特許 6493212 新規なグルコースデヒドロゲナーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6493212

(24)【登録日】2019年3月15日

(45)【発行日】2019年4月3日

(54)【発明の名称】新規なグルコースデヒドロゲナーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/04 20060101AFI20190325BHJP

   C12M 1/40 20060101ALI20190325BHJP

   C12Q 1/32 20060101ALI20190325BHJP

   C12Q 1/54 20060101ALI20190325BHJP

   G01N 27/327 20060101ALI20190325BHJP

   G01N 33/66 20060101ALI20190325BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/04 DZNA

   C12M1/40 B

   C12Q1/32

   C12Q1/54

   G01N27/327 353Z

   G01N33/66 Z

【請求項の数】7

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2015-543798(P2015-543798)

(86)(22)【出願日】2014年10月10日

(86)【国際出願番号】JP2014077223

(87)【国際公開番号】WO2015060150

(87)【国際公開日】20150430

【審査請求日】2017年8月30日

(31)【優先権主張番号】特願2013-218308(P2013-218308)

(32)【優先日】2013年10月21日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000003160

【氏名又は名称】東洋紡株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】相場 洋志

(72)【発明者】

【氏名】角田 洋輔

(72)【発明者】

【氏名】山崎 泰裕

(72)【発明者】

【氏名】歌島 悠

(72)【発明者】

【氏名】岸本 高英

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００４／０５８９５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／０２２０７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０７３９８７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１３−０８１３９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／１６９５１２（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下（Ａ）〜（Ｅ）の特性を有するフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
（Ａ）作用：電子受容体存在下でＤ−グルコースを酸化し、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。
（Ｂ）分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が６５０００
（Ｃ）熱安定性：６０℃１５分処理後の残存活性が８５％以上、かつ６５℃１５分処理後の残存活性が５０％以上、かつ７０℃１５分処理後の残存活性が１０％以上。
（Ｄ）至適反応ｐＨ：７．０
（Ｅ）基質特異性：
Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのマルトースに対する反応性が２％以下であり、かつ、
Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ−ガラクトースに対する反応性が２％以下であり、かつ、
Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ−キシロースに対する反応性が１０％以下である。

【請求項2】

アスペルギルス属糸状菌由来である、請求項１に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。

【請求項3】

アスペルギルス属糸状菌がアスペルギルス・エスピーＲＤ００９４６９株である、請求項２に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれかに記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼを生産するアスペルギルス属糸状菌を栄養培地にて培養し、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。

【請求項5】

請求項１〜３のいずれかに記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。

【請求項6】

請求項１〜３のいずれかに記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。

【請求項7】

請求項１〜３のいずれかに記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース定量法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グルコース濃度を測定する試薬及びグルコースセンサに利用することのできるグルコースデヒドロゲナーゼに関する。また、該酵素の製造方法、並びに該酵素を用いたグルコース定量用組成物及びグルコースセンサに関する。

【背景技術】

【0002】

フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．９９．１０、以下グルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨ、またＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤ−ＧＤＨとも記す）は、主に血中グルコース濃度測定に用いられる酵素であり、以下の反応を触媒する。
Ｄ−グルコース ＋ 電子受容体（酸化型）
→ Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン ＋ 電子受容体（還元型）

【0003】

このような血中グルコース定量用酵素としては、他にグルコースオキシダーゼが知られているが、本酵素は分子状酸素を電子受容体としうるため、グルコース濃度を測定する際に溶存酸素濃度の影響を受けるという問題点が指摘されている。グルコースデヒドロゲナーゼは、このような溶存酸素の影響がないことから、近年のグルコースセンサ用酵素の主流となっている。ＧＤＨには、ＦＡＤ依存型のほかにピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存型、ＮＡＤ（Ｐ）依存型が存在する。アシネトバクター・バウマンニ由来のものに代表されるＰＱＱ依存型ＧＤＨは、マルトースに対してもグルコースと同等の反応性を有しているなど、基質特異性に問題がある。また、ＮＡＤ（Ｐ）依存型ＧＤＨとしては例えばバチルス・スブチリス由来、バチルス・メガテリウム由来、サーモプロテウス・エスピー由来のもの等が知られており、ＰＱＱ依存型ＧＤＨと比して基質特異性はより厳密であるが、補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）を別途添加しなければならないため、グルコース定量試薬やセンサーを作製する際のコスト高や品質管理上の煩雑さがあり、必ずしも有用とはいえなかった。その点、アスペルギスル属由来に代表されるＦＡＤ−ＧＤＨは、補酵素結合型であり、かつ基質特異性も高いため近年重宝されている。

【0004】

ところで、グルコースセンサを作製するにあたっては、ＧＤＨ溶液を反応層上に蒸発乾固させる工程を踏む。ここで、５０℃ないしはそれ以上の温度で加温することにより、蒸発乾固の効率を高め、製造の効率化を図ることが少なくない。かかる加温処理は製造の効率化に有効である一方、一般的にタンパク質は熱による変性が起こることが知られており、特に熱安定性の低い酵素ではそのリスクが高くなる。

【0005】

また作製後のセンサストリップは、通常においては室温程度の温度で最長２年の保証期間を設ける場合が多い。但し、グルコースセンサを使用する一般ユーザーにおいてはセンサストリップを保管する際に厳密な温度管理を行うことはまれであり、特に夏場において３５℃以上、あるいは時に４０℃を超える現状を踏まえれば、酵素自身の高い安定性が望まれることは想像に難くない。熱安定性に優れる酵素は、一般にその立体構造が安定であり、過酷な条件での長期保存により適しているといえる。

【0006】

これまでに知られるＦＡＤ−ＧＤＨとしては、例えばペニシリウム属由来（特許文献１）、アスペルギルス属由来（特許文献２、３など）、ムコール属由来（特許文献４、５など）等が知られている。これら酵素はいずれも水溶液中での耐熱性の上限が５０℃ないし５５℃程度であり、十分とはいえなかった。また、特許文献６、７にはタンパク質工学的にＦＡＤ−ＧＤＨの熱安定性を向上させた例が記載される。しかしながら、タンパク質工学的な改変による安定性向上には限界があり、元の野生型の安定性の高さが重要となる。
上記特許文献に記載されるどの酵素も、６０℃ないし６５℃の熱処理に耐えるものではなく、安定性の面でいまだ改善の余地があった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】米国特許７８７１８０５号

【特許文献2】特許第４４９４９７８号

【特許文献3】特許第４２９２４８６号

【特許文献4】特許第４６４８９９３号

【特許文献5】ＷＯ２０１３／１１８７９８

【特許文献6】特許第４３４８５６３号

【特許文献7】ＷＯ２０１２／１６９５１２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的は、グルコースセンサを作製する工程並びに作製後の保存状態において高い安定性を有するＦＡＤ−ＧＤＨを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行った結果、従来知られているＦＡＤ−ＧＤＨよりも高い熱安定性を有する新規ＦＡＤ−ＧＤＨを見出し、本発明を完成させた。

【0010】

すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．
以下（Ａ）〜（Ｅ）の特性を有するフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
（Ａ）作用：電子受容体存在下でＤ−グルコースを酸化し、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。
（Ｂ）分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が６５０００
（Ｃ）熱安定性：６０℃１５分処理後の残存活性が８５％以上、かつ６５℃１５分処理後の残存活性が５０％以上、かつ７０℃１５分処理後の残存活性が１０％以上。
（Ｄ）至適反応ｐＨ：７．０
（Ｅ）基質特異性：
Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのマルトースに対する反応性が２％以下であり、かつ、
Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ−ガラクトースに対する反応性が２％以下であり、かつ、
Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ−キシロースに対する反応性が１０％以下である。
項２．
以下（Ａ）〜（Ｃ）の特性を有するフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
（Ａ）アミノ酸配列：配列番号３に示すアミノ酸配列との同一性が７８％以上である。
（Ｂ）作用：電子受容体存在下でＤ−グルコースを酸化し、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。
（Ｃ）熱安定性：６０℃１５分処理後の残存活性が８５％以上、かつ６５℃１５分処理後の残存活性が５０％以上、かつ７０℃１５分処理後の残存活性が１０％以上。
項３．
アスペルギルス属糸状菌由来である、項１または２に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項４．
アスペルギルス属糸状菌がアスペルギルス・エスピーＲＤ００９４６９株である、項３に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項５．
項１〜４のいずれかに記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼを生産する微生物を栄養培地にて培養し、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、項１〜４のいずれかに記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
項６．
項１〜４のいずれかに記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
項７．
項１〜４のいずれかに記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
項８．
項１〜４のいずれかに記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース定量法。

【発明の効果】

【0011】

本発明により、熱安定性が高く、グルコースセンサの製造中あるいは製造後において失活のリスクの低いグルコースデヒドロゲナーゼが提供可能である。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】アスペルギルス・エスピー・ＲＤ００９４６９株由来ＦＡＤ−ＧＤＨの各処理温度における活性残存率を示す。

【図2】アスペルギルス・エスピー・ＲＤ００９４６９株由来ＦＡＤ−ＧＤＨの各ｐＨにおける相対活性を示す。

【図3】実施例１で得られた精製ＦＡＤ−ＧＤＨ溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル写真を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

（１）ＦＡＤ−ＧＤＨ
本発明の実施形態の一つは、以下（Ａ）〜（Ｅ）の特性を有するフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）である。
（Ａ）作用：電子受容体存在下でＤ−グルコースを酸化し、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。
（Ｂ）分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が６５０００
（Ｃ）熱安定性：６０℃１５分処理後の残存活性が８５％以上、かつ６５℃１５分処理後の残存活性が５０％以上、かつ７０℃１５分処理後の残存活性が１０％以上。
（Ｄ）至適反応ｐＨ：７．０
（Ｅ）基質特異性：
Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのマルトースに対する反応性が２％以下であり、かつ、
Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ−ガラクトースに対する反応性が２％以下であり、かつ、
Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ−キシロースに対する反応性が１０％以下である。

【0014】

ＡＤ−ＧＤＨの酵素活性は、後述の「ＦＡＤ−ＧＤＨ活性測定法」に記載の方法により測定する。

【0015】

（１−１）熱安定性
本明細書において、熱安定性は、０．１Ｍのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）に２Ｕ／ｍｌのＧＤＨが含まれる状態で１５分間の加温処理をした後も維持される活性で評価される。
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、６０℃で１５分加温した際の活性残存率が８５％以上であり、好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上である。
また、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、６５℃で１５分の加温処理後の活性残存率が５０％以上であり、好ましくは６０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上である
さらに、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、７０℃１５分処理後の残存活性率が１０％以上であり、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上である。

【0016】

（１−２）基質特異性
本明細書において、基質特異性は、後述の「基質特異性の評価方法」に従って評価される。
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのマルトースに対する反応性が２％以下であり、好ましくは１％以下である。
また、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ−ガラクトースに対する反応性が２％以下であり、好ましくは１％以下である。
さらに、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ−キシロースに対する反応性が１０％以下であり、好ましくは５％以下である。

【0017】

（１−３）分子量
本明細書において、「タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量」は、エンドグルコシダーゼＨによって糖鎖部分を除去（より厳密には、前記の糖鎖部分除去後には、元々糖鎖が付加されていたポリペプチド鎖上のアスパラギン残基にＮ−アセチルグルコサミン１個が残存する。）した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことによって推定される分子量である。
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのタンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量はおおよそ６５０００である。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合には通常６０−７０ｋＤａである。「６０−７０ｋＤａ」とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量を測定した際に、当業者が、通常６０ｋＤａから７０ｋＤａの間の位置にバンドがあると判断する範囲を含むことを意味する。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量の測定は、一般的な手法及び装置を用い、市販される分子量マーカーを用いて行うことができる。

【0018】

（１−４）至適反応ｐＨ
本明細書において、至適反応ｐＨは以下の手順で評価される。
後述の「ＦＡＤ−ＧＤＨ活性測定法」に記載の反応液組成における、０．１ｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳに代えて、ｐＨ５．０〜９．０の範囲でさまざまなｐＨの測定液を作製する。
次いで、前記各測定液を用いて、前記活性測定法の手順に従って、各ｐＨにおけるＦＡＤ−ＧＤＨ活性を測定する。
そして、その結果を基に、最も高い活性を示した条件における活性値を１００として、各ｐＨにおける相対活性値を算出する。
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの至適反応ｐＨは、７．０である。

【0019】

また、別の観点から本発明の好ましい実施形態の一つは、以下（Ａ）〜（Ｃ）の特性を有するＦＡＤ−ＧＤＨである。
（Ａ）アミノ酸配列：配列番号３に示すアミノ酸配列との同一性が７８％以上である。
（Ｂ）作用：電子受容体存在下でＤ−グルコースを酸化し、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。
（Ｃ）熱安定性：６０℃１５分処理後の残存活性が８５％以上、かつ６５℃１５分処理後の残存活性が５０％以上、かつ７０℃１５分処理後の残存活性が１０％以上。

【0020】

（１−５）アミノ酸配列
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列は、前記（Ｂ）の作用および（Ｃ）の熱安定性を有する限りにおいて、配列番号３に示すアミノ酸配列との同一性が７８％以上であり、好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９８％以上であり、さらに好ましくは９９％以上であり、もっとも好ましくは１００％（配列番号３と同一）である。
また、別の観点から本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列は、前記（Ｂ）の作用および（Ｃ）の熱安定性を有する限りにおいて、配列番号３に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなるものであっても良い。

【0021】

配列番号３で示されるアミノ酸配列とは、後述の実施例で示されるとおり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＲＤ００９４６９に由来するＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列である。

【0022】

アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。

【0023】

また、前記ＦＡＤ−ＧＤＨを構成するポリペプチドは、シグナルペプチド部分を欠失していてもよい。ＳｉｇｎａｌＰ ４．１を用いた推定によれば、配列番号３に示すアミノ酸配列のうち、１番目から１６番目までがシグナル配列と予想される。したがって、この部分を欠失することは酵素特性に不都合な影響をもたらさないと推察される。

【0024】

（１−６）由来
上述の本発明のＦＡＤ−ＧＤＨにおいて、由来は特に限定しないが、好ましくは糸状菌であり、より好ましくはアスペルギルス属であり、最も好ましくはアスペルギルス・エスピーＲＤ００９４６９株として独立行政法人製品評価技術基盤機構が保有している菌株である。

【0025】

（２）ＦＡＤ−ＧＤＨの製造方法
本発明の他の実施形態の一つは、前記のＦＡＤ−ＧＤＨを生産する微生物を栄養培地にて培養し、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、前記のＦＡＤ−ＧＤＨの製造方法である。

【0026】

本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを製造するにあたっては、前記の本発明のＧＤＨの由来菌株を培養することにより実施可能であるが、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡを取得し、これを適当な宿主に形質転換することによって得られる形質転換体を培養することもできる。

【0027】

本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡを発現可能なプラスミドの作製方法としては、例えば本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの由来菌株を培養し、得られる菌体よりゲノムＤＮＡを抽出するかもしくは全ＲＮＡを抽出し、定法に従ってｃＤＮＡライブラリを作製する。
ゲノムＤＮＡであれば例えばインバースＰＣＲの方法により、またｃＤＮＡライブラリであれば５‘−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥにより末端配列を決定し、遺伝子全長をクローニング可能である。このようにして得られる、ＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡ配列として最も好ましい例は、配列番号２に示す塩基配列である。

【0028】

（２−１）ＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡ
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡ配列としては、前記の、
（ａ）配列番号２に示す塩基配列
のほかに、以下の（ｂ）〜（ｆ）が例示できる。
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列との相同性が８０％以上である塩基配列をからなり、且つ、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含み、且つＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列であり、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、且つ、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。

【0029】

本書において「タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡ、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。従ってコドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれる。

【0030】

本発明のＤＮＡは、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質が、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を備える限り、配列番号２に示される塩基配列との相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは８８％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である塩基配列を有する。

【0031】

塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＡｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴ ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（％）を算出する。

【0032】

本発明のＤＮＡは、それがコードするタンパク質がＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有する限り、配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであっても良い。
本明細書では、「ストリンジェントな条件」とは、以下に示す条件を言う。
ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ， １５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を６５℃で用いる。

【0033】

このような条件でハイブリダイズするＤＮＡの中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれ得るが、それらについては、市販の活性発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させて、酵素活性を公知の手法で測定することによって容易に取り除くことができる。

【0034】

また、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ生産に用いるＤＮＡの入手方法としては、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法を利用して接続することにより、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの全長をコードするＤＮＡを構築することも可能である。化学合成もしくはＰＣＲ法との組み合わせで全長ＤＮＡを構築することの利点は、該遺伝子を導入する宿主に合わせて使用コドンを遺伝子全長にわたり設計できる点にある。同一のアミノ酸をコードする複数のコドンは均一に使用されるわけではなく、生物種によってその使用頻度が異なる。一般にある生物種において高発現する遺伝子に含まれるコドンは、その生物種において使用頻度の高いコドンを多く含んでおり、逆に発現量の低い遺伝子は使用頻度の低いコドンの存在がボトルネックとなって高発現を妨げている例が少なくない。異種遺伝子の発現に際し、その遺伝子配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに置換することで該異種タンパク質発現量が増大した例はこれまでに多数報告されており、このような使用コドンの改変は異種遺伝子発現量の増大に効果があると期待される。

【0035】

上記の理由から、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡは、それが導入される宿主細胞により適したコドン（即ち、該宿主において使用頻度の高いコドン）に改変することが望ましい。各宿主のコドン使用頻度は、該宿主生物のゲノム配列上に存在する全遺伝子における各コドンの使用される割合で定義され、たとえば１０００コドンあたりの使用回数で表される。またコドン使用頻度は、その全ゲノム配列の解明されていない生物にあっては代表的な複数遺伝子の配列から近似的に算出することも可能である。組換えようとする宿主生物におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（財）かずさＤＮＡ研究所のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ）に公開されている遺伝暗号使用頻度データベースを用いることができ、または各生物におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよく、あるいは使用する宿主生物のコドン使用頻度データを自ら決定してもよい。入手したデータと導入しようとする遺伝子配列を参照し、遺伝子配列に用いられているコドンの中で宿主生物において使用頻度の低いものを、同一のアミノ酸をコードし使用頻度の高いコドンに置換すればよい。このような使用頻度の高いコドンとしては、例えば宿主が大腸菌Ｋ１２株である場合にあっては、ＧｌｙにはＧＧＴまたはＧＧＣ、ＧｌｕにはＧＡＡ、ＡｓｐにはＧＡＴ、ＶａｌにはＧＴＧ、ＡｌａにはＧＣＧ、ＡｒｇにはＣＧＴまたはＣＧＣ、ＳｅｒにはＡＧＣ、ＬｙｓにはＡＡＡ、ＩｌｅにはＡＴＴまたはＡＴＣ、ＴｈｒにはＡＣＣ、ＬｅｕにはＣＴＧ、ＧｌｎにはＣＡＧ、ＰｒｏにはＣＣＧなどが挙げられる。

【0036】

（２−２）宿主−ベクター系
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡは、組換えベクターに接続した状態で形質転換される。本発明の組換えベクターは原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものが好ましく選択され、プラスミドベクターやウイルスベクター等が包含される。当該組換えベクターは、簡便には当該技術分野において入手可能な公知のクローニングベクターまたは発現ベクターに、上記のＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡを適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより調製することができる。また、Ｔａｑポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、ＴＡクローニングによるベクターへの接続も可能である。または宿主細胞のゲノムＤＮＡ中にＤＮＡを導入する場合にあっては、必ずしも宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるベクターである必要はなく、本発明のＧＤＨをコードする遺伝子、祝す細胞で作動可能なプロモーター、及び形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子を少なくとも有し、宿主細胞に固有の遺伝子組換えシステムを利用するかまたはゲノムＤＮＡ中に遺伝子を挿入するために必要なエンドヌクレアーゼ遺伝子等と共に宿主細胞に導入し、所望のＤＮＡが挿入された形質転換体を選抜すればよい。

【0037】

ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など、酵母由来プラスミドとして、例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５など、枯草菌由来プラスミドとして、例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４などが挙げられる。また、ウイルスとして、λファージなどのバクテリオファージや、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等のパポバウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）等のレトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニヤウイルス、バキュロウイルスなどの動物および昆虫のウイルスが例示される。

【0038】

特に、本発明は、目的の宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下にＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡが配置されたＦＡＤ−ＧＤＨ発現ベクターを提供する。使用されるベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で機能して、その下流に配置された遺伝子の転写を制御し得るプロモーター領域（例えば宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｅｃＡプロモーター等、宿主が枯草菌の場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等、宿主が哺乳動物細胞の場合、ＳＶ４０由来初期プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ由来ロングターミナルリピート、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター）と、該遺伝子の転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し、該プロモーター領域と該ターミネーター領域とが、少なくとも１つの制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターをその箇所のみで切断するユニークな制限部位を含む配列を介して連結されたものであれば特に制限はないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有していることが好ましい。さらに、挿入されるＧＤＨをコードするＤＮＡが開始コドンおよび終止コドンを含まない場合には、開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）を、それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター領域の上流に含むベクターが好ましく使用される。
宿主細胞として細菌を用いる場合、一般に発現ベクターは上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主細胞内で自律複製し得る複製可能単位を含む必要がある。また、プロモーター領域は、プロモーターの近傍にオペレーターおよびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を包含する。
宿主として酵母，動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは、エンハンサー配列、ＧＤＨ ｍＲＮＡの５’側および３’側の非翻訳領域、ポリアデニレーション部位等をさらに含むことが好ましい。

【0039】

（２−３）ＦＡＤ−ＧＤＨの製造
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、上記のようにして調製されるＦＡＤ−ＧＤＨ発現ベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物からＧＤＨを回収することによって製造することができる。

【0040】

使用される培地は、宿主細胞（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの由来生物もしくは形質転換体）の生育に必要な炭素源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース，デキストラン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例えばテトラサイクリン，ネオマイシン，アンピシリン，カナマイシン等）など〕を含んでいてもよい。

【0041】

培養は当分野において知られている方法により行われる。下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、本発明における培養条件はこれらに何ら限定されるものではない。
宿主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌等である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜９である培地である。宿主が大腸菌の場合、好ましい培地としてＬＢ培地，Ｍ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ． Ｊ．， Ｅｘｐ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ， ｐ．４３１， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７２）］等が例示される。培養は、必要により通気・攪拌をしながら、通常１４〜４３℃で約３〜７２時間行うことができる。宿主が枯草菌の場合、必要により通気・攪拌をしながら、通常３０〜４０℃で約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母の場合、培地として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最少培地 ［Ｂｏｓｔｉａｎ． Ｋ．Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７， ４５０５ （１９８０）］が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、培地として、例えば約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）［Ｓｃｉｅｎｃｅ， １２２， ５０１ （１９５２）］、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ８， ３９６ （１９５９）］、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ． Ａｍ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ．， １９９， ５１９ （１９６７）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．， ７３， １ （１９５０）］ 等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、培地として、例えばウシ胎仔血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２， ８４０４ （１９８５）］等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。

【0042】

ＧＤＨの精製は、ＧＤＨ活性の存在する画分に応じて、通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。
培養物の培地中に存在するＧＤＨは、培養物を遠心または濾過して培養上清（濾液）を得、該培養上清から、例えば、塩析、溶媒沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことにより得ることができる。

【0043】

一方、細胞質に存在するＧＤＨは、培養物を遠心または濾過して細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解、浸透圧ショック、および／またはトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤処理などにより、細胞およびオルガネラ膜を破砕（溶解）した後、遠心分離や濾過などによりデブリスを除去して可溶性画分を得、該可溶性画分を、上記と同様の方法で処理することにより単離精製することができる。

【0044】

組換えＧＤＨを迅速且つ簡便に取得する手段として、ＧＤＨのコード配列のある部分（好ましくはＮまたはＣ末端）に、金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列（例えば、ヒスチジン、アルギニン、リシン等の塩基性アミノ酸からなる配列、好ましくはヒスチジンからなる配列）（いわゆる「タグ」）をコードするＤＮＡ配列を、遺伝子操作により付加して宿主細胞で発現させ、該細胞の培養物のＧＤＨ活性画分から、該金属イオンキレートを固定化した担体とのアフィニティーによりＧＤＨを分離回収する方法が好ましく例示される。
金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、例えば、ＧＤＨをコードするＤＮＡをクローニングする過程で、ＧＤＨのＣ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列に該ＤＮＡ配列を連結したハイブリッドプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ったり、あるいは該ＤＮＡ配列を終止コドンの前に含む発現ベクターにＧＤＨをコードするＤＮＡをインフレームで挿入することにより、ＧＤＨコード配列に導入することができる。また、精製に使用される金属イオンキレート吸着体は、遷移金属、例えばコバルト、銅、ニッケル、鉄の二価イオン、あるいは鉄、アルミニウムの三価イオン等、好ましくはコバルトまたはニッケルの二価イオン含有溶液を、リガンド、例えばイミノジ酢酸（ＩＤＡ）基、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）基、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）基等を付着したマトリックスと接触させて該リガンドに結合させることにより調製される。キレート吸着体のマトリックス部は通常の不溶性担体であれば特に限定されない。
あるいは、タグとしてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＨＡ、ＦＬＡＧペプチドなどを用いてアフィニティー精製することもできる。

【0045】

上記精製工程において、必要に応じて膜濃縮、減圧濃縮、活性化剤および安定化剤添加等の処理を行うこともできる。特に本ＧＤＨは耐熱性に優れているため、他の宿主細胞由来夾雑タンパク質を熱変性せしめ、かつＧＤＨ活性を保持しうる範囲での加温処理が、大幅なＧＤＨ純度向上に有効である。これら工程に用いる溶媒としては特に限定されないが、ｐＨ６〜９程度の範囲において緩衝能を有するＫ−リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ＧＯＯＤの緩衝液等に代表される各種緩衝液が好ましい。

【0046】

かくして得られるＧＤＨが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該タンパク質が塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
また、該ＧＤＨを含む溶液または組成物に対して安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース、マンニトール等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、さらにはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリグルタミン酸などの親水性ポリマーを適宜添加してもよい。

【0047】

精製酵素は液状で産業利用に供することも可能であるが、粉末化し、あるいはさらに造粒することもできる。液状酵素の粉末化は定法により凍結乾燥することでなされる。

【0048】

さらに、本発明のＧＤＨは、それをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞タンパク質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。本発明のＧＤＨをコードするＲＮＡは、本発明のＧＤＨをコードするｃＤＮＡの取得方法において上記した、本発明のＧＤＨをコードするｍＲＮＡを常法を用いて該ＲＮＡを発現する宿主細胞から精製するか、あるいは、ＧＤＨをコードするＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写系を用いてｃＲＮＡを調製することによって取得することができる。無細胞タンパク質転写／翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌抽出液はＰｒａｔｔ Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， "Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ"， Ｈａｍｅｓ Ｂ．Ｄ． ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ． ｅｄｓ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ １７９−２０９ （１９８４） に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはＥ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ社製） やＲＴＳ ５００ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｒｏｃｈｅ社製） 等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ社製） 等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製） 等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ Ｆ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １７９： １６０−１６１ （１９５７） あるいはＥｒｉｃｋｓｏｎ Ａ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ９６： ３８−５０ （１９９６） 等に記載の方法を用いることができる。

【0049】

化学合成によるＧＤＨの製造は、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列、すなわち本発明のＧＤＨのアミノ酸配列を基にして、配列の全部または一部をペプチド合成機を用いて合成することにより行うことができる。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本発明のＧＤＨを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を含む場合は保護基を脱離することにより、目的とするタンパク質を製造することができる。ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（１）および（２）に記載された方法に従って行われる。
（１） Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙａｎｄ Ｍ．Ａ． Ｏｎｄｅｔｔｉ， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９６６）
（２） Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ａｎｄ Ｌｕｅｂｋｅ， Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６５）

【0050】

このようにして得られた本発明のＧＤＨは、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるＧＤＨが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にタンパク質が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。

【0051】

（３）グルコースの測定方法等
本発明の別の実施形態は、上記の特性を有する本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの用途である。用途としては、グルコースの測定方法が例示でき、血糖値の測定や食品（調味料や飲料など）中のグルコース濃度の測定などに好適に利用できる。
また、本発明のさらに別の実施形態は、グルコースアッセイキットやグルコースセンサーなど、上記の特性を有する本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを含む、グルコースを測定するための種々のプロダクトである。

【0052】

ＦＡＤ−ＧＤＨを用いたグルコースの測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを用いて、各種試料中のグルコースの量又は濃度を測定することができる。本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを用いてグルコースの濃度又は量が測定可能である限り、その態様は特に制限されない。

【0053】

（３−１）グルコース測定用試薬
本発明のグルコース測定用試薬は、典型的には、本発明のＧＤＨ、緩衝液、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。また好ましくはメディエーターなど測定に必要な試薬を含む。また、ＧＤＨを含む試薬中には、安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース、マンニトール等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、さらにはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリグルタミン酸などの親水性ポリマーを適宜添加してもよい。

【0054】

（３−２）グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、典型的には、本発明のＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。また、ＧＤＨを含む試薬中には、安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、さらにはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリグルタミン酸などの親水性ポリマーを適宜添加してもよい。

【0055】

（３−３）グルコースセンサ
本発明のグルコースセンサは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＧＤＨを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、ＮＡＤもしくはＮＡＤＰといった補酵素、あるいは電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。使用する電子メディエーターとしては、ＧＤＨの補酵素であるＦＡＤから電子を受け取り、発色物質や電極に電子を供与しうるものが挙げられ、たとえばフェリシアン化物塩、フェナジンエトサルフェート、フェナジンメトサルフェート、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン、１−メトキシ−フェナジンメトサルフェート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、２，５−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５−ジクロロ−１，４−ベンゾキノン、ニトロソアニリン、フェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体等が例示されるが、これらに限定されない。また、電極上のＧＤＨ組成物中には、安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、さらにはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリグルタミン酸などの親水性ポリマーを含んでもよい。

【0056】

グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液、ＧＤＨ、メディエーターとして２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）を含む反応液を入れ、一定温度に維持する。そこにグルコースを含む試料を加え、一定温度で一定時間反応させる。この間、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、メディエーターとしてｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ （ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてｎｉｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｒｉｕｍ ｂｌｕｅ （ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。いうまでもなく使用するメディエーターおよび発色試薬はこれらに限定されない。

【0057】

またグルコース濃度の測定は、以下のようにしても行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＧＤＨ、および必要に応じてメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。

【0058】

（４）測定方法等
（４−１）ＦＡＤ−ＧＤＨ活性測定法
本明細書において、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性測定は特に断りのない限り、以下の方法に従って行われる。
反応液（０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、２００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ−グルコース、０．５５ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＣＰＩＰ、ｐＨ６．５）２．９ｍＬを石英セルにいれ、３７℃で５分間予備加温する。そしてＧＤＨ溶液０．１ｍＬを加えて混和し、３７℃で５分反応させ、この間７００ｎｍ吸光度を測定する。吸光度変化の直線部分から１分間あたりの吸光度の上昇度（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ）を算出する。盲検は、ＧＤＨ溶液の代わりに緩衝液を加えて混和し、同様に３７℃５分インキュベートして７００ｎｍ吸光度を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）を算出する。これらの値を以下の式に当てはめて活性値（Ｕ／ｍＬ）を算出する。なおここでは、基質存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。

ＧＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）＝［（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ−ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）×３．０×希釈倍率］／（４．５×１．０×０．１）

なお、ここで
３．０ ：ＧＤＨ溶液混和後の容量（ｍＬ）
４．５ ：ＤＣＰＩＰのミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／マイクロモル）
１．０ ：光路長（ｃｍ）
０．１ ：添加するＧＤＨ溶液の液量（ｍＬ）
である。

【0059】

（４−２）タンパク質の定量および比活性の算出例
本発明に述べるタンパク質量は２８０ｎｍの吸光度を測定することにより測定したものである。すなわち、２８０ｎｍにおける吸光度が０．１〜１．０の範囲となるように酵素溶液を蒸留水で希釈し、蒸留水を用いてゼロ点補正を行った吸光度計を用いて２８０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ）を測定する。本発明に述べるタンパク質濃度は、１Ａｂｓ≒１ｍｇ／ｍｌと近似し、吸光度の測定と測定した溶液の希釈倍率とを乗じた値で示したものである。また、本発明に述べる比活性とは、本測定方法によるタンパク質量として１ｍｇあたりのＧＤＨの活性（Ｕ／ｍｇ）であり、この際のＧＤＨ活性は、上記活性測定例に従って測定することにより得られる値である。

【0060】

（４−３）グルコースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）の算出例
本発明に述べる基質に対するミカエリス定数（Ｋｍ）の算出方法は、以下の測定方法により行う。すなわち、測定溶液として上述の活性測定例に記載の反応液組成におけるＤ−グルコースの濃度を２００ｍｍｏｌ／Ｌ、 １６０ｍｍｏｌ／Ｌ、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ、８０ｍｍｏｌ／Ｌ、４０ｍｍｏｌ／ＬＬとした５種類の反応液を作製し、それぞれの測定溶液を用いて上述の活性測定例の方法に従いＧＤＨ溶液（上述の活性測定例における活性値が０．８Ｕ／ｍｌとなるよう調整した溶液）のΔＯＤ（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。それら測定値をもとにＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット法（両逆数プロット法）に従ってミカエリス定数（Ｋｍ）を算出する

【0061】

（４−４）基質特異性の評価方法
本明細書において、基質特異性の評価は、以下の方法により行う。すなわち、測定溶液として上述の「ＦＡＤ−ＧＤＨ活性測定法」に記載の反応液組成におけるＤ−グルコースに換えて、他の糖類（例えばマルトース、ガラクトース、キシロースなど）を２００ｍｍｏｌ／Ｌ含む反応液をそれぞれ作製し、これらを用いて「ＦＡＤ−ＧＤＨ活性測定法」に従って活性値を測定する。これら反応液を用いた活性値を、グルコースを基質とした場合の活性値で割った値を、各基質に対する反応性（対グルコース％）として算出する。

【0062】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0063】

＜実施例１＞
アスペルギルス・エスピーＲＤ００９４６９株からのＧＤＨの取得
アスペルギルス・エスピーＲＤ００９４６９株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構より貸与を受けた。この菌株をまずはＭＥ寒天培地（２％マルトエキス、０．１％ペプトン、０．１％リン酸１カリウム、２％グルコース、１．５％アガロース、ｐＨ６．０）に植菌し、２５℃で培養することにより菌糸をプレート一面に生育させた。この菌糸を生育させたアガロース全量をプレートからかき出し、１００ｍｌの滅菌水に懸濁した。１０Ｌ容ジャーファーメンターに６ＬのＹＭ培地（３％酵母エキス、３％マルトース、０．０５％アデカノール）に懸濁した寒天を投入し、２５℃で６５時間通気攪拌培養した。培養終了後、培地上清のＧＤＨ活性を測定したところ、０．２Ｕ／ｍｌの活性が検出された。この培養液をろ紙によりろ過して菌体を除去したのち、１Ｌあたり３００ｇの硫酸アンモニウムを添加し、完全に溶解させた後、２０％水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを６．０に調整した。この液を、同じ濃度の硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で緩衝化した２００ｍｌのＰｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）充填カラムに通液しＧＤＨを吸着させた。さらに硫酸アンモニウム濃度を０まで低下させたグラジエント溶出によりＧＤＨを溶出させ、ＧＤＨ活性を有する画分を集めた。さらに分子量１０，０００カットの限外ろ過膜を用い、透過液が透明になるまで５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）を加えつつ限外ろ過を行った。最後に３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）で緩衝化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（５６０ｍｌ、ＧＥヘルスケア製）を用いてゲルろ過を行うことにより、精製ＧＤＨを得た。得られた精製ＧＤＨの比活性はおおよそ１８０Ｕ／ｍｇであった。

【0064】

＜実施例２＞
ＧＤＨの熱安定性
実施例１で得られたＧＤＨについて、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）を用いてＧＤＨ濃度２Ｕ／ｍｌとなるよう希釈し、それぞれの溶液について４０℃〜７０℃までの範囲で５℃刻みの各温度で１５分加温処理を行い、加温後におけるＧＤＨ活性の加温前のＧＤＨ活性に対する比率（活性残存率）を調べた。結果を図１に示す。本ＧＤＨの加温後の活性残存率は、６０℃で９４．５％、６５℃で７８．８％、７０℃で４８．６％であった。

【0065】

＜実施例３＞
ＧＤＨ活性値のｐＨ依存性
実施例１で得られたＧＤＨについて、次のようにＧＤＨ活性値のｐＨ依存性を調べた。活性測定例に示す組成のうち、０．１ｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳに代えて各種バッファーを使用し、ｐＨ５．０〜９．０の範囲でさまざまなｐＨの測定液を作製した。使用したバッファー種は、酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０〜５．５）、ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．５〜６．５）、リン酸カリウム（ｐＨ６．０〜８．０）、トリス塩酸（ｐＨ７．０〜９．０）であり、測定液中におけるバッファー濃度はすべて７０ｍＭである。それぞれの測定液を用い、上述の活性測定例の手順に従って各ｐＨにおけるＧＤＨ活性を測定した。最も高い活性を示した条件における活性値を１００として、各ｐＨにおける相対活性値を算出した（図２）。至適反応ｐＨは、おおよそ７．０であった。

【0066】

＜実施例４＞
ＧＤＨの基質特異性
実施例１で得られたＧＤＨについて、基質特異性を調べた。方法は上述の基質特異性の評価例に従うが、使用する基質としてマルトース、ガラクトース、キシロースに加えて、さらに２−デオキシグルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、アラビノース、グリセロール、メレジトールについても同様に反応性（対グルコース％）を測定した。結果を表１に示す。マルトース、ガラクトースに対しては対グルコース比１％未満、またキシロースに対しては対グルコース比５％未満であり、本発明のＧＤＨは良好な基質特異性を有していることが確認された。

【0067】

【表1】

【0068】

＜実施例５＞
ＧＤＨの基質に対するミカエリス定数
実施例１で得られたＧＤＨについて、基質に対するミカエリス定数（Ｋｍ）を上述の算出例に従って求めた。結果、本発明のＧＤＨのＤ−グルコースに対するミカエリス定数は、５２．２ｍＭであった。

【0069】

＜実施例６＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびペプチド質量分析による分子量の推定
実施例１で得られたＧＤＨについて、まずエンドグリコシダーゼＨ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ製Ｅｎｄｏ Ｈ）を用いて糖鎖を切断し、定法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図３）。主に６５ｋＤａおよび５５ｋＤａにそれぞれ濃いバンドが見られたため、それぞれのバンドをゲルから切り出し、トリプシンで消化させた後ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析による消化断片の分子量測定、およびＭＡＳＣＯＴ解析によるタンパク質の同定を行った。結果、６５ｋＤａのバンドから得られるペプチドが既知のＦＡＤ依存型ＧＭＣオキシドレダクターゼ様タンパク質と高いヒット率を示し、このバンドがすなわちＧＤＨであると推定した。

【0070】

＜実施例７＞
ＧＤＨのアミノ酸配列の推定
実施例６でえられるＳＤＳ−ＰＡＧＥのみかけの分子量６５ｋＤａのバンドについて、バンドの切り出しおよび脱水処理ののち、トリプシンを含む溶液を浸透させて１晩消化させ、産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、セミドライ法によるＰＶＤＦ膜への転写およびＣＢＢ染色を行った。出現したバンドのいくつかについてエドマン分析によりＮ末端アミノ酸配列を決定し、得られた配列よりディジェネレートプライマーを設計してｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを行い、ＧＤＨ遺伝子の部分断片を得た。この遺伝子部分断片を東洋紡製ＴＡクローニングキット（ＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ−）を用いてプラスミドｐＴＡ２にクローニングし、その塩基配列を解析した。得られた部分塩基配列を配列番号１に示す。さらにこの部分配列情報を元に、定法に従って５‘−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥを行い、最終的に配列番号２に示す、本発明のＧＤＨをコードする塩基配列全長を決定した。この配列から推定される本発明のＧＤＨのアミノ酸配列を配列番号３に示す。この配列についてデータベース上の配列との相同性検索を行ったところ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ＮＩＨ２６２４由来ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＴＥＧ＿０８２９５（シーケンスＩＤ：ＸＰ＿００１２１６９１６．１）が最も同一性が高く７７％、ついでＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ ＩＦＯ４３０８由来のＧｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅとアノテーションされている配列（シーケンスＩＤ：ＧＡＡ９２２９１．１）が６３％の同一性であり、本発明のＧＤＨは新規な酵素であるといえる。また、上記アミノ酸配列から計算上推定されるポリペプチド鎖の分子量は６４６００であり、実施例６に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とほぼ一致する。

【産業上の利用可能性】

【0071】

本発明により製造したグルコースデヒドロゲナーゼは、血糖値測定用試薬、血糖センサー並びにグルコース定量キットの原料としての供給が可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]