特許 6491277 正電荷有機添加剤での処理によるタンパク質製剤におけるタンパク質−不純物複合体及び凝集体のレベルを低下させるための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6491277

(24)【登録日】2019年3月8日

(45)【発行日】2019年3月27日

(54)【発明の名称】正電荷有機添加剤での処理によるタンパク質製剤におけるタンパク質−不純物複合体及び凝集体のレベルを低下させるための方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/00 20060101AFI20190318BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/00

【請求項の数】45

【外国語出願】

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2017-143236(P2017-143236)

(22)【出願日】2017年7月25日

(62)【分割の表示】特願2015-514965(P2015-514965)の分割

【原出願日】2013年2月6日

(65)【公開番号】特開2017-222699(P2017-222699A)

(43)【公開日】2017年12月21日

【審査請求日】2017年7月25日

(31)【優先権主張番号】61/653,752

(32)【優先日】2012年5月31日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504354117

【氏名又は名称】エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ

(74)【代理人】

【識別番号】100116872

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 和子

(72)【発明者】

【氏名】ガグノン ピーター

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭６１−００１３９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５２２０５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０４０２１６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表平１１−５０１０４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Curr. Pharmaceut. Biotech., 2009年，Vol.10，p.400-407

【文献】 Analytical Biochem., 2003年，Vol.316，p.223-231

【文献】 J. Biotechnol., 1999年，Vol.72，p21-31

【文献】 J. Biol. Chem., 1956年，Vol.218，p.1-7

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体と抗体を含む凝集物とを含むサンプル中の凝集物を低下させる方法であって、
（ｉ）０．１％（重量／体積）以下の正電荷有機添加剤を前記サンプル中に加えること、及び
（ｉｉ）０．５６％〜１％（重量／体積）、１〜２％（重量／体積）、２〜５％（重量／体積）、５〜１０％（重量／体積）又は１０〜１５％（重量／体積）の範囲の濃度のアラントインをサンプル中に加えることを含み、
前記アラントインを加えた後、前記サンプルは未溶解のアラントインを含み、前記サンプルはアラントインで過飽和である、前記方法。

【請求項2】

前記正電荷有機添加剤がエタクリジン、クロルヘキシジン、及びポリエチレンイミンからなる群から選択される１種を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記アラントインが前記正電荷有機添加剤の前に添加される、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記正電荷有機添加剤が０．０１％（重量／体積）以下のレベルで加えられる、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記正電荷有機添加剤が０．００１％（重量／体積）以下のレベルで加えられる、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記正電荷有機添加剤が、０．０２％〜０．０３％の濃度で加えられる、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記サンプルに２種類以上の正電荷有機添加剤が加えられる、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記２種類以上の正電荷有機添加剤の濃度が１％（重量／体積）以下である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記２種類以上の正電荷有機添加剤の濃度が０．１％（重量／体積）以下である、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記２種類以上の正電荷有機添加剤の濃度が０．０１％（重量／体積）以下である、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記２種類以上の正電荷有機添加剤の濃度が０．００１％（重量／体積）以下である、請求項７に記載の方法。

【請求項12】

前記サンプルの電気伝導率が、１５ｍＳ／ｃｍ以上に調整される、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記サンプルの電気伝導率が、２０ｍＳ／ｃｍ以上に調整される、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記サンプルの電気伝導率が、２５ｍＳ／ｃｍ以上に調整される、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記サンプルの電気伝導率が、３０ｍＳ／ｃｍ以上に調整される、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記サンプルの電気伝導率が、３５ｍＳ／ｃｍ以上に調整される、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記正電荷有機添加剤の添加の前に、前記サンプルの電気伝導率が調整される、請求項１２〜１６の何れか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記サンプルに有機溶媒が加えられる、請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記有機溶媒が、エタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、リン酸トリ（ｎ−ブチル）、及びグリセロールからなる群から選択される１種を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記有機溶媒が０．０１〜２０％（重量／体積）の範囲の濃度で加えられる、請求項１８又は１９に記載の方法。

【請求項21】

エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、エタノール、イソプロパノール、又はリン酸トリ（ｎ−ブチル）を含む有機溶媒が０．０１〜１％の範囲の濃度で加えられる、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、エタノール、又はイソプロパノールを含む有機溶媒が１〜５％の範囲の濃度で加えられる、請求項１８に記載の方法。

【請求項23】

エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、エタノール、又はイソプロパノールを含む有機溶媒が５〜１０％の範囲の濃度で加えられる、請求項１８に記載の方法。

【請求項24】

エチレングリコール、プロピレングリコール、又はグリセロールを含む有機溶媒が１０〜２０％の範囲の濃度で加えられる、請求項１８に記載の方法。

【請求項25】

有機溶媒が、エタノール、イソプロパノール、及びリン酸トリ（ｎ−ブチル）からなる群から選択される１種である、請求項１８に記載の方法。

【請求項26】

前記有機溶媒が１％未満の濃度で加えられる、請求項２５記載の方法。

【請求項27】

前記有機溶媒が０．１％未満の濃度で加えられる、請求項２５又は２６に記載の方法。

【請求項28】

前記有機溶媒が０．０１％未満の濃度で加えられる、請求項２５〜２７の何れか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記サンプルに界面活性剤が加えられる、請求項１〜２８の何れか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記界面活性剤が非イオン性の界面活性剤を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記非イオン性の界面活性剤が、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）及びトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）からなる群から選択される１種を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記界面活性剤が双性イオンの界面活性剤を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記双性イオンの界面活性剤がＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、及びオクタグルコシドからなる群から選択される１種を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記界面活性剤が１％未満の非ゼロ濃度で加えられる、請求項２９〜３３の何れか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記界面活性剤が０．１％未満の非ゼロ濃度で加えられる、請求項２９〜３３の何れか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記界面活性剤が０．０１％未満の非ゼロ濃度で加えられる、請求項２９〜３３の何れか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記サンプルにキレート剤が加えられる、請求項１〜３６の何れか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記キレート剤が、トリス（２−アミノエチル）アミン又はデフェロキサミンを含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記キレート剤が１００ｍＭ未満の非ゼロ濃度で加えられる、請求項３７又は３８に記載の方法。

【請求項40】

前記キレート剤が５０ｍＭ未満の非ゼロ濃度で加えられる、請求項３７又は３８に記載の方法。

【請求項41】

前記キレート剤が２０ｍＭ未満の非ゼロ濃度で加えられる、請求項３７又は３８に記載の方法。

【請求項42】

前記キレート剤が１０ｍＭ未満の非ゼロ濃度で加えられる、請求項３７又は３８に記載の方法。

【請求項43】

前記キレート剤が５ｍＭ未満の非ゼロ濃度で加えられる、請求項３７又は３８に記載の方法。

【請求項44】

以下：（ａ）有機溶媒、（ｂ）有機ポリマー、（ｃ）可溶性ウレイド、（ｄ）界面活性剤、（ｅ）キレート剤、及び（ｆ）塩のうちの複数が加えられる、請求項１〜４３の何れか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記未溶解のアラントインは、未溶解のアラントイン結晶を含む、請求項１〜４４の何れか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗体を含むタンパク質の精製を高めるための方法に関する。特に、細胞培養収集物（ｈａｒｖｅｓｔ）の浄化との併用を含む、凝集体のレベルを低下させるための方法に関する。さらに、最終的な精製の所望のレベルを達成するための他の精製方法と、これらの能力の統合に関する。

【背景技術】

【0002】

不自然なヘテロ会合が、自然に、宿主細胞由来の不純物と、インビトロ細胞培養方法により産生される組み換えタンパク質との間で形成されることが示されている（Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇｒ．（２００８）２４：１１１５−１１２１；Ｌｕｈｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ（２００９）８７７：１５４３−１５５２；Ｍｅｃｈｅｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ（２０１１）８７９：２５８３−２５９４；Ｇａｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，（２０１１）１２１８：２４０５−２４１２；Ｇａｇｎｏｎ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊ．（２０１０）９（４）：１４−２４）。これらのヘテロ会合は、２つの側面において、不自然と考えられる：
１）成分たる不純物は、しばしば、非ヒト由来であり、生きている非ヒト宿主細に胞により分泌され、又は非ヒト宿主細胞が死に際し溶解するとき培地中に放出される。生きているヒトにおいて、そのような非ヒト不純物は存在しない；及び
２）成分たる不純物は、死細胞成分がすぐに除去されるヒトインビボ系と比較して、高い濃度で蓄積する。
従って、組み換え産物は、典型的には生体系において起こらない濃度で強力に相互作用する不純物の高いレベルに晒される。その間、組み換えタンパク質の高い発現レベルは、それらを、これらの非ヒト不純物との非特異的な会合のための好適な基質にし、複合体及び凝集体を含有する異種の組成物の望ましくないヘテロ会合の形成に好都合である。

【0003】

ヘテロ−凝集体の不純物混入タンパク質の内容物は、不純物混入タンパク質の直接な標的化により（Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｇａｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ）、同様に、不純物混入タンパク質の原因である対応するＤＮＡ成分の標的化により間接的に（Ｌｕｈｒｓ ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｇａｇｎｏｎ ｓｕｐｒａ）、ある程度、扱われている。抗体の凝集レベルの低減は、いくつかの複合体が解離するときに示されている（Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｃｈｅｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ａｎｄ Ｇａｇｎｏｎ ｓｕｐｒａ）。抗体−不純物複合体のレベルを低減するためのアニオン交換体の能力は開示されているが（Ｌｕｈｒｓ ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｇａｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）、アニオン交換処理がヘテロ−凝集体を完全に除去できることは示されていない。サイズ排除、カチオン交換、及び疎水性相互作用クロマトグラフィも、ヘテロ−凝集体を低減する試みにおいて採用さているが、これらの技術は一般的にアニオン交換に劣っていた（Ｇａｇｎｏｎ ｅｔ ａｈ，ｓｕｐｒａ）。

【0004】

ヘテロ−凝集体を分離することが期待されるであろう作用物質（ａｇｅｎｔ）で抗体製剤を処理することは、一般的に効果がない証明されている。例えば、尿素、塩、又はその２種の組合せを高濃度で採用することは、実質的に、ＩｇＭ−不純物のヘテロ−凝集体を分離できない（Ｇａｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。尿素、アルコール、及び界面活性剤の溶出前洗浄を用いるプロテインＡ親和クロマトグラフィは、洗浄剤を用いない場合より効果的にヘテロ−凝集体レベルを低減させることが示されており（Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）、プロテインＧ親和クロマトグラフィと尿素、塩、及びＥＤＴＡを組み合わせた溶出前洗浄も同様であった（Ｍｅｃｈｅｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。尿素の溶出前洗浄を用いるアニオン交換クロマトグラフィは、尿素洗浄の不存在下より効果的にヘテロ−凝集体を低減させることが示されている（Ｇａｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。カチオン交換クロマトグラフィも、溶出前ＥＤＴＡ洗浄を用いて、洗浄を用いない場合より効果的にヘテロ−凝集体を低減させることが示されている（Ｇａｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。最後に、尿素及び／又は塩溶出前洗浄を用いるヒドロキシアパタイトも、そのような洗浄を用いない場合より効果的にヘテロ−凝集体を低減させる（Ｇａｇｎｏｎ、ｓｕｐｒａ）。これらの知見にもかかわらず、一般に、クロマトグラフィカラムに結合された抗体の溶出前洗浄における作用物質を分離することの使用は、唯一適度に成功している。

【0005】

正電荷有機添加剤は、酸性タンパク質の沈殿（Ｆａｒｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第２００８０１９３９８１号；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ（２０１０）８７８：７９８−８０６；Ｐｅｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇｒ．，（２０１０）２６：１３２２−１３２６；Ｇｌｙｎｎ，ｉｎ Ｕ．Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ（ｅｄ．），Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｃａｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊ．Ｔ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，（２００９）Ｈｏｂｏｋｅｎ，３０９−３２４），ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ（Ｇｌｙｎｎ ｓｕｐｒａ；Ｃｏｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇｒ．，（１９９０）６：２８３−２８５；Ｄｉｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，（１９９９） ７ ２２１：９−１１）及びウイルスの不活化（Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ、米国特許第５，５５９，２５０号）のために示されている。多価金属カチオンも、いくつかのタンパク質製剤からＤＮＡ及び内毒素を除去することが示されている（Ａｋｃａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（１９６０）１８７：３２３−３２４；Ｍａｔｓｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，（２００３）３（３）：１６３−１６４；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，（２００４）３７：４６８−４７１；Ｋｅｊｎｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，（１９９７）２５：１８７０−１８７１；Ｏｎｇｋｕｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，（２０１１）８３ ３９１：１３−１７）。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、ある実施形態において、正電荷有機添加剤を用いてサンプルを処理することにより、タンパク質製剤のような所望のタンパク質種を含有するサンプルにおいて、産物−不純物複合体及び凝集体の量を低下させるための方法を提供する。ある実施形態において、複合体及び／又は凝集体の低減は、正電荷有機添加剤の極低レベルを用いて達成される。ある実施形態において、本発明は、特に、ヌクレオソーム、及び／又はヒストン、及び／又はＤＮＡのようなクロマチンの残渣を含む凝集体の内容物を低下させる。ある実施形態において、サンプルは、高められた電気伝導率の値（塩の濃度）で処理される。ある実施形態において、サンプルは、付加的に、未溶解ウレイドを用いて処理され、所望のタンパク質を含有する上清が集められる。ある実施形態において、サンプルは、代わりに又は付加的に、複合体及び凝集体における所望のタンパク質に伴う不純物の分離を強めるように意図された、非イオン性の有機ポリマー、有機溶媒、界面活性剤、又はウレイドのような他の有機添加剤を用いて処理される。ある実施形態において、処理されたサンプルは、その後、所望のタンパク質から、選択的に正電荷有機添加剤及び潜在的に他の化学的な実体を除去する化学部分を有する固体物質に晒される。

【発明を実施するための形態】

【0007】

タンパク質の精製のために、方法及びキットが提供される。ある実施形態において、本発明は、正電荷有機添加剤と、そのような所望のタンパク質の接触を通して、抗体又は他のタンパク質の調剤からのタンパク質−不純物複合体及び凝集体の低減を提供する。ある実施形態において、本発明は、いわゆる生理学上の条件から、そのような生理学上の条件の３倍以上の電気伝導率の値までの電気伝導率レベルの範囲で実施されるだろう；そのように高められた電気伝導率レベルは、所望の又は目標のタンパク質の沈殿を抑えるだろう。ある実施形態において、本発明は、正電荷有機添加剤を極低濃度；沈殿を仲介する目的のためにそのような添加剤が適用される濃度より１０倍〜１００倍低いようなレベルで用いて実施されるだろう。本発明は、ある実施形態において、注目するタンパク質にカスタマイズされる手段の開発条件の必要性を低下させること、注目するタンパク質の回収の改良、精製方法の再現性の改良、及び凝集体を除去するための追加的な処理工程の必要性を低下させることの利点を提供する。

【0008】

実施形態は、本明細書において、所望のタンパク質を含むサンプルの内容物の凝集を低下させる方法であって、正電荷有機添加剤及び未溶解ウレイドと、サンプルを接触させる工程を含む方法を提供することを開示する。

【0009】

いくつかのそのような実施形態において、電気伝導率の値が１５ｍＳ／ｃｍ以上での、所望のタンパク質を含むサンプルの内容物の凝集を低下させる方法であって、０．１％以下の濃度で正電荷有機添加剤を添加する工程を含む。

【0010】

前述の実施形態の１以上において、所望のタンパク質を含むサンプルの内容物の凝集を低下させる方法であって、前記サンプルの電気伝導率の値が５ｍＳ／ｃｍ以上であり、沈殿の形成を低下させるために１以上の有機添加剤の存在下で、０．１％以下の濃度で正電荷有機添加剤を添加する工程を含み、１以上の有機添加剤がウレイド、有機溶媒、又は界面活性剤からなる群から選択される。

【0011】

前述の実施形態の１以上において、所望のタンパク質を含むサンプルの内容物の凝集量を低下させる方法であって、凝集体を含有するサンプルを供給する工程を含み、所望のタンパク質がサンプルにおける溶液中に存在し、正電荷有機添加剤とサンプルを接触させる工程を含む。

【0012】

前述の実施形態の１以上において、ウレイドがアラントインである。

【0013】

前述の実施形態の１以上において、ウレイドが約０．５〜約２重量／体積％の範囲で存在する。

【0014】

前述の実施形態の１以上において、正電荷有機添加剤がエタクリジン、クロルヘキシジン、ポリエチレンイミン、メチレンブルー、及び塩化ベンザルコニウムからなる群から選択される１種を含む。

【0015】

前述の実施形態の１以上において、ウレイドが正電荷有機添加剤の前に添加される。

【0016】

前述の実施形態の１以上において、塩が、実質的に、所望のタンパク質の沈殿を防ぐためのレベルで加えられる。

【0017】

前述の実施形態の１以上において、所望のタンパク質が抗体、第ＶＩＩＩ因子、成長ホルモン、及び組み換えタンパク質からなる群から選択される１種を含む。

【0018】

前述の実施形態の１以上において、正電荷有機添加剤が１重量／体積％以下のレベルで加えられる。

【0019】

前述の実施形態の１以上において、正電荷有機添加剤が０．１重量／体積％以下のレベルで加えられる。

【0020】

前述の実施形態の１以上において、正電荷有機添加剤が０．０１重量／体積％以下のレベルで加えられる。

【0021】

前述の実施形態の１以上において、正電荷有機添加剤が０．００１重量／体積％以下のレベルで加えられる。

【0022】

前述の実施形態の１以上において、正電荷有機添加剤が、０．０２％〜０．０３％の濃度で存在する。

【0023】

前述の実施形態の１以上において、複数種類の正電荷有機添加剤が存在する。

【0024】

前述の実施形態の１以上において、複数種類の正電荷有機添加剤の凝集体の濃度が１重量／体積％以下である。

【0025】

前述の実施形態の１以上において、複数種類の正電荷有機添加剤の凝集体の濃度が０．１重量／体積％以下である。

【0026】

前述の実施形態の１以上において、複数種類の正電荷有機添加剤の凝集体の濃度が０．０１重量／体積％以下である。

【0027】

前述の実施形態の１以上において、複数種類の正電荷有機添加剤の凝集体の濃度が０．００１重量／体積％以下である。

【0028】

前述の実施形態の１以上において、未溶解ウレイドがアラントインである。

【0029】

前述の実施形態の１以上において、アラントインが、約０．５６重量／体積％〜約１重量／体積％の範囲の濃度で存在する。

【0030】

前述の実施形態の１以上において、アラントインが、約１重量／体積％〜約２重量／体積％の範囲の濃度で存在する。

【0031】

前述の実施形態の１以上において、アラントインが、約２重量／体積％〜約５重量／体積％の範囲の濃度で存在する。

【0032】

前述の実施形態の１以上において、アラントインが、約５重量／体積％〜約１０重量／体積％の範囲の濃度で存在する。

【0033】

前述の実施形態の１以上において、アラントインが、約１０重量／体積％〜約１５重量／体積％の範囲の濃度で存在する。

【0034】

前述の実施形態の１以上において、正電荷有機添加剤の添加の前に、ウレイドがサンプルに添加される。

【0035】

前述の実施形態の１以上において、沈殿を通して、所望のタンパク質の実質的な減量を抑えるために、サンプルの電気伝導率が十分に高いレベルに調整される。

【0036】

前述の実施形態の１以上において、サンプルの電気伝導率が、所望のタンパク質の実質的な減量を抑えるのに必要であるレベルより高いレベルに調整される。

【0037】

前述の実施形態の１以上において、サンプルの電気伝導率が生理学上の電気伝導率の２倍まで調整される。

【0038】

前述の実施形態の１以上において、サンプルの電気伝導率が生理学上の電気伝導率の３倍以上まで調整される。

【0039】

前述の実施形態の１以上において、サンプルの電気伝導率が、所望のタンパク質の実質的な減量を抑えるために十分な高さのままであるが、低減される。

【0040】

前述の実施形態の１以上において、正電荷有機添加剤の添加の前に、サンプルの電気伝導率が調整される。

【0041】

前述の実施形態の１以上において、有機溶媒が存在する。

【0042】

前述の実施形態の１以上において、有機溶媒が、エタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、リン酸トリ（ｎ−ブチル）、及びグリセロールからなる群から選択される１種を含む。

【0043】

前述の実施形態の１以上において、有機溶媒が約０．０１〜約２０重量／体積％の範囲の濃度で含まれる。

【0044】

前述の実施形態の１以上において、有機溶媒が、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、エタノール、イソプロパノール、又はリン酸トリ（ｎ−ブチル）を、約０．０１〜約１％の範囲の濃度で含む。

【0045】

前述の実施形態の１以上において、有機溶媒が、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、エタノール、又はイソプロパノールを、約１〜約５％の範囲の濃度で含む。

【0046】

前述の実施形態の１以上において、有機溶媒が、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、エタノール、又はイソプロパノールを、約５〜約１０％の範囲の濃度で含む。

【0047】

前述の実施形態の１以上において、有機溶媒が、エチレングリコール、プロピレングリコール、又はグリセロールを、約１０〜約２０％の範囲の濃度で含む。

【0048】

前述の実施形態の１以上において、有機溶媒が存在し、エタノール、イソプロパノール、及びリン酸トリ（ｎ−ブチル）からなる群から選択される１種を含む。

【0049】

前述の実施形態の１以上において、有機溶媒の濃度が１％未満である。

【0050】

前述の実施形態の１以上において、有機溶媒の濃度が０．１％未満である。

【0051】

前述の実施形態の１以上において、有機溶媒の濃度が０．０１％未満である。

【0052】

前述の実施形態の１以上において、可溶性ウレイドが存在する。

【0053】

前述の実施形態の１以上において、可溶性ウレイドが尿素である。

【0054】

前述の実施形態の１以上において、可溶性ウレイドが、約０．５〜約１Ｍの範囲の濃度で存在する。

【0055】

前述の実施形態の１以上において、可溶性ウレイドが、約１〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する。

【0056】

前述の実施形態の１以上において、可溶性ウレイドが、約２〜約４Ｍの範囲の濃度で存在する。

【0057】

前述の実施形態の１以上において、可溶性ウレイドが、約４〜約８Ｍの範囲の濃度で存在する。

【0058】

前述の実施形態の１以上において、界面活性剤が存在する。

【0059】

前述の実施形態の１以上において、界面活性剤が非イオン性の界面活性剤を含む。

【0060】

前述の実施形態の１以上において、非イオン性の界面活性剤が、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）及びトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）からなる群から選択される１種を含む。

【0061】

前述の実施形態の１以上において、界面活性剤が双性イオンの界面活性剤を含む。

【0062】

前述の実施形態の１以上において、双性イオンの界面活性剤がＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、及びオクタグルコシドからなる群から選択される１種を含む。

【0063】

界面活性剤が１％未満の非ゼロ濃度で存在する。

【0064】

前述の実施形態の１以上において、界面活性剤が０．１％未満の非ゼロ濃度で存在する。

【0065】

前述の実施形態の１以上において、界面活性剤が０．０１％未満の非ゼロ濃度で存在する。

【0066】

前述の実施形態の１以上において、キレート剤が存在する。

【0067】

前述の実施形態の１以上において、キレート剤が正に帯電される。

【0068】

前述の実施形態の１以上において、正に帯電したキレート剤が、トリス（２−アミノエチル）アミン又はデフェロキサミンを含む。

【0069】

前述の実施形態の１以上において、キレート剤が１００ｍＭ未満の非ゼロ濃度で存在する。

【0070】

前述の実施形態の１以上において、キレート剤が５０ｍＭ未満の非ゼロ濃度で存在する。

【0071】

前述の実施形態の１以上において、キレート剤が２０ｍＭ未満の非ゼロ濃度で存在する。

【0072】

前述の実施形態の１以上において、キレート剤が１０ｍＭ未満の非ゼロ濃度で存在する。

【0073】

前述の実施形態の１以上において、キレート剤が５ｍＭ未満の非ゼロ濃度で存在する。

【0074】

前述の実施形態の１以上において、以下：（ａ）有機溶媒、（ｂ）有機ポリマー、（ｃ）可溶性ウレイド、（ｄ）界面活性剤、（ｅ）キレート剤、及び（ｆ）塩のうちの複数が存在する。

【0075】

前述の実施形態の１以上において、残りの不純物から前記所望のタンパク質を分画するための後の処理工程の前に、前記接触したサンプルが、少なくとも１つの正電荷有機添加剤を除去するために、１以上の固形物に晒される。

【0076】

キットは、前述の実施形態の何れか１つの方法を実施するために提供されるだろう。

【0077】

ある実施形態において、本発明は、ホモ−凝集体のような所望のタンパク質と比較して高分子量を有する凝集体のレベルを低下させるため、及びヘテロ−凝集体のような所望のタンパク質よりわずかに大きい流動力学的な大きさの凝集体のレベルも低下させるための方法を提供する。ある実施形態において、凝集体は所望のタンパク質及び不純物のヘテロ−凝集体を含み、このような実施形態において、不純物は核酸、ヌクレオチド、内毒素、金属イオン、タンパク質、脂質、又は細胞培地成分である。ある実施形態において、所望のタンパク質のホモ−凝集体の存在は、実質的に排除する。ある実施形態において、所望のタンパク質及び不純物のヘテロ−凝集体の存在は、実質的に排除する。

【0078】

ある実施形態において、本発明は、凝集体の低下と共に、付加的に、ＤＮＡ、内毒素、及びウイルスのような不純物のレベルの低下を提供する。ある実施形態において、本発明は、抗ウイルス薬の付加的な含有と共に実施される。

【0079】

ある実施形態において、注目するタンパク質種（例えば、浄化すべき所望のタンパク質）は組み換え起源であり、タンパク質製剤は、細胞含有の細胞培養収集物（ｈａｒｖｅｓｔ）、細胞培養上清、浄化した細胞培養上清、クロマトグラフィカラムからの溶出物、又は精製の前段階で得られたタンパク質含有の溶液を含んでもよい。ある実施形態において、タンパク質製剤は抗体を含有し、そのような実施形態において、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、若しくはそれらの断片、又はＦｃ−融合タンパク質のような、抗体若しくは抗体断片の融合タンパク質である。ある実施形態において、所望のタンパク質は第ＶＩＩＩ因子のようなタンパク質を凝固してもよい。ある実施形態において、所望のタンパク質はヒト成長ホルモンのようなペプチドホルモンであってもよい。

【0080】

ある実施形態において、本発明は、サンプルの電気伝導率が、サンプルからの所望のタンパク質の沈殿を実質的に避けるための十分に高いレベルであるように実施される。電気伝導率は、当該技術分野で公知の方法に従い、塩又は希釈剤の添加によって調整されてもよい。ある実施形態において、電気伝導率は、所望のタンパク質の実質的な沈殿を避けるために必要とされる定められたレベルより５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ又は２０ｍＳ／ｃｍ高い。ある実施形態において、電気伝導率は、２０ｍＳ／ｃｍ、２５ｍＳ／ｃｍ、３０ｍＳ／ｃｍ、３５ｍＳ／ｃｍ、４０ｍＳ／ｃｍ、４５ｍＳ／ｃｍより高く、又は４５ｍＳ／ｃｍより高い。これらの系における電荷の相互作用が高い電気伝導率で低減されると知られているから、高い電気伝導率での、不純物の重要なサブセット（ｓｕｂｓｅｔｓ）を除去する方法の能力は、本発明の意外な特徴の１つを表す。２５ｍＳ／ｃｍ以上の電気伝導率で、例えば、負に帯電したタンパク質の極少数は正の電荷を有する表面に結合されることが知られている。本発明の方法の他に、５ｍＳ／ｃｍ未満の電気伝導率で、ＩｇＧ抗体の調剤への多くの正の電荷を有する作用物質の適用が存在し、及び通常、アルカリｐＨを必要とする付加的な作業を有する。このような作用ｐＨは、本発明の方法に必要とされない。高い電気伝導率が凝集体中の内部的な静電的会合を弱らせる効果を有し、これにより凝集体の分離、及び／又は所望のタンパク質と引合う不純物の除去を達成する前記方法の能力を増大させることは、当該技術分野の当業者に明らかであろう。

【0081】

ある実施形態において、正電荷有機添加剤は、エタクリジン、９−アミノアクリジン（アミナクリン）、３，６−アクリジンジアミン（プロフラビン）、アクリゾルシン、アクリザン（フェナクリダン）、アクリジンオレンジ、キナクリン、アクリサイド、アクリドン、アクリジン−９−カルボン酸、アクラニール（１−［（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）アミノ］−３−（ジエチルアミノ）−２−プロパノール二塩酸塩）、フェノサフラニン、フェノキサジン、フェノチアジン、アクリフラビン（３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウム塩酸塩及び３，６−アクリジンジアミン）、ポリエチレンイミン（ポリ（イミノエチレン））、クロルヘキシジン、又はポリアミノ酸である。ある実施形態において、正電荷有機添加剤は、エタクリジン、ポリエチレンイミン、若しくはクロルヘキシジン、又はその塩である。

【0082】

ある実施形態において、正電荷有機添加剤は、実質的に最も低い濃度で、凝集体の所望の低減度合いを十分に促進するために提供される。ある実施形態において、正電荷有機添加剤の濃度は、（重量／体積基準で）０．１％、０．０５％、０．０４％、０．０２５％、又は０．００１％未満であってもよい。ある実施形態において、正電荷有機添加剤は０．０１〜０．０４％、又は０．０２〜０．０２５％の濃度で提供される。そのような実施形態において、正電荷有機添加剤は、エタクリジン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、又はクロルヘキシジンである。正電荷有機添加剤の濃度が０．１％未満で、有用な効果を達成する方法の能力は、その方法の別の意外な特徴の１つを強調する：アルカリｐＨを必要とせず、高い電気伝導率で作業することに加えて、その方法は、かなりの量の沈殿の形成をもたらすことなく、高効率となり得る。正電荷有機添加剤は、一般に、酸性のタンパク質、ＤＮＡ、及びウイルス、特に不純物の沈殿を媒介するのに使用される。それらは、それゆえに１％以上のような高い濃度で使用される。本発明の方法の目的は、凝集体を分離すること、又は凝集体中の内部的な会合を弱らせること、又は凝集体を安定させる非生産の不純物を除去することである。多くの実施形態において、正電荷有機添加剤の低濃度、及び高い作用電気伝導率の双方を理由とする、沈殿の除去の必要性を極小にする又は避けることは、沈殿を極小にする又は避ける前記方法の第２の目的である。

【0083】

ある実施形態において、サンプルの凝集体の量を低下させる一方、本発明は、所望のタンパク質の沈殿を避ける又は制限するために選択されたｐＨレベルで実施されてもよい。そのｐＨレベルは、従来の手段により調整されてもよく、電気伝導率の選択と組み合わせて選択されてもよい。ある実施形態において、サンプルのｐＨはおよそ４〜およそ９、およそ５〜およそ８、又はおよそ６〜およそ７．５である。これは、再度、正電荷有機添加剤のこの使用の珍しい性質を強調する。

【0084】

ある実施形態において、サンプルは、好ましくは正電荷有機添加剤と実質的に同時に、付加的に抗ウイルス薬と接触される。そのような実施形態において、抗ウイルス薬それ自身は、塩化ベンザルコニウム又はメチレンブルーのような正電荷を有する有機分子である。リン酸トリ（ｎ−ブチル）のような、電気的中性の又は非イオン性の抗ウイルス薬も使用されてよい。抗ウイルス薬は、およそ１％（ｗ／ｖ）未満の量、およそ０．１％（ｗ／ｖ）未満の量、およそ０．０１％（ｗ／ｖ）未満の量、又はおよそ０．００１％未満の量で存在してもよい。そのような作用物質は、低いｐＨでの処理によってウイルス不活化を許容しないタンパク質にとりわけ有用となり得る。

【0085】

ある実施形態において、前記方法は、付加的に、ウレイドがサンプルに溶解しない十分な量で、ウレイドとサンプルを接触させる工程を含む。所望のタンパク質を含有する上清は、沈殿された不純物を含むサンプルの残渣から分離される。そのような実施形態において、ウレイドは、正電荷有機添加剤とサンプルを接触させる工程よりも前に供給され、その他の場合において、ウレイドは、正電荷有機添加剤とサンプルを接触させる工程と実質的に同時に供給され、さらに他の場合において、ウレイドは、正電荷有機添加剤とサンプルを接触させる工程の後に供給される。このような実施形態において、ウレイドは尿酸、ヒダントイン（イミダゾリジン−２，４−ジオン）、アラントイン（２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル）尿素、アルクロキサ、アルジオキサ、ヘモキャン（ｈｅｍｏｃａｎｅ）、ウレイドヒダントイン、５−ウレイドヒダントイン、グリオキシルウレイド、グリオキシル酸ジウレイド、２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、及びプリンの何れかとなり得る。ある実施形態において、ウレイドはアラントインであり、そのような場合において、アラントインは０．５６％（ｗ／ｖ）より高い濃度、１％、１．５％、２％、又はそれ以上の濃度で存在する。ある実施形態において、ウレイドは尿酸であり、そのような場合において、尿酸は、０．００２５％（ｗ／ｖ）より高い濃度、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、又はそれ以上の濃度で存在する。

【0086】

ある実施形態において、前記方法は、付加的に、ウレイドが完全に溶解される量でウレイドとサンプルを接触させる工程を含む。このような実施形態において、前記可溶性ウレイドは尿素、イミダゾリジナル（ｉｍｉｄａｚｏｌｙｄｉｎａｌ）尿素、又は他のウレイドとなり得る。ある実施形態において、ウレイドは尿素であり、そのような場合において、尿素は０．５Ｍより高い濃度、又は１Ｍより高い濃度、又は２Ｍより高い濃度、又は４Ｍより高い濃度、又は６Ｍより高い濃度、又は８Ｍより高い濃度で存在する。これは、タンパク質沈殿の回避は前記方法の特定の目的である、前記方法の意外な性質を再度強調する。尿素のような高い溶解性のウレイドは、その存在が沈殿物の形成を拒むと言える、多くの化合物の溶解性を増加させる一般的な効果を有する。高い溶解性のウレイドの存在が凝集体中の内部的な疎水性を、及び／又は水素結合の会合を弱める効果を有し、これにより、凝集体の分離、及び／又は所望のタンパク質と引き合う不純物の除去を達成する前記方法の能力を増大させることは、当該技術分野の当業者に明らかであろう。

【0087】

ある実施形態において、本発明を適用する場合、細胞培養収集物（ｈａｒｖｅｓｔ）において細胞片の沈降も加速させ、実質的に、ＤＮＡ、内毒素、及びウイルスのレベルを低減させることの事実によって、本発明の有用性は高められる。実験データは、優先的に凝集体、内毒素、及びウイルスと相互作用するいくつかのウレイドの能力がこれらの結果に貢献すること、及びウレイドの不存在下での正電荷有機添加剤との処理と比較して、溶解したウレイドの低いレベルが、サポートする抗体回復がより高まることに貢献し得ることを示唆する。本発明は、その有用性をさらに拡大し得る、非正電荷抗ウイルス薬の添加を共に行ってもよい。処理の後、沈降又は濾過によって固体物質が除去されても、実質的に、上清において凝集のないタンパク質のままである。他の方法によって処理された物質が典型的には濁って、もやもやしているのに対して、これは、処理された物質が光学的に透明であり、粒状でないとの本発明の別の有利な点を提供する。

【0088】

ある実施形態において、本発明は、非イオン性の有機ポリマー、有機溶媒、界面活性剤、又はウレイドのような可溶性有機調節因子とサンプルを接触させる付加的な工程と実施してもよい。そのような実施形態において、有機調節因子とサンプルを接触させる工程は、正電荷有機添加剤とサンプルを接触させる工程より前に起こる。他の場合において、有機調節因子とサンプルを接触させる工程は、正電荷有機添加剤とサンプルを接触させる工程と実質的に同時に起こる。さらに他の場合において、有機調節因子とサンプルを接触させる工程は、正電荷有機添加剤とサンプルを接触させる工程の後に起こる。ある実施形態において、有機調節因子は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリブチレングリコールのような非イオン性の有機ポリマーであり、そのような実施形態において、非イオン性の有機ポリマーは、およそ１０００Ｄａ以下、５００Ｄａ以下、２５０Ｄａ以下、又は１００Ｄａ以下の平均分子質量を有する。ある実施形態において、有機調節因子は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、又はフェノキシエタノールのような有機溶媒である。ある実施形態において、有機調節因子は、およそ１％（ｗ／ｖ）以上の濃度で提供される。ある実施形態において、有機調節因子は、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、又はオクチルグルコシドのような界面活性剤であり、そのような実施形態において、界面活性剤は、およそ１％（ｗ／ｖ）以下、およそ０．１％（ｗ／ｖ）以下、又はおよそ０．０２％（ｗ／ｖ）以下の濃度で提供される。ある実施形態において、有機調節因子は、亜飽和の量で提供されるウレイドであり、そのような実施形態において、ウレイドは尿素、ヒダントイン、又はアラントインである。これは、再度、正電荷有機添加剤がかなりの量の沈殿の形成を低減し又は除去する条件下で使用される、前記方法の珍しい性質を強調する。正電荷有機添加剤の著しく低い濃度、高い作用電気伝導率、アルカリｐＨからの独立性、及び周知の尿素の可溶化作用に加えて、有機溶媒及び界面活性剤の存在は、ある好ましい正電荷有機添加剤と、タンパク質又は他の不純物との間の疎水性の相互作用を弱める効果を有する。これは、とりわけ、エタクリジン若しくはその類似体のような疎水性の正電荷有機添加剤に、又はクロルヘキシジン若しくは塩化ベンザルコニウムに適用される。前述したような有機添加剤の存在が凝集体の内部の化学的な会合を弱める効果を備え、これにより、凝集体の分離、及び／又は所望のタンパク質と引き合う不純物の除去を達成する方法の能力を増大させることは、当該技術分野の当業者に明らかであろう。

【0089】

ある実施形態において、本発明は、サンプルが正電荷有機添加剤と接触される溶液において、所望のタンパク質を含有するサンプルに含まれる凝集体の量を低下させるための方法を提供する。このような実施形態において、サンプルの電気伝導率は、サンプルから所望のタンパク質の沈殿を実質的に避けるために、かなり高いレベルである。ある実施形態において、電気伝導率は１５ｍＳ／ｃｍよりも高く、又は電気伝導率は３０ｍＳ／ｃｍよりも高い。

【0090】

ある実施形態において、本発明は、正電荷有機添加剤の濃度がおよそ０．１％（ｗ／ｖ）未満である方法を提供する。ある実施形態において、正電荷有機添加剤は、エタクリジン、９−アミノアクリジン（アミナクリン）、３，６−アクリジンジアミン（プロフラビン）、アクリゾルシン、アクリザン（フェナクリダン）、アクリジンオレンジ、キナクリン、アクリサイド、アクリドン、アクリジン−９−カルボン酸、アクラニール（ｌ−［（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）アミノ］−３−（ジエチルアミノ）−２−プロパノール二塩酸塩）、フェノサフラニン、フェノキサジン、フェノチアジン、アクリフラビン（３，６−ジアミノ−１０メチルアクリジニウム塩酸塩及び３，６−アクリジンジアミン）、ポリエチレンイミン、クロルヘキシジン、及びポリアミノ酸からなる群から選択される。ある実施形態において、本発明は、正電荷有機添加剤がエタクリジン、ポリエチレンイミン、若しくはクロルヘキシジン、又はその塩である方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、正電荷有機添加剤が、およそ０．０１％〜およそ０．０５％の量、又はおよそ０．０１％未満の量、又はおよそ０．００５％未満の量、又はおよそ０．００１％未満の量で存在する方法を提供する。

【0091】

ある実施形態において、本発明は、サンプルのｐＨがおよそ４〜およそ９、又はおよそ５〜およそ８、又はおよそ６〜およそ７．５である方法を提供する。

【0092】

ある実施形態において、本発明は、低減される凝集体は所望のタンパク質のホモ−凝集体を含む方法を提供し、他の場合において、低減される凝集体は所望のタンパク質及び不純物のヘテロ−凝集体を含み、他の場合において、凝集体はそのようなホモ−凝集体及びヘテロ−凝集体の双方を含有する。ある実施形態において、本発明は、凝集体がサンプル中から実質的に除去される、方法を提供する。ある実施形態において、低減される凝集体は、実質的に、所望のタンパク質と同じ流体力学的な大きさである。ある実施形態において、低減される凝集体は、核酸、ヌクレオチド、内毒素、金属イオン、タンパク質、脂質、又は細胞培地成分を含むヘテロ−凝集体である。

【0093】

ある実施形態において、本発明は、所望のタンパク質が抗体又は抗体断片である方法を提供する。ある実施形態において、サンプルが細胞培養収集物（ｈａｒｖｅｓｔ）、細胞培養上清、細胞培養由来の抗体含有の溶液、又はタンパク質精製の前段階からの抗体含有の溶液である。

【0094】

ある実施形態において、本発明は、サンプルがタンパク質精製の前段階からの溶液を含有する所望のタンパク質である方法を提供する。ある実施形態において、サンプルはクロマトグラフィカラムからの溶出物である。

【0095】

ある実施形態において、本発明は、サンプルが付加的に抗ウイルス薬と接触される方法を提供する。ある実施形態において、抗ウイルス薬は、塩化ベンザルコニウム、メチレンブルー、及びリン酸トリ（ｎ−ブチル）からなる群から選択される。ある実施形態において、抗ウイルス薬は、およそ１％（ｗ／ｖ）未満の量、又はおよそ０．１％（ｗ／ｖ）未満の量、又はおよそ０．０１％（ｗ／ｖ）未満の量で存在する。

【0096】

ある実施形態において、本発明は、ウレイドがサンプルに溶解しない十分な量でウレイドとサンプルが接触し、サンプルの一部から、所望のタンパク質を含有する上清を分離する付加的な工程を含む方法を提供する。

【0097】

ある実施形態において、本発明は、ウレイドとサンプルを接触させる工程が正電荷有機添加剤とサンプルを接触させる工程よりも前に起こる方法を提供する。

【0098】

ある実施形態において、本発明は、ウレイドとサンプルを接触させる工程が正電荷有機添加剤とサンプルを接触させる工程と実質的に同時に起こる方法を提供する。

【0099】

ある実施形態において、本発明は、ウレイドとサンプルを接触させる工程が正電荷有機添加剤とサンプルを接触させる工程の後に起こる方法を提供する。

【0100】

ある実施形態において、本発明は、ウレイドが尿素、尿酸、ヒダントイン、アラントイン、アルクロキサ、アルジオキサ、ヘモキャン（ｈｅｍｏｃａｎｅ）、ウレイドヒダントイン、５−ウレイドヒダントイン、グリオキシルウレイド、グリオキシル酸ジウレイド、２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル尿素、及びプリンからなる群から選択される方法を提供する。

【0101】

ある実施形態において、本発明は、ウレイドがアラントインである方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、アラントインが０．５％（ｗ／ｖ）より大きい量で存在する方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、アラントインがおよそ１％（ｗ／ｖ）より大きい量で存在する方法を提供する。

【0102】

ある実施形態において、本発明は、ウレイドが尿酸である方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、尿酸が０．００２５％（ｗ／ｖ）より大きい量で存在する方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、尿酸がおよそ０．０１％（ｗ／ｖ）より大きい量で存在する方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、尿酸がおよそ０．１％（ｗ／ｖ）より大きい量で存在する方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、尿酸がおよそ１％（ｗ／ｖ）より大きい量で存在する方法を提供する。

【0103】

ある実施形態において、本発明は、非イオン性の有機ポリマー、有機溶媒、界面活性剤、及びウレイドからなる群から選択される有機調節因子とサンプルを接触させる付加的な工程を含む方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、有機調節因子とサンプルを接触させる工程が正電荷有機添加剤とサンプルを接触させる工程よりも前に起こる方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、有機調節因子とサンプルを接触させる工程が正電荷有機添加剤とサンプルを接触させる工程と実質的に同時に起こる方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、有機調節因子とサンプルを接触させる工程が正電荷有機添加剤とサンプルを接触させる工程の後に起こる方法を提供する。

【0104】

ある実施形態において、本発明は、有機調節因子がポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリブチレングリコールからなる群から選択される非イオン性の有機ポリマーである方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、非イオン性の有機ポリマーがおよそ５００Ｄａ以下の平均分子質量を有する方法を提供する。

【0105】

ある実施形態において、本発明は、有機調節因子がエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、及びフェノキシエタノールからなる群から選択される有機溶媒である方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、有機調節因子がおよそ１％（ｗ／ｖ）以上の濃度で提供される方法を提供する。

【0106】

ある実施形態において、本発明は、有機調節因子がトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、及びオクチルグルコシドからなる群から選択される界面活性剤である方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、界面活性剤がおよそ１％（ｗ／ｖ）以下の濃度で提供される方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、界面活性剤がおよそ０．１％（ｗ／ｖ）以下の濃度で提供される方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、有機調節因子が亜飽和の量で提供されるウレイドである方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、ウレイドが尿素、ヒダントイン、及びアラントインからなる群から選択される方法を提供する。

【0107】

ある実施形態において、本発明は、本願明細書に開示される、何れかの方法の簡便な実施を提供するキットを提供し、キットは、サンプル、有機調節因子、及び抗ウイルス薬を過飽和させるのに十分な量で正電荷有機添加剤及び少なくとも１つのウレイドを含み、提供される物質は、キットが提供されるサンプルに関して、本発明の簡便な実施のために十分な量で提供される。

【0108】

ある実施形態において、本発明は、本発明のある方法の簡便な実施のためにキットを提供する。そのようなキットは、多価有機カチオン、ウレイド、有機調節因子、抗ウイルス薬、及び電気伝導率の調整のための試薬の１種以上の、そのような、本発明の実施に有用な試薬を提供し得る。キットは、タンパク質の精製において使用するための本発明の実施に適した量及び濃度で物質を提供してもよい。そのようなキットは、ＩｇＧ又はＩｇＭ抗体のようなあるタンパク質と用いるために適合され、タンパク質製剤及び精製のある一定の規模に好適な量に適合されてもよい。物質は、本発明の方法の実施において使用するための溶液の生成において、ユーザーによって使用されるために、既製の溶液形態で、希釈に好適な高濃度溶液で、又は固体形態で供給されてもよい。

【0109】

ある実施形態において、本発明は、付加的な処理より前に、サンプルから正の電荷を有する作用物質、又は他のサンプル構成成分を選択的に除去する効果を有する固形の意図を備える固体物質とサンプルの接触を伴う。

【0110】

ある実施形態において、本発明は、高いレベルの精製を達成するため、又は他の不純物を除去するため、従来のタンパク質の精製方法と組み合わせてもよい。例えば、本発明は、沈殿、クロマトグラフィ、及び液−液抽出方法を含む従来の精製方法と併用して実施されてもよい。そのような付加的な方法は、本発明の前、又は後に実施されるように本発明と組み合わせてもよい。産物の所望の精製を達成するために、これらの方法の適切な条件を開発し、それらを本願明細書に記載される本発明と統合することは、当該技術分野の当業者の能力の範囲内である。

【0111】

ある実施形態において、本発明は、クロマトグラフィによる精製が始まる前に凝集レベルの低減を可能にし、その後の処理工程から負荷を取り除く。ＤＮＡ、内毒素、及びウイルスレベルは、下流の精製工程における負荷をさらに低減し得る凝集体の低減と同時に低減し得る。ある実施形態において、有機調節因子の使用は、正電荷有機添加剤の低濃度と組み合わせて、実質的な沈殿の形成を防ぎ、潜在的に、固形分を除去するための中間体処理工程がなくとも、クロマトグラフィカラムへの本発明において処理されたサンプルの直接適用を可能にする。そのような実施形態は、付加的に非正電荷有機添加剤抗ウイルス薬の添加と両立できる。

【0112】

ある実施形態において、実施上の条件は、ｐＨによって、並びに／又はキレート剤、有機ポリマー若しくは溶媒、界面活性剤、カオトロープ、及び種々の凝集体が低減する度合いを調節するための塩の種類、及び溶液に残る所望のタンパク質の存在によって変わってもよい。

【0113】

本発明の付加的な目的及び利点は、前記後述の説明において説明し、その説明から明らかになり、又は本発明の実施によって知り得るだろう。本発明の目的及び利点は、特許請求の範囲に特定された構成成分及び組合せの手段によって、理解され、達成するだろう。

【0114】

前述の一般的説明及び以下の詳細な説明の双方が模範的、及び説明的に記載されたものであり、特許請求の範囲に記載の本発明を制限するものではないということを理解されたい。

【0115】

定義
用語は、本発明がより容易に理解されるために定義される。付加的な定義は、詳細な説明の全体にわたって説明される。

【0116】

「凝集体」は、生理学的な条件で安定した、広い範囲のｐＨ及び電気伝導率の条件にわたって安定したままとなり得る２以上の分子の会合に関する。凝集体は、しばしば、タンパク質、核酸、又は脂質、及び別の分子又は金属イオンのような、少なくとも１つの生体分子を含む。会合は、化学的相互作用の何れのタイプ又は何れの組合せによっても起こる。抗体の凝集体は２つのカテゴリに分類できる：「ホモ−凝集体」は、２以上の抗体分子の安定した会合に関し；「ヘテロ−凝集体」は、１以上の抗体分子と１以上の非抗体分子との安定した会合に関する。非抗体の構成成分は、ヌクレオチド、内毒素、金属イオン、タンパク質、脂質、又は細胞培地の構成成分からなる群からの１つ以上の要素からなり得る。

【0117】

「抗体」は、免疫グロブリン、複合体、又はそれらの断片に関する。その用語は、自然の形態、又はヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組み換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、移植抗体、及びインビトロ生成抗体のような遺伝子改変された形態を含む、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭクラスのポリクローナル又はモノクローナル抗体を含んでもよいが、それらに限定されない。「抗体」は、免疫グロブリン部分を含有する融合タンパク質を含むがそれらに限定されない、複合形態を含んでもよい。「抗体」はまた、それらが抗原結合機能を保留していようとなかろうとＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、Ｆｃ及び他の組成物のような抗体断片を含んでもよい。

【0118】

「内毒素」は、溶解の際に細胞から放出されるグラム陰性菌の外膜に存在する熱毒安定リポ多糖物質に関する。

【0119】

「非イオン性の有機ポリマー」は、荷電基を欠く、結合された繰返しの有機サブユニットからなる、天然に存在する又は合成の炭化水素に関する。直鎖、いくつかの分岐を備える支配的に直鎖、又は支配的に分岐鎖であってもよい。本発明を実施するための好適な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含むが、これらに限定されない。ＰＥＧは構造式ＨＯ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−０）_ｎ−Ｈを有する。例としては、１００Ｄａ未満から１０００Ｄａより大きい範囲の平均ポリマー分子質量を有する組成物を含むが、これらに限定されない。

【0120】

「正電荷有機添加剤」は、有機分子、カチオン若しくは天然の塩、又は少なくとも１つの正電荷を有し、及び多数の正電荷を含有してもよい合成由来の化合物に関する。正電荷有機添加剤は負電荷を有してもよいが、そのような場合は、採用される実施上の条件下で、実効の正電荷を維持するだろう。正電荷有機添加剤は、塩化物、臭化物、スルフェート、有機酸、乳酸塩、グルコネート、及び前記方法と両立し得ないものでない任意の他のアニオンのような対イオン（アニオン）と一緒に提供されてよい、実効正電荷である。ある実施形態において、正電荷有機添加剤の正電荷の一部は、アミン、イミン又は他の窒素部分によって供給される。正電荷有機添加剤は、付加的に、疎水性の残渣、金属親和性の残渣、水素結合した残渣、他の機能的な部分、及び／又は化学的な相互作用の他のタイプに関与する能力を有するであろうものを含んでもよい。正電荷有機添加剤の例は、ある実施形態において、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン；ポリエチレンイミン；ポリアリルアミン；ポリジメチリン（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ）、ポリメチルアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニア；ポリジアリルジメチルアンモニア；ポリビニルベンジルトリメチルアンモニア；ポリビニルグアニジン；ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジン；ＤＥＡＥ−デキストラン；ＤＥＡＥ−セルロース；エタクリジン（ＣＡＳ番号４４２−１６−０；７−エトキシアクリジン−３，９−ジアミン）；トリス（２−アミノエチル）アミン；グアニジン；クロルヘキシジン；アレキシジン；シトリシダル、プロタミン；スペルミン；スペルミジン；サルミン；キトサン；及び前述の異形及び誘導体のような、ジアミノ酸、ジ−、トリ−、又は大きいホモ又はヘテロ−ペプチドを含むが、これらに限定されない。例えば、エタクリジンの異形及び誘導体は、９−アミノアクリジン（アミナクリン）、３，６−アクリジンジアミン（プロフラビン）、アクリゾルシン、アクリザン（フェナクリダン）、アクリジンオレンジ、キナクリン、アクリサイド、アクリドン、アクリジン−９−カルボン酸、アクラニール（１−［（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）アミノ］−３−（ジエチルアミノ）−２−プロパノール二塩酸塩）、フェノサフラニン、フェノキサジン、フェノチアジン、アクリフラビン（３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウム、塩化物、及び３，６−アクリジンジアミン）、及びそれらの塩（例えば塩化物、臭化物、スルフェート、乳酸塩、グルコネート）を含むことが理解される。

【0121】

「有機溶媒」は、液体状態で存在する、天然に存在する又は合成有機化合物に関する。本発明の実施に好適な例としては、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、及びフェノキシエタノールを含むが、これらに限定されない。

【0122】

「有機ポリマー」は、自然に発生する有機単量体の合成ポリマーに関する。例としては、とりわけ、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、デキストラン、又はセルロースを含むが、これらに限定されない。

【0123】

「ポリヌクレオチド」は、鎖において、多様な共有結合されたヌクレオチド単量体から構成されるバイオポリマーに関する。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。

【0124】

「タンパク質」は、炭素、水素、酸素、窒素、及び通常は硫黄を含有し、主として、ペプチド結合により繋がったアミノ酸の１以上の鎖からなる有機高分子の複合体の任意のグループに関する。タンパク質は、天然又は組み換え由来であってもよい。タンパク質は、グリコシル化、ペグ化、又は他の化学的部分との接合を経たような非アミノ酸部分で変性されてもよい。タンパク質の例としては、抗体、凝血因子、酵素、及びペプチドホルモンを含むが、これらに限定されない。

【0125】

「未溶解ウレイド」は、特定のタンパク質製剤において広くゆき渡った状態下で、ウレイドの最大の溶解度を超過した量を含有する溶液に関する。ある実施形態において、本発明は、そのようなウレイドのいくつかの小部分が、そのサンプル中に未溶解の形態で存在している、そのようなサンプルの状態下、そのようなサンプルにおいて、そのようなウレイドの溶解度を超える量で存在するウレイドとサンプルを提供する。

【0126】

「界面活性剤」は、それらを両親媒性と呼ばせる、一般的に、疎水性の部分と親水性の部分を表す有機分子の分類のような「表面活性剤」を含む。水溶液における十分な濃度で、界面活性剤は、水との接触が最小になるように中心に集まる疎水性の部分と、水との接触が最大になるように外側に放射する親水性の部分とにより、クラスター中に自己会合できる。生物学的な調剤、とりわけ、疎水性の性質有すか、或いは疎水性の性質の領域を有する物質を含むものの存在下で、界面活性剤の疎水性の部分は、自発的に、疎水性の物質のいくつかの部分と会合しやすく、界面活性剤の親水性の部分の影響を通して、それらの溶解性を増大させる。それらは、水溶性溶媒に溶解させた疎水性の異なる物質の双方の間に生じる疎水性の相互作用を調整するのに使用されてもよい。本発明のある実施形態を実施するのに好適な界面活性剤の例は、ポリソルベート界面活性剤（例えば、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、ポリオキシエチレン（２０）モノラウリン酸ソルビタン、及びトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、ポリオキシエチレン（２０）モノオレイン酸ソルビタン）及びトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（例えば、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）のような非イオン性の界面活性剤、及びＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）、及びオクチルグルコシド（例えば、（２Ｒ，３５’，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−６−オクトキシオキサン（ｏｃｔｏｘｙｏｘａｎｅ）−３，４，５−トリオール）のような双性イオンの界面活性剤を含むが、これらに限定されない。

【0127】

「ウイルス」又は「ウイルス粒子」は、生きている宿主、主に細菌、植物、及び動物の細胞内のみで複製する、極微（ほぼ直径２０〜３００ｎｍ）の、代謝的に不活性な、感染病原体に関する：ＲＮＡ又はＤＮＡコア、タンパク質コート、及び、多くの複合タイプで構成され、外膜で覆われる。

【0128】

ある実施形態に係る本発明を使用した調製において、正電荷有機添加剤を選択する必要があるだろう。実験データは、一般的な事項として、正電荷有機添加剤の疎水性が弱いほど、注目するタンパク質の回収率が高いことを明らかにする。また、疎水性が弱いほど、正電荷有機添加剤が、タンパク質のかなりの損失なく効果的な凝集体の低減を達成するのに適用できる濃度範囲は幅広く高い。従って、弱い疎水性のＰＥＩは、疎水性のエタクリジンより好ましい候補であり、疎水性のクロルヘキシジンより、一層好ましい候補であると考えられる。しかしながら、他の課題として、産物の回収率に勝ることが考慮されなければならない。ＰＥＩは周知の細胞毒性の特性を現し、精製処理の過程を通して、タンパク質製剤からの除去を容易に確認するために適切な感度で検出するのは難しい。エタクリジンは、抗ウイルス薬として、血漿タンパク分画の分野におけるその長い歴史を理由に好ましいであろう。加えて、その明るい黄色及び内因性の蛍光は、与えられたサンプルの内容物の感度測定を容易にし、これにより、前記方法の実施に続く除去の証拠資料を助ける。異なる正電荷有機添加剤は、所望の効果を仲介するそれらの能力を促す、異なる副次的な化学的官能性を現すだろう。例えば、ＰＥＩは、主に、静電的な相互作用、及び水素結合によって、ＤＮＡと結合すると理解される。エタクリジンは双方の相互作用の僅かな機会を提供するが、ＤＮＡをインターカレートすることが知られている。そのような違いは、僅かに貢献するものであるかもしれないが、他に対する、特定の正電荷有機添加剤の相対的な適合性において有用であり、表面上は非理想の様である評価する候補に、実際の利益があるとのポイントを強調する。

【0129】

ある実施形態において使用する正電荷有機添加剤の評価の過程で、正電荷有機添加剤の適用の条件は、以下のとおり調査されてもよい。正電荷有機添加剤の使用は、潜在的に、ある実施形態において、前記方法が実施され得る条件において、いくつかの制限を課す。例えば、実質的に正電荷有機添加剤と注目するタンパク質との間の強い相互作用を防ぐ条件を採用するのが望ましい。そのような条件の近似を得るための簡単な方法は、アニオン交換体に注目するタンパク質を適用し、塩勾配に溶出することである。塩濃度は、タンパク質が溶出する閾値の真上、前記方法が最も効果的に実施される最小の電気伝導率であることを、一応確認する。この濃度は、前記同じ手段によりモデルが形成され、ｐＨに影響を受けるだろう。前記方法が細胞培養上清に適用されれば、ＩｇＧ抗体は、前述のかなりの損失を避けるために、塩の添加又はｐＨの調整を必要としないだろう。ＩｇＭ抗体は、塩の添加、３０ｍＳ／ｃｍの値に届く電気伝導率（生理学的なものより約２倍高い値）を必要とするだろう。ある実施形態において、未溶解ウレイドと正電荷有機添加剤との使用を伴う、ＩｇＧの適用は、潜在的に１ｍＳ／ｃｍ以下の値を含む、生理学的な電気伝導率より低い値で実施され、この場合、ホストタンパク質の相当量が解離する凝集体と併せて除去される。そのような適用は、ホストタンパク質への結合により損失した量の補填のために、正電荷有機添加剤の濃度が増加することを必要とする。そのような状況におけるより低い作用電気伝導率は、ＤＮＡ、内毒素、及びウイルスの除去も向上させる。ある実施形態において、本発明は、一般的に、９５％より高く、通常９８−９９％の抗体の回収率を維持する。サンプルの電気伝導率及びｐＨ条件は、典型的には、ウレイド又は正電荷有機添加剤の何れかを添加する前に確立すべきである。

【0130】

ある実施形態において、及びイオン性の相互作用により仲介されたプロセスのほとんどに反して、本発明を実施するための条件の評価が、実質上の最小値を実質的に上回る電気伝導率の値を明確に含み、潜在的に好むことが推奨される。生理学的な電気伝導率のかなり低い条件は、とりわけ、細胞培養上清のような粗製サンプルに適用する際、１つがそのような条件が沈殿物の形成を促進し得る、潜在的に少なくとも２つの望ましくない結果を生み出す、酸性のタンパク質と正電荷有機添加剤の強い相互作用を促進し得る。他には、酸性タンパク質及び／又は沈殿物により正電荷有機添加剤の部分母集団を隔離することであり、凝集体内容物を低減する本発明の能力を制限する潜在的な効果を備える、残った正電荷有機添加剤の利用できる濃度を低減させる。一般的な事項として、生理学的なものの３倍までの電気伝導率の値は、効果的な凝集体の低減、及び９０％より高い抗体の回収率を維持する。

【0131】

ある実施形態において、及びイオン性の相互作用、とりわけ、生体分子と正電荷有機添加剤との間の相互作用により仲介されるプロセスほとんどのための推奨に反して、ｐＨは４以下の値にまで低減され得る。そのような極度は必要とされるとしても極めてまれであり、タンパク質の溶解性を維持するために中性のｐＨの値より高い電気伝導率を要する。

【0132】

ある実施形態において、ＩｇＧモノクローナル抗体を含有する細胞培養の上澄液を浄化するための評価条件の１つの効果的な手段は、正電荷有機添加剤が０．００５〜０．０５％の範囲にあり、電気伝導率が生理学的な電気伝導率からその２倍までの範囲にあることである。その範囲は、拡大でき、所望に応じて狭められる。これらの範囲内で沈殿が観察される場合において、しばしば、凝集体の低減を縮小することなく、電気伝導率を生理学的なものの３倍まで増加させることによって防げる。これは、約４５ｍＳ／ｃｍに対応する。より高い電気伝導率もまた使用できる。一般的に、正電荷有機添加剤を添加する前にサンプルの電気伝導率を調整することは有利である。

【0133】

ある実施形態において、細胞培養の上澄液を浄化するための、本発明に係る精製手順を進展させるための都合のよい出発点は、０．０２％エタクリジンを使用することである。細胞含有の未浄化の収集物（ｈａｒｖｅｓｔ）は、その細胞がヘテロ−凝集体の分離に利用できる量を減らすための十分な正電荷有機添加剤を引き付けるから、おそらく、より高濃度での使用により利益を得る。本発明の副次的な利益は、細胞含有の調剤に適用される際、実質的に細胞及び残渣の沈降を加速することであり、それらの除去を容易にする。本発明が細胞含有の調剤に適用される際、調製中における過剰の細胞死亡率及び／又は細胞内容物の排出を避けるため、生理学的な条件の付近に維持するのが賢明である。

【0134】

ある実施形態において、その実施により抗体の回収率を改良し得るから、正電荷有機添加剤を添加する前に、タンパク質製剤に有機調節因子を分散することにより開始することが有利である。正電荷有機添加剤の添加前の長いインキュベーションは不要であると考えられる；より長いインキュベーションが不利でないように見えるけれども、１５分以下で十分である。実験データは、一般的に、正電荷有機添加剤より先に添加する際、過飽和させる量でのアラントインの添加がＩｇＧの回収率を約１％増加させることを示す。

【0135】

ある実施形態において、タンパク質製剤全体にわたって迅速な分散を容易にするために、サンプルへの追加の前に、例えば水又は緩衝液に、正電荷有機添加剤カチオンが溶解されていることが推奨される。例えば、よく混合された懸濁液中に溶解された正電荷有機添加剤に徐々に注ぐことによって、残留する局所的な過剰を避けることに注意すべきである。インキュベーション時間は、６０分間より長い継続から十分に効果が見られないから、少なくとも１５分間、好ましくは３０分間とすべきである。

【0136】

前記方法は、一般的に、常温で実施されてもよいが、より高い温度又はより低い温度、例えば、４〜３７℃の範囲の温度で、実施されてもよい。実験データは、温度が、実質的に得られる結果を変えないことを示し、作業温度選択においては、タンパク質の安定性要求が決定的な要因のままとなるだろう。

【0137】

ある実施形態において、正電荷有機添加剤は、例えば水又は緩衝液に溶解又は分散され、サンプルへの添加前に、ｐＨが調整される。これは、ある正電荷有機添加剤、とりわけ、カチオン性ポリマーを含む正電荷有機添加剤は、極端にアルカリであり、意図しない方法において、実質的に実験条件を変えることへの可能性を有することが理由である。

【0138】

過飽和のウレイド及び正電荷有機添加剤の双方の使用を含む実施形態において、一般的に、ウレイドアラントインを用いたことが、この実施が抗体の回収率を改良できることを示すから、正電荷有機添加剤を添加する前にタンパク質製剤に分散したウレイドで開始することは有利であろう。正電荷有機添加剤の添加前の長いインキュベーションは、不要と思われ、より長いインキュベーションは不利ではないように見えるが、１５分以下が適切である。

【0139】

ある実施形態において、組合せ及び実施上の条件が特定用途に最も適しるように決定したプロセスを開始するために、有機調節因子及び正電荷有機添加剤を選択することが望ましいだろう。正電荷有機添加剤の性質が有機調節因子の最も好適な有機調節因子、又は実用的な濃度を、少なくとも部分的に決定する、及び／又は逆もまた同様であることの知識によって、その選択は助けられる。一般用語において、ある実施形態に関して、正電荷有機添加剤の疎水性が強いほど、疎水性の相互作用を弱める高い能力を備える有機調節因子、又は高濃度で使用されるためのより弱い疎水性の調節因子の必要性は高い。これは、調節は水素結合、並びに疎水性の相互作用及び水素結合の能力の異なるバランスを現すことが期待され得る、異なる正電荷有機添加剤、及び異なる有機調節因子も含まれるから、単純化され過ぎであるが、その考えは示される。この弱い疎水性のＰＥＩは、効き目の軽い有機調節因子の最小の濃度で良好な結果をもたらし得るから、場合によっては好ましいが、細胞毒性の特性、及び精製処理の過程を通したタンパク質製剤からの除去を簡単に確認するため、適切な感度でのＰＥＩを検出することが潜在的に困難であることから、ＰＥＩは好ましくないだろう。強力に、疎水性のエタクリジンは、相互作用した物質の沈殿が生じる傾向を理由に、場合によっては好ましくないだろう。しかしながら、抗ウイルス薬として、血漿タンパク分画の分野におけるその長い歴史から、エタクリジンは好ましいだろう。付加的に、その明るい黄色及び内因性の蛍光は、与えられたサンプルの内容物の感度測定を容易にし、これにより、前記方法の実施に続く除去の証拠資料を助ける。エタクリジンの結合／沈殿傾向は、適切な濃度で、適切な有機調節因子によって補われる。クロルヘキシジンの優れた疎水性は調節のさらに高い程度を必要とするが、その選択は、２８０ｎｍでのその強いＵＶ吸光度によって防がれるだろう。

【0140】

手順の進展中であろうと又は生成中であろうと、前記方法による凝集体の分離又は除去の達成を観察するための、複数の選択肢は存在する。最も単純なのは、好適な選択性でカラムの分析的サイズ排除クロマトグラフィを実施し、２８０ｎｍのＵＶ波長で観察することである。これは、通常、非凝集の産物の大きさの整数倍に適度に従う、流体力学的な寸法を示すから、ＨＭＷ凝集体を明らかにするだろう。ヘテロ−凝集体は、それらの流体力学的な寸法が非凝集の産物のそれよりわずかに優れるだけであるから、この方法によって、よく見落とされる。そのような場合において、会合した不純物が全く無いことが信じられている浄化されたタンパク質の吸光度比に対する値と比較するとき、凝集体の異形の組成物は、ＵＶ吸光度２８０ｎｍに対するＵＶ吸光度２５４（又は２６０）ｎｍの比を算出することによって明らかとなるだろう。例えば、ＤＮＡ含有ヘテロ−凝集体は、２５４／２８０の高い比によって明らかになるだろう。クロマトグラフが機能を提供するなら、エタクリジンの内容物は３６５ｎｍで同時に観察される。これは、その後の精製処理でエタクリジンの除去を実証するのに役立ち得る。多数の波長観察は、他のクロマトグラフィ法と併用して使用されることもできる。

【0141】

ある実施形態において、その後の精製より前に、本発明は、正電荷有機添加剤、及び潜在的にサンプルの他の成分を取除くための処理と一体として実施できる。そのような処理は、サンプルの残りから正電荷有機添加剤を隔離する目標と共に、性質上、正電荷有機添加剤の特性に相補性のある化学的部分を備える固形分へのサンプルの暴露を含んでもよい。

【0142】

ある実施形態において、本発明は、これらに限定されないが、タンパク質Ａ及び他の形態の生物学的親和性クロマトグラフィ、アニオン交換クロマトグラフィ、カチオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイト、若しくは他の複合モードクロマトグラフィ、並びに／又は沈殿及び液−液抽出のような非クロマトグラフィによる方法を含む、１以上の精製方法と一体として実施できる。特定の抗体の精製に必要なことを達成するために、種々の方法に対して適切な条件を開発すること、及びそれらを本願明細書に記載の本発明と一体として実施することは、当該技術分野の当業者の技能の範囲内である。

【0143】

ある実施形態において、本発明の実施において使用するための評価に対して、少なくとも１つのウレイドの種類を選択する必要性がある。尿酸は、実質的には不溶性であり、未溶解のアラントインは正電荷有機添加剤の効果を調節するように見え、典型的には高い抗体の回収率を維持するが、未溶解の尿酸の除去後に、ほとんど処理されたタンパク質製剤が存在しないとの利益を備える。正電荷有機添加剤の選択に関して、エタクリジンは、特に、抗ウイルス薬として、血漿タンパク分画の分野におけるその長い歴史を含む、いくつかの魅力的な特徴を提供する。また、ＤＮＡをインターカレートし、内毒素と強く結合する。付加的に、その明るい黄色及び内因性の蛍光は、与えられたサンプルの内容物の感度測定を容易にし、これにより、前記方法の実施に続く除去の証拠資料を助ける。

【0144】

ある実施形態において、ウレイド及び正電荷有機添加剤の望ましい濃度は、処理に用いられるタンパク質製剤の組成物によって影響される。細胞培養の上澄液を浄化するための都合のよい出発点は、１％アラントイン及び０．０２％エタクリジンである。双方は、実験的に、所望の結果を提供する微調整した量に変更できる。細胞含有の細胞培養収集物（ｈａｒｖｅｓｔ）への本発明の適用は、おそらく、ウレイド及び正電荷有機添加剤の双方を多量に必要とするだろう。実験データは、特に、ある実施形態において、過飽和を達成するためにより多い量のアラントインが必要とされ、細胞表面における損失量を補填するためにより多い量のエタクリジンが必要とされる得ることを示す。実験は、双方の好適に有効な量を明らかにするのに役立つだろう。本発明は、ある実施形態において、とりわけ、かなり高い細胞密度の培養が、凝集した抗体の大部分を産生する状況において、凝集体を除去するよりむしろ分離することによって、抗体の回収率を増加させる価値のある利益を提供する。これにより、実質的に、産生／精製プロセス全ての生産性及び経済性を改良する結果と共に、非常に高生産性である細胞培養からのタンパク質の精製を可能にする。本発明の他の利益は、実質的に細胞及び残渣の沈降を加速することであり、それらの除去を容易にする。

【0145】

示差走査熱量測定からのデータは、３５ｍＭ（飽和付近）のアラントインが、３５ｍＭの尿素が熱転移温度を下げる量の約半分によって、ＩｇＧに対し熱転移温度を下げる効果を有することを示す。これは、アラントインによるタンパク質変性のリスクが無いことを示す。正電荷有機添加剤とアラントインの組合せが正電荷有機添加剤を単独で用いて達成したレベルを超えて、ウイルス不活化のレベルを増加し、そのようなウイルス不活化が、未溶解ウレイドによるウイルスの結合に加えて起こることも示す。

【実施例】

【0146】

実施例１
ＨＭＷ凝集体の低減及びヘテロ−凝集体の分離について、正電荷有機添加剤の比較。モノクローナルＩｇＭ含有の浄化された細胞培養上清を、２００ｍＭのアルギニン、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＭＥＳを含む、ｐＨ６．５の緩衝液において、実施されたサイズ排除クロマトグラフィによって分析した。その物質は、１１％のＨＭＷ凝集体及びヘテロ−凝集体の実質的な存在を示す、０．５０６の２５４／２８０比を示したＩｇＭピークを含んでいた。上清の電気伝導率を、塩化ナトリウムの添加によって、２０ｍＳ／ｃｍまで上げた。９つのサンプルを、０．０１、０．０５、及び０．１％のＰＥＩ−１２００、０．０１、０．０５、及び０．１％のエタクリジン、並びに０．０１、０．０５、及び０．１％のクロルヘキシジンで処理し、３０分間インキュベートし、次いでＳＥＣにより分析した（結果は以下に示す）。０．１％のクロルヘキシジンのサンプルは、分析の前に沈殿した。サンプルを３０分間インキュベーションし、次いでＳＥＣにより分析した。エタクリジンだけＨＭＷ凝集体を除去した。効果的なヘテロ−凝集体の分離も維持した。ＰＥＩは、全ての濃度で、９７％より優れた回収率、及び良好なヘテロ−凝集体の分離を提供したが、ヘテロ−凝集体の低減には乏しかった。クロルヘキシジンは、ほぼエタクリジン及びＰＥＩの中間であった。

【0147】

【表1】

【0148】

実施例２
ＨＭＷ凝集体の低減及びヘテロ−凝集体の分離について、正電荷有機添加剤の比較。他の抗体を用いて、実施例１の形式を再び実施した。この抗体は７．５％のＨＭＷ凝集体及び低いヘテロ−凝集体が内容物であることを示した。傾向は、基本的に実施例１におけるサンプルと同じであるが、明らかな違いがあり、明らかに、抗体の特性に起因し得る。以下に示す。

【0149】

【表2】

【0150】

実施例３
より高い電気伝導率の効果。実施例２の一連のエタクリジンを、４０ｍＳ／ｃｍの上清の電気伝導率で再び実施した。ＨＭＷ凝集体及びヘテロ−凝集体レベルは、未処理の対照において２０ｍＳ／ｃｍより低い値であった。ＨＭＷ凝集体はエタクリジンの濃度に対しては同様の傾向を示したが、回収率が低い一方、ヘテロ−凝集体は反対方向に向かう傾向がある。

【0151】

【表3】

【0152】

実施例４
モノクローナルＩｇＭ含有の細胞培養上清におけるＤＮＡ抗体のヘテロ−凝集体のレベルを低下させることについて、作用濃度の測定。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィは、モノクローナルＩｇＭクローン８５をＤＮＡと大いに複合化したことを示した。これは、ほぼ、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度と同等である、２５４ｎｍでのＩｇＭピークのＵＶ吸光度によって明らかとなった。ＤＮＡ−フリー（ｆｒｅｅ）ＩｇＭは約２：１の２８０／２５４比を有する。ＩｇＭからＤＮＡを解離するための最も有効な組合せを測定するため、正電荷有機添加剤ＰＥＩ−１３００及びウレイドアラントインの様々な組合せと、モノクローナルＩｇＭ含有の浄化された細胞培養上清の１０ｍＬサンプルを合わせて、実験を行った。サンプルは、最初は、不純物の存在のためにその色が黄褐色であり、少しばかりの濁りは沈殿の存在を示す。乾燥アラントイン粉末の直接の添加によって、全てのサンプルをアラントインで飽和した。アラントインを含むサンプルの全ては、見かけが濃い乳白色である。ＰＥＩの原液を、酢酸を用いてｐＨ７．０とした５０％のＰＥＩ−１３００（Ｓｉｇｍａ）を滴定することによって調製し、水を加えて最終的なＰＥＩ濃度を１０％とした。ＰＥＩを、サンプルに加え、２％、１％、０．５％、０．０２５％、０．０１２５％、及び０．００６２５％の最終濃度とした。ＰＥＩを欠くがアラントインを含む、実験対照を調製した。別の対照を、アラントインの不存在下で、０．０５％ＰＥＩで調製した。後者の対照において、濁度は変わらないままであり、ＰＥＩ−１３００だけでは、実質的なＤＮＡ又は他のサンプルの内容物の沈殿を起こす能力が無いことを示す。それぞれのサンプルを０．２２μｍの膜を通してろ過した。サンプルを容易にろ過し、処理後、光学的に透明に光っていた。これは、本発明の特定の特徴である。それぞれのサンプルを、ｐＨ７．０で、５０ｍＭのＨｅｐｅｓで平衡化したヒドロキシアパタイトのカラム（ＣＨＴ ｔｙｐｅ ＩＩ、４０μｍ、１ｍＬ、５×５０ｍｍ、１ｍＬ／分）に適用し；ｐＨ７．０で、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ＭのＮａＣｌで洗浄し；初期条件に再平衡化した；ｐＨ７．０で、２５０ｍＭのリン酸ナトリウムに、１０カラム容量（ＣＶ）の直線勾配で溶離した；次いで、ｐＨ７．０で、５００ｍＭのリン酸塩で洗浄した。ＰＥＩだけのサンプルは、部分的な分離を示した。非常に大きいＤＮＡピークは、洗浄工程で溶離した。アラントインだけのサンプルは、ＤＮＡ複合体のより少ない低減を示したが、非常に少ないＤＮＡは洗浄のピークで溶離した。ＰＥＩ／アラントインで処理したサンプルの全てから溶離したＩｇＭは、ＩｇＭから分離した実質的に完全なＤＮＡを示す理想的な２８０／２５４比を与え、ごく少量のＤＮＡのみが洗浄工程で溶離した１％のＰＥＩにて前記実験から回収されたヒドロキシアパタイトで分画したＩｇＭを分析的ＳＥＣカラムに適用した。ＩｇＭを、ＤＮＡが残っていることを示さない、９５％より高い純度であると推定した。この例は、供給材料における高いＤＮＡレベルの存在により通常は無効となる方法によって、有効な産物回収を可能とする本発明の能力を説明する。それは、正電荷有機添加剤及び水素供与体／受容体の組合せがＤＮＡ（正電荷有機添加剤に対して高い親和性を有する）と、ＤＮＡより低いが正電荷有機添加剤に対する高い親和性を有する産物との間の微細な区別を達成できることも明らかにする。この実験は、また、重要な見識及びこの技術の価値のある実施例をもたらした。ＰＥＩだけの処理におけるＤＮＡピークは、ほぼ、未処理のサンプルにおけるＤＮＡピークの２倍の大きさであった。これは、ほぼ、元のサンプルにおけるＤＮＡの半分をタンパク質とのヘテロ−凝集体に含むことを示し、それらの分離の重要性を強調する。この実施例は、また、非常に透明な生物サンプルを達成できる、極めて珍しく、望ましい結果を達成する前記方法の能力を強調する。多くの方法は、細胞培養上清を浄化するために存在するが、全て、サンプルにおいて明らかな曇りを残し、この曇りは、しばしば後の精製のための方法に干渉すると疑われる。前記方法で処理された溶液の著しい透明さは、とりわけ、未溶解アラントインと併用して実施したとき、他の方法との明らかな差異を強調する。

【0153】

実施例５
好ましい添加の順序の決定。実験を、０．０２５％のＰＥＩ−１３００及び飽和アラントインで処理した実施例４に記載の抗体の２分割量において実施した。ＰＥＩを、一つの実験において、最初に加え、他において、アラントインを最初に加えた。サンプルをろ過し、上記のとおり、ヒドロキシアパタイトカラムに適用した。アラントインで最初に処理したもののＩｇＭピークは、ほぼ、ＰＥＩで最初に処理したものの２倍の大きさであった。これらの結果は、産物回収率を最大化するための添加の順番の重要性を強調し、また、正電荷有機添加剤とタンパク質との相互作用を調節するアラントインの能力を強調する。

【0154】

実施例６
インキュベーション時間の測定。実験を、ＰＥＩの添加前に１〜３０分、及びＰＥＩの添加後、濾過の前に１〜３０分間の間隔でインキュベートしたアラントインにおいて実施した。ヒドロキシアパタイトカラムでの２８０／２５４比、又はＩｇＭピークの大きさにおいて、明らかな傾向は無かった。これは、ＤＮＡ分離及び除去の速度が速いということを示唆する。

【0155】

実施例７
モノリスにおける立体排除クロマトグラフィによるＩｇＭの精製。ＩｇＭ−Ｂ０７細胞培養上清のサンプルを、上記のとおり、１％のＰＥＩ−１２００及び飽和アラントインで処理した。８ｍＬのヒドロキシルモノリス（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を、ｐＨ７．０で、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のポリエチレングリコール６０００を用いて、平衡化した。処理したＩｇＭ上清を、１０％のＰＥＧで適用した；カラムを、平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、３．７５ＣＶ直線勾配で、ｐＨ７．０で、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣｌに溶離した。未処理のサンプルを、その後、参考までに、クロマトグラフした。未処理の参考用サンプルは、ブロードな、立下りの（ｔｒａｉｌｉｎｇ）、薄い、混濁したピークに溶離した。処理したサンプルは、シャープな、対称的な、濃縮した、光学的に透明なピークに溶離し、凝集体の立下りの（ｔｒａｉｌｉｎｇ）ピークからよく分離した。分析的ＳＥＣは、処理したサンプルからのＩｇＭが、９５％より高い純度であり、ただこの一度だけのクロマトグラフィ工程後に凝集体が無いことを示した。

【0156】

実施例８
酵素により消化されたＤＮＡの除去。ＤＮＡをフラグメントに消化するため、モノクローナルＩｇＭクローンＡ４を、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）で事前に処理した。ついで、ヘテロ−凝集体を分離するために、飽和アラントイン及び０．０１％のＰＥＩ−１３００で処理した。沈殿物を除去し、立体排除クロマトグラフィによって、サンプルは分画した。ＤＮＡが実質的に溶離した抗体に存在しないことは、小さいＤＮＡフラグメントの除去に対する本発明の有効性が大きいＤＮＡの除去に対するその有効性と同等であることを示している。

【0157】

実施例９
ＰＥＩ−１３００の代わりにエタクリジンを用いること以外は、実施例４の形式を再び実施した。エタクリジンが、より狭いダイナミックレンジを提供するが、同様の結果を生み出すということが見出された。抗体回収率は、０．００６２５％に下がるまでのエタクリジンの濃度に反比例した。ＤＮＡ分離の効率は、０．００１％〜０．００６２５％のエタクリジンの濃度に比例した。

【0158】

実施例１０
クロルヘキシジンとのＩｇＭ−ＤＮＡ複合体の分離。ろ過したＩｇＭ８５含有細胞培養上清を強力なアニオン交換多孔性粒子の樹脂（ＥＭＤ ＴＭＡＥ）に適用し、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）に、直線勾配で分画した。高いＤＮＡ含有量が知られているにもかかわらず、ＤＮＡピークは全ＤＮＡの約２％を表すように見えた。ＩｇＭ及びＤＮＡの間で溶離する、２５４ｎｍでの高い吸収を有するピークは、ＤＮＡの残りがヘテロ−凝集体に存在していたことを示した。飽和アラントインで処理したＩｇＭ８５のサンプルは、小さいが、ヘテロ−凝集体の量における一定の低減と、対応するＤＮＡピークにおける増加とを示した。クロルヘキシジンを、０．００１〜１％の範囲のレベルで、アラントイン−飽和サンプルに加え、処理したサンプルはアニオン交換体に適用した。ヘテロ−凝集体を分離し、ＤＮＡは、０．０１〜１．０％の範囲のクロルヘキシジンにおいて除去した。複合体を、低い濃度で部分的にだけ分離し、ＤＮＡの低減は最小であった。激しい抗体の低減を、１％及び０．５％のクロルヘキシジンで観察した。これらの結果は、クロルヘキシジンがヘテロ−凝集体の分離、及び飽和アラントインの存在下でのＤＮＡ除去に有効である一方、その有効な範囲がＰＥＩ−１３００又はエタクリジンより高くも狭くもあることを示す。この実施例は、また、事前にＤＮＡを除去してしまう本発明のため、ＩｇＭの回収方法としてのアニオン交換クロマトグラフィの実施可能性を説明する。実施例４との比較は、ＩｇＭの回収方法としてのヒドロキシアパタイトの実施可能性を示した。

【0159】

実施例１１
上記の実験によって明らかにされるように、正電荷有機添加剤の疎水性の増加は、例えば一連のＰＥＩ、エタクリジン、クロルヘキシジンにおいて、有用なダイナミックレンジの狭小化、及び注目するタンパク質の損失の増加という結果となる。実験に基づく比較を、０．０２％のエタクリジン又は０．０２％のＰＥＩ−１３００と組み合わせて、１％の尿と１％のアラントインとの間で作成した。ＩｇＭ回収率は、双方のウレイドとＰＥＩ、及びアラントインとエタクリジンに対して同等であったが、エタクリジンと尿酸の組合せでは約９４％まで低減した。これらの結果は未溶解溶液の飽和成分アラントイン（約３６ｍＭ）が、エタクリジンと抗体との相互作用を変性することを示すことを解釈した。凝集体の分離は、全ての処理において同等であった。ＳＥＣもまた、全ての上記実験のように、処理の結果として、抗体ピークの見かけの大きさが低減することが明らかとなった。これは、溶出時間において、僅かだが明確な増加が観察され、肉盛りした特性によって明確に明らかとなった。２５４／２８０比の平行した低減は、サイズにおける変化が、抗体と会合する２５４−ドミナント（ｄｏｍｉｎａｎｔ）の不純物の除去に起因することを示す。

【0160】

実施例１２
細胞含有の培地ブロス（ｂｒｏｔｈ）へのアラントイン及びエタクリジンの添加。１．５Ｌのハイブリドーマ培地ブロスを振とうフラスコから回収した。電気伝導率を２５ｍＳ／ｃｍに調整し、アラントイン及びエタクリジンを、１％（ｗ／ｖ）及び０．０２％（ｗ／ｖ）となるようにそれぞれブロス（ｂｒｏｔｈ）に加え、２０分間室温でよく混合した。混合物を遠心分離により浄化し、分析的ＳＥＣによって分析した。この初期では、ヘテロ−凝集体を観察せず、ＩｇＭピークの２５４／２８０ピーク高さ比が１：２であり、ＩｇＭがほとんどＤＮＡ不純物を含まないことを示した。この実施例は、ＤＮＡの除去、及び細胞除去と凝集体の分離を統合できることを示す。

【0161】

実施例１３
モノクローナルＩｇＭ含有の細胞培養上清における、ＤＮＡ−抗体のヘテロ−凝集体のレベルを低下させるための作用濃度の測定。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィは、モノクローナルＩｇＭクローン８５をＤＮＡと大いに複合化したことを示した。これは、ほぼ、２８０ｎｍでのそのＵＶ吸光度と同等である、２５４ｎｍでのＩｇＭピークのＵＶ吸光度によって明らかとなった。ＤＮＡ−フリー（ｆｒｅｅ）ＩｇＭは、約２：１の２８０／２５４比を有する。ＩｇＭからＤＮＡを解離するための最も有効な組合せを測定するため、正電荷有機添加剤ＰＥＩ−１３００及び１Ｍの尿素の様々な組合せと、モノクローナルＩｇＭ含有の浄化した細胞培養上清の１０ｍＬサンプルを合わせて、実験を行った。サンプルは、最初は、不純物の存在のためにその色が黄褐色であり、少しばかりの濁りは、沈殿の存在を示す。ＰＥＩの原液を、酢酸を用いてｐＨ７．０とした５０％のＰＥＩ−１３００（Ｓｉｇｍａ）を滴定することによって調製し、水を加えて最終的なＰＥＩの濃度を１０％とした。ＰＥＩを、サンプルに加え、２％、１％、０．５％、０．０２５％、０．０１２５％、及び０．００６２５％の最終濃度とした。乾燥尿素を、１Ｍの濃度に加えた。ＰＥＩを欠くが、１Ｍの尿素を含む、実験対照を調製した。別の対照を、尿素の不存在下で０．０５％のＰＥＩで調製した。後者の対照において、濁度は変わらないままであった。それぞれのサンプルを０．２２μｍの膜を通してろ過した。それぞれのサンプルを、ｐＨ７．０で、５０ｍＭのＨｅｐｅｓと平衡化した、ヒドロキシアパタイトのカラム（ＣＨＴ ｔｙｐｅ ＩＩ、４０μｍ、１ｍＬ、５×５０ｍｍ、１ｍＬ／分）に適用し；ｐＨ７．０で、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ＭのＮａＣｌで洗浄し；初期条件に再平衡化し；ｐＨ７．０で、２５０ｍＭのリン酸ナトリウムに、１０カラム容量（ＣＶ）の直線勾配で溶離し；次いで、ｐＨ７．０で、５００ｍＭのリン酸塩で洗浄した。ＰＥＩだけのサンプルは、ヘテロ−凝集体の部分的な分離を示したが、洗浄工程における非常に大きいＤＮＡピークはヘテロ−凝集体の分離が、それにもかかわらず、実質的にあったことを示した。尿素だけのサンプルは、ヘテロ−凝集体のより少ない低減、及び洗浄工程のピークにおいてより少ないＤＮＡを示した。ＰＥＩ／尿素で処理したサンプルの全てから溶離したＩｇＭは、ただ無視してよい量だけの洗浄工程で溶離したＤＮＡと共に、実質的に完全なヘテロ−凝集体の分離を示す、２．０より優れた２８０／２５４比を与えた。１％のＰＥＩでの実験から回収したヒドロキシアパタイトを、分析的ＳＥＣカラムに適用した。０．２％未満のＨＭＷ凝集体と、ＩｇＭを９５％より高い純度であると概算し、ヘテロ−凝集体は見られなかった。回収率は９８〜９９％であった。この実施例は、供給材料における高いＤＮＡレベルの存在により通常は無効化された方法によって、有効な産物回収を可能とする本発明の能力を説明する。これらの結果は、未処理のサンプルと比較して、抗体と他のタンパク質と共に元のサンプルにおける大部分のＤＮＡをヘテロ−凝集体に含むことの重要な点を強調する。

【0162】

実施例１４
好ましい添加の順番の測定。実験を、０．０２５％のＰＥＩ−１３００及び１Ｍの尿素で処理した実施例１４に記載の抗体の２分割量において行った。ＰＥＩを、一つの実験において、最初に加え、他において、尿素を最初に加えた。サンプルをろ過し、上記のとおり、ヒドロキシアパタイトカラムに適用した。尿素で最初に処理したもののＩｇＭのピークは、ほぼ、ＰＥＩで最初に処理したもののピーク２倍の大きさであった。これらの結果は、産物回収率を最大化するための添加の順番の重要性を強調し、また、正電荷有機添加剤とタンパク質との相互作用を調整する尿素の能力を強調する。

【0163】

実施例１５
モノリスにおけるサイズ排除クロマトグラフィによる複数の構成要素からなるＩｇＭの精製。ＩｇＭ−Ｂ０７細胞培養上清のサンプルを、１％のＰＥＩ−１２００及び１０％のプロピレングリコールで処理した。８ｍＬのヒドロキシルモノリス（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を、ｐＨ７．０で、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のポリエチレングリコール６０００を用いて平衡化した。処理されたＩｇＭ上清を１０％のＰＥＧで適用した；カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、３．７５ＣＶ直線勾配で、ｐＨ７．０で、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣｌに溶離した。未処理のサンプルを、その後、参考までに、クロマトグラフした。未処理の参考用サンプルは、ブロードな、立下りの（ｔｒａｉｌｉｎｇ）、薄い、混濁したピークに溶離した。処理したサンプルは、シャープな、対照的な、濃縮した、光学的に透明なピークに溶離した。分析的ＳＥＣでは、処理したサンプルからのＩｇＭが、０．１％未満のＨＭＷ凝集体と共に、９５％より高い純度であることを示し、ヘテロ−凝集体は見られなかった。

【0164】

実施例１６
クロルヘキシジンと、ＩｇＭヘテロ−凝集体の測定。ろ過したＩｇＭ８５含有細胞培養上清を強力なアニオン交換多孔性粒子の樹脂（ＥＭＤ ＴＭＡＥ）に適用し、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）に直線勾配で分画した。高いＤＮＡ容量が知られているにもかかわらず、ＤＮＡピークは、全ＤＮＡの約２％だけを表すように見えた。ＩｇＭ及びＤＮＡの間で溶離する、２５４ｎｍでの高い吸収を有するピークは、ＤＮＡの残りがヘテロ−凝集体に存在していたことを示した。１Ｍの尿素で処理したＩｇＭ８５のサンプルは（クロルヘキシジンを含まない）、小さいが、ヘテロ−凝集体の量における一定の低減と、対応するＤＮＡピークにおける増加とを示した。クロルヘキシジンを、０．００１％〜１％の範囲のレベルで、１Ｍの尿素サンプルに加え、処理したサンプルはアニオン交換体に適用した。ヘテロ−凝集体を分離し、ＤＮＡは０．０１〜１．０％の範囲のクロルヘキシジンにおいて除去した。ヘテロ−凝集体を、低い濃度で部分的にだけ分離し、ＤＮＡの低減は最小化であった。深刻な抗体の低減を、０．５％及び１％のクロルヘキシジンで観察した。これらの結果は、クロルヘキシジンが、ＨＭＷ凝集体の除去及びヘテロ−凝集体の分離に対して有効であり、その有効な範囲が、ＰＥＩ−１３００又はエタクリジンより高くも及び狭くもあることを示す。この実施例は、また、事前にＤＮＡを除去してしまう本発明のためＩｇＭの回収方法としてのアニオン交換クロマトグラフィの実施可能性を説明する。実施例１４との比較は、ＩｇＭの回収方法としてのヒドロキシアパタイトの実施可能性を示した。

【0165】

実施例１７
ウイルス及びＤＮＡの低減。マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、及びチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞の生きたサンプルを含む細胞培養を、１％のアラントイン及び０．０２５％のエタクリジンで処理した。全ての実験を、生理学的な条件で行った。ＭｕＬＶは１．６ｌｏｇで低減した。ＭＶＭは３．１ｌｏｇで低減した。ＣＨＯ培養におけるＤＮＡは２．１ｌｏｇで低減した。アラントインの不存在下で０．０２５％のエタクリジンで処理した並行するサンプルの種類は、効果的でなく、１．３ｌｏｇｓでＭｕＬＶを、１．４ｌｏｇｓでＭＶＭを、及び１．６ｌｏｇｓでＤＮＡを低下させた。

【0166】

特定の要求に対応するために必要などんなボリュームでも、上述の実施例において説明したような実験に由来する拡大又は縮小の方法が当該技術分野の当業者によって理解されるだろう。

【0167】

本願明細書に引用した全ての参考文献は、参照によりその全体を援用したものとし、あらゆる目的のために、個々の出版物又は特許若しくは特許出願のそれぞれと同じ範囲が、特に及び個々に、参照によりあらゆる目的のためにその全体を援用されることを示す。本願明細書に含まれる開示と矛盾する、参照により援用された出版物及び特許又は特許出願の範囲のため、本願明細書が取って代わると意図され、及び／又はそのような矛盾する物質の何れにも勝る。

【0168】

成分の量を表す全ての数字、クロマトグラフィの条件、明細書及び特許請求の範囲で使用されたその他のものは、用語「約」との用語によって、あらゆる場合において、加減され得ると理解される。従って、反対を示していない限り、明細書及び特許請求の範囲において説明する数字で表したパラメータは、本発明により得られることが求められる所望のパフォーマンスによって調整され得る近似である。

【0169】

本発明の多くの調節及び変更は、その精神及び範囲から逸脱せずに可能であり、当業者に明らかである。本願明細書に記載される特定の実施形態は、例としてのみ示し、どんな方法であれ制限されることを意味しない。詳細な説明及び実施例はただ例となるものであると、特許請求の範囲によって示される本発明の本当の範囲及び趣旨と共に意図される。