特許 6490660 活性に基づくプローブの化合物、組成物、および使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6490660

(24)【登録日】2019年3月8日

(45)【発行日】2019年3月27日

(54)【発明の名称】活性に基づくプローブの化合物、組成物、および使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07D 409/14 20060101AFI20190318BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20190318BHJP

   C07K 5/06 20060101ALI20190318BHJP

   C12Q 1/37 20060101ALI20190318BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20190318BHJP

【ＦＩ】

   C07D409/14CSP

   A61K49/00

   C07K5/06

   C12Q1/37

   G01N21/64 F

【請求項の数】22

【全頁数】50

(21)【出願番号】特願2016-503301(P2016-503301)

(86)(22)【出願日】2014年3月15日

(65)【公表番号】特表2016-518341(P2016-518341A)

(43)【公表日】2016年6月23日

(86)【国際出願番号】US2014029990

(87)【国際公開番号】WO2014145257

(87)【国際公開日】20140918

【審査請求日】2017年3月14日

(31)【優先権主張番号】61/794,296

(32)【優先日】2013年3月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ボギョー， マシュー エス．

(72)【発明者】

【氏名】フェルドウス， マルテイン

【審査官】 東 裕子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／１１８７１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／１２４２６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０２１８００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開昭６３−２５３０６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５１９４０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 VERDOES，CHEMISTRY AND BIOLOGY，２０１２年，V19 N5，P619-628

【文献】 Brak K. et al.，Journal of Medicinal Chemistry ，２０１０年，53(4)，1763-1773，NIH Public Access, Author Manuscript

【文献】 DEU，CHEMISTRY AND BIOLOGY，２０１０年，V17 N8，P808-819

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）

【化101】

（式中、
Ｄ−Ｔ−が、

【化103】

（式中、Ｄは、蛍光標識であり、
Ｌ_１はリンカーであり、
ＡＡ_１はアミノ酸側鎖であり、
ＵはＯ、ＮまたはＳであり、
Ｒ_１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキルまたは保護基であり、必要に応じて１〜３個のＡ基で置換され、
各Ａは独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルカノイル、アルキルアミノ、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、アラルカノイル、アラルクアミノ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルコキシ、ヘテロアラルカノイル、ヘテロアラルクアミノ、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルコキシ、シクロアルカノイル、シクロアルカミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルコキシ、ヘテロシクリルアルカノイル、ヘテロシクリルアルカミノ、ヒドロキシル、チオ、アミノ、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、アルキルカルボキシ、カーボネート、カルバメート、グアニジニル、ウレア、ハロ、トリハロメチル、シアノ、ニトロ、ホスホリル、スルホニル、スルホンアミドまたはアジドである）であり、
Ｌは、Ｌ_２−Ｌ_３−Ｑであり、
Ｌ_２がフェノキシ基であり、
Ｌ_３がリンカーであり、
Ｑがクエンチャーである）
を有するプロテアーゼを標識化することにおける使用のための化合物。

【請求項2】

Ｌ_１が必要に応じて置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子が必要に応じてヘテロ原子で置き換えられる、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

ＡＡ_１が、必要に応じて１〜３個のＡ基で置換される、アラルキルアミノ酸側鎖である、請求項１に記載の化合物。

【請求項4】

ＵがＯである、請求項１に記載の化合物。

【請求項5】

前記蛍光標識が、フルオレセイン、オレゴングリーン、ボラ−ジアザ−インデセン、ローダミンまたはシアニン標識である、請求項１に記載の化合物。

【請求項6】

前記蛍光標識がシアニン標識である、請求項５に記載の化合物。

【請求項7】

前記シアニン標識が、Ｃｙ５である、請求項６に記載の化合物。

【請求項8】

Ｌが

【化104】

であり、式中各Ｙが独立して電子求引基または水素である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項9】

各Ｙが独立して、ハロゲンまたは水素である、請求項８に記載の化合物。

【請求項10】

Ｌが

【化105】

であり、Ｌ_３が必要に応じて置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子が必要に応じてヘテロ原子に置き換えられる、請求項９に記載の化合物。

【請求項11】

Ｌが、

【化106】

であり、
ＲがＱＳＹクエンチャーであり、
ｎが１〜１６の整数である、請求項１０に記載の化合物。

【請求項12】

前記ＱＳＹクエンチャーが、親水性ＱＳＹクエンチャーである、請求項１１に記載の化合物。

【請求項13】

前記親水性ＱＳＹクエンチャーが、スルホ−ＱＳＹクエンチャーである、請求項１２に記載の化合物。

【請求項14】

式（ＩＩ）

【化107】

を有する、請求項１に記載の化合物。

【請求項15】

式（ＩＩＩ）

【化108】

（式中、ＲはＱＳＹクエンチャーであり、
Ｄはシアニン色素であり、
ｍおよびｎは独立して、１〜１６の整数である）
を有する請求項１４に記載の化合物。

【請求項16】

ＲがＱＳＹ２１またはスルホ−ＱＳＹ２１であり、ＤがＣｙ５である、請求項１５に記載の化合物。

【請求項17】

以下の化合物

【化109】

（式中、Ｒ＝ＱＳＹ２１およびｎ＝６、
Ｒ＝スルホ−ＱＳＹ２１およびｎ＝６、
Ｒ＝ＱＳＹ２１およびｎ＝２および
Ｒ＝スルホ−ＱＳＹ２１およびｎ＝２）の１つから選択される、請求項１６に記載の化合物。

【請求項18】

請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物と、薬学的に許容され得る担体と、を含む、動物中のプロテアーゼを標識化することにおける使用のための組成物。

【請求項19】

請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物を含む、動物内のプロテアーゼを標識するための組成物。

【請求項20】

請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物を含む、動物内の腫瘍を可視化するための組成物であって、カセプシンシステインプロテアーゼとの化合物の反応から、前記動物中で発生した検出可能シグナルが測定され、前記検出可能シグナルが、前記動物内の腫瘍に関連する、組成物。

【請求項21】

前記検出可能シグナルが蛍光シグナルである、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記蛍光シグナルが、腫瘍マージンにて発生する、請求項２１に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７９４，２９６号の利益を請求し、その開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
政府支援の声明
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されれプロジェクト番号５Ｒ０１ＥＢ００５０１１の下、政府支援によりなされた。政府は、本発明の特定の権利を有する。

【背景技術】

【0002】

本発明の背景
種々の技術が、分子イメージングおよび疾患モニタリングの領域での利用のために現在開発されている。とりわけ、光学蛍光イメージングが、その感度、特異性および非侵襲性を考慮して、臨床ツールとして将来性を示しはじめているアプローチである。蛍光光学プローブの特異性は、場合によって、それらの生物学的標的によって提供され得る。例えば、生物学的試料中の酵素標的によって認識される光学プローブはしばしば、プローブの蛍光が、酵素反応に際して抑制が効かなくなる場合のみに、極めて特異的なシグナルを産する。理想的に、蛍光シグナルが、酵素反応によって活性化された後でさえ、プローブの蛍光部分がその酵素標的と結合したままである。そのような蛍光活性に基づくプローブ（ＡＢＰｓ）が、プロテアーゼ標的に対して記述されてきた。Ｂｌｕｍら、（２００９）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４：ｅ６３７４；ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００６３７４。ＡＢＰｓは、酵素の活性部位触媒残基とのＡＢＰの反応からもたらされる永久共有結合によって、単純な蛍光性基質から区別可能である。蛍光基質が、それらの標的酵素による、触媒ターンオーバーからもたらされるシグナル増幅のために有利であるとみられ得るが、ＡＰＢｓは、標的酵素のそれらの共有改変のために、組織取込の増加した速度と、標的組織中のプローブの保持の延長を提示することがわかった。

【0003】

蛍光に基づく光学プローブとの利用のための対象の標的酵素は、プロテアーゼ、とりわけシステインプロテアーゼである。システインカセプシンは、健康および疾患にて重要な役割を果たすプロテアーゼの一ファミリーである。Ｒｅｉｓｅｒら、（２０１０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０：３４２１−３１。それらの機能が主に、エンドソーム経路に寄与しているとして記述されてきたけれども、それらがマトリックス分解の主要な調節物であるという証拠が蓄積されており、これは、細胞外文脈にてまた機能を有することを示唆している。Ｂｒｏｅｍｍｅ＆Ｗｉｌｓｏｎ（２０１１） Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｃａｔｈｅｐｓｉｎｓ ｉｎ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｖｏｌｕｍｅ ２ ２３−５１。加えて、システインカセプシンファミリーのメンバーは、種々の型のがんの発達および進行において主要なプレイヤーであると示されて来た。Ｍｏｈａｍｅｄ＆Ｓｌｏａｎｅ （２００６） Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ（２００６） ６：７６４−７５；Ｐａｌｅｒｍｏ＆Ｊｏｙｃｅ （２００８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２９：２２−８。さらに、カセプシン、システインの内因性阻害剤の発現における変化が、がんにおいて観察されてきた。Ｃｏｘ（２００９）Ｃｙｓｔａｔｉｎｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ． Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１４：４６３−７４。これらの観察は、細胞内および細胞外環境における潜在的変化と組み合わせて、野生型腫瘍微小環境の文脈において、これらのプロテアーゼの活性の直接の査定を許容するツールの重要性を強調する。システインカセプシンファミリーを標的とする種々のＡＢＰｓが合成されてきた。Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎら、（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１５：７９８−８０５。とりわけ、蛍光的にクエンチされたＡＢＰｓ（ｑＡＢＰｓ）が、がんの非侵襲性光学イメージングと、続く組織学的、細胞およびタンパク質レベル上の標的カセプシンの特性化のための強力なツールであると証明されてきた。Ｂｌｕｍら、（２００７）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：６６８−７７，Ｖｅｒｄｏｅｓら、（２０１２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９：６１９−２８。

【0004】

２，３，５，６−テトラフルオロフェノキシアリールメチルケトン反応性基に基づく、ジペプチジルペプチダーゼＩの活性に基づく阻害剤が報告されてきた（Ｄｅｕら、（２０１０）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１７：８０８−８１９）が、これらの阻害剤は、非ペプチド性であり、検出可能基を含まなかった。

【0005】

カセプシンのような活性プロテアーゼを含む、細胞の蛍光イメージングにて使用するためのクエンチされた活性に基づくペプチド性阻害剤もまた報告されてきた。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７２５号明細書を参照のこと。これらのプローブは、プロテアーゼ活性部位に結合するために、エステル結合アシロキシメチルケトン反応性基を使用する。場合によって、活性に基づく蛍光プローブは非ペプチド性である。例えば、国際公開第２０１２／１１８７１５号パンフレットを参照のこと。場合によっては、活性に基づくプローブは、それらの標的酵素を放射標識するために使用される。例えば国際公開第２００９／１２４２６５号パンフレットを参照のこと。
しかしながら、より高い細胞取込を有する、システインプロテアーゼ活性のより広いスペクトルを標的とする、および検出の増加感度を提案する、システインプロテアーゼの新規活性に基づく蛍光プローブに対する必要性が、本分野で残っている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００７／００３６７２５号明細書

【特許文献2】国際公開第２０１２／１１８７１５号

【特許文献3】国際公開第２００９／１２４２６５号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｂｌｕｍら、（２００９）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４：ｅ６３７４；ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００６３７４

【非特許文献2】Ｒｅｉｓｅｒら、（２０１０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０：３４２１−３１

【非特許文献3】Ｂｒｏｅｍｍｅ＆Ｗｉｌｓｏｎ（２０１１） Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｃａｔｈｅｐｓｉｎｓ ｉｎ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｖｏｌｕｍｅ ２ ２３−５１

【非特許文献4】Ｍｏｈａｍｅｄ＆Ｓｌｏａｎｅ （２００６） Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ（２００６） ６：７６４−７５

【非特許文献5】Ｐａｌｅｒｍｏ＆Ｊｏｙｃｅ （２００８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２９：２２−８

【非特許文献6】Ｃｏｘ（２００９）Ｃｙｓｔａｔｉｎｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ． Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１４：４６３−７４

【非特許文献7】Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎら、（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１５：７９８−８０５

【非特許文献8】Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：６６８−７７，Ｖｅｒｄｏｅｓら、（２０１２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９：６１９−２８

【非特許文献9】Ｄｅｕら、（２０１０）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１７：８０８−８１９

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、化合物、組成物、システインプロテアーゼを標識するための該化合物および組成物の利用方法を提供することによって、これらの、そして他の問題に取り組む。

【0009】

とりわけ、本発明の一様態にしたがって、構造式（Ｉ）

【化1】

（式中、
Ｌはエーテル結合脱離要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）であり、
Ｔは標的化要素であり、
Ｄは検出可能要素である）
によって表されるような化合物が提供される。

【0010】

本発明のいくつかの実施形態において、Ｄ基は蛍光標識、放射標識またはキレータである。

【0011】

特定の実施形態において、Ｄ基は、蛍光標識であり、とりわけフルオレセイン、オレゴングリーン、ボラ−ジアザ−インデセン、ローダミン、またはシアニン標識である。また特定の実施形態において、蛍光標識は、Ｃｙ５のようなシアニン標識である。

【0012】

本発明のいくつかの実施形態において、Ｔ基は、システインプロテアーゼへと化合物を標的化させる。特定の実施形態において、Ｔ基は、例えばトリアゾール構造を含む種々の特定の化合物を含む、トリアゾール構造を含む要素のような、非ペプチド性標的化要素である。特定の他の実施形態において、Ｔ基は、ペプチド性標的化要素である。

【0013】

いくつかの化合物実施形態において、Ｄ−Ｔ−基は、

【化2】

であり、
式中、Ｌ_１はリンカーであり、
ＡＡ_１はアミノ酸側鎖であり、
ＵはＯ、ＮまたはＳであり、
Ｒ_１はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキルまたは保護基であり、必要に応じて１〜３個のＡ基で置換され、
各Ａが独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルカノイル、アルキルアミノ、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、アラルカノイル、アラルクアミノ（ａｒａｌｋａｍｉｎｏ）、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルコキシ、ヘテロアラルカノイル、ヘテロアラルクアミノ、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルコキシ、シクロアルカノイル、シクロアルカミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルコキシ、ヘテロシクリルアルカノイル、ヘテロシクリルアルカミノ、ヒドロキシル、チオ、アミノ、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、アルキルカルボキシ、カーボネート、カルバメート、グアニジニル、ウレア、ハロ、トリハロメチル、シアノ、ニトロ、ホスホリル、スルホニル、スルホンアミドまたはアジドである。

【0014】

特定の化合物実施形態において、Ｌ_１は、必要に応じて置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子は必要に応じてヘテロ原子によって置き換えられる。

【0015】

他の特定の化合物実施形態において、ＡＡ_１は、必要に応じて１〜３個のＡ基で置換された、アラルキルアミノ酸側鎖である。

【0016】

また他の特定の化合物実施形態において、ＵはＯである。

【0017】

特定の実施形態において、Ｄ基は蛍光標識、放射標識またはキレータである。

【0018】

特定の実施形態において、Ｄ基は、蛍光標識であり、よりとりわけ、フルオレセイン、オレゴングリーン、ボラ−ジアザ−インデセン、ローダミンまたはシアニン標識である。より特定の実施形態において、蛍光標識は、Ｃｙ５のようなシアニン標識である。

【0019】

いくつかの化合物実施形態において、Ｌ基は、クエンチャーを含み、より特定の実施形態において、Ｌは、Ｌ_２−Ｌ_３−Ｑであり、式中Ｌ_２はフェノキシ基であり、Ｌ_３はリンカーであり、Ｑはクエンチャーである。

【0020】

特定の実施形態において、Ｌは、

【化3】

であり、式中各Ｙは独立して、電子求引基または水素である。

【0021】

より特定の実施形態において、各Ｙは独立して、ハロゲンまたは水素であり、より特定の実施形態において、Ｌは、

【化4】

であり、Ｌ３は必要に応じて置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子は必要に応じてヘテロ原子で置き換えられる。

【0022】

より特定の実施形態において、Ｌは

【化5】

であり、式中ＲはＱＳＹクエンチャーであり、ｎは１〜１６の整数である。

【0023】

好ましい実施形態において、ＱＳＹクエンチャーは、疎水性ＱＳＹクエンチャーであり、よりとりわけ、親水性ＱＳＹクエンチャーは、スルホ−ＱＳＹクエンチャーである。

【0024】

本発明のいくつかの実施形態において、構造式（ＩＩ）

【化6-1】

によって表されるような化合物が提供され、式中Ｄは蛍光標識であり、Ｌ_３はリンカーであり、Ｑはクエンチャーである。

【0025】

より特定の実施形態において、構造式（ＩＩＩ）

【化6-2】

によって表されるような化合物が提供され、式中ＲはＱＳＹクエンチャーであり、Ｄはシアニン色素であり、ｍおよびｎは独立して１〜１６の整数である。Ｒ基は、これらの実施形態のいくつかで、ＱＳＹ２１またはスルホ−ＱＳＹ２１であり得、Ｄ基はＣｙ５であり得る。

【0026】

本発明の特定の化合物実施形態には以下の

【化7】

が含まれ、
式中、Ｒ＝ＱＳＹ２１およびｎ＝６、
Ｒ＝スルホ−ＱＳＹ２１およびｎ＝６、
Ｒ＝ＱＳＹ２１およびｎ＝２および
Ｒ＝スルホ−ＱＳＹ２１およびｎ＝２。

【0027】

他の様態にしたがって、本発明は、本開示の化合物と薬学的に許容され得る担体と、を含む、動物におけるプロテアーゼを標識することにおける利用のための組成物を提供する。

【0028】

また他の様態にしたがって、本発明は、動物に本開示の組成物を投与する工程を含む、動物におけるプロテアーゼを標識化する方法を提供する。

【0029】

本発明はさらに、本開示の組成物を動物に投与することと、カセプシンシステインプロテアーゼとの組成物の反応から、該動物内に発生した検出可能シグナルを測定することと、を含む、動物中の腫瘍を可視化する方法を提供し、該検出可能シグナルが、動物内の腫瘍に関連する。

【0030】

特定の方法実施形態において、検出可能シグナルは、蛍光シグナルである。他の特定の方法実施形態において、蛍光シグナルは、腫瘍マージンにて産出される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
式（Ｉ）

【化101】

（式中、
Ｌはエーテル結合脱離要素であり、
Ｔは標的化要素であり、
Ｄは検出可能要素である）
を有するプロテアーゼを標識化することにおける使用のための化合物。
（項目２）
Ｄが蛍光標識、放射標識またはキレータである、項目１に記載の化合物。
（項目３）
Ｄが、蛍光標識である、項目２に記載の化合物。
（項目４）
前記蛍光標識がフルオレセイン、オレゴングリーン、ボラ−ジアザ−インデセン、ローダミンまたはシアニン標識である、項目３に記載の化合物。
（項目５）
前記蛍光標識が、シアニン標識である、項目４に記載の化合物。
（項目６）
前記シアニン標識が、Ｃｙ５である、項目５に記載の化合物。
（項目７）
Ｔが、システインプロテアーゼへと、化合物を標的化させる、項目１に記載の化合物。
（項目８）
Ｔが、非ペプチド性標的化要素である、項目１に記載の化合物。
（項目９）
前記非ペプチド性標的化要素が、トリアゾール構造を含む、項目８に記載の化合物。
（項目１０）
以下の化合物、

【化102】

の１つから選択される、項目９に記載の化合物。
（項目１１）
Ｔが、ペプチド性標的化要素である、項目１に記載の化合物。
（項目１２）
Ｄ−Ｔ−が、

【化103】

（式中、Ｌ_１はリンカーであり、
ＡＡ_１はアミノ酸側鎖であり、
ＵはＯ、ＮまたはＳであり、
Ｒ_１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキルまたは保護基であり、必要に応じて１〜３個のＡ基で置換され、
各Ａは独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルカノイル、アルキルアミノ、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、アラルカノイル、アラルクアミノ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルコキシ、ヘテロアラルカノイル、ヘテロアラルクアミノ、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルコキシ、シクロアルカノイル、シクロアルカミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルコキシ、ヘテロシクリルアルカノイル、ヘテロシクリルアルカミノ、ヒドロキシル、チオ、アミノ、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、アルキルカルボキシ、カーボネート、カルバメート、グアニジニル、ウレア、ハロ、トリハロメチル、シアノ、ニトロ、ホスホリル、スルホニル、スルホンアミドまたはアジドである）である、項目１１に記載の化合物。
（項目１３）
Ｌ_１が必要に応じて置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子が必要に応じてヘテロ原子で置き換えられる、項目１２に記載の化合物。
（項目１４）
ＡＡ_１が、必要に応じて１〜３個のＡ基で置換される、アラルキルアミノ酸側鎖である、項目１２に記載の化合物。
（項目１５）
ＵがＯである、項目１２に記載の化合物。
（項目１６）
Ｄが蛍光標識、放射標識またはキレータである、項目１２に記載の化合物。
（項目１７）
Ｄが蛍光標識である、項目１６に記載の化合物。
（項目１８）
前記蛍光標識が、フルオレセイン、オレゴングリーン、ボラ−ジアザ−インデセン、ローダミンまたはシアニン標識である、項目１７に記載の化合物。
（項目１９）
前記蛍光標識がシアニン標識である、項目１８に記載の化合物。
（項目２０）
前記シアニン標識が、Ｃｙ５である、項目１９に記載の化合物。
（項目２１）
Ｌがクエンチャーを含む、項目１〜２０のいずれか１項に記載の化合物。
（項目２２）
ＬがＬ_２−Ｌ_３−Ｑであり、
Ｌ_２がフェノキシ基であり、
Ｌ_３がリンカーであり、
Ｑがクエンチャーである、項目２１に記載の化合物。
（項目２３）
Ｌが

【化104】

であり、式中各Ｙが独立して電子求引基または水素である、項目２２に記載の化合物。
（項目２４）
各Ｙが独立して、ハロゲンまたは水素である、項目２３に記載の化合物。
（項目２５）
Ｌが

【化105】

であり、Ｌ_３が必要に応じて置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子が必要に応じてヘテロ原子に置き換えられる、項目２４に記載の化合物。
（項目２６）
Ｌが、

【化106】

であり、
ＲがＱＳＹクエンチャーであり、
ｎが１〜１６の整数である、項目２５に記載の化合物。
（項目２７）
前記ＱＳＹクエンチャーが、親水性ＱＳＹクエンチャーである、項目２６に記載の化合物。
（項目２８）
前記親水性ＱＳＹクエンチャーが、スルホ−ＱＳＹクエンチャーである、項目２７に記載の化合物。
（項目２９）
式（ＩＩ）

【化107】

（式中Ｄは蛍光標識であり、
Ｌ_３はリンカーであり、
Ｑはクエンチャーである）を有する、項目１２に記載の化合物。
（項目３０）
式（ＩＩＩ）

【化108】

（式中、ＲはＱＳＹクエンチャーであり、
Ｄはシアニン色素であり、
ｍおよびｎは独立して、１〜１６の整数である）
を有する項目２９に記載の化合物。
（項目３１）
ＲがＱＳＹ２１またはスルホ−ＱＳＹ２１であり、ＤがＣｙ５である、項目３０に記載の化合物。
（項目３２）
以下の化合物

【化109】

（式中、Ｒ＝ＱＳＹ２１およびｎ＝６、
Ｒ＝スルホ−ＱＳＹ２１およびｎ＝６、
Ｒ＝ＱＳＹ２１およびｎ＝２および
Ｒ＝スルホ−ＱＳＹ２１およびｎ＝２）の１つから選択される、項目３１に記載の化合物。
（項目３３）
項目１〜３２のいずれか１項に記載の化合物と、薬学的に許容され得る担体と、を含む、動物中のプロテアーゼを標識化することにおける使用のための組成物。
（項目３４）
前記動物に、項目３３に記載の組成物を投与する工程を含む、動物内のプロテアーゼを標識する方法。
（項目３５）
前記動物に、項目３３に記載の組成物を投与する工程と、
カセプシンシステインプロテアーゼとの組成物の反応から、前記動物中で発生した検出可能シグナルを測定する工程と、
を含み、前記検出可能シグナルが、前記動物内の腫瘍に関連する、動物内の腫瘍を可視化する方法。
（項目３６）
前記検出可能シグナルが蛍光シグナルである、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記蛍光シグナルが、腫瘍マージンにて発生する、項目３６に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】図１は、ａ）本実施にて合成したｑＡＢＰｓＧＢ１３７（１）およびプローブ２〜８の構造。ｂ）１μＭでの生ＲＡＷ細胞中のプローブ１〜８の標識化プロファイルである。ｃ）生ＲＡＷ細胞内のプローブ１および８による濃度依存標識化。ｄ）５μＭ ＧＢ１３７（１）に対する、生ＲＡＷ細胞内のプローブ（ｐｒｏｂｅｓ ｐｒｏｂｅｓ）１〜８の総カセプシン標識化強度。

【0032】

【図2】図２は、ａ）ｐＨ５．５にて、プローブ８によるＲＡＷ細胞溶解物の濃度依存標識化。ｂ）生ＲＡＷ細胞中の０．５μＭプローブ８での標識化時間経過である。ｃ）ＪＰＭ−ＯＥｔ（５０μＭ）で前処理した生ＲＡＷ細胞中のプローブ１および８の標識化の阻害と血清安定性。ｄ）１μＭプローブ８に曝露したＲＡＷ細胞の生細胞蛍光顕微鏡（パネル上列）、およびリソトラッカーと共局在化（パネルの第二列、スケールバー１０μｍ）。

【0033】

【図3-1】図３は、ａ）プローブ８および１を注射した、腫瘍を有するマウスの、非侵襲性光学イメージング時間経過（右パネル）である。下パネルは、各時間点での最適蛍光コントラストを表す。ｂ）プローブ１または８で処理したマウスに対する、時間依存腫瘍特異的蛍光（腫瘍−バックグラウンド）（ｎ＝３、データは、平均値±標準偏差を表す）。ｃ）エクスビボ腫瘍蛍光（上パネル）と、インゲル蛍光スキャニングによって可視化されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の、インビボ蛍光標識化タンパク質（下パネル）。ｄ）非侵襲性光学イメージング（ａにて示す）、エクスビボ腫瘍イメージングおよびインゲル蛍光標識化の最終点における蛍光強度（ｃで示す）。プローブ１に対する強度を描写する（ｎ＝３、データは平均値±標準偏差を示す）。ｅ）ＣＤ６８免疫染色（中央パネル）および核染色（ＤＡＰＩ−右パネル、スケールバー５０μｍ）での、プローブ８（左パネル）処理腫瘍組織切片の蛍光顕微鏡。ｆ）ＣＤ６８免疫染色（緑）および核染色（ＤＡＰＩ−青）での、プローブ８（赤）処理腫瘍組織切片のＣＬＳＭの３Ｄ再構築。

【図3-2】図３は、ａ）プローブ８および１を注射した、腫瘍を有するマウスの、非侵襲性光学イメージング時間経過（右パネル）である。下パネルは、各時間点での最適蛍光コントラストを表す。ｂ）プローブ１または８で処理したマウスに対する、時間依存腫瘍特異的蛍光（腫瘍−バックグラウンド）（ｎ＝３、データは、平均値±標準偏差を表す）。ｃ）エクスビボ腫瘍蛍光（上パネル）と、インゲル蛍光スキャニングによって可視化されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の、インビボ蛍光標識化タンパク質（下パネル）。ｄ）非侵襲性光学イメージング（ａにて示す）、エクスビボ腫瘍イメージングおよびインゲル蛍光標識化の最終点における蛍光強度（ｃで示す）。プローブ１に対する強度を描写する（ｎ＝３、データは平均値±標準偏差を示す）。ｅ）ＣＤ６８免疫染色（中央パネル）および核染色（ＤＡＰＩ−右パネル、スケールバー５０μｍ）での、プローブ８（左パネル）処理腫瘍組織切片の蛍光顕微鏡。ｆ）ＣＤ６８免疫染色（緑）および核染色（ＤＡＰＩ−青）での、プローブ８（赤）処理腫瘍組織切片のＣＬＳＭの３Ｄ再構築。

【0034】

【図4】図４は、ａ）ＢＭＶ１０９標識化システインカセプシンの免疫沈降。ｂ、ｃ）生ＲＡＷ細胞中のプローブ１〜８による濃度依存標識化である。ｂ）およびｃ）中のパネルは、それぞれ同一のゲル上で走らせた。

【0035】

【図5-1】図５は、ａ）プローブ１、２、６または８の注射８時間後、腫瘍を有するマウスの非侵襲性光学イメージングである。下パネルは、各時間点での最適蛍光コントラストを表している。ｂ）プローブ１、２、６または８で処理したマウスに対する、時間依存腫瘍特異的蛍光（腫瘍−バックグラウンド）（ｎ＝３、データは平均値±標準偏差を表している）。ｃ）エクスビボ腫瘍蛍光（上パネル）およびインゲル蛍光スキャニングによって可視化したＳＤＳ−ＰＡＧＥ後インビボ蛍光標識化タンパク質（下パネル）。ｄ）非侵襲性光学イメージングの最終点の蛍光強度（ａで示す）、エクスビボ腫瘍イメージング、およびインゲル蛍光標識化（ｃで示す）。プローブ１に対する強度を描写する（ｎ＝３、データは平均値±標準偏差を表している）。ｅ）ＣＤ６８免疫染色（第二、第三および第四カラム）および核染色（ＤＡＰＩ−第三および第四カラム、スケールバー５０μｍ）での、プローブ８（第一、第三および第四カラム）処理腫瘍切片の蛍光顕微鏡。プローブなし対照（中央列パネル）と免疫染色用イソ型対照（下列パネル）を描写する。ｆ）プローブ８（Ｃｙ５）およびＣＤ６８（ＦＩＴＣ）に対するコロカリゼーションダイアグラム。

【図5-2】図５は、ａ）プローブ１、２、６または８の注射８時間後、腫瘍を有するマウスの非侵襲性光学イメージングである。下パネルは、各時間点での最適蛍光コントラストを表している。ｂ）プローブ１、２、６または８で処理したマウスに対する、時間依存腫瘍特異的蛍光（腫瘍−バックグラウンド）（ｎ＝３、データは平均値±標準偏差を表している）。ｃ）エクスビボ腫瘍蛍光（上パネル）およびインゲル蛍光スキャニングによって可視化したＳＤＳ−ＰＡＧＥ後インビボ蛍光標識化タンパク質（下パネル）。ｄ）非侵襲性光学イメージングの最終点の蛍光強度（ａで示す）、エクスビボ腫瘍イメージング、およびインゲル蛍光標識化（ｃで示す）。プローブ１に対する強度を描写する（ｎ＝３、データは平均値±標準偏差を表している）。ｅ）ＣＤ６８免疫染色（第二、第三および第四カラム）および核染色（ＤＡＰＩ−第三および第四カラム、スケールバー５０μｍ）での、プローブ８（第一、第三および第四カラム）処理腫瘍切片の蛍光顕微鏡。プローブなし対照（中央列パネル）と免疫染色用イソ型対照（下列パネル）を描写する。ｆ）プローブ８（Ｃｙ５）およびＣＤ６８（ＦＩＴＣ）に対するコロカリゼーションダイアグラム。

【図5-3】図５は、ａ）プローブ１、２、６または８の注射８時間後、腫瘍を有するマウスの非侵襲性光学イメージングである。下パネルは、各時間点での最適蛍光コントラストを表している。ｂ）プローブ１、２、６または８で処理したマウスに対する、時間依存腫瘍特異的蛍光（腫瘍−バックグラウンド）（ｎ＝３、データは平均値±標準偏差を表している）。ｃ）エクスビボ腫瘍蛍光（上パネル）およびインゲル蛍光スキャニングによって可視化したＳＤＳ−ＰＡＧＥ後インビボ蛍光標識化タンパク質（下パネル）。ｄ）非侵襲性光学イメージングの最終点の蛍光強度（ａで示す）、エクスビボ腫瘍イメージング、およびインゲル蛍光標識化（ｃで示す）。プローブ１に対する強度を描写する（ｎ＝３、データは平均値±標準偏差を表している）。ｅ）ＣＤ６８免疫染色（第二、第三および第四カラム）および核染色（ＤＡＰＩ−第三および第四カラム、スケールバー５０μｍ）での、プローブ８（第一、第三および第四カラム）処理腫瘍切片の蛍光顕微鏡。プローブなし対照（中央列パネル）と免疫染色用イソ型対照（下列パネル）を描写する。ｆ）プローブ８（Ｃｙ５）およびＣＤ６８（ＦＩＴＣ）に対するコロカリゼーションダイアグラム。

【発明を実施するための形態】

【0036】

システインカセプシンは、正常細胞生理学ならびに多くのヒト疾患の病理学両方において、重要な役割を果たすプロテアーゼの一ファミリーである。したがって、多数の基質および活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）クラスが、これらの酵素の機能を研究するために開発されてきた。本明細書では、いくつかの実施形態において、フェノキシメチルケトン（ＰＭＫ）求電子剤を含む、クエンチされた蛍光活性に基づくプローブのクラスが提供される。これらの試薬は、システインカセプシンに対して、増強された、広い反応性を示し、先に報告されたＡＢＰｓと比べて、インビトロおよびインビボ標識化特性の劇的な改善が導かれる。プローブはさらに、本明細書で、前例のないシグナル強度およびコントラストにて、マウス中の腫瘍を強調するように実証される。これらの新規試薬は、ヒト疾患の様々なモデルにおいて、生物、組織、細胞およびタンパク質レベルにおけるシステインカセプシンの研究を可能にする。

【0037】

化合物
したがって、いくつかの様態において、本開示は、プロテアーゼ酵素、とりわけカセプシンを標識することにおける利用のための新規化合物を提供する。本開示の化合物は、式（Ｉ）

【化8】

（式中、
Ｌはエーテル結合脱離要素であり、
Ｔは標的化要素であり、
Ｄは検出可能要素である）
の化合物であり得る。

【0038】

本化合物の標的化要素Ｔは、ペプチド性または非ペプチド性構造であり得、好ましくは化合物を、システインプロテアーゼに標的化する。

【0039】

これらの目的のために、本化合物内に有用に組み込まれた非ペプチド性構造要素の非限定例は、その全てが本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１２／１１８７１５号パンフレットに記述される。好ましい実施形態において、非ペプチド性標的化要素は、トリアゾール構造を有する。

【0040】

非ペプチド性標的化要素を有する、本発明の化合物の特定の例は、

【化9】

である。

【0041】

化合物をシステインプロテアーゼ、とりわけシステインカセプシンに標的化するための本化合物に有用に組み込まれ得るペプチド性構造要素の非限定例は、その全てが参照によって本明細書に組み込まれている、国際公開第２００９／１２４２６５号パンフレットに記述されている。

【0042】

本化合物のいくつかの実施形態において、Ｄ−Ｔ−は、

【化10】

であり、式中、
Ｌ_１はリンカーであり、
ＡＡ_１はアミノ酸側鎖であり、
ＵはＯ、ＮまたはＳであり、
Ｒ_１はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキルまたは保護基であり、必要に応じて１〜３個のＡ基で置換され、
各Ａが独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルカノイル、アルキルアミノ、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、アラルカノイル、アラルクアミノ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルコキシ、ヘテロアラルカノイル、ヘテロアラルクアミノ、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルコキシ、シクロアルカノイル、シクロアルカミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルコキシ、ヘテロシクリルアルカノイル、ヘテロシクリルアルカミノ、ヒドロキシル、チオ、アミノ、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、アルキルカルボキシ、カーボネート、カルバメート、グアニジニル、ウレア、ハロ、トリハロメチル、シアノ、ニトロ、ホスホリル、スルホニル、スルホンアミドまたはアジドである。

【0043】

本明細書で使用する場合、用語「アルキル」は、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂肪環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む、飽和脂肪族基のラジカルを意味する。いくつかの実施形態において、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格に、３０またはそれ未満の炭素原子を含み（例えば直鎖に対してＣ_１〜Ｃ_３０、分岐差に対してＣ_３〜Ｃ_３０）、よりとりわけ２０またはそれ未満である。同様に、いくつかのシクロアルキルは、３〜１０炭素原子をそれらの環構造中に含み、よりとりわけ、環構造中に、５、６または７個の炭素を有する。

【0044】

さらに、本明細書、実施例および請求項を通して使用する場合、用語「アルキル」（または「低級アルキル」）は、「未置換アルキル」および「置換アルキル」両方を含むことが意図され、後者は、炭化水素骨格の１つまたはそれを超える炭素上の水素を置き換えている置換基を有するアルキル部分を意味する。そのような構造としては、例えば、ハロ、ヒドロキシル、（ケト、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ホルミルまたはアシルのような）カルボニル、（チオエステル、チオアセテートまたはチオホルメートのような）チオカルボニル、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、チオ、アルキルチオ、硫酸塩、スルホン酸塩、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキルまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を挙げることができる。炭化水素鎖上で置換された部分が、適切な場合に、それら自身置換され得ることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、置換アルキルの置換基には、置換および末置換形態のアミノ、アジド、イミノ、アミド、（ホスホン酸塩およびホスフィン酸塩を含む）ホスホリル、（硫酸塩、スルホンアミド、スルファモイルおよびスルホン酸塩を含む）スルホニル、およびシリル基、ならびにエーテル、アルキルチオ、（ケトン、アルデヒド、カルボキシレートおよびエステルを含む）カルボニル、−ＣＦ_３、−ＣＮなどを挙げることができる。例示置換アルキルを以下に記述する。シクロアルキルはさらに、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル−置換アルキル、−ＣＦ_３、−ＣＮなどでさらに置換され得る。

【0045】

本明細書で使用する場合、用語「アルコキシ」は、それに結合した酸素を有する、アルキル基、ある特定の実施形態において、低級アルキル基を意味する。代表的なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔ−ブトキシなどが挙げられる。

【0046】

本明細書で使用する場合、用語「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含む脂肪族基を意味し、「未置換アルケニル」と「置換アルケニル」両方を含むことを意図し、後者は、アルケニル基の１つまたはそれを超える炭素上の水素を置き換える置換基を有するアルケニル部分を意味する。そのような置換基は、１つまたはそれを超える二重結合中に含まれる、または含まれない１つまたはそれを超える炭素上で発生し得る。さらに、そのような置換基には、安定性が阻害される場合を除いて、上で議論したような、アルキル基に対して企図された全ての物が含まれる。例えば、１つまたはそれを超えるアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基によるアルケニル基の置換が企図される。

【0047】

アシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアルコキシのような、化学部分と一緒に使用される場合、用語「Ｃ_ｘ−ｙ」は、鎖中にｘ〜ｙ炭素を含む基を含むことが意味される。例えば、用語「Ｃ_ｘ−ｙ−アルキル」は、トリフルオロメチルおよび２，２，２−トリフルオロエチルなどのようなハロアルキル基を含む、ｘ〜ｙ炭素を鎖中に含む、直鎖アルキルおよび分岐鎖アルキル基を含む、置換または未置換飽和炭化水素基を意味する。「Ｃ_０−アルキル」は、基が末端位置にある、または内部であれば結合である、水素を示す。用語「Ｃ_２−ｙ−アルケニル」および「Ｃ_２−ｙ−アルキニル」は、長さにして置換または未置換不飽和脂肪族基アナログ、および上述したアルキルへの可能性のある置換を意味するが、それぞれ少なくとも１つの二重結合または三重結合を有する。

【0048】

本明細書で使用する場合、用語「アルキルアミノ」は、少なくとも１つのアルキル基で置換されたアミノ基を意味する。

【0049】

本明細書で使用する場合、用語「アルキルチオ」は、アルキル基で置換されたチオール基を意味し、一般式アルキル−Ｓ−によって表され得る。

【0050】

本明細書で使用する場合、用語「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を含む脂肪族基を意味し、「未置換アルキニル」と「置換アルキニル」両方を含むことを意図し、後者は、アルキニル基の１つまたはそれを超える炭素上の水素を置き換える置換基を有する、アルキニル部分を意味する。そのような置換基は、１つまたはそれを超える三重結合に含まれる、または含まれない、１つまたはそれを超える炭素上で発生され得る。さらに、そのような置換基は、安定性が阻害される場合を除いて、以上で議論したような、アルキル基に対して企図されるもの全てを含む。例えば、１つまたはそれを超えるアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基によるアルキニル基の置換が企図される。

【0051】

本明細書で使用する場合、用語「アミド」は、基

【化11】

を意味し、式中Ｒ^ｘおよびＲ^ｙはそれぞれ独立して、水素またはヒドロカルビル基を表し、またはＲ^ｘとＲ^ｙは、それらが結合しているＮ原子と一緒に、環構造中、４〜８原子を有するヘテロ環を完結する。

【0052】

用語「アミン」および「アミノ」は、本技術分野で認識されており、未置換および置換アミンおよびその塩、例えば

【化12】

によって表すことができる部分が意味され、式中Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙおよびＲ^ｚはそれぞれ独立して、水素またはヒドロカルビル基を表し、またはＲ^ｘとＲ^ｙは、それらが結合しているＮ原子と一緒に、環構造中４〜８原子を有するヘテロ環を完結する。

【0053】

本明細書で使用する場合、用語「アミノアルキル」は、アミノ基で置換されたアルキル基を意味する。

【0054】

本明細書で使用する場合、用語「アラルキル」は、アリール基で置換されたアルキル基を意味する。

【0055】

本明細書で使用する場合、用語「アリール」は、環の各原子が炭素である、置換または未置換単一環芳香族基を含む。特定の実施形態において、環は、５〜７員環であり、より具体的な実施形態では６員環である。用語「アリール」はまた、２つまたはそれを超える炭素が、２つの連結している環に共通である、２つまたはそれを超える環式環を有する多環式環系を含み、そこで少なくとも１つの環が芳香族であり、例えば他の環式環がシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよび／またはヘテロシクリルであり得る。アリール基には、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、フェノール、アニリンなどが含まれる。

【0056】

用語「カルバメート」は、本技術分野で認識されており、基

【化13】

を意味し、式中Ｒ^ｘとＲ^ｙは独立して、水素またはヒドロカルビル基を表し、またはＲ^ｘおよびＲ^ｙは、それらが結合している原子と一緒に、環構造中に４〜８原子を有するヘテロ環を完結する。

【0057】

本明細書で使用する場合、用語「シクロアルキル」は、環の各原子が炭素である、非芳香族飽和または不飽和環を意味する。特定の実施形態において、シクロアルキル環は、３〜１０原子、より特定の実施形態において、５〜７原子を含む。

【0058】

用語「カーボネート」は、本技術分野で認識されており、基−ＯＣＯ_２−Ｒ^ｘを意味し、式中Ｒ^ｘは、ヒドロカルビル基を表す。

【0059】

本明細書で使用する場合、用語「カルボキシ」は、式−ＣＯ_２Ｈによって表される基を意味する。

【0060】

本明細書で使用する場合、用語「エステル」は、基−Ｃ（Ｏ）ＯＲ^ｘを意味し、式中Ｒ^ｘは、ヒドロカルビル基を表す。

【0061】

本明細書で使用する場合、用語「エーテル」は、酸素を通して、もう一つのヒドロカルビル基に結合したヒドロカルビル基を意味する。したがって、ヒドロカルビル基のエーテル置換基は、ヒドロカルビル−Ｏ−であり得る。エーテルは、対称であるか、または非対称いずれかであり得る。エーテルの例としては、ヘテロ環−Ｏ−ヘテロ環およびアリール−Ｏ−ヘテロ環が挙げられるが、これらに限定されない。エーテルには、「アルコキシアルキル基」が含まれ、これらは、一般式アルキル−Ｏ−アルキルによって表され得る。

【0062】

用語「グアニジニル」は、本技術分野で認識されており、一般式

【化14】

によって表され得、式中Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは独立して水素またはヒドロカルビルを表す。

【0063】

本明細書で使用する場合、用語「ハロ」および「ハロゲン」は、ハロゲンを意味し、クロロ、フルオロ、ブロモおよびヨードを含む。

【0064】

本明細書で使用する場合、用語「ヘタラルキル」および「ヘテロアラルキル」は、ヘタリール基によって置換されたアルキル基を意味する。

【0065】

用語「ヘテロアリール」および「ヘタリール」は、その環構造が、少なくとも１つのヘテロ原子、いくつかの実施形態において、１〜４個のヘテロ原子、より特定の実施形態において、１〜２個のヘテロ原子を含む、置換または未置換芳香族単一環構造、ある特定の実施形態において、５〜７員環、よりとりわけ５〜６員環を含む。用語「ヘテロアリール」および「ヘタリール」はまた、２つまたはそれを超える炭素が、２つの隣接する環に対して共通である、２つまたはそれを超える環式環を有する多環式環系を含み、少なくとも１つの環がヘテロ芳香族であり、例えば他の環式環がシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよび／またはヘテロシクリルであり得る。ヘテロアリール基としては、例えば、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンなどが挙げられる。

【0066】

本明細書で使用する場合、用語「ヘテロ原子」は、炭素または水素以外の任意の元素の原子を意味する。典型的なヘテロ原子は、窒素、酸素および硫黄である。

【0067】

用語「ヘテロシクリル」、「ヘテロ環」および「ヘテロ環式」は、その環構造が、少なくとも１つのヘテロ原子、いくつかの実施形態において、１〜４ヘテロ原子、より特定の実施形態において、１または２ヘテロ原子を含む、置換または未置換非芳香族環構造、ある特定の実施形態において、３〜１０員環、よりとりわけ３〜７員環を意味する。用語「ヘテロシクリル」および「ヘテロ環式」はまた、２つまたはそれを超える炭素が、２つの隣接する環に対して共通である、２つまたはそれを超える環式環を有する多環式環系も含み、そこで少なくとも１つの環はヘテロ環式であり、例えば他の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよび／またはヘテロシクリルであり得る。ヘテロシクリル基としては、例えば、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、モルホリン、ラクトン、ラクタムなどが挙げられる。

【0068】

本明細書で使用する場合、用語「ヘテロシクリルアルキル」は、ヘテロ環基で置換されたアルキル基を意味する。

【0069】

本明細書で使用する場合、用語「ヒドロカルビル」は、＝Ｏまたは＝Ｓ置換基を有さず、典型的には、少なくとも１つの炭素−水素結合と、主に炭素骨格を有するが、必要に応じてヘテロ原子を含み得る、炭素原子を通して結合する基を意味する。したがって、メチル、エトキシエチル、２−ピリジルおよびトリフルオロメチルのような基が、本明細書の目的のためのヒドロカルビルであると考えられるが、（結合炭素上で＝Ｏ置換基を有する）アセチルおよび（炭素でなく、酸素を通して結合する）エトキシのような置換基ではない。ヒドロカルビル基としては、アリール、ヘテロアリール、カルボ環、ヘテロ環、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。

【0070】

本明細書で使用する場合、用語「ヒドロキシアルキル」は、ヒドロキシ基で置換されたアルキル基を意味する。

【0071】

アシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアルコキシのような、化学部分と一緒に使用する場合に、用語「低級」は、１０またはそれ未満、特定の実施形態では、６またはそれ未満の非水素原子が置換基内に存在する基を含むことが意味される。例えば、「低級アルキル」は、１０またはそれ未満、特定の実施形態において６またはそれ未満の炭素原子を含むアルキル基を意味する。特定の実施形態において、本明細書で定義したアシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアルコキシ置換基は、記述において、ヒドロキシアルキルおよびアラルキル（この場合、例えばアリール基内の原子は、アルキル置換基中の炭素原子を数える時に、計算に入れない）のような、単独または他の置換基との組合せで現れるであろうとなかろうと、それぞれ低級アシル、低級アシルオキシ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニルおよび低級アルコキシである。

【0072】

用語「ポリシクリル」、「多環」および「多環式」は、２つまたはそれを超える原子が、２つの隣接している環に対して共通である、２つまたはそれを超える環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、および／またはヘテロシクリル）を意味し、例えば環は「融合環」である。多環の環のそれぞれは、置換または未置換であり得る。特定の実施形態において、多環の各環は、環中に３〜１０原子、よりとりわけ５〜７含む。

【0073】

用語「置換された」は、骨格の１つまたはそれを超える炭素上の水素を置き換える置換基を有する部分を意味する。「置換」または「で置換された」には、そのような置換が、置換された原子と置換基の許容された価数にしたがってであること、および置換が、例えば化合物が使用されるべきである条件下、化合物が、例えば再構成、環化、削除などによってのような変形を自発的にうけることはない、安定化合物をもたらすこと、という暗黙の条件が含まれることを理解されたい。本明細書で使用する場合、用語「置換された」は、有機化合物の全ての許容され得る置換基を含むことが熟考される。広い様態において、許容され得る置換基には、有機化合物の非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環およびヘテロ環、芳香族および非芳香族置換基が含まれる。許容され得る置換基は、適切な有機化合物に対して、１つまたはそれを超える、および同一または異なり得る。本発明の目的のために、窒素のようなヘテロ原子が、ヘテロ原子の価数を満足させる、本明細書で記述した有機化合物の水素置換基および／または任意の許容され得る置換基を有し得る。置換基としては、本明細書で記述した任意の置換基、例えばハロゲン、ヒドロキシル、（ケト、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ホルミルまたはアシルのような）カルボニル、（チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメートのような）チオカルボニル、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルホヒドリル、アルキルチオ、硫酸塩、スルホン酸塩、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を挙げることができる。炭化水素鎖上で置換された部分が、適切な場合、それ自身置換され得ることが、当業者によって理解されるであろう。

【0074】

「未置換」と特に記述しない場合、本明細書の化学部分に対する参照は、置換されたバリアントを含むと理解される。例えば、「アリール」基または部分に対する参照は、置換および未置換バリアント両方を暗黙に含む。

【0075】

用語「硫酸塩」は、本技術分野で認識されており、基−ＯＳＯ_３Ｈ、またはその薬学的に許容され得る塩を意味する。

【0076】

用語「スルホンアミド」は、本技術分野で認識されており、一般式

【化15】

によって表される基を意味し、式中Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは独立して、水素またはヒドロカルビルを表す。

【0077】

用語「スルホキシド」は、本技術分野で認識されており、基−Ｓ（Ｏ）−Ｒ^ｘを意味し、式中Ｒ^ｘはヒドロカルビルを表す。

【0078】

用語「スルホ」または「スルホネート」は、本技術分野で認識されており、基−ＳＯ_３Ｈまたはその薬学的に許容され得る塩を意味する。

【0079】

用語「スルホン」は、本技術分野で認識されており、基−Ｓ（Ｏ）_２−Ｒ^ｘを意味し、式中Ｒ^ｘはヒドロカルビルを表す。

【0080】

本明細書で使用する場合、用語「チオアルキル」は、チオール基で置換されたアルキル基を意味する。

【0081】

本明細書で使用する場合、用語「チオエステル」は、基−Ｃ（Ｏ）ＳＲ^ｘまたは−ＳＣ（Ｏ）Ｒ^ｘを意味し、式中Ｒ^ｘはヒドロカルビルを表す。

【0082】

本明細書で使用する場合、用語「チオエーテル」は、エーテルと等価であり、酸素が硫黄に置き換えられる。

【0083】

用語「ウレア」は、本本技術分野で認識されており、一般式

【化16】

によって表され得、式中Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは独立して、水素またはヒドロカルビルを表す。

【0084】

本発明の化合物は一般に、標準の合成化学技術を用いて、例えば、以下の実施例の項目にて記述した方法を用いて、合成する。他の有用な合成技術は、例えば、Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，７ｔｈ Ｅｄ．，（Ｗｉｌｅｙ，２０１３）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４^ｔｈ Ｅｄ．，Ｖｏｌｓ．Ａ ａｎｄ Ｂ（Ｐｌｅｎｕｍ ２０００，２００１）；Ｆｉｅｓｅｒｓ’ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−２７（Ｗｉｌｅｙ，２０１３）；Ｒｏｄｄ’ｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−５ ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８９）；Ｏｒｇａｎｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−８１（Ｗｉｌｅｙ，２０１３）；およびＬａｒｏｃｋ’ｓ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．，１９８９）（その全てが、参照によって組み込まれている）にて記述される。化合物は通常、商業的供給源より一般に入手可能であるか、当業者に周知の方法を用いて調製される開始材料を用いて容易に合成される。例えば、補遺を含む、Ｆｉｅｓｅｒｓ’ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−２７（Ｗｉｌｅｙ，２０１３）、またはＢｅｉｌｓｔｅｉｎｓ Ｈａｎｄｂｕｃｈ ｄｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ，４，Ａｕｆｌ．ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎを参照のこと。

【0085】

本発明の化合物の成分を参照する時に、用語「から由来する残基」は、共有結合を形成するために、第一成分上の第一の反応性官能基と、第二成分上の第二の反応性官能基の反応によって形成される残基を記述するために使用され得る。例示実施形態において、第一成分上のアミン基が、第二成分上の活性化カルボキシル基と反応して、１つまたはそれを超えるアミド部分を含む残基を形成し得る。第一および第二反応性官能基の他の配列が、本発明によって含まれる。例えば、アジド置換第一成分の、アルキン置換第二成分との銅触媒化、または銅を含まない反応が、当業者に理解されるように、周知の「クリック」反応を通して、チアゾール含有残基をもたらす。Ｋｏｌｂら、（２００１）Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４０：２００４；Ｅｖａｎｓ（２００７）Ａｕｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６０：３８４を参照のこと。「クリック」反応を用いた非ペプチド性蛍光イメージングプローブを産出する例示方法は、国際公開第２０１２／１１８７１５号パンフレットにて提供される。本請求項の化合物を産出、または改変するためのこれらの方法の適合が、当業者の範囲内である。

【0086】

当業者は、保護基が、分子の所望の位置に可逆的に結合し、その位置で他の薬剤の反応を制御することを理解するであろう。本発明の実施において有用な保護基は、本技術分野で周知である。例えば、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ ａｎｄ Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅによるＧｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，４^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００６）；および、Ｐ． ＫｏｃｉｅｎｓｋｉによるＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ（Ｔｈｉｅｍｅ，２００５）を参照のこと。

【0087】

本化合物のＬ_１基は、検出可能な要素Ｄを、標的化要素に連結する、リンカー基である。この基は、当業者によって理解されるように、任意の好適なリンカーであり得る。Ｌ_１基は好ましくはアルキルリンカー基であり、そこでアルキルリンカーは必要に応じて置換され、さらにリンカー内の炭素は必要に応じて、得られる構造が化学的に安定である程度まで、ヘテロ原子によって置換される。そのような置換基および交換が、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステル、アミド、カーボネート、カルバメートなどのようなリンカー内の介在基を含むと理解されるべきである。好ましいリンカーは、長さにして、５〜４０結合の範囲であり、分岐鎖、直鎖であり得るか、または環を含み得る。リンカーは場合によって、二重結合を含み得る。これらは、特定の要件にしたがって所望されるように、疎水性または親水性であり得る。

【0088】

Ｌ_１基と検出可能要素Ｄ間の連結が、当業者によって理解されるように、任意の好適な化学連結であり得ることがさらに理解されるべきである。例えば、本化合物は、場合によって、検出可能要素前駆体中、例えば、アミノ基、チオール基などのような、特定の化学基と反応性である部分を含むことによって便利に調製され得る。検出可能要素を、そのような状態において、標的化要素上のこの基の反応を通して標的化要素に簡単に接続可能である。これらの型の結合はしたがって、接続の構造詳細が明確に示されない場合でさえも、開示された化合物の範囲内であると理解される。

【0089】

本化合物のＡＡ_１基は、当業者によって理解されるように、任意の天然または非天然アミノ酸側鎖であり得る。好ましい実施形態において、ＡＡ_１基は、１〜３個のＡ基で必要に応じて置換されるアラルキルアミノ酸側鎖である。さらに好ましい実施形態において、ＡＡ１基は、フェニルアラニン側鎖である。

【0090】

好ましい化合物において、Ｕ基はＯである。

【0091】

本化合物の検出可能な要素は、特定の実施形態において、蛍光標識、放射標識、キレータなどである。これらの化合物中での利用のために好適な放射標識およびキレータの例は、国際公開第２００９／１２４２６５号パンフレットに記述される。

【0092】

本化合物の好ましい実施形態において、検出可能要素は蛍光標識である。当業者によって公知のように、蛍光標識は、入射電磁放射の吸収によって刺激される時に、電磁放射、好ましくは可視光を放射する。標識を、例えばアミノ基、チオール基などのような反応性基に結合するために有用な反応性部分を有する標識を含む、広く種々の蛍光標識が市販されている。例えば、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標） Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを参照のこと。

【0093】

蛍光標識の例は、広く免疫蛍光標識化にて使用される、フルオレセインである。フルオレセインは、４９５ナノメートルにて吸収極大を有するキサンテン色素である。関連フルオロフォアが、フルオレセインのフッ素化誘導体である、オレゴングリーンである。

【0094】

本発明の化合物の検出可能な要素中で使用される蛍光標識は、いくつかの実施形態において、ｐＨ依存フルオロフォアであり得る。例えば、「ＬＥＳ１２」および「ＬＥＳ１３」と標識される化合物中で使用されるような、以下で示すそのような蛍光標識が、当業者によって理解されるように、標識の環境のｐＨに依存する蛍光スペクトルを提示し、したがって、反応後の標識の環境に関する情報、例えば反応性化合物によって標識されたプロテアーゼの型または位置についての情報を報告することにおいて有用である。本化合物の検出可能な要素中に有益に含まれる種々の標識のｐＨ依存蛍光が周知であり得る。例えば、その全てが参照によって本明細書に組み込まれている、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標） Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを参照のこと。

【0095】

本化合物中での使用に好適な他の例示蛍光標識は、ボラ−ジアザ−インデセン、ローダミンおよびシアニン色素である。とりわけ、ボラ−ジアザ−インデセン色素は、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素として知られる、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インデセンによって表される。これらの色素の種々の誘導体が公知であり、本開示の化合物中の検出可能な要素としての使用に好適であると考えられる。例えば、Ｃｈｅｎら、（２０００）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：２９００−２９０６を参照のこと。

【0096】

本発明の化合物中で有益に使用される他のクラスの蛍光標識は、Ｌｉ−Ｃｏｒ（ｗｗｗ．ｌｉｃｏｒ．ｃｏｍ）より入手可能なＩＲＤｙｅ赤外線色素である。これらの色素の非限定例は、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤ、ＩＲＤｙｅ ６８０ＬＴ、ＩＲＤｙｅ ７５０、ＩＲＤｙｅ ７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ ８００ＲＳ、およびＩＲＤｙｅ ６５０である。

【0097】

ローダミン色素は、ローダミン環構造に基づく色素の一クラスである。ローダミンとしてはとりわけ、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、タンパク質共役体、とりわけ抗体およびアビジン共役体を調製するため非常に一般的なフルオロフォア、およびカルボキシテトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）、オリゴヌクレオチド標識および自動化核酸シークエンシングのために一般に使用される色素、が挙げられる。ローダミンは、フルオレセインに基づくフルオロフォアに対する天然の補足として確立され、より長い波長放射最大を提案し、次いで多重色標識化または染色化のための機会を開く。

【0098】

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素として公知のフルオロフォアのスルホン化ローダミンシリーズがまた、ローダミン色素群の範囲内に含まれる。最新のフルオロフォア技術における劇的な進歩が、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素によって例示され、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓによって導入された。これらのスルホン化ローダミン誘導体は、スペクトル的に同様のプローブよりも、より強い蛍光放射に対して、より高い量子収率を示し、光安定性増強、共通のレーザー線に対して適合した吸収スペクトル、ｐＨ不感受性および高程度の水溶性を含む、種々の追加の改善された特性を有する。

【0099】

シアニン色素は、様々な炭素数のポリアルケンブリッジを介して連結している２つの芳香族ユニットを有する、部分的に飽和したインドール窒素ヘテロ環核に基づく、関連色素のファミリー、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７およびそれらの誘導体に相当する。これらのプローブは、フルオレセインおよびテトラメチルローダミンのような、伝統的な色素の多くと同様であるが、水溶性の増強、光安定性およびより高い量子収率を有する、蛍光励起および放射プロファイルを示す。ほとんどのシアニン色素は、それらの伝統的なカウンターパートよりも、より環境的に安定であり、それらの蛍光放射強度に、ｐＨおよび有機マウンティング媒体（ｏｒｇａｎｉｃ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉａ）に対するより少ない感度を与える。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓと同様の様式において、合成色素のＣｙシリーズの励起波長が、とりわけ一般的なレーザーおよびアーク放電供給源との利用に対して調整され、蛍光放射が、伝統的なフィルタ組合せで検出可能である。シアニン色素は、反応性色素またはフルオロフォアとして簡単に入手可能である。シアニン色素は一般に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒファミリーのメンバーよりも、より広い吸収スペクトルを有し、それらを、共焦点顕微鏡に対するレーザー励起供給源の選択において、いくらかより万能とする。

【0100】

好ましい実施形態において、本化合物の検出可能な要素は、シアニン色素、Ｃｙ５である。

【0101】

いくつかの実施形態において、本発明の化合物の検出可能な要素内に、多重蛍光標識、放射標識、キレータなどをを含めることが有益であり得る。例えば、以下、「ＬＥＳ１２」および「ＬＥＳ１３」と標識する例示化合物が、単一の検出可能要素内に、２つの異なる蛍光標識を含む。そのような多重標識化は、当業者によって理解されるように、ルーチンの結合化学反応を用いて達成可能である。例えば、「ＬＥＳ１２」および「ＬＥＳ１３」化合物内の蛍光標識を、「クリック」化学反応を用いて連結した。「クリック」化学反応による、検出可能な要素内に多重標識を含む化合物の合成において有用な中間化合物の例を以下に示す（「ＷＬ９３８」）。本化合物は、アジド基を含み、したがって、「クリック」反応にて、好適なアルキン含有試薬と簡単に反応可能である。アルキンおよびアジド基の位置はまた、所望であれば、当業者によって理解されるように、逆でもよい。

【0102】

いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、式（Ｉ）の化合物であり、式中Ｔはペプチド性標的化要素であり、本化合物はさらに、以下の番号付けされたセンテンスにて記述される。
１．式中Ｄ−Ｔ−は短い検出可能ペプチド性基であり、Ｌはエーテル結合脱離要素である、式（Ｉ）の化合物。
２．検出可能ペプチド性基が、１〜４アミノ酸残基を含む、センテンス１の化合物。
３．Ｄ−Ｔが

【化17】

であり、式中、各ＡＡ_１、ＡＡ_２、ＡＡ_３およびＡＡ_４は独立して、アミノ酸側鎖であるか、−Ｌ_１−Ｄであり、
各Ｒ_Ａは独立して、水素またはＲ_１であり、
Ｒ_Ｂは水素、Ｒ_１、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ_１または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_１）（Ｒ_Ａ）であり、
Ｒ_１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、保護基、または−Ｌ_１−Ｄ−であり、必要に応じて１〜３個のＡ基で置換され、
各Ａが独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルカノイル、アルキルアミノ、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、アラルカノイル、アラルクアミノ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルコキシ、ヘテロアラルカノイル、ヘテロアラルクアミノ、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルコキシ、シクロアルカノイル、シクロアルカミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルコキシ、ヘテロシクリルアルカノイル、ヘテロシクリルアルカミノ、ヒドロキシル、チオ、アミノ、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、アルキルカルボキシ、カーボネート、カルバメート、グアニジニル、ウレア、ハロ、トリハロメチル、シアノ、ニトロ、ホスホリル、スルホニル、スルホンアミドまたはアジドであり、
Ｌ_１はリンカーである、センテンス２の化合物。
４．各Ｒ_Ａが水素であり、Ｒ_Ｂが−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１である、センテンス３の化合物。
５．Ｄ−Ｔが、

【化18】

であり、
各ＡＡ_１およびＡＡ_２が独立して、アミノ酸側鎖または−Ｌ_１−Ｄであり、
各Ｒ_Ａは水素である、センテンス３の化合物。
６．Ｄ−Ｔが、

【化19】

であり、
各ＡＡ_１、ＡＡ_２およびＡＡ_３は独立して、アミノ酸側鎖またはＬ_１−Ｄであり、
各Ｒ_Ａは水素である、センテンス３の化合物。
７．Ｄ−Ｔが、

【化20】

であり、
各ＡＡ_１、ＡＡ_２、ＡＡ_３およびＡＡ_４は独立して、アミノ酸側鎖または−Ｌ_１−Ｄであり、
各Ｒ_Ａは水素である、センテンス３の化合物。
８．Ｌ_１は必要に応じて置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子が必要に応じてヘテロ原子で置き換えられる、センテンス３の化合物。
９．Ｒ_Ｂが−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１である、センテンス３の化合物。
１０．Ｄが蛍光標識、放射標識またはキレータである、センテンス３の化合物。
１１．Ｄが蛍光標識である、センテンス１０の化合物。
１２．蛍光標識が、フルオレセイン、オレゴングリーン、ボラ−ジアザ−インデセン、ローダミンまたはシアニン標識である、センテンス１１の化合物。
１３．蛍光色素がシアニン標識である、センテンス１２の化合物。
１４．シアニン標識がＣｙ５である、センテンス１３の化合物。

【0103】

本化合物のこれらの実施形態において、ＡＡ_１、ＡＡ_２、ＡＡ_３およびＡＡ_４基は独立して、当業者によって理解されるように、任意の天然または非天然アミノ酸側鎖、または基「−Ｌ_１−Ｄ」であり得る。好ましい実施形態において、基は、必要に応じて１〜３個のＡ基で置換されるアラルキルアミノ側鎖である。さらに好ましい実施形態において、基はフェニルアラニンからの側鎖である。他の好ましい実施形態において、基は、任意の組合せで、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基からの側鎖、またはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンまたは他のそのようなアミノ酸残基のようなアルキルアミノ酸残基からの側鎖のような酸性アミノ酸残基からの側鎖である。リシン、アルギニン、チロシン、グルタミン、アスパラギンなどのような他のアミノ酸残基からの側鎖もまた、本化合物中で好ましい。

【0104】

ＡＡ_１、ＡＡ_２、ＡＡ_３またはＡＡ_４基が、「−Ｌ_１−Ｄ」基である化合物実施形態において、Ｌ_１リンカー成分は、アミノ酸側鎖によって提供され得る。例えば、リシン残基は便利に、好適に活性化された検出可能要素との反応のために、アミノ−アルキル基を提供する。

【0105】

「短い」検出可能ペプチド性基は、１０までのアミノ酸残基を有する検出可能ペプチド性基として、本明細書で定義される。

【0106】

本化合物のエーテル結合脱離要素Ｌは、それらの標的酵素活性部位との化合物の反応性に影響を与え、特定の酵素に対して標的化する特異性に影響をおよぼし得る。これらの化合物内の脱離要素のエーテル結合は、アシルオキシメチルケトン（ＡＯＭＫｓ）のような、他の活性に基づくプローブのエステル結合と対照的である。例えば、フェノールエーテル−結合脱離要素のようなエーテル結合脱離要素が、エステル結合または他の型のプローブに対して、インビボで改善された安定性を提供し得る。

【0107】

いくつかの実施形態において、本化合物のエーテル結合脱離要素にはクエンチャーが含まれる。用語「クエンチャー」は、フルオロフォアの放射を調節する、化学エンティティを意味する。場合によって、クエンチャーはそれ自身、その蛍光がクエンチされている標識とは異なる、特徴的な波長にて、蛍光を放射する蛍光分子であり得る。したがって、フルオロフォアは、適切に他の色素に結合した時に、クエンチャーとして働くことができ、その逆もあり得る。これらの状況において、ドナー標識のものとは異なる波長のものである、アクセプタ分子からの蛍光の増加は、例えば、標的酵素の活性部位のような、その環境との、標識化された化合物の相互作用を別に報告することができる。場合によって、クエンチャーは、それ自身、蛍光を発しない（すなわち、クエンチャーは「暗アクセプタ」である）。そのようなクエンチャーには、例えばダブシル、メチルレッドおよびＱＳＹジアリールローダミン色素などが含まれる。特に、ダブシル（４−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）安息香酸）が、ＤＮＡ検出のための「分子ビーコン」のような多くのアッセイにて広く使用される共通の暗クエンチャーである。米国特許第５，９８９，８２３号明細書。「ブラックホールクエンチャー（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ）」と呼ばれる、ＢＨＱシリーズのジアゾ色素が、多くのフルオロフォアの放射とよく重なる、広い範囲の吸収を提供する。国際公開第０１／８６００１号パンフレット。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓのＱＳＹシリーズ色素が、多くのバイオアッセイにてクエンチ試薬として広範囲にわたって使用されてきた暗クエンチャー色素の他の例である。米国特許第６，３９９，３９２号明細書。

【0108】

とりわけＱＳＹ７は、非蛍光ジアリールローダミン誘導体である。米国特許出願公開第２００５／００１４１６０号明細書。ＱＳＹ２１は、可視スペクトルにおいて強力な吸収を有する、非蛍光ジアリールローダミンクロモフォアであり、効果的な蛍光クエンチャーである。フルオロフォア／クエンチャー対はさらに、米国特許出願公開第２００４／０２４１６７９号に例示されている。

【0109】

ＩＲＤｙｅ ＱＣ−１（Ｌｉ−Ｃｏｒより入手可能）は、本化合物中のクエンチャーとしての利用のために好適である、非蛍光色素の他の例である。これは、可視領域から近赤外線までの波長範囲を含む、広い範囲のフルオロフォアからの蛍光を効果的にクエンチする。

【0110】

本化合物のいくつかの実施形態において、脱離基要素Ｌは、Ｌ_２−Ｌ_３−Ｑであり、式中Ｌ_２はフェノキシ基であり、Ｌ_３はリンカーであり、Ｑはクエンチャーである。脱離基要素は例えば、

【化21】

であり得、式中各Ｙは独立して、電子求引性基または水素である。そのような化合物において、各Ｙは独立してハロゲンまたは水素であり得る。特定の化合物において、Ｌ基は、例えば、

【化22】

である。

【0111】

上記脱離要素のＬ_３リンカー基は、当業者によって理解されるように、任意の好適なリンカーであり得る。特に、Ｌ_３リンカー基は、例えば上記のような、Ｌ_１基であり得る。

【0112】

他の特定の化合物において、Ｌ基は例えば、

【化23】

であり、式中ＲはＱＳＹクエンチャーであり、ｎは１〜８の整数である。特定の実施形態において、ＱＳＹクエンチャーは、例えば、スルホ−ＱＳＹクエンチャーのような、親水性クエンチャーである。

【0113】

いくつかの特定の実施形態において、本開示の化合物は、式（ＩＩ）の構造を有する。

【化24】

【0114】

いくつかのさらに特定の実施形態において、本開示の化合物は、式（ＩＩＩ）の構造を有する。

【化25】

【0115】

これらの実施形態において、ｍおよびｎは独立して１〜１６の整数である。

【0116】

いくつかの実施形態において、ＲはＱＳＹ２１またはスルホ−ＱＳＹ２１であり、ＤはＣｙ５である。

【0117】

本発明の特定の非限定化合物実施形態は、

【化26】

を含み、
式中Ｒ＝ＱＳＹ２１およびｎ＝６、
Ｒ＝スルホ−ＱＳＹ２１およびｎ＝６、
Ｒ＝ＱＳＹ２１およびｎ＝２ならびに
Ｒ＝スルホ−ＱＳＹ２１およびｎ＝２。

【0118】

いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、式（ＩＶ）の構造を有する化合物であって、

【化27】

式中Ｔはペプチド性標的化要素であり、本化合物はさらに、以下の番号付けされたセンテンスにて記述される。
１．式中Ｄ−Ｔ−は短い検出可能ペプチド性基であり、
Ｌ_３はリンカーであり、
Ｑはクエンチャーである、式（ＩＶ）の化合物。
２．検出可能ペプチド性基が、１〜４アミノ酸残基を含む、センテンス１の化合物。
３．Ｄ−Ｔが

【化28】

であり、式中、各ＡＡ_１、ＡＡ_２、ＡＡ_３およびＡＡ_４は独立して、アミノ酸側鎖であるか、−Ｌ_１−Ｄであり、
各Ｒ_Ａは独立して、水素またはＲ_１であり、
Ｒ_Ｂは水素、Ｒ_１、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１、−（Ｃ（Ｏ）ＳＲ_１または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_１）（Ｒ_Ａ）であり、
Ｒ_１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、保護基、または−Ｌ１−Ｄ−であり、必要に応じて１〜３個のＡ基で置換され、
各Ａが独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルカノイル、アルキルアミノ、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、アラルカノイル、アラルクアミノ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルコキシ、ヘテロアラルカノイル、ヘテロアラルクアミノ、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルコキシ、シクロアルカノイル、シクロアルカミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルコキシ、ヘテロシクリルアルカノイル、ヘテロシクリルアルカミノ、ヒドロキシル、チオ、アミノ、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、アルキルカルボキシ、カーボネート、カルバメート、グアニジニル、ウレア、ハロ、トリハロメチル、シアノ、ニトロ、ホスホリル、スルホニル、スルホンアミドまたはアジドであり、Ｌ_１はリンカーである、センテンス２の化合物。
４．各Ｒ_Ａが水素であり、Ｒ_Ｂが−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１である、センテンス３の化合物。
５．Ｄ−Ｔ−が、

【化29】

であり、
各ＡＡ_１およびＡＡ_２が独立して、アミノ酸側鎖または−Ｌ_１−Ｄであり、
各Ｒ_Ａは水素である、センテンス３の化合物。
６．Ｄ−Ｔ−が、

【化30】

各ＡＡ_１、ＡＡ_２およびＡＡ_３は独立して、アミノ酸側鎖またはＬ_１−Ｄであり、
各Ｒ_Ａは水素である、センテンス３の化合物。
７．Ｄ−Ｔが、

【化31】

各ＡＡ_１、ＡＡ_２、ＡＡ_３およびＡＡ_４は独立して、アミノ酸側鎖または−Ｌ_１−Ｄであり、
各Ｒ_Ａは水素である、センテンス３の化合物。
８．Ｌ_１は必要に応じて置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子が必要に応じてヘテロ原子で置換される、センテンス３の化合物。
９．Ｒ_Ｂが−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１である、センテンス３の化合物。
１０．Ｄが蛍光標識、放射標識またはキレータである、センテンス３の化合物。
１１．Ｄが蛍光標識である、センテンス１０の化合物。
１２．蛍光標識が、フルオレセイン、オレゴングリーン、ボラ−ジアザ−インデセン、ローダミンまたはシアニン標識である、センテンス１１の化合物。
１３．蛍光色素がシアニン標識である、センテンス１２の化合物。
１４．シアニン標識がＣｙ５である、センテンス１３の化合物。

【0119】

本化合物のこれらの実施形態において、ＡＡ_１、ＡＡ_２、ＡＡ_３およびＡＡ_４基は独立して、当業者によって理解されるように、任意の天然または非天然アミノ酸側鎖、または基「−Ｌ_１−Ｄ」であり得る。好ましい実施形態において、基は、必要に応じて１〜３個のＡ基で置換されるアラルキルアミノ側鎖である。さらに好ましい実施形態において、基はフェニルアラニンからの側鎖である。他の好ましい実施形態において、基は、任意の組合せで、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基からの側鎖、またはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンまたは他のそのようなアミノ酸残基のようなアルキルアミノ酸残基からの側鎖のような、酸性アミノ酸残基からの側鎖である。リシン、アルギニン、チロシン、グルタミン、アスパラギンなどのような他のアミノ酸残基からの側鎖もまた、本化合物中で好ましい。

【0120】

ＡＡ_１、ＡＡ_２、ＡＡ_３またはＡＡ_４基が、「−Ｌ_１−Ｄ」基である化合物実施形態において、Ｌ_１リンカー成分は、アミノ酸側鎖によって提供され得る。例えば、リシン残基は便利に、好適に活性化された検出可能要素との反応のために、アミノ−アルキル基を提供する。

【0121】

「短い」検出可能ペプチド性基は、１０までのアミノ酸残基を有する検出可能ペプチド性基として、本明細書で定義される。

【0122】

本発明の他の特定の非限定化合物実施形態には、

【化32】

【化33】

が含まれる

【0123】

薬学的組成物
他の様態において、本発明は、本発明の化合物と、薬学的に許容され得る担体を含む薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、例えば、動物における組織のイメージングにて有用であり、さらに、動物内の酵素、例えばプロテアーゼ酵素の活性を査定することにおいて有用である。とりわけ、カセプシンを標識する本発明の化合物に対して、薬学的組成物は、がん細胞の非侵襲性光学イメージングに対するツールとして有用に働き得る。

【0124】

薬学的に許容され得る担体は、本技術分野で周知であり、例えば、水または生理学的緩衝生理食塩水のような水溶液、またはグリコール、グリセロールのような他の溶媒もしくは賦形剤、オリーブ油または注射可能有機エステルのような油が含まれる。特定の実施形態において、そのような薬学的組成物がヒト投与である場合に、水溶液は発熱物質を含まず、または実質的に発熱物質を含まない。賦形剤は、例えば、薬剤の遅延放出に影響を与えるため、または１つまたはそれを超える細胞、組織または器官を選択的に標的化するために選択され得る。薬学的組成物は、錠剤、カプセル、スプリンクルカプセル、顆粒、粉末、シロップ、坐薬、注射などのような、単位剤形であり得る。組成物はまた、経皮伝達系、例えば皮膚パッチ内に存在し得る。

【0125】

薬学的に許容され得る担体は、例えば、本発明の化合物の吸収を安定化させる、または増加させるために働く、生理学的に許容され得る薬剤を含み得る。そのような生理学的に許容され得る薬剤には、例えば、グルコース、スクロースまたはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質または他の安定化剤または賦形剤が含まれる。生理学的に許容され得る薬剤を含む、薬学的に許容され得る担体の選択は、例えば、組成物の投与経路に依存する。薬学的組成物はまた、その中に例えば本発明の化合物を組み込むことができる、リポソームまたは他のポリマーマトリックスを含み得る。例えば、リン脂質または他の脂質からなるリポソームは、作製および投与が比較的単純である、非毒性で、生理学的に許容され得、代謝可能である担体である。

【0126】

語句「薬学的に許容され得る」は、堅実な医学判断の範囲内で、過剰な毒性、炎症、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触しての利用に好適であり、合理的な利益／リスク比でふさわしいものである、化合物、材料、組成物および／または投与形態を意味するために本明細書で使用する。

【0127】

本明細書で使用する場合、語句「薬学的に許容され得る担体」は、１つの器官、または体の部分から、他の器官または体の部分に、対象化合物を運ぶまたは輸送することに関与する、液体または固体充填剤、希釈液、賦形剤、溶媒、または封入材料のような、薬学的に許容され得る材料、組成物または賦形剤を意味する。各担体は、処方の他の成分と適合性であり、患者に有害ではないという点で、「許容され得」なければならない。薬学的に許容され得る担体として働き得る材料のいくつかの例としては、（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖と、（２）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンのようなデンプンと、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなセルロースおよびその誘導体と、（４）粉末化トラガカントと、（５）モルトと、（６）ゼラチンと、（７）タルクと、（８）ココアバターおよび坐薬ワックスのような賦形剤と、（９）ピーナッツ油、木綿油、ヒマワリ油、セサミ油、オリーブ油、コーン油および大豆油のような油と、（１０）プロピレングリコールのようなグリコールと、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールのようなポリオールと、（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステルと、（１３）寒天と、（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤と、（１５）アルギン酸と、（１６）発熱物質を含まない水と、（１７）等張生理食塩水と、（１８）リンガー溶液と、（１９）エチルアルコールと、（２０）リン酸緩衝溶液と、（２１）薬学的処方中で使用される他の非毒性適合基質と、が挙げられる。Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄ．（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ．），２０００を参照のこと。

【0128】

本発明の化合物を含む薬学的組成物は、例えば経口（例えば水性または非水性溶液または懸濁液中のような水薬、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、舌への適用のためのペースト）、舌下、肛門内、直腸内または膣内（例えば、ペサリ、クリームまたは泡として）、（例えば、無菌溶液または懸濁液として、筋肉内、静脈内、皮下または髄膜内を含む）非経口、経鼻、腹腔内、皮下、（例えば、皮膚へ適用するパッチのような）経皮、または（例えば皮膚に適用するクリーム、軟膏またはスプレーとして）局所を含む、任意の多数の投与経路によって対象に投与され得る。化合物はまた、吸入のために処方され得る。特定の実施形態において、本発明の化合物は、単純に滅菌水に溶解または懸濁させることができる。適切な投与経路と、その経路に好適な組成物の詳細は、例えば、米国特許第６，１１０，９７３号明細書、同第５，７６３，４９３号明細書、同第５，７３１，０００号明細書、同第５，５４１，２３１号明細書、同第５，４２７，７９８号明細書、同５，３５８，９７０号明細書、同４，１７２，８９６号明細書ならびに本明細書で引用した特許にて見ることができる。

【0129】

標識化と可視化の方法
他の様態において、本発明は、本発明の組成物を動物に投与する工程を含む、動物における腫瘍を可視化する方法を提供する。

【0130】

また他の様態において、本発明は、本発明の組成物を動物に投与する工程と、カセプシンシステインプロテアーゼと組成物の反応から、動物中に発生した検出可能なシグナルを測定する工程を含む、動物中の腫瘍を可視化する方法を提供し、そこで検出可能なシグナルは、動物内の腫瘍と関連する。

【0131】

方法のいくつかの実施形態において、検出可能なシグナルは、蛍光シグナルである。いくつかの実施形態において、蛍光シグナルは、腫瘍マージンにて発生する。

【0132】

動物へのペプチドイメージング薬剤の投与が、当業者によく理解されている。好ましい実施形態において、任意の他の好適な投与手段が本発明の範囲内であると考えられるけれども、薬剤は注射によって投与される。

【0133】

本発明の方法は、動物内の、プロテアーゼ、とりわけシステインプロテアーゼの標識化、および可視化にて指向する。好適な動物には、とりわけ腫瘍細胞内でシステインプロテアーゼを発現している動物が含まれる。好ましい実施形態において、動物は哺乳動物である。非常に好ましい実施形態において、動物はヒトである。他の好ましい実施形態において、動物は、家畜またはペットである。

【0134】

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、動物内に発生した検出可能なシグナルを測定する工程を含む。検出可能なシグナルを測定する方法としては、イメージング法、例えば蛍光イメージング法が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、蛍光イメージングシステムは、例えば、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ１００システムであるが、任意の好適なイメージングシステムが使用され得る。

【0135】

本明細書で記述する方法および適用に対する他の好適な改変および適合が、本発明またはその任意の実施形態の範囲内から逸脱することなしに実施され得ることは当業者には容易に明白となるであろう。ここで本発明を詳細に記述することで、このことが、例示のみの目的のために本明細書に含まれ、本発明を制限する意図はない、以下の実施例に対する参照によってより明確に理解されるであろう。

【実施例】

【0136】

新規フェノキシメチルケトン（ＰＭＫ）求電子剤を含むクエンチされた蛍光システインカセプシンイメージングプローブの合成および特性化
本研究の目的は、がんの非侵襲性光学イメージングのために使用可能であった既存のｑＡＢＰｓと比較して、全体の改善されたインビボ特性を有するｑＡＢＰを開発することである。したがって、プローブの３つの主要な要素、クエンチャー、リンカーおよび求電子「弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）」を最適化することを決定した。今日までに報告されたシステインカセプシンｑＡＢＰｓの最も大きな障害の１つは、比較的貧弱な水溶性である。スルホネート基をしたがって、水溶性、それによってプローブのバイオ分散を改善するために、ＱＳＹ２１クエンチャー（Ｘｉｎｇら、（２００５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：４１５８−９）に導入した。求電子剤とクエンチャーを結ぶスペーサーの長さはまた、ｑＡＢＰの親油性を減少させるために変化させた。最後に、新規求電子剤を、可能性あるカセプシン標的の範囲を増加させるために調査した。システインカセプシンファミリーの様々なメンバーが、種々のがんにてアップレギュレートされるので（Ｍｏｈａｍｅｄ＆Ｓｌｏａｎｅ（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ（２００６）６：７６４−７５）、腫瘍におけるより明るい蛍光シグナルが、プローブが、広いスペクトルのシステインカセプシン活性を標的化する場合に、予想されるであろう。より汎反応性プローブを得るために、求電子剤の大きさを減少させ、活性を増加させた。２，３，５，６−テトラフルオロ置換フェノキシメチルケトン（ＰＭＫ）求電子剤が、２，６−ジメチル安息香酸誘導アシルオキシメチルケトン（ＡＯＭＫ）と比較して、システインジペプチジルアミノペプチダーゼに対してより大きな反応性を有することは以前に示されている。Ｄｅｕら、（２０１０）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１７：８０８−８１９。より小さな大きさのＰＭＫがまた、システインカセプシンのいくつかの結合溝が、立体的に制限されるので、凡反応性を増加させ得る。Ｂｌｕｍら（２００５）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：２０３−９、Ｂｌｕｍら、（２００７）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：６６８−７７、Ｐａｕｌｉｃｋ＆Ｂｏｇｙｏ（２０１１）ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：５６３−７２。さらに、フェノールエーテルは、エステラーゼによって分解され得るエステル結合を含む、ＡＯＭＫ求電子剤と比較して、インビボにてより安定であると推定される。

【0137】

本研究のための開始点として、ｑＡＢＰ ＧＢ１３７（１）の７つの類似体（２〜８）を合成した。Ｂｌｕｍら、（２００７）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：６６８〜７７。（図１ａ）これらの化合物は、２つの求電子剤、２つのクエンチャーおよび２つのリンカー長の全ての組合せを表す。全てのプローブを、以下のスキーム１に関連した記述にて記述したような最適化、溶液化学反応に基づく手順を用いて合成した。プローブの特異性および強度をまず、無傷のＲＡＷ２６４．７細胞（マウス白血病単球マクロファージ細胞株）を標識化することによって試験した（図１ｂ）。種々の傾向が、プローブの特性において観察された。全てのスルホ−ＱＳＹ２１官能化ｑＡＢＰｓ（２、４、６および８）が、プローブを含むより疎水性のＱＳＹ２１（１、３、５および７）と比較して、より強い総カセプシン標識を示した。興味深いことに、ヘキシルからエチルリンカーまでのスペーサー長における変化は、標識化プロファイルに劇的な影響を持たなかった。おそらく、最も著しい観察は、ＰＭＫ求電子剤を有するｑＡＢＰが、それらのＡＯＭＫカウンターパートと比較して、より広いシステインカセプシン標識化プロファイルを示したことであった。プローブ５〜８は、強固なカセプシンＸ標識化を示し、スルホ−ＱＳＹ２１官能化プローブ６および８は、カセプシンＬのより高分子量プレフォームを標識化可能であった。蛍光標識したカセプシンの同一性を、免疫沈降によって決定した（図４ａ）。生ＲＡＷ細胞での滴定標識化実験を実施するに際して、種々の他の興味深い傾向が観察された（図１ｃ、ｄ、図４ｂ、ｃ）。最も疎水性のｑＡＢＰｓ（１および５）は、０．５μＭで標識化強度の減少した最大値まで達し、これは、それらの減少した水溶性が、より高い濃度でのプローブの沈降をもたらすことを示唆している。より短いスペーサー長は、有益であるように見え、全てのプローブが、それらのヘキシル含有カウンターパートと比較して、より明るい標識化を与えるエチルスペーサーを有する。ＡＯＭＫｓをＰＭＫｓと比較する時に、選択性における明確な差が観察される。ＡＯＭＫ ｑＡＢＰｓはカセプシンＳおよびＬを好ましく標識し、より高い濃度でのみ、カセプシンＢを標識する。驚くべきことに、先の研究で、種々の他の関連するＡＯＭＫｓが、この標的を標識できなかったことが示された（Ｐａｕｌｉｃｋ＆Ｂｏｇｙｏ（２０１１）ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：５６３−７２）けれども、ＡＯＭＫ ｑＡＢＰｓ ２〜４はカセプシンＸを標識する。ＰＭＫ ｑＡＢＰｓはまた、より低いプローブ濃度であっても、等しい強度で、全ての標的システインカセプシンを標識する。一緒に、これらの実験は、親水性の増加が、標識化強度を改善すること、および新規ＰＭＫ ｑＡＢＰｓがより広い、より汎システインカセプシン標識化プロファイルを有すること、を示している。

【0138】

ＰＭＫ ｑＡＢＰ８が、総標識化強度と、広いカセプシン反応性に関して、最も最適であったので、さらなるインビボ研究について、このプローブで進めることを決定した。標的選択性をさらに定義するために、ＲＡＷ細胞溶解物を、ｐＨ５．５での増加濃度のｑＡＢＰ８で標識した。これらの結果は、プローブが、カセプシンＢおよびＸに対して最も強力であり、標識化が５ｎＭ程度の低い濃度で観察されることを示した。しかしながら、全てのカセプシン（Ｂ、Ｓ、Ｌ、Ｘ）の標識化が、５００ｎＭのプローブで飽和した（図２ａ）。プローブを、５００ｎＭの設定濃度にて、生ＲＡＷ細胞の時間経過標識化のために使用した時に、カセプシンＸの急速な飽和が観察され、次いでカセプシンＳ、ＬおよびＢの標識化がよりゆっくりであり、１２０分においてさえ、カセプシンＢ標識化シグナルが増加した（図２ｂ）。これらのデータは、プローブが、おそらく細胞内または細胞表面上のその位置により、カセプシンＸのプールに最も迅速にアクセスすることが可能であろうことを示唆する。カセプシンＢおよびＸが、異なる程度まで、プローブによってアクセスされ得る細胞中の交互の位置であり得ることも示唆される。新規ＰＭＫプローブの安定性を試験するために、ＲＡＷ細胞中の標識化における血清曝露の効果を試験した（図１ｃ）。本来のＡＯＭＫプローブ１への血清前曝露の４時間が、標的標識化のほぼ７０％の欠損をもたらす一方で、標識化の８０％より多くが、ＰＭＫ ｑＡＢＰ８に対して維持された。システインカセプシン阻害剤ＪＰＭ−ＯＥｔでの細胞の前処理がまた、この標識化の９０％より多くをブロックした。ＰＭＫプローブの安定性と改善された標識化特性を考え、生細胞蛍光顕微鏡研究を次に実施した。これらの結果は、プローブが、明るい、特定の標識化シグナルを産出したことと、主要なプローブ標識化カセプシンが、リソソーム中に残ったこととを確認した（図２ｄ）。

【0139】

新規ＰＭＫ求電子剤の陽性の生細胞標識化資質を考え、最もよく実行するＰＭＫ ｑＡＢＰｓ２、６および８を、乳がんの同所性マウスモデルにて試験した。Ｔａｏら、（２００８）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ８：２２８。さらに、これらのＰＭＫプローブを、本来のＡＯＭＫプローブ１と比較した（図３および図５）。４Ｔ１細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウスの、数字２および７乳房脂肪体に埋め込み、腫瘍増殖をモニタした。腫瘍が確立された時に、マウスに、等モル量のｑＡＢＰｓ（２０ｎｍｏｌ）を、尾静脈を通して注射し、Ｃｙ５蛍光を経時的に、非侵襲性にイメージ化した（図３ａ、ｂ）。再び、これらの結果は、ｑＡＢＰ８が、優れていることを証明したことを確かめた。蛍光の強固な腫瘍特異的活性化が、とりわけ、高い総コントラストにて、腫瘍領域で、プローブ８に対して観察可能であった。このシグナルは、時間経過の最後まで、経時的に増加し続けた。最終的に、プローブ８は、プローブ１と比較して、腫瘍特異的蛍光シグナルの２０倍より大きな増強を達成した。良好な腫瘍特異的コントラストがまた、プローブ６に対して観察され、プローブ２に対してより少ない程度観察されたが、両方とも１０倍より大きくまで、プローブ１より大きかった（図５ａ、ｂ）。時間経過の完了後、腫瘍を除去し、腫瘍蛍光をエクスビボにて測定し、続いて均質化と蛍光標識タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を実施した（図３ｃおよび図５ｃ）。エクスビボ蛍光と、総システインカセプシン標識化の定量は、非侵襲性光学イメージング研究にて見られたものと同様の傾向を示した（図３ｄおよび図５ｄ）。プローブ蛍光の細胞供給源を決定するために、プローブ標識マウスからの腫瘍組織切片の免疫蛍光染色を、マクロファージマーカーＣＤ６８を用いて染色した（図３ｅおよび図５ｅ）。Ｃｙ５蛍光はＣＤ６８陽性細胞に対して局在化したが、しかしながら、全てのＣＤ６８陽性細胞がまたプローブ８陽性というわけではなく、これは腫瘍関連マクロファージの異なる活性状態を示唆している。共焦点レーザー走査性顕微鏡（ＣＬＳＭ）によるより詳細な解析により、プローブ８に対して陽性であった全ての細胞が、ＣＤ６８陽性であること、しかしプローブ標識カセプシンとＣＤ６８シグナルは、同一のベシクルに対して共局在しないこと、を確認した（図３ｆおよび図５ｆ）。一緒に考慮すると、これらのデータは、クエンチャーの親水性を増加させることと、スペーサーの短縮化と、より反応性で立体的に制限の少ない求電子トラップの導入とが、広いシステインカセプシン反応性と、インビボ特性の総合的な改善を有するｑＡＢＰをもたらしたことを確認する。

【0140】

非常の異なる機能が、いくつかのシステインカセプシンファミリーメンバーに対して記述されてきたが（Ｃｏｎｕｓ＆Ｓｉｍｏｎ（２０１０）Ｓｗｉｓｓ Ｍｅｄ．Ｗｋｌｙ．１４０：ｗ１３０４２）、他の役割は重複し、１つのカプサイシンの活性の変更が、他の活性に影響を与え得る。例えば、カセプシンＢの欠損は、カセプシンＸの活性増加によって補われ（Ｓｅｖｅｎｉｃｈら、（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：２４９７−５０２）、カセプシンＢのアップレギュレーションが、カセプシンＬのダウンレギュレーションをもたらす（Ｇｏｐｉｎａｔｈａｎら、（２０１２）Ｇｕｔ ６１：８７７−８４）。したがって、１つの実験において多重システインカセプシンのリードアウトを促進し、互いに関して個々のカセプシンの活性比較を可能にするので、広いスペクトルプローブが高く価値がある。そのような汎反応性ＡＢＰｓの実用性は、汎セリンヒドロラーゼフルオロホスホネートプローブ（Ｌｉｕら、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１４６９４−９）および汎反応性プロテアソームプローブＭＶ１５１（Ｖｅｒｄｏｅｓら、（２００６）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：１２１７−２６）によって示されて来た。さらに、ＰＭＫに基づくｑＡＢＰｓは、カセプシンＸに対して非常に反応性であり、それらの足場は、このまだほとんど理解されていないシステインカセプシンに対する選択的ｑＡＢＰｓを産出するために使用可能である（Ｐａｕｌｉｃｋ＆Ｂｏｇｙｏ（２０１１）ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：５６３−７２）。

【0141】

結論として、新規のクラスのクエンチされた蛍光活性に基づくプローブが、先に報告されたＡＯＭＫに基づくプローブと比較して、より大きな反応性と、より広い選択性を有するＰＭＫ求電子剤を有して合成された。ｑＡＢＰの親水性がさらに、スルホン化クエンチャーを導入し、求電子剤とクエンチャーを結ぶスペーサーを短くすることによって増加し、より大きな水溶性と、改善されたインビボ特性をもたらし、がんの非侵襲性光学イメージングにおける増強されたコントラストをもたらす。

【0142】

方法
一般
全ての樹脂および試薬は、商業供給業者から購入し、さらなる精製なしに使用した。使用した全ての溶媒は、ＨＰＬＣグレードであった。全ての水感受性反応を、アルゴンの陽圧下、無水溶媒中で実施した。反応を、ＡＰＩ １５０ＥＸ単一四極子質量分析機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＬＣ−ＭＳによって解析した。逆相ＨＰＬＣを、Ｃ１８カラムを用いて、ÅＫＴＡエクスプローラ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にて実施した。パルス場勾配アクセサリを備えたＶａｒｉａｎ ４００ＭＨｚ（４００／１００）、Ｖａｒｉａｎ ５００ＭＨｚ（５００／１２５）またはＶａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ６００ＭＨｚ（６００／１５０ＭＨｚ）上でＮＭＲスペクトルを記録した。化学シフトは、内部標準としてテトラメチルシランに対して、ｐｐｍ（δ）で与える。カップリング定数をＨｚで示す。蛍光ゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００フラットベッドレーザースキャナ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてスキャンした。インゲル標識化強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて定量した。統計解析を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを用いて実施し、ｓ．ｅ．ｍ．を、ｓ．ｄ．をｎの平方根によって割ることによって計算した。蛍光顕微鏡イメージを、１０×、４０×および６３×対物レンズを備えるＺｅｉｓｓ共焦点ＬＳＭ７１０およびＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ逆顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）上で取得した。顕微鏡およびカメラを制御するために、そしてデータ解析（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）のために、スライドブックソフトウェアを使用した。

【0143】

ｑＡＢＰ合成
以下の化合物の合成のための合成スキームを、スキーム１にて以下に描写する。

【0144】

安息香酸２，６−ジメチル−４−（（６−（トリチルアミノ）ヘキシル）カルバモイル）（１１ａ）。モノ−トリチル１，６−ジアミノヘキサン酢酸塩（９ａ）（１１７．２ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ中に取り、飽和水性ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、真空下で濃縮した。アミンをＤＭＦ中に溶解し、ＨＯＢｔ一水和物（４３ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１当量）、ＥＤＣ（５４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１当量）、および２，６−ジメチルテレフタル酸（１０）（５４．４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１当量）を加え、反応混合物を一晩撹拌して、次いで真空にて濃縮した。未精製物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）によって精製し、続いてＤＣＭ中に取り、水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させて、７０ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ、４７％単離収率）を得た。

【0145】

安息香酸２，６−ジメチル−４−（（２−（トリアミノ）エチル）カルバモイル）（１１ｂ）。モノ−トリチルエチレンジアミン酢酸塩（９ｂ）（９７．９ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）をＤＣＭに取り、飽和水性ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、真空下で濃縮した。アミンをＤＭＦ中に溶解し、ＨＯＢｔ一水和物（４３ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１．０４当量）、ＥＤＣ（６１ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、１．２当量）および２，６−ジメチルテトラフタル酸（１０）（５２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１当量）を加え、反応混合物を一晩撹拌し、次いで真空下濃縮した。未精製物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）によって精製し、続いてＤＣＭ中に取り、水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させて、２８ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ、２２％単離収率）を得た。

【0146】

２，３，５，６−テトラフルオロ−４−ヒドロキシ−Ｎ−（６−（トリチルアミノ）ヘキシル）ベンズアミド（１３ａ）。モノ−トリチル１，６−ジアミノヘキサン酢酸塩（９ａ）（１１７．２ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ中に取り、飽和水性ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、真空下で濃縮した。アミンをＤＭＦ中に溶解し、ＨＯＢｔ一水和物（４３ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１当量）、ＥＤＣ（５４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１当量）および２，３，５，６−テトラフルオロ−４−ヒドロキシ安息香酸（１２）（５９ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１当量）を加え、反応混合物を一晩撹拌し、次いで真空下濃縮した。未精製物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中１５％→３０％酢酸エチル）によって精製して、９０ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ、５８％単離収率）を得た。

【0147】

２，３，５，６−テトラフルオロ−４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−（トリチルアミノ）エチル）ベンズアミド（１３ｂ）。モノ−トリチルエチレンジアミン酢酸塩（９ｂ）（１００ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ中に取り、飽和水性ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、真空下で濃縮した。アミンをＤＭＦ中に溶解し、ＨＯＢｔ一水和物（４３ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１当量）、ＥＤＣ（５４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１当量）および２，３，５，６−テトラフルオロ−４−ヒドロキシ安息香酸（１２）（５９ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１当量）を加え、反応混合物を一晩撹拌し、次いで真空下濃縮した。未精製物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中２０％→３５％酢酸エチル）によって精製して、９０ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ、６５％単離収率）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ＝ ８．７７ （ｔ， Ｊ＝６．０， １Ｈ）， ７．３９ （ｄ， Ｊ＝７．８， ６Ｈ）， ７．２７ （ｔ， Ｊ＝７．７， ６Ｈ）， ７．１７ （ｔ， Ｊ＝７．２， ３Ｈ）， ３．４０ − ３．３５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８６ − ２．７７ （ｍ， １Ｈ）， ２．１４ − ２．０４ （ｍ， ２Ｈ）．

【化34】

スキーム１ 試薬および条件：ｉ．ＥＤＣ、ＨＯＢｔ、ＤＭＦ。ｉｉ．ａ）ＫＦ、ＤＭＦ。ｂ）１％ＴＦＡ、ＤＣＭ。ｉｉｉ．ａ）ＱＳＹ２１−ＮＨＳまたはスルホ−ＱＳＹ２１−ＮＨＳ、ＤｉＰＥＡ、ＤＭＳＯ。ｂ）ＴＦＡ／ＤＣＭ＝１／１。ｃ）Ｃｙ５−ＮＨＳ、ＤｉＰＥＡ、ＤＭＳＯ。ｉｖ．ａ）ＫＦ、ＤＭＦ、８０°Ｃ。ｂ）１％ＴＦＡ、ＤＣＭ。

【0148】

中間体１５。フッ化カリウム（３ｍｇ、５２μｍｏｌ、３当量）を、５分間の超音波処理によってＤＭＦ中に懸濁し、その後カルボン酸１１ａ（１０ｍｇ、１９μｍｏｌ、１．１当量）を加えた。反応混合物を、クロロメチルケトン１４（９．７ｍｇ、１７．３μｍｏｌ、１当量）を加える前に、１０分間撹拌した。２時間後、反応混合物を真空下で濃縮し、未精製物をＤＣＭ中１％ＴＦＡ中に取り、３０分間撹拌し、その後に溶液が無色であるまで、トリイソプロピルシランの添加によってクエンチした。トルエンとの共沸（３×）の後、表題化合物を、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、１５：８５〜５５：４５、５ｍＬ／分）によって精製、次いで凍結乾燥して、白色粉末（３．１２ｍｇ、３．４６μｍｏｌ、２段階にわたり２０％）として１５を得た。

【0149】

中間体１６。フッ化カリウム（３ｍｇ、５２μｍｏｌ、３当量）を、５分間の超音波処理によってＤＭＦ中に懸濁し、その後カルボン酸１１ｂ（９．５ｍｇ、２０μｍｏｌ、１．１当量）を加えた。反応混合物を、クロロメチルケトン１４（１０ｍｇ、１７．９μｍｏｌ、１当量）を加える前に、１０分間撹拌した。１．５時間後、反応混合物を真空下で濃縮し、未精製物をＤＣＭ中１％ＴＦＡ中に取り、３０分間撹拌し、次いで溶液が無色に変わるまで、トリイソプロピルシランの添加によってクエンチした。トルエンとの共沸（３×）の後、中間体１６を、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、１５：８５〜５５：４５、５ｍＬ／分）によって精製、続いて凍結乾燥して、白色粉末（３．９９ｍｇ、４．５７μｍｏｌ、２段階にわたり２６％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ） δ ７．８０ （ｓ， １Ｈ）， ７．４２ （ｓ， １Ｈ）， ７．３５ − ７．１８ （ｍ， １０Ｈ）， ５．０６ （ｓ， ２Ｈ）， ４．８５ − ４．７８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４２ （ｄｄ， Ｊ ＝ １３．１， ６．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．１， ４．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．１８ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．１２ （ｄｄ， Ｊ ＝ １３．７， ７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．０１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ １３．６， ８．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．４１ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３４ （ｓ， ３Ｈ）， １．９２ − １．８２ （ｍ， １Ｈ）， １．６７ − １．５７ （ｍ， １Ｈ）， １．４９ − １．２６ （ｍ， ４Ｈ）， １．４２ （ｓ， ９Ｈ）．

【0150】

中間体１７。フッ化カリウム（６．３ｍｇ、１０８μｍｏｌ、３当量）を、５分間の超音波処理によってＤＭＦ中に懸濁し、その後フェノール１３ａ（２１．５ｍｇ、３９μｍｏｌ、１．１当量）を加えた。反応混合物を、クロロメチルケトン１４（２０ｍｇ、３６μｍｏｌ、１当量）を加える前に、１０分間撹拌した。反応混合物を８０℃にて５時間撹拌し、真空下濃縮した。未精製物をＤＣＭ中１％ＴＦＡ中に取り、３０分間撹拌し、次いで溶液が無色に変わるまで、トリイソプロピルシランの添加によってクエンチした。トルエンとの共沸（３×）の後、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、２５：７５〜７０：３０、５ｍＬ／分）によって精製、続いて凍結乾燥して、白色粉末（１６．６ｍｇ、１７．５μｍｏｌ、２段階にわたり４９％）として、表題化合物を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ） δ ７．２９ （ｍ ， １０Ｈ）， ５．０７ （ｓ， ２Ｈ）， ４．８６ （ｍ ， ２Ｈ）， ４．４４ （ｍ ， ２Ｈ）， ３．４１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８， ２Ｈ）， ３．１０ （ｄｄ， Ｊ ＝ １３．５， ７．０， １Ｈ）， ３．０２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８， ２Ｈ）， ２．９７ − ２．９１ （ｍ， ３Ｈ）， １．９３ − １．８１ （ｍ， １Ｈ）， １．７３ − １．６２ （ｍ， ４Ｈ）， １．６２ − １．５３ （ｍ， １Ｈ）， １．５１ − １．４６ （ｍ， ４Ｈ）， １．４３ （ｓ， ９Ｈ）， １．４５ − １．２５ （ｍ， ４Ｈ）．

【0151】

中間体１８。フッ化カリウム（６．３ｍｇ、１０８μｍｏｌ、３当量）を、５分間の超音波処理によってＤＭＦ中に懸濁し、その後フェノール１３ｂ（１９．４ｍｇ、３９μｍｏｌ、１．１当量）を加えた。反応混合物を、クロロメチルケトン１４（２０ｍｇ、３６μｍｏｌ、１当量）を加える前に、１０分間撹拌した。反応混合物を８０℃にて３時間撹拌し、真空下濃縮した。未精製物をＤＣＭ中１％ＴＦＡ中に取り、３０分間撹拌し、次いで溶液が無色に変わるまで、トリイソプロピルシランの添加によってクエンチした。トルエンとの共沸（３×）の後、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、２０：８０〜６０：４０、５ｍＬ／分）によって精製、続いて凍結乾燥して、白色粉末（１５．４ｍｇ、１７．３μｍｏｌ、２段階にわたり４８％）として、表題化合物を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ） δ ＝ ７．３６ − ７．１２ （ｍ， １０Ｈ）， ５．０５ （ｓ， ２Ｈ）， ４．８６ − ４．８１ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４２ − ４．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６４ （ｔ， Ｊ＝６．５， ２Ｈ）， ３．１４ （ｔ， Ｊ＝６．５， ２Ｈ）， ３．０８ （ｄｄ， Ｊ＝１３．９， ７．２， １Ｈ）， ２．９９ （ｔ， Ｊ＝６．５， ２Ｈ）， ２．９１ （ｄｄ， Ｊ＝１３．９， ８．４， １Ｈ）， １．９０ − １．７８ （ｍ， １Ｈ）， １．６２ − １．４８ （ｍ， １Ｈ）， １．４１ （ｓ， ９Ｈ）， １．４６ − １．２０ （ｍ， ４Ｈ）．

【0152】

プローブ１（ＧＢ１３７）。中間体１５（１．５ｍｇ、１．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５０μｌ）中に取り、ＱＳＹ２１−ＮＨＳ（１．３９ｍｇ、１．７μｍｏｌ、１当量）とＤｉＰＥＡ（１．５μｌ、８．５μｍｏｌ、５当量）とを加えた。１時間後、ＱＳＹ２１アミドを、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、４０：６０〜８０：２０、５ｍＬ／分）、続いて凍結乾燥によって精製した。Ｂｏｃ保護基を除去するために、得られた暗青粉末をＴＦＡ／ＤＣＭ（１／１）中に取り、トルエンとの共沸（３×）前に、３０分間反応させ、２．４２ｍｇの相当するＴＦＡ塩（１．６μｍｏｌ、２段階にわたり９５％）を得た。アミンをＤＭＳＯ（５０μｌ）中に溶解し、Ｃｙ５−ＮＨＳ（１．３ｍｇ、１．７６μｍｏｌ、１．１当量）と、ＤｉＰＥＡ（１．４μｌ、８μｍｏｌ、５当量）とを加えた。１時間後、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、４０：６０〜７５：２５、５ｍＬ／分）による精製、続いて凍結乾燥で、プローブ１を暗青粉末（２．０ｍｇ、０．９９μｍｏｌ、６２％）として得た。

【0153】

プローブ２（ＢＭＶ１２２）。中間体１５（１．５ｍｇ、１．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５０μｌ）中に取り、スルホ−ＱＳＹ２１−ＮＨＳ（１．６６ｍｇ、１．７μｍｏｌ、１当量）とＤｉＰＥＡ（１．５μｌ、８．５μｍｏｌ、５当量）とを加えた。１時間後、スルホ−ＱＳＹ２１アミドを、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、３０：７０〜７０：３０、５ｍＬ／分）によって精製、続いて凍結乾燥した。Ｂｏｃ保護基を除去するために、得られた暗青粉末をＴＦＡ／ＤＣＭ（１／１）中に取り、トルエンとの共沸（３×）前に、３０分間反応させ、２．２９ｍｇの相当するＴＦＡ塩（１．３９μｍｏｌ、２段階にわたり８１％）を得た。アミンをＤＭＳＯ（５０μｌ）中に溶解し、Ｃｙ５−ＮＨＳ（１．１ｍｇ、１．５μｍｏｌ、１．１当量）と、ＤｉＰＥＡ（１．２μｌ、７μｍｏｌ、５当量）とを加えた。１時間後、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、１５：８５〜５０：５０、５ｍＬ／分）による精製、続いて凍結乾燥で、プローブ２を暗青粉末（１．８３ｍｇ、０．８４μｍｏｌ、６１％）として得た。

【0154】

プローブ３（ＢＭＶ１４５）。中間体１６（１．５ｍｇ、１．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５０μｌ）中に取り、ＱＳＹ２１−ＮＨＳ（１．３９ｍｇ、１．７μｍｏｌ、１当量）とＤｉＰＥＡ（１．５μｌ、８．５μｍｏｌ、５当量）とを加えた。１時間後、ＱＳＹ２１アミドを、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、４０：６０〜８０：２０、５ｍＬ／分）によって精製、続いて凍結乾燥した。Ｂｏｃ保護基を除去するために、得られた暗青粉末をＴＦＡ／ＤＣＭ（１／１）中に取り、トルエンとの共沸（３×）前に、３０分間反応させ、０．８６ｍｇの相当するＴＦＡ塩（０．６μｍｏｌ、２段階にわたり３５％単離収率）を得た。アミンをＤＭＳＯ（５０μｌ）中に溶解し、Ｃｙ５−ＮＨＳ（０．５ｍｇ、０．６６μｍｏｌ、１．１当量）と、ＤｉＰＥＡ（０．５７μｌ、３．３μｍｏｌ、５当量）とを加えた。１時間後、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、４０：６０〜７５：２５、５ｍＬ／分）による精製、続いて凍結乾燥で、プローブ３を暗青粉末（０．６７ｍｇ、０．３４μｍｏｌ、５７％）として得た。

【0155】

プローブ４（ＢＭＶ１４６）。中間体１６（１．０ｍｇ、１．２μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５０μｌ）中に取り、スルホ−ＱＳＹ２１−ＮＨＳ（１．２５ｍｇ、１．２μｍｏｌ、１当量）とＤｉＰＥＡ（１．０５μｌ、６μｍｏｌ、５当量）とを加えた。１時間後、スルホ−ＱＳＹ２１アミドを、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、２０：８０〜８０：２０、５ｍＬ／分）によって精製、続いて凍結乾燥した。Ｂｏｃ保護基を除去するために、得られた暗青粉末をＴＦＡ／ＤＣＭ（１／１）中に取り、トルエンとの共沸（３×）前に、３０分間反応させ、１．０６ｍｇの相当するＴＦＡ塩（０．６６μｍｏｌ、２段階にわたり５５％）を得た。アミンをＤＭＳＯ（５０μｌ）中に溶解し、Ｃｙ５−ＮＨＳ（０．５５ｍｇ、０．７３μｍｏｌ、１．１当量）と、ＤｉＰＥＡ（０．６４μｌ、３．６５μｍｏｌ、５当量）とを加えた。１時間後、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、１５：８５〜５０：５０、５ｍＬ／分）による精製、続いて凍結乾燥で、プローブ４を暗青粉末（０．６３ｍｇ、０．３μｍｏｌ、４５％）として得た。

【0156】

プローブ５（ＢＭＶ１１８）。中間体１７（１．２ｍｇ、１．３μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５０μｌ）中に取り、ＱＳＹ２１−ＮＨＳ（１．０ｍｇ、１．３μｍｏｌ、１当量）とＤｉＰＥＡ（１．１３μｌ、６．５μｍｏｌ、５当量）とを加えた。２時間後、ＱＳＹ２１アミドを、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、４０：６０〜８０：２０、５ｍＬ／分）によって精製、続いて凍結乾燥した。Ｂｏｃ保護基を除去するために、得られた暗青粉末をＴＦＡ／ＤＣＭ（１／１）中に取り、トルエンとの共沸（３×）前に、３０分間反応させ、２．０ｍｇの相当するＴＦＡ塩（１．３μｍｏｌ、２段階にわたり定量的）を得た。アミンをＤＭＳＯ（５０μｌ）中に溶解し、Ｃｙ５−ＮＨＳ（１．０ｍｇ、１．３μｍｏｌ、１当量）と、ＤｉＰＥＡ（１．１μｌ、６．５μｍｏｌ、５当量）とを加えた。１時間後、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、４０：６０〜８５：１５、５ｍＬ／分）による精製、続いて凍結乾燥で、プローブ５を暗青粉末（１．９１ｍｇ、０．９４μｍｏｌ、７２％）として得た。

【0157】

プローブ６（ＢＭＶ１１９）。中間体１７（１．２ｍｇ、１．３μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５０μｌ）中に取り、スルホ−ＱＳＹ２１−ＮＨＳ（１．３５ｍｇ、１．３μｍｏｌ、１当量）とＤｉＰＥＡ（１．１３μｌ、６．５μｍｏｌ、５当量）とを加えた。１時間後、スルホ−ＱＳＹ２１アミドを、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、３０：７０〜９０：１０、５ｍＬ／分）によって精製、続いて凍結乾燥した。Ｂｏｃ保護基を除去するために、得られた暗青粉末をＴＦＡ／ＤＣＭ（１／１）中に取り、トルエンとの共沸（３×）前に、３０分間反応させ、１．９８ｍｇの相当するＴＦＡ塩（０．９μｍｏｌ、２段階にわたり７０％）を得た。アミンをＤＭＳＯ（５０μｌ）中に溶解し、Ｃｙ５−ＮＨＳ（０．７ｍｇ、０．９μｍｏｌ、１．１当量）と、ＤｉＰＥＡ（０．８μｌ、４．５μｍｏｌ、５当量）とを加えた。１時間後、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、１５：８５〜５０：５０、５ｍＬ／分）による精製、続いて凍結乾燥で、プローブ６を暗青粉末（１．６３ｍｇ、０．７４μｍｏｌ、８２％）として得た。

【0158】

プローブ７（ＢＭＶ１０８）。中間体１８（１．２ｍｇ、１．３μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５０μｌ）中に取り、ＱＳＹ２１−ＮＨＳ（１．２ｍｇ、１．４μｍｏｌ、１．１当量）とＤｉＰＥＡ（１．１３μｌ、６．５μｍｏｌ、５当量）とを加えた。１時間後、ＱＳＹ２１アミドを、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、３０：７０〜７０：３０、５ｍＬ／分）によって精製、続いて凍結乾燥して、暗青粉末（１．４３ｍｇ、０．９９μｍｏｌ、７６％）を得た。続いて、トルエンとの共沸（３×）前に、Ｂｏｃ保護基をＴＦＡ／ＤＣＭ（１／１）中で３０分間除去した。ＴＦＡ塩を、ＤＭＳＯ（５０μｌ）中に溶解し、Ｃｙ５−ＮＨＳ（０．８３ｍｇ、１．１μｍｏｌ、１．１当量）と、ＤｉＰＥＡ（０．８８μｌ、５μｍｏｌ、５当量）とを加えた。１時間後、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、３０：７０〜７０：３０、５ｍＬ／分）による精製、続いて凍結乾燥で、プローブ７を暗青粉末（０．９５ｍｇ、０．４８μｍｏｌ、２段階にわたり４９％）として得た。

【0159】

プローブ８（ＢＭＶ１０９）。中間体１８（５．８ｍｇ、６．５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１００μｌ）中に溶解した、スルホ−ＱＳＹ２１−ＮＨＳ（９．７５ｍｇ、１０．３９μｍｏｌ、１．６当量）とＤｉＰＥＡ（８．４μｌ、５０．５μｍｏｌ、７．８当量）を加え、混合液を一晩撹拌した。スルホ−ＱＳＹ２１アミドを、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、２５：７５〜５５：４５、５ｍＬ／分）によって精製、続いて凍結乾燥して、暗青粉末を得た。Ｂｏｃ保護基を、トルエン（３×）での共沸の前に、続けてＴＦＡ／ＤＣＭ（１／１）において３０分間除去した。残余物をＤＭＳＯ（２５０μｌ）中に溶解し、Ｃｙ５−ＮＨＳ（１０．５ｍｇ、１３．９μｍｏｌ、２．１当量）と、ＤｉＰＥＡ（１２μｌ、７２μｍｏｌ、１１当量）とを加えた。４時間後、ＨＰＬＣ（プレパラトリー逆相Ｃ_１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ０．１％ＴＦＡ、２０分かけて、２５：７５〜４５：５５、５ｍＬ／分）による精製、続いて凍結乾燥で、プローブ８を暗青粉末（７．７４ｍｇ、４．６１μｍｏｌ、３段階にわたり７１％）として得た。^１Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＣＮ） δ ８．１２ − ８．０８ （ｍ， １Ｈ）， ８．０１ − ７．９３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．８９ − ７．８５ （ｍ， ２Ｈ）， ７．７５ （ｄｄ， Ｊ ＝ １２．０， １．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．７２ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， １．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．３， １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６６ （ｓ， ２Ｈ）， ７．６２ − ７．５７ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ５．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４６ （ｄ， Ｊ ＝ ９．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４１ − ７．３５ （ｍ， ３Ｈ）， ７．２４ （ｓ， １Ｈ）， ７．２２ （ｓ， １Ｈ）， ７．２１ − ７．１４ （ｍ， ６Ｈ）， ７．１３ − ７．０９ （ｍ， ６Ｈ）， ７．０５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．８， ４．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．３９ （ｔ， Ｊ ＝ １２．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．１１ （ｔ， Ｊ ＝ １２．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８７ （ｑ， Ｊ ＝ １２．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．８３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ３９．７， １４．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．２３ − ４．１２ （ｍ， ４Ｈ）， ３．９３ （ｑ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８６ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．７， ４．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．２８ − ３．１５ （ｍ， ９Ｈ）， ３．０４ − ２．９２ （ｍ， ３Ｈ）， ２．８０ − ２．７４ （ｍ， １Ｈ）， ２．４５ （ｔ， Ｊ ＝ １１．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１５ − ２．０９ （ｍ， １Ｈ）， ２．０９ − ２．０３ （ｍ， ２Ｈ）， １．７４ − １．５８ （ｍ， ７Ｈ）， １．５７ （ｓ， ６Ｈ）， １．５５ （ｓ， ６Ｈ）， １．４９ （ｄｄ， Ｊ ＝ １５．１， ７．４ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．３５ − １．２２ （ｍ， ７Ｈ）， １．２０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．１６ − １．１２ （ｍ， ４Ｈ）．

【0160】

生細胞および細胞溶解物の細胞培養と標識化
ＲＡＷ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ）、１００ユニット／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を補足したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。４Ｔ１細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ）、１００ユニット／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を補足したＲＰＭＩ（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。全ての細胞を、５％ ＣＯ_２加湿インキュベータ中、３７℃で培養した。無傷細胞標識化のために、他に言及しない限り、細胞を、培養培地中、プローブ（ＤＭＳＯ中５００×）に曝露し、３７℃にて２時間インキュベートした。示したところで、細胞を１時間、阻害剤ＪＰＭ−ＯＥｔ（ＤＭＳＯ中５００×）とともに前インキュベートするか、細胞添加の前に、４時間、マウス血清（９μｌ血清に加えたＤＭＳＯ中１μｌプローブストック溶液）に曝露した。標識化の後、細胞をＰＢＳにて洗浄し、低張溶解緩衝液（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭ ＤＴＴおよび１％ ＮＰ−４０）中に再懸濁させ、１５分間氷上に置き、４℃にて３０分間遠心し、上清を回収し、タンパク質濃度を、ＢＣＡキット（ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。４０μｇの総タンパク質を、４×ＳＤＳ−試料緩衝液の添加と、３分間１００℃での加熱によって変性させ（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｂｅ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）によって分解し、標識化プロテアーゼを、Ｔｙｐｈｏｏｎイメージャ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にてゲルをスキャンすることによって可視化した。標識化強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて定量化した。細胞溶解物中のカセプシン標識化のために、細胞を回収し、ＰＢＳにて洗浄し、クエン酸緩衝液（５０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ５．５、５ｍＭ ＤＤＴ、０．５％ＣＨＡＰＳ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ）中に再懸濁させた。氷上で１５分、および４℃にて３０分間の遠心の後、上清を集め、タンパク質濃度を、ＢＣＡキット（ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。４０μｇの総タンパク質を、示唆したプローブ（ＤＭＳＯ中２００×）に対して、１時間３７℃で曝露した。４×ＳＤＳ−試料緩衝液を加え、タンパク質を、１００℃にて３分間変性させ、上記のように解析した。生細胞顕微鏡のために、ＲＡＷ細胞を、フェノールレッドを含まない完全培地中、１・１０^５細胞の密度で、３５ｍｍガラス底ディッシュ（インビトロ科学的）中に播き、一晩培養した。細胞を、ＤＭＳＯまたは１μＭプローブ（ＤＭＳＯ中５００×）いずれかに２時間曝露した。最後の１時間、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ−グリーン（２００ｎＭ最終濃度、ＤＭＳＯ中１０００×）を細胞に加えた。示したところで、細胞を、阻害剤ＪＰＭ−ＯＥｔ（ＤＭＳＯ中５００×）とともに１時間前インキュベートした。細胞を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ共焦点顕微鏡を用いて４０×にて、Ｃｙ５およびＦＩＴＣチャンネルにてイメージ化した。

【0161】

動物モデル
全ての動物取扱および実験を、現Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅガイドラインにしたがって実施した。メスＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、イソフラン麻酔下、ＰＢＳ中１・１０^５ ４Ｔ１細胞（ＡＴＣＣ）で、脂肪体番号２および７に注射し、腫瘍増殖をモニタした。イメージングの２４時間前に、対象領域の毛を、「Ｎａｉｒローション」を用いて除去した。１０日目に、指定したプローブ（２０ｎｍｏｌ、０．８ｎｍｏｌ ｇ^−１）を、１００μＬ容量（ＰＢＳ中２０％ＤＭＳＯ）中、尾静脈を介して投与した。注射の後、マウスを、ＩＶＩＳ１００システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて、指定した時間点にて、非侵襲性にイメージ化した。イメージを、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にて解析した。最終点の後、マウスをイソフルオランで麻酔し、頸椎脱臼によって殺した。エクスビボ蛍光測定と、インビボプローブ標識化プロファイルの査定のために、腫瘍を取り除き、ＦＭＴ２５００（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてイメージ化し、組織を、クエン酸緩衝液（５０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ５．５、５ｍＭ ＤＤＴ、０．５％ ＣＨＡＰＳ、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ）中で超音波処理した（氷上１分間）。４℃にて３０分間の遠心の後、上清を回収し、タンパク質濃度をＢＣＡキット（ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。４０μｇの総タンパク質を、ＳＤＳ−試料緩衝液中、１００℃にて３分間変性させ、上記のように解析した。免疫蛍光に関して、切除された腫瘍を、ＰＢＳ中４％ ＰＦＡ溶液中で、４℃にて６時間インキュベートし、続いて３０％スクロース溶液中で一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）インキュベートし、ＯＣＴ培地中で組織を（ｆｏ）凍結した。６−μｍ切片をアセトンで固定し、ＰＮＢブロッキング緩衝液でブロックし、ラット抗−マウスＣＤ６８（１：１０００、Ｓｅｒｏｔｅｃ）と一晩インキュベートした。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８と共役したヤギ抗−ラット（１：５００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温にて１時間インキュベートした。切片を次いで、ＤＡＰＩ（２μｇ／ｍＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、５分間染色し、次いでＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマウントした。組織を次いで、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡を用いて可視化した。

【0162】

全ての特許、特許発行物、および本明細書で言及された他の発行された参照は、それぞれが、個々に、そして特異的に、本明細書に参照として組み込まれるように、それら全てが、参照によって本明細書に組み込まれている。

【0163】

特定の実施例が提供された一方で、以上の記述は、例示的であり、制限ではない。先に記述された実施形態の任意の１つまたはそれを超える特徴が、任意の様式にて、本発明の任意の他の実施形態の１つまたはそれを超える特徴と組合せることが可能である。さらに、本発明の多くのバリエーションが、本明細書を概説するに際して、当業者に明らかになるであろう。本発明の範囲はしたがって、それらの等価物の完全な範囲とともに、添付の請求項に対する参照によって決定されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】