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特許6487850アジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物、並びにこれらの製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6487850
(24)【登録日】2019年3月1日
(45)【発行日】2019年3月20日
(54)【発明の名称】アジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物、並びにこれらの製造方法
(51)【国際特許分類】
   A61K 39/39 20060101AFI20190311BHJP
   A61K 39/00 20060101ALI20190311BHJP
   A61K 47/28 20060101ALI20190311BHJP
   A61K 47/12 20060101ALI20190311BHJP
   A61K 47/26 20060101ALI20190311BHJP
   A61K 47/24 20060101ALI20190311BHJP
   A61K 47/10 20060101ALI20190311BHJP
   A61K 47/14 20060101ALI20190311BHJP
   A61K 47/44 20170101ALI20190311BHJP
   A61K 47/22 20060101ALI20190311BHJP
【ＦＩ】
   A61K39/39
   A61K39/00 Z
   A61K47/28
   A61K47/12
   A61K47/26
   A61K47/24
   A61K47/10
   A61K47/14
   A61K47/44
   A61K47/22
【請求項の数】8
【全頁数】56
(21)【出願番号】特願2015-550654(P2015-550654)
(86)(22)【出願日】2014年11月17日
(86)【国際出願番号】JP2014080380
(87)【国際公開番号】WO2015079952
(87)【国際公開日】20150604
【審査請求日】2017年11月8日
(31)【優先権主張番号】特願2013-248543(P2013-248543)
(32)【優先日】2013年11月29日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000109543
【氏名又は名称】テルモ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】八田国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】坂口 奈央樹
【審査官】 深草 亜子
(56)【参考文献】
【文献】 特表２００３−５０９４５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】 特表２００４−５２７２６４（ＪＰ，Ａ）
【文献】 特開２０１２−２３２９４９（ＪＰ，Ａ）
【文献】 特開２００８−１２０７１８（ＪＰ，Ａ）
【文献】 特開昭６３−２０１１３３（ＪＰ，Ａ）
【文献】 第３５回バイオマテリアル学会大会予稿集，２０１３年１１月２５日，p.239
【文献】 Vaccine，２０１１年，Vol.29，p.9611-9617
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｐＨ感受性担体と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質と、を含み、
前記ｐＨ感受性担体が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、を含み、膜破壊機能促進効果を発現する、アジュバント組成物。
【請求項2】
前記自然免疫を活性化する刺激を有する物質が、モノホスホリルリピドＡである、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項3】
前記自然免疫を活性する刺激を有する物質の含有量が、前記両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、０．０２２７〜２２．７ｍｏｌである、請求項１または２に記載のアジュバント組成物。
【請求項4】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物。
【請求項5】
前記抗原がペプチドまたはタンパク質である、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項6】
前記抗原の含有量が、前記両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、３．２〜４００μｇである、請求項４または５に記載のワクチン組成物。
【請求項7】
デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
自然免疫を活性化する刺激を有する物質と、
を会合させる工程を含む、アジュバント組成物の製造方法。
【請求項8】
デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
自然免疫を活性化する刺激を有する物質と、
を会合させる工程；
前記会合により得られた会合体に抗原を混合する工程；
前記混合により得られた混合物を凍結融解する工程；および
前記凍結融解により得られた融解物を凍結乾燥する工程を含む、ワクチン組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物、並びにこれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫系とは、生体内に侵入した異物や異常細胞等を排除して、生体を病気等から保護する防御機構である。
【0003】
免疫系の機能は、一般に、液性免疫および細胞性免疫という２種の機構を介して発現する。
【0004】
液性免疫の免疫応答は、通常、以下のように発現する。すなわち、生体内に侵入した細菌等の外因性抗原が、エンドサイトーシスにより抗原提示細胞に取り込まれ、抗原提示細胞内のエンドソームでタンパク分解酵素により消化されて、ペプチド断片に分解される。当該ペプチド断片は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子と結合し、得られた複合体が抗原提示細胞の表面でＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示されて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が活性化される。そして、活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞が、サイトカインの放出等を行うことにより、最終的にＢ細胞から抗体が産生される。なお、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子は、マクロファージ、樹状細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞等に発現する。
【0005】
一方、細胞性免疫の免疫応答は、通常、以下のように発現する。すなわち、ウイルス感染細胞やガン細胞で産生されるタンパク質等の内因性抗原が、ユビキチン化された後、プロテアソームによってペプチドにまで分解される。分解されたペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子と結合し、得られた複合体が抗原提示細胞の表面でＣＤ８陽性Ｔ細胞に提示されて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化される。そして、活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）へと分化する。なお、上記ＭＨＣクラスＩ分子は、ほとんどすべての有核細胞および血小板の細胞表面に存在する。
【0006】
ところで、細胞性免疫を担うＣＴＬは、ウイルス感染細胞やガン細胞の排除をすることができることから、特に注目されている。近年では、外因性抗原によりＣＴＬの誘導へ導く、いわゆるクロスプレゼンテーションについての研究が試みられている。より詳細には、外因性抗原は、上述のように、抗原提示細胞内のエンドソーム内で分解されて、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する。しかしながら、クロスプレゼンテーションにおいては、一部の量でも、外因性抗原を細胞膜あるいはエンドソームの膜を通過させて細胞質基質に移行させることにより、細胞質基質に移行した外因性抗原が内因性抗原のように作用し、最終的にＭＨＣクラスＩ分子と結合して、ＣＴＬを誘導する。
【0007】
クロスプレゼンテーションにおいては、外因性抗原がエンドソームの膜を通過する必要があり、これについて種々の検討がなされている。例えば、非特許文献１には、ｐＨ感受性のポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）共役体を用いて抗原を効率良く細胞質基質に輸送することが記載されている。また、非特許文献２には、がん免疫療法のためのナノ粒子に基づくワクチンデリバリーが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ． ２００９ Ｆｅｂ．２０（２）：２４１−２４８
【非特許文献2】Ｉｍｍｕｎｅ Ｎｅｔｗ． ２０１３ Ｏｃｔ １３（５） １７７−１８３
【発明の概要】
【0009】
細胞性免疫を担うＣＴＬの誘導は、治療を目的としたワクチン開発の観点から、実現が強く望まれており、アジュバント分子の探索や改良が盛んに行われているが、依然としてＣＴＬを誘導する効果は十分とは言えない。
【0010】
また、ＣＴＬの強力な誘導を目的とし、クロスプレゼンテーションに着目した検討例では、新規の合成材料や、ウイルスの成分を用いたものが多く、安全性の観点から懸念が存在している。
【0011】
そこで、本発明は、安全性が高く、かつ、効果的にＣＴＬを誘導することができる担体を提供することを目的とする。
【0012】
本発明者は鋭意研究を行った。その結果、ｐＨに感受性を有する担体に、自然免疫を活性化する刺激を有する物質を併用することで、上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0013】
すなわち、本発明の上記課題は以下の手段により達成される。
【0014】
（１）ｐＨ感受性担体と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質と、を含むアジュバント組成物；
（２）前記ｐＨ感受性担体が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、を含み、膜破壊機能促進効果を発現する、（１）に記載のアジュバント組成物；
（３）前記自然免疫を活性化する刺激を有する物質が、モノホスホリルリピドＡである、（１）または（２）に記載のアジュバント組成物；
（４）前記自然免疫を活性する刺激を有する物質の含有量が、前記両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、０．０２２７〜２２．７ｍｏｌである、（２）または（３）に記載のアジュバント組成物；
（５）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物；
（６）前記抗原がペプチドまたはタンパク質である、（５）に記載のワクチン組成物；
（７）前記抗原の含有量が、前記両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、３．２〜４００μｇである、（５）または（６）に記載のワクチン組成物；
（８）デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質と、を会合させる工程を含む、アジュバント組成物の製造方法；
（９）デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質と、を会合させる工程；前記会合により得られた会合体に抗原を混合する工程；前記混合により得られた混合物を凍結融解する工程；および前記凍結融解により得られた融解物を凍結乾燥する工程を含む、ワクチン組成物の製造方法。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】本発明の一実施形態に係るアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物の模式図である。
【図2】ＥＬＩｓｐｏｔ法によるＣＴＬ誘導の評価結果である。（Ａ）は、ＩＦＮγのｓｐｏｔ形成数を評価したグラフであり、（Ｂ）はペプチド単独を用いた場合のＳｐｏｔ形成の様子であり、（Ｃ）は、ペプチドと、ＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体（アジュバント組成物）を用いた場合のＳｐｏｔ形成の様子である。評価条件は２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。
【図3】Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ（ＩＣＳ）法によるＣＴＬ誘導率の評価結果である。（Ａ）は、ペプチド単独を用いた場合の結果であり、（Ｂ）はペプチドと、ＭＰＬ分散液を用いた場合の結果であり、（Ｃ）はペプチドと、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体（アジュバント組成物）を用いた場合の結果である。
【図4】種々の調製方法によって調製したワクチン組成物を用いた場合における、ＣＴＬ誘導率の評価結果である。（Ａ）は、ＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体（分散調製法）を用いた場合の結果であり、（Ｂ）はＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体（混合調製法）を用いた場合の結果であり、（Ｃ）はＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体（凍結融解−凍結乾燥調製法）を用いた場合の結果である。
【図5】組込率の評価結果である。（Ａ）は、ペプチド溶液のフィルター前後における、Ｌｏｗｒｒｙ法の吸光度を示すグラフであり、（Ｂ）は、アジュバント組成物のフィルター前後における、リン脂質テストワコーによる吸光度を示すグラフである。（Ｃ）は、種々のワクチン組成物における組込率を評価した結果である。
【図6】評価系の確認をするための、自然免疫を活性化する刺激の評価を行った図である。（Ａ）は、培養したマウス脾臓細胞を染色せずに評価したフローサイトメトリーの結果であり、（Ｂ）および（Ｃ）は、ＰＢＳ単独、ＬＰＳを添加した場合のＣＤ８０の発現増強を確認した結果であり、（Ｄ）は種々の濃度でＬＰＳを添加した場合における、フローサイトメトリーの結果をまとめたグラフであり、（Ｅ）および（Ｆ）は、他の補助刺激分子であるＣＤ８６、およびＣＤ４０の発現増強を確認した結果である。
【図7】（Ａ）は、ＣＤ８０の産生増強を評価した結果であり、（Ｂ）および（Ｃ）は、他の指標であるＣＤ８６、ＣＤ４０の発現増強を評価した結果である。
【図8】種々の材料における自然免疫を活性化する刺激の有無を調べた結果である。（Ａ）は、ＭＰＬを含まないＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体を、種々の量にて添加してＣＤ８０の産生増強を調べた結果であり、（Ｂ）は培養したマウス脾臓細胞に、種々のサンプル溶液を添加してＣＤ８０の産生増強を調べた結果である。
【図9】（Ａ）は、ＭＰＬ含率０．２２７に相当する量のＭＰＬを投与した場合の溶出率であり、（Ｂ）はＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の各ｐＨにおける溶出率であり、（Ｃ）は、ＭＰＬの含有量を変化させた場合のＤＬＰＣ―デオキシコール酸複合体のｐＨ７．４とｐＨ５．０における溶出率の結果である。
【図10】分散調製法、混合調製法、凍結融解−凍結乾燥調製法により調製したワクチン組成物におけるｐＨ７．４とｐＨ５．０の溶出率を調べた結果である
【図11】アジュバント組成物の膜破壊機能促進効果に及ぼす、ＭＰＬ含有の影響を、種々のデオキシコール酸複合化量において調べた結果である。（Ａ）は、複合化量が１０の場合の結果であり、（Ｂ）は、複合化量が２０の場合の結果であり、（Ｂ）は、複合化量が６４０の場合の結果である。
【図12】アジュバント組成物の膜融合促進効果に及ぼすＭＰＬ含有の影響を調べた結果である
【図13】ワクチン組成物の自然免疫の活性化に及ぼす抗原量の影響を調べた結果である。（Ａ）は、ペプチドを用いた場合の結果であり、（Ｂ）は、ＯＶＡを用いた場合の結果である。
【図14】アジュバント組成物の自然免役を活性化する刺激に対する、両親媒性物質の影響を調べた結果である。
【図15】アジュバント組成物、およびワクチン組成物の自然免疫を活性化する刺激の強さに及ぼす、ｐＨ感受性化合物の複合化の影響を調べた結果である。（Ａ）はＭＰＬ含率が０．０２２７における、種々の複合化量のデオキシコール酸を用いて調製した場合の結果であり、（Ｂ）は、ＭＰＬ含率が２２．７における、種々の複合化量のデオキシコール酸を用いて調製した場合の結果である。
【図16】ワクチン組成物の自然免疫を活性化する刺激の強さに及ぼす、ｐＨ感受性化合物の種類の影響を調べた結果である。（Ａ）は、ＭＰＬ含率が０．０２２７における、種々のｐＨ感受性化合物を用いて調製した場合の結果であり、（Ｂ）は、ＭＰＬ含率が２２．７における、種々のｐＨ感受性化合物を用いて調製した場合の結果である。
【図17】ワクチン組成物を用いた場合の、ＥＬＩｓｐｏｔ法の評価結果である。（Ａ）は、高ＭＰＬの条件において、ペプチドとＭＰＬ分散液を用いた場合のｓｐｏｔ形成の様子であり、（Ｂ）は、高ＭＰＬの条件において、ペプチドとアジュバント組成物を用いた場合のｓｐｏｔ形成の様子である。評価条件は１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。
【図18】種々のｐＨ感受性化合物を用いて調製したワクチン組成物における、ＥＬＩｓｐｏｔ法の評価結果である。抗原はＯＶＡを使用し、自然免疫を刺激する物質、あるいはアジュバント組成物として（Ａ）は、ＭＰＬ分散液を用いた場合のＳｐｏｔ形成の様子であり、（Ｂ）は、ＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸を用いた場合のＳｐｏｔ形成の様子であり、（Ｃ）は、ＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−コール酸を用いた場合のＳｐｏｔ形成の様子であり、（Ｄ）は、ＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−ウルソデオキシコール酸を用いた場合のＳｐｏｔ形成の様子であり、（Ｅ）は、ＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−ヒオデオキシコール酸を用いた場合のＳｐｏｔ形成の様子である。評価条件は２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。
【図19】各調製方法で調製したワクチン組成物のＣＴＬ誘導率を示すグラフである。
【図20】ワクチン組成物によって誘導されたＣＴＬの抗原特異性を評価した結果である。（Ａ）は抗原の再刺激を加えた場合のＣＴＬ誘導率であり、（Ｂ）は抗原の再刺激を加えなかった場合のＣＴＬ誘導率である。
【図21】ＣＴＬの抗原特異性を評価したＥＬＩｓｐｏｔ法の評価結果である。（Ａ）〜（Ｆ）は、再刺激ありの場合のｓｐｏｔ形成の様子であり、（Ｇ）〜（Ｌ）は、再刺激なし場合のｓｐｏｔ形成の様子である。マウスへの投与物として、（Ａ）と（Ｇ）は、８０μｇのＯＶＡとＭＰＬ分散液を用いた場合の結果であり、（Ｂ）と（Ｈ）は、８０μｇのＯＶＡと、１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸を用いて調製したアジュバント組成物を用いた場合の結果であり、（Ｃ）と（Ｉ）は、８０μｇのＯＶＡと、６４０ｎｍｏｌのデオキシコール酸を用いて調製したアジュバント組成物を用いた場合の結果であり、（Ｄ）と（Ｊ）は、８０μｇのペプチドとＭＰＬ分散液を用いた場合の結果であり、（Ｅ）と（Ｋ）は、８０μｇのペプチドと、１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸を用いて調製したアジュバント組成物を用いた場合の結果であり、（Ｆ）と（Ｌ）は、８０μｇのペプチドと、６４０ｎｍｏｌのデオキシコール酸を用いて調製したアジュバント組成物を用いた場合の結果である。評価条件は２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。
【図22】各調製方法で調製したワクチン組成物を用いた場合における、ＩｇＧ抗体価を示すグラフである。
【図23】ＣｐＧ−ＯＤＮを用いた場合における、ＥＬＩｓｐｏｔ法の評価結果である。（Ａ）は、８０μｇのＯＶＡとＣｐＧ−ＯＤＮ単独をマウスに投与した場合のｓｐｏｔ形成の様子であり、（Ｂ）は８０μｇのＯＶＡと、ＣｐＧ−ＯＤＮを含むアジュバント組成物を用いた場合のｓｐｏｔ形成の様子であり、（Ｃ）は抗原の再刺激を加えなかった場合における、８０μｇのＯＶＡとＣｐＧ−ＯＤＮ単独をマウスに投与した場合のｓｐｏｔ形成の様子であり、（Ｄ）は、抗原の再刺激を加えなかった場合における、８０μｇのＯＶＡと、ＣｐＧ−ＯＤＮを含むアジュバント組成物を用いた場合のｓｐｏｔ形成の様子である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明の一実施形態によれば、ｐＨ感受性担体と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質と、を含むアジュバント組成物が提供される。上記アジュバント組成物により、効果的にＣＴＬを誘導することができる担体が提供される。また、当該アジュバント組成物により、安全性の高い担体が提供される。
【0017】
＜アジュバント組成物＞
本形態に係るアジュバント組成物は、ｐＨ感受性担体（以下、単に「担体」、「会合体」、または「複合体」と称することがある）と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質と、を含む。
【0018】
また、本形態に係るアジュバント組成物は、ｐＨ感受性担体が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、を含み、膜破壊機能促進効果を発現する。
【0019】
以下、図面を参照しながら、本実施形態を説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、以下の形態のみに制限されない。なお、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
【0020】
図１は、本発明の一実施形態に係るアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物の模式図である。
【0021】
図１によれば、アジュバント組成物４は、両親媒性物質１と、ｐＨ感受性化合物２と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質３と、を含む。図１に示すように、一実施形態によれば、自然免疫を活性化する刺激を有する物質３は、両親媒性物質１の構成する疎水性部分に、ｐＨ感受性化合物２とともに会合する。この場合、アジュバント組成物４は、アジュバント複合体ともいうことができる。また、別の一実施形態によれば、自然免疫を活性化する刺激を有する物質３は、両親媒性物質１およびｐＨ感受性化合物２を含むｐＨ感受性担体と独立して存在する。
【0022】
また、ワクチン組成物６は、アジュバント組成物４と、抗原５とを含む。図１に示されるように、抗原５は、上記２つの形態に係るアジュバント組成物４に包含されてもよいし、独立に存在してもよい。このうち、特にアジュバント複合体４に抗原５が包含されるワクチン組成物６については、ワクチン複合体ともいうことができる。
【0023】
本明細書において、「アジュバント組成物」とは、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する刺激を有する物質を含むものを意味し、その形態について特に制限はない。すなわち、「アジュバント組成物」は、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する刺激を有する物質を混合したものであってもよいし、ｐＨ感受性担体に自然免疫を活性化する刺激を有する物質を担持または包含したもの（アジュバント複合体）であってもよく、本明細書においては両者をまとめて「アジュバント組成物」と称する。
【0024】
また、本明細書において、「ワクチン組成物」とは、アジュバント組成物および抗原を含むものを意味し、その形態については特に制限はない。すなわち、「ワクチン組成物」には、アジュバント組成物の構成要素および抗原からなる群から選択される２種以上が混合されたものでもあってもよいし、アジュバント複合体に抗原を担持または包含したもの（ワクチン複合体）であってもよく、本明細書においては両者をまとめて「ワクチン組成物」と称する。
【0025】
［ｐＨ感受性担体］
ｐＨ感受性担体は、ｐＨに感受性を有し、ｐＨが酸性になると細胞内の抗原を細胞質基質に輸送できる機能を有する。
【0026】
ｐＨ感受性担体としては、特に制限されないが、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、を含み、膜破壊機能促進効果を発現するものであることが好ましい。なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
【0027】
以下、上記のｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含む、膜破壊機能促進効果を発現するｐＨ感受性担体について詳細に説明する。
【0028】
（ｐＨ感受性担体の構造）
ｐＨ感受性担体は、生理的ｐＨ以上において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが会合して形成されているものと考えられる。より詳細には、ｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物が、両親媒性物質の構成する疎水性部分に会合して形成されているものと考えられる。なお、ｐＨ感受性担体の当該会合形式は推測であり、ｐＨ感受性担体は、当該会合形式には限定されない。
【0029】
（膜破壊機能促進効果）
「膜破壊機能」とは、溶出性試験において溶出を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における溶出性試験とは、消光物質と蛍光物質とを含む水溶液を内包したリポソーム（分散液）と、評価サンプル分散液とを、所定のｐＨに調整した水溶液に添加し、当該水溶液を３７℃で９０分間あるいは３０分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光を測定する試験である。当該方法により、リポソームから溶出した蛍光物質量が測定することができ、ｐＨ感受性担体のリポソームの膜破壊機能を確認することができる。なお、溶出性試験については、後述する実施例で詳細に説明する。
【0030】
また、「膜破壊機能促進効果を発現する」とは、（１）溶出性試験において、生理的ｐＨにおける溶出率よりも生理的ｐＨ未満の所定のｐＨにおける溶出率が上昇し、なおかつその上昇幅がｐＨ感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、および、（２）当該生理的ｐＨ未満の所定のｐＨでの溶出性試験において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質が複合体（ｐＨ感受性担体）を形成したときの溶出率が、ｐＨ感受性化合物単独の溶出率と両親媒性物質単独の溶出率の和より大きいこと、の両者を満たすことを意味する。より具体的には、膜破壊機能促進効果を発現するとは、ｐＨ７．４とｐＨ５．０またはｐＨ４．５との溶出性試験において、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との複合体）の溶出率Ｌｃが、ｐＨ感受性化合物単独の溶出率Ｌａと両親媒性物質単独の溶出率Ｌｂと、下記の関係を双方満たすものをいう。すなわち、上記（１）が、下記式（１）で表され、上記（２）が下記式（２）で表される。なお、下記式中、ｐＨ７．４の溶出率を、それぞれ、Ｌｃ７．４、Ｌａ７．４、Ｌｂ７．４と表し、ｐＨ５．０または４．５の溶出率を、それぞれ、Ｌｃｘ、Ｌａｘ、Ｌｂｘと表す。
【0031】
【数1】
【0032】
上記式（１）において、Δは、０を超えていればよいが、５以上であることが好ましく、１０以上であることがより好ましく、３０以上であることがさらに好ましい。また、上記式（２）において、Δ’は、０を超えていればよいが、５以上であることが好ましく、１０以上であることがより好ましく、１５以上であることがさらに好ましい。
【0033】
本発明の一実施形態において、上記式（１）および上記式（２）におけるΔおよびΔ’が、それぞれ５以上であり、かつ、胆汁酸および脂質を含むｐＨ感受性担体が好ましい。また、本発明の別の一実施形態において、上記式（１）および上記式（２）におけるΔおよびΔ’が、それぞれ５以上であり、かつ、グリチルリチン酸またはグリチルレチン酸および脂質を含むｐＨ感受性担体であることが好ましい。
【0034】
ここで、本明細書において「生理的ｐＨ」とは、正常組織や正常体液におけるｐＨを意味する。生理的ｐＨは、通常、７．４であるが、正常組織や正常体液によって若干（±０．１）異なる。また、「生理的ｐＨ未満の所定のｐＨ」とは、ｐＨ７．４未満であればよく、好ましくはｐＨ３．０以上、ｐＨ７．４未満、より好ましくはｐＨ４．０以上、ｐＨ７．３未満、さらに好ましくはｐＨ４．５以上、ｐＨ７．０未満である。
【0035】
ｐＨ感受性担体が膜破壊機能促進効果を発現するメカニズムは明らかではないが、下記のように推測される。なお、本発明は、下記推測によって限定されるものではない。
【0036】
ｐＨ感受性担体は、周辺環境が生理的ｐＨ未満となった場合には、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との会合形態が変化し、その結果、膜破壊機能促進効果を有するものと考えられる。例えば、ｐＨ感受性担体と、生体膜（例えば、細胞膜、小胞膜など）とが存在している系で、ｐＨが生理的ｐＨ未満となった場合、ｐＨ感受性担体の会合形態が変化し、生体膜と接触した後、当該変化に誘起されて、生体膜の膜構造変化も生じるものと推測される。すなわち、ｐＨ感受性担体が生体膜の膜構造変化を誘起する。これは、ｐＨが弱酸性に変化することで、ｐＨ感受性担体中のｐＨ感受性化合物が該担体の構造中で不安定化し、その結果、ｐＨ感受性担体が、系内に存在する生体膜と再配列し、膜破壊機能促進効果が発現すると考えられる。また、換言すれば、ｐＨ感受性化合物は、ｐＨが弱酸性に変化すると、プロトン化により疎水的な会合への溶解性を変化させる分子であると考えられる。つまり、ｐＨ感受性化合物を含む疎水的な会合は、弱酸性環境に応答し、機能を発現することが可能であるといえる。なお、「膜破壊」とは、このような膜構造の変化を称するものであり、膜構成成分が全て分離または分解しなくてもよい。このような「膜破壊」が生じることにより、生体膜（例えば、エンドソーム）の膜内部に含有されうる成分が生体膜の外部（例えば、細胞質基質）に溶出等する。
【0037】
ｐＨ感受性担体は、溶出性試験における溶出率がｐＨ７．４で２０％未満であり、かつ、ｐＨ４．０で２０％より大きいものであることが好ましい。また、溶出性試験における溶出率がｐＨ６．５で２０％未満であり、かつ、Ｈ４．０で２０％より大きいものであることがより好ましい。また、上記においてｐＨ７．４またはｐＨ６．５での溶出率が、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。また、ｐＨ４．０での溶出率が、４０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることがさらに好ましい。ｐＨ感受性担体の溶出率が、上記のようになることで、弱酸性ｐＨにおける膜破壊機能促進効果の発現がより発揮される。
【0038】
また、ｐＨ感受性担体は、膜破壊機能促進効果とともに、膜融合機能促進効果を発現しうる。
【0039】
本発明において、「膜融合機能」とは、膜融合試験において膜融合を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における膜融合試験とは、２種類の蛍光物質を二分子膜に組み込んだリポソーム（分散液）と、評価サンプル分散液とを、所定のｐＨに調整した水溶液に添加し、当該水溶液を３７℃で６０分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光を測定する試験である。当該方法により、リポソーム中に組み込まれた２種類の蛍光物質のエネルギー共鳴移動の変化を測定することができ、ｐＨ感受性担体の膜融合機能を確認することができる。なお、膜融合試験については、後述する実施例で詳細に説明する。
【0040】
また、「膜融合機能促進効果を発現する」とは、膜融合試験において、生理的ｐＨにおける融合率よりも生理的ｐＨ未満の所定のｐＨにおける融合率が上昇し、なおかつその上昇幅がｐＨ感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、を満たすことを意味する。より具体的には、膜融合機能促進効果を発現するとは、ｐＨ７．４とｐＨ５．０との膜融合試験において、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との複合体）の融合率Ｒｃ（％）が、ｐＨ感受性化合物単独の融合率Ｒａ（％）と、下記式（３）の関係を満たすものをいう。なお、下記式中、ｐＨ７．４の融合率を、それぞれ、Ｒｃ７．４、Ｒａ７．４、と表し、ｐＨ５．０の融合率を、それぞれ、Ｒｃｘ、Ｒａｘ、と表す。
【0041】
【数2】
【0042】
上記式（３）においてΔＲは、０を超えていればよいが、２以上であることが好ましく、５以上であることがより好ましく、１０以上であることがさらに好ましい。
【0043】
上記式（３）においてΔＲが２以上であるｐＨ感受性担体であって、該担体は胆汁酸と脂質を含むものが好ましい。
【0044】
ｐＨ感受性担体は、弱酸性ｐＨ（生理的ｐＨ未満の所定のｐＨ）において、膜融合機能促進効果を発現する。これらのメカニズムは明らかではないが、上記の膜破壊機能促進効果と同様のメカニズムであると考えられる。なお、本発明は、当該推測によって限定されるものではない。
【0045】
すなわち、本発明のｐＨ感受性担体は、周辺環境が生理的ｐＨ未満となった場合、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との会合形態が変化し、系内に存在する生体膜と再配列することで、膜融合するものと推測される。この際、膜融合は互いに親和性のある成分どうしで再配列するため、生体膜と親和性がない、または低い成分（例えば、抗原）は、再配列される膜から排除、放出される。
【0046】
上述のように、通常、抗原は、生体膜の一種であるエンドソーム（endosome）に取り囲まれ、細胞（抗原提示細胞等）に取り込まれる。その後、プロトンポンプの作用によってエンドソーム内部のｐＨが低下する。さらに、エンドソームは、加水分解酵素を含むリソソームと融合して、抗原は分解される（その後、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に抗原提示されうる）。このため、ほとんどの抗原は細胞質基質内にデリバリーされない。
【0047】
これに対して、本形態に係るｐＨ感受性担体を使用すると、抗原（例えば、外因性抗原）を細胞質基質にデリバリーすることができる。より詳細には、抗原がｐＨ感受性担体とともにエンドソームに取り囲まれ、細胞に取り込まれると、同様にして、ｐＨが低下した環境に導かれる。そして、ｐＨの低下（酸性化）に伴い、ｐＨ感受性化合物がｐＨ感受性担体を不安定化させ、エンドソームとｐＨ感受性担体との間で膜の再配列が起こる。その結果、ｐＨ感受性担体による膜破壊機能（場合によっては膜融合機能とともに発現する膜破壊機能）が生じる。この膜破壊機能（または膜融合機能および膜破壊機能）に伴い、抗原がエンドソームから細胞質基質にデリバリーされうる。なお、上記メカニズムによれば、原則として抗原はｐＨ感受性担体とともにエンドソームに取り込まれさえすれば細胞質基質への輸送が可能となりうることから、抗原とｐＨ感受性担体とを混合した組成物の形態で使用されても、抗原がｐＨ感受性担体に担持または包含された形態で使用されてもよいことが理解される。
【0048】
（ｐＨ感受性化合物）
ｐＨ感受性化合物は、上記のように、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種である。ｐＨ感受性化合物の塩としては、特に制限されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩；マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩などが挙げられる。これらのｐＨ感受性化合物は、単独で用いても、２種以上を併用して用いてもよい。
【0049】
本発明の一実施形態によれば、ｐＨ感受性化合物は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【0050】
また、本発明の別の一実施形態によれば、ｐＨ感受性化合物は、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、グリチルリチン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましい。
【0051】
ｐＨ感受性化合物として好ましく用いられるデオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸およびグリコデオキシコール酸は、胆汁酸と総称される。胆汁酸は、代表的なステロイド誘導体として１９２０年代以前から知られており、細菌学の分野において利用されている。胆汁酸はヒトの生体内においてコレステロールや脂質、脂溶性ビタミンと複合体を形成し、その吸収を補助する働きを有している。また、物理化学的な性質から脂質やタンパク質、疎水的な材料との複合体を形成することができるため、タンパク質の分離精製や可溶化剤、乳化剤として古くから利用されている。最近ではワクチンの製造工程の用途、胆汁酸トランスポーターを介在させることによる薬剤の吸収促進剤としても注目されている。特に、デオキシコール酸ナトリウム（別名デスオキシコール酸ナトリウム）とウルソデオキシコール酸（別名ウルソデスオキシコール酸）はヒトへの注射が可能な医薬品添加物として実績を有しており、優れた安全性が認められている。そのため、ｐＨ感受性化合物として、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸またはその塩（例えば、ナトリウム塩）を用いることがさらに好ましい。
【0052】
ｐＨ感受性化合物は、両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、１０ｍｏｌ以上の割合で含有されることが好ましく、１０〜６４０ｍｏｌの割合で含有されることがより好ましく、２０〜３２０ｍｏｌの割合で含有されることがさらに好ましく、２０〜１６０ｍｏｌの割合で含有されることが特に好ましい。なお、本明細書において、ｐＨ感受性化合物の、両親媒性物質１００ｍｏｌに対する含有量を、「ｐＨ感受性化合物の複合化量」とも称する。
【0053】
（両親媒性物質）
両親媒性物質は、上記のように、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種である。これらの両親媒性物質は、単独で用いても、２種以上を併用して用いてもよい。
【0054】
なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
【0055】
炭素数１０〜１２のホスファチジルコリンとしては、飽和のアシル基を有するジアシルホスファチジルコリンであることが好ましく、例えば、ジデカノイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ；１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）が挙げられる。これらのうち、ホスファチジルコリンとしては、天然由来または公知の方法で合成したものでもよく、また市販のものを用いることができる。
【0056】
炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルとしては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、ポリオキシエチレンソルビタンミリスチン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノミリステート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンパルミテート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）等が挙げられる。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、ソルビタンに付加したポリオキシエチレン鎖の合計した重合度が、１０〜２００であることが好ましく、１５〜１００であることがより好ましく、２０〜５０であることがさらに好ましい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル）として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、炭素数１６〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０）を用いることが好ましい。
【0057】
炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビタンモノパルミチン酸エステル（ソルビタンモノパルミテート）、ソルビタンモノステアリン酸エステル（ソルビタンモノステアレート）、ソルビタンモノオレイン酸エステル（ソルビタンモノオレート）等のソルビタンモノ脂肪酸エステル；ソルビタントリパルミチン酸エステル（ソルビタントリパルミテート）、ソルビタントリステアリン酸エステル（ソルビタントリステアレート）、ソルビタントリオレイン酸エステル（ソルビタントリオレート）等のソルビタントリ脂肪酸エステル等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ソルビタン脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、ＳＰＡＮ４０（ソルビタンパルミチン酸エステル）、ＳＰＡＮ６０（ソルビタンステアリン酸エステル）、ＳＰＡＮ８０（ソルビタンオレイン酸エステル）、ＳＰＡＮ６５（ソルビタントリステアリン酸エステル）、ＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレイン酸エステル）として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、ＳＰＡＮ８０、ＳＰＡＮ６５、ＳＰＡＮ８５を用いることが好ましい。
【0058】
モノオレイン酸グリセロール（モノオレイン酸グリセリル）、ジラウリン酸グリセロール（ジラウリン酸グリセリル）、ジステアリン酸グリセロール（ジステアリン酸グリセリル）、ジオレイン酸グリセロール（ジオレイン酸グリセリル）は、グリセリンに１または２分子の脂肪酸がエステル結合したアシルグリセロールであり、脂肪酸が結合する部位は特に制限されない。例えば、モノアシルグリセロールであるモノオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのＣ１位またはＣ２位に脂肪酸がエステル結合していてよい。また、ジアシルグリセロールであるジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのＣ１位およびＣ２位、またはＣ１位およびＣ３位に脂肪酸がエステル結合していればよい。例えば、ジラウリン酸グリセロールとしては、Ｃ１位およびＣ３位が置換された、α、α’−ジラウリンが好ましい。ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールとしては、Ｃ１位およびＣ２位が置換されたジアシルグリセロールが好ましい。これらのグリセロール誘導体としては、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。
【0059】
ポリオキシエチレンヒマシ油は、ヒマシ油にポリオキシエチレンが付加したものである。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、３〜２００であることが好ましく、５〜１００であることがより好ましく、１０〜５０であることがさらに好ましい。ポリオキシエチレンヒマシ油は、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。
【0060】
α−トコフェロールとしては、天然由来または公知の方法で合成したものを用いても、市販のものを用いてもよい。
【0061】
上述の両親媒性物質のうち、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレオレート、ソルビタンモノオレオレート、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択されることが好ましく、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレオレート、ソルビタンモノオレオレート、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択されることがより好ましい。
【0062】
（ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質の組み合わせ）
ｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、所望のｐＨにおいて、膜破壊機能促進効果を発現させることができる。この際、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果を発現し始めるｐＨは異なる。これはｐＨ感受性化合物によってｐＫａが異なること、さらには両親媒性物質との会合形成の様式が、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより異なることに由来するものと考えられる。したがって、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせを適宜変更することによって、機能を発現するｐＨを選択することが可能であり、デリバリーを詳細に設定することが可能であるといえる。
【0063】
ｐＨ感受性担体において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせとしては、コール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびα−トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’−ジラウリン）、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ヒオデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリコデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、ウルソデオキシコール酸およびα−トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’−ジラウリン）、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリチルリチン酸およびＤＤＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ２０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ４０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ６０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ４０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６５、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８５、グリチルリチン酸およびα−トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジステアリン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’−ジラウリン）、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油が好ましい。
【0064】
より好ましくは、コール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびα‐トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ヒオデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリコデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、ウルソデオキシコール酸およびα‐トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリチルリチン酸およびＤＤＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ４０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ６０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ４０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６５、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８５、グリチルリチン酸およびα−トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油である。
【0065】
［自然免疫を活性化する刺激を有する物質］
自然免疫を活性化する刺激を有する物質とは、構造パターン認識受容体に認識され、免疫担当細胞を活性化に導く物質を意味する。
【0066】
自然免疫を活性化する刺激を有する物質としては、特に制限されないが、Ｔｏｌｌ様受容体に対するアゴニストであることが好ましい。
【0067】
自然免疫を活性化する刺激を有する物質の具体例としては、特に制限されないが、ミョウバン等の鉱物塩；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム等のゲルタイプアジュバント；ＣｐＧモチーフを含む免疫調節性ＤＮＡ配列、免疫刺激性ＲＮＡ分子、内毒素（リポ多糖（ＬＰＳ；内毒素）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ：登録商標））、外毒素（コレラ毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性毒素、百日咳毒素）、ムラミルジペプチド、フラジェリン等の微生物アジュバント；不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）等の油性アジュバント、流動パラフィン、ラノリン等の油性アジュバント生分解性ミクロスフェア、サポニン（ＱＳ−２１、Ｑｕｉｌ−Ａ等）、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似物、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド（非ＣｐＧ合成ポリヌクレオチド等）、イミダゾキノリン等の合成アジュバント；ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＤＡ等のカチオン性脂質；一本鎖ＲＮＡ；二本鎖ＲＮＡ等が挙げられる。これらのうち、前記自然免疫を活性化する刺激を有する物質は、ミョウバン等の鉱物塩；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム等のゲルタイプアジュバント；ＣｐＧモチーフを含む免疫調節性ＤＮＡ配列、免疫刺激性ＲＮＡ分子、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ：登録商標））、外毒素（コレラ毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性毒素、百日咳毒素）、フラジェリン等の微生物アジュバント、サポニン（ＱＳ−２１、Ｑｕｉｌ−Ａ等）、合成ポリヌクレオチド（非ＣｐＧ合成ポリヌクレオチド等）、イミダゾキノリン等の合成アジュバント、一本鎖ＲＮＡ；二本鎖ＲＮＡ等であることが好ましく、モノホスホリルリピドＡ、ＣｐＧモチーフを含む免疫調節性ＤＮＡ配列であることがより好ましい。
【0068】
自然免疫を活性化する刺激を有する物質は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0069】
自然免疫を活性化する刺激を有する物質の含有量は、使用する自然免疫を活性化する刺激を有する物質の種類によっても異なるが、両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、０．０２２７〜２２．７ｍｏｌであることが好ましく、０．２２７〜２.２７ｍｏｌであることがより好ましい。自然免疫を活性化する刺激を有する物質の含有量が０．０２２７ｍｏｌ以上であると、免疫応答を好適に誘導させることができることから好ましい。一方、自然免疫を活性化する刺激を有する物質の含有量が２２．７ｍｏｌ以下であると、コストが低減できることから好ましい。
【0070】
［水性溶媒］
アジュバント組成物は、水性溶媒を含んでいてもよい。
【0071】
アジュバント組成物が水性溶媒を含む場合、ｐＨ感受性担体、自然免疫を活性化する刺激を有する物質は、水性溶媒中で分散した分散液となりうる。
【0072】
この際、ｐＨ感受性担体は、好ましくは、水性媒体中で、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを含む複合体を形成する。これらの複合体の形態は特に制限されず、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが膜を形成してもよいし、両親媒性物質が形成する構造にｐＨ感受性化合物の一部分もしくは全体が会合などにより埋め込まれていてもよい。また、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とがミセル状の粒子（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが疎水性相互作用により粒状に会合した粒子であり、典型的には単分子膜構造の粒子である）を形成するのが好ましい。また、ファゴサイトーシスやエンドサイトーシスによる取り込みは、一定以上の大きさの粒子に対して活発に行われることから、ミセル状の粒子は、粒子径が１０〜２００ｎｍであることが好ましく、１０〜１００ｎｍであることがより好ましい。なお、上記ミセル状の粒子には、脂質二分子膜構造（例えば、リポソーム）を形成するものは含まない。また、本明細書中、ｐＨ感受性担体の粒子径は、動的光散乱法（ＭＡＬＶＥＲＮ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、ＮａｎoＺＳ９０）により測定することができる。
【0073】
また、アジュバント組成物は、水性媒体中で、複合体を形成したｐＨ感受性担体と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質と、を含む複合体（アジュバント複合体）を形成することが好ましい。複合体の形態は特に制限されないが、ｐＨ感受性担体を構成するｐＨ感受性物質および両親媒性物質と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質とがミセル状の粒子を形成することが好ましい。当該ミセル状の粒子の粒子径は、１０〜２００ｎｍであることが好ましく、１０〜１００ｎｍであることがより好ましい。
【0074】
なお、アジュバント組成物を含む水性溶液中、ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質、自然免疫を刺激する活性を有する物質の少なくとも１つが、会合体を形成せず、遊離の状態で存在していてもよい。
【0075】
本発明のｐＨ感受性担体を含む水性溶液の溶媒としては、緩衝剤、ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類を含む水溶液であることが好ましい。
【0076】
緩衝剤としては、アジュバント組成物のｐＨを生理的ｐＨ以上に維持するものであれば公知の緩衝剤が適宜使用でき、特に限定されるものではない。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ緩衝剤（トリス塩酸緩衝剤）、ＭＥＳ緩衝剤（２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝剤）、ＴＥＳ緩衝剤（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤）、酢酸緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤（３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝剤）、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝剤）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝剤などのＧＯＯＤ緩衝剤、グリシン−塩酸緩衝剤、グリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝剤などのアミノ酸系緩衝剤；トリス−ホウ酸緩衝剤、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのホウ酸系緩衝剤；またはイミダゾール緩衝剤などが用いられる。これらのうち、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、ＭＥＳ緩衝剤、酢酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝剤を用いることが好ましい。緩衝剤の濃度としては、特に制限されず、０．１〜２００ｍＭであることが好ましく、１〜１００ｍＭであることがより好ましい。なお、本明細書において「緩衝剤の濃度」とは、水性溶液中に含まれる緩衝剤の濃度（ｍＭ）をいう。
【0077】
ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類の濃度としては、特に制限されず、０．１〜２００ｍＭであることが好ましく、１〜１５０ｍＭであることがより好ましい。
【0078】
水性溶液中のｐＨ感受性担体の濃度としては、特に制限されないが、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、好ましくは０．７３μｍｏｌ／Ｌ〜７．４ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは７．３μｍｏｌ／Ｌ〜６．５ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは８．０μｍｏｌ／Ｌ〜４．２ｍｍｏｌ／Ｌである。
【0079】
また、水性溶液中の自然免疫を活性化する刺激を有する物質のモル濃度は、特に制限されないが、好ましくは０．１４ｎｍｏｌ／Ｌ〜０．２２７ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．４ｎｍｏｌ／Ｌ〜０．１９ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１．６ｎｍｏｌ／Ｌ〜０．１２ｍｍｍｏｌ／Ｌである。
【0080】
［他の成分］
アジュバント組成物は、他の成分を含んでいてもよい。当該他の成分としては、特に制限されないが、安定化剤等が挙げられる。
【0081】
安定化剤としては、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する刺激を有する物質に悪影響を与えなければ特に制限されず、例えば、１−オクタノール、１−ドデカノール、１−ヘキサドデカノール、１−エイコサノール等の飽和および不飽和の炭素数４〜２０のアルコール；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の飽和および不飽和の炭素数１２〜１８の脂肪酸；カプリル酸メチル（オクタン酸メチル）、カプリル酸エチル（オクタン酸エチル）、ラウリン酸メチル、ラウリン酸エチル、ミリスチン酸エチル、パルミチン酸エチル、ステアリン酸エチル、オレイン酸メチル、オレイン酸エチル等の飽和および不飽和の炭素数８〜１８の脂肪酸アルキルエステル（炭素数１〜３のアルキル）；Ｄ（Ｌ）−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニン等のＤ（Ｌ）−アミノ酸；トリカプロイン、トリカプリリン等のアミノ酸トリグリセライド；ポリオキシエチレンソルビタントリパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタントリオレイン酸エステル等の炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタントリ脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ６５、Ｔｗｅｅｎ８５）；ポリオキシエチレンラウリン酸エステル、ポリオキシエチレンミリスチン酸エステル、ポリオキシエチレンパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンステアリン酸エステル等の炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンアルキルエステル（例えば、ＰＥＧ２０ステアリルエーテル、ＰＥＧ２３ラウリルエーテル）；ポリオキシアルキレン硬化ヒマシ油（例えば、ＰＥＧ１０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ４０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ６０硬化ヒマシ油）；カプリリン（オクタン酸グリセロール）、モノカプリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、モノミリスチン酸グリセロール、モノパルミチン酸グリセロール、モノステアリン酸グリセロール、モノオレイン酸グリセロール等の飽和および不飽和の炭素数８〜１８のモノ脂肪酸グリセロールエステル；ジオクタン酸グリセロール、ジカプリン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジミリスチン酸グリセロールエステル、ジパルミチン酸グリセロール等の炭素数８〜１６のジ脂肪酸グリセロール；α−トコフェロール酢酸エステル、ヒマシ油、大豆油、コレステロール、スクアレン、スクアラン、ラクトース、パルミチン酸アスコルビル、安息香酸ベンジル、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、等の公知の安定化剤が用いられうる。なお、安定化剤における「炭素数」とは、疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
【0082】
これら他の成分の含有量としては、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する刺激を有する物質に悪影響を与えなければ特に制限されないが、両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、１５０ｍｏｌ以下であることが好ましく、０ｍｏｌを超えて６６．４ｍｏｌ以下であることがより好ましい。
【0083】
本形態に係るアジュバント組成物は、抗原とともに投与することにより、効果的にＣＴＬを誘導することができる。
【0084】
すなわち、本形態に係るアジュバント組成物においては、ｐＨ感受性担体に、自然免疫を活性化する刺激を有する物質を併用しても、ｐＨ感受性担体の機能、例えば、膜破壊機能促進効果（および膜融合機能促進効果）を好適に発揮することができる。また、ｐＨ感受性担体とともに自然免疫を活性化する刺激を有する物質を用いると、自然免疫を活性化する刺激を有する物質の機能も好適に発揮することができる。この理由は必ずしも明らかではないが、以下のような理由によるものと推察される。
【0085】
すなわち、ｐＨ感受性担体は、好ましい形態において、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含み、膜破壊機能促進効果（場合によっては、膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果）を有する。この際、前記膜破壊機能促進効果（および膜融合機能促進効果）は、上述のように、酸性環境下におけるｐＨ感受性化合物によるｐＨ感受性担体の会合状態の変化の惹起、およびこの場合における両親媒性物質によるエンドソーム等の細胞膜との再配列に基づくものである。ここで、ｐＨ感受性担体に自然免疫を活性化する刺激を有する物質を併用しても、ｐＨ感受性化合物のｐＨ感受性は変動しないため、ｐＨ感受性化合物は、ｐＨ感受性担体の会合状態の変化を惹起することができる。また、自然免疫を活性化する刺激を有する物質が、例えば、両親媒性物質に組み込まれていても、ｐＨ感受性担体と独立に存在していても、両親媒性物質による細胞膜との再配列には影響を与えない。そうすると、自然免疫を活性化する刺激を有する物質をｐＨ感受性担体と併用しても、ｐＨ感受性担体の機能は損なわれない。そして、自然免疫を活性化する刺激を有する物質は、例えば、疎水的な相互作用によりｐＨ感受性担体の両親媒性物質に組み込まれているだけであり、または、単にｐＨ感受性担体と独立して存在しているだけであり、その機能も損なわれない。その結果、本形態に係るアジュバント組成物は、抗原とともに投与した場合、ｐＨ感受性担体の機能により抗原を細胞質基質に導入することができるとともに、自然免疫を活性化する刺激を有する物質が作用することにより、細胞質基質に導入された抗原に基づくクロスプレゼンテーションを好適に誘導することができ、効果的にＣＴＬを誘導することができる。
【0086】
なお、上記理由は推定のものであり、これ以外の理由によって本発明の効果がもたらされたとしても、本発明の技術的範囲に含まれる。
【0087】
また、本発明の好ましい一実施形態によれば、液性免疫をも好適に誘導することができる。
【0088】
上述のように、外因性抗原は、通常であれば、抗原提示細胞内のエンドソームでペプチド断片まで分解され、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示される。
【0089】
本形態に係るアジュバント組成物が、共に投与された抗原をクロスプレゼンテーションすることにより、ＣＴＬを誘導する場合には、ｐＨ感受性担体が、エンドソームの細胞膜の再配列を起こす際に抗原や自然免疫を活性化する刺激を有する物質が細胞質基質に導入されうる。しかし、一実施形態においては、再配列が起きたとしても、抗原および自然免疫を活性化する刺激を有する物質の一部または全部がエンドソーム内に残存する場合がありうる。また、一実施形態において、抗原とアジュバント組成物とが独立して存在する場合には、一部のエンドソームにおいては、抗原のみが取り込まれる場合がありうる。そうすると、エンドソームで抗原がペプチド断片まで分解され、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示されて液性免疫が誘導される。この際、クロスプレゼンテーションを好適に誘導している樹状細胞は、免疫的に活性化された状態にあることから、当該液性免疫の誘導は好適に発現することとなる。あるいは、クロスプレゼンテーションを好適に誘導している樹状細胞は、免疫を活性化するサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）を盛んに産生し、周りの環境を、免疫誘導に適した環境に導くこととなる。
【0090】
したがって、本発明の別の一実施形態によれば、クロスプレゼンテーションとともに、またはクロスプレゼンテーションに代えて、液性免疫を誘導することができる。
【0091】
＜ワクチン組成物＞
ワクチン組成物は、アジュバント組成物および抗原を含む。
【0092】
［アジュバント組成物］
アジュバント組成物としては、上述したものが用いられうることからここでは説明を省略する。
【0093】
［抗原］
抗原としては、免疫応答を生じさせるものであれば特に制限されないが、ペプチドまたはタンパク質であることが好ましい。
【0094】
前記ペプチドまたはタンパク質としては、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、原虫性または寄生虫性抗原、ガン抗原、アレルギー関連抗原、疾患関連抗原、移植片拒絶関連抗原等が挙げられる。
【0095】
前記ウイルス抗原としては、特に制限されないが、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、並びに他のＨＩＶコンポーネント等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ、およびＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのｐｒｅ−Ｓ抗原、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ、並びにＡ、Ｂ、およびＣ型肝炎のウイルスコンポーネント等の肝炎ウイルス抗原；赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ、並びに他のインフルエンザウイルスコンポーネント等のインフルエンザウイルス抗原；麻疹ウイルス抗原；風疹ウイルス抗原；ロタウイルス抗原；サイトメガロウイルス抗原；呼吸器合胞体ウイルス抗原；単純ヘルペスウイルス抗原；水痘帯状疱疹ウイルス抗原；日本脳炎ウイルス抗原；狂犬病ウイルス抗原が挙げられる。その他、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｒｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス又は海綿状ウイルス由来のペプチドが挙げられる。
【0096】
前記細菌性抗原としては、特に制限されないが、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼ、他の百日咳細菌性抗原コンポーネント等の細菌性抗原；ジフテリア毒素またはトキソイド、他のジフテリア細菌性抗原コンポーネント等のジフテリア細菌性抗原；破傷風毒素又はトキソイド、他の破傷風細菌性抗原コンポーネント等の破傷風細菌性抗原連鎖球菌細菌性抗原；リポ多糖、他のグラム陰性細菌性抗原コンポーネント等のグラム陰性桿菌細菌性抗原；ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａ、他のマイコバクテリア抗原コンポーネント等の結核菌細菌性抗原；ヘリコバクター・ピロリ細菌性抗原コンポーネント；肺炎球菌細菌性抗原；インフルエンザ菌細菌性抗原；炭疽菌細菌性抗原；リケッチア細菌性抗原等が挙げられる。
【0097】
前記真菌性抗原としては、特に制限されないが、カンジダ真菌性抗原コンポーネント；ヒストプラズマ真菌性抗原；クリプトコッカス真菌性抗原；コクシジオイデス真菌性抗原；白癬真菌性抗原等が挙げられる。
【0098】
前記原虫性または寄生虫性抗原としては、特に制限されないが、熱帯熱マラリア原虫抗原；トキソプラズマ抗原；住血吸虫抗原；リーシュマニア抗原；トリパノソーマ・クルージ抗原等が挙げられる。
【0099】
前記ガン抗原としては、特に制限されず、腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官等に由来するガン抗原が挙げられる。当該ガンとしては、白血病、リンパ腫、神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、口唇癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫等が挙げられる。なお、ガン抗原の具体例を挙げると、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｈｕｍａｎ ＥＧＦＲ ｒｅｌａｔｅｄ ２）、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＭＡＧＥ（Ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＸＡＧＥ（Ｘ ａｎｔｉｇｅｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ／ｍａｒｔ−１、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、ＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＡＰ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ｐ５３、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＭＵＣ−１（Ｍｕｃｉｎ−１）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＷＴ−１（Ｗｉｌｍｓ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ １）、ＡＦＰ（Ａｌｐｈａ Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＰＣ（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、等が挙げられる。
【0100】
前記アレルギー関連抗原としては、特に制限されないが、スギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原；ライグラス花粉抗原等の花粉抗原；イエダニ抗原、ネコ抗原等の動物由来抗原；組織適合性抗原、ペニシリン等の治療薬等が挙げられる。
【0101】
前記疾患関連抗原（自己免疫疾患、アレルギー等）は、特に制限されないが、糖尿病、関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、アトピー性皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、クローン病、潰瘍性大腸炎、結膜炎、角結膜炎、喘息、アレルギー性喘息、直腸炎、薬疹、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、再生不良性貧血、赤芽球貧血症、特発性血小板減少症、ウェゲナー肉芽腫症、スティーブンス・ジョンソン症候群、間質性肺線維症等が挙げられる。具体例を挙げると、例えば、自己免疫疾患に関与する抗原の例として、グルタミン酸脱炭酸酵素６５（ＧＡＤ６５）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体コンポーネント、サイログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体が挙げられる。
【0102】
前記移植片拒絶関連抗原としては、特に制限されないが、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、神経移植片コンポーネント等の移植片レシピエントに移植される移植片の抗原性コンポーネントが挙げられる。
【0103】
上述の抗原は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0104】
抗原の含有量は、ｐＨ感受性担体を構成する両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、３．２〜４００μｇであることが好ましく、１６μｇ〜８０μｇであることがより好ましい。
【0105】
抗原の組込率は、特に制限されず、抗原とアジュバント組成物が独立して存在してもよいが、３％以上であることが好ましく、５〜８０％であることがより好ましく、１０〜６０％であることがより好ましい。組込率が３％以上であると、例えば、ワクチン組成物が細胞にエンドサイトーシスされる際に、抗原がアジュバント組成物と同じエンドソームに導入される可能性が高くなり、発明の効果を好適に得られうることから好ましい。なお、「抗原の組込率」は、主として抗原がアジュバント組成物に担持または包含された割合を意味し、その値は、実施例に記載の方法によって測定された値を採用するものとする。
【0106】
［添加剤］
ワクチン組成物は、他の医薬品添加剤を含んでいてもよい。
【0107】
使用されうる添加剤は、ワクチン組成物の剤型によって異なりうる。この際、ワクチン組成物は、錠剤、粉末、カプセルなどの固形製剤の形態であっても、注射製剤のような液体製剤の形態であってもよいが、液体製剤であることが好ましい。なお、液体製剤の場合には、用時に水または他の適切な賦形剤で再生する乾燥製品として提供されてもよい。
【0108】
ワクチン組成物が錠剤およびカプセルである場合には、通常の方法により腸溶コーティングを施すことが望ましい。腸溶コーティングとしては、当該分野において通常用いられるものを利用できる。また、カプセルは粉末又は液体のいずれを含有することもできる。
【0109】
また、ワクチン組成物が固形製剤である場合には、賦形剤(例えば乳糖、ショ糖のような糖類、トウモロコシデンプンのようなデンプン類、結晶セルロースのようなセルロース類、アラビアゴム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸カルシウムなど)、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールなど）、結合剤(例えばマンニトール、ショ糖のような糖類、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉のようなデンプン類、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース類、架橋ポリビニルピロリドンなど）、着色剤、矯味矯臭剤などを含みうる。
【0110】
一方、ワクチン組成物が液体製剤である場合には、溶媒（例えば生理食塩水、滅菌水、緩衝液など）、膜安定剤（例えばコレステロールなど）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、グルコース、グリセリンなど）、抗酸化剤（例えばトコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなど）、防腐剤（例えばクロルブタノール、パラベンなど）などを含みうる。なお、前記溶媒は、ワクチン組成物の製造に用いる溶媒であってもよい。
【0111】
本発明の一実施形態によれば、ワクチン組成物は、抗原を効率良くクロスプレゼンテーションさせることにより、細胞性免疫を誘導することができる。これにより、例えば、ＣＴＬを誘導することができる。なお、本明細書において、「細胞性免疫を誘導する」とは、ワクチン組成物未処置のコントロールと対比して、高いＣＴＬの誘導率が得られることを意味する。また、「ＣＴＬの誘導率」とは、全ＣＤ８陽性細胞中に占めるＩＦＮγ産生細胞の割合を意味する。
【0112】
なお、本形態に係るアジュバント組成物は、投与に用いた抗原が同様であっても、自然免疫を活性化する物質を処置したコントロールと対比して、より高いＣＴＬ誘導率を示しうることから、細胞性免疫を増強する効果を有しうる。本明細書において、「ＣＴＬ誘導増強効果を有する」とは、自然免疫を刺激する物質を単独で使用した場合と対比して、高いＣＴＬの誘導率が得られることを意味する。したがって、ＣＴＬ誘導増強効果が示された場合、細胞性免疫を誘導することも同時に示される。
【0113】
また、本発明の別の一実施形態によれば、ワクチン組成物は、液性免疫の免疫応答を誘導することができる。これにより、ＩｇＧ等の抗体を産生することができる。この際、「液性免疫を誘導する」とは、ワクチン組成物未処置のコントロールと対比して高いＩｇＧ抗体価となることを意味する。
【0114】
なお、本形態に係るワクチン組成物は、自然免疫を活性化する物質を処置したコントロールと対比しても、より高いＩｇＧ抗体価を示しうることから、液性免疫を増強する効果を有しうる。
【0115】
［用途］
本形態のワクチン組成物は、対象者に投与して、ワクチン組成物の外部環境が生理的ｐＨ未満（例えば、ｐＨ６．５）となったときに、膜破壊機能促進効果、または膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果を発現し、抗原を効率よく細胞質基質に放出させることが可能になる。そして、好適に細胞性免疫を誘導することができ、免疫を付与することができる。
【0116】
よって、本形態に係るワクチン組成物により、治療または予防を必要とする対象者に、上記のワクチン組成物の有効量を投与することを含む、疾患の治療または予防方法が提供される。
【0117】
ワクチン組成物の投与方法としては、特に制限はなく、経口投与；静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、経皮投与または経皮的吸収等の非経口的投与等が挙げられる。例えば、抗原としてペプチドおよびタンパク質を用いる場合は、非経口経路、特に皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈注射による投与が好ましい。なお、抗原がアジュバント組成物に担持または包含されずに独立に混合されてなるワクチン組成物については、局所投与、具体的には、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与の形態で投与することが好ましい。
【0118】
上記の対象者は、哺乳動物が好ましく、特に好ましくはヒトである。
【0119】
上記疾患としては、例えば、ヒト免疫不全症候群（ＨＩＶ）、肝炎、インフルエンザ等のウイルス感染症；百日咳、ジフテリア、破傷風、結核、ヘリコバクター・ピロリ、肺炎球菌等による細菌感染症；カンジダ等の真菌感染症；マラリア等の原虫性または寄生虫性感染症；白血病、リンパ腫、神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、口唇癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫等のガン；スギ花粉等によるアレルギー；糖尿病、関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患；移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の移植による拒絶反応が挙げられる。
【0120】
本発明の好ましい一実施形態によれば、疾患の治療または予防方法が提供される。このような知見は出願時の技術常識を適宜参照することができる。
【0121】
また、本発明の一実施形態において、ワクチン組成物は、培養により、細胞に抗原を輸送することもできる。すなわち、本発明の一形態によれば、抗原を細胞に輸送するための培養方法が提供される。
【0122】
前記培養方法は、細胞を、ワクチン組成物を含む培地で培養する工程を含む。
【0123】
前記培地としては、特に制限されず、公知のものを使用することができる。具体的には、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ等が挙げられる。
【0124】
前記培地へのワクチン組成物の添加量としては、特に制限されないが、両親媒性物質のモル濃度が０．６６μｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、６．６μｍｏｌ／Ｌ〜０．８８ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、７．２μｍｏｌ／Ｌ〜０．５６ｍｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましい。
【0125】
また、前記培地のｐＨは、７．０以上であることが好ましく、７．２〜７．８であることがより好ましい。培地のｐＨが７．０以上であると、培地中でのｐＨ感受性担体を構成するｐＨ感受性化合物の不安定化を防止できることから好ましい。
【0126】
前記細胞としては、特に制限されないが、対象者から採取された細胞、株化された培養細胞等が挙げられる。
【0127】
この際、前記対象者から採取された細胞または株化された培養細胞の具体例としては、樹状細胞、ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ）細胞、Ｔリンパ細胞、Ｂリンパ球細胞、リンパ球細胞等が挙げられる。
【0128】
上記細胞のうち、対象者から採取された細胞を用いることが好ましく、対象者から採取された樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、リンパ細胞等を用いることがより好ましく、樹状細胞を用いることがさらに好ましい。
【0129】
対象者から採取された細胞を用いる場合には、対象者を採血、生検等により当該細胞を採取することができる。すなわち、一実施形態において、前記培養方法は、対象者から細胞を採取する工程を含みうる。
【0130】
なお、培養した細胞は、対象者に投与してもよい。これにより、対象者の疾患の治療または予防をすることができる。すなわち、本発明の一実施形態において、疾患の治療または予防方法が提供される。
【0131】
好ましい一実施形態において、前記治療または予防方法は、対象者から細胞を採取する工程と、ワクチン組成物を含む培地で前記採取した細胞を培養する工程と、前記培養した細胞を前記対象者に投与する工程と、を含む。
【0132】
これにより、疾患の治療または予防をすることができる。なお、前記疾患は上述のとおりである。
【0133】
＜アジュバント組成物の製造方法＞
本発明に係るアジュバント組成物は、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。
【0134】
例えば、ｐＨ感受性担体と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質とが独立に存在するアジュバント組成物においては、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する刺激を有する物質を混合することにより製造することができる。また、自然免疫を活性化する刺激を有する物質が、ｐＨ感受性担体に担持または包含されるアジュバント組成物においては、ｐＨ感受性担体と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質とを会合させることにより製造することができる。
【0135】
以下、ｐＨ感受性担体として、所定のｐＨ感受性化合物および所定の両親媒性物質を含み、膜破壊機能促進効果を有するｐＨ感受性担体を用いる好ましい形態について、以下に詳細に説明する。
【0136】
本形態に係るアジュバント組成物の製造方法は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質と、を会合させる工程を含む。
【0137】
ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質、および自然免疫を活性化する刺激を有する物質を会合させる方法としては、ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質、および自然免疫を活性化する刺激を有する物質が、水性溶液中で接触すればよい。したがって、本形態に係るアジュバント組成物は、ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質とを、水性溶液中で接触させることにより製造することができる。
【0138】
ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質とを、水性溶液中で接触させる方法としては、これらが会合体を形成すれば特に制限されない。例えば、（１）ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液と、両親媒性物質を含む水性溶液と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質を含む水性溶液とを別々に調製し、これら水性溶液を混合し、当該溶液を、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて強く撹拌し分散させてアジュバント組成物を得る方法；（２）リポソームの製造法として公知であるバンガム法にて調製する方法等が挙げられる。なお、前記バンガム法の具体的な方法としては、例えば以下の方法で行うことができる。すなわち、ガラス容器中で、アジュバント組成物の構成成分を有機溶媒（例えば、メタノール、クロロホルム）に溶解し、ロータリーエバポレーターなどによって有機溶媒を除去して、ガラス容器の壁に薄膜を形成させる。次いで、水性溶液を、薄膜を形成したガラス容器に加えて、５〜３５℃で薄膜を膨潤させた後、５〜３５℃でガラス容器を振盪する。この際、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波を用いて強く撹拌し、薄膜を十分に水性溶液中に分散させることができる。バンガム法の方法の詳細は、公知のリポソームの製造方法を参考にすることができ、「リポソーム」（野島庄七、砂本順三、井上圭三編、南江堂）および「ライフサイエンスにおけるリポソーム」（寺田弘、吉村哲郎編、シュプリンガー・フェアラーク東京）に記載されている。また、上記の（１）製造方法において、両親媒性物質を含む水性溶液に、ｐＨ感受性化合物、自然免疫を活性化する刺激を有する物質を混合させてもよい。なお、水性溶液の溶媒としては、上述した水性溶液の溶媒を使用することができる。上記（１）の方法では、各水性溶液を調製する際の温度および水性溶液を混合する温度は、特に制限されないが、５〜３５℃、好ましくは常温の１５〜２５℃であるのが好ましい。
【0139】
なお、水性溶媒を成分として含むアジュバント組成物に含有されうる安定化剤等の他の成分の添加方法は、特に制限されない。例えば、ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、および／または自然免疫を活性化する刺激を有する物質を含む水性溶液に添加していてもよいし、バンガム法により薄膜を調製する際に、アジュバント組成物の構成成分と一緒に溶解させて、これらの成分を含む薄膜を用いて、アジュバント組成物を含む水性溶液を得てもよい。
【0140】
＜ワクチン組成物の製造方法＞
本発明に係るワクチン組成物は、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。具体的なワクチン組成物の製造方法としては、分散調製法、混合調製法、および凍結融解−凍結乾燥調製法等が挙げられる。
【0141】
（分散調製法）
分散調製法は、ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質と、抗原と、を混合する工程を含む。すなわち、ガラス容器の壁に、アジュバント組成物の構成成分を含む薄膜を形成させる。次いで、抗原を含む溶液を、薄膜を形成したガラス容器に加えて、５〜３５℃で薄膜を膨潤させた後、ガラス容器を振盪する。この際、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波を用いて強く撹拌し、分散させる方法で、ワクチン組成物を調製する。または、ガラス容器の壁に、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質を含む薄膜を形成させ、次いで、抗原と自然免疫を活性化する刺激を有する物質とを、含む溶液を、薄膜を形成したガラス容器に加えて、５〜３５℃で薄膜を膨潤させた後、ガラス容器を振盪する。この際、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波を用いて強く撹拌させる方法で、ワクチン組成物を調製する。
【0142】
前記抗原を含む溶液、および抗原と自然免疫を活性化する刺激を有する物質とを含む溶液は、下記混合調製法と同様のものまたは参考にして調製したものが用いられうる。
【0143】
（混合調製法）
混合調製法は、ｐＨ感受性化合物を含む溶液と、両親媒性物質を含む溶液と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質を含む溶液と、抗原を含む溶液と、を混合する工程を含む。すなわち、混合調製法では、アジュバント組成物を、上記（１）および（２）の方法で調製する。たとえば、アジュバント組成物を（２）の方法で調製する場合は、アジュバント組成物の分散液と、抗原または抗原を含む溶液とを混合することでワクチン組成物を得ることができる。また、（１）の方法でアジュバント組成物を得る場合は、下記の溶液を準備するのが好ましい。
【0144】
ｐＨ感受性化合物を含む溶液
前記ｐＨ感受性化合物を含む溶液は、ｐＨ感受性化合物および溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
【0145】
前記ｐＨ感受性化合物としては、上述したものが使用されうることからここでは説明を省略する。
【0146】
前記溶媒としては、緩衝剤、ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類を含む水溶液の他、滅菌水等が用いられうる。これらのうち、ワクチン組成物を生体に好適に投与する観点から、生理食塩水、滅菌水、緩衝液を用いることが好ましい。
【0147】
前記ｐＨ感受性化合物を含む溶液におけるｐＨ感受性担体の濃度は、ｐＨ感受性化合物のモル濃度が０．０６６μｍｏｌ／Ｌ〜６．４ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．６６μｍｏｌ／Ｌ〜５．６ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、０．７２μｍｏｌ／Ｌ〜３．６ｍｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましい。
【0148】
両親媒性物質を含む溶液
前記両親媒性物質を含む溶液は、両親媒性物質および溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
【0149】
前記両親媒性物質および前記溶媒としては、上述したものが用いられうることからここでは説明を省略する。
【0150】
前記両親媒性物質を含む溶液における両親媒性物質の濃度は、両親媒性物質のモル濃度が０．６６μｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、６．６μｍｏｌ／Ｌ〜０．８８ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、７．２μｍｏｌ／Ｌ〜０．５６ｍｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましい。
【0151】
自然免疫を活性化する刺激を有する物質を含む溶液
前記自然免疫を活性化する刺激を有する物質を含む溶液は、自然免疫を活性化する刺激を有する物質および溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
【0152】
前記自然免疫を活性化する刺激を有する物質および前記溶媒としては、上述したものが使用されうることからここでは説明を省略する。
【0153】
前記自然免疫を活性化する刺激を有する物質を含む溶液における自然免疫を活性化する刺激を有する物質の濃度は、自然免疫を活性化する刺激を有する物質のモル濃度が、好ましくは０．１４ｎｍｏｌ／Ｌ〜０．２２７ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．４ｎｍｏｌ／Ｌ〜０．１９ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１．６ｎｍｏｌ／Ｌ〜０．１２ｍｍｍｏｌ／Ｌである。
【0154】
抗原を含む溶液
前記抗原を含む溶液は、抗原および溶媒を含む。
【0155】
前記抗原および前記溶媒としては、上述したものが使用されうることからここでは説明を省略する。
【0156】
混合
上述のｐＨ感受性化合物を含む溶液、両親媒性物質を含む溶液、自然免疫を活性化する刺激を有する物質を含む溶液、および抗原を含む溶液の混合方法は特に制限されない。
【0157】
得られた混合液は分散させることが好ましく、当該分散は、例えば、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて行うことができる。
【0158】
なお、一実施形態において、ｐＨ感受性化合物を含む溶液、両親媒性物質を含む溶液、自然免疫を活性化する刺激を有する物質を含む溶液、および抗原を含む溶液は、別途の溶液とせず、２種以上の混合液を使用してもよい。例えば、ｐＨ感受性化合物および自然免疫を活性化する刺激を有する物質を含む溶液を調製し、これを両親媒性物質を含む溶液、抗原を含む溶液と混合してもよい。
【0159】
（凍結融解−凍結乾燥調製法）
凍結融解−凍結乾燥調製法は、分散調製法または混合調製法により得られた溶液を凍結融解して融解液を調製する工程、当該融解液を凍結乾燥する工程を含む。
【0160】
融解液を調製する工程
融解液は、分散調製法または混合調製法により得られた溶液を凍結融解することにより調製することができる。
【0161】
凍結融解とは、溶液を凍結乾燥した後、得られた乾燥物を融解させることを意味する。
【0162】
凍結乾燥の方法としては、特に制限されないが、液体窒素、冷却したメタノール等を用いた水分を昇華させる方法が好ましい。
【0163】
また、乾燥物の融解方法としては、特に制限されないが、冷却して得られた乾燥物を昇温する方法、溶媒を添加する方法が好ましい。
【0164】
凍結乾燥する工程
本工程は、上記で得られた融解液を、凍結乾燥する工程である。
【0165】
凍結乾燥の方法は、上記と同様に特に制限されないが、液体窒素、冷却したメタノール等を用いた水分を昇華させる方法が好ましい。
【0166】
上述のワクチン組成物の製造方法のうち、抗原の凍結融解−凍結乾燥調製法を用いることが好ましい。凍結融解−凍結乾燥調製法によれば、抗原がアジュバント組成物に担持または包含されやすくなり、高い抗原の組込率が得られうる。より詳細には、凍結融解−凍結乾燥調製法によれば、凍結融解の段階において、凍結乾燥して得られた乾燥物を融解する際、融解は一定時間をかけて進行する。その結果、融解初期段階では、抗原およびアジュバント組成物は近接した状態となる。抗原およびアジュバント組成物は、一度近接した状態となると、その状態が解除されにくくなる。その結果、融解が完了した融解液中においても抗原およびアジュバント組成物は近接した状態は維持されうる。そして、このような状態で凍結乾燥をすると、抗原はアジュバント組成物に担持または包含されやすくなり、高い抗原の組込率が実現されうる。
【0167】
本発明の好ましい一実施形態によれば、ｐＨ感受性担体は、所定のｐＨ感受性化合物および所定の両親媒性物質を含む。したがって、好ましい実施形態に係るワクチン組成物の製造方法は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質と、を会合させる工程；前記会合により得られた会合体に抗原を混合する工程；前記混合により得られた混合物を凍結融解する工程；および前記凍結融解により得られた融解物を凍結乾燥する工程を含む。
【実施例】
【0168】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【0169】
＜原料＞
実施例では、下記の化合物を用いた。試薬名と製品名が同一の場合は製品名を省略した。
【0170】
（１）ｐＨ感受性化合物
・デオキシコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・コール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・ウルソデオキシコール酸ナトリウム（東京化成工業社製）
・ケノデオキシコール酸（東京化成工業社製）
・ヒオデオキシコール酸（東京化成工業社製）
・グリコデオキシコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・グリチルリチン酸モノアンモニウム（東京化成工業社製）
（２）両親媒性物質
・ＤＤＰＣ（１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＭＣ−１０１０）
・ＤＬＰＣ（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＭＣ−１２１２）
・ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０，８０：東京化成工業社製）
・ソルビタン脂肪酸エステル（ＳＰＡＮ８０：ナカライテスク社製−ソルビタンモノオレエート）
・ポリオキシエチレンヒマシ油（和光純薬工業社製、ポリオキシエチレン１０ヒマシ油）
・α−トコフェロール（ナカライテスク社製、ＤＬ−α−トコフェロール）
（３）自然免疫を活性化する刺激を有する物質等
・ＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ）（Ｓｉｇｍａ社製、リピッドＡ,モノホスホリル サルモネラ菌 セロタイプ／Ｉｎ Ｖｉｖｏｇｅｎ社製、Ｍｏｎｏｐｈｏｓｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）
・ＩＦＡ（Ｆｒｅｕｎｄ‘ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ：不完全フロイントアジュバント) (Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
・ＣｐＧ−ＤＮＡ（ＣｐＧ−ＯＤＮ：ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製、ＯＤＮ−２３９５）
・ＬＰＳ（内毒素）（和光純薬工業社製、大腸菌Ｏ１１１由来フェノール抽出品）
（４）溶媒等
・注射用水：（大塚製薬株式会社製）
・ＭＥＳ−Ｎａ（メルク社製）
・塩化ナトリウム（関東化学社製）
・ＰＢＳ Ｔａｂｌｔｅｓ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：タカラバイオ社製）
・メタノール（ナカライテスク社製）
・クロロホルム（和光純薬工業社製）
・水酸化ナトリウム水溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ：ナカライテスク社製）
・塩酸（０．１ｍｏｌ／Ｌ、１ｍｏｌ／Ｌ：ナカライテスク社製）
・ＯＶＡペプチド：ＳＩＩＮＦＥＫＬ，（ピーエイチジャパン委託合成）（以下、単に「ペプチド」とも称する。）
・ＯＶＡタンパク質：ＯＶＡ（ＥｎｄｏＦｉｔ Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ：ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製社製）（以下、単に「ＯＶＡ」とも称する。）
（５）培地等
・ＲＰＭＩ（ナカライテスク社製、ＲＰＭＩ １６４０培地（液体））
・Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔａｍｙｃｉｎ Ｍｉｘｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）
・ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，Ｃｅｎｔｉｆｉｅｄ，Ｈｅａｔ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｅｄ，ＵＳ Ｏｒｉｇｉｎ：Ｇｉｂｃｏ社製）
（６）試薬
・ＥＹＰＣ（未水添卵黄ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣ−５０）
・リン脂質Ｃ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）：リン脂質測定試薬
・Ｐｙｒａｎｉｎｅ（東京化成工業社製）：蛍光物質
・ＤＰＸ（ｐ−ｘｙｌｅｎｅ−ｂｉｓ−ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製）：消光剤
・Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００(和光純薬工業社製)：界面活性剤
・ＮＢＤ−ＰＥ（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ（７−ｎｉｔｒｏ−２−１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍ：ＡｖＡｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ社製）
・Ｒｈ−ＰＥ(１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍ：ＡｖＡｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ社製）：蛍光標識脂質
・Ｒｈ−ＰＥ(１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍ：Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ社製）：蛍光標識脂質
・Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ、Ｂ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）：タンパク質定量キット
ＩｓｏＦｌｏｗ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）：フローサイトメトリー専用シース液
・ＲＢＣ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）：赤血球溶血バッファー
・細胞分散用コラゲナーゼ（和光純薬工業社製）：細胞分散試薬
・Ａｎｔｉ−ＣＤ１１ｃＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＣＤ１１ｃＦＩＴＣ）：フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗体
・Ａｎｔｉ−ＣＤ８０ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＣＤ８０（Ｂ７−１）ＰＥ）：Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）標識抗体（以下、ＣＤ８０ＰＥとも称する。）
・Ａｎｔｉ−ＣＤ８６ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＣＤ８６（Ｂ７−２）ＰＥ）：ＰＥ標識抗体（以下、ＣＤ８６ＰＥとも称する。）
・Ａｎｔｉ−ＣＤ４０ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＣＤ４０ＰＥ）：ＰＥ標識抗体（以下、ＣＤ４０ＰＥとも称する。）
・Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ１６／３２ （ＢＤ バイオサイエンス社製）
・Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ バイオサイエンス社製）：細胞固定・細胞膜透過キット
・ＢＤ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ：染色用バッファー
・ＢＤ ＧｏｌｇＰｌｕｇ：細胞刺激キット
・Ａｎｔｉ−ＣＤ８αＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）：ＰＥ標識抗体
・Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ Ｓｅｔ（ＢＤ バイオサイエンス社製）
・ＡＥＣ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｅｔ（ＢＤ バイオサイエンス社製）
・炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）
・炭酸ナトリウム（和光純薬工業社製）
・二次抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社製）
・アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、Ｓｉｇｍａ社製）
・ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト株式会社製）
（７）動物
雌、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６−８週齢）は日本エスエルシーより購入した。実験はテルモ株式会社における動物実験に関する指針に従って実施した。
【0171】
＜試料の調製等＞
・ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ
ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭの配合量で調製した。ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒは、特別な記載のない限りｐＨは７．４である。
・ＰＢＳ
ＰＢＳ Ｔａｂｌｔｅｓ（タカラバイオ社製）を用いて調製した。具体的には、ＰＢＳ Ｔａｂｌｔｅｓ１０錠を蒸留水に溶解し、全量を１０００ｍＬとして調製した。なお、ｐＨは、７．３５〜７．６５である。
・ＭＰＬストック溶液の作製
ＭＰＬのストック溶液は、クロロホルム、メタノール（７：３）の混合溶液を用いて、１００ｎｇ／μＬとなるように調製した。また、必要であればさらに希釈して使用した。
・ＲＰＭＩメディウム
抗生物質としてペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加し、必要に応じてＦＢＳを追加で添加し、１０％血清含有ＲＰＭIメディウムとした。
【0172】
＜使用機器＞
超音波照射機：ＵＳＣ−Ｊ
分光光度計：ＦＰ−６５００
フローサイトメーター：（ＦＣ５００，ソフトウェア：ＣＸＰ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒ２）
ＵＶ−ｖｉｓ分光光度計：ＵＶ−３６００
凍結乾燥機：ＥＹＥＬＡ ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤＵ５０６
真空ポンプ：ＧＣＤ１３５ＸＡ
ＣＯ２、インキュベーター：ＭＣＯ２０ＡＩＣ
分離用フィルター：Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３０Ｋ
＜細胞の培養＞
細胞の培養は、５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター（ＭＣＯ２０ＡＩＣ）を用いて実施した。
【0173】
（アジュバント組成物およびワクチン組成物の調製）
分散調製法による製造
メタノール（またはクロロホルム）に溶解した１０００ｎｍｏｌの両親媒性物質と、メタノール（またはクロロホルム）に溶解したｐＨ感受性化合物と、ＭＰＬのストック溶液とを１０ｍＬナスフラスコで混合し、ロータリーエバポレーターを用いて薄膜とした。
【0174】
作製した薄膜に１．０ｍＬのＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（溶出性試験および膜融合試験の場合）または１．０ｍＬのＰＢＳ（組込率の測定、自然免疫を活性化する刺激の評価、マウスへの免疫の場合）を添加し、超音波照射装置を用いて分散させ、アジュバント組成物の分散液を調製した。ワクチン組成物の場合は、所定量の抗原を溶解させたＭＥＳ ＢｕｆｆｅｒあるいはＰＢＳを使用した。
【0175】
なお、両親媒性物質とｐＨ感受性化合物との比率は、所望の比率となるよう調整した。また、複数の両親媒性物質を使用する場合は、両親媒性物質の総量が、所望のモル数（１０００ｎｍｏｌ）となるように調整した。また、実施例や図の説明におけるｐＨ感受性化合物の使用量は、１００ｎｍｏｌの両親媒性物質に対する使用量である。
【0176】
混合調製法による製造
メタノール（またはクロロホルム）に溶解した１０００ｎｍｏｌの両親媒性物質と、メタノール（またはクロロホルム）に溶解したｐＨ感受性化合物と、ＭＰＬのストック溶液とを１０ｍＬナスフラスコで混合し、ロータリーエバポレーターを用いて薄膜とした。得られた薄膜に、０．５ｍＬのＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（溶出性試験および膜融合試験の場合）または０．５ｍＬのＰＢＳ（組込率の測定、自然免疫を活性化する刺激の評価、マウスへの免疫の場合）を添加し、５〜３５℃で超音波照射装置を用いて分散させ、アジュバント組成物の分散液を調製した。
【0177】
得られたアジュバント組成物の分散液に、種々の濃度の抗原溶液を等量添加し、混合することで、ワクチン組成物の分散液を調製した。
【0178】
凍結融解−凍結乾燥調製法による製造
混合調製法と同様の方法で、アジュバント組成物の分散液を調製した。得られたアジュバント組成物の分散液に、種々の濃度の抗原溶液を等量添加し、凍結融解および凍結乾燥を順次行った。得られた凍結乾燥物を５〜３５℃で１．０ｍＬの注射用水にて再分散させることで、ワクチン組成物の分散液を調製した。
【0179】
なお、凍結融解は、１０ｍＬナスフラスコを冷却したメタノールに浸漬させ、分散液を凍結させた後、さらに５〜３５℃での蒸留水に浸漬させることで行った。
【0180】
また、凍結乾燥は、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤＵ５０６）と真空ポンプ（ＧＣＤ１３５ＸＡ）を用いて、分散液を凍結乾燥させた。
【0181】
ＣｐＧ−ＤＮＡ（ＣｐＧ−ＯＤＮ）を用いる場合は、１０００ｎｍｏｌの両親媒性物質と、所定量のｐＨ感受性化合物からなる混合薄膜を作製し、０．５ｍＬのＰＢＳと超音波照射装置によって分散液とした。さらに、所定量のＣｐＧ-ＤＮＡと、所定量の抗原を溶解させた０．５ｍＬのＰＢＳを添加し、実験に使用した。
【0182】
（比較試料の調製）
比較試料として、ＭＰＬ単独の分散液（ＭＰＬ分散液）、両親媒性物質単独の分散液、ｐＨ感受性担体単独の分散液をそれぞれ調製した。なお、マウスへの免疫を実施する場合は、さらに所定量の抗原を含む。
【0183】
すなわち、ＭＰＬストック溶液またはメタノール（またはクロロホルム）に溶解した両親媒性物質もしくはｐＨ感受性担体を１０ｍＬナスフラスコに所定量添加し、ロータリーエバポレーターにより薄膜とした。得られた薄膜に１．０ｍＬのＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（溶出性試験および膜融合試験の場合）または１．０ｍＬのＰＢＳ（組込率の測定、自然免疫を活性化する刺激の評価、マウスへの免疫の場合）を添加し、超音波照射装置を用いて分散させることで、ＭＰＬ単独の分散液、両親媒性物質単独の分散系、またはｐＨ感受性担体単独の分散液を調製した。ＣＴＬ誘導率を評価する場合は、所定量の抗原を溶解させたＰＢＳを使用した。
【0184】
＜測定方法＞
（溶出性試験：Ｌｅａｋａｇｅ（溶出率）の測定）
Ｌｅａｋａｇｅ（溶出率）は、Ｋ．Ｋｏｎｏ ｅｔ ａｌ. Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２００８ １９ １０４０−１０４８に記載の方法に従い、蛍光物質であるＰｙｒａｎｉｎｅと消光剤であるＤＰＸとを内包したＥＹＰＣリポソームを用いて評価した。
【0185】
クロロホルムに溶解させた３０００ｎｍｏｌのＥＹＰＣを１０ｍＬナスフラスコに測り入れ、ロータリーエバポレーターを用いて薄膜とした。Ｐｙｒａｎｉｎｅ溶液（Ｐｙｒａｎｉｎｅ：３５ｍＭ、ＤＰＸ：５０ｍＭ、ＭＥＳ：２５ｍＭ、ｐＨ７．４）５００μＬを加え、超音波照射装置（ＵＳＣ−Ｊ）を用いて分散させた後、エクストルーダーを用いて孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を通し、粒子径を揃えた。ＭＥＳ ＢｕｆｆｅｒとＧ１００カラムを用いて外水層の置換を行い、蛍光物質を内包したＥＹＰＣリポソーム分散液を得た。リン脂質Ｃ−テストワコーを用いてリン脂質の濃度を求め、リン脂質が１．０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒを用いて濃度を調整した。
【0186】
濃度を調製したＥＹＰＣリポソーム分散液２０μＬと、評価サンプル分散液２０μＬを、ｐＨを調整した２９６０μＬのＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒに投与し、３７℃にて９０あるいは３０分間インキュベーションした後(実施例において、特別な記載のない限り、９０分間の結果である)、分光光度計ＦＰ−６５００を用いてＥｘ４１６、Ｅｍ５１２ｎｍの蛍光を観察することにより、Ｌｅａｋａｇｅをモニターした。
【0187】
なお、ＥＹＰＣリポソーム分散液のみの場合を０％とし、１０倍希釈したＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を３０μＬ加えた場合の値を１００％として、溶出率を算出した。具体的には、溶出率は、下記式に従って計算した。なお、下記式中において、測定した蛍光強度をＬとし、蛍光物質を内包したＥＹＰＣリポソーム分散液のみの蛍光強度をＬ０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加えた場合の蛍光強度をＬ１００と表す。
【0188】
【数3】
【0189】
（膜融合試験：Ｆｕｓｉｏｎ（膜融合）の測定）
Ｆｕｓｉｏｎ（膜融合）は、Ｋ．Ｋｏｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００８ ２９ ４０２９−４０３６に記載の方法に従い、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）を利用して評価した。蛍光標識は、ＮＢＤ−ＰＥ、Ｒｈ−ＰＥを用いた。
【0190】
ＥＹＰＣに対して０．６ｍｏｌ％のＮＢＤ−ＰＥ、およびＲｈ−ＰＥを含むＥＹＰＣ（ＥＹＰＣ１０００ｎｍｏｌ）の薄膜を作製し、１．０ｍＬのＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒを加え、超音波照射装置（ＵＳＣ−Ｊ）を用いて分散させた後、エクストルーダーを用いて孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を通し、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液を得た。
【0191】
二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液２０μＬと、評価サンプル分散液２０μＬを、ｐＨを調製した２９６０μＬのＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒに投与し、３７℃にて６０分間インキュベーションした後、分光光度計（ＦＰ−６５００）を用いて４５０ｎｍの励起光による５００ｎｍ〜６２０ｎｍの蛍光スペクトルを測定し、５２０ｎｍと５８０ｎｍとの蛍光強度比を求めた。
【0192】
融合率は、上記で得られた二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と両親媒性物質とをインキュベーションした場合の蛍光強度比を０％とし、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と、評価サンプル分散液と、をメタノール処理したものを１００％として算出した。なお、メタノール処理は二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と評価サンプル分散液との両者をメタノールに溶解させた後、ロータリーエバポレーターを用いて薄膜とし、３．０ｍＬのＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒと超音波照射装置を用いて分散させて実施した。
【0193】
具体的には、融合率は、下記式に従って計算した。なお、下記式中において、測定して得られた蛍光強度比をＲとし、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と両親媒性物質とをインキュベーションした場合の蛍光強度比をＲ０、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と評価サンプル分散液をメタノール処理して得られた蛍光強度比をＲ１００と表す。
【0194】
【数4】
【0195】
（組込率の測定）
組込率の評価は、抗原が、単独であるとフィルターを通過し、アジュバント組成物に担持または包含されたものであるとフィルターを通過しないことを利用して、下記のように実施した。
【0196】
アジュバント組成物および抗原を含む分散液を、室温、７０００ｒｐｍ、１０分の条件にて、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３０Ｋのフィルターを通した。
【0197】
フィルター前後の抗原を測定することで、組込率を算出した。フィルター前後において、Ｌｏｗｒｙ法により抗原の呈色を行い、ＵＶ−ｖｉｓ分光光度計で７５０ｎｍの吸光度を測定し、下記式に従って組込率を算出した。なお、呈色には２００μＬを用いて実施した。また、下記式中において、フィルター前の分散液の抗原の呈色に基づく吸光度をＡｂｅｆｏｒｅとし、フィルター後の分散液の抗原の呈色に基づく吸光度をＡａｆｔｅｒとし、ＰＢＳを用いた場合の吸光度をＡＢｕｆｆｅｒとした。すなわち、分子はフィルターを通過しなかった抗原、つまりアジュバント組成物に組み込まれた（担持または包含された）抗原を表す。
【0198】
【数5】
【0199】
（自然免疫を活性化する刺激の評価）
自然免疫を活性化する刺激の評価は、下記に従って実施した。
【0200】
すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの脾臓を摘出し、２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ溶液５００μＬ（ＲＰＭＩメディウムを用いて調製）を摘出した脾臓に注射し、３７℃にて３０分間インキュベートした。ＢＤ Ｆａｌｃｏｎセルストレーナーを用いて脾臓を処理し、細胞懸濁液とした。ＲＢＣ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いて溶血操作を行った後、ＲＰＭＩメディウムを用いて細胞を洗浄した。細胞をＲＰＭＩメディウムにて分散した後、細胞数をカウントし、次の操作に使用した。
【0201】
９６ｗｅｌｌ ｄｉｓｈに、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μＬとなるように細胞を播種した後、各種分散液を含むＲＰＭＩメディウム１００μＬをさらに添加し、一晩インキュベーションした。これらの操作は、血清非含有ＲＰＭIメディウムを用いて行った。
【0202】
細胞を回収し、ＢＤ ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒを用いて洗浄した後、０．２５μｇ／１００μＬのＡｎｔｉ−ＣＤ１１ｃＦＩＴＣとインキュベーションし（４℃、３０分）、細胞を染色した。細胞を洗浄した後、さらに０．２５μｇ／１００μＬのＡｎｔｉ−ＣＤ８０ＰＥ、Ａｎｔｉ−ＣＤ８６ＰＥ、またはＡｎｔｉ−ＣＤ４０ＰＥとインキュベーションし（４℃、３０分）、染色した。細胞を少なくとも３回以上洗浄した後、フローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００，ソフトウェア：ＣＸＰ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒ２）を用いて細胞の評価を行った。
【0203】
（マウスへの免疫）
投与は麻酔下にて実施し、背部１箇所に１００μＬ／ｈｅａｄにて皮下注射した。両親媒性物質は１００ｎｍｏｌ／ｈｅａｄとし、ｐＨ感受性化合物は１０〜６４０ｎｍｏｌ／ｈｅａｄ、ＭＰＬ含率は０．０２２７〜２２．７ｎｍｏｌ／ｈｅａｄとした。抗原量は、３．２〜４００μｇ／ｈｅａｄとした。細胞性免疫を評価する場合は、投与を１回とし、投与から７日後にアッセイを実施した。液性免疫を評価する場合は、投与を２回とした。初回投与から１４日後に２回目の投与を実施し、２回目の投与から７日後にアッセイを実施した。
【0204】
（マウス脾臓からの細胞分散液の調製）
最終の投与から７日目においてマウスを安楽死させ、脾臓を摘出した。３．０ｍＬの１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを添加した後、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎセルストレーナーを用いて脾臓を処理し、細胞懸濁液とした。ＲＢＣ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いて溶血操作を行った後、１０％血清含有ＲＰＭIメディウムを用いて細胞を洗浄した。細胞を１０％血清含有ＲＰＭIメディウムにて分散した後、細胞数をカウントし、脾臓の細胞分散液を得た。
【0205】
（ＣＴＬ誘導率の評価−ＩＣＳ法）
脾臓の細胞分散液を１０％血清含有メディウムにて１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μＬとなるように播種した。抗原の再刺激として、４０μｇ／ｍＬのＯＶＡペプチドを含む１０％血清含有ＲＰＭIメディウム１００μＬを添加し、３時間インキュベーションした。その後、ＢＤ ＧｏｌｇｉＰｌｕｇを０．２μＬ／１００μＬとなるように加え、一晩培養した。再刺激を加えない場合は、ＯＶＡペプチドを含まない１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを使用した。
【0206】
細胞を回収し、ＢＤ ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒを用いて洗浄した後、Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ１６／３２を添加し、４℃にて１０分間インキュベートした。細胞を洗浄した後、Ａｎｔｉ−ＣＤ８αＰＥにて細胞を染色し（４℃、３０分）、再度、細胞を洗浄した。その後、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍを用いて細胞を透過処理し、洗浄した後、Ａｎｔｉ−ＩＦＮγＦＩＴＣにて細胞を染色した（４℃、３０分）。細胞を少なくとも３回以上洗浄した後、フローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００，ソフトウェア：ＣＸＰ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒ２）を用いて細胞の評価を行った。ＣＴＬ誘導率は、全ＣＤ８陽性細胞中に占めるＩＦＮγ産生細胞の割合として算出した。
【0207】
（ＥＬＩｓｐｏｔ法）
ＥＬＩｓｐｏｔ法は、Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ Ｓｅｔを用いて実施した。細胞を播種する前日に、９６ｗｅｌｌ ＥＬＩｓｐｏｔプレートにキットに付属のｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙを吸着させて、プレートを作製した。作製したプレートを１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムにて洗浄した後、２００μＬの１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを添加し、３７℃にて２時間静置しブロッキングを行った。１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムにてプレートを洗浄した後、抗原の再刺激を加える場合は、４０μｇ／ｍＬのＯＶＡペプチドを含む１０％血清含有ＲＰＭＩメディウム１００μＬをプレートに添加し、抗原の再刺激を加えない場合は１０％血清含有ＲＰＭＩメディウム１００μＬをプレートに添加した。前記プレートに、脾臓の細胞分散液を所定の細胞数となるように播種し、最後に、１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを用いて１穴あたりの全量が２００μＬとなるように、調整した。その後、二晩培養し、プレートの呈色を行った。
【0208】
プレートの呈色は、Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ Ｓｅｔ、およびＡＥＣ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｅｔに記載のプロトコールに従って実施した。
【0209】
（抗体価の測定）
２回目の投与から７日後に採血を実施し、血清を得た。５００ｍＬのＰＢＳに５ｇのアルブミンを溶解し、Ｂｌｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒとした。１．４７ｇの炭酸水素ナトリウムと０．８０ｇの炭酸ナトリウムを５００ｍＬの水に溶解させ、Ｃｏａｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒとした。プレートの洗浄には、５００ｍＬのＰＢＳに２．５ｍＬのＴｗｅｅｎ２０を添加したものを使用した。
【0210】
ＯＶＡタンパク質をＣｏａｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒに溶解させ、０．１μｇ／ｗｅｌｌ（１００μＬ）となるように、９６ｗｅｌｌプレートに添加した。３７℃にて２時間静置した後、３００μＬのＢｌｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒと置換し、４℃にて一晩静置した。プレートを洗浄した後、所定の倍率に希釈した血清を各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、３７℃にて２時間静置した。プレートを洗浄した後、Ｂｌｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒにて１０００倍希釈した二次抗体溶液を各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、３７℃にて２時間静置した。プレートを洗浄した後、ペルオキシダーゼ用発色キットを用いて発色を行い、抗体価を求めた。
【0211】
［評価］
前記記載の方法に従って調製した分散液を用いて各種評価を行った。
【0212】
（１）免疫応答の誘導
細胞性免疫の誘導について検討した。アジュバント組成物の両親媒性物質はＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物は１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸とした。ＭＰＬ含率は０．２２７とし、モデル抗原としてＯＶＡペプチド（以下、「ペプチド」とも称する）を選択した。この際、ＭＰＬ含率とは１００ｎｍｏｌの両親媒性物質に対するＭＰＬの量（ｎｍｏｌ）であり、ｐＨ感受性化合物の量は１００ｎｍｏｌの両親媒性物質に対する量である。
調製法は分散調製法である。
【0213】
また、比較試料としては、ペプチド単独の溶液、ｐＨ感受性担体（ＤＬＰＣ−デオキシコール酸）およびペプチドの分散液、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）およびペプチドの溶液を用いた。上記の溶液または分散液を、それぞれＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの背部皮下に１回投与し、脾臓におけるＩＦＮγ産生細胞数を測定し、ＣＴＬの誘導を評価した。
【0214】
具体的な評価は、ＥＬＩｓｐｏｔ法により行った。得られた結果を図２に示す。評価条件は、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。図２の（Ａ）は、ＩＦＮγのｓｐｏｔ形成数を評価したグラフであり、（Ｂ）はペプチド単独を用いた場合のＳｐｏｔ形成の様子であり、（Ｃ）は、ペプチドと、ＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体（アジュバント組成物）を用いた場合のＳｐｏｔ形成の様子である。ペプチド単独は未処置と同等のｓｐｏｔ数であり、ＣＴＬは誘導されなかった（図２（Ａ））。また、ＭＰＬを含まないＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体も未処置と同等のｓｐｏｔ数であり、ＣＴＬの誘導には至らなかった（図２（Ａ））。これは興味深い結果であり、ＣＴＬの誘導には自然免疫を活性化する刺激が必要であることを示している。
【0215】
一方、アジュバント組成物であるＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体を用いた場合は、未処置やペプチド単独に比べて多数のｓｐｏｔを形成した（図２（Ａ）〜（Ｃ））。ｓｐｏｔ数はポジティブコントロールのＩＦＡと同等であったことから、ＩＦＡと同程度に強くＣＴＬを誘導したものと考えられる。ＩＦＡはＣＴＬを誘導するアジュバントとして臨床試験に広く使用されており、同等の活性をもつ本発明は臨床における有効性が期待される。
【0216】
（２）ＭＰＬとの比較
ＭＰＬは自然免疫を活性化し、単独でもアジュバントとして機能することが知られている。また、細胞性免疫を誘導することが知られている。そこで、抗原と共に投与するものとして、ＭＰＬを単独で使用した場合と、ＭＰＬをｐＨ感受性担体と共に使用した場合（アジュバント組成物）における、細胞性免疫の誘導を比較した。なお、抗原は８０μｇのペプチドを使用し、ＭＰＬはＭＰＬ含率０．２２７あるいは前記に相当する量を使用した。アジュバント組成物は、上記（１）と同様、ＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の分散液とした。上記の溶液または分散液を、それぞれＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの背部皮下に１回投与し、ＩＣＳ法によりＣＴＬ誘導率を求めた。この際、ＣＴＬ誘導率は、死細胞の影響を受けにくい所定の領域における全ＣＤ８陽性細胞に対するＩＦＮγ産生細胞の割合（ＩＦＮγ産生細胞／全ＣＤ８陽性細胞）である。
【0217】
得られた結果を図３に示す。図３の（Ａ）は、ペプチドの溶液（ペプチド単独）を用いた場合の結果であり、（Ｂ）はペプチドと、ＭＰＬ分散液（ＭＰＬ単独）を用いた場合の結果であり、（Ｃ）はペプチドと、ＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体（アジュバント組成物）を用いた場合の結果である。
【0218】
ペプチドとＭＰＬ分散液を用いた場合のＣＴＬ誘導率は０．２７％であり、ペプチド単独を用いた場合（０．１４％）に比べて、僅かに高い値となった（図３（Ａ）、（Ｂ））。また、ペプチドとＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体を用いた場合のＣＴＬ誘導率は０．５３％となり、ＭＰＬ分散液の場合と比べて、高い値となった（図３（Ｂ）、（Ｃ））。同様の抗原を用いたにも関わらず、ＭＰＬを含むｐＨ感受性担体（アジュバント組成物）は、ＭＰＬ分散液を用いた場合よりも高いＣＴＬ誘導率を示した。この結果は、アジュバント組成物のＣＴＬ誘導増強効果を示している。
【0219】
以上の結果により、ＭＰＬのＣＴＬ誘導効果はｐＨ感受性担体によって増強されることが示された。ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果が、細胞質基質への抗原のデリバリーを可能とし、クロスプレゼンテーションの促進を通じてＣＴＬ誘導効果を増強したものと考えられる。
【0220】
（３）調製方法の検討
ワクチン組成物は、抗原とアジュバント組成物を含む。ワクチン組成物の調製方法を検討することにより、アジュバント組成物のＣＴＬ誘導増強効果を、より高めることが出来ると考え、検討を行った。
【0221】
分散調製法、混合調製法、および凍結融解−凍結乾燥調製法を用いてワクチン組成物の分散液を調製し、上記（２）と同様の方法で、ＣＴＬ誘導率を求めた。両親媒性物質はＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物は１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸とした。ＭＰＬ含率は０．２２７とし、抗原は８０μｇのペプチドとした。
【0222】
得られた結果を図４に示す。図４の（Ａ）は、ＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体（分散調製法）を用いた場合の結果であり、（Ｂ）はＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体（混合調製法）を用いた場合の結果であり、（Ｃ）はＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体（凍結融解−凍結乾燥調製法）を用いた場合の結果である。
【0223】
分散調製法、混合調製法、および凍結融解−凍結乾燥調製法によって調製したワクチン組成物は、いずれもＭＰＬ単独よりも高いＣＴＬ誘導率を示した（０．５３％、０．５４％、１．４７％、図４（Ａ）〜（Ｃ））。このため、ワクチン組成物中における、アジュバント組成物は、いずれの調製方法においてもＣＴＬ誘導増強効果を有することが確認された。特に、凍結融解−凍結乾燥調製法により調製したワクチン組成物は、非常に高いＣＴＬ誘導率を示しており、凍結融解−凍結乾燥調製法は、ワクチン組成物中におけるアジュバント組成物に対して、高いＣＴＬ誘導増強効果を与えることが明らかとなった（図４（Ｃ））。
【0224】
（４）組込率の評価
（３）において、凍結融解−凍結乾燥調製法により調製されたワクチン組成物は、非常に高いＣＴＬ誘導率を示した。
【0225】
アジュバント組成物への抗原の組込が、細胞質基質へのデリバリー効率の向上をもたらし、高いＣＴＬ誘導増強効果をもたらしたと考えられる。そこで、アジュバント組成物への抗原の組込率を評価した。まず、評価系の確認を行った。ペプチド単独の溶液では、フィルター前後においてＬｏｗｒｙ法の吸光度に変化はなく、ペプチドはフィルターに捕獲されなかった（図５（Ａ））。一方、テストワコーによる吸光度はフィルターにより、ほぼ完全に消失し（図５（Ｂ））、アジュバント組成物はフィルターによって捕獲されることが明らかとなった。以上より、本評価系によりアジュバント組成物への抗原の組込率を評価可能であると考えた。
【0226】
図５の（Ｃ）は、分散調製法、混合調製法、および凍結融解−凍結乾燥調製法によってワクチン組成物を調製し、組込率の評価を行った結果である。分散調製法は５％前後と低い組込率であり、混合調製法においても低い組込率であった。一方、凍結融解−凍結乾燥調製法は、最大で約６０％の組込率であった（図５（Ｃ））。凍結融解−凍結乾燥調製法により調製したワクチン組成物は、アジュバント組成物と抗原が高い割合で一体となっていることが示された。なお、両親媒性物質はＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物は１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸とした。ＭＰＬ含率は０．２２７である。
【0227】
凍結融解−凍結乾燥調製法は、抗原の高い組込率を実現し、アジュバント組成物と抗原が同一のエンドソームに取り込まれる確率を高めたと考えられる。その結果、膜破壊機能促進効果による細胞質基質デリバリーが効率良く実現し、上記（３）の結果でも示されたような高いＣＴＬ誘導増強効果に繋がったと考えられる。
【0228】
（５）ＭＰＬの量について
上述の（１）の結果において、ＭＰＬを含まないＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体を用いた場合は、ＣＴＬの誘導には至らなかったことが確認された。これは、ｐＨ感受性担体をアジュバント組成物として利用するためには、自然免疫を活性化する物質が必要であることを示している。そこで、ｎａｔｕｒｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１１ ｖｏｌ：１０（３） ２４３−２５１やＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１１ ７１ ２８５８−２８７０の報告を参考にマウス脾臓細胞を用いたｅｘ ｖｉｖｏ実験を行うことで、自然免疫を活性化する刺激の強さを調べた。これにより必要なＭＰＬの量を求めた。
【0229】
まず、評価系の確認を行った。
【0230】
図６に、評価系の確認を行った結果を示す。図６の（Ａ）は、培養したマウス脾臓細胞を染色せずに評価したフローサイトメトリーの結果であり、死細胞の領域を調べたものである。図６の（Ｂ）および（Ｃ）は培養したマウス脾臓細胞にＰＢＳ単独、ＬＰＳを４００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、ＣＤ８０の発現増強を確認した結果である。図６の（Ｄ）は種々の濃度でＬＰＳを添加した場合における、フローサイトメトリーの結果をまとめたグラフである。図６の（Ｅ）および（Ｆ）は、他の補助刺激分子であるＣＤ８６、およびＣＤ４０の発現増強を確認した結果である。
【0231】
モニターした領域において、ＣＤ８０ＰＥの蛍光強度がＬＰＳ量に依存して増大した（図６（Ｂ）〜（Ｄ））。また、他の補助刺激分子であるＣＤ８６やＣＤ４０も同様に増強された（図６（Ｅ）、（Ｆ））。以上から本評価系により、自然免疫を活性化する刺激の強さが評価可能であることを確認した。
【0232】
次に、ＭＰＬの含有量を適宜変更し、アジュバント組成物による、自然免疫を活性化する刺激の評価を行った。得られた結果を図７に示す。アジュバント組成物の両親媒性物質はＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物は１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸とした。また、比較試料としては、ＰＢＳ、ｐＨ感受性担体（ＤＬＰＣ−デオキシコール酸）の分散液、リポ多糖（ＬＰＳ）の溶液を用いた。
【0233】
図７の（Ａ）は、ＣＤ８０の産生増強を評価した結果であり、（Ｂ）および（Ｃ）は、他の指標であるＣＤ８６、ＣＤ４０の発現増強を評価した結果である。ＭＰＬを含まないＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体は、０．１μＬと１０μＬの、いずれの添加量においてもＰＢＳ単独と同等の蛍光強度であり、自然免疫を活性化する刺激は認められなかった（図７（Ａ））。一方、ＭＰＬ含率を増大させた場合、得られる蛍光強度は増大し、自然免疫を活性化する刺激も増大する傾向であることが明らかとなった（図７（Ａ））。この際、ＭＰＬ含率が、０．００２２７の場合、ＭＦＩ（蛍光強度）の値は、４１．６であり、ＰＢＳ単独のＭＦＩ（３９．１）およびＭＰＬ含率がゼロの場合（ｐＨ感受性担体）のＭＦＩ（３８．８）よりも大きい値となった。また、ＭＰＬ含率が、２．２７である場合および２２．７である場合のＭＦＩの値を対比すると、それぞれ６９．１および７０．９であり、自然免疫を活性化する刺激に若干の飽和が見られた（図７（Ａ）値は添加量１０μＬのもの）。
【0234】
なお、他の共刺激分子であるＣＤ４０やＣＤ８６の産生増強も確認されたことから、これらのアジュバント組成物は確かに自然免疫を活性化する刺激を有していることが確認された（図７（Ｂ）、（Ｃ））。
【0235】
（６）細胞性免疫の増強と自然免疫の活性化について
ここで、細胞性免疫の増強と自然免疫の活性化について、相関を検証した。
【0236】
まず、（１）において、ＣＴＬの誘導に至らなかった、ＭＰＬを含まないＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体は、（５）において、自然免疫を活性化する刺激は認められなかった。図８（Ａ）は、さらに詳細を調べた結果である。ＭＰＬを含まないＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体を０．５μＬから５０μＬで添加した場合においても、ＣＤ８０ＰＥの蛍光強度はＰＢＳのそれから増加せず、ＭＰＬを含まないＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体は、自然免疫を活性化する刺激を有していないことが明らかとなった（図８（Ａ））。
【0237】
一方、（２）においてＣＴＬ誘導増強効果を示したアジュバント組成物のＭＰＬ含率は０．２２７であり、（５）において、確かに自然免疫を活性化する刺激が認められている。以上より、細胞性免疫の増強と、自然免疫の活性化は相関していると考えられる。
【0238】
なお、図８（Ｂ）は、種々のサンプルにおいて、培養したマウス脾臓細胞に５μＬの溶液を添加し、ＣＤ８０の産生増強（自然免疫の活性化）を調べた結果である。ペプチドおよびＯＶＡ溶液は８００μｇ／ｍＬ、ＤＬＰＣ単独は１０００ｎｍｏｌ／ｍＬ、デオキシコール酸単独は１６００ｎｍｏｌ／ｍＬの溶液を使用した結果である。
【0239】
ペプチド単独、ＯＶＡ単独、ＤＬＰＣ単独、およびデオキシコール酸単独を添加した場合、ＣＤ８０ＰＥの蛍光強度は、ＰＢＳを添加した場合と変わらず、自然免疫を活性化する刺激は認められなかった（図８（Ｂ））。
【0240】
（７）膜破壊機能促進効果に及ぼす影響
（７−１）ＭＰＬの影響
アジュバント組成物の膜破壊機能促進効果に及ぼすＭＰＬ含有の影響を調べた。結果を図９に示す。図９の（Ａ）は、ＭＰＬ含率０．２２７に相当する量のＭＰＬを、溶出性試験の評価系に投与した場合の溶出率であり、（Ｂ）はＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の各ｐＨにおける溶出率であり、（Ｃ）は、ＭＰＬ含率を変化させた場合のＤＬＰＣ―デオキシコール酸複合体のｐＨ７．４とｐＨ５．０における溶出率である。
【0241】
ＭＰＬを、ＰＢＳあるいはＤＭＳＯに分散させてセル中に添加し、低ｐＨにおける溶出率の増大を調べたところ、いずれの場合においても、ＰＢＳ単独と同等であった。（図９（Ａ））。ＭＰＬは溶出を引き起こす性質を有していないことが示された。
【0242】
次に、ＭＰＬを種々の割合でｐＨ感受性担体に含有させて、アジュバント組成物とし、種々のｐＨにおける溶出率を調べた。ＭＰＬ含率が、０．２２７や、２．２７である場合であっても、各ｐＨにおける溶出率は、通常のｐＨ感受性担体（ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体）と一致する値を示した（図９（Ｂ））。したがって、膜破壊機能促進効果を発現するｐＨに対して、ＭＰＬ含有の影響は小さいことが示された。また、ｐＨ５．０の溶出率をモニターし、広範囲のＭＰＬ含率の影響を調べたところ、ＭＰＬ含率が２２．７においても、溶出率は通常のｐＨ感受性担体（ＭＰＬ含有割合＝０）と変化がなかった（図９（Ｃ））。膜破壊機能促進効果に及ぼすＭＰＬ含有の影響は小さいことが改めて確認された。含有されるＭＰＬが、ｐＨ感受性担体の両親媒性物質に対して少量であるため、ＭＰＬによる膜破壊機能促進効果に及ぼす影響は少ないものと考えられる。
【0243】
（７−２）調製方法の影響
抗原とアジュバント組成物からなる、ワクチン組成物において、膜破壊機能促進効果に及ぼす、調製方法の影響を調べた。図１０は、分散調製法、混合調製法、凍結溶融−凍結乾燥法により調製したワクチン組成物におけるｐＨ７．４とｐＨ５．０の溶出率である。なお、ワクチン組成物の両親媒性物質はＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物はデオキシコール酸を使用した。ＭＰＬ含率は０．２２７であり、複合化量は１６０ｎｍｏｌである。１５μｇのペプチドを使用した。
【0244】
いずれの調製方法によるワクチン組成物においても、ｐＨ７．４とｐＨ５．０における溶出率は同様の値を示したことから、ワクチン組成物の調製方法の相違は、膜破壊機能促進効果に影響を及ぼさないことを確認した（図１０）。
【0245】
（７−３）ｐＨ感受性化合物の複合化量の影響
図１１は、アジュバント組成物の膜破壊機能促進効果に及ぼす、ＭＰＬ含有の影響を、種々のデオキシコール酸複合化量において調べた結果である。アジュバント組成物の両親媒性物質はＤＬＰＣとし、デオキシコール酸の複合化量は（Ａ）１０、（Ｂ）２０、（Ｃ）６４０ｎｍｏｌである。ＭＰＬ含率は、０．０２２７および２２．７のものを使用した。比較試料としては、ＤＬＰＣ単独、デオキシコール酸単独、ｐＨ感受性担体（ＭＰＬ不含）を用いた。溶出率は、ｐＨ７．４とｐＨ５．０の条件で測定した。
【0246】
まず、ＭＰＬを含まないアジュバント組成物（ｐＨ感受性担体、図中：ＭＰＬ不含）は、いずれの複合化量においても、膜破壊機能促進効果を発現した（図１１（Ａ）〜（Ｃ））。次に、ＭＰＬ含率が０．０２２７および２２．７であるアジュバント組成物の溶出率は、ｐＨ７．４およびｐＨ５．０の双方において、ＭＰＬを含まないアジュバント組成物の溶出率と同様の値を示しており、同程度の膜破壊機能促進効果を有していた（図１１（Ａ））。また、同様の結果は、複合化量が２０および６４０のアジュバント組成物においても確認された（図１１（Ｂ）、（Ｃ））。これらの結果は、いずれの複合化量のアジュバント組成物においても、ＭＰＬの含有は膜破壊機能促進効果に影響を及ぼさないことを示している。
【0247】
ｐＨ感受性化合物の複合化量の相違により、ＭＰＬの含有による膜破壊機能促進効果への影響はないことを確認した（図１１）。
【0248】
（７−４）両親媒性物質またはｐＨ感受性化合物の種類による影響
アジュバント組成物の膜破壊機能促進効果に及ぼす、両親媒性物質およびｐＨ感受性化合物の種類の影響を調べた。
【0249】
表１および表２に、それぞれ、種々の両親媒性物質を用いて調製したアジュバント組成物の膜破壊機能促進効果と、種々のｐＨ感受性化合物を用いて調製したアジュバント組成物の膜破壊機能促進効果を評価した結果を示す。
【0250】
【表1】
【0251】
【表2】
【0252】
まず、いずれの両親媒性物質やｐＨ感受性化合物においても、調製したｐＨ感受性担体（表中、ＭＰＬ：０）は、膜破壊機能促進効果を発現した（表１、表２）。次に、ＭＰＬを含むアジュバント組成物（表中、ＭＰＬ：０．２２７）は、いずれの両親媒性物質やｐＨ感受性化合物を用いて調製した場合においても、ｐＨ７．４とｐＨ５．０の双方において、ＭＰＬを含まないアジュバント組成物、すなわちｐＨ感受性担体と同様の溶出率となり、同様に膜破壊機能促進効果を有していた（表１、表２）。これらの結果は、いずれの両親媒性物質や、いずれのｐＨ感受性化合物を用いて調製したアジュバント組成物においても、ＭＰＬの含有は膜破壊機能促進効果に影響を及ぼさないことを示している。
【0253】
両親媒性物質またはｐＨ感受性化合物の種類の相違は、ＭＰＬの含有による膜破壊機能促進効果への影響に対して、無関係であることを確認した。
【0254】
以上の（７−１）〜（７−４）の結果から、調製方法、複合化量、両親媒性物質、ｐＨ感受性化合物、の要因において、いずれの設定においても、アジュバント組成物は膜破壊機能促進効果を有すると考えられる。
【0255】
（８）膜融合促進効果に及ぼす影響
図１２は、アジュバント組成物の膜融合促進効果に及ぼす、ＭＰＬ含有の影響を調べた結果である。両親媒性物質はＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物は１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸とした。また、ＭＰＬ含率は０〜０．２２７とし、アジュバント組成物は、分散調製法により調製した。図１２の結果からも明らかなように、ＭＰＬの含有による膜融合促進機能に及ぼす影響はないことを確認した。
【0256】
（９）自然免疫を活性化する刺激への影響
（９−１）抗原量の影響
抗原とアジュバント組成物からなる、ワクチン組成物において、自然免疫を活性化する刺激の強さに及ぼす、抗原量の影響を調べた。なお、両親媒性物質はＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物は１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸を使用した。ＭＰＬ含率は、０．０２２７（以下、単に「低ＭＰＬ」とも称する）および２２．７（以下、単に「高ＭＰＬ」とも称する）の２種のアジュバント組成物を用い、ワクチン組成物は、分散調製法により調製した。
【0257】
結果を図１３に示す。図１３の（Ａ）は、種々の量のペプチドを含むワクチン組成物を、培養したマウス脾臓細胞に添加した場合のＣＤ８０ＰＥの蛍光強度であり、（Ｂ）は、種々の量のＯＶＡタンパク質（以下、単に「ＯＶＡ」とも称する）を含むワクチン組成物を、添加した場合のＣＤ８０ＰＥの蛍光強度である。
【0258】
低ＭＰＬおよび高ＭＰＬの双方において、ＣＤ８０ＰＥの蛍光強度はペプチド量、およびＯＶＡ量に依存せず一定の値となった（図１３（Ａ），（Ｂ））。すなわち、抗原量は、自然免疫を活性化する刺激の強さに影響を及ぼさないことが示された。
【0259】
（９−２）両親媒性物質の種類による影響
アジュバント組成物の自然免役を活性化する刺激に対する、両親媒性物質の影響を調べた。表３、図１４に、種々の両親媒性物質を用いて調製したアジュバント組成物の結果を示す。ｐＨ感受性化合物は１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸とし、ＭＰＬ含率は０．０２２７〜２２．７とした。調製方法は分散調製法である。
【0260】
【表3】
【0261】
いずれの両親媒性物質を用いた場合においても、両親媒性物質単独に比べて、アジュバント組成物は、高いＣＤ８０ＰＥの蛍光強度となり、自然免疫を活性化する刺激が付加された（表３、図１４）。この結果は、いずれの両親媒性物質を用いても、アジュバント組成物として機能することを示唆している。
【0262】
（９−３）ｐＨ感受性化合物の複合化量による影響
図１５は、アジュバント組成物、およびワクチン組成物の自然免疫を活性化する刺激の強さに及ぼす、ｐＨ感受性化合物の複合化の影響を調べた結果である。両親媒性物質はＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物はデオキシコール酸とした。ＭＰＬ含率は０．０２２７と、２２７とし、抗原は０μｇ（アジュバント組成物）と４００μｇ（ワクチン組成物）とした。調製方法は、いずれも分散調製法である。なお、評価は、５μＬの分散液を用いて実施した。
【0263】
図１５の（Ａ）は、ＭＰＬ含率が０．０２２７において、ＤＬＰＣに種々の量のデオキシコール酸を複合化させた場合の、ＣＤ８０ＰＥの蛍光強度であり、（Ｂ）は、ＭＰＬ含率が２２．７において、ＤＬＰＣに種々の量のデオキシコール酸を複合化させた場合の、ＣＤ８０ＰＥの蛍光強度である。
【0264】
ＭＰＬ含率０．０２２７、および２２．７の双方の場合において、ＣＤ８０ＰＥの蛍光強度は、デオキシコール酸の複合化、および複合化量に関わらず、一定の値となった。すなわち、デオキシコール酸の複合化は、アジュバント組成物、およびワクチン組成物の自然免疫を活性化する刺激の強さに影響を及ぼさないことが示された（図１５（Ａ）、（Ｂ））。
【0265】
（９−４）ｐＨ感受性化合物の種類による影響
図１６は、ワクチン組成物の自然免疫を活性化する刺激の強さに及ぼす、ｐＨ感受性化合物の種類の影響を調べた結果である。図１６の（Ａ）および（Ｂ）は、種々のｐＨ感受性化合物を用いて調製したワクチン組成物を、培養したマウス脾臓細胞に添加した場合における、ＣＤ８０の蛍光強度である。両親媒性物質はＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物の複合化量は１６０ｎｍｏｌとした。ＭＰＬ含率は０．０２２７〜２２．７とし、抗原は４００μｇのペプチドとした。調製法は混合調製法である。
【0266】
いずれのｐＨ感受性化合物においてもＣＤ８０ＰＥの蛍光強度は、抗原とＰＢＳ（図中、ＰＢＳ単独）よりも大きく、自然免疫を活性化する刺激が付加された。すなわち、ｐＨ感受性化合物の種類は、自然免疫を活性化する刺激の強さに影響を及ぼさないことが明らかとなった（図１６（Ａ）、（Ｂ））。
【0267】
以上の（９−１）〜（９−４）の結果から、抗原量、両親媒性物質、複合化量、ｐＨ感受性化合物の要因において、いずれの設定においても、アジュバント組成物として機能すると考えられる。
【0268】
（１０）免疫応答誘導の検証
（１０−１）ＭＰＬ量の影響
ＭＰＬ含率０．０２２７（低ＭＰＬ）、および２２．７（高ＭＰＬ）において、アジュバント組成物のＣＴＬ誘導増強効果を検証した。両親媒性物質はＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物は１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸とした。抗原は１匹あたり３．２μｇから４００μｇのＯＶＡペプチドとし、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの背部皮下に１回投与した。調製法は、分散調製法であり、各群ｎ＝３とした。下記表４に結果を示す。なお、ＭＰＬ単独は、抗原とＭＰＬ分散液を用いた場合の結果である。
【0269】
【表4】
【0270】
同一の抗原量の結果を比較した場合、双方のＭＰＬ含率において、アジュバント組成物を用いた場合は、ＭＰＬ単独を用いた場合よりも高いＣＴＬ誘導率となった（表４）。前記の条件において、アジュバント組成物のＣＴＬ誘導増強効果が示された。また、図１７に、ワクチン組成物を用いた場合の、ＥＬＩｓｐｏｔ法の評価結果を示す。用いた抗原は、８０μｇのＯＶＡであり、図１７の（Ａ）は、高ＭＰＬの条件において、ペプチドとＭＰＬ分散液（ＭＰＬ単独）を用いた場合のＳｐｏｔ形成の様子であり、（Ｂ）は、高ＭＰＬの条件において、ペプチドとアジュバント組成物を用いた場合（ワクチン組成物）のＳｐｏｔ形成の様子である。なお、評価条件は、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。
【0271】
ＥＬＩｓｐｏｔ法の評価においても、アジュバント組成物を用いた場合は、ＭＰＬ単独と比較して、多数のＩＦＮγのｓｐｏｔを誘導しており、前記結果を支持している（図１７（Ａ）、（Ｂ））。
【0272】
（１０−２）ｐＨ感受性化合物の複合化量の影響について
アジュバント組成物のＣＴＬ誘導増強効果に及ぼす、ｐＨ感受性化合物の複合化量の影響を調べた。具体的には、ＤＬＰＣに種々の量のデオキシコール酸を複合化させてアジュバント組成物を調製し、ＣＴＬ誘導増強効果を検証した。ＭＰＬ含率は０．２２７とし、８０μｇのペプチド、あるいは８０μｇのＯＶＡを抗原としてＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスに投与した。分散調製法により調製し、各群ｎ＝１とした。結果を表５に示す。
【0273】
【表5】
【0274】
ペプチド、およびＯＶＡの双方において、アジュバント組成物を用いた場合のＣＴＬ誘導率は、いずれの複合化量においてもＭＰＬ単独（抗原とＭＰＬ分散液）に比べて高い値を示した（表５）。１００ｎｍｏｌの両親媒性物質に対して、１０〜６４０ｎｍｏｌのｐＨ感受性化合物において、ＣＴＬ誘導増強効果が得られることが示された。
【0275】
（１０−３）両親媒性物質またはｐＨ感受性化合物の種類による影響
続いて、アジュバント組成物のＣＴＬ誘導増強効果に及ぼす、両親媒性物質およびｐＨ感受性化合物の種類の影響を調べた。具体的には、種々の両親媒性物質またはｐＨ感受性化合物を用いてアジュバント組成物を調製し、ＣＴＬ誘導増強効果の有無を検証した。
【0276】
この際、ＭＰＬ含率は０．２２７とし、８０μｇのＯＶＡを抗原とした。ｐＨ感受性化合物の複合化量は１６０ｎｍｏｌとし、分散調製法により調製した。各群ｎ＝１である。
【0277】
表６に、種々の両親媒性物質を用いて調製した場合の結果を示し、表７に、種々のｐＨ感受性化合物を用いて調製したアジュバントの結果を示す。
【0278】
【表6】
【0279】
【表7】
【0280】
いずれの両親媒性物質、およびいずれのｐＨ感受性化合物を用いて調製した場合においても、アジュバント組成物を用いた場合のＣＴＬ誘導率は、ＭＰＬ単独のそれよりも高い値を示しており、アジュバント組成物のＣＴＬ誘導増強効果が確認された（表６、表７）。
【0281】
また、図１８に、種々のｐＨ感受性化合物を用いて調製したワクチン組成物における、ＥＬＩｓｐｏｔ法の評価結果を示す。評価条件は２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌであり、用いた抗原は８０μｇのＯＶＡである。ＭＰＬ含率は０．２２７であり、自然免疫を刺激する物質、あるいはアジュバント組成物として、図１８の（Ａ）は、ＭＰＬ分散液を用いた場合のＳｐｏｔ形成の様子であり、（Ｂ）は、ＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸を用いた場合のＳｐｏｔ形成の様子であり、（Ｃ）は、ＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−コール酸を用いた場合のＳｐｏｔ形成の様子であり、（Ｄ）は、ＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−ウルソデオキシコール酸を用いた場合のＳｐｏｔ形成の様子であり、（Ｅ）は、ＭＰＬ含有ＤＬＰＣ−ヒオデオキシコール酸を用いた場合のＳｐｏｔ形成の様子である。
【0282】
いずれのｐＨ感受性化合物を用いて調製したアジュバント組成物においても、ＭＰＬ単独の場合と比較して、多数のＩＦＮγのｓｐｏｔを誘導しており、アジュバント組成物は、いずれのｐＨ感受性化合物を用いて調製した場合においても、ＣＴＬ誘導増強効果を有することが示された図１８（Ａ）〜（Ｅ））。これらの結果は、ＩＣＳ法における結果と一致している。
【0283】
（１１）調製方法について
タンパク質を用いた場合における、ワクチン組成物の調製方法の相違が与える影響について調べた。図１９は、各調製方法で調製したワクチン組成物のＣＴＬ誘導率を示すグラフである。ワクチン組成物は、分散調製法、混合調製法、凍結融解−凍結乾燥調製法により調製し、両親媒性物質はＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物は１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸とした。ＭＰＬ含率は０．０２２７〜２２．７とし、抗原は８０μｇのＯＶＡを投与した。各群はｎ＝１である。
【0284】
図１９からも明らかなように、いずれの調製方法においてもワクチン組成物は、ＭＰＬ単独よりも高いＣＴＬ誘導率を示した。また、凍結融解−凍結乾燥調製法は、高いＣＴＬ誘導率を示した。これらの結果は、どのようなワクチン組成物の調製方法においても、アジュバント組成物はＣＴＬ誘導増強効果を有していることを示している（図１９）。抗原としてタンパク質を用いた場合においても、凍結融解−凍結乾燥調製法により調製されたワクチン組成物は、他の調製方法と比較して、高いＣＴＬ誘導率を示した（図１９）。
【0285】
（１２）抗原特異性について
ワクチン組成物により誘導されたＣＴＬが抗原特異性を有するかどうかを確認した。具体的には、マウスから摘出した脾臓細胞の懸濁液に、抗原であるＯＶＡペプチドを添加した場合（再刺激あり）と、ＯＶＡペプチドを添加することなく、メディウムのみで培養した場合（再刺激なし）におけるＣＴＬ誘導率を比較した。ワクチン組成物の両親媒性物質はＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物は１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸とした。ＭＰＬ含率は２２．７であり、８０μｇのＯＶＡをＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスに投与した。ワクチン組成物の分散液は、混合調製法により調製した。各群ｎ＝１とした。
【0286】
得られた結果を図２０に示す。図２０の（Ａ）は再刺激ありの場合のＣＴＬ誘導率であり、（Ｂ）は再刺激なしの場合のＣＴＬ誘導率である。再刺激ありの場合におけるＣＴＬ誘導率は１．０８％であり、ＣＴＬの誘導が確認された。一方、再刺激なしの場合におけるＣＴＬ誘導率は０．３１％であり、抗原の再刺激を加えた場合と対比して、小さな値となった（図２０）。同様の結果は、種々のｐＨ感受性化合物を用いた場合においても確認されている（表７）。これらの結果は、ワクチン組成物により誘導されたＣＴＬは、抗原特異的であることを示している。
【0287】
さらに、ＥＬＩｓｐｏｔ法においても抗原特異性の確認を行った。ワクチン組成物の両親媒性物質はＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物は１６０ｎｍｏｌおよび６４０ｎｍｏｌのデオキシコール酸とした。ＭＰＬ含率は０．２２７であり、８０μｇのＯＶＡあるいは８０μｇのペプチドをＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスに投与した。ワクチン組成物の分散液は、分散調製法により調製した。評価条件は２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。
【0288】
得られた結果を図２１に示す。図２１の（Ａ）〜（Ｆ）は、抗原であるＯＶＡペプチドを添加して培養した場合（再刺激あり）のｓｐｏｔ形成の様子であり、（Ｇ）〜（Ｌ）は、メディウムのみで培養した場合（再刺激なし）のｓｐｏｔ形成の様子である。ワクチン組成物を用いた場合のｓｐｏｔ形成は、再刺激を加えた場合に比べて、再刺激を加えない場合に顕著に少ないものとなっており、ワクチン組成物により誘導されたＣＴＬは、抗原特異的であることを示している（図２１）。ＥＬＩｓｐｏｔ法においても、ＩＣＳ法と同様の結論を示す結果が得られた。
【0289】
（１３）液性免疫の増強について
ワクチン組成物による液性免疫の誘導、およびアジュバント組成物の液性免疫誘導増強効果を検証した。具体的には、種々の調製法に従って調製したワクチン組成物を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの背部皮下に２回投与し、血中のＩｇＧ抗体価を測定した。両親媒性物質はＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物は１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸とした。ＭＰＬ含率は０．２２７であり、抗原は８０μｇのＯＶＡとした。比較としては、抗原を投与しない未処置群と、抗原を含むＭＰＬ単独群を設けた。各群ｎ＝３とした。
【0290】
得られた結果を図２２に示す。分散調製法、混合調製法、および凍結融解−凍結乾燥調製法のいずれの調製法においても、ワクチン組成物は未処置群と比較して、高いＩｇＧ抗体価を示したことから、ワクチン組成物によって液性免疫が誘導されることが明らかとなった（図２２）。
【0291】
また、いずれの調製方法のワクチン組成物（抗原とアジュバント組成物）においても、抗体価の値は、ＭＰＬ単独群（抗原とＭＰＬ分散液）と比較して高い値を示した（図２２）。アジュバント組成物を用いた場合は、ＭＰＬを単独で用いた場合と比較して、高い抗体価を示したことから、アジュバント組成物は液性免疫誘導増強効果を有していることが示された（図２２）。
【0292】
（１４）ＣｐＧ−ＤＮＡを含むアジュバント組成物について
ＭＰＬ以外の自然免疫を活性化する物質として、ＣｐＧ−ＤＮＡ（ＣｐＧ−ＯＤＮ）を用いた場合における、アジュバント組成物のＣＴＬ誘導増強効果を検証した。具体的には、１匹あたり５μｇのＣｐＧ−ＯＤＮと、ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体を混合し、アジュバント組成物とし、さらに８０μｇのＯＶＡを混合することで、ワクチン組成物とした。デオキシコール酸は１６０ｎｍｏｌとし、ワクチン組成物の全量は１００μＬとした。各群１匹とし、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスに投与した。ＥＬＩｓｐｏｔ法における評価条件は２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。
【0293】
表８は、抗原の再刺激を加えた場合と、再刺激を加えなかった場合における、ＣＴＬ誘導率であり、抗原とＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣｐＧ−ＯＤＮ単独）、または抗原と、ＣｐＧ−ＯＤＮを含むアジュバント組成物（ワクチン組成物）を投与に用いた場合の結果である。ＣｐＧ−ＯＤＮを含むアジュバント組成物を用いた場合のＣＴＬ誘導率は、ＣｐＧ−ＯＤＮ単独の場合に比べて高い値を示した（表８）。ＭＰＬ以外の自然免疫を活性化する物質を用いた場合によっても、アジュバント組成物はＣＴＬ誘導増強効果を有することが示された。また、再刺激を加えなかった場合のＣＴＬ誘導率は、再刺激を加えた場合に比べて、小さな値となったことから、ＣｐＧ−ＯＤＮを含むワクチン組成物により誘導されたＣＴＬは、ＭＰＬの場合と同様に、抗原特異的であることが明らかとなった（表８）。これらと同様の結果は、ＥＬＩｓｐｏｔ法の評価においても得られた（図２３）。
【0294】
なお、図２３において、（Ａ）は、８０μｇのＯＶＡとＣｐＧ−ＯＤＮ単独をマウスに投与した場合のｓｐｏｔ形成の様子であり、（Ｂ）は８０μｇのＯＶＡと、ＣｐＧ−ＯＤＮを含むアジュバント組成物を用いた場合のｓｐｏｔ形成の様子であり、（Ｃ）は抗原の再刺激を加えなかった場合における、８０μｇのＯＶＡとＣｐＧ−ＯＤＮ単独をマウスに投与した場合のｓｐｏｔ形成の様子であり、（Ｄ）は、抗原の再刺激を加えなかった場合における、８０μｇのＯＶＡと、ＣｐＧ−ＯＤＮを含むアジュバント組成物を用いた場合のｓｐｏｔ形成の様子である。
【0295】
【表8】
【0296】
本出願は、２０１３年１１月２９日に出願された日本特許出願番号２０１３−２４８５４３号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として、組み入れられている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
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