特許 6487145 ディフォシンおよびその使用の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6487145

(24)【登録日】2019年3月1日

(45)【発行日】2019年3月20日

(54)【発明の名称】ディフォシンおよびその使用の方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/31 20060101AFI20190311BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20190311BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20190311BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20190311BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20190311BHJP

   C07K 14/33 20060101ALI20190311BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20190311BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20190311BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/31ZAA

   A61K31/7088

   A61K35/74 A

   A61K48/00

   A61P31/04

   C07K14/33

   C12N1/21

   C12P21/02 C

【請求項の数】12

【全頁数】43

(21)【出願番号】特願2013-512273(P2013-512273)

(86)(22)【出願日】2011年5月27日

(65)【公表番号】特表2013-529910(P2013-529910A)

(43)【公表日】2013年7月25日

(86)【国際出願番号】US2011038358

(87)【国際公開番号】WO2011150342

(87)【国際公開日】20111201

【審査請求日】2014年4月30日

【審判番号】不服2016-14059(P2016-14059/J1)

【審判請求日】2016年9月20日

(31)【優先権主張番号】61/349,145

(32)【優先日】2010年5月27日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508340019

【氏名又は名称】アビッドバイオティクス コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100182730

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 浩明

(72)【発明者】

【氏名】ディーン エム．ショール

(72)【発明者】

【氏名】ダナ エム．ゲバート

(72)【発明者】

【氏名】スティーブン アール．ウィリアムズ

(72)【発明者】

【氏名】グレゴリー アール．ゴボーニ

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド ダブリュ．マーティン

【合議体】

【審判長】 中島 庸子

【審判官】 松浦 安紀子

【審判官】 高堀 栄二

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５３７１４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＦＮ５４５８１６， Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ Ｒ２０２９１ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ， ［ｏｎｌｉｎｅ］， 掲載日： ２００９／１０／１， Ｄａｔａｂａｓｅ ＥＭＢＬ， ＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎａ／ｄａｔａ／ｖｉｅｗ／ＦＮ５４５８１６＞

【文献】 Ｉｎｆｅｃｔ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｈｏｓｐ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，２００２年，Ｖｏｌ．２３， Ｎｏ．１１，ｐｐ．６４１−６４７

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＳＴＮ）

IPC C12N 15/00-15/90, C12P 1/00-41/00

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

殺細菌活性を有するＲ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンをコードする単離された核酸分子であって、ここで、当該核酸分子は、配列番号４〜１５からなるポリペプチドと、又は配列番号６６〜７７からなるポリペプチドと、少なくとも９０％同一であるポリペプチドを含むポリペプチドをコードし、
当該バクテリオシンが、配列番号４〜１５からなるポリペプチドと、又は配列番号６６〜７７からなるポリペプチドと、少なくとも９０％同一であるポリペプチドを発現する天然に存在する対応するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株のものとは異なる殺菌スペクトルを有し、
そして前記Ｒ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）が、配列番号４〜１５からなるポリペプチドと、又は配列番号６６〜７７からなるポリペプチドと、少なくとも９０％同一であるポリペプチドを発現する前記天然に存在する対応するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株とは異なるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株に由来し、又は、当該ＲＢＤが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染するバクテリオファージに由来し、又はプロファージに由来する、核酸分子。

【請求項2】

前記配列番号４〜１５からなるポリペプチドと、又は配列番号６６〜７７からなるポリペプチドと、少なくとも９０％同一であるポリペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸分子がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株のゲノム由来であり、当該Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株がＣｄ１６であり、かつ当該ゲノムが配列番号１のポリヌクレオチドを有する、又は当該Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株がＣｄ４であり、かつ当該ゲノムが配列番号６１のポリヌクレオチドを有する、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項3】

前記Ｒ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンが、配列番号１６または７８の５０以上の隣り合うアミノ酸のポリペプチドに対し少なくとも９０％同一であるポリペプチドからなるベースプレートアタッチメント領域（ＢＰＡＲ）を含む、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされる単離されたＲ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシン。

【請求項5】

請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子を含む発現カセット。

【請求項6】

前記核酸分子が、異種プロモーターに対して作動可能に連結され、当該異種プロモーターが、誘導性または抑制性プロモーターである、請求項５に記載の発現カセット。

【請求項7】

請求項５〜６のいずれか１項に記載の発現カセットを含む、又はその染色体内に請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、プロデューサー細胞。

【請求項8】

前記細胞が、非病原性でかつ非偏性嫌気性の細菌であり、当該非病原性でかつ非偏性嫌気性の細菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＬｉｓｔｅｒｉａからなる群より選択される細菌の属由来の種である、請求項７に記載のプロデューサー細胞。

【請求項9】

Ｒ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンを産生する方法であって、
誘導性プロモーターに対して作動可能に連結される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子を含むプロデューサー細胞を、誘導剤に対して、Ｒ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンの発現を誘導するのに有効な濃度で暴露することと、
この発現されたＲ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンを精製することと、
を包含し、当該Ｒ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンをコードする前記核酸分子が、前記プロデューサー細胞の前記ゲノムに対して異種であり、かつ前記核酸分子が、プロデューサー細胞の染色体内に含まれるか、または前記プロデューサー細胞内の染色体外発現ベクターに含まれる、産生方法。

【請求項10】

前記プロデューサー細胞が、非病原性でかつ非偏性嫌気性の細菌であり、当該非病原性でかつ非偏性嫌気性の細菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＬｉｓｔｅｒｉａからなる群より選択される細菌の属由来の種であり、かつ当該プロデューサー細胞が、Ｒ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンを産生するように誘導されるとき、溶解しないものである、請求項９に記載の産生方法。

【請求項11】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを殺傷するための医薬組成物であって、請求項４に記載のＲ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンを含有し、当該医薬組成物がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅと接触することによって前記Ｒ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンが、病原性細菌に結合しかつ殺傷する、医薬組成物。

【請求項12】

動物におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの感染を治療するための医薬組成物であって、請求項４に記載のＲ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシン、又は請求項７若しくは請求項８に記載のプロデューサー細胞を含有する、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、あたかも詳細に示されるかのように参照によってその全内容が援用される、現在係属中の、２０１０年５月２７日出願の米国特許仮出願第６１／３４９，１４５号から米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて優先権の恩典を主張する。

【0002】

発明の分野
本出願は概して、バクテリオシン、およびさらに詳細には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを特異的に殺傷するＲ型の高分子量バクテリオシンを産生するために十分な遺伝子のクラスターの特定および単離、ならびにバクテリオシンの殺菌特性を変更する方法、バクテリオシンを産生および使用する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、偏性の嫌気性で、芽胞形成の、グラム陽性細菌であって、ヒトおよび他の哺乳動物のための悪名高い病原体である（Ｂａｒｔｌｅｔｔら、１９７７；Ｂａｒｔｌｅｔｔら、１９７９；Ｋｅｅｌら、２００７；Ｓｕｎｅｎｓｈｉｎｅ ＆ ＭｃＤｏｎａｌｄ，２００６）。低密度では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、哺乳動物の胃腸（ＧＩ）管では無害のままであり得るが、増殖の際、片利共生生物細菌Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌を減少する抗生物質投与の結果として高頻度に、十分な外毒素を生成して、軽度の下痢性疾患由来のある範囲の疾患を、特徴的な偽膜性の大腸炎（生命にかかわる）に、特により高齢のヒトおよび有意な併存疾患を有するその他のヒトに対して生じさせる（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，２００２）。

【0004】

この病原体によって形成される芽胞は、広範に広がり、病院および慢性治療施設で根絶または不活化することが困難であり、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって感染される患者の確率は、このような施設に入る際に、急激に増大する（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，２００７）。実際、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの超毒性の毒素産生性細菌株であるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの比較的新しい株、ＢＩ／ＮＡＰ １／０２７（大規模感染の状況では重篤な疾患を生じる）は近年、よく考証されている（Ｓｐｉｇａｇｌｉａら、２００２；Ｐｅｐｉｎら、２００４；ＭｃＤｏｎａｌｄら、２００５；Ｍｕｔｏら、２００５；Ｌｏｏら、２００５；Ｂｅｌｍａｒｅｓら、２００９）。小児におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患（ＣＤＡＤ）の出現頻度は以前には低リスクであり、また実質的に増大した（Ｂｅｎｓｏｎら、２００７；Ｚｉｌｂｅｒｂｅｒｇら、２０１０）。

【0005】

抗生物質を投与することによって無症候性キャリアまたは細菌感染している被験体において予防的に病原体を排除することは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連の疾患を誘発するリスクが高いせいで、強く禁忌とされる。

【0006】

グラム陰性細菌によって作製されるＲ型のバクテリオシンは、記載されており、他の競合的なグラム陰性株、さらにいくつかの状況では、グラム陰性細菌の他の種または属を殺傷するために、このような細菌によって配備された（Ｋａｇｅｙａｍａら、１９６４；Ｋａｇｅｙａｍａら、１９６４ａ；Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，Ｄ，１９６６；ＢｌａｃｋｗｅｌｌおよびＬａｗ，１９８１；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら、１９８２；Ｃａｍｐａｇｎａｒｉら、１９９４；Ｓｔｒａｕｃｈら、２００１；Ｊａｂｒａｎｅら、２００２）。グラム陰性細菌に対して新規な殺菌特性を有する新規なＲ型のピオシン類の創出を生じる、異種レセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）に対するＲ型ピオシンのベースプレートアタッチメント領域（ＢＰＡＲ）の融合は、記載されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２００８；Ｓｃｈｏｌｌら、２００９）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

他の高分子量バクテリオシンまたはＲ型のバクテリオシンは、グラム陽性の細菌で記載されている（Ｃｏｅｔｚｅｅら、１９６８；ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＰａｔｔｅｅ，１９８１；Ｚｉｎｋら、１９９５）。しかし、グラム陽性細菌によって生成される、Ｒ型の高分子量バクテリオシンの構造についてはほとんど公知でない。しかし、このような記載はあるが、遺伝子レベルで特徴づけられてはおらず、有用な因子を開発するのに支持するかまたは必要な方式で操作もされていない。高分子量バクテリオシンは、２つのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種である、ｂｏｔｕｌｉｎｕｍおよびｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓについて記載された（ＥｌｌｉｓｏｎおよびＫａｕｔｔｅｒ，１９７０；Ａｎａｓｔａｓｉｏら、１９７１；Ｎｉｅｖｅｓら、１９８１）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって生成されることも、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを殺傷することも記載したものはない。

【課題を解決するための手段】

【0008】

発明の要旨
本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの他の株に対して殺菌性である、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ特異的なＲ型バクテリオシン（本明細書では、「ディフォシン類」と呼ぶ）をコードする全体的な遺伝子座または遺伝子クラスターの単離；好気性細菌中でのディフォシン遺伝子クラスターの発現およびディフォシンの産生；ならびにディフォシン遺伝子クラスターのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１３７４が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株に対するそのディフォシンの殺菌性スペクトルを決定するという発見に基づく。本発明は、新規なディフォシンを産生するための遺伝子操作によるディフォシンの特異性の変更という実用的な手段、およびその製造、ならびにヒトを含む、細菌感染した動物の胃腸（ＧＩ）管からＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを排除するためのディフォシンの直接的または間接的な投与を提供する。ディフォシン類の投与は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染および関連する疾患の発症を、伝統的な抗生物質のように、良好な健康状態に必要な片利共生生物ＧＩ細菌に悪影響することなく処置または予防し得る。

【0009】

本発明によれば、Ｒ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンをコードする単離された核酸分子が提供される。一実施形態では、Ｒ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンをコードする単離された核酸分子であって、ここで、この核酸分子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのある株のあるゲノム由来であり、かつここで、このＲ型のｈｍｗバクテリオシンは、配列番号４〜１６、１８、１９、および６６〜８０からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも８０％同一であるポリペプチドを含み、かつこのＲ型のｈｍｗバクテリオシンは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの少なくとも１つの他の株のレセプターに結合するレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）を有し、従ってＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの他の株（単数または複数）に対する殺菌活性を有する、核酸分子が提供される。特定の実施形態では、上記核酸分子は、Ｃｄ４、Ｃｄ１６、Ｃｄ１９１０８、Ｃｄ１９１２３、Ｃｄ１９１２６、Ｃｄ１９１４５、およびＡＴＣＣアクセッション番号４３５９３からなる群より選択されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのある株のあるゲノム由来である。いくつかの実施形態では、この株は、Ｃｄ１６であり、この核酸分子は、配列番号１を含むか、またはこの株は、Ｃｄ４であり、この核酸分子は、配列番号６１を含む。

【0010】

本発明の別の実施形態では、本発明の核酸分子によってコードされる単離されたＲ型のバクテリオシンが提供される。一態様では、このＲ型のバクテリオシンは、好気性プロデューサー細菌中で発現される。

【0011】

本発明の別の実施形態では、殺菌活性を有する、単離されたＲ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンであって、ここでこのＲ型のｈｍｗバクテリオシンが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌の第一の種の第一の株のベースプレートアタッチメント領域（ＢＰＡＲ）、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の上記第一の種の第二の株由来、もしくは第二の種由来、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種に感染するバクテリオファージのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）、あるいはＲＢＤの改変型を含み、ここで上記バクテリオシンが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの少なくとも１つの株に対する殺菌活性を有する、Ｒ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンが提供される。特定の実施形態では、ＢＰＡＲは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの第一の株由来であり、かつ上記ＲＢＤは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの第二の株由来、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染するバクテリオファージ由来である。いくつかの実施形態では、このＢＰＡＲは、配列番号１６、５４〜５６および７８の１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも８０％同一である。他の実施形態では、このＲＢＤは、配列番号１７および４９〜５６の１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも８０％同一である。特定の実施形態では、このＢＰＡＲは、配列番号１６もしくは７８の５０個以上連続するアミノ酸を含有するか、または配列番号５４〜５６の５０個以上連続するアミノ酸を含有するポリペプチドに対して少なくとも８０％同一である。

【0012】

本発明の別の実施形態では、本発明の核酸分子を含有する発現カセットが提供される。発現カセットは、プラスミドのような発現ベクター内に含まれてもよいし、またはプロデューサー細胞の染色体内に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、この発現カセットは、Ｒ型のバクテリオシンをコードする核酸分子に対して作動可能に連結された異種プロモーターを含む。このプロモーターは誘導性であっても、抑制性であっても、または構成的に活性であってもよい。一態様では、このプロモーターは誘導性であり；別の態様では、プロモーターは抑制性である。いくつかの実施形態では、このプロモーターは低分子のインデューサー、リプレッサー、またはデ−リプレッサーを付加または除去することによって誘導される。一態様では、このプロモーターは、低分子のインデューサーまたはデ−リプレッサーによって誘導される。特定の態様では、カセットの発現は、構成的に活性なＲｅｃＡタンパク質をコードする作動可能に連結されたｒｅｃＡ遺伝子によって、および低分子のインデューサーまたはデ−リプレッサーに対応する異種プロモーターの制御下で調節される。

【0013】

本発明のさらに別の実施形態では、本発明の発現カセットを含有するプロデューサー細胞が提供される。発現カセットは、プロデューサー細胞内のエピソーム発現ベクターに含まれてもよい。あるいは、プロデューサー細胞は、本発明の核酸分子または発現カセットをその染色体内に含んでもよい。特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、非病原性でかつ非偏性嫌気性の細菌である。いくつかの実施形態では、この非病原性でかつ非偏性嫌気性の細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＬｉｓｔｅｒｉａからなる群より選択される細菌の属に由来する種である。特定の実施形態では、この非病原性でかつ非偏性嫌気性の細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来である。いくつかの態様では、この細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓである。特定の態様では、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは、ＰＢＳＸ遺伝子クラスターを欠く。別の実施形態では、このプロデューサー細胞は、偏性嫌気性であるが、非病原性の細菌である。

【0014】

本発明のさらに別の実施形態では、本発明のＲ型のｈｍｗバクテリオシンを産生する方法が提供される。この方法は、誘導剤または抑制剤に対して感受性の誘導性プロモーターまたは脱抑制性プロモーターに対して作動可能に連結された本発明の核酸配列を含むプロデューサー細胞を、この剤に対してＲ型のバクテリオシンの発現を誘導するのに有効な濃度で暴露することと、この発現されたＲ型のバクテリオシンを精製することとを包含する。いくつかの実施形態では、Ｒ型のバクテリオシンをコードする核酸分子は、プロデューサー細胞のゲノムに対して異種である。特定の態様では、この核酸分子は、プロデューサー細胞の染色体中に含まれるか、またはプロデューサー細胞内の染色体外発現ベクター中に含まれる。特定の実施形態では、このプロデューサー細胞は、非病原性でかつ非偏性嫌気性の細菌である。いくつかの実施形態では、この非病原性でかつ非偏性嫌気性の細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＬｉｓｔｅｒｉａからなる群より選択される細菌の属由来の種である。特定の実施形態では、この非病原性でかつ非偏性嫌気性の細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来である。いくつかの態様では、この細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓである。特定の態様では、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは、Ｒ型のバクテリオシンを産生するように誘導されるとき、溶解しない。さらなる態様では、このＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは、ＰＢＳＸ遺伝子クラスターを欠く。

【0015】

本発明のさらなる実施形態では、病原性細菌を殺傷する方法が提供される。この方法は、この病原性細菌と本発明のＲ型のバクテリオシンとを接触させ、それによって、Ｒ型のバクテリオシンがこの病原性細菌に結合して殺傷することを包含する。一態様では、この病原性細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。一態様では、このＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、動物中にあり、そして殺菌量のＲ型のバクテリオシンが、この動物に投与される。

【0016】

本発明の別の実施形態では、動物においてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの疾患発生性の感染を処置または予防する方法が提供される。この方法は、本発明のＲ型のバクテリオシンの殺菌量を、その必要な動物に直接的に投与すること、この剤をプロデューサー細胞によって間接的に投与すること、または天然のディフォシン類を産生するが、毒素を産生しないように遺伝的に操作されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌の芽胞を投与することを包含する。特定の実施形態では、動物におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの感染は、殺菌量のバクテリオシンを産生する本発明のプロデューサー細胞の量を、その必要な動物に対して投与して、それによってその感染を処置することによって処置される。一態様では、バクテリオシンをコードする核酸は、ｌａｃプロモーターの制御下であり、かつこの動物は、ラクトースを投与される。いくつかの実施形態では、この動物は哺乳動物である。一態様では、この哺乳動物はヒトである。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1-1】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-2】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-3】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-4】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-5】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-6】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-7】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-8】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-9】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-10】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-11】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-12】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-13】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-14】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-15】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-16】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-17】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-18】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-19】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-20】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-21】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-22】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-23】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-24】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-25】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-26】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-27】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-28】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-29】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-30】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-31】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図1-32】図１は、配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸の配列を示す。

【図2】図２。臨床的なＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ単離体に対するディフォシン類の殺菌活性。指標株の番号は、行列の上に沿って示す；星印の株は、ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ株である。試験したディフォシン類のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ供給源の特定は、左の縁に沿って示す。株は、ＬＣ Ｆｏｒｔｉｅｒ（４および１６）、ＡＴＣＣ（４３５９３）、またはＲＭ Ａｌｄｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ、Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手した。

【図3】図３は、ｄｉｆ１６の走査電子顕微鏡写真を示す。花状のテールファイバー（ｔａｉｌ ｆｉｂｅｒ）付属物に注目のこと。

【図4】図４は、標的株Ｃｄ１９１３５上のｄｉｆ４のスポット試験の結果の写真を示す。精製されたディフォシンは、１０倍連続希釈して、５μｌのアリコートの希釈物を、標的のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌叢の上にスポットした。３７℃で一晩の嫌気性のインキュベーション後、ディフォシンの殺傷は、細菌叢上の増殖の除去によって示される。

【図5】図５は、ｄｉｆ４（「４」）およびｄｉｆ１６（「１６」）の濾過（ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（「Ｆ」）および非濾過（ｕｎｆｉｌｔｅｒｅｄ）（「ＵＦ」）調製物の両方の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真を示す。この矢印は、切り出されて、質量分析法によって特定されたバンドを示す。

【図6】図６は、Ｃｄ６３０およびＣｄ１６由来のディフォシン遺伝子クラスターの模式図を示す。この遺伝子座は、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅのファージテール装置に典型的な構造タンパク質および構造アセンブリタンパク質をコードするＯＲＦであるＯＲＦ１３６２〜ＯＲＦ１３７５（このマップの下に示す）から構成された。これらの遺伝子に隣接するのは、推定のファージ様調節性タンパク質をコードする遺伝子であった。下の矢印は、ＯＲＦが転写される方向を示しており、ＯＲＦの推定の機能は、マップの上に示される。

【図7】図７は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株１９０９９の細菌叢で試験されるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＤＲ１２３−４８８（セクター１）およびＢＤＲ１２３−４９１（セクター２）によって産生されるｄｉｆ１６のスポット試験の画像を示す。

【図8-1】図８は、活性なディフォシン類を産生したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの５株の各々由来のＯＲＦ１３７４遺伝子によってコードされる部分的アミノ酸配列（それぞれ、出現順で、配列番号８１〜８６）のＣｌｕｓｔａｌＷ分析の結果を示す。整列した配列の各々の列の下で「^＊」は、全ての５つの遺伝子によってコードされるその位置でのアミノ酸同一性を示し、「：」は、全ての５つの遺伝子によってコードされるその位置での高度に類似のアミノ酸を示し、そして「．」は、全ての５つの遺伝子によってコードされるその位置でのある程度類似のアミノ酸を示し；そして配列の整列における所定の位置でのブランクは、全ての５つの遺伝子によってコードされるアミノ酸類似性がないことを示す。

【図8-2】図８は、活性なディフォシン類を産生したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの５株の各々由来のＯＲＦ１３７４遺伝子によってコードされる部分的アミノ酸配列（それぞれ、出現順で、配列番号８１〜８６）のＣｌｕｓｔａｌＷ分析の結果を示す。整列した配列の各々の列の下で「^＊」は、全ての５つの遺伝子によってコードされるその位置でのアミノ酸同一性を示し、「：」は、全ての５つの遺伝子によってコードされるその位置での高度に類似のアミノ酸を示し、そして「．」は、全ての５つの遺伝子によってコードされるその位置でのある程度類似のアミノ酸を示し；そして配列の整列における所定の位置でのブランクは、全ての５つの遺伝子によってコードされるアミノ酸類似性がないことを示す。

【図8-3】図８は、活性なディフォシン類を産生したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの５株の各々由来のＯＲＦ１３７４遺伝子によってコードされる部分的アミノ酸配列（それぞれ、出現順で、配列番号８１〜８６）のＣｌｕｓｔａｌＷ分析の結果を示す。整列した配列の各々の列の下で「^＊」は、全ての５つの遺伝子によってコードされるその位置でのアミノ酸同一性を示し、「：」は、全ての５つの遺伝子によってコードされるその位置での高度に類似のアミノ酸を示し、そして「．」は、全ての５つの遺伝子によってコードされるその位置でのある程度類似のアミノ酸を示し；そして配列の整列における所定の位置でのブランクは、全ての５つの遺伝子によってコードされるアミノ酸類似性がないことを示す。

【図8-4】図８は、活性なディフォシン類を産生したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの５株の各々由来のＯＲＦ１３７４遺伝子によってコードされる部分的アミノ酸配列（それぞれ、出現順で、配列番号８１〜８６）のＣｌｕｓｔａｌＷ分析の結果を示す。整列した配列の各々の列の下で「^＊」は、全ての５つの遺伝子によってコードされるその位置でのアミノ酸同一性を示し、「：」は、全ての５つの遺伝子によってコードされるその位置での高度に類似のアミノ酸を示し、そして「．」は、全ての５つの遺伝子によってコードされるその位置でのある程度類似のアミノ酸を示し；そして配列の整列における所定の位置でのブランクは、全ての５つの遺伝子によってコードされるアミノ酸類似性がないことを示す。

【図8-5】図８は、活性なディフォシン類を産生したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの５株の各々由来のＯＲＦ１３７４遺伝子によってコードされる部分的アミノ酸配列（それぞれ、出現順で、配列番号８１〜８６）のＣｌｕｓｔａｌＷ分析の結果を示す。整列した配列の各々の列の下で「^＊」は、全ての５つの遺伝子によってコードされるその位置でのアミノ酸同一性を示し、「：」は、全ての５つの遺伝子によってコードされるその位置での高度に類似のアミノ酸を示し、そして「．」は、全ての５つの遺伝子によってコードされるその位置でのある程度類似のアミノ酸を示し；そして配列の整列における所定の位置でのブランクは、全ての５つの遺伝子によってコードされるアミノ酸類似性がないことを示す。

【図9】図９は、ＢＤＲ１２３−５８０によって産生される「Ｄｉｆ４」および「Ｄｉｆ４−１６」のスポット試験の画像である。後者は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＤＲ１２３−５８７によって産生され、ここではｄｉｆ４のｏｒｆ１３７４（配列番号４９）が、ｄｉｆ１６のｏｒｆ１３７４（配列番号１７）に切り替わっていた。これらのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓによって産生される２つのディフォシンは両方とも、示すとおり、株１９１３７および１９１４５の細菌叢で試験した。「Ｄｉｆ４−１６」による殺傷の特異性は、ｄｉｆ４の特異性からｄｉｆ１６の特異性に切り替わった。

【発明を実施するための形態】

【0018】

発明の詳細な説明
定義
本明細書において用いる場合、「Ｒ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシン」とは、単純に、「Ｒ型のバクテリオシン」としても公知であり、そしてＲ型のピオシン類、ディフォシン類、モノシン類（ｍｏｎｏｃｉｎｓ）、エンテロコリチシン類（ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃｉｎｓ）、メニンゴシン類（ｍｅｎｉｎｇｏｃｉｎｓ）、または他の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシン（ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ科のバクテリオファージに構造的にまたは遺伝的に関連する）が挙げられる。Ｒ型のバクテリオシンとしては、改変バージョンのＲ型のピオシン類、ディフォシン類、エンテロコリチシン類、モノシン類およびメニンゴシン類が挙げられる（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２００８；Ｓｔｒａｕｃｈら、２００１；Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，１９６６；Ｚｉｎｋら、１９９５）。

【0019】

本明細書において用いる場合、「ディフォシン」という用語は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅから単離されるか、またはそれに由来するＲ型の高分子量バクテリオシンを指し、これには、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅから得られる天然の粒子、および天然でないプロデューサー細胞におけるディフォシン遺伝子クラスターの発現を通じて得られる粒子が挙げられる。ディフォシンはまた、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの１つ以上の株由来の遺伝子によってコードされ、かつ配列番号２〜２３、４９および６２〜８０の１つ以上のポリペプチドに対して８０％以上同一であるポリペプチドから構成される遺伝子操作された粒子であってもよい。

【0020】

本発明のＲ型のバクテリオシンは、熱不安定性で、軽度酸耐性で、トリプシン耐性で、約６５，０００×ｇの遠心分離によって沈降性で、かつ電子顕微鏡によって解像可能であり得る（Ｋａｇｅｙａｍａら、１９６２；Ｂｒａｄｌｅｙ，１９６７；Ｄａｗら、１９９６；Ｊａｂｒａｎｅら、２００２；Ｆｏｒｔｉｅｒら、２００７）。多くの場合、本明細書で開示される遺伝子操作されたＲ型のバクテリオシンは、これらの特性のうち１つ以上を任意の組み合わせで有する。本明細書に開示されるＲ型のバクテリオシンに共通の追加的な特性は、それらが核酸を含まず、従って、複製欠損であり、その結果、多くのバクテリオファージで可能であるように、標的細菌の殺傷後、またはその間、それら自体を再生できないということである。それらは、純粋なタンパク質であって、生物体ではない。

【0021】

本明細書で開示されるＲ型のバクテリオシンは、複数のタンパク質、またはポリペプチド、サブユニットを含む複雑な分子であり、ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ科のバクテリオファージのテール構造を模倣する。天然に存在するＲ型のバクテリオシンでは、サブユニット構造は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅまたはＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのゲノムのような細菌ゲノムによってコードされ、他の細菌に対して天然の防御として機能するＲ型のバクテリオシンを形成する（Ｋａｇｅｙａｍａ，１９７５）。感受性の標的細菌は、典型的には、単一のＲ型のバクテリオシン分子によって殺傷される（Ｋａｇｅｙａｍａら、１９６４；Ｋａｇｅｙａｍａら、１９６４ａ；Ｍｏｒｓｅら、１９８０；Ｓｔｒａｕｃｈら、２００１）。

【0022】

「標的細菌」または「標的細菌」とは、開示のＲ型のバクテリオシンによって結合されるか、および／またはその増殖、生存もしくは複製がそのバクテリオシンによって阻害される細菌（単数または複数）を指す。いくつかの実施形態では、この標的細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ属由来である。特定の実施形態では、この細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。一態様では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの２つ以上の株が標的される。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの例示的な株としては限定するものではないが、ＮＡＰ１／ＢＩ／リボタイプ０２７、および図２に列挙される株が挙げられる。

【0023】

「成長阻害」という用語、またはその変化型は、細菌細胞の分裂の速度の減速もしくは停止、または細菌細胞分裂の休止、あるいは細菌（単数または複数）の死滅を指す。

【0024】

本明細書において用いる場合、「核酸」または「核酸分子」とは典型的に、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマー（純粋または混合）を、一本鎖型または二本鎖型で指す。この用語は、ヌクレオチドアナログもしくは改変骨格残基もしくは連結を含む核酸であって、合成、天然に存在するおよび天然には存在せず、参照核酸と同様の結合、構造または機能的特性を有し、そして参照ヌクレオチドと同様の方式で代謝される、核酸を包含する。このようなアナログの例としては限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−０−メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。核酸という用語は、いくつかの状況では、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと交換可能に用いられ得る。

【0025】

特定の核酸配列は、その保存的に改変された改変体（縮退コドン置換、など）、および相補配列、ならびに明示された配列も包含する。特に、縮退コドン置換は、１個以上の選択された（または全ての）コドンの第三（「ウォッブル（ｗｏｂｂｌｅ）」）の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成されてもよい。従って、本明細書で開示するタンパク質配列をコードする核酸配列は、本明細書で記載されるとおり、その改変された改変体も包含する。

【0026】

「セグメント」という用語は、アミノ酸配列に関して、本明細書において用いる場合、１０、１２、１５、２０、２５、５０または１００アミノ酸残基長であり得るアミノ酸の連続配列を指す。

【0027】

本明細書において用いる場合、「異種」という用語は、タンパク質または核酸配列の一部に関して用いる場合、この配列が、自然にはお互いと同じ関係で通常は見いだされない２つ以上の配列を含むということを示す。一例では、この異種配列は、異なる種の細菌由来である。別の例では、異種配列は、同じ種の細菌の異なる株由来である。一態様では、異種配列は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの異なる株由来である。別の態様では、異種配列は、細菌およびバクテリオファージ由来であるか、または細菌および合成の非天然のＤＮＡの配列由来である。

【0028】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、通常、本明細書において交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを意味する。アミノ酸は、本明細書では、一般に公知の３文字記号で表してもよいし、またはＩＵＰＡＣ‐ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号で表してもよい。

【0029】

毒性因子は、生物体の病原性に寄与するが、その一般的な生存能には必ずしも寄与しない分子である。毒性因子が消失すれば、生物の病原性は下がるが、必ずしも生存能が下がるとは限らない。毒性因子は、多くの機能、例えば、遺伝子発現の制御、接着性もしくは移動性の提供、毒素の提供、毒素の注入、抗生物質の排出、またはバイオフィルムを含む防御皮膜の形成のうちのいずれか１つを有し得る。

【0030】

適応性因子（ｆｉｔｎｅｓｓ ｆａｃｔｏｒ）とは、生物のその環境下での一般的な生存能、増殖速度、または競合性に寄与する分子である。適応性因子が消失すれば、その生物体は生存能または競合性が低下し、この障害によって、間接的に病原性が低下する。適応性因子はまた、多数の機能、例えば、栄養素、イオンもしくは水の摂取、細胞膜もしくは細胞壁の構成要素もしくは保護剤の形成、核酸の複製、修復もしくは変異誘発、環境的なもしくは競合的な攻撃からの防御もしくはそれに対する攻撃の提供のうちのいずれか１つを保有してもよい。

【0031】

「プロデューサー細胞」という用語は、本明細書において用いる場合、ディフォシンコード核酸分子を産生できるか、または発現できて、このような核酸分子を天然には含まない細胞を指す。プロデューサー細胞は、酸素の存在下で生存および増殖し得、そして、ディフォシンをコードする核酸分子を含むベクターで形質転換されており、このベクターは、このプロデューサー細胞の染色体に組み込まれてもよいし、またはエピソーム性であってもよい。このプロデューサー細胞は、グラム陽性細菌であり得る。特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、またはＬｉｓｔｅｒｉａという属由来の細菌であってもよい。いくつかの実施形態では、細菌は、ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、およびｍｅｇａｔｅｒｉｕｍからなる群より選択されるＢａｃｉｌｌｕｓ属由来の種である。一態様では、この細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓである。特定の態様では、プロデューサー細胞は、ＰＢＳＸ遺伝子クラスターを欠くＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株である。他の実施形態では、この細菌は、ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、ｃａｓｅｉ、およびｂｕｌｇａｒｉｃｕｓからなる群より選択されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来の種である。さらに他の実施形態では、この細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａである。別の実施形態では、非病原性プロデューサー細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉであっても、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細胞であってもよい。

【0032】

本開示を実施する形態の詳細な説明
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅから単離されたＲ型バクテリオシンは殺菌活性を有する。
殺菌活性について試験するため、２つのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株の溶解物、Ｃｄ４およびＣｄ１６（ＬＣ Ｆｏｒｔｉｅｒ由来）を、厳密な嫌気性の条件下で完全に細胞を中対数期まで増殖すること、次いでこの培養物を３μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣに曝すことによって作製した。細菌細胞が溶解した後、溶解液中の粒子を濃縮して、高速の遠心分離によって精製した（実施例１を参照のこと）。これらの調製物は、電子顕微鏡によって、濃い頭部なしのファージ様粒子を含むことが示された（図３）。濃縮および精製の後、沈殿物をスポットプレート法によって殺菌活性について評価し、それによってサンプルを標的のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌の積層の細菌叢に、再度、厳密な嫌気性の条件下で加えた。ほとんどのファージテール様のバクテリオシンは、典型的には標的の産生細菌とは異なる株を標的するので、２９のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの臨床単離体のパネルから最初に構成されている標的株を試験した。一晩のインキュベーション後、プレートを、精製した物質をスポットした、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌の細菌叢における排除によって示される殺傷活性の存在について試験した。図４は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株、Ｃｄ１９１３５上にスポットしたＣｄ４由来のディフォシン（ｄｉｆ４）の典型的なスポットアッセイを示す。

【0033】

ｄｉｆ４（Ｃｄ４由来のディフォシン）およびｄｉｆ１６（Ｃｄ１６由来のディフォシン）は、スポットアッセイに基づく異なる殺菌スペクトルを示した（図２）。ｄｉｆ４は、２９のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの臨床単離体株のうち１０個で殺菌活性を示したが、ｄｉｆ１６は、２９株のうち８つに対して活性を有した。両方のディフォシン類に対して影響を受けやすい株にはある程度の重複があるが、２つのディフォシン類は、別個の殺菌スペクトルを有した。Ｃｄ１０８およびＣｄ４３５９３由来のディフォシン類は、極めて類似の殺傷スペクトルを有し、かつ２９個のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ臨床単離体のパネルにおける１０個のＮＡＰ１／０２７／ＢＩ超毒性株のうち少なくとも９つを殺傷した。さらに試験した場合、ｄｉｆ４３５９３は、全ての１８個の追加の独立したＮＡＰ１／０２７／ＢＩ単離体を殺傷した。従って、ｄｉｆ４３５９３は、ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの全ての２８個の試験された株を殺傷する（図２）。

【0034】

ディフォシン遺伝子座の特定
ディフォシン粒子（株Ｃｄ４から単離して精製した）を変性し、そのタンパク質成分を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）によって分離して、銀染色によって検出した（図５）。２つの個々のバンド（約２００ｋＤおよび約４０ｋＤ）を、切り出して、質量分析によって分析した。４０ｋＤのバンド由来のペプチドは、参照株Ｃｄ６３０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００９０８９．１）を含む、完全なゲノムが配列決定された、いくつかのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株においてコードされる２つのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）由来の予測される生成物に適合することが見出された。これらの最初は、ＯＲＦ１３６３（配列番号５）、３９，１９２ダルトンのファージ様のタンパク質であった。このバンドにおける第二の優勢なポリペプチドは、ＯＲＦ１３７１（配列番号１４）、３９，５６５ダルトンのファージ様のベースプレートタンパク質に相当した。これらのタンパク質は、分子量では偶然、極めて近いので、それらは、同じＳＤＳ ＰＡＧＥのバンドで泳動した。２００ｋＤのバンドは、２つの他のファージ様ＯＲＦのすぐ下流、ＯＲＦ１３７４（配列番号１７）のＣ末端の一部に相当する優勢なポリペプチドを生じた。

【0035】

これらのＯＲＦは、Ｃｄ６３０ゲノム内で極めて近位にマッピングされるので、周囲の領域を分析した。プロファージ様のエレメントが、ＯＲＦ１３６０Ａ−１３７９を含む、塩基１５７４５９３と１５９６３８４との間で見出された（図６および配列番号１〜２３）。特に注目されるのは、この領域中でコードされる構造遺伝子が、典型的なＭｙｏｖｉｒｉｄａｅファージのテール構造の成分にのみ対応するということであった；カプシド、カプシドアセンブリタンパク質、またはポータル（ｐｏｒｔａｌ）タンパク質の遺伝子は見出されなかった。また、推定のＤＮＡ複製、またはＤＮＡパッケージング機構をコードするＯＲＦもなかった。従って、この遺伝子座は、Ｒ型の（ミオウイルス科ファージテール様）バクテリオシンの遺伝子座と一致した。構造遺伝子に隣接するのは、推定のファージ様の調節性タンパク質をコードするいくつかのＯＲＦであった。この遺伝子座由来のいくつかのＯＲＦは、ディフォシン粒子に見出されるポリペプチドをコードし、および遺伝子クラスターは、Ｒ型のバクテリオシンのものを模倣したという事実のために、本発明者らは、この領域へディフォシン遺伝子座を割り当てた。

【0036】

この構造遺伝子は全て、一本鎖上にコードされ、そして同じ方向に転写された。この遺伝子の機構は、Ｒ型のピオシン類および多くのミオウイルス科ファージの遺伝子の機構を模倣した。構造タンパク質のいくつかは、ファージΦ１１９およびΦＣ２を含めて公知の
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅバクテリオファージに対して配列類似性を示した（Ｇｏｈら、２００７；Ｇｏｖｉｎｄら、２００６）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株Ｃｄ６３０はまた、２つのインタクトなプロファージをコードすることが公知であり、そのプロファージの両方とも誘導性であることが公知であった（Ｇｏｈら、２００７）。ディフォシンＯＲＦのいくつかは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株Ｃｄ６３０のプロファージ１および２に対して配列類似性を有し、これによって、これらのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅミオウイルス科ファージおよびディフォシン類が、共通の祖先を共有するということが示唆される。

【0037】

特に注目されるのは、ディフォシンのＯＲＦ１３７４（配列番号１７）であった。この遺伝子は、ＯＲＦ１３７３、配列番号１６のすぐ下流に位置する大きいポリペプチドをコードし、このクラスター中の位置は、ＯＲＦ１３７４が、Ｒ型のバクテリオシンテールファイバーの一部、すなわち、レセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）であることを示した。ディフォシン類と命名されたものの電子顕微鏡写真によって、テールファイバー領域で大きい花状の構造が明らかになったので、この構造は、大きいタンパク質を含むということが明らかになった。ＯＲＦ１３７３（配列番号１６）は、ディフォシンテールファイバーのベースプレートアタッチメント領域（ＢＰＡＲ）をコードし、ＲＢＤをコードしたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのファージにおける類似のＯＲＦ１３７３の短縮型、およびＢＰＡＲである（このようなファージがＯＲＦ１３７４を欠くと仮定する場合）、ことが明らかになった。従って、天然に存在するディフォシン類のテールファイバーは、２つのタンパク質、ＯＲＦ１３７３およびＯＲＦ１３７４から構成され、このタンパク質は、結合されたテールファイバーを形成するが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのバクテリオファージは、単一のタンパク質（ＢＰＡＲおよびＲＢＤ機能を提供するいくらか長いＯＲＦ１３７３）から構成されるテールファイバーを有する。この知識があれば、ＯＲＦ１３７３（配列番号１６）またはＯＲＦ１３７４（配列番号１７）のいずれかをコードする核酸は、基質として本明細書に就かれ、これから新規なＲＢＤ特異性の機能を遺伝子操作する。

【0038】

ディフォシン類は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ単離体の中で広く伝播される。
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの一連の独立した臨床単離体を、異なる殺菌スペクトルを有し得るディフォシン粒子を産生する能力のために試験した。臨床単離体Ｃｄ１９１２３、Ｃｄ１９１４５、Ｃｄ１９１２６、Ｃｄ１９１０８（ＲＭ Ａｌｄｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ由来）、およびＡＴＣＣ Ｃｄ４３５９３を、厳密な嫌気性の条件下でマイトマイシンＣを用いて誘導し、続いて、産生された粒子を精製および濃縮した。次いで、精製された材料を、臨床収集物中の他のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株の細菌叢上に別々にスポットして、殺菌活性を検出した。この結果、これらの単離体の各々が、異なる殺菌スペクトルを有する粒子を産生することが示された（それぞれ、臨床単離体Ｃｄ１９１２３、Ｃｄ１９１４５、Ｃｄ１９１２６、Ｃｄ１９１０８、およびＡＴＣＣ Ｃｄ４３５９３由来のｄｉｆ１２３、ｄｉｆ１４５、ｄｉｆ１２６、ｄｉｆ１０８、およびｄｉｆ４３５９３と命名されたディフォシン類）（図２）。ｄｉｆ１０８およびｄｉｆ４３５９３は、極めて類似でかつ広範なスペクトルを有したが、株Ｃｄ１９１４５は、狭い殺菌スペクトルを有する粒子を産生した。Ｃｄ１９１１３およびＣｄ１９１５０を含めて、誘導について試験されたいくつかの単離体は、マイトマイシンに対する暴露後に溶解したが、検出可能なディフォシン粒子は産生しなかった。

【0039】

ゲノム配列決定された実験室株Ｃｄ６３０がディフォシン遺伝子座をコードすることが本明細書で認識され；そして、実際には、このゲノムは本明細書において、ディフォシン遺伝子を特定するために用いられた。株Ｃｄ６３０は、マイトマイシンＣでの誘導後に溶解したが、検出可能なディフォシン粒子が産生された。代わりに、少量のプロファージ１およびプロファージ２が産生された。

【0040】

ディフォシンクラスターの特定およびクローニング
Ｃｄ６３０は、マイトマイシンＣによる溶解の誘導の際に、検出可能なディフォシン粒子を産生しなかった。従って、Ｃｄ１６由来のディフォシン遺伝子クラスターを代わりにクローニングした。Ｃｄ１６のドラフトゲノム配列を最初に得た。Ｃｄ６３０のものと類似のディフォシン遺伝子座を、特定して、アノテーションした。プロデューサー株Ｃｄ１６由来の全体的なディフォシン遺伝子クラスターを、ＢＡＣ中にクローニングして（配列番号１）、引き続き、非病原性の微生物および非偏性嫌気性の菌である微生物中で活性なディフォシンを産生するのに必要な全ての遺伝子を含むことを実証した。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、両方とも病原性であって、かつ偏性嫌気性の細菌であり、これによって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、天然のディフォシン類または組み換えＤＮＡ遺伝子操作によって改変されるディフォシン類について非実用的な産生細胞となる。単離されたディフォシンクラスターはまた、組み換えＤＮＡ技術によって遺伝子操作されて、プロデューサー微生物の培養培地または誘導培地に添加される非毒性の低分子のインデューサーまたはデ−リプレッサーに対して応答する異種プロモーターによってその発現を調節されてもよい。このような低分子としては、限定するものではないが、テトラサイクリン、無水テトラサイクリン、ラクトース、アラビノース、キシロース、およびそれらの非代謝性アナログ、例えば、ＩＰＴＧ（ラクトースを置き換える）が挙げられる。

【0041】

ディフォシン類
ディフォシン類は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの他の株に対して殺菌性である、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅから単離されたＲ型のｈｍｗバクテリオシンである。ディフォシン類は、マイトマイシンＣの存在下で嫌気性の条件下で増殖されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株から単離され得る。いくつかの実施形態では、ディフォシンは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの臨床単離体Ｃｄ４、Ｃｄ１６、Ｃｄ１９１２３、Ｃｄ１９１４５、Ｃｄ１９１２６、Ｃｄ１９１０８、またはＡＴＣＣ Ｃｄ４３５９３（それぞれ、ｄｉｆ４、ｄｉｆ１６、ｄｉｆ１２３、ｄｉｆ１４５、ｄｉｆ１２６、ｄｉｆ１０８、およびｄｉｆ４３５９３と命名される）由来である。一態様では、ディフォシンは、Ｃｄ４由来であり；別の態様では、ディフォシンはＣｄ１６由来である。

【0042】

本発明の別の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌のゲノムに由来するディフォシンをコードする単離された核酸分子が提供される。一態様では、この核酸分子は、配列番号１の遺伝子クラスターを含む。別の態様では、核酸分子は、配列番号６１の遺伝子クラスターを含む。他の実施形態では、この核酸分子は、配列番号２〜２３；４９、６２〜８０からなる群より選択される１つ以上のポリペプチドを含むディフォシンをコードする。さらに他の実施形態では、この核酸分子は、配列番号４〜１６、１８、１９、および６６〜８０からなる群より選択される１つ以上のポリペプチドを含むディフォシンをコードする。一態様では、この核酸分子は、配列番号２〜２３のポリペプチドをコードする。別の態様では、この核酸分子は、配列番号４９および６２〜８０のポリペプチドをコードする。

【0043】

また、改変体のディフォシン類も提供される。改変体ディフォシン類としては、配列番号４〜１６、１８、１９、および６６〜８０からなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するディフォシン類が挙げられる。他の実施形態では、改変体ディフォシンは、配列番号４〜１６、１８、１９、および６６〜８０からなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％）、９８％、または実に９９％同一である、アミノ酸配列を有する。

【0044】

いくつかの実施形態では、改変体ディフォシンは、異種のベースプレートアタッチメント領域（ＢＰＡＲ）を含んでもよく、ここでこのＢＰＡＲは、配列番号１６、５４〜５６、および７８のうちの１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも８０％同一である。別の実施形態では、このＢＰＡＲは、配列番号１６、５４〜５６、および７８のうちの１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも８５％同一である。別の実施形態では、このＢＰＡＲは、配列番号１６、５４〜５６、および７８のうちの１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも８９％同一である。別の実施形態では、このＢＰＡＲは、配列番号１６、５４〜５６、および７８のうちの１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも９０％同一である。さらに別の実施形態では、このＢＰＡＲは、配列番号１６、５４〜５６、および７８のうちの１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも９５％同一である。さらに別の実施形態では、このＢＰＡＲは、配列番号１６、５４〜５６、および７８のうちの１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも９８％同一である。さらなる実施形態では、このＢＰＡＲは、配列番号１６、５４〜５６、および７８のうちの１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも９９％同一である。

【0045】

さらなる実施形態では、改変体ディフォシンは、異種のレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）を含んでもよく、ここでこのＲＢＤは、配列番号１７および４９〜５３のうちの１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも８０％同一であるか、または配列番号５４〜５６からなる群より選択されるポリペプチドのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％同一である。別の実施形態では、ＲＢＤは、配列番号１７および４９〜５３のうちの１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも８５％同一であるか、または配列番号５４〜５６からなる群より選択されるポリペプチドのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに対して少なくとも８５％同一である。別の実施形態では、このＲＢＤは、配列番号１７および４９〜５３のうちの１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも８９％同一であるか、または配列番号５４〜５６からなる群より選択されるポリペプチドのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに対して少なくとも８９％同一である。別の実施形態では、このＲＢＤは、配列番号１７および４９〜５３のうちの１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも９０％同一であるか、または配列番号５４〜５６からなる群より選択されるポリペプチドのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに対して少なくとも９０％同一である。別の実施形態では、このＲＢＤは、配列番号１７および４９〜５３のうちの１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも９５％同一であるか、または配列番号５４〜５６からなる群より選択されるポリペプチドのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに対して少なくとも９５％同一である。別の実施形態では、このＲＢＤは、配列番号１７および４９〜５３のうちの１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも９８％同一であるか、または配列番号５４〜５６からなる群より選択されるポリペプチドのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに対して少なくとも９８％同一である。別の実施形態では、このＲＢＤは、配列番号１７および４９〜５３のうちの１つ以上の対応するセグメントに対して少なくとも９９％同一であるか、または配列番号５４〜５６からなる群より選択されるポリペプチドのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに対して少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、このレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）領域は、配列番号５４、５５、または５６のアミノ酸残基５１からカルボキシ末端残基を含む。

【0046】

別の実施形態では、ディフォシン類は、ディフォシンＯＲＦ１３７３の生成物に対してファージテールＲＢＤを融合することによって、変化した殺菌スペクトルを有するように遺伝子操作されてもよい。ＯＲＦ１３７４は、天然のディフォシン類の一次スペクトル決定因子またはＲＢＤをコードするが、この極めて大きいタンパク質は、ＯＲＦ１３７３タンパク質と複合して、ＯＲＦ１３７３タンパク質は、ＢＰＡＲを提供し、すなわち、これは、ＯＲＦ１３７４タンパク質のＲＢＤを、ディフォシンベースプレート構造に結合する。ＯＲＦ１３７３は、ΦＣＤ２（配列番号５４）、ΦＣＤ１１９（配列番号５５）、およびΦＣＤ２７（配列番号５６）のようなミオウイルス科バクテリオファージのテールファイバー遺伝子と、ならびにＲ型のピオシン類のテールファイバーと類似であり、アミノ酸配列同一性を共有する。ディフォシン類のＯＲＦ１３７３（例えば、配列番号１６または７８）は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのミオウイルス科ファージ、ΦＣＤ２（配列番号５４）のテールファイバーと、特にＮ末端部分の最初の１６０アミノ酸またはＢＰＡＲで、有意な配列同一性を共有する。しかし、ファージのテールファイバーは、ディフォシンＯＲＦ１３７３タンパク質よりも長く、かつそれらの細菌標的を認識するためのＣ末端ＲＢＤを含む。ディフォシン類のＯＲＦ１３７３タンパク質は、この後者のドメインを含まず、そのＲＢＤ機能は、ＯＲＦ１３７４によってコードされる、別のポリペプチドによって置き換えられる。従って、ＯＲＦ１３７４は、ディフォシンクラスターから完全に欠失されてもよく、ファージテールファイバーのＲＢＤ、例えば、ΦＣＤ２のＲＢＤを、ＯＲＦ１３７３によってコードされるディフォシンＢＰＡＲに融合して、それによってファージテールファイバー様のタンパク質を有し、従って、ドナーファージの宿主範囲に関連する殺菌スペクトルを有するディフォシンを生成してもよい。重要なことに、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅファージテールファイバーとＯＲＦ１３７３タンパク質との間のアミノ酸配列相同性の領域は、２つの間の首尾よい機能的融合を可能にするので、当業者は、突然変異したまたは非突然変異のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅファージから宿主範囲改変体を選択可能で、このＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅファージは次に、新規な殺菌スペクトルを有する改変ディフォシン類を創出するための新規なＲＢＤの供給源となり得る。

【0047】

遺伝子操作したディフォシンの一実施形態では、ＲＢＤがＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの別の株由来のＲＢＤで、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染するバクテリオファージ由来のＲＢＤで置換されている、ディフォシンが提供される。一実施例では、この核酸分子は、配列番号１６または７８をコードする配列を含むが、対応する天然のＲＢＤ（すなわち、それぞれ、配列番号１７または４９をコードする配列）を含まず；代わりに、この天然のＲＢＤは、ＲＢＤをコードする異種配列で置換されている。特定の実施形態では、この核酸分子は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの異なる株のＲ型のバクテリオシンのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）をコードする異種配列を含む。一態様では、核酸分子は、配列番号１６または７８をコードする配列、および配列番号４９〜５３からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号５４〜５６からなる群より選択されるポリペプチドのレセプター結合領域をコードする配列を含む。別の態様では、この核酸分子は、配列番号２〜１６および１８〜２３または配列番号６２〜８０をコードする配列、ならびに配列番号１７および４９〜５６からなる群より選択されるポリペプチド由来のＲＢＤをコードする異種配列から構成される。

【0048】

遺伝子操作されたディフォシンの他の実施形態では、ディフォシンのＲＢＤは、天然のＲＢＤの改変型で置換されてもよい。「天然のＲＢＤ」とは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株から、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染するバクテリオファージから単離もしくはクローニングされたＲＢＤに対して同一であるアミノ酸配列を有するＲＢＤを指す。多数のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株由来の例示的な天然のＲＢＤは、配列番号１７および４９〜５３を含む。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染するバクテリオファージ由来の例示的な天然のＲＢＤは、配列番号５４〜５６（例えば、アミノ酸残基５１からカルボキシ末端残基）を含む。いくつかの実施形態では、改変ＲＢＤは、天然のＲＢＤに対してＲＢＤのアミノ酸配列における変化を含む。アミノ酸配列における変化の非限定的な例としては、置換、挿入（または付加）、または１つ以上のアミノ酸の欠失が挙げられる。さらなる実施形態では、ディフォシンは、２００６年１月８日公開の米国特許出願公開第２００６／０１２１４５０（あたかも全体が示されるかのように参照によって本明細書に援用される）に記載されるように、多様性発生レトロエレメント（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔ）（ＤＧＲ）を配置することによって構造を多様化する生物体由来のＲＢＤでの置換、またはそのＲＢＤの挿入を含む。

【0049】

いくつかの実施形態では、改変型は、対応する未改変または天然のＲＢＤとは異なる殺菌性スペクトルを有する。特定の実施形態では、この改変型は、天然のＲＢＤと少なくとも８０％同一である。他の実施形態では、このＲＢＤは、配列番号１７および４９〜５３からなる群より選択されるポリペプチド、または配列番号５４〜５６からなる群より選択されるポリペプチドのレセプター結合領域に対して、少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または実に９９％同一であるアミノ酸配列を有し、この改変されたＲＢＤは、対応する未改変のまたは天然のＲＢＤとは異なる殺菌スペクトルを有する。

【0050】

標的細菌
患者から単離されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株は、パルスゲル電気泳動によって、およびそれらの病原性において広く変化する。ＢＩ／ＮＡＰ１またはリボタイプ０２７株（毒素を過剰産生する）は、毒素Ａおよび毒素Ｂの発現レベルを負に調節する遺伝子ｔｃｄＣの機能をそれらが消失しているという結果として特に悪性である（ＭｃＤｏｎａｌｄら、２００５）。

【0051】

実際、ｔｃｄＣ遺伝子の特定の変異体対立遺伝子を保有するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株は、医療機関でまたはその間で流行性に伝播することが示された。これらの流行性および高度に悪性の株は、特に重要な標的細菌であり、これは、伝統的な抗生物質治療の開始の前または直後にディフォシンの経口適用によってキャリア患者のＧＩ管から予防的に排除され得る。野生型レベルの毒素ＡおよびＢを生じるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌は、重要な標的病原体であるのは、５０歳超の患者または合併症のある患者には特に、潜在的に致死性でもあるからである（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＪＧ，２００２）。

【0052】

過剰プロデューサーであってもなくても、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株で広がっている、Ｓ層タンパク質のような表面アクセス可能な毒性または適応性因子を標的することによって、それらが、標的のＲ型バクテリオシンに対して耐性で出現する場合、このような病原体がそれらの毒性または適応性を損なうようにさせる魅力的な手段が提供される。ディフォシン類のＲＢＤの高い特異性のせいで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ以外の生物体は、標的ではなく、ディフォシン類の別個のかつ強力な利点である。なぜなら、それらは、ＧＩ管の片利共生生物細菌（正常なＧＩ機能および良好な健康に必要な細菌）の巻き添えの傷害を生じないからである。

【0053】

「感染」とは、被験体もしくは組織、または非細菌の細胞などの中での細菌の増殖であって、ここで、この細菌が、実際にもしくは潜在的に、被験体組織、または非細菌の細胞内において疾患または症状を引き起こし得る増殖を指す。感染の処置は、ｄｉｆ４３５９３のようなディフォシン類を産生し得る解毒されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌の物質、材料、プロデューサー細胞、または芽胞での予防的処置を包含し得る。処置された対象物の非限定的な例としては、示される臓器、組織および細胞；医療的装置、例えば、呼吸器または透析装置；または創傷、例えば、術中または術後の創傷が挙げられる。他の用途としては、さらなる増殖の際に問題を生じ得る標的細菌の除去が挙げられる。さらなる実施形態では、ｈｍｗバクテリオシンを用いて、細菌による感染もしくは汚染がある食品、植物または植物の収穫部分を処理するか、または、病院もしくは商業的な環境などにおいて標的細菌の環境中での存在を処理する。

【0054】

上記されるとおり、抗菌のＲ型のバクテリオシンを用いて、特定の細菌の増殖、生存または複製を阻害してもよい。細菌は、病原性であっても、もしくは環境的に有害な株であってもよいし、または予防的な方法で処理されてもよい。病原性微生物は一般には、時には特定の環境でのみ、疾患を生じる。

【0055】

ディフォシン類の調製および使用
ディフォシン類は、約一千万ダルトンの粒子であり、従って、種々の遠心分離、差分濾過、水性二相分離、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿および／またはイオン交換クロマトグラフィーによって単離および精製して、生物製剤等級の経口抗菌剤を生成してもよい。Ｒ型バクテリオシンは、凍結融解に安定であることが見出されており、安定な処方物を作製するために噴霧乾燥されてもよい。

【0056】

本発明のいくつかの実施形態では、Ｒ型のｈｍｗバクテリオシンを産生する方法が提供される。この方法は、Ｒ型のバクテリオシンの発現をもたらす濃度で、誘導剤に感受性の誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたＲ型のｈｍｗバクテリオシンをコードする核酸配列に対してプロデューサー細胞を暴露すること、およびこの発現されたＲ型バクテリオシンを精製することを包含する。一態様では、Ｒ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンは、配列番号２〜２３または配列番号４９および６２〜８０からなる群より選択される１つ以上のポリペプチドを含む。この核酸分子は、プロデューサー細胞の天然の核酸に対して異種であり、かつプロデューサー細胞の染色体に含まれてもよいし、またはエピソーム発現ベクターに含まれてもよい。

【0057】

標的される場合、強力な抗菌剤、ディフォシン類は、ＣＤＡＤを予防するため、ヒトおよび他の動物の下部ＧＩ管からＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを除去または独立させるために用いられる。広範なスペクトルの抗生物質で処置される動物およびヒトは、もしＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって感染された場合、潜在的に致死性のＣＤＡＤを発症するリスクが高い。コロニー除去は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが健康なＧＩの微生物叢と争うという理由で、ディフォシンの特に魅力的な有用性である。さらに、ディフォシン類は、急性のＣＤＡＤにおける病原体負荷を低下するため、および／または他の方法による首尾よい処置後のＣＤＡＤの高い出現率もしくは再発生もしくは再発を低下するために、ディフォシン類を産生できる解毒されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌の投与されたプロデューサー細胞または芽胞を介して直接または間接的に投与されてもよい。

【0058】

投与の方式
Ｒ型のバクテリオシンは、給餌された胃および上部十二指腸を正常に機能する酸性度である、ｐＨ４．０以下で不活性化される。しかし、ディフォシン類は、上部ＧＩ管を通過して、下部ＧＩ管を優先的に感染させる標的化細菌病原体に到達しなければならない。従って、ディフォシンは、上部ＧＩ管の酸およびプロテアーゼから脆弱な剤を保護してこのような剤を活性な状態で遠位の上部ＧＩ管または下部ＧＩ管に送達する、１または複数の公知の方法によって処方され得る。さらに、動物は、Ｒ型バクテリオシンの経口投与前に胃の酸性化を防ぐために、シメチジンまたはプロトンポンプインヒビターなどの抗ヒスタミン剤で処置され得る。従って、適切に処方されたディフォシン類、ディフォシン類を産生できるプロデューサー細胞、またはディフォシン産生性の解毒されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌の芽胞を、正常な胃のヒトもしくは動物に対して、または酸性化が薬学的に妨げられたものに対して経口投与することは、腸の感染した部分への送達を可能にし、それによって有効にできる。腸の通過時間に基づいて、無症候性の人または動物を感染除去するためのディフォシンの直接的または間接的な経口投与の頻度は、６時間ごと、１２時間ごと、１８時間ごと、２４時間ごと、毎週、または毎月であってもよい。ディフォシンはまた、ＣＤＡＤを有する患者に、または最近、ＣＤＡＤを「治癒した」患者に、同じ以上の頻度で投与されてもよい。特に活性なＣＤＡＤの管理のために、ディフォシン類は、坐剤、浣腸またはコロニー灌流によって、直腸用に処方されて、直接または間接的に投与されてもよい。

【0059】

本開示の遺伝子操作されたディフォシンは、ディフォシンに対して影響を受けやすい細菌による感染もしくは汚染で影響されるか、影響されたと診断されるか、または影響されていると疑われる任意の被験体に対して投与され得る。このような被験体の非限定的な例としては、動物（哺乳動物、爬虫類、両生動物、鳥類および魚類）の種、ならびに昆虫、植物および真菌が挙げられる。哺乳動物種の代表的で、非限定的な例としては、ヒト；非ヒト霊長類；ウシ、ブタ、ヤギ、およびヒツジなどの農業関連の種；マウス、およびラットなどのげっ歯類；イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、およびウマなどのペット、展示、またはショーのための哺乳動物；ならびにイヌおよびウマなどの作業用の哺乳動物が挙げられる。鳥類の種の代表的で非限定的な例としては、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ならびにオウムおよびインコなどのペットまたはショーのための鳥類が挙げられる。本開示の遺伝子操作されたディフォシンで処置される動物被験体とはまた、四足動物、二足動物、水生動物、脊椎動物、または昆虫を含む無脊椎動物であってもよい。

【0060】

いくつかの実施形態では、処置されるべき被験体は、ヒトの子供、またはまだ成熟期に達していないその他の若い動物である。従って、本開示は、本開示のディフォシンに対して感受性の細菌またはその他の微生物による感染を含む小児の状態の処置を包含する。

【0061】

本開示は、ヒト被験体または非ヒト動物の微生物叢中に存在する細菌の望ましくない増殖から生じるような、日和見感染の処置または予防を提供する。日和見感染は、被験体の免疫抑制状態の結果、または泌尿生殖器（ＧＵ）もしくは胃腸（ＧＩ）管の共生細菌叢を変化させる抗生物質治療の結果である場合がある。従って、本開示はまた、免疫抑制状態の被験体、および他の薬剤に曝された被験体の処置、または予防を提供する。抗細菌活性を有するディフォシンは、非限定的な例として抗生物質、もしくは抗真菌剤などの別の抗細菌剤、または抗微生物剤と組み合わせて用いられてもよい。「抗微生物剤」とは、単細胞生物の増殖を阻害する、もしくはこれを死滅させるために用いられ得る薬剤、または化合物である。抗微生物剤としては、抗生物質、化学療法剤、抗体（補体あり、もしくはなしで）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、もしくは細胞膜の合成または機能の化学的インヒビターが挙げられる。

【0062】

いくつかの実施形態では、ディフォシン、プロデューサー細胞、またはディフォシンを産生できる無毒化Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌の芽胞は、「薬理学的に許容される」賦形剤、腸溶性コーティングまたは担体と共に製剤される。そのような成分とは、過度な有害な副作用なしにヒト、動物、および／または植物に用いるのに適する成分である。有害な副作用の非限定的な例としては、毒性、刺激、および／またはアレルギー性の応答が挙げられる。賦形剤または担体は、典型的には、合理的なリスク対効果比に見合ったものである。非限定的な薬学的に許容される担体としては、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。例としては、限定するものではないが、リン酸緩衝食塩水、水、水中油型エマルジョンなどのエマルジョン、および様々な種類の湿潤剤などの、標準的な薬学的賦形剤が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン、または懸濁液が挙げられ、食塩水および緩衝媒体が含まれる。非経口のビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、体液および栄養素の補充液、および電解質補充液（リンゲルデキストロースを主体としたものなど）などが挙げられる。

【0063】

本明細書で開示するさらなる製剤および医薬組成物は、細菌病原体に特異的な単離されたディフォシン；同じ細菌病原体を標的とする２、３、５、１０、もしくは２０種類以上の異なるディフォシンの混合物、プロデューサー細胞またはディフォシンを産生できる無毒化Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌の芽胞；および、異なる細菌病原体、または同じ細菌病原体の異なる株を標的とする２、３、５、１０、もしくは２０種類以上の混合物を含む。

【0064】

必要に応じて、本開示のディフォシンまたはプロデューサー細胞を含む組成物はまた、本技術分野で周知の手段を用いて噴霧乾燥されても、凍結乾燥されてもよい。当該分野で公知のとおり、その後、再構成して使用することが実際的であり得る。

【0065】

ディフォシンは典型的には、「安全かつ効果的な」量または濃度で用いられるが、これは、上述のような過度で有害な副作用を起こすことなく、所望の治療応答をもたらすのに十分な量を意味する。ディフォシンは、また、「治療効果のある」量または濃度で用いてもよく、それは、所望の治療反応を得るのに有効な量を指し、例えば、限定するものではないが、細菌細胞の分裂速度を遅延させるか、または細菌細胞の分裂を停止させるか、または細菌を死滅させるかもしくは細菌の個体数の増加速度を低下させるのに有効な量である。安全でかつ効果的な量、または治療上もしくは予防上有効な量は、様々な要因で変わるが、熟練した医師であれば、過度な実験をすることなく容易に決定し得る。要因の非限定的な例としては、治療を行う特定の状態、被験体の身体状態、治療を受けている被験体の種類、治療の期間、併用する治療（もしあれば）の性質、および使用される具体的な製剤が挙げられる。

【0066】

本発明の主題事項を一般的に説明したが、以下に示す実施例を参照することで、同じ内容がより容易に理解され、その実施例は、特に断りのない限り、説明のために提供するのであって、本開示を限定することを意図したものではない。
実施例

【0067】

１．ディフォシン類の殺菌活性の決定
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ培養物を、厳密な嫌気性の条件下で、Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌチャンバの中で、１０％ＣＯ_２、１０％Ｈ_２、８０％Ｎ_２の雰囲気を用いて増殖した。全ての培地、緩衝液、およびプレートを、使用前に少なくとも２４時間この雰囲気中で還元した。培養物を、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの選択寒天プレート（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＢＢＬ Ｃａｔ．２２２２２８）上に画線して、３７℃で２日間インキュベートした。これらのプレートを、次にストックとして大気温度で嫌気的に保管した。

【0068】

ディフォシン類を誘導するために、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌を、Ｂｒｕｃｅｌｌａ培地（Ｄｉｆｃｏ）を用いて液体培地中３７℃で、振盪せずに増殖させた。約０．２というＯＤ_６００で、マイトマイシンＣを、３μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。次いで、培養物を３〜１６時間インキュベートした。細菌溶解は、培養物の視覚的な浄化によって検出した。

【0069】

培養物を、嫌気性のチャンバから取り出して、細胞破砕物を、５，０００×ｇの遠心分離によって除去した。次いで、上清は０．２μｍの酢酸セルロースシリンジフィルターを通過させた。その濾液を９０，０００×ｇで２時間遠心分離して、ディフォシン粒子をペレットにした。そのペレットを、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、３％マンニトール中に、もとの培養容積の１／５０で再懸濁した。

【0070】

標的株を、Ｂｒｕｃｅｌｌａブロス中で３７℃で一晩増殖させた。１００μｌという培養容積を５ｍｌのテンパリングした、還元したＢｒｕｃｅｌｌａ積層アガー（０．５％寒天）に加え、Ｂｒｕｃｅｌｌａ寒天プレート（１．５％寒天）上に注ぎ、固めさせた。５μｌのディフォシン調製物のサンプルを、プレート上にスポットして、風乾させた（約３０分）。次いで、そのプレートを、３７℃で一晩、嫌気的にインキュベートした。細菌活性は、サンプルを細菌叢に加えた位置またはスポットでの、浄化、または細菌増殖の欠失によって決定した。

【0071】

２．Ｃｄ１６ディフォシン遺伝子座のクローニング
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株Ｃｄ１６のドラフトゲノム配列を、ゲノムＤＮＡの４５４装置の配列分析によって得た。全体的なｄｉｆ１６遺伝子座またはクラスター（配列番号１）を、株Ｃｄ６３０に対する比較によって得た（上記を参照のこと）。

【0072】

骨格のＢＡＣベクターを調製する。出発のベクターは、ｐＥＴｃｏｃｏｌであった（Ｎｏｖａｇｅｎ）。これは、ＢｂｓＩ末端を有する、プライマーＡＶ１４１９（配列番号２４）およびＡＶ１４２０（配列番号２５）を有する２つのＸｈｏＩ部位を除去するように改変された。こう改変するために、特定の領域を、これらのプライマーを用いてｐＥＴｃｏｃｏｌ ＤＮＡから増幅して、引き続き、ＰＣＲ生成物を、ＢｂｓＩで切り出して、より大きいｐＥＴｃｏｃｏｌベクターフラグメント（これはＸｈｏＩで事前に切断していた）中に戻して連結した。この連結は、ｐＥＴｃｏｃｏｌの２つのＸｈｏＩ部位を破壊した。次いで、後者のプラスミドを、同様のストラテジーによってさらに改変して、プライマーＡＶ１４１６（配列番号２６）およびＡＶ１２４５（配列番号２７）を用いてＥｃｏＲＩ部位を破壊した。得られたベクターをＳＷ２５１と名付けた。

【0073】

ディフォシンクラスターのフラグメントを受容するためのｐＵＣ１９ベクター調製。ｐＵＣ１９のポリリンカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化すること、ならびにオリゴＡＶ１３７２（配列番号２８）、ＡＶ１３７３（配列番号２９）、ＡＶ１３７４（配列番号３０）、およびＡＶ１３７５（配列番号３１）に連結することによって改変した。これによって、ポリリンカーを、ＮｏｔＩ−ＮｈｅＩ−ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＶ−ＢｓｔＢＩ−ＢｂｓＩ−ＥｃｏＲＩ−ＮｓｉＩ−ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ−ＡｓｃＩに変化した。これを、ＳＷ２３２と命名した。

【0074】

ディフォシンクラスターのＳＷ２３２中へのクローニング。ディフォシンクラスターの３つのフラグメント、配列番号１は、Ｃｄ１６のＤＮＡからＰＣＲによって個々に増幅された。５’フラグメント（配列番号３２）は、それぞれ、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ末端を有する、プライマー１３６８（配列番号３５）および１２８９（配列番号３６）を用いて増幅した。中央フラグメント（配列番号３３）は、それぞれＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ末端を有するプライマーＡＶ１２８８（配列番号３７）およびＡＶ１３６６（配列番号３８）を用いて増幅した。３’フラグメント、配列番号３４は、それぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ末端を有するプライマーＡＶ１３６７（配列番号３９）およびＡＶ１３００（配列番号４０）を用いて増幅した。これらの３つのＰＣＲフラグメントは、それぞれ、５’、中央、および３’位置について、ＳＷ２３２中に別々にクローニングして、ＳＷ２４１、ＳＷ２４２、およびＳＷ２４３と名付けた。

【0075】

ＢＡＣ ＳＷ２５１中へのディフォシンクラスターのクローニング。ディフォシンクラスターの３つのフラグメント（ＳＷ２４１、ＳＷ２４２、およびＳＷ２４３中）（各々が、Ｅ．ｃｏｌｉ中にクローニングすることによって増殖され、かつ精製される）を、ＳＷ２４１、ＳＷ２４２、およびＳＷ２４３ベクターから切り出した。ＳＷ２４１は、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩを用いて消化して、ＳＷ２４２は、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、そしてＳＷ２４３は、ＥｃｏＲＩおよびＡｓｃＩを用いて消化した。（このＡｓｃＩ部位は、上記の改変されたＳＷ２３２ポリリンカーの一部であったことに注意のこと）。

【0076】

これらの３つのフラグメントを、ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩで最初に消化したＳＷ２５１中にアセンブルした。得られたプラスミドは、ＤＧ４６１と命名し、全体的なｄｉｆ１６クラスターを含んだ。これを、Ｅ．ｃｏｌｉ中で増幅した。

【0077】

Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中での発現のためのディフォシン組み込みベクター作製。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ組み込みベクターであるｐＤＲ１１１（クローニング／プロモーター領域に隣接するａｍｙＥ遺伝子、およびスペクチノマイシン耐性遺伝子の一部を含む）を用いた。

【0078】

ｐＤＲ１１１ポリリンカーは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩを用いてベクターを消化すること、ならびにオリゴＤＧ１（配列番号４１）およびＤＧ２（配列番号４２）中に連結することによって改変した。これは、ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩ部位をｐＤＲ１１１に追加した。次に、改変したポリリンカーとともに全体的なａｍｙＥ前部および後部領域を含む領域を、両方ともがＢｓａＩ末端を有する、プライマーＤＧ９（配列番号４３）およびＤＧ１０（配列番号４４）を用いて増幅した。このフラグメントを、ＳＷ２５１のＮｏｔＩおよびＡｓｃＩ部位中に連結して（この２つの部位の破壊を生じる）、ＤＧ４８７を創出した。ｐＤＲ１１１由来の挿入物の改変ポリリンカーによって、新規なＮｏｔＩおよびＡｓｃＩ部位がＤＧ４８７中に導入されたことに注目のこと。

【0079】

Ｅ．ｃｏｌｉでのＤＧ４８７の増殖後、次に、ＤＧ４６１由来のディフォシンクラスターを含むＮｏｔＩ／ＡｓｃＩフラグメントを切り出して、ＤＧ４８７のＮｏｔＩ／ＡｓｃＩ部位中にクローニングした。この新規な構築物を、ＤＧ４８８と名付けて、そのベクターを用いて、全体的なディフォシン遺伝子クラスターをＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（下記）に導入した。

【0080】

３．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるディフォシン遺伝子クラスターの発現
天然のディフォシンプロデューサーは、偏性の嫌気性菌であるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。微量の酸素に曝された場合でさえ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌は、胞子形成して、即座に死滅する。培養されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅからごく微量のディフォシンを生成する能力でさえ、困難でかつ苦労が多く、予防的または治療的な適用に有用な量のディフォシンの産生は確実に、必要とされる厳密な嫌気性の条件下では現実的ではない。従って、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の全体的なディフォシン遺伝子クラスターを最初に特定し、次いで分子クローニングによって単離して、さらなる遺伝子操作および産生のために、好気性グラム陽性細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中にこのクラスターを導入した。

【0081】

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ組み込みベクターであるＤＧ４８８は、実施例２に記載のように作製し、全体的な２２，８２７塩基のディフォシン遺伝子座（配列番号１）を含んだ。このベクターを用いて、ディフォシン遺伝子座をＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのゲノム中に組み換えた。

【0082】

レシピエントのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ株は、ａｍｙＥ遺伝子内にクロラムフェニコール耐性マーカーが挿入されたＢＤＲ１２３であった。この株をＤＧ４８８で形質転換した場合、ベクター内の前部および後部のａｍｙＥ配列と、ゲノムのａｍｙＥ配列との間で組み換えが生じた。これによって、ディフォシン遺伝子座を含むＤＧ４８８の前部および後部のａｍｙＥ領域と、スペクチノマイシン耐性遺伝子との間の全配列のＢＤＲ１２３ゲノムへの挿入が生じた。首尾よい組み換え体は、スペクチノマイシン耐性であったが、組み換え事象の結果としてゲノムマーカーの損失に起因してクロラムフェニコール感受性になった。このＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株は、ＢＤＲ１２３−４８８と命名された。

【0083】

全体的なディフォシン遺伝子座を、ＤＧ４８８ベクター（実施例２）中に挿入したので、従って、これは、その全体がＢＤＲ１２３−４８８中に挿入された。この挿入されたディフォシン遺伝子座は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ中での正常な発現に必要な全ての調節性遺伝子を含み、そして構造的なディフォシン粒子遺伝子は、これらの遺伝子および／または調節性エレメントの制御下であった。ＢａｃｉｌｌｕｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍは、関連の細菌であったので、これらのディフォシン調節性エレメントは、Ｂａｃｉｌｌｕｓのバックグラウンドで機能し、それらの天然の状態でのように、ＲｅｃＡ媒介性の機構を通じてＤＮＡ損傷によって導入されることが予測された。これは、実際に事実であり、ディフォシン粒子産生は、ＤＮＡ損傷剤マイトマイシンＣおよび殺傷された株Ｃｄ１９０９９との接触によってＢＤＲ１２３−４８８中で誘導された（図７）。

【0084】

ディフォシン調節性遺伝子（ＯＲＦ１３５９、１３６０、１３６１）は、構造遺伝子に関連する遺伝子座の５’領域に位置した。調節性遺伝子（ＯＲＦ１３７７（配列番号２０）、１３７８（配列番号２１）、および１３７９（配列番号２３））はまた、構造遺伝子に対して下流３’に位置した。これらの後者を排除するために、調節性遺伝子ＤＧ４９１を、シングル・スリー・ウェイ・ライゲーション（ｓｉｎｇｌｅ ｔｈｒｅｅ ｗａｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ）でＤＧ４８８から生成した。１つのＰＣＲフラグメントは、プライマーＤＧ１３（配列番号４５）およびＤＧ１４（配列番号４６）を用いるＰＣＲ増幅によってＤＧ４８８から作製し、他のフラグメントは、プライマーＤＧ１５（配列番号４７）およびＤＧ１６（配列番号４８）を用いてＰＣＲ増幅によって作製した。両方のＰＣＲフラグメントは、ＡｓｃＩおよびＳｐｈＩで消化した。次いで、ＤＧ４８８を、ＳｐｈＩで消化し、２つの消化されたＰＣＲフラグメントを、ＳｐｈＩで消化したＤＧ４８８由来の大きいベクターフラグメント中に連結して、ＤＧ４９１を産生した。ＤＧ４９１を、ＢＤＲ１２３（ＢＤＲ１２３−４９１）中に形質転換して、ディフォシン遺伝子クラスターを含み、ｏｒｆ（オープンリーディングフレーム）１３７７（配列番号２０）、１３７８（配列番号２１）、および１３７９（配列番号２３）を欠いている、組み換え体Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを生成した。これらのＯＲＦを欠いているこの改変されたディフォシンクラスターは、野生型のディフォシンクラスターがＢＤＲ１２３−４８８中で発現するように、マイトマイシンＣに曝された際に活性なディフォシンを発現した（図７）。

【0085】

４．複数のディフォシン類からの殺菌性スペクトル決定配列の特徴づけ
Ｃｄ１６ディフォシン遺伝子座（配列番号１）とＣｄ６３０との比較、ならびに配列決定された他のＣｄ株（ＱＣＤ−６６ｃ２６；ＱＣＤ−２３ｍ６３；ＱＣＤ−３２ｇ５８；ＱＣＤ−６３ｑ４２）およびＣｄ４（配列番号６１）との比較によって、１つを除いて、オープンリーディングフレーム（配列番号１および６１）の全てが、８９〜１００％のアミノ酸配列同一性を共有することが示された。例外は、ＯＲＦ１３７４であった。この例外的な配列は、配列決定されたディフォシン全ての間で変動したが、サイズは同様であり、共有したのはわずか３０％程度の配列同一性であった。ディフォシンクラスター内のＯＲＦ１３７４の位置は、レセプター結合ドメインの位置と一致した。単離された活性なディフォシンのＯＲＦ１３７４の配列を決定して、それらの配列が高度に変動し過ぎたことを見出した（配列番号１７、４９〜５３）。これらの配列の比較を図８に示す。さらに、単離されたディフォシン類のスペクトル（図２）は、ＯＲＦ１３７４のアミノ酸配列の類似性または相違点を反映した（図８）。例えば、ｄｉｆ１６および（配列番号１７）およびｄｉｆ１２６（配列番号５２）のＯＲＦ１３７４の配列は、アミノ酸１個だけが異なり、それらの殺菌スペクトルはほぼ同一であった。ｄｉｆ１６（配列番号１７）およびｄｉｆ１０８（配列番号５０）のＯＲＦ１３７４の配列は、１８８アミノ酸異なり、それらの殺菌スペクトルは、極めて似ておらず、重複はわずかであった。この理由、およびＯＲＦ１３７４が、遺伝子クラスター中で唯一の可変性のタンパク質であったという理由で、ＯＲＦ１３７４は、標的の認識決定因子であり、各々の特定のディフォシンの固有のスペクトルを担うと結論された。

【0086】

５．Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるＤｉｆ４のクローニングおよび発現
ディフォシン４遺伝子座は、ディフォシン１６についての方法と同様の方法によってＣｄ４からクローニングした。しかし、ｄｉｆ４遺伝子クラスター、配列番号６１内にＥｃｏＲＩ部位がないせいで、ある程度の改変が必要であった。プラスミドＳＷ２５１（上の実施例２を参照）を改変して、オリゴＤＧ２１１、配列番号５７およびＤＧ２１２、配列番号５８を用いてポリリンカー中にＸｈｏＩ部位を有するように改変して、それぞれＮｏｔＩおよびＡｓｃＩ部位を導入した。これによって、ベクターＤＧ５７７を創出した。

【0087】

Ｃｄ４のＤＮＡ由来のディフォシンクラスターを、３つのフラグメント中で増幅した。第一は、プライマーＤＧ２１０（配列番号５９）およびＡＶ１２８８（配列番号３７）を用いて、ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩ部位を導入した。第二は、プライマーＤＧ２０９（配列番号６０）およびＤＧ１５（配列番号４７）を用いて、ＮｃｏＩおよびＡｓｃＩ部位を導入した。これらの２つを、事前にＸｈｏＩ／ＡｓｃＩで切断されたＤＧ５７７中にクローニングしてＤＧ５７８を創出した。三番目のフラグメントを、ＡＶ１３６８（配列番号３５）およびＡＶ１２８９（配列番号３６）を用いて増幅して、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位を導入して、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで事前に切断された、ＤＧ５７８中にクローニングして、ＤＧ５７９を創出した。ｄｉｆ４クラスター（配列番号６１）を含んでいる後者の構築物は、ｄｉｆ１６についてＤＧ４９１の等価物であり、すなわち、これは、ディフォシンの構造的遺伝子の下流の不必要な推定の調節性配列であるｏｒｆ１３７７、ｏｒｆ１３７８およびｏｒｆ１３７９を欠いていた。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓへｄｉｆ４クラスターを導入するための組み込みベクターは、ＤＧ５７９からＮｏｔＩ ＡｓｃＩフラグメントを取ること、およびこれをＤＧ４８７中にクローニングすることによって作製した（上記の実施例２を参照のこと）。この構築されたプラスミドはＤＧ５８０であった。

【0088】

Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中でｄｉｆ４を発現するために、ｏｒｆ１３７７−１３７９（配列番号６１）のない、ｄｉｆ４遺伝子座を含むＤＧ５８０を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのゲノム中に組み込んだ。レシピエントのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ株は、ａｍｙＥ遺伝子中に挿入されたクロラムフェニコール耐性マーカーを有するＢＤＲ１２３であった。この株をＤＧ５８０で形質転換したとき、ベクター内の前面および後面のａｍｙＥ配列と、ゲノムのａｍｙＥ配列との間で組み換えが生じた。これによって、ディフォシン遺伝子座を含むＤＧ５８０の前面および後面のａｍｙＥ領域と、ストレプトマイシン耐性遺伝子との間の全配列のＢＤＲ１２３ゲノム中への挿入が生じた。首尾よい組み換え体は、スペクチノマイシン耐性であったが、組み換え事象の結果としてそのゲノムマーカーを欠くせいで、クロラムフェニコール感受性になった。このＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株をＢＤＲ１２３−５８０と命名した。

【0089】

この組み込まれたｄｉｆ４遺伝子座は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ中の正常なディフォシン発現に必要な調節性遺伝子の全てを含み、そして予想どおりおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるｄｉｆ１６について以前に示したとおり、ｄｉｆ４粒子産生は、ＢＤＲ１２３−５８０中で、マイトマイシンＣとの接触によって誘導された（図９）。従って、本実施例は、ｄｉｆ４およびｄｉｆ１６の両方についての遺伝子座のクローニング、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（非病原性好気性産生細菌の例）における各々の発現を提供する。

【0090】

６．Ｏｒｆ１３７４は、ディフォシン類の殺菌スペクトルを決定する。
Ｏｒｆ１３７４は、精製されたディフォシン構築物の一部であることが質量分析法によって示された大きい予想ポリペプチド（約２００ｋＤａ）をコードする。ディフォシン１６およびディフォシン４の遺伝子クラスターを比較するとき、遺伝子産物のほとんど（特に、構造的な成分であることが予測される遺伝子産物）は、アミノ酸レベルでほぼ同一である。２つのクラスターの間の大きいアミノ酸配列相違は、ｏｒｆ１３７４である。この理由、および下に考察される他の理由のために、この遺伝子産物は、ディフォシン類の標的特異性を付与すると推測された。これを試験するために、ｄｉｆ４のＯｒｆ１３７４（すなわち、配列番号４９をコードする配列）を、ＤＧ５８０中で、Ｃｄ１６由来のＯｒｆ１３７４（すなわち、配列番号１７をコードする配列）で置き換えて、ＤＧ５８７を創出した。ＤＧ５８７を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＤＲ１２３のゲノム中に組み込んで、ＢＤＲ１２３−５８７組み換え体を、ｄｉｆ１６およびｄｉｆ４について上記のように作製した。得られたＢＤＲ１２３−５８７を、マイトマイシンに曝して、溶解液を処理して、ディフォシン類を調製した。得られたディフォシン粒子は、ディフォシン１６に対して感受性のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株１９１４５に対して殺菌活性を有し、かつｄｉｆ４に対して感受性である株１９１３７を殺傷する能力は欠いていた（図９）。この実験をさらに洗練した。ＤＧ５８７の構築によって、Ｃｄ４およびＣｄ１６のキメラであるＯｒｆ１３７３を生じた。構築物は、ＤＧ５８７のＯｒｆ１３７３が、もとのＣｄ４ １３７３、配列番号７８と１００％同一であることが回復されるように作製し、これによって、Ｏｒｆ１３７４、配列番号１７のみがきれいに置換されている構築物を創出した。この構築物をＤＧ６０３と命名した。この構築物をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＢＤＲ１２３ゲノム中に組み込んで、上記のようにマイトマイシンＣで誘導した。この得られたディフォシン粒子は、株１９０９９および１９１４５に対して殺菌活性を有し、かつ１９１３７を殺傷する能力は欠いていた。従って、ディフォシンの殺菌スペクトルは、ｏｒｆ１３７４によってコードされるタンパク質によって決定され、ｏｒｆ１３７４が変化すれば、本明細書で示すように、ディフォシンの殺菌性スペクトルは変化した。

【0091】

７．ＲｅｃＡが活性化されたとき溶解しない、ＰＢＳＸのないプロデューサー細胞
ＰＢＳＸプロファージは、野生型Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに偏在する。このプロファージは、誘導された場合、発育不良の（ｓｔｕｎｔｅｄ）頭部（ヘッド）構造を保有し、ＤＮＡの小さい、ランダムなフラグメントしか含まないという点で欠損性である。これは、ＲｅｃＡの制御下であり、従って、ＤＮＡ損傷剤、例えば、マイトマイシンＣ、および他の形態の細菌に対する重度のストレスによって誘導される。誘導された場合、これは細菌の溶解およびＰＢＳＸ粒子の放出を生じる。ＰＢＳＸ粒子による培養培地の汚染を回避するため、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓプロデューサー細菌の溶解を排除するため、（ディフォシン類の発現がｒｅｃＡまたはｄｉｎＲ／ｌｅｘＡ活性を調節することによって調節されるとき）、ＰＢＳＸ遺伝子クラスターを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＤＲ１１細菌から排除した。

【0092】

Ｌｉｕらによって概説される手順に従って、ＰＢＳＸノックアウトを構築した。要するに、Ｌｉｕの論文で用いられるプライマーおよび重複の伸長ＰＣＲ技術を用いて、親株ＢＤＲ１１のａｒａＲ遺伝子を欠失させて、Ｂａｃｉｌｌｕｓのアラビノースのプロモーター、Ｐ_ａｒａＡ−ｎｅｏ^Ｒのもとでネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子と置き換えて、株ＢＤＧ２を作製した。ａｒａＲ遺伝子の欠失は、ＰＣＲによって、およびカナマイシンに対する耐性の付与によって確認した。

【0093】

次に、ＤＮＡ構築物を作製して、ＰＢＳＸ遺伝子座自体を欠失した。この構築物を作製するために、以下の５つのＰＣＲ産物を、１つの大きい生成物（ＢＤＲ１１から増幅した、１ｋｂのｘｙｌＢ遺伝子の配列５’；ＢＤＲ１１から増幅した、１ｋｂのｘｙｌＡ遺伝子の配列３’；プラスミドｐＪＷ０３４から増幅したクロラムフェニコール耐性遺伝子ｃａｔ；ＢＤＲ１１から増幅したａｒａＲ；および最後に、ＢＤＲ１１から増幅した、１ｋｂのｘｙｌＢ遺伝子を含有する配列）への重複伸長ＰＣＲによってスプライシングした。重複した伸長ＰＣＲ産物を、ｐＵＣ１９のＸｍａＩおよびＳｐｅＩ部位にクローニングした。次いでこの構築物を、ＳａｃＩＩで直線化して、株ＢＤＧ２細菌中に形質転換して、これを、１ｍｌあたり５μｇのクロラムフェニコールを補充したＬＢ寒天プレート上にプレートした。コロニーをこのプレートからピックアップして、１ｍｌあたり５μｇのクロラムフェニコール、または１ｍｌあたり２０μｇのカナマイシンのいずれかを補充したＬＢ寒天プレート上にパッチした。クロラムフェニコール耐性およびカナマイシン感受性であった株を、抗生物質選択なしのＬＢブロス中で４時間増殖し、次いで、１ｍｌあたり２０μｇのカナマイシンを補充したＬＢ寒天プレート上にプレートした。これらのプレート上で増殖したコロニーを、ＰＢＳＸ遺伝子の存在下でコロニーＰＣＲによって試験した。ＰＢＳＸ遺伝子クラスターの欠失は、ｗｔ（野生型）株ＢＤ１２３中のＰＢＳＸ遺伝子の部位にまたがったＰＣＲ産物を配列決定することによって、株ＢＤＧ９中で確認した。さらに、分析によって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＢＤ１２３またはＢＤＧ２とは異なり、ＢＤＧ９は、３μｇマイトマイシンＣ／ｍｌの存在下でＰＢＳＸ粒子を溶解も産生もしないことが示された。

【0094】

ＰＢＳＸ欠失株、ＢＤＧ９を、プラスミドＤＧ５８０で形質転換して、ＢＤＧ２７を創出した。Ｃｄ４ディフォシンクラスターの組み込みは、スペクチノマイシン耐性によって確認した。ＢＤＧ２７を増殖して、上記のようにマイトマイシンＣで誘導した。１６時間後、細胞を回収して、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で溶解して、細胞を破壊した。なぜなら、ＰＢＳＸなしでは、本発明者らは、ディフォシン類が細胞内で蓄積すると予想したからである。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒで細胞を溶解した後、細片を遠心分離によって除去して、上清を株１９１３７に対して殺菌活性について試験した。ＢＤＧ２７によって産生されるディフォシンは、Ｃｄ１９１３７に対する活性を示したが、Ｃｄ１９０９９に対しては示さず、従って、ディフォシン４が、この非溶解性ＰＢＳＸ欠失株で産生されたことが示された。

【0095】

「含む、包含する、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む、包含する、備える（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「〜によって特徴づけられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」と交換可能に用いられて、包括的または制限のない言語であり、追加の、言及してない要素、または方法工程を排除するものではない。「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という句は、特許請求の範囲で特定されていない、いかなる要素、工程または成分も排除する。「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という句は、特許請求の範囲を、特定の材料または工程、および特許請求された発明の基本的および新規な特徴に物質的に影響しないものに限定する。本発明の開示は、これらの句の各々の範囲に相当する、本発明の組成物および方法の実施形態を考慮する。従って、言及される要素または工程を含む組成物または方法は、この組成物または方法が、それらの構成要素または工程から本質的になるか、またはなる、特定の実施形態を考慮する。

【0096】

特許、特許出願および刊行物を含む、本明細書に言及される全ての引用文献は、前に詳細に援用されていても、または援用されていなくても、その全体が参照によって本明細書に援用されている。

【0097】

ここで本発明を詳細に記載してきたが、当業者には、広範な範囲の等価なパラメーター、濃度および条件内で、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、かつ過剰な実験なしに同じことを行うことができることが理解される。

【0098】

本発明は、その特定の実施形態に関連して記載してきたが、さらなる改変が可能であることが理解される。本出願は、概して、本開示の原理に従い、そして本発明が関与する当該分野の範囲内の公知のまたは従来の実践の範囲内となるような、および本明細書において上述される本質的な特徴に適用することができるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変動、使用または適合を包含するものとする。

【0099】

本発明は、上記の実施例を参照して記載してきたが、改変および変動は、本発明の趣旨および範囲内に包含されることが理解される。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

【0100】

引用文献
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Ｚｉｌｂｅｒｂｅｒｇ，ＭＤ，Ｔｉｌｌｏｔｓｏｎ，ＧＳおよびＭｃＤｏｎａｌｄ，ＬＣ，２０１０ 米国の入院小児におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ａｍｏｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ），１９９７−２００６．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １６：６０４−６０９．

【0139】

Ｚｉｎｋ，Ｒ．，Ｍ．Ｊ．Ｌｏｅｓｓｎｅｒ、およびＳ．Ｓｃｈｅｒｅ．１９９５．Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける潜在性プロファージ（モノシン類）の特徴づけおよびホリン／エンドリシン遺伝子の配列分析（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｒｏｐｈａｇｅｓ（ｍｏｎｏｃｉｎｓ）ｉｎ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｈｏｌｉｎ／ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ ｇｅｎｅ）．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１ ：２５７７−２５８４．

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

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【図1-6】

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【図1-8】

【図1-9】

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【図1-12】

【図1-13】

【図1-14】

【図1-15】

【図1-16】

【図1-17】

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【図1-20】

【図1-21】

【図1-22】

【図1-23】

【図1-24】

【図1-25】

【図1-26】

【図1-27】

【図1-28】

【図1-29】

【図1-30】

【図1-31】

【図1-32】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【図8-5】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]