特許 6493861 チロシナーゼ阻害剤、毛乳頭細胞増殖促進剤及び肺ガン細胞成長抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6493861

(24)【登録日】2019年3月15日

(45)【発行日】2019年4月3日

(54)【発明の名称】チロシナーゼ阻害剤、毛乳頭細胞増殖促進剤及び肺ガン細胞成長抑制剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/366 20060101AFI20190325BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190325BHJP

   A61K 8/35 20060101ALI20190325BHJP

   A61Q 19/02 20060101ALI20190325BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/366

   A61P43/00 111

   A61K8/35

   A61Q19/02

【請求項の数】2

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2015-204054(P2015-204054)

(22)【出願日】2015年10月15日

(65)【公開番号】特開2017-75122(P2017-75122A)

(43)【公開日】2017年4月20日

【審査請求日】2018年3月1日

(73)【特許権者】

【識別番号】510266941

【氏名又は名称】有限会社バイオシステムコンサルティング

(74)【代理人】

【識別番号】110000590

【氏名又は名称】特許業務法人 小野国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】多和田 真吉

【審査官】 金子 亜希

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０６−３２１７５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−０１０９２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Drug Discov Ther，２０１５年 ６月，9(3)，197-204

【文献】 BMC Complement Altern Med，２０１２年，12:106

【文献】 Pigment Cell Melanoma Res，２０１４年，27(3)，387-397

【文献】 Bioorg Med Chem，２０１２年，20(4)，1482-1493

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／３６６

Ａ６１Ｋ ８／３５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

次の式（Ｉｄ）〜（Ｉｆ）

で表されるデヒドロカワイン系化合物から選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有するチロシナーゼ阻害剤。

【請求項2】

デヒドロカワイン系化合物が，上記式（Ｉｅ）及び（Ｉｆ）よりなる群から選ばれる１種又は２種である請求項１記載のチロシナーゼ阻害剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、沖縄に自生するゲットウ由来の生理活性物質を利用したチロシナーゼ阻害剤、毛乳頭細胞増殖促進剤及び肺ガン細胞成長抑制剤に関する。

【背景技術】

【0002】

従来から沖縄に自生するさまざまな植物から生理活性物質を抽出して、これらを有効成分として含有する健康食品や医薬品等が知られている。特にゲットウ由来の生理活性物質は、優れた効果を有しており、本出願人はこれまで、皮膚構成タンパク質の分解酵素を阻害する物質（特許文献１）やポリフェノール含有量の多い抗老化物質（特許文献２）を見出している。

【0003】

皮膚が紫外線に曝露されると、皮膚内で発生する活性酸素、過酸化脂質等は、炎症を引き起こし、皮膚組織に大きな損傷を与える。皮膚や毛髪等に存在する色素であるメラニンは、このような紫外線による損傷から皮膚を保護する役割を有する。しかし、メラニンが過剰産生されると、低色素沈着や色素沈着過剰などの皮膚異常を引き起こす他、シミ、ソバカスなどが生じるため、メラニンの生成を抑制することを目的として種々の美白剤が開発されている。メラニンは、メラノサイトにおいてチロシンがチロシナーゼによって酸化されることにより生成されるため、美白剤の多くはメラニン生成における鍵酵素であるチロシナーゼ活性阻害物質である。

【0004】

チロシナーゼ活性阻害物質の代表的なものとして、コウジ酸やアルブチン、アスコルビン酸などがよく知られており、メラニンの生成および沈着を抑制する美白剤として利用されている（特許文献３〜５）。しかし、これらの中には活性が十分でないものもあり、天然物由来で強力かつ安全性の高いチロシナーゼ阻害剤がなお強く求められている。

【0005】

また、発毛メカニズムは、毛包下部にある毛母細胞が、毛乳頭細胞からの発毛シグナルを受け取ることによって、頻繁に細胞分裂を行って髪の毛となって成長していく。そのため、頭皮の血行を良くしたり、適度な刺激を与えることによって毛乳頭細胞の活動を高めることや毛乳頭細胞の増殖は発毛にとって重要なことである。

【0006】

これまで、毛乳頭細胞の増殖に効果を有するものとして、ハトムギ抽出物やツツジ科エリカ属植物の抽出物が知られている（特許文献６及び特許文献７）。しかしながら、更に毛乳頭細胞の増殖効果に優れ、かつ安全性の高い有効成分の提供が望まれている。

【0007】

また、さらに、甘草抽出物から得られるリキリチゲンニンが、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞であるＡ５４９細胞の増殖を抑制することが知られている（特許文献８）。このように、植物由来の安全性に優れ、日常的に摂取可能なものは、需要者に好まれるものであるが、いまだ十分満足し得るものは提供されていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２０１４−１３６６９１号公報

【特許文献2】特開２０１４−２１０７２３号公報

【特許文献3】特開昭５６−７７１０号公報

【特許文献4】特開昭６３−１７４９１０号公報

【特許文献5】特開昭５１−９５１４０号公報

【特許文献6】特開２００６−２１９４０７号公報

【特許文献7】特開２００８−１７９５９９号公報

【特許文献8】特開２０１３−１４４６９３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

従って、本発明の課題は、安全性が高く、優れた効果を有するチロシナーゼ阻害剤、毛乳頭細胞増殖促進剤及び肺ガン細胞成長抑制剤を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、沖縄に自生する植物であるゲットウに含まれる特定の化合物が、優れたチロシナーゼ阻害活性、毛乳頭細胞増殖促進作用及び肺ガン細胞成長抑制作用を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。

【0011】

すなわち本発明は、下記一般式（I）；

【化1】

（式中、Ｒ^１は、メチル基または水素原子を、Ｒ^２は水酸基、メトキシ基または水素原子を示し、点線は結合の存在または不存在を示す）
で表されるデヒドロカワイン系化合物及び８（１７）,１２−ラブダジエン−１５,１６−ジアールよりなる群から選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有するチロシナーゼ阻害剤である。

【0012】

また、本発明は、下記一般式（I）；

【化2】

（式中、Ｒ^１は、メチル基または水素原子を、Ｒ^２は水酸基、メトキシ基または水素原子を示し、点線は結合の存在または不存在を示す）
で表されるデヒドロカワイン系化合物を有効成分として含有する毛乳頭細胞増殖促進剤である。

【0013】

さらに、本発明は、下記一般式（I）；

【化3】

（式中、Ｒ^１は、メチル基または水素原子を、Ｒ^２は水酸基、メトキシ基または水素原子を示し、点線は結合の存在または不存在を示す）
で表されるデヒドロカワイン系化合物を有効成分として含有する肺ガン細胞成長抑制剤である。

【発明の効果】

【0014】

本発明のチロシナーゼ阻害剤は、優れたチロシナーゼ阻害活性を有し、メラニン生成を有効に抑制することができ、かつ安全性も高いものである。したがって、医薬品のほか、美白化粧料などとして利用することができる。また、本発明の毛乳頭細胞増殖促進剤は、同細胞の増殖性に優れており、育毛剤として利用することができる。さらに、本発明の肺ガン細胞成長抑制剤は、肺ガン細胞の成長を効果的に妨げることができ、医薬品等に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】ゲットウ根茎抽出物からＤＫおよびＤＤＫを得る工程を示した図面。

【図2】ゲットウ根茎抽出物からのＤＫおよびＤＤＫの分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図面。（Ａ）はＤＫ、（Ｂ）はＤＤＫである。

【図3】ヒスピジンのマススペクトルである。

【図4】デヒドロカワイン系化合物及び８（１７）,１２−ラブダジエン−１５,１６−ジアールのＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞生存性に対する影響を示すグラフ。

【図5】デヒドロカワイン系化合物及び８（１７）,１２−ラブダジエン−１５,１６−ジアールのメラニン産生抑制作用を示すグラフ。

【図6】デヒドロカワイン系化合物及び８（１７）,１２−ラブダジエン−１５,１６−ジアールのチロシナーゼ阻害作用を示すグラフ。

【図7】ヒスピジン誘導体１〜３のチロシナーゼ阻害作用を示すグラフ。

【図8】各濃度におけるＤＫ（Ａ）、ＤＤＫ（Ｂ）、ヒスピジン（Ｃ）、ククルビタシンＩ（Ｄ）、アルテピリンＣ（Ｅ）のヒト毛乳頭細胞の増殖率を示すグラフ。

【図9】ＤＫ、ＤＤＫ、ヒスピジン、ヒスピジン誘導体１〜３、ククルビタシンＩを１０μＭ（ククルビタシンＩについては１０ｎＭ）使用した場合におけるヒト毛乳頭細胞の増殖率を示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明では、有効成分として下記一般式（Ｉ）で表されるデヒドロカワイン系化合物（以下、「デヒドロカワイン系化合物（Ｉ）」ということがある）は、ゲットウの根茎抽出物から、あるいはその代謝物として得られるものである。

【0017】

【化4】

（式中、Ｒ^１は、メチル基または水素原子を、Ｒ^２は水酸基、メトキシ基または水素原子を示し、点線は結合の存在または不存在を示す）

【0018】

上記デヒドロカワイン系化合物（Ｉ）には、次の式（Ｉａ）で表される５,６−デヒドロカワイン（ＤＫ）、次の式（Ｉｂ）で表されるジヒドロ−５,６−デヒドロカワイン（ＤＤＫ）、次の式（Ｉｃ）で表されるヒスピジン（ Hispidin；６−（３,４−ジヒドロキシスチリル）−４−ヒドロキシ−２−ピロン）、次の式（Ｉｄ）で表されるヒスピジン誘導体１（Ｈ１；６−（３，４−ジメトキシスチリル）−４−メトキシ−２Ｈ−ピラン−２−オン）、次の式（Ｉｅ）で表されるヒスピジン誘導体２（Ｈ２；６−（３，４−ジメトキシフェネチル）−４−メトキシ−２Ｈ−ピラン−２−オン）及び次の式（Ｉｆ）で表されるヒスピジン誘導体３（Ｈ３；６−（３，４−ジヒドロキシフェネチル）−４−ヒドロキシ−２Ｈ−ピラン−２−オン）を含む。

【0019】

【化5】

【0020】

上記化合物のうち、ＤＫおよびＤＤＫは、ゲットウ（月桃）（学名：Alpinia zerumbet）の根茎抽出物中に含まれている化合物であり、これから単離することにより得ることができる。

【0021】

このゲットウは、ジンジベラセアエ・ショウガ科植物で、世界中の亜熱帯および熱帯の領域に広く分布し、日本では沖縄県から九州南部に分布している。

【0022】

ゲットウの根茎から抽出物を得るには、まず、新鮮なゲットウの根茎を、適当な大きさ（例えば、２〜３ｍｍ程度）に細断し、これを水、エタノール等の低級アルコールまたはこれらの混液（以下、「抽出溶媒」ということがある）で抽出する。

【0023】

次いで、上記のように準備した抽出原料に対し、その３０ないし５０重量倍の抽出溶媒を加えた後、２４ないし４８時間程度抽出を行う。抽出に用いる抽出溶媒は前記の通りであり、これらは、例えば、５０ないし８０容量％程度の、任意の割合のエタノール−水混液のような混合溶媒であっても良い。この抽出に当たっての溶媒の温度は、室温ないし１００℃程度であり、８０℃以上の熱溶媒であることが好ましく、抽出中、必要により連続あるいは間欠的に攪拌すればよい。

【0024】

斯くして得られるゲットウ根茎からの抽出物は、必要に応じて濾過、遠心分離等により固液分離し、液状のゲットウ抽出物を得ることができる。また、更に必要により凍結乾燥などの手段で乾燥させることで粉末状のゲットウ抽出物とすることができる。

【0025】

このゲットウの根茎抽出物から、ＤＫおよびＤＤＫを得るには、例えば、図１に示す手順に従って分離すればよい。

【0026】

すなわち、ゲットウ抽出物にヘキサン等の非極性溶媒を加え、十分攪拌した後、非極性溶媒相を分離取得する。ついで、この非極性溶媒相から非極性溶媒を留去した後、残留した固体物に水に加えて懸濁液とし、温度が１００℃になるまで加熱する。

【0027】

この加熱した懸濁液を濾過し、濾液と残渣に分け、残渣部分から分取用高速液体クロマトグラフィー等の分離手段により、ＤＫを得ることができる。一方、濾液部分を、４℃で２４時間、冷蔵庫内に放置し、析出した固体の再結晶を繰り返すことにより純粋なＤＤＫを得ることができる。

【0028】

一方、式（Ｉｃ）で表されるヒスピジンは、薬用きのこであるフェリナス・リンテウス（ Phellinus linteus ）から得られるフェノールの化合物として既に報告されたものであり（Chen, W.ら、“ Chemico-Biol. Interact. ”（2012） 199, 137-142.）、市販もされている化合物である。また、本発明者らが先に報告した、５,６−デヒドロカワイン（ＤＫ）を胃で加水分解し、これを更にＣＹＰ２Ｃ９を含むウサギの肝臓ミクロソームで代謝させることで得ることもできる（Upadhyay, A.ら、“ In proceedings of 16th international conference on cytochrome P450.” Shoun, H., Ohkawa, H., Eds., Nago: Okinawa, Japan. 2009, pp 31-34.)。

【0029】

さらに、式（Ｉｄ）で表されるＨ１は、ヒスピジンをメタノールとジクロロメタンの混合溶液に溶解し、ジアゾメタンを添加して、シリカゲル分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）を用いて精製することにより得られる。具体的には、ヒスピジンをメタノール：ジクロロメタン（１：５）に溶解し、０℃に冷やして、ジクロロメタンに溶解したジアゾメタンを添加し、この混合溶液を４℃で一晩保存し、溶媒を蒸発させ、残留物をシリカゲル分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）を用いて精製することで得られる。または、マグネシウムメトキシドの懸濁液含有無水メタノールに、４−メトキシ−６−メチル−２−ピロン（ＭＭＰ）と３，４−ジメトキシベンズアルデヒドを添加し、得られた混合物を室温で撹拌した後、水酸化マグネシウムを溶解するために酢酸を添加し、濾液を真空中で乾燥させ、残渣を数ｍＬのメタノールで洗浄し、メタノールで繰り返し再結晶することによりＨ１を製造できる。また、式（Ｉｅ）で表されるＨ２は、Ｈ１をメタノールとクロロホルムの混合溶液に溶解させ、１０％パラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ）の存在下で攪拌し、ろ過溶液を真空で蒸発させ、カラムクロマトグラフィーで精製することにより得られる。さらに、式（Ｉｆ）で表されるＨ３は、Ｈ２と同様にして、ヒスピジンを還元することで得ることができる。

【0030】

また、８（１７）,１２−ラブダジエン−１５,１６−ジアール（以下、「ラブダジエン」と略称することがある）も、ゲットウの種子や根茎の抽出物に含まれる成分である。ゲットウの種子の抽出物は、例えば、ゲットウの種子を必要に応じ適当な大きさに細断し、これを水、エタノール等の低級アルコールまたはこれらの混液等の抽出溶媒で抽出することにより得られる。抽出は、ゲットウの種子に対し、１〜５０質量倍程度の抽出溶媒を加え、室温〜６０℃程度で２４〜３６時間程度行えばよい。この抽出液から抽出溶媒を留去した後、残留した固体物に水に加えて懸濁液とし、例えば、液−液分配、薄層クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、分配カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー等の公知の分離精製手段を用いてラブダジエンを分離精製することができる。ラブダジエンは下記式（II）で表される化合物である。

【0031】

【化6】

【0032】

本発明においては、上記化合物の他、ククルビタシン化合物を用いることもできる。ククルビタシン化合物としては、ククルビタシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉなどが含まれるが、このうち、ククルビタシンＩが毛乳頭細胞増殖促進剤や肺ガン細胞成長抑制剤等に優れることから好適に用いられる。

【0033】

ククルビタシン化合物は、ニガウリ（Momordica charantia）などのウリ科（Cucurbitaceae）に属する植物から、例えば、以下のようにして単離精製することができる。

【0034】

ニガウリは、沖縄ではゴーヤと呼ばれ、従来から種子やわたを除いた果実部が食用に供されている。ゴーヤの各部位を、好ましくは、風乾した後、適切な大きさに細断ないし粉砕して抽出原料とする。この抽出原料に対し、１〜２０質量倍の抽出溶媒を加えた後、１〜２０時間程度抽出を行う。抽出に用いる抽出溶媒としては、上記水性溶媒が好適である。抽出温度は、５０〜１００℃程度が好ましい。このようにして得られたニガウリ抽出物からカラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー等公知の分離精製方法を用いることにより、ククロビタシン化合物を単離することができる。また有機合成によって製造されたものを用いてもよい。

【0035】

さらに、本発明においては、アルテピリンＣを有効成分として用いることができる。アルテピリンＣは、プロポリスに含まれる成分の一つであり、従来公知の製造方法によって得ることができる（例えば特開２００３−５５２９７号公報参照）。アルテピリンＣには塩の形態でもよく、塩としては特に限定されず、ナトリウム、カリウム、カルシウム等が例示される。

【0036】

以上のようにして得られたＤＫ、ＤＤＫ、ヒスピジン、ヒスピジン誘導体１〜３（以下、「Ｈ１〜３」ともいう）、ラブダジエン、ククルビタシン化合物及びアルテピリンＣは、そのまま、あるいは必要に応じ、液体高速クロマトグラフィーなど公知の方法によって精製した後、チロシナーゼ阻害剤、毛乳頭細胞増殖促進剤又は肺ガン細胞成長抑制剤として利用することができる。

【0037】

例えば、本発明のチロシナーゼ阻害剤毛乳頭細胞増殖促進剤又は肺ガン細胞成長抑制剤の調製は、治療有効量のＤＫ、ＤＤＫ、ヒスピジン、Ｈ１〜３、ラブダジエン、ククルビタシン化合物又はアルテピリンＣを、製薬上許容される任意成分、例えば、慣用の賦形剤、担体、結合剤、滑沢剤、水性溶剤、油性溶剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、安定剤等と組み合わせ、混合することにより行うことができる。

【0038】

本発明のチロシナーゼ阻害剤、毛乳頭細胞増殖促進剤又は肺ガン細胞成長抑制剤は、経口あるいは非経口の医薬として製剤化することができる。経口投与による場合、通常の経口投与製剤、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形剤；水剤；油性懸濁剤；又はシロップ剤もしくはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤形としても用いることができる。非経口投与による場合は、水性又は油性懸濁注射剤、点鼻液、皮膚外用剤として用いることができる。皮膚外用剤の形態で使用する場合は、これを薬学的に許容される担体や添加剤と組み合わせ、軟膏剤、クリーム剤、乳剤、ゲル剤、ローション剤、貼付剤等の形態に調製すればよい。

【0039】

本発明のチロシナーゼ阻害剤、毛乳頭細胞増殖促進剤又は肺ガン細胞成長抑制剤の投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、状態および疾患の種類によっても異なるが、通常、成人１日あたり約１０〜５００ｍｇであり、好ましくは、約１０〜５０ｍｇであり、これを必要に応じて数回に分け投与すれば良い。

【0040】

本発明のチロシナーゼ活性阻害剤、毛乳頭細胞増殖促進剤又は肺ガン細胞成長抑制剤の添加量は、添加対象物の種類、投与経路、剤形等の諸条件によって異なるが、例えば、医薬製剤中に０．００１質量％〜１０質量％含有させればよく、色素沈着過剰、低色素沈着等皮膚異常の治療薬、育毛剤、肺がん治療薬等とすることができる。

【0041】

さらに、本発明のチロシナーゼ阻害剤は、メラニンの産生や沈着を抑制し、美白作用を有するため、化粧料に配合し美白化粧料とすることもできる。例えば、公知の化粧料基剤にチロシナーゼ阻害剤を、０．０１〜１０質量％程度配合し、常法に従って、溶液状、可溶化状、乳化状、粉末状、ペースト状、ムース状、ジェル状の形態とすることにより製造され、化粧水、乳液、クリーム、パック、軟膏等として提供される。

【0042】

また、上記美白化粧料の製造にあたっては、必要に応じて、通常化粧料に使用される、精製水、アルコール類、水溶性高分子、油剤、界面活性剤、ゲル化剤、保湿剤、ビタミン類、抗菌剤、香料、塩類、ｐＨ調整剤等の成分を加えることができる。

【0043】

また本発明の毛乳頭細胞増殖促進剤は、例えば、精製水、エタノール、油性物質、保湿剤、増粘剤、防腐剤、乳化剤等の任意成分を組合せ、ローションやヘアトニック、エアゾール剤、クリーム、ジェル、シャプー等の育毛剤とすることができる。

【0044】

一方、ラブダジエンは脂肪細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）及び一酸化窒素（ＮＯ）の生成抑制作用も有する。肥満では、脂肪組織において、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシラジカル等のラジカルや過酸化水素、一重項酸素等の活性酸素種（ＲＯＳ）の産生が促進され、脂肪細胞の分化に重要な役割を果たす。したがって、ラブダジエンは、抗酸化剤の他、抗肥満剤やメタボリックシンドロームの治療・予防剤としても利用することができる。その用量・用法等は上記チロシナーゼ阻害剤等と同様である。

【実施例】

【0045】

次に参考例および実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例で使用した材料等は、次のように入手し、統計処理は下のように行った。

【0046】

（化学物質および測定試薬）
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞及び３Ｔ３−Ｌ１細胞は、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手した。また、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、デキサメサゾン、３−イソブチル−１−メトキシキサンチン（ＩＢＭＸ）、牛胎児血清（ＦＢＳ）、トリトン−Ｘ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は和光純薬工業社から購入した。インシュリン、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、スルファニルアミド、ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩はシグマアルドリッチ社から入手した。

【0047】

（統計処理）
すべての分析評価は、３重で行なわれた。データは、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）後ダンカンテストを行った。データは平均±標準偏差として表し、ｐ値＜０.０５を有意差ありとした。

【0048】

参 考 例 １
ゲットウ抽出物の取得：
琉球大学（沖縄県中城郡西原町千原１）のキャンパスからゲットウ（Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt. & R.M. Sm. (Family Zingiberaceae) ）を採取した。このゲットウの根茎を、２〜３ｍｍ程度に細断した後、その２０ｇを、６００ｍｌのエタノール溶液（濃度８０％）中に入れ、室温で４８時間抽出した。得られた抽出物を、減圧下で乾燥するまで濃縮し、ゲットウ根茎のエタノール抽出物を得た。

【0049】

一方、同じゲットウのサンプル各２０ｇを、沸騰状態の１Ｌの水中に３０分浸漬し、その後放冷させ、抽出物をろ過し、真空下、４０℃で乾燥させ、ゲットウ根茎の熱水抽出物を得た。これらの抽出物それぞれについて、残留物を定量後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（濃度５０％）に溶解し、抽出物が１ｍｇ／ｍＬ濃度であるゲットウ抽出物の各サンプルを得た。

【0050】

参 考 例 ２
ＤＫおよびＤＤＫの取得：
ゲットウ根茎の熱水抽出物を出発原料とし、図１に示す工程によりＤＫおよびＤＤＫを抽出した。

【0051】

まず、ゲットウ根茎２ｋｇの熱水抽出物（乾燥前）１０Ｌを、１Ｌになるまで濃縮後、その５００ｍＬのヘキサンで３回、分液ロートで分液操作を行い、ヘキサン相を分離取得した。

【0052】

ついで、このヘキサン相から、４０℃の温度でヘキサンを減圧下で留去し、固体物を得た。この固形物に、１００ｍＬの水を加え、温度が１００℃になるまで加熱した後、濾過した。

【0053】

上記の濾過工程で得られる残渣部分を更に下記条件の分取用の高速液体クロマトを用いて精製し、ＤＫを１００ｇ当たり１８.８ｍｇ得た。

【0054】

カラム：
ＴＳＫ ｇｅｌ ＯＤＳ−１００Ｚ（１５.０×０.４６ｃｍ ｉ.ｄ.：
５μｍ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ）
移動相Ａ： 水（０.１％酢酸）
移動相Ｂ： メタノール（０.１％酢酸）
流 速： ０.８ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長： ２８０ｎｍ
移動相の濃度勾配：
０から１０分までは、移動相Ａと移動相Ｂの５０：５０混液から、１００％移動相Ｂ まで変化する濃度勾配
１０から２０分までは、１００％移動相Ｂで変化なし
２０から２１分までは、１００％移動相Ｂから、移動相Ａと移動相Ｂが５０：５０混 液まで変化する濃度勾配

【0055】

一方、上記の濾過工程で得られる濾液部分は、４℃で２４時間冷蔵庫内に放置し、析出した固体を濾取し、ＤＤＫを原料１００ｇ当たり２４.１ｍｇ得た。上記ＤＫとＤＤＫの分析ＨＰＬＣクロマトグラムを図２に示す。

【0056】

得られたＤＤＫおよびＤＫについて、そのＣＤＣｌ_３中の、^１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）スペクトルを、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＥＣＡ６００（ＪＥＯＬ、日本）で測定したところ、下記の通りであった。化学シフトは、ＴＭＳに対するｐｐｍ（δ）で示した。２ＤＮＭＲ（Ｈ，Ｃ−ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣ）試験は、標準パルスシーケンスを用いて行った。

【0057】

ＤＤＫ：
EIMS, m/z 230 [M] (30), 202 (8), 125 (30), 111 (28), 91 (100), 69 (12); 1 H (CDCl₃), δ 2.73-2.76 (m, 2H, CH₂), 2.96-2.97 (m, 2H, CH₂), 3.77 (s, 3H, CH₃), 5.42 (s, 1H, CH), 5.72 (s, 1H, CH), 7.18-7.29 (m, 5H, aromatic)

【0058】

ＤＫ：
EIMS, m/z 228 [M](60), 200 (20), 157 (35), 129 (20), 69 (20), 44 (35), 40 (100); 1 H (CDCl₃), δ 3.79 (s, 3H, CH₃), 5.51 (d, 1H, CH), 5.97 (s, 1H, CH), 6.81 (d, 1H, CH), 7.31 (d, 1H, CH), 7.32 (m, 5H, aromatic)

【0059】

参 考 例 ３
ラブダジエンの取得：
ラブダジエンはゲットウの種子から単離した。種子５００ｇをエタノール１Ｌに浸漬して２日間抽出した。濾過後、濾液から溶媒を蒸発乾固し褐色の飴状抽出物３．２６ｇを得た。この抽出物を蒸留水３００ｍＬに懸濁し、ヘキサン（３００ｍＬ）及び酢酸エチル（３００ｍＬ）に分配した。酢酸エチル（１．０２ｇ）をシリカゲル（シリカゲル６０Ｎ、粒径６３−１２０μｍ、７０−２３０メッシュ（ＡＳＴＭ））を充填したガラスクロマトグラフィーカラムに付し、ヘキサン：アセトン（０−１００％）で溶出して３つの画分を得た。第１画分をさらに薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に付した。その溶液（ヘキサン：アセトン＝９：１）をラブダジエン単離に用いた。プレコートＴＬＣシリカゲルプレート（Ｍｅｒｋ−６０ ２５４，０．２５ｍｍ厚）を予め４５分間移動相に浸透させたツインスルーガラスタンク（Ｃａｍａｇ社）を用いて展開し、各プレートは１０ｃｍの高さまで展開した。その後プレートを取り外し、乾燥後、スポットをＵＶ光で可視化した。さらにラブダジエンを採取するために分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）を用いた。第１画分５０ｍｇをアセトンに溶解し、プレートを合計容量２００ｍＬのヘキサン：アセトン混液（９：１）に展開した。波長２５４ｎｍで４つのバンドが検出された。各バンドを擦り取り、剥離物を酢酸エチルで撹拌しながら抽出した。抽出は２〜３回行った。ＵＬＴＲＡＳＨＩＥＬＤ（商標）ＰＬＵＳ ５００ＭＨｚ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ社）を用いてメタノールＤ_４中の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。化学シフトは、標準パルスシーケンスを用いてｐｐｍ（δ）で示した。バンド３がラブダジエンであると同定された。データを以下に示す。
EIMS, m/z (rel. int.); 302 (20), 137 (100), 123 (50), 109 (35), 95 (73), 81 (70), 69 (55), 55 (48), 41 (50).
¹H (CDCl₃): d 0.74, 0.84 ,0.90 (s, each 3H, CH₃, 18, 19, 20), 1.04-2.51 (m, 14H, CH₂, CH, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11), 3.45 (s, 2H, CH₂, 14), 4.39 (s, 1H, CH₂, 17), 4.88 (s, 1H, CH₂, 17), 6.78 (t, 1H, CH, 12), 9.42 (s, 1H, CHO, 15) , 9.67 (s, 1H, CHO, 16)

【0060】

参 考 例 ４
ヒスピジンの調製：
５,６−デヒドロカワイン（ＤＫ）をラット肝臓でヒスピジンに転換した。ラット肝臓ミクロソームでの代謝によるＤＫからヒスピジンへの転換は、文献記載の方法を若干改変した行った（Tang, C.; Shou, M.; Roddrigues, A.D. Substrate-dependent effect of acetonitrile on human liver microsomal cytochrome P4502C9 (CYP2C9) activity. Drug. Metab. Dispos. 2000, 28, 567-572.）。すなわちウィスター種マウスを殺し、直ちに肝臓を採取した。肝臓を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で灌流した後細断し、０．１５Ｍ ＫＣｌ、1ｍＭ ＥＤＴＡ，０．２５Ｍ スクロース含有０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中にて４℃、３０分間１０００×ｇでホモジナイズした。上清をさらに４℃にて１００，０００×ｇ、６０分間遠心分離し、得られたペレットを２０％グリセロール，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．２５Ｍ スクロース含有０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）にタンパクの終濃度が２０ｍｇ／ｍＬとなるように添加し−８０℃で保存した。

【0061】

１０ｍＭ ＤＫ １００μＬ，３．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ １００μＬ，酵素４００μＬ（ミクロソームタンパク０．２ｍｇ／ｍＬ），１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）３００μＬからなる混合物（最終容量１ｍＬ）を３７℃で５分間インキュベートした。次にＮＡＤＰＨ １００μＬを加え３７℃で１０分間インキュベートを継続した。アセトニトリル／メタノール混液５０ｍＬを混合物に加え３００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。有機相を蒸発させ残渣をメタノール／酢酸／アセトニトリル混液（９５：４：１）に溶解した。

【0062】

次にＳｙｎｅｒｇｉ ４ｕ ＭＡＸ−ＲＰ ８０Ａ カラム（１５ｘ０．４６ｃｍ,５μｍ)を用いＨＰＬＣを行った。移動相はメタノール／酢酸／アセトニトリル（９５：４：１、ｖ／ｖ；溶媒Ｂ）及び０．１％酢酸溶液（ｖ／ｖ；溶液Ａ)を用いた。グラジエント溶離条件は、０〜２分間：溶液Ｂ ５％、２〜２０分間：溶液Ｂ １００％、２０〜２５分間：溶液Ｂ １００％、２５〜３０分間：溶液Ｂ ５％とした。移動相は４０℃、流速０．５ｍＬ/ｍｉｎで供給した。定量は３６５ｎｍでのＵＶピーク面積を測定した。
質量分析は、ＣＯＳＭＯＳＩＬ５ Ｃ １８ ＡＲＩＩ（１５０ｍｍｘ２．０ｍｍφ）を用いてＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−２０ＡＤ ＸＲ ＬＣシステムとＷａｔｅｒ Ｑｕａｔｔｒｏ ｍｉｃｒｏ ＡＰ ＭＳシステムにより行った。試料の注入量は５μＬとした。移動相は溶媒Ａ（０．１％酢酸水溶液）と溶媒Ｂ（メタノール：酢酸：アセトニトリル＝９５：４：１）とし、０．５ｍＬ／ｍｉｎの一定の流速で導入した。勾配は、溶媒Ｂを２０−１００％の間で増加させた。グラジエント条件は、０〜２分間：溶液Ｂ ５％、２〜２０分間：溶液Ｂ １００％、２０〜２５分間：溶液Ｂ １００％、２５〜３０分間：溶液Ｂ ５％とした。コーン及びキャピラリー電圧は、それぞれ５０Ｖと４．０ｋＶであった。温度は３５０℃に設定した。赤外線（ＩＲ）スペクトルは４００〜４０００ｃｍ^−１の波長範囲で、ＫＢｒペレットを用いてＪＡＳＣＯ ＦＴ／ＩＲ−６１００ ｐｌｕｓ ｓｐｅｔｒｏｍｅｔｅｒで測定した。マススペクトルを図３に示す。

【0063】

参 考 例 ５
ヒスピジン誘導体（Ｈ１〜Ｈ３）の調製：
無水メタノール１０ｍＬにマグネシウムメトキシド（１０４ｍｇ）を懸濁させた液に、４−メトキシ−６−メチル−２−ピロン（ＭＭＰ）（１．４ｍｍｏｌ，２００ｍｇ）と３，４−ジメトキシベンズアルデヒド（１．７ｍｍｏｌ，２８５ｍｇ）を添加した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。水酸化マグネシウムを溶解するために酢酸２ｍｌを添加し、ろ液を真空中で乾燥させた。残渣を数ｍＬのメタノールで洗浄し、メタノールで繰り返し再結晶して淡黄粉末としてヒスピジン誘導体Ｈ１を得た。次に、Ｈ１をメタノール：クロロホルム（１：１）０．８２ ｍＬに溶解させ、１０％パラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ）の存在下で２時間攪拌した。この混合溶液をろ過し、溶媒を真空で蒸発させた。カラムクロマトグラフィーで精製を行い、Ｈ２を得た（３ｍｇ、収率８５％、白色個体）。同様に、ヒスピジンを還元してＨ３を得た。データを以下に示す。
(H1) 6-(3,4-dimethoxystyryl)-4-methoxy-2Hpyran-2-one.
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）δ：
7.43(d,1H,CH),7.07(dd,1H,CH),7.00(d,1H,CH),6.85(d,1H,CH),6.43(d,1H,CH),5.89(d,1H,CH),5.46(d,1H,CH),3.91(s,3H,OCH₃),3.89(s,3H,OCH₃),3.81(s,3H,OCH₃).
(H2) 6-(3,4-dimethoxyphenethyl)-4-methoxy-2Hpyran-2-one.
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）δ：
6.77(d,1H,CH),6.69(dd,1H,CH),6.66(d,1H,CH),5.69(d,1H,CH),5.40(d,1H,CH),3.84(s,3H,OCH₃),3.83(s,3H,OCH₃),3.76(s,3H,OCH₃),2.91(m,2H,CH2),2.71(m,2H,CH2).
(H3) 6-(3,4-dihydroxyphenethyl)-4-hydroxy-2Hpyran-2-one.
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：
7.29(d,1H,CH),7.20(dd,1H,CH),6.76(d,1H,CH),6.11(d,1H,CH),5.26(d,1H,CH),3.34(m,2H,CH2),2.99(m,2H,CH2).

【0064】

実 施 例 １
メラニン産生抑制作用：
（１）マウスＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（ＡＴＣＣより入手）を、３７℃にて、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１０．０００Ｕ／１００μｇ／ｍＬ）を加えたＤＭＥＭ中で５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気にて培養した。

【0065】

（２）細胞生存性
細胞生存率はＭＴＴアッセイを用いて測定した（Campos, P.M.; da Silva Horinouchi, C.D.; da Silveira Prudente, A.; Cechinel-Filho, V.; de Almeida Cabrini, D.; Otuki, M.F. Effect of a Garcinia gardneriana (Planchon and Triana) Zappi hydroalcoholic extract on melanogenesis in B16F10 melanoma cells. J. Ethnopharmacol. 2013, 148, 199-204.）。Ｂ１６Ｆ１０細胞を９６ウェルプレートに７×１０^３細胞／ウェルの密度で播種した。４８時間培養後、細胞を１００又は２００μｇ／ｍＬの濃度の試験化合物、又は５００μＭコウジ酸溶液に接触させ、３７℃でさらに４８時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄し、３７℃、３時間ＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）でインキュベートした。培地を捨てて、エタノール200μLを添加した。マイクロプレート分光光度計（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用いて５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図４に示す。

【0066】

（３）メラニン含有量測定
メラニン含有量はYoonらの方法に従って測定した（Yoon, N.Y.; Eom, T-K.; Kim, M-M.; Kim, S-K. Inhibitory effect of Phlorotannins isolated from Ecklonia cava on mushroom tyrosianse activity and melanin formation in mouse B16F10 melanoma cells. J. Agri. Food. Chem. 2009, 57, 4124-4129.）。すなわち、Ｂ１６Ｆ１０細胞を７×１０^３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。４８時間培養後、細胞を２０又は５０μｇ／ｍＬの試験化合物、又は５００μＭコウジ酸溶液に接触させた。１時間後、１００μＭイソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を加え、さらに３７℃で４８時間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄し、次いで１０％ＤＭＳＯを含むＮａＯＨ（１Ｎ）１００μＬに溶解させた。サンプルを８０℃で１時間インキュベートし、メラニンを可溶化するために混合した。混合ホモジネートの４９０ｎｍにおける光学濃度を測定した。コントロール群において実験期間中に生成するメラニンの総量を１００％とし、処置群における阻害率を計算した。結果を図５に示す。

【0067】

（４）ＤＫ、ＤＤＫ、ヒスピジン及びラブダジエンにおける細胞内チロシナーゼ活性
Liらの方法を若干修正してチロシナーゼ活性を測定した（Li, X.; Guo, L.; Sun, Y.; Zhou, J.; Gu, Y.; Li Y. Baicalein inhibits melanogenesis through activation of the ERK signaling pathway. Inter. J. Mol. Med. 2010, 25, 923-927.）。Ｂ１６Ｆ１０細胞を９６ウェルプレートに７×１０^３細胞／ウェルの密度で播種した。４８時間培養後、細胞を２０又は５０μｇ／ｍＬの試験化合物、又は５００μＭコウジ酸の溶液に接触させたた。１時間後、１００μＭ イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を加え、さらに３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷リン酸緩衝液で洗浄し、１％トリトン−Ｘ（９０μＬ／ウェル）含有リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶解した。プレートを−８０℃で３０分間凍結した。解凍、混合した後、１％Ｌ−ＤＯＰＡ １０μＬを各ウェルに加えた。３７℃、２時間インキュベーションした後、９０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図６に示す。

【0068】

（５）Ｈ１〜Ｈ３における細胞内チロシナーゼ活性
Chanらの方法に従ってチロシナーゼ活性を測定した（Chan CF, Lai ST, Guo YC, Chen MJ. 2014. Inhibitory effects of novel synthetic methimazole derivatives on mushroom tyrosinase and melanogenesis. Bioorg Med Chem 22: 2809-2815.）。９６ウェルプレートに、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と１％ ペニシリン／ストレプトマイシンで補充したＤＭＥＭ含有培養培地を用意し、Ｂ１６Ｆ１０細胞を、５×１０^３細胞／ウェルの密度で播種し、２４時間培養した。Ｂ１６Ｆ１０細胞をα-メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）１００ｎＭで処理した後、試験化合物で４８時間処理した。Ｂ１６Ｆ１０細胞を５０ｍＭ 氷冷リン酸緩衝液（ｐＨ ６．８）で２回洗浄し、１％ トリトン−Ｘ含有５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．８）９０μＬで溶解し、−８０℃で３０分間凍結した。解凍、混合した後、０．２％ Ｌ−ＤＯＰＡ ２０μＬを各ウェルに加えた。３７℃、２時間インキュベーションした後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。陽性対照としてミモシン（１００μＭ）及びコウジ酸（５０μＭ）を使用した。結果を図７に示す。

【0069】

結果：
３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）は、チロシナーゼを活性化する強力なメラニン産生刺激因子である。チロシナーゼはメラニン形成における重要かつ律速段階に関与する酵素である。チロシナーゼは、チロシンの水酸化により３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）を生成し、次にＬ−ＤＯＰＡの酸化によりドーパキノンとなる。メラニン産生刺激因子であるＩＢＭＸの存在下、ＤＫ、ＤＤＫ、ヒスピジン、ラブダジエンのメラニン産生抑制活性を評価した。
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を、４８時間ＩＢＭＸの存在下でＤＫ、ＤＤＫ、ヒスピジン、ラブダジエン（２０又は５０μｇ／ｍＬ）で処理したところ、図５に示されるように、いずれも有意にメラニン含有量を減少させた。５０μｇ／ｍＬでは、ＤＫ、ＤＤＫ、ヒスピジン、ラブダジエンのメラニン生成抑制率はそれぞれ７１．９±５．３３％、６７．６±４．４７％、６７．２±５．９３％、６７．３±５．３４％であり、陽性対照であるコウジ酸（５００μＭ、５０．５±４．９４％）よりも優れたメラニン生成抑制作用を示した。

【0070】

ＤＫ、ＤＤＫ、ヒスピジン、ラブダジエンが細胞内チロシナーゼ活性を阻害するか否かを評価するために、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞をＤＫ、ＤＤＫ、ヒスピジン、ラブダジエン(２０又は５０μｇ／ｍＬ)で４８時間処理し、Ｌ−ＤＯＰＡを加えてインキュベーションした。２０μｇ／ｍＬにおけるＤＫ、ＤＤＫ、ヒスピジン、ラブダジエンのチロシナーゼ阻害率は、それぞれ５２．４±０．７６％、４６．０±１．８７％、６３．７±５．０１％、５８．７±０．８４％であった。５０μｇ／ｍＬにおける阻害率は、それぞれ７４．３±２．８６％、５５．４±４．４８％、６９．９±７．６６％、６２．３±６．９９％であり、陽性対照であるコウジ酸（５３．４±１．３８％）よりも強い阻害活性を示した。またこれらの化合物は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞の生存率にほとんど影響を与えなかった。
Ｈ１〜３についても、一定の細胞内チロシナーゼ活性を示した。

【0071】

実 施 例 ２
活性酸素種（ＲＯＳ）及び一酸化窒素（ＮＯ）生成阻害試験：
（１）肥満細胞の培養と分化：
細胞として、３Ｔ３−Ｌ１細胞を用い、これを、２％のグルタミンと、１０（ｖ／ｖ）％のウシ胎児血清（ＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、コンフルエントになるまで培養した。コンフルエンシーに達した２日後に、細胞は、追加の２日間、１０％ＦＢＳ、０.５ｍＭ ＩＢＭＸ、１μＭデキサメサゾンおよび１０μＭインシュリンを含むＤＭＥＭ培地中で培養することによって脂肪細胞に分化するように刺激された。細胞は、それから更に、２日間、１０％ＦＢＳと１０μｇ／ｍＬインシュリンを含むＤＭＥＭ中で維持され、更に４日間、１０％ＦＢＳのみを含むＤＭＥＭで培養された。
この結果、細胞の９０％以上は、脂質滴が蓄積された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に分化していた。分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞は、異なった濃度の試験化合物で処理され、試験中を通して５％のＣＯ_２を含む加湿されたインキュベーター中で、３７℃に維持した。

【0072】

（２）細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）測定
３Ｔ３−Ｌ１細胞を９６ウェルプレートに２×１０^６細胞／ｍＬの密度で播種し、上記と同様にしてコンフルエントになるまで培養し、分化させた。ＲＯＳ生成は、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）アッセイによって検出した（Oliveira, H.R.; Verlengia, R.; Carvalho, C.R.; Britto L.R.; Curi, R.; Carpinelli, A.R. Pancreatic β-cells express phagocyte-like NAD(P)H oxidase. J. Diabetes. 2003, 52, 1457-1463.）。ＮＢＴは、ＲＯＳにより還元され、ホルマザンと呼ばれる暗青色で不溶性形態になる。分化後、細胞を１０又は２０μｇ／ｍＬの濃度のラブダジエンで２４時間インキュベートした。次いで、細胞を０．２％ＮＢＴ含有ＰＢＳ１００μＬ中で９０分間インキュベートした。暗青色のホルマザンを５０％酢酸に溶解し、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。

【0073】

（３）細胞内一酸化窒素（ＮＯ）生成測定
３Ｔ３−Ｌ１細胞を９６ウェルプレートに播種し、分化させた。亜硝酸塩生成（ＮＯ_２）アッセイを用いて測定した( Fang, X.K.; Gao, J.; Zhu, D.N. Kaempferol and quercetin isolated from Euonymus alatus improve glucose uptake of 3T3-L1 cells without adipogenesis activity. J. Life Sci. 2008, 82, 615-622.)。細胞を１０又は２０μｇ／ｍＬの濃度のラブダジエンで２４時間インキュベートした。上清（１００μＬ）及びグリース試薬（１００μＬ、１％スルファニルアミドと０．１％ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩含有５％リン酸の１：１混合物（ｖ／ｖ））を、９６ウェルプレート中で混合し、室温で１０分間インキュベートした。マイクロプレート分光光度計を用いて５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、亜硝酸ナトリウムで作成した標準曲線により亜硝酸塩濃度を推定した。

【0074】

結果：
ラブダジエンは脂肪細胞におけるＲＯＳ生成を有意に阻害した。濃度２０μｇ／ｍＬにおける阻害率は６３．９±０．５６％であった。またＮＯ生成も有意に抑制し、ＮＯ生成阻害率は７２．０±０．４１％であった。

【0075】

実 施 例 ３
発毛促進作用：
（１）ヒト毛乳頭細胞の培養
ヒト毛乳頭細胞（ＨＦＤＰＣ）を、５０ｍＬ毛乳頭細胞成長培地（ＰＣＧＭ）、０．５ｍＬ ウシ胎仔血清（ＦＳＣ）、０．５ｍＬ ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）、０．２５ｍＬ シプロテロン（Ｃｙｐ）及び０．２５ｍＬインスリン トランスフェリン トリヨードサイロニン（ＩＴＴ）を含む５１．５ｍＬ ＨＦＤＰＣ成長培地で培養した。

【0076】

（２）細胞増殖率
細胞増殖率は、チアゾリル ブルー テトラゾリウム 臭化物（ＭＴＴ）アッセイを用いて、特開２００６−２１９４０７号公報に記載された方法に基づいて行った。すなわち、ヒト毛乳頭細胞を１×１０^４細胞／ｍＬ濃度に、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含んだ培地で希釈した。次に、２００μＬ 細胞培養液（２，０００細胞／ウエル）をコラーゲンでコーティングした９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で３日間培養した。培地を除き、ＤＭＥＭで調整した試験物質２００μＬを添加し、４日間培養後、ＤＭＥＭに溶解したＭＴＴ溶液（０．４ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを加え、２時間培養し、未反応のＭＴＴを取り除いた。２−プロパノール１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを振とうさせ、マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍと６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。陽性対照としてミノキシジル（１０μＭ）を使用した。結果を図８及び図９に示す。

【0077】

ＤＫ(図８（Ａ）)、ＤＤＫ(同（Ｂ）)及びヒスピジン（同（Ｃ））は、陽性対照であるミノキシジルよりも高い発毛促進効果があった。特に、ヒスピジンを１０μＭ使用した場合、ミノキシジルと比較しておよそ２倍の効果があった。さらに、ククルビタシンＩは最も効果に優れ、１０ｎＭでも２０％程度の促進効果が得られた。これはミノキシジルの１０００倍以上の効果である（同（Ｄ））。またアルテピリンＣ（同（Ｅ））も発毛促進効果を示した。

【0078】

実 施 例 ４
Ａ５４９肺がん細胞の生存率：
細胞生存率はＭＴＴアッセイを用いて測定した（Campos PM, Horinouchi CDS, Prudente AS, Cechinel-Filho V, Cabrini DA, Otuki MF. 2013. Effect of a Garcinia gardneriana (Planchon and Triana) Zappi hydroalcoholic extract on melanogenesis in B16F10 melanoma cells. J Ethnopharmacol 148: 199-204.）。Ａ５４９肺がん細胞を９６ウェルプレートに１×１０^４細胞／ウェルの密度で播種し、２４時間培養した。試験化合物を添加し、加湿５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で、７２時間インキュベートした。インキュベーション後、ＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを各ウェルに加え、３時間インキュベートした。培地を捨てて、ホルマザン含有ＤＭＳＯ ２００μＬを添加し、１０分間プレートを振とうした。細胞生存率は、マイクロプレートリーダー（BioTek, Synergy HT, Winooski, Vermont, USA）を用いて５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。陽性対照としてレスベラトロールを使用した。結果を表１に示す。

【0079】

【表1】

【0080】

ヒスピジン誘導体であるＨ１〜Ｈ３は、陽性対照であるレスベラトロールよりも、Ａ５４９肺がん細胞の成長を阻害する効果が高かった。特にククルビタシンＩ（ＣＢＩ）は最も高い阻害活性を示し、ＩＣ_５０は１４０ｎＭであった。

【産業上の利用可能性】

【0081】

本発明のチロシナーゼ阻害剤は、優れたメラニン生成抑制作用を有するとともに安全性が高いため、皮膚障害を予防・治療するための医薬や美白化粧料等として利用できるものである。また本発明の毛乳頭細胞増殖促進剤は、細胞の増殖性に優れており、育毛剤として利用できるものである。さらに、本発明の肺ガン細胞成長抑制剤は、肺ガン細胞の成長を効果的に妨げることができ、医薬品等に利用できるものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】