特許 6493899 抗ウイルス剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6493899

(24)【登録日】2019年3月15日

(45)【発行日】2019年4月3日

(54)【発明の名称】抗ウイルス剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/732 20060101AFI20190325BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20190325BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190325BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20190325BHJP

   A61K 131/00 20060101ALN20190325BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/732

   A61P31/12

   A61P43/00 111

   A23L33/105

   A61K131:00

【請求項の数】6

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2018-99597(P2018-99597)

(22)【出願日】2018年5月24日

【審査請求日】2018年9月20日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】595011548

【氏名又は名称】株式会社ジュポンインターナショナル

(73)【特許権者】

【識別番号】504180239

【氏名又は名称】国立大学法人信州大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】▲濱▼渦 康範

(72)【発明者】

【氏名】河原 岳志

(72)【発明者】

【氏名】井ノ上 利文

【審査官】 鶴見 秀紀

(56)【参考文献】

【文献】 園芸研究，２０１０年，Vol.9,No.1，p.451

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ２３Ｌ ３３／１０５

Ａ６１Ｐ ３１／１２

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｋ １３１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

カリン種子抽出物を有効成分とする抗ウイルス剤。

【請求項2】

カリン種子抽出物が、カリン種子エタノール抽出物である請求項１記載の抗ウイルス剤。

【請求項3】

抗ウイルス剤が、抗ウイルス薬又は抗ウイルス用食品組成物である請求項１又は２記載の抗ウイルス剤。

【請求項4】

カリン種子抽出物を有効成分とする抗ウイルス性遺伝子発現増強剤。

【請求項5】

カリン種子抽出物が、カリン種子エタノール抽出物である請求項４記載の抗ウイルス性遺伝子発現増強剤。

【請求項6】

抗ウイルス性遺伝子発現増強剤が、抗ウイルス性遺伝子発現増強薬又は抗ウイルス性遺伝子発現増強用食品組成物である請求項４又は５記載の抗ウイルス性遺伝子発現増強剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗ウイルス剤、特に抗ウイルス性遺伝子発現増強剤に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞がウイルスに感染すると、様々なサイトカイン、ケモカイン等が産生され炎症反応を引き起こす。これらの中で特に重要なものは、インターフェロン（ＩＦＮ）、特にＩ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）であり、ウイルス感染後の自然免疫応答に重要な役割を果たしている。ウイルス感染によって分泌されたＩＦＮは、近傍のまだウイルス感染を受けていない細胞のＩＦＮ受容体に結合して、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を介して抗ウイルス活性をもつタンパク質の発現誘導を行い、細胞にウイルス抵抗性の性質を誘起する。

【0003】

Ｉ型ＩＦＮによって発現誘導を受けるタンパク質の一つにＭｘタンパク質がある。Ｍｘタンパク質はインフルエンザウイルスや水泡口内炎ウイルス等に抵抗性を示すことが知られており、中でもＭｘ１遺伝子はＩＦＮ誘導性タンパク質としてＲＮＡウイルスの増殖を抑制する遺伝子である（非特許文献１）。
また、Ｉ型ＩＦＮの産生は転写レベルで厳密に制御されており、ここにはＩＲＦファミリー転写因子が必須の役割を果たしている。中でもＩＲＦ３とＩＲＦ７は、ＩＦＮα遺伝子あるいはＩＦＮβ遺伝子の転写誘導に深く関与している（非特許文献２〜４）。
また、ＩＦＩＴ２及びＩＦＩＴ４は、インターフェロン誘発タンパク質として知られているタンパク質である（非特許文献２〜４）。

【0004】

一方、植物由来の抗ウイルス剤としては、カリン抽出物を有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤が知られている（特許文献１〜４）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２０１１／０３６８８３号

【特許文献2】特開２０１２−２２９１７８号公報

【特許文献3】特開２０１３−８７１０１号公報

【特許文献4】特開２０１３−８７１０２号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Trends in Microbiology, March 2015, Vol.23, No.3, p154-163

【非特許文献2】蛋白質・核酸・酵素 Vol.53, No.10, P1231-1238(2008)

【非特許文献3】Immunity 25, p349-360, September 2006

【非特許文献4】Genes and Immunity(2011)12, p399-414

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

前記のようにインターフェロンは、ウイルス感染症に対して優れた治療作用を有し、実際にＣ型肝炎治療薬、Ｂ型肝炎治療薬として広く用いられている。しかし、インターフェロン製剤は、タンパク製剤であるために副作用が発生している。
従って、本発明の課題は、安全性が高い、インターフェロン誘導を介した新たな抗ウイルス剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

そこで、本発明者は、新たなインターフェロン誘発を介した抗ウイルス剤を開発すべく種々検討したところ、前記特許文献１〜４に記載されているようなカリン果実抽出物にはインターフェロン関連遺伝子の発現を増強させる作用がほとんどないにもかかわらず、全く意外にも、カリン種子抽出物がインターフェロン誘発性遺伝子の発現を増強する作用を有し、優れた抗ウイルス剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。

【0009】

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔６〕を提供するものである。

【0010】

〔１〕カリン種子抽出物を有効成分とする抗ウイルス剤。
〔２〕カリン種子抽出物が、カリン種子エタノール抽出物である〔１〕記載の抗ウイルス剤。
〔３〕抗ウイルス剤が、抗ウイルス薬又は抗ウイルス用食品組成物である〔１〕又は〔２〕記載の抗ウイルス剤。
〔４〕カリン種子抽出物を有効成分とする抗ウイルス性遺伝子発現増強剤。
〔５〕カリン種子抽出物が、カリン種子エタノール抽出物である〔４〕記載の抗ウイルス性遺伝子発現増強剤。
〔６〕抗ウイルス性遺伝子発現増強剤が、抗ウイルス性遺伝子発現増強薬又は抗ウイルス性遺伝子発現増強用食品組成物である〔４〕又は〔５〕記載の抗ウイルス性遺伝子発現増強剤。

【発明の効果】

【0011】

本発明の抗ウイルス剤及び抗ウイルス性遺伝子発現増強剤は、インターフェロン誘発に関与する種々の遺伝子の発現を増強させる作用を有し、種々のウイルス感染性疾患の治療薬及び食品組成物として有用である。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】炎症を誘導したＨａＣａＴ細胞に各抽出物で処理を行った際のインターフェロン関連遺伝子の相対発現量を示す。垂線は標準誤差（ｎ＝３）。ＮＣ，対照群；ＰＣ，炎症誘導群；ＣｑＳＥ，カリン種子抽出物固形分溶液（１％（ｗ／ｖ））；ＣｑＦＥ，カリン果肉抽出物固形分溶液（１％（ｗ／ｖ））

【図2】マイクロアレイ解析による遺伝子発現量を示す（マイクロアレイ）（値はＰＣに対する発現量比で示している）。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明の抗ウイルス剤及び抗ウイルス性遺伝子発現増強剤の有効成分は、カリン種子抽出物である。

【0014】

特許文献１〜４には、カリン果実抽出物に抗ウイルス作用があることは記載されているが、カリン種子抽出物に抗ウイルス作用があることは全く記載されていない。また、特許文献１〜４のいずれにも、カリン抽出物がインターフェロン誘発性遺伝子にどのような作用をするのかについても全く記載されていない。

【0015】

カリン（Pseudocydonia sinensis）は、バラ科の落葉高木である。本発明ではカリンの果実ではなく、カリンの種子を使用する。カリンの種子は、カリン果実の中央部に存在する。カリンの種子としては、果実が熟したカリンの種子を用いるのが好ましい。

【0016】

抽出溶媒としては、有機溶媒及び／又は水が挙げられる。有機溶媒としては、アルコール類、アセトン、アセトニトリル等の親水性有機溶媒が好ましく、アルコール類がより好ましい。アルコール類としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、１，３−ブチレングリコール等が挙げられるが、低級アルコールが好ましく、エタノールが特に好ましい。また、エタノール等の親水性有機溶媒は、水と混合して用いることができ、その混合比率（質量比率）は親水性有機溶媒（エタノール等）：水＝５：９５〜９５：５が好ましく、特に３０：７０〜７０：３０がより好ましい。また、水により抽出する場合は室温又は熱水（５０〜１００℃）抽出するのがより好ましい。使用する溶媒の量は、カリン種子の質量の１０〜１００質量倍が好ましい。

【0017】

抽出にあたっては、カリンの種子から溶媒で直接抽出することもできるが、種子の乾燥物を粉砕し、当該粉砕物から抽出するのが好ましい。抽出方法としては、常温又は加温下で行えばよく、浸漬法、ソックスレー抽出器を用いる方法などが挙げられる。抽出後は、抽出物をそのまま用いてもよく、濃縮物、乾燥物として用いてもよい。

【0018】

カリン種子抽出物は、後記実施例に示すように、インターフェロン誘発性Ｍｘタンパク質の遺伝子やインターフェロン誘発性遺伝子であるＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３、ＩＦＩＴ４、ＩＲＦ７等の遺伝子の発現を増強させる作用を有する。一方、カリン果実抽出物には、これらの遺伝子の発現を増強させる作用はほとんどない。
従って、カリン種子抽出物は、抗ウイルス剤、抗ウイルス性遺伝子発現増強剤として有用である。ここで、Ｍｘタンパク質の抗ウイルス作用の対象となるウイルスとしては、種々の肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、水胞性口炎ウイルス、レオウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ノロウイルス、ヘルペスウイルス等が挙げられる。

【0019】

本発明の抗ウイルス剤及び抗ウイルス性遺伝子発現増強剤は、医薬品、医薬部外品、食品組成物、化粧品として使用することができる。また、食品組成物としては、特定保健用食品、機能性食品等が挙げられる。
医薬品、医薬部外品又は食品組成物とする場合には、賦形剤、安定剤、等張剤、崩壊剤、滑沢剤等を添加して、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤等の経口投与用製剤とすることができる。また、医薬品、医薬部外品、化粧品とする場合には、植物油、脂肪酸類、高級アルコール、シリコーン類、界面活性成分、水溶性合成高分子、増粘成分、粉体成分、保湿成分、紫外線吸収剤、紫外線遮蔽物、香料、金属キレート剤、pH調整剤などの公知の成分を含有させて、皮膚外用剤とすることができる。さらには、抗炎症成分、活性酸素消去成分、血行促進成分、美白成分あるいは、その他の公知の添加剤である有効成分を配合することもできる。ここで、皮膚外用剤の形態としては、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤が挙げられる。

【0020】

これらの医薬品、医薬部外品、食品組成物又は化粧品中のカリン種子抽出物の含有量は、０．００１〜８０質量％が好ましく、０．００１〜５０質量％がより好ましい。

【0021】

本発明の抗ウイルス剤、抗ウイルス性遺伝子発現増強剤は、カリン種子抽出物の乾燥固形分量として、０．００１mg〜１００mgを１日１〜数回に分けて投与するのが好ましい。

【実施例】

【0022】

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。

【0023】

実施例１
カリン種子（信州産、毛涯かりん）の乾燥種子５０ｇにエタノール２００ｍＬを加え室温で１週間浸漬抽出した。エタノール５０ｍＬで洗浄しながら濾過した。抽出液をエバポレータでエタノールを除去し、水に転溶後凍結乾燥してカリン種子抽出物の凍結乾燥粉末を得た。
試験に用いる際には、凍結乾燥粉末を１％（ｗ／ｖ）になるようにエタノールに溶解して用いた。

【0024】

比較例１
カリン果実の果肉乾燥物（種子除去）５０ｇを用いて、実施例１と同様にして、カリン果肉抽出物を得た。

【0025】

実施例２
（試験方法）
ヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａＴ細胞）を用いて、以下の条件で試験をおこなった。
（細胞培養および抽出物による処理）
細胞は１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含んだＤＭＥＭ培地１０ｍＬをディッシュに入れ、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内でコンフルエントになるまで培養した。コンフルエントになった細胞は培地を全て吸い取り、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５ｍＬで一度洗浄してトリプシン処理をおこなった。トリプシン処理により細胞をディッシュから剥がし、４℃、１００００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を除き、ペレット化した細胞をＤＭＥＭ培地に溶かし、再度１０ｍＬディッシュに植え付けて継代をおこなった。実験のために継代は２回おこなった。
継代し、コンフルエントとなった細胞は上記と同様の処理を行い、血球計算盤上でペレット化した細胞を溶かしたＤＭＥＭ培地１０μＬ中に含まれる細胞数をカウントし、全体の細胞数を計数した。細胞は２．５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で２４ウェルプレートに植えつけ、ポアサイズ０．２μｍの滅菌シリンジフィルターを通した各抽出物の１％（ｗ／ｖ）ＥｔＯＨ 溶液を添加し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターで２４時間インキュベートした。コントロール区には同量のＥｔＯＨを添加した。２４時間後に、炎症を誘導するためＴＮＦ−αを１０μｇ／ｍＬの濃度で１０μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターで６時間インキュベートした。炎症を誘導しない区には、同量の滅菌水を添加した。６時間インキュベート後培養液を吸い取り、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＴＲＩ ｒｅａｇｅｎｔ試薬１ｍＬを加えピペッティングにより細胞を剥がして回収した。

【0026】

（培養細胞からのＲＮＡ調製）
使用する試薬は全てＲＮＡグレードのものを使用した。細胞が溶解したＴＲＩ ｒｅａｇｅｎｔ試薬を５分間室温におき、２００μＬのクロロホルムを加えて１５秒間手で激しくシェイクした。その後３分間室温に静置し、４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を４００〜５００μＬ回収した。回収した上清にイソプロピルアルコール５００μＬを加えて１５秒間手で激しくシェイクし、１０分間室温で静置し、４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心した。イソプロピルアルコールを除いた後に７５％ＥｔＯＨ／ＤＥＰＣ水を１ｍＬ加え、４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、ピペットを用いて上清を完全に取り除いた。細胞のペレットは３０μＬのＤＥＰＣ水に沈殿が見えなくなるまで溶解した。細胞懸濁液３０μＬのうち５μＬを用いてＲＮＡ量を測定し、その残りでｃＤＮＡの合成をおこなった。
ＲＮＡ量の測定は、分光光度計(GE healthcare Ultrospec 3300 pro)による吸光度測定によっておこなった。細胞懸濁液５μＬにＤＰＥＣ水９５μＬを加え、２０倍希釈された１００μＬの測定用希釈サンプルを調製し、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を測定し、懸濁液中のＲＮＡ濃度を算出した。ゼロ合わせはＤＰＥＣ水１００μＬによっておこなった。算出された濃度をもとに、吸光度測定に使用した細胞懸濁液の残りにＤＰＥＣ水を加え、ＲＮＡサンプルが１μｇとなるように調製した。

【0027】

（ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成）
ＰＣＲチューブにＲＮＡサンプル＋ＤＰＥＣ水５．５μＬと、１０μＭオリゴｄＴ１８プライマー０．５μＬ をそれぞれ分注して遠心でＭｉｘし、サーマルサイクラ―にセットして６５℃で５分間加熱した。サンプルは一旦取り出して氷上で急冷し、軽く遠心した。別のエッペンチューブ１本に、１サンプルあたり５×Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｂｕｆｆｅｒ ２．０μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ １．０μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ０．５μＬを氷冷しながら加え、遠心により混合した。ピペット操作によるロスを考慮し、サンプル数＋１本分調製した。その後、サンプル数＋１本分の逆転写酵素０．５μＬ（２００Ｕ／Ｌ）を加え、サーマルサイクラ―で加温したチューブに４μＬずつ分注し、遠心でＭｉｘした。チューブは再びサーマルサイクラ―にセットし、４２℃で５０分、７５℃で１５分加熱してＲＴ反応をおこなった。プログラムが終了し、１５℃の保温状態でサンプルを取り出した。

【0028】

（ＲＴ−ＰＣＲ解析）
ＰＣＲ解析は、Ｅｃｏ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムにより行った。ＲＴ反応により調製したｃＤＮＡテンプレートをＰＣＲ用精製水で２０倍希釈したものを調製した。エッペンチューブに、１反応あたり滅菌蒸留水を２．２μＬ、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ プライマー（１０μＬ）を０．４μＬ、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ プライマー（１０μＬ）を０．４μＬ、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ IIを５μＬ加え、ＰＣＲマスターミックスを調製した。プライマーはＧＡＰＤＨ、ＴＡＲＣ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２ ｐ３５（ＩＬ−１２Ａ、ＮＫＳＦ１）、ＩＬ−１２ ｐ４０（ＩＬ−１２Ｂ、ＮＫＳＦ２）、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ７（ＩＲＦ７）、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＸ１、ＭｘＡ）、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４４（ＩＦＩ４４）、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ ２（ＩＦＩＴ２）、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ３（ＩＦＩＴＭ３）についてのものを使用した。また、１つのターゲットの反応あたり３点設定した。マスターミックスは各ターゲットごとに必要量＋１反応分程度調製した。専用の４８ウェル反応プレートにターゲットの配置を決め、区画ごとに３点分のマスターミックス８μＬとｃＤＮＡテンプレート２．０μＬを分注した。プレートはシーラーで完全にシールし、卓上プレート遠心にかけ、サンプルをウェルの底に落とした。Ｅｃｏ ソフトウェアを起動し、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｏｐｔｉｏｎ（Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｙｅ）、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌ（ＤＮＡ）、Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｔｅｒｉａｌ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を選択し、サーマルプロファイルの入力でＰＣＲ Ｃｙｃｌｅの項目を設定した。プレートレイアウトでサンプルを配置した通りに測定項目とサンプル項目の両方を入力した。測定項目のＧＡＰＤＨはＲｅｆｅｒｅｎｃｅ指定とした。機器にシーラーでシールした４８ウェル反応プレートを設置し、リッドをしっかりと閉め、Ｒｕｎボタンにより反応をスタートさせた。各遺伝子の発現量は、ＧＡＰＤＨに対する相対発現量で表した。

【0029】

結果を図１に示す。図１より、カリン果肉抽出物に比べて、カリン種子抽出物は、Ｍｘ１、ＩＲＦ７、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３及びＩＦＩＴ４遺伝子の発現量を顕著に増強することがわかる。

【0030】

実施例３
（試験方法）
Ｉｎ ｖｉｖｏ系における活性試験を、Ｎｃ／Ｎｇａマウスを用いて次のように実施した。
（抽出液の塗布処理）
Ｎｃ／Ｎｇａマウスをコントロール群、対照群、マルメロ種子抽出溶液で処理した試験群、カリン種子抽出溶液で処理した試験群の４つの群に各２匹ずつ振り分け、個別飼いで２週間の塗布試験を行った。皮膚炎誘導は上記の操作を行い、２週目の塗布試験時に、ビオスタＡＤを塗る直前に対照群にはＥｔＯＨ １００μＬ、試験群には各試料をそれぞれ１００μＬ均一に塗布した。塗布試験終了後の翌日にマウスの皮膚を約５ｍｍ平方の大きさに切り取り、すぐに１ｍＬのＴＲＩ ｒｅａｇｅｎｔに浸して細断し、細胞を溶解させた。その後、ＲＮＡ抽出を行うまで−８０℃で保存した。

【0031】

（皮膚組織からのＲＮＡ調製）
使用する試薬は全てＲＮＡグレードのものを使用した。細胞が溶解したＴＲＩ ｒｅａｇｅｎｔ試薬を５分間室温におき、２００μＬのクロロホルムを加えて１５秒間手で激しくシェイクした。その後３分間室温に静置し、４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を４００〜５００μＬ回収した。回収した上清にイソプロピルアルコール５００μＬを加えて１５秒間手で激しくシェイクし、１０分間室温で静置し、４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心した。イソプロピルアルコールを除いた後に７５％ＥｔＯＨ／ＤＥＰＣ水を１ｍＬ加え、４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、ピペットを用いて上清を完全に取り除いた。細胞のペレットは３０μＬのＤＥＰＣ水に沈殿が見えなくなるまで溶解した。細胞懸濁液３０μＬのうち５μＬを用いてＲＮＡ量を測定し、その残りでｃＤＮＡの合成をおこなった。
ＲＮＡ量の測定は、分光光度計（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３３００ ｐｒｏ）による吸光度測定によっておこなった。細胞懸濁液５μＬにＤＰＥＣ水９５μＬを加え、２０倍希釈された１００μＬの測定用希釈サンプルを調製し、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を測定し、懸濁液中のＲＮＡ濃度を算出した。ゼロ合わせはＤＰＥＣ水１００μＬによっておこなった。算出された濃度をもとに、吸光度測定に使用した細胞懸濁液の残りにＤＰＥＣ水を加え、ＲＮＡサンプルが１μｇとなるように調製した。

【0032】

調製したＲＮＡサンプルを、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｒｅ^TM Ｃｌｅａｎｕｐを用いてマイクロアレイ解析用ＲＮＡに精製した。まず、ＲＮＡサンプルを１００μＬのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒに溶解し、３５０μＬのＲＬＴバッファーを加えた。その後，２５０μＬのエタノールを加え、ピペッティングでよく混合した。次に、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ（２ｍＬ）にＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎをセットし、５００μＬのエタノール添加ＲＰＥバッファーを分注して蓋をし、１００００ｒｐｍで１５秒間遠心した。ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを新しいＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ（２ｍＬ）にセットし、再度５００μＬのエタノール添加ＲＰＥバッファーを分注して蓋をし、１００００ｒｐｍで１５秒間遠心した。洗浄後のエタノール添加ＲＰＥバッファーは廃棄した。同様の作業を８０％エタノールに変更して行い、１００００ｒｐｍで２分間遠心した。その後、再度ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを新しいＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ（２ｍＬ）にセットして１５０００ｒｐｍで５分間遠心を行い、エタノールを完全に除去した。最後に、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを新しいＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ（１．５ｍＬ）にセットし、１６μＬのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒをｓｐｉｎ ｃｏｌｉｍｎのメンブレンの中央部に分注して蓋をし、１５０００ｒｐｍで１分間遠心を行った。精製されたＲＮＡ懸濁液から１μＬを用いてＲＮＡ濃度の測定を行った。ＲＮＡ懸濁液は９９μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで１００倍に希釈した後，分光光度計（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３３００ ｐｒｏ）による吸光度測定をおこなった。２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を測定し、懸濁液中のＲＮＡ濃度を算出した。精製されたＲＮＡ懸濁液が入った１．５ｍＬチューブをパラフィルムで密閉し、三菱レイヨン株式会社に解析を委託した。

【0033】

結果を図２に示す。図２より、カリン種子抽出物は、Ｍｘ１、ＩＲＦ７、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３及びＩＦＩＴ４遺伝子の発現量を顕著に増強することが判明した。

【要約】

【課題】新たな抗ウイルス剤の提供。
【解決手段】カリン種子抽出物を有効成分とする抗ウイルス剤。
【選択図】なし

【図1】

【図2】