＰｉｎは高いＨＧＦ阻害効果を示した。例示的な結果を表５にまとめている。一連のＤＡＲＰｉｎに関する滴定曲線の例を図５に示す。ＩＣ₅₀値は、前述のようにして得た滴定曲線から、当業者に知られている標準的な手順を使用して算出した。

【0176】

【表4】

【0177】

実施例６：ＨＧＦに対する結合特異性を有するＤＡＲＰｉｎによるＵ８７腫瘍成長の阻害
１０⁷個のＵ８７−ＭＧ細胞をスイスヌードマウスの右脇腹に皮下注入した。腫瘍の平均サイズが１２６±５１ｍｍ³に達した２５日後、マウスを１群あたり８匹ずつ、治療群に無作為に振り分け、治療を開始した。マウスに３日おきに合計７回、０．１ｍｌの溶媒／ＰＢＳまたはＰＢＳに溶解した様々な濃度のＤＡＲＰｉｎ（０．１１ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇおよび１１ｍｇ／ｋｇ用量）を静脈注入した（Ｑ３Ｄ×７）。体重および腫瘍体積を週に二回監視した。この実験は治療開始から２１日経過後に終了させた。例として図６に、ペグ化ＤＡＲＰｉｎ＃６２による治療を開始してからの治療期間（日）に対する腫瘍体積をプロットしたものを示す。この腫瘍成長阻害実験で使用したＤＡＲＰｉｎは、Ｎ末端ヒス−タグ（配列番号９）、ＨＧＦに対する結合特異性を有する本発明のアンキリン反復ドメイン、ＧＳ−リンカー（配列番号１０）、およびＣ末端Ｃｙｓ残基を含む。ＤＡＲＰｉｎのタンパク質部分をヒス−タグを使用して標準的な手段で精製し、標準的なマレイミド化学反応を使用して４０ｋＤａのペグ（ＰＥＧ）に結合させた。本発明のアンキリン反復ドメインの終末相半減期を延ばすその他のよく知られている手法（前述のペグ化以外）を使用して、このような腫瘍モデルにおけるこれらドメインのインビボ効力を試験することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]