特許 6494515 幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させる方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6494515

(24)【登録日】2019年3月15日

(45)【発行日】2019年4月3日

(54)【発明の名称】幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させる方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/07 20100101AFI20190325BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20190325BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20190325BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20190325BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/07

   C12N5/0735

   C12N5/10

   !C12N15/12ZNA

【請求項の数】37

【全頁数】97

(21)【出願番号】特願2015-537668(P2015-537668)

(86)(22)【出願日】2013年10月21日

(65)【公表番号】特表2015-534805(P2015-534805A)

(43)【公表日】2015年12月7日

(86)【国際出願番号】SG2013000453

(87)【国際公開番号】WO2014062138

(87)【国際公開日】20140424

【審査請求日】2016年10月17日

(31)【優先権主張番号】201207832-5

(32)【優先日】2012年10月19日

(33)【優先権主張国】SG

(73)【特許権者】

【識別番号】508305029

【氏名又は名称】エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100102255

【弁理士】

【氏名又は名称】小澤 誠次

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100188352

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 一弘

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100198074

【弁理士】

【氏名又は名称】山村 昭裕

(72)【発明者】

【氏名】アン レイ テン

(72)【発明者】

【氏名】ロー カイル エム．

(72)【発明者】

【氏名】リム ビン

【審査官】 伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／１３９６２８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／１４３１９３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／００９４３８１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２００８−５４６４１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０１９０９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Journal of Cellular Biochemistry，2011, Vol.112, pp.1022-1034

【文献】 Proceedings of the National Academy of Sciences of USA，2006, Vol.103, No.45, pp.16806-16811

【文献】 Stem Cells，2007, Vol.25, pp.29-38

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

多能性幹細胞を胚体内胚葉（ＤＥ）系列の細胞に分化させる、インビトロでの方法であって、
ｉ)前記多能性幹細胞を、
ａ．ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングの１又は２以上のアクチベーター；
ｂ．Ｗｎｔシグナリングの１又は２以上のアクチベーター；及び
ｃ．ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリングの１又は２以上のインヒビター
と接触させて、原始線条前部（ＡＰＳ）系列の細胞を産生するステップであって、前記ＡＰＳ系列の細胞が、前記多能性幹細胞から２４時間以内に産生されるステップと、
ii)前記ＡＰＳ系列の細胞を、
ａ．ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングの１又は２以上のアクチベーター；及び
ｂ．ＢＭＰシグナリングの１若しくは２以上のインヒビター
と接触させて、ＤＥ系列の細胞を産生するステップであって、前記ＤＥ系列の細胞が、前記ＡＰＳ系列の細胞から４８時間以内に産生されるステップと
を含む、前記方法。

【請求項2】

ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングの１又は２以上のアクチベーターが、アクチビンＡ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＮｏｄａｌからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＢＭＰシグナリングの１又は２以上のインヒビターが、ＤＭ３１８９／ＬＤＮ−１９３１８９、ノギン、コーディン、ドルソモルフィン及びＤＭＨ１からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

ステップ（ii）のＡＰＳ系列の細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び２５０ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９と接触させる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

ステップ（ii）のＡＰＳ系列の細胞を、１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び１ｎＭ〜１００ｍＭのＬＤＮ−１９３１８９と接触させる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

ＤＥ系列の細胞が、未分化細胞と比較して内胚葉遺伝子発現の上昇及び多能性遺伝子発現の低下を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

ＤＥ系列の細胞が、有意に低下した中胚葉遺伝子発現を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

Ｗｎｔシグナリングの１又は２以上のアクチベーターがＣＨＩＲ９９２０１又はＷｎｔ３ａである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリングの１又は２以上のインヒビターがＰＩ−１０３、ＰＩＫ−９０、ＧＤＣ０９４１、又はＬＹ２９４００２である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリングの１又は２以上のインヒビターがＰＩ−１０３である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

ステップ（ｉ）の多能性幹細胞を、アクチビンＡ、ＰＩ−１０３及びＣＨＩＲ９９２０１と接触させる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

多能性幹細胞を、１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌのアクチビンＡ、１ｎＭ〜１００ｍＭのＰＩ−１０３及び１ｎＭ〜１００ｍＭのＣＨＩＲ９９２０１と接触させる、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

多能性幹細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、５０ｎＭのＰＩ−１０３及び２μＭのＣＨＩＲ９９２０１と接触させる、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

ＡＰＳ系列の細胞が、未分化細胞と比較して、線条前部又は全線条マーカーであるＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＦＯＸＡ２、ＧＳＣ、ＦＺＤ８、ＨＨＥＸ、ＬＨＸ１及びＥＯＭＥＳの１又は２以上の遺伝子発現の上昇、並びに、線条後部マーカーであるＭＥＳＰ１及びＥＶＸ１の１又は２の発現の低下を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

多能性幹細胞のＡＰＳ系列の細胞への分化が、２４時間以内に完了する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

ＤＥ系列の細胞を、レチノイン酸、ＢＭＰインヒビター、Ｗｎｔインヒビター及びＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビターと接触させることにより、前記ＤＥ系列の細胞を前腸後部（ＰＦＧ）の細胞に分化させることをさらに含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

ＤＥ系列の細胞を、１ｎＭ〜１００ｍＭのレチノイン酸、１ｎＭ〜１００ｍＭのＬＤＮ１９３１８９、１ｎＭ〜１００ｍＭのＩＷＰ２及び１ｎＭ〜１００ｍＭのＰＤ０３２５９０１と接触させる、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

ＤＥ系列の細胞を、２μＭのレチノイン酸、２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９、４μＭのＩＷＰ２及び０．５μＭのＰＤ０３２５９０１と接触させる、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

ＰＦＧの細胞が、未分化の細胞と比較して、中腸／後腸（ＭＨＧ）遺伝子であるＣＤＸ２、ＥＶＸ１及び５‘ＨＯＸの１又は２以上；又は前腸前部（ＡＦＧ）遺伝子であるＯＴＸ２、ＩＲＸ３、ＴＢＸ１、ＰＡＸ９、及びＳＯＸ２の１又は２以上；のいずれかの発現レベルの上昇を含まず、前腸後部（ＰＦＧ）遺伝子であるＳＯＸ２、ＯＤＤ１、ＰＤＸ１、ＨＮＦ１β、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ６、及びＨＯＸＡ１の１又は２以上の発現レベルの上昇を含む、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。

【請求項20】

ＤＥ系列の細胞を、ＢＭＰアクチベーター、Ｗｎｔアクチベーター及びＦＧＦアクチベーターと接触させることにより、前記ＤＥ系列の細胞を中腸／後腸（ＭＨＧ）の細胞に分化させることをさらに含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。

【請求項21】

ＤＥ系列の細胞を、１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌのＢＭＰ４、１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌのＦＧＦ２、及び１ｎＭ〜１００μＭのＣＨＩＲ９９２０１と接触させる、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

ＤＥ系列の細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、及び３μＭのＣＨＩＲ９９２０１と接触させる、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

ＭＨＧの細胞が、未分化の細胞と比較して、ＭＨＧ遺伝子であるＣＤＸ２、ＥＶＸ１及び５’ＨＯＸの１又は２以上の発現レベルの上昇を含む、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

ＰＦＧを、
ａ）１又は２以上のＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビター；
ｂ）１又は２以上のＢＭＰインヒビター；及び
ｃ）レチノイン酸（ＲＡ）
と接触させることにより、ＤＥ系列の細胞を膵臓前駆体に３日以内に誘導することをさらに含む、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。

【請求項25】

ＰＦＧを１又は２以上のヘッジホッグインヒビターと接触させることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

ＰＦＧを１又は２以上のＷｎｔインヒビターと接触させることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

ＰＦＧをアクチビンＡと接触させることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項28】

ＰＦＧを１又は２以上のヘッジホッグインヒビター；１又は２以上のＷＮＴインヒビター及びアクチビンＡと接触させることをさらに含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

ＰＦＧを、１ｎＭ〜１００ｍＭのＰＤ０３２５９０１又はＰＤ１７３０７４、１ｎＭ〜１００ｍＭのＳＡＮＴ１、１ｎＭ〜１００ｍＭのＬＤＮ１９３１８９、１ｎＭ〜１００ｍＭのＩＷＰ２又はＣ５９、１ｎＭ〜１００ｍＭのレチノイン酸及び１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌのアクチビンＡと接触させる、請求項２４に記載の方法。

【請求項30】

ＰＦＧを、０．５μＭのＰＤ０３２５９０１又は１００ｎＭのＰＤ１７３０７４、１５０ｎＭのＳＡＮＴ１、２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９、４μＭのＩＷＰ２、２μＭのレチノイン酸及び１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと接触させる、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

膵臓前駆体の細胞が、未分化の細胞と比較して、膵臓遺伝子であるＰＤＸ１の発現レベルの上昇を含み、肝臓前駆体遺伝子であるＡＦＰ及びＨＮＦ４Ａの発現を含まない、請求項２４〜３０のいずれかに記載の方法。

【請求項32】

ＰＦＧを１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌのＦＧＦ２と接触させることをさらに含む、請求項２４〜３１のいずれかに記載の方法。

【請求項33】

ＰＦＧを１０〜２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２と接触させることをさらに含む、請求項２４〜３１のいずれかに記載の方法。

【請求項34】

ＰＦＧを、
ａ）１又は２以上のＴＧＦβインヒビター；
ｂ）レチノイン酸（ＲＡ）；
ｃ）１又は２以上のＢＭＰアクチベーター、及び
ｄ）１又は２以上のＷｎｔインヒビター
と接触させることにより、ＤＥ系列の細胞を前記ＰＦＧの肝臓前駆体に４日以内に誘導することをさらに含む、請求項１６〜１９のいずれに記載の方法。

【請求項35】

ＰＦＧを、１ｎＭ〜１００ｍＭのＡ８３−０１、１ｎＭ〜１００ｍＭのＲＡ、１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのＢＭＰ４、及び１ｎＭ〜１００ｍＭのＩＷＰ２又はＣ５９と接触させる、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

ＰＦＧを、１μＭのＡ８３−０１、２μＭのＲＡ、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、及び４μＭのＩＷＰ２と接触させる、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

肝臓前駆体の細胞が、未分化の細胞と比較して、肝臓遺伝子であるＡＦＰ及びＨＮＦ４Ａのいずれか１又は２の発現レベルの上昇を含み、膵臓前駆体遺伝子であるＰＤＸ１の発現を含まない、請求項３４〜３６のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１０月１９日に出願された、シンガポール国特許出願第２０１２０７８３２−５号明細書の優先権の利益を主張し、その内容はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組込まれる。

【0002】

本発明は、一般にバイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、多能性幹細胞又は多能性細胞を複数の細胞系列に分化させるための方法に関する。本発明はさらに、本明細書に記載の方法の実施における使用のための培養培地及びキットに関する。

【背景技術】

【0003】

複数の発生岐路で、系列特定転写因子（ＴＦ、transcription factor）は、多能性前駆体（progenitor）を単一の系列結果に向かわせ、別の運命を抑制し、片側性の系列決定を確保する（Graf, T., and Enver, T. (2009). Forcing cells to change lineages. Nature 462, 587-594、Loh, K.M., and Lim, B. (2011). A precarious balance: pluripotency factors as lineage specifiers. Cell Stem Cell 8, 363-369.）。しかしながら、そのような系列分岐を支配する外部シグナル及びそれらが特定する正確な細胞型は、インビボでの遺伝的摂動（Schier, A.F., and Talbot, W.S. (2005). Molecular genetics of axis formation in zebrafish. Annu Rev Genet 39, 561-613、Tam, P.P.L., and Loebel, D.A.F. (2007). Gene function in mouse embryogenesis: get set for gastrulation. Nature Reviews Genetics 8, 368-381）及びエクスビボでの外植片手法（例えば、（Bernardo, A.S., Faial, T., Gardner, L., Niakan, K.K., Ortmann, D., Senner, C.E., Callery, E.M., Trotter, M.W., Hemberger, M., Smith, J.C., et al. (2011). BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell Stem Cell 9, 144-155、Deutsch, G., Jung, J., Zheng, M., Lora, J., and Zaret, K.S. (2001). A bipotential precursor population for pancreas and liver within the embryonic endoderm. Development 128, 871-881））から獲得された情報的洞察にも拘らず、まだ完全には解明されていない。関連する問題は、連続的な細胞運命移行を駆動する動的シグナリングスイッチの順序及びタイミング（Wandzioch, E., and Zaret, K.S. (2009). Dynamic signaling network for the specification of embryonic pancreas and liver progenitors. Science 324, 1707-1710）並びに別の系列がどのように各分岐点で分離するかを含む。従って、初期の系列分岐を統轄するシグナルの知識は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ、human pluripotent stem cell）などの多能性幹細胞を、細胞補充療法のための運命付けられた細胞型に分化させる際に非常に有益である（Cohen, D.E., and Melton, D. (2011). Turning straw into gold: directing cell fate for regenerative medicine. Nature Reviews Genetics、McKnight, K., Wang, P., and Kim, S.K. (2010). Deconstructing pancreas development to reconstruct human islets from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 6, 300-308、Murry, C.E., and Keller, G. (2008). Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell 132, 661-680、Smith, A.G. (2001). Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol 17, 435-462）。

【0004】

これに関して、胚体内胚葉（ＤＥ、definitive endoderm）の胚葉の誘導及び前後パターン化並びにその後の器官形成を駆動するシグナリング動力学をさらに精査する必要がある。ＤＥは甲状腺、肺、膵臓、肝臓及び腸などの器官の胚前駆体である（Svajger, A., and Levak-Svajger, B. (1974). Regional developmental capacities of the rat embryonic endoderm at the head-fold stage. J Embryol Exp Morphol 32, 461-467）。多能性胚盤葉上層（マウス胚形成におけるＥ５．５）は、原始線条前部（約Ｅ６．５）に分化し、ＤＥを生成する（約Ｅ７．０〜Ｅ７．５）（Lawson, K.A., Meneses, J.J., and Pedersen, R.A. (1991). Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Development 113, 891-911、Tam, P.P., and Beddington, R.S. (1987). The formation of mesodermal tissues in the mouse embryo during gastrulation and early organogenesis. Development 99, 109-126）。次いで、ＤＥは前後軸に沿って異なる前腸、中腸、及び後腸テリトリー（約Ｅ８．５）にパターン化され、内胚葉器官原基が特定の前後ドメイン（約Ｅ９．５）から生じる（Zorn, A.M., and Wells, J.M. (2009). Vertebrate endoderm development and organ formation. Annu Rev Cell Dev Biol 25, 221-251）。

【0005】

ｈＰＳＣなどの多能性幹細胞を、ＤＥに向かって分化させる様々な方法は、動物血清、フィーダー共培養又は規定の条件を用いる（Cheng, X., Ying, L., Lu, L., Galvao, A.M., Mills, J.A., Lin, H.C., Kotton, D.N., Shen, S.S., Nostro, M.C., Choi, J.K., et al. (2012). Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 10, 371-384、D'Amour, K.A., Agulnick, A.D., Eliazer, S., Kelly, O.G., Kroon, E., and Baetge, E.E. (2005). Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol 23, 1534-1541、Touboul, T., Hannan, N.R.F., Corbineau, S., Martinez, A., Martinet, C., Branchereau, S., Mainot, S., Strick-Marchand, H., Pedersen, R., Di Santo, J., et al. (2010). Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology 51, 1754-1765）が、典型的には、ＤＥと他の夾雑系列との混合物が得られ、その誘導効率は細胞株間で変動する（Cohen, D.E., and Melton, D. (2011). Turning straw into gold: directing cell fate for regenerative medicine. Nature Reviews Genetics、McKnight, K., Wang, P., and Kim, S.K. (2010). Deconstructing pancreas development to reconstruct human islets from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 6, 300-308、Smith, A.G. (2001). Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol 17, 435-462）。夾雑系列を担持する混合された初期ＤＥ集団は、内胚葉器官誘導体のその後の生成を複雑にする（McKnight, K., Wang, P., and Kim, S.K. (2010). Deconstructing pancreas development to reconstruct human islets from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 6, 300-308）。脊椎動物の胚において、及びＰＳＣ分化の間に、Ｎｏｄａｌ／ＴＧＦβ／アクチビンシグナリングはＤＥ特定にとって必須であるが、ＢＭＰは中胚葉サブタイプを広く誘導する（例えば、（Bernardo, A.S., Faial, T., Gardner, L., Niakan, K.K., Ortmann, D., Senner, C.E., Callery, E.M., Trotter, M.W., Hemberger, M., Smith, J.C., et al. (2011). BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell Stem Cell 9, 144-155、D'Amour, K.A., Agulnick, A.D., Eliazer, S., Kelly, O.G., Kroon, E., and Baetge, E.E. (2005). Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol 23, 1534-1541、Dunn, N.R., Vincent, S.D., Oxburgh, L., Robertson, E.J., and Bikoff, E.K. (2004). Combinatorial activities of Smad2 and Smad3 regulate mesoderm formation and patterning in the mouse embryo. Development 131, 1717-1728））。しかし、ＴＧＦβシグナリング（さらなる因子と一緒であっても）は、均質なＤＥ（（Chetty, S., Pagliuca, F.W., Honore, C., Kweudjeu, A., Rezania, A., and Melton, D.A. (2013). A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods）によって定量される）を特定するには不十分である。ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＷｎｔもまた、ＤＥを生成するためにＴＧＦβシグナルと一緒に用いられてきた（Cheng, X., Ying, L., Lu, L., Galvao, A.M., Mills, J.A., Lin, H.C., Kotton, D.N., Shen, S.S., Nostro, M.C., Choi, J.K., et al. (2012). Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 10, 371-384、Goldman, O., Han, S., Sourrisseau, M., Dziedzic, N., Hamou, W., Corneo, B., D’souza, S., Sato, T., Kotton, Darrell N., Bissig, K.-D., et al. (2013). KDR Identifies a Conserved Human and Murine Hepatic Progenitor and Instructs Early Liver Development. Cell Stem Cell 12, 748-760、Green, M.D., Chen, A., Nostro, M.-C., D'Souza, S.L., Schaniel, C., Lemischka, I.R., Gouon-Evans, V., Keller, G., and Snoeck, H.-W. (2011). Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol、Kroon, E., Martinson, L.A., Kadoya, K., Bang, A.G., Kelly, O.G., Eliazer, S., Young, H., Richardson, M., Smart, N.G., Cunningham, J., et al. (2008). Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol 26, 443-452、Nostro, M.C., Sarangi, F., Ogawa, S., Holtzinger, A., Corneo, B., Li, X., Micallef, S.J., Park, I.-H., Basford, C., Wheeler, M.B., et al. (2011). Stage-specific signaling through TGFβ family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development 138, 861-871、Touboul, T., Hannan, N.R.F., Corbineau, S., Martinez, A., Martinet, C., Branchereau, S., Mainot, S., Strick-Marchand, H., Pedersen, R., Di Santo, J., et al. (2010). Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology 51, 1754-1765）。しかしながら、これらのモルフォゲンもまた中胚葉の運命付けに関与し（Davis, R.P., Ng, E.S., Costa, M., Mossman, A.K., Sourris, K., Elefanty, A.G., and Stanley, E.G. (2008). Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood 111, 1876-1884、Gertow, K., Hirst, C.E., Yu, Q.C., Ng, E.S., Pereira, L.A., Davis, R.P., Stanley, E.G., and Elefanty, A.G. (2013). WNT3A Promotes Hematopoietic or Mesenchymal Differentiation from hESCs Depending on the Time of Exposure. Stem Cell Reports 1, 53-65）、ＤＥ誘導におけるその正確な関与はまだ解明されていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Graf, T., and Enver, T. (2009). Forcing cells to change lineages. Nature 462, 587-594

【非特許文献2】Loh, K.M., and Lim, B. (2011). A precarious balance: pluripotency factors as lineage specifiers. Cell Stem Cell 8, 363-369.

【非特許文献3】Schier, A.F., and Talbot, W.S. (2005). Molecular genetics of axis formation in zebrafish. Annu Rev Genet 39, 561-613

【非特許文献4】Tam, P.P.L., and Loebel, D.A.F. (2007). Gene function in mouse embryogenesis: get set for gastrulation. Nature Reviews Genetics 8, 368-381

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【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

胚葉の誘導及びパターン化並びに様々な細胞系列への分化の複数のステップの基礎となるシグナリング論理の理路整然とした理解は現在ない。

【0008】

本発明の目的は、無関係の系列を最小にしながら幹細胞を単一の細胞運命に一方的に駆動するための幹細胞の誘導及び分化の基礎となるシグナリング論理を解明することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

一態様によれば、幹細胞をＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングの１又は２以上のアクチベーター及びＷｎｔシグナリングの１又は２以上のアクチベーターと接触させることを含む、前記細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させる方法が提供される。

【0010】

別の態様によれば、原始線条前部系列の細胞を、ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングの１若しくは２以上のアクチベーター、及びＢＭＰシグナリングの１若しくは２以上のインヒビター、又はＷｎｔシグナリングの１若しくは２以上のインヒビターと接触させることにより、原始線条前部細胞を胚体内胚葉（ＤＥ）系列の細胞に分化させる方法が提供される。

【0011】

別の態様によれば、ＤＥ細胞をＴＧＦβインヒビター及びＢＭＰインヒビターと接触させることにより、ＤＥの細胞（cells of the DE）をＡＦＧの細胞に分化させる方法が提供される。

【0012】

別の態様によれば、ＤＥの細胞をレチノイン酸、ＢＭＰインヒビター、Ｗｎｔインヒビター及びＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビターと接触させることにより、ＤＥ系列の細胞をＰＦＧの細胞に分化させる方法が提供される。

【0013】

別の態様によれば、ＤＥ細胞（DE cells）をＢＭＰアクチベーター、Ｗｎｔアクチベーター及びＦＧＦアクチベーターと接触させることにより、ＤＥ系列の細胞（cells of the DE lineage）をＭＨＧの細胞に分化させる方法が提供される。

【0014】

別の態様によれば、ＰＦＧを、１又は２以上のＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビター；１又は２以上のＢＭＰインヒビター；及びレチノイン酸（ＲＡ、retinoic acid）と接触させることにより、３日以内のＤＥからＰＦＧの膵臓前駆体を誘導する方法が提供される。

【0015】

別の態様によれば、ＰＦＧを、１又は２以上のＴＧＦβインヒビター；１又は２以上のＢＭＰアクチベーター、レチノイン酸及び１又は２以上のＷｎｔインヒビターと接触させることにより、４日以内のＤＥからＰＦＧの肝臓前駆体を誘導する方法が提供される。

【0016】

別の態様によれば、１又は２以上の下記因子：１又は２以上のＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビター；１又は２以上のヘッジホッグインヒビター；１又は２以上のＢＭＰインヒビター、１又は２以上のＷｎｔインヒビター、レチノイン酸、アクチビンＡ、及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリングの１又は２以上のインヒビターを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地が提供される。

【0017】

別の態様によれば、１又は２以上の下記因子：ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングの１又は２以上のアクチベーター、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングの１又は２以上のアクチベーター、及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリングの１又は２以上のインヒビターを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地が提供される。

【0018】

別の態様によれば、１又は２以上の下記因子：ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングの１又は２以上のアクチベーター、及びＢＭＰシグナリングの１又は２以上のインヒビターを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地が提供される。

【0019】

別の態様によれば、ＴＧＦβインヒビター及びＢＭＰインヒビターを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地が提供される。

【0020】

別の態様によれば、１又は２以上の下記因子：レチノイン酸、ＢＭＰインヒビター、Ｗｎｔインヒビター及びＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビターを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地が提供される。

【0021】

別の態様によれば、１又は２以上の下記因子：ＢＭＰ４、Ｗｎｔアクチベーター及びＦＧＦアクチベーターを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地が提供される。

【0022】

別の態様によれば、１又は２以上の下記因子：１又は２以上のＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビター；１又は２以上のヘッジホッグインヒビター；１又は２以上のＢＭＰインヒビター；１又は２以上のＷＮＴインヒビター；レチノイン酸（ＲＡ）、及びアクチビンＡを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地が提供される。

【0023】

別の態様によれば、１又は２以上の下記因子：１又は２以上のＴＧＦβインヒビター；１又は２以上のＢＭＰアクチベーター、及び１又は２以上のＷｎｔインヒビターを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地が提供される。

【0024】

別の態様によれば、本明細書に記載の方法のいずれかに従って産生される細胞が提供される。

【0025】

別の態様によれば、本明細書に記載の細胞培養培地の１又は２以上の容器を使用説明書と一緒に含む、本明細書に記載の方法のいずれかにおける使用のためのキットが提供される。

【発明を実施するための形態】

【0026】

定義
本明細書で用いられる以下の単語及び用語は、示される意味を有する。

【0027】

本明細書で用いられる用語「幹細胞」は、限定されるものではないが、単一細胞レベルで、子孫細胞を産生するために自己複製する能力と、分化する能力との両方により定義される未分化の細胞、例えば、自己複製する前駆体、複製しない前駆体、及び最終的に分化した細胞を含む。例えば、「幹細胞」は、（１）全能性幹細胞；（２）多能性幹細胞；（３）多分化能幹細胞；（４）少能性幹細胞；及び（５）単能性幹細胞を含んでもよい。

【0028】

本明細書で用いられる用語「全能性」とは、成体における全ての細胞並びに胚外組織、例えば、胎盤を作る発生能力を有する細胞を指す。受精卵（接合体）は、桑実胚（受精後の１６細胞段階まで）の細胞（割球）であるため、全能性である。

【0029】

本明細書で用いられる用語「多能性幹細胞」とは、異なる条件下で、３つ全ての胚葉、すなわち、内胚葉（例えば、腸組織）、中胚葉（血液、筋肉、及び血管を含む）、並びに外胚葉（皮膚及び神経など）に特徴的な細胞型に分化する発生能力を有する細胞を指す。３つ全ての胚葉に分化する細胞の発生能力を、例えば、ヌードマウス奇形腫形成アッセイを用いて決定することができる。いくつかの実施形態においては、多能性を、胚性幹（ＥＳ、embryonic stem）細胞マーカーの発現により証明することもできるが、本明細書に記載の組成物及び方法を用いて生成される細胞又は細胞集団の多能性に関する好ましい試験は、細胞が３つの胚葉のそれぞれの細胞に分化する発生能力を有することの証明である。

【0030】

本明細書で用いられる用語「誘導多能性幹細胞」又はｉＰＳＣは、幹細胞が、３つ全ての胚葉又は皮層：中胚葉、内胚葉、及び外胚葉の組織に分化することができる細胞に誘導又は変化された、すなわち、再プログラミングされた分化した成体細胞から産生されることを意味する。産生されるｉＰＳＣは、それらが天然に見出される細胞を指さない。

【0031】

本明細書で用いられる用語「胚性幹細胞」とは、胚性胚盤胞の内部細胞集団の天然の多能性幹細胞を指す。同様に、そのような細胞を、体細胞核移植から誘導される胚盤胞の内部細胞集団から取得することができる。胚性幹細胞は多能性であり、発生中に３つの一次胚葉：外胚葉、内胚葉及び中胚葉の全ての誘導体を生じさせる。換言すれば、それらは特定の細胞型のための必要十分な刺激を与えた場合、成体の２００を超える細胞型のそれぞれに発生することができる。それらは胚体外膜又は胎盤に寄与しない、すなわち、全能性ではない。

【0032】

本明細書で用いられる用語「多分化能幹細胞」とは、１又は２以上の胚葉の細胞に分化する発生能力を有するが、３つ全ての胚葉の細胞に分化する発生能力を有さない細胞を指す。かくして、多分化能細胞を「部分的に分化した細胞」と呼ぶこともできる。多分化能細胞は当業界で周知であり、多分化能細胞の例としては、例えば、造血幹細胞及び神経幹細胞などの成体幹細胞が挙げられる。「多分化能」は、細胞が所与の系列の多くの細胞型を形成し得るが、他の系列の細胞を形成しないことを示す。例えば、多分化能造血細胞は、多くの異なる型の血液細胞（赤血球、白血球、血小板など）を形成することができるが、ニューロンを形成することはできない。従って、用語「多分化能性」とは、全能性及び多能性未満である一定程度の発生能力を有する細胞の状態を指す。

【0033】

本明細書で用いられる用語「分化」は、特殊化されていない（「運命付けられていない」）又はあまり特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋肉細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した細胞又は分化誘導された細胞は、細胞の系列内のより特殊化された（「運命付けられた」）位置を獲得したものである。用語「運命付けられた」は、分化のプロセスに適用される場合、正常な環境下で、特定の細胞型又は細胞型のサブセットに分化し続け、正常な環境下で、異なる細胞型に分化するか、又はあまり分化していない細胞型に復帰することができない地点まで分化経路中で進行した細胞を指す。脱分化とは、細胞が、細胞の系列内のあまり特殊化されていない（又は運命付けられていない）位置に復帰するプロセスを指す。本明細書で用いられる場合、細胞の系列は、細胞の遺伝、すなわち、細胞がどの細胞に由来するか、及び細胞がどんな細胞を生じ得るかを定義する。細胞の系列は、発生及び分化の遺伝的スキーム内にその細胞を置く。系列特異的マーカーとは、所望の系列の細胞の表現型と特異的に関連する特徴を指し、それを用いて、運命付けられていない細胞の所望の系列への分化を評価することができる。

【0034】

本明細書で用いられる用語「未分化細胞」とは、自己複製する性質を有し、発生能力に関する特定の暗示される意味（すなわち、全能性、多能性、多分化能など）を有さない、複数の細胞型に分化する発生能力を有する未分化状態にある細胞を指す。

【0035】

本明細書で用いられる用語「前駆細胞（progenitor cell）」とは、より高い発生能力を有する細胞、すなわち、それが分化により生じさせることができる細胞と比較してより原始的である（例えば、発生経路又は進行に沿ったより早いステップにある）細胞表現型を指す。しばしば、前駆細胞は、有意な、又は非常に高い増殖能力を有する。前駆細胞は、発生経路並びに細胞が発生及び分化する環境に応じて、より低い発生能力を有する複数の異なる細胞、すなわち、分化した細胞型、又は単一の分化した細胞型を生じさせることができる。

【0036】

本明細書で用いられる用語「マーカー」とは、所望の細胞中で示差的に発現される核酸又はポリペプチド分子を指す。この文脈において、示差的発現とは、陽性マーカーのレベルの増加及び陰性マーカーのレベルの低下を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、当業界で公知の様々な方法のいずれかを用いて所望の細胞を同定し、他の細胞から識別することができるような、他の細胞と比較して所望の細胞において十分により高いか、又はより低いものである。

【0037】

ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリング、Ｗｎｔシグナリング、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリング、ＢＭＰシグナリング、増殖因子シグナリング、又はレチノイン酸、ＦＧＦ／ＭＡＰＫ、ヘッジホッグの活性の文脈における本明細書で用いられる用語「モジュレーター」とは、規定のシグナリング経路又はその標的の生物活性を増強又は阻害する任意の分子又は化合物を指す。インヒビター又はアクチベーターは、限定されるものではないが、シグナリング経路又は標的天然リガンドの一部であり、それによってシグナリング経路の生物活性を調節する、受容体、転写因子、シグナリングメディエータ／トランスデューサなどを標的とするペプチド、抗体、又は低分子を含んでもよい。これに関して、ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリング、Ｗｎｔシグナリング、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリング、ＢＭＰシグナリング、増殖因子シグナリング、又はレチノイン酸、ＦＧＦ／ＭＡＰＫ、若しくはヘッジホッグの活性の文脈における本明細書で用いられる「インヒビター」又は「アクチベーター」とは、限定されるものではないが、シグナリングリガンド、受容体、トランスデューサ、シグナリングメディエータ及び転写因子などの規定のシグナリングの１又は２以上の成分の阻害又は活性化を指す。特に、「インヒビター」又は「アクチベーター」は、シグナリング経路のリガンドタンパク質又はリガンドタンパク質以外のシグナリング伝達経路の任意の成分（例えば、受容体、トランスデューサ、シグナリングメディエータ）のアンタゴニスト又はアゴニストを指してもよい。

【0038】

本明細書で用いられる語句「培養培地」とは、幹細胞及び任意の細胞系列の増殖を支援するために用いられる液体物質を指す。いくつかの実施形態に従って本発明により用いられる培養培地は、液体に基づく培地、例えば、塩、栄養素、ミネラル、ビタミン、アミノ酸、核酸、サイトカイン、増殖因子及びホルモンなどのタンパク質などの物質の組合せを含んでもよい水であってもよい。

【0039】

本明細書で用いられる用語「フィーダー細胞」とは、幹細胞がフィーダー細胞と共培養された場合、又はフィーダー細胞により生成される条件培地の存在下で、多能性幹細胞がマトリックス（例えば、細胞外マトリックス、合成マトリックス）上で培養された場合、幹細胞を増殖状態に維持するフィーダー細胞（例えば、線維芽細胞）を指す。フィーダー細胞の支持は、培養物（例えば、組織培養プレート中でフィーダー細胞を培養することにより形成される三次元マトリックス）中にある間のフィーダー細胞の構造、フィーダー細胞の機能（例えば、フィーダー細胞による増殖因子、栄養素及びホルモンの分泌、フィーダー細胞の増殖速度、老化前のフィーダー細胞の増殖能力）及び／又はフィーダー細胞層への幹細胞の結合に依存する。

【0040】

本開示を通して、ある特定の実施形態を範囲形式で開示することができる。範囲形式での記載は、単に便宜上及び簡潔性のためのものであると理解されるべきであり、開示される範囲に関する柔軟性のない限定と解釈されるべきではない。従って、ある範囲の記載は、特に開示される全ての可能なサブ範囲並びにその範囲内の個々の数値を有すると考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの特に開示されるサブ範囲、並びにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５及び６を有すると考えるべきである。これは、範囲の幅に関わりなく適用される。

【0041】

任意選択の実施形態の開示
本発明を説明する前に、本発明が記載される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして変化してもよいことが理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲においてのみ限定されるため、本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定を意図されるものではないことも理解されるべきである。

【0042】

別途定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する業界の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。改変及び変更が本開示の精神及び範囲内に包含されることが理解されるため、本明細書に記載のものと類似するか、又は同等である任意の方法及び材料を、本発明の実施又は試験において用いることができる。

【0043】

本開示及び実施形態は、原始線条（ＰＳ、primitive streak）誘導に関する内胚葉発生；内胚葉と中胚葉の胚葉の分離；内胚葉前後パターン化；及び細胞系列の分岐の４つの連続ステップで相互排他的な細胞系列を分離する方法に関する。特に、本開示及び実施形態は、どのシグナルが、一方又は他方に向かう均質なｈＰＳＣ分化を可能にするそれぞれの内胚葉分岐で特定の発生結果を指示又は抑制したかの決定に関する。有利には、本開示は、それぞれの分岐点で別の系列を排除することにより多様なｈＰＳＣ株を様々な内胚葉細胞型の純粋な集団に普遍的に分化させるための単一の戦略になった、連続発生ステップを通じた効率的な分化と組み合わせた正確な時間的シグナリング動力学の知識を提供する。

【0044】

従って、本発明は、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させる方法を提供する。これに関して、幹細胞は、限定されるものではないが、全能性幹細胞、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、少能性幹細胞、又は単能性幹細胞を含んでもよい。

【0045】

一実施形態においては、幹細胞は、限定されるものではないが、ヒト胚起源から誘導されていてもいなくてもよいヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ、human embryonic stem cell）を含む多能性幹細胞であってもよい。例えば、本発明における使用にとって好適な多能性幹細胞は、限定されるものではないが、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、ヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Cellartis社、Sweden）、Ｈｅｓ３（ＮＩＨコード：ＥＳ０３）、ＭｅＬ１（ＮＩＨコード：０１３９）、又は多能性細胞に特徴的な以下のマーカー：ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦｏｘＤ３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−Ｉ、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａｌ−６０、Ｔｒａｌ−８１の少なくとも１つを発現する幹細胞を含んでもよい。同様に、多能性幹細胞は、非胚起源から誘導されていてもよく、無制限に増殖し、３つの胚葉のそれぞれに分化することができる誘導多能性幹（ｉＰＳ、induced pluripotent stem）細胞であってもよい。例えば、ＩＰＳ細胞株としては、限定されるものではないが、ＢＪＣ１及びＢＪＣ３が挙げられる。ｉＰＳ細胞は培養物中でＥＳＣと本質的に同じように振舞うことが理解される。

【0046】

これに関して、当技術分野の文脈において周知である通り、多能性幹細胞は、内胚葉、中胚葉又は外胚葉のいずれかの複数の胚葉に由来する様々な細胞系列の機能的細胞に分化し、並びに移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞への注入後に全てではないとしても、実質的に多くの組織に寄与することができる。例えば、多能性幹細胞を、限定されるものではないが、原始線条前部（ＡＰＳ、anterior primitive streak）系列、胚体内胚葉（ＤＥ）系列、前腸前部（ＡＦＧ、anterior foregut）系列、前腸後部（ＰＦＧ、posterior foregut）系列、中腸後部（ＭＨＧ、mid gut hind）系列、膵臓前駆体系列、又は肝細胞前駆体系列を含んでもよい内胚葉の細胞系列に分化させることができる。あるいは、多能性幹細胞を、限定されるものではないが、心臓中胚葉、側板中胚葉、沿軸中胚葉、未分節中胚葉、体節中胚葉、中間中胚葉及び胚外中胚葉を含む中胚葉の細胞系列に分化させるか、又は限定されるものではないが、神経外胚葉、神経堤及び表層外胚葉を含む外胚葉の細胞系列に分化させることができる。

【0047】

特定の遺伝子及び／又はタンパク質マーカーの発現を測定することにより、１又は２以上の細胞系列への幹細胞の分化の進行を検出し、その進行をモニタリングすることができる。培養された、又は単離された細胞中の遺伝子及び／又はタンパク質マーカーの発現を測定及び評価するための方法は、標準的なものであり、当業界で公知である。例えば、そのような方法としては、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ、reverse transcriptase polymerase chain reaction）、ノーザンブロット、ハイブリダイゼーション、及び免疫アッセイ、例えば、切片化された材料の免疫組織化学分析、免疫染色及び蛍光画像化、ウェスタンブロッティング、並びに無処置の細胞中に到達可能であるマーカーについては、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ、flow cytometry analysis）が挙げられる。特に、系列特異的細胞の単離は、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ、fluorescence activated cell sorter）による細胞の選別により行われる。

【0048】

様々な増殖因子及び他の化学的シグナルは、１又は２以上の特定の所望の細胞系列の子孫細胞培養物への幹細胞の分化を調節することができる。本発明において用いることができる分化因子としては、限定されるものではないが、ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリング、Ｗｎｔシグナリング、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリング、ＢＭＰシグナリング、増殖因子シグナリング、レチノイン酸、ＦＧＦ／ＭＡＰＫ又はヘッジホッグの１又は２以上の活性を調節する化合物又は分子が挙げられる。

【0049】

一実施形態においては、ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングのモジュレーターは、限定されるものではないが、アクチビンＡ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、１ＤＥ１／２若しくはＮｏｄａｌなどのアクチベーターを含んでもよく、又は限定されるものではないが、Ａ−８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）、ＳＢ−５０５１２４（２−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］−６−メチル−ピリジン）、ＩＤＥ１（１−［２−［（２−カルボキシフェニル）メチレン］ヒドラジド］ヘプタン酸）、ＩＤＥ２（ヘプタン二酸−１−（２−シクロペンチリデンヒドラジド）、Ｌｅｆｔｙ１及びＬｅｆｔｙ２などのインヒビターを含んでもよい。一実施形態においては、Ｗｎｔシグナリングのモジュレーターは、限定されるものではないが、ＣＨＩＲ９９２０１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル、Ａ１０７０７２２（１−（７−メトキシキノリン−４−イル）−３−［６−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル］尿素）、Ｗｎｔ３ａ、アセトキシム若しくはＷｎｔシグナリング経路のファミリーメンバーなどのアクチベーターを含んでもよく、又は限定されるものではないが、Ｃ５９（２−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）フェニル）−Ｎ−（４−（ピリジン−３−イル）フェニル）アセトアミド）、ＩＷＰ２（Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド）、Ｄｋｋ１、ＸＡＶ９３９（３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン）、ＩＷＲ１（４−（１，３，３ａ，４，７，７ａ−ヘキサヒドロ−１，３−ジオキソ−４，７−メタノ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−Ｎ−８−キノリニル−ベンズアミド）ＦＨ−５３５＝（２，５−ジクロロ−Ｎ−（２−メチル−４−ニトロフェニル）ベンゼンスルホンアミドなどのインヒビターを含んでもよい。

【0050】

ｉＣＲＴ−１４＝５−［［２，５−ジメチル−１−（３−ピリジニル）−１Ｈ−ピロール−３−イル］メチレン］−３−フェニル−２，４−チアゾリジンジオン）、ＪＷ−５５（Ｎ−［４−［［［［テトラヒドロ−４−（４−メトキシフェニル）−２Ｈ−ピラン−４−イル］メチル］アミノ］カルボニル］フェニル］−２−フランカルボキサミド）、ＪＷ−６７（トリスピロ［３Ｈ−インドール−３，２’−［１，３］ジオキサン−２’’，３’’’−［３Ｈ］インドール］−２，２’’’（１Ｈ，１’’’Ｈ）−ジオン）又はＦｚｄ８（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８）。

【0051】

一実施形態においては、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリングのモジュレーターは、限定されるものではないが、ＰＩ−１０３（３−［４−（４−モルホリニル）ピリド［３’，２’：４，５］フロ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル］−フェノール）、ＰＩＫ−９０（Ｎ−（２，３−ジヒドロ−７，８−ジメトキシイミダゾ［１，２−ｃ］キナゾリン−５−イル）−３−ピリジンカルボキサミド），又はＬＹ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、ＡＳ−２５２４２４（５−［［５−（４−フルオロ−２−ヒドロキシフェニル）−２−フラニル］メチレン］−２，４−チアゾリジンジオン）、ＡＳ−６０５２４０（５−（６−キノキサリニルメチレン）−２，４−チアゾリジン−２，４−ジオン）、ＡＺＤ−６４８２（（−）−２−［［（１Ｒ）−１−［７−メチル−２−（４−モルホリニル）−４−オキソ−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−９−イル］エチル］アミノ］安息香酸）、ＢＡＧ−９５６（α，α，−ジメチル−４−［２−メチル−８−［２−（３−ピリジニル）エチニル］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−ベンゼンアセトニトリル）、ＣＺＣ−２４８３２（５−（２−アミノ−８−フルオロ［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−６−イル）−Ｎ−（１，１−ジメチルエチル）−３−ピリジンスルホンアミド）、ＧＳＫ−１０５９６１５（５−［［４−（４−ピリジニル）−６−キノリニル］メチレン］−２，４−チアゾリデンジオン）、化合物４０１（２−（４−モルホリニル）−４Ｈ−ピリミド［２，１−ａ］イソキノリン−４−オン）、ＰＦ−０５２１２３８４（Ｎ−［４−［［４−（ジメチルアミノ）−１−ピペリジニル］カルボニル］フェニル］−Ｎ’−［４−（４，６−ジ−４−モルホリニル−１，３，５−トリアジン−２−イル）フェニル］尿素）などのインヒビターを含んでもよい。

【0052】

一実施形態においては、ＢＭＰシグナリングのモジュレーターは、限定されるものではないが、ＤＭ３１８９／ＬＤＮ−１９３１８９（４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリンヒドロクロリド）、ノギン、コーディン、又はドルソモルフィン（６−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）、又はＤＭＨ１（４−（６−（４−イソプロポキシフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノロン）などのインヒビターを含んでもよく、又は限定されるものではないが、Ｂｍｐ４及びＢｍｐ２などのアクチベーターを含んでもよい。

【0053】

一実施形態においては、ＦＧＦ／ＭＡＰＫのモジュレーターは、限定されるものではないが、ＰＤ０３２５９０１（Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド）、ＰＤ１７３０７４（Ｎ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）尿素）、ＰＤ−１６１５７０（Ｎ−［６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）尿素）又はＦＩＩＮ １塩酸塩（Ｎ−（３−（（３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシフェニル）−７−（４−（ジエチルアミノ）ブチルアミノ）−２−オキソ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル）メチル）フェニル）アクリルアミド）、ＦＲ−１８０２０４（５−（２−フェニル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−３−イルアミン）及びＳＵ５４０２（２−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパン酸）などのインヒビターを含んでもよい。一実施形態においては、ヘッジホッグのモジュレーターは、限定されるものではないが、ＳＡＮＴ１（Ｎ−［３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチレン］−４−（フェニルメチル）−１−ピペラジンアミン）、シクロパミン又はその誘導体、ビスモデギブ、ＩＰＩ−９２６（Ｎ−（（２Ｓ，３Ｒ，３ａＳ，３’Ｒ，４ａ’Ｒ，６Ｓ，６ａ’Ｒ，６ｂ’Ｓ，７ａＲ，１２ａ’Ｓ，１２ｂ’Ｓ）−３，６，１１’，１２ｂ’−テトラメチル−２’，３ａ，３’，４，４’，４ａ’，５，５’，６，６’，６ａ’，６ｂ’，７，７ａ，７’，８’，１０’，１２’，１２ａ’，１２ｂ’−イコサヒドロ−１’Ｈ，３Ｈ−スピロ［フロ［３，２−ｂ］ピリジン−２，９’−ナフト［２，１−ａ］アズレン］−３’−イル）メタンスルホンアミド）、ＬＤＥ２２５（Ｎ−（６−（（２Ｒ，６Ｓ）−２，６−ジメチルモルホリノ）ピリジン−３−イル）−２−メチル−４’−（トリフルオロメトキシ）−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミド）、ＸＬ１３９（Ｎ−（２−メチル−５−（（メチルアミノ）メチル）フェニル）−４−（（４−フェニルキナゾリン−２−イル）アミノ）ベンズアミド）及びＰＦ−０４４９９１３などのインヒビターを含んでもよい。

【0054】

一実施形態においては、増殖因子シグナリングのモジュレーターは、限定されるものではないが、アドレノメデュリン（ＡＭ、Adrenomedullin）、アンギオポエチン（Ａｎｇ、Angiopoietin）、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ、Bone morphogenetic protein）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、Brain-derived neurotrophic factor）、表皮増殖因子（ＥＧＦ、Epidermal growth factor）、エリスロポエチン（ＥＰＯ、Erythropoietin）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、Fibroblast growth factor）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ、Glial cell line-derived neurotrophic factor）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、Granulocyte colony-stimulating factor）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Granulocyte macrophage colony-stimulating factor）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９、Growth differentiation factor-9）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ、Hepatocyte growth factor）、ヘパトーマ由来増殖因子（ＨＤＧＦ、Hepatoma-derived growth factor）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ、Insulin-like growth factor）、遊走刺激因子（Migration-stimulating factor）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経増殖因子（ＮＧＦ、Nerve growth factor）及び他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ、Platelet-derived growth factor）、トロンボポエチン（ＴＰＯ、Thrombopoietin）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α、Transforming growth factor alpha）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α、Tumor necrosis factor-alpha）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、Vascular endothelial growth factor）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ、placental growth factor）、ウシ胎仔ソマトトロピン（ＦＢＳ、Foetal Bovine Somatotrophin）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６又はＩＬ−７のシグナリング経路のいずれか１つのファミリーメンバータンパク質を含んでもよい。一実施形態においては、増殖因子シグナリングのモジュレーターは、限定されるものではないが、ＦＧＦタンパク質のファミリーのいずれか１つなどのＦＧＦシグナリングリガンドを含んでもよい。

【0055】

一実施形態においては、レチノイン酸のモジュレーターは、限定されるものではないが、レチノイン酸前駆体、オールトランスレチノイン酸又はビタミンＡなどのアクチベーターを含んでもよい。オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ、All-trans retinoic acid）のアクチベーターは、限定されるものではないが、３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ−ノナテトラエン酸を含んでもよい；ＡＴＲＡの代替的な実施形態は、９−ｃｉｓレチノイン酸及び１３−ｃｉｓレチノイン酸である（９−ｃｉｓレチノイン酸のＩＵＰＡＣ名は３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）ノナ−２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ，８Ｅ−テトラエン酸であり、１３−ｃｉｓレチノイン酸は（２Ｚ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキセン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン酸である）。

【0056】

ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリング、ＢＭＰシグナリング又は増殖因子シグナリングのアクチベーターを、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌ、又は約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌ、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、又は約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、又は約１５ｎｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの量で用いることができる。ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングのインヒビター、Ｗｎｔシグナリングのアクチベーター、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリングのインヒビター、ＢＭＰシグナリングのインヒビター、レチノイン酸のアクチベーター、ヘッジホッグのインヒビターを、約０．１ｎＭ〜約２００ｍＭ、又は約０．５ｎＭ〜約１５０ｍＭ、又は約０．５ｎＭ〜約１００ｍＭ、又は約１ｎＭ〜約１００ｍＭの範囲の量で用いることができる。

【0057】

従って、本発明は、幹細胞を、ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングの１又は２以上のアクチベーター、及びＷｎｔシグナリングの１又は２以上のアクチベーターと接触させることを含む、前記細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させる方法を提供する。

【0058】

一実施形態においては、１又は２以上の細胞系列は、原始線条前部細胞系列のものである。

【0059】

一実施形態においては、ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングの１又は２以上のモジュレーターを、アクチビンＡ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２又はｎｏｄａｌから選択することができる。一実施形態においては、Ｗｎｔシグナリングの１又は２以上のアクチベーターを、ＣＨＩＲ９９２０１、Ｗｎｔ３ａ又はＷｎｔシグナリング経路の他のファミリーメンバーから選択することができる。

【0060】

別の実施形態においては、幹細胞を、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリングの１又は２以上のインヒビターとさらに接触させる。一実施形態においては、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリングの１又は２以上のインヒビターを、ＰＩ−１０３、ＰＩＫ−９０又はＬＹ２９４００２から選択することができる。

【0061】

一実施形態においては、細胞を、アクチビンＡ、ＰＩ−１０３及びＣＨＩＲ９９２０１と接触させることができる。

【0062】

別の実施形態においては、幹細胞を、約１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの量のアクチビンＡと、約１ｎＭ〜１００ｍＭの量のＣＨＩＲ９９２０１と接触させることができる。

【0063】

別の実施形態においては、幹細胞を、約１００ｎｇ／ｍｌの量のアクチビンＡ、約５０ｎＭの量のＰＩ−１０３及び約２μＭの量のＣＨＩＲ９９２０１と接触させる。

【0064】

別の実施形態においては、幹細胞を、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンギオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヘパトーマ由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経増殖因子（ＮＧＦ）及び他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ウシ胎仔ソマトトロピン（ＦＢＳ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６又はＩＬ−７からなる群から選択される１又は２以上の増殖因子とさらに接触させる。

【0065】

一実施形態においては、増殖因子シグナリングのモジュレーターは、限定されるものではないが、ＦＧＦタンパク質のファミリーのいずれか１つなどのＦＧＦシグナリングリガンドを含んでもよい。一実施形態においては、ＦＧＦファミリーメンバータンパク質は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの量にあってもよい。一実施形態においては、ＦＧＦファミリーメンバータンパク質は、約１５ｎｇ／ｍｌ〜約４０ｎｇ／ｍｌの量にあってもよい。別の実施形態においては、ＦＧＦファミリーメンバータンパク質は、２０ｎｇ／ｍｌの量のＦＧＦ２である。

【0066】

さらなる実施形態において、原始線条前部細胞系列は、未分化細胞と比較して、限定されるものではないが、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＦＯＸＡ２、ＧＳＣ、ＦＺＤ８、ＨＨＥＸ、ＬＨＸ１及び／又はＥＯＭＥＳなどの、線条前部又は全線条（pan-streak）マーカーの遺伝子又はタンパク質発現が上昇していてもよく、限定されるものではないが、ＭＥＳＰ１及びＥＶＸ１などの線条後部マーカーの発現が低下していてもよい。

【0067】

一実施形態においては、１又は２以上の細胞系列への幹細胞の分化は、約１２〜８４時間、１２〜７２時間、１８〜７２時間、１８〜６６時間、１８〜６０時間又は２４〜６０時間で完了する。一実施形態においては、１又は２以上の細胞系列への幹細胞の分化は、約２４〜６０時間で完了してもよい。

【0068】

一実施形態においては、原始線条前部（ＡＰＳ）系列の細胞への幹細胞の分化は、約１２〜８４時間、１２〜７２時間、１８〜７２時間、１８〜６６時間、１８〜６０時間又は２４〜６０時間以内に完了してもよい。一実施形態においては、ＡＰＳへの幹細胞の分化は、約２４〜２７時間で完了してもよい。

【0069】

幹細胞が原始線条前部細胞系列に分化した事象において、原始線条前部細胞を、胚体内胚葉（ＤＥ）系列の細胞にさらに分化させることができる。従って、別の実施形態においては、本明細書に開示される方法により得られる原始線条前部系列の細胞を、ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングの１又は２以上のアクチベーター、ＢＭＰシグナリングの１又は２以上のインヒビター及びＷＮＴシグナリングの１又は２以上のインヒビターと接触させることにより、原始線条前側系列の前記細胞を胚体内胚葉（ＤＥ）系列の細胞にさらに分化させる。

【0070】

一実施形態においては、ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングの１又は２以上のモジュレーターを、アクチビンＡ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２又はＮｏｄａｌから選択することができる。

【0071】

一実施形態においては、ＢＭＰシグナリングの１又は２以上のインヒビターを、ＤＭ３１８９／ＬＤＮ−１９３１８９、ノギン、コーディン、ドルソモルフィン又はＤＭＨ１から選択することができる。

【0072】

別の実施形態においては、原始線条前部細胞を、約１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの量のアクチビンＡ、及び約１ｎＭ〜１００ｍＭの量のＬＤＮ−１９３１８９と接触させる。

【0073】

別の実施形態においては、幹細胞を、約１ｎＭ〜１０ｍＭの量のＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリングの１又は２以上のインヒビターとさらに接触させる。別の実施形態においては、原始線条前部細胞を、約１００ｎｇ／ｍｌの量のアクチビンＡ及び約２５０ｎＭの量のＬＤＮ−１９３１８９と接触させる。

【0074】

一実施形態においては、胚体内胚葉系列の細胞は、未分化細胞と比較して、限定されるものではないが、ＦＯＸＡ２、ＨＨＥＸ、ＦＺＤ８、ＣＥＲ１、ＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ１などの内胚葉マーカーの遺伝子又はタンパク質発現が上昇していてもよく、限定されるものではないが、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４などの多能性遺伝子又はタンパク質発現が低下していてもよい。

【0075】

別の実施形態においては、胚体内胚葉系列の細胞は、限定されるものではないが、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＦＯＸＦ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＨＡＮＤ１、ＥＶＸ１、ＩＲＸ３、ＣＤＸ２、ＴＢＸ６、ＭＩＸＬ１、ＩＳＬ１、ＳＮＡＩ２、ＦＯＸＣ１及びＰＤＧＦＲαなどの中胚葉マーカーの遺伝子又はタンパク質発現の低下を含む。

【0076】

一実施形態においては、胚体内胚葉（ＤＥ）系列の細胞への原始線条前部細胞の分化は、約１２〜１２０時間、１２〜１１４時間、１８〜１１４時間、１８〜１０８時間、２４〜１０８時間、２４〜１０２時間又は２４〜９６時間以内に完了してもよい。一実施形態においては、胚体内胚葉（ＤＥ）系列の細胞への原始線条前部細胞の分化は、約２４〜９６時間以内に完了してもよい。

【0077】

一実施形態においては、本明細書に記載の方法により得られる胚体内胚葉（ＤＥ）系列の細胞を、前腸前部（ＡＦＧ）、前腸後部（ＰＦＧ）又は中腸／後腸（ＭＨＧ）のいずれか１つの細胞にさらに分化させることができる。

【0078】

従って、一実施形態においては、胚体内胚葉（ＤＥ）系列の細胞を、ＴＧＦβインヒビター及びＢＭＰインヒビターと接触させることにより、前記ＤＥ細胞を前腸前部（ＡＦＧ）の細胞にさらに分化させることができる。

【0079】

一実施形態においては、ＴＧＦβインヒビターを、Ａ−８３−０１、ＳＢ４３１５４２、Ｌｅｆｔｙ１又はＬｅｆｔｙ２から選択することができる。一実施形態においては、ＢＭＰインヒビターを、ＤＭ３１８９／ＬＤＮ−１９３１８９、ノギン、コーディン、又はドルソモルフィンから選択することができる。

【0080】

別の実施形態においては、胚体内胚葉細胞を、約１ｎＭ〜１００ｍＭの量のＡ−８３−０１、及び約１ｎＭ〜１００ｍＭの量のＬＤＮ−１９３１８９と接触させる。別の実施形態においては、胚体内胚葉細胞を、約１μＭの量のＡ−８３−０１及び約２５０ｎＭの量のＬＤＮ−１９３１８９と接触させる。

【0081】

一実施形態においては、前腸前部の細胞は、前腸後部（ＰＦＧ）又は中腸／後腸（ＭＨＧ）転写因子のいずれかを含まず、未分化細胞と比較して、限定されるものではないが、ＯＴＸ２、ＩＲＸ３、ＴＢＸ１、ＰＡＸ９、ＳＯＸ２などの前腸前部マーカーの遺伝子又はタンパク質発現レベルの上昇を含む。

【0082】

一実施形態においては、胚体内胚葉（ＤＥ）系列の細胞を、レチノイン酸、ＢＭＰインヒビター、Ｗｎｔインヒビター及びＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビターと接触させることにより、ＤＥの前記細胞を前腸後部（ＰＦＧ）の細胞にさらに分化させることができる。

【0083】

別の実施形態においては、ＢＭＰインヒビターはＬＤＮ１９３１８９を含み、ＷｎｔインヒビターはＩＷＰ２を含み、ＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビターはＰＤ０３２５９０１を含む。

【0084】

別の実施形態においては、胚体内胚葉細胞を、約１ｎＭ〜１００ｍＭのレチノイン酸、約１ｎＭ〜１００ｍＭのＬＤＮ１９３１８９、約１ｎＭ〜１００ｍＭのＩＷＰ２及び約１ｎＭ〜１００ｍＭのＰＤ０３２５９０１と接触させる。別の実施形態においては、胚体内胚葉細胞を、約２μＭのレチノイン酸、約２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９、約４μＭのＩＷＰ２及び約０．５μＭのＰＤ０３２５９０１と接触させる。

【0085】

一実施形態においては、前腸後部の細胞は、ＭＨＧ又はＡＦＧ遺伝子又はタンパク質発現のいずれも含まず、未分化細胞と比較して、限定されるものではないが、ＳＯＸ２、ＯＤＤ１、ＰＤＸ１、ＨＮＦ１β、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ６、及びＨＯＸＡ１の発現などの前腸後部遺伝子又はタンパク質発現の遺伝子又はタンパク質発現レベルが上昇していてもよい。

【0086】

一実施形態においては、胚体内胚葉（ＤＥ）系列の細胞を、ＢＭＰアクチベーター、Ｗｎｔアクチベーター及びＦＧＦアクチベーターと接触させることにより、前記ＤＥ細胞を中腸／後腸（ＭＨＧ）の細胞にさらに分化させることができる。

【0087】

一実施形態においては、ＢＭＰアクチベーターはＢＭＰ４を含み、ＦＧＦアクチベーターはＦＧＦ２を含み、ＷｎｔアクチベーターはＣＨＩＲ９９２０１を含む。

【0088】

別の実施形態においては、胚体内胚葉細胞を、約１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのＢＭＰ４、約１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのＦＧＦ２、及び約１ｎＭ〜１０μＭのＣＨＩＲ９９２０１と接触させる。別の実施形態においては、胚体内胚葉細胞を、約１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、約１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、及び約３μＭのＣＨＩＲ９９２０１と接触させる。

【0089】

一実施形態においては、前腸後部の細胞は、未分化細胞と比較して、限定されるものではないが、ＣＤＸ２、ＥＶＸ１、及び５’ＨＯＸクラスター遺伝子などのＭＨＧマーカーの遺伝子又はタンパク質発現レベルが上昇していてもよい。

【0090】

一実施形態においては、前腸前部（ＡＦＧ）、前腸後部（ＰＦＧ）又は中腸／後腸（ＭＨＧ）のいずれか１つへの胚体内胚葉細胞の分化は、約１２〜３００時間、１２〜２８０時間、１８〜２８０時間、１８〜２６０時間、２４〜２６０時間、２４〜２５０時間又は２４〜２４０時間内に完了してもよい。一実施形態においては、前腸前部（ＡＦＧ）、前腸後部（ＰＦＧ）又は中腸／後腸（ＭＨＧ）のいずれか１つへの胚体内胚葉細胞の分化は、２４〜２４０時間以内に完了する。

【0091】

別の実施形態においては、前腸後部（ＰＦＧ）の細胞を、１又は２以上のＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビター；１又は２以上のヘッジホッグインヒビター；１又は２以上のＢＭＰインヒビター；１又は２以上のＷｎｔインヒビター；レチノイン酸（ＲＡ）、及びアクチビンＡと接触させることにより、前記ＰＦＧを３日以内の胚体内胚葉から誘導して、膵臓前駆細胞にさらに分化させることができる。

【0092】

一実施形態においては、ＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビターはＰＤ０３２５９０１又はＰＤ１７３０７４を含み、ヘッジホッグインヒビターはＳＡＮＴ１を含み、ＢＭＰインヒビターはＬＤＮ１９３１８９を含み、ＷｎｔアクチベーターはＩＷＰ２又はＣ５９を含む。

【0093】

別の実施形態においては、ＰＦＧ細胞を、約１ｎＭ〜１００ｍＭのＰＤ０３２５９０１又はＰＤ１７３０７４、約１ｎＭ〜１００ｍＭのＳＡＮＴ１、約１ｎＭ〜１００ｍＭのＬＤＮ１９３１８９、約１ｎＭ〜１００ｍＭのＩＷＰ２又はＣ５９、約１ｎＭ〜１００ｍＭのレチノイン酸及び約１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのアクチビンＡと接触させることができる。別の実施形態においては、ＰＦＧ細胞を、約０．５μＭのＰＤ０３２５９０１又は１００ｎＭのＰＤ１７３０７４、約１５０ｎＭのＳＡＮＴ１、約２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９、約４μＭのＩＷＰ２、約２μＭのレチノイン酸及び約１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと接触させることができる。

【0094】

別の実施形態においては、膵臓前駆体の細胞は、未分化細胞と比較して、限定されるものではないが、ＰＤＸ１遺伝子などの膵臓遺伝子の遺伝子又はタンパク質発現レベルが上昇していてもよく、限定されるものではないが、ＡＦＰ及びＨＮＦ４Ａなどの肝臓前駆体遺伝子又はタンパク質発現を排除してもよい。別の実施形態においては、膵臓前駆体の細胞は、未分化細胞と比較して、限定されるものではないが、ＰＤＸ１遺伝子などの膵臓遺伝子の発現レベルの上昇を含み、限定されるものではないが、ＡＦＰ及びＨＮＦ４Ａなどの膵臓前駆体遺伝子又はタンパク質発現を排除する。

【0095】

一実施形態においては、前腸後部（ＰＦＧ）の細胞を、１又は２以上のＴＧＦβインヒビター；レチノイン酸（ＲＡ）；１又は２以上のＢＭＰアクチベーター、及び１又は２以上のＷｎｔインヒビターと接触させることにより、前記ＰＦＧを４日以内の胚体内胚葉から誘導して肝臓前駆細胞にさらに分化させることができる。

【0096】

一実施形態においては、ＴＧＦβインヒビターはＡ８３−０１を含み、１又は２以上のＢＭＰアクチベーターはＢＭＰ４を含み、１又は２以上のＷｎｔインヒビターはＩＷＰ２又はＣ５９を含む。

【0097】

別の実施形態においては、ＰＦＧを、約１ｎＭ〜１００ｍＭのＡ８３−０１、約１ｎＭ〜１００ｍＭのＲＡ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのＢＭＰ４、及び約１ｎＭ〜１００ｍＭのＩＷＰ２又はＣ５９と接触させる。別の実施形態においては、ＰＦＧを、約１μＭのＡ８３−０１、約２μＭのＲＡ、約１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、及び約４μＭのＩＷＰ２と接触させる。

【0098】

別の実施形態においては、肝臓前駆体の細胞は、未分化細胞と比較して、限定されるものではないが、ＡＦＰ及びＨＮＦ４Ａ遺伝子などの肝臓遺伝子の遺伝子又はタンパク質発現レベルの上昇を含んでもよく、限定されるものではないが、ＰＤＸ１などの膵臓前駆体遺伝子又はタンパク質発現を排除してもよい。

【0099】

一実施形態においては、原始線条前部系列の細胞を、ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングの１若しくは２以上のアクチベーター、及びＢＭＰシグナリングの１若しくは２以上のインヒビター、又はＷｎｔシグナリングの１若しくは２以上のインヒビターと接触させることにより、原始線条前部細胞を胚体内胚葉（ＤＥ）系列の細胞に分化させる方法が提供される。

【0100】

一実施形態においては、ＤＥ細胞をＴＧＦβインヒビター及びＢＭＰインヒビターと接触させることにより、前記ＤＥの細胞をＡＦＧの細胞に分化させる方法が提供される。

【0101】

一実施形態においては、ＤＥ系列の細胞をレチノイン酸、ＢＭＰインヒビター、Ｗｎｔインヒビター及びＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビターと接触させることにより、ＤＥの前記細胞をＰＦＧの細胞に分化させる方法が提供される。

【0102】

一実施形態においては、ＤＥ系列の細胞をＢＭＰアクチベーター、Ｗｎｔアクチベーター及びＦＧＦアクチベーターと接触させることにより、前記ＤＥ細胞をＭＨＧの細胞に分化させる方法が提供される。

【0103】

一実施形態においては、ＰＦＧの膵臓前駆体を、１又は２以上のＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビター；１又は２以上のヘッジホッグインヒビター；１又は２以上のＢＭＰインヒビター；１又は２以上のＷＮＴインヒビター；レチノイン酸（ＲＡ）、及びアクチビンＡと接触させることにより、３日以内のＤＥから前記ＰＦＧを誘導する方法が提供される。

【0104】

一実施形態においては、ＰＦＧの肝臓前駆体を、１又は２以上のＴＧＦβインヒビター；レチノイン酸、１又は２以上のＢＭＰアクチベーター、及び１又は２以上のＷｎｔインヒビターと接触させることにより、４日以内のＤＥから前記ＰＦＧを誘導する方法が提供される。

【0105】

本明細書に記載の方法において、細胞を接触させるステップは、意図される細胞系列への細胞の増殖及び／又は分化を支援することができる好適な培養培地中で細胞を培養することを含んでもよい。特に、細胞の接触は、培養培地中の細胞を、１又は２以上の分化因子と一緒にインビトロでインキュベートすることを含むことが意図される。用語「接触」は、分化因子への細胞のインビボでの曝露を含むことが意図されず、任意の好適な様式で行うことができる。例えば、細胞を、１又は２以上の分化因子を含む接着培養液、又は懸濁培養液中で処理することができる。１又は２以上の分化因子と接触させた細胞を、他の細胞分化環境でさらに処理して、細胞を安定化させるか、又は細胞をさらに分化させることができることが理解される。

【0106】

一実施形態においては、幹細胞を、他の因子を添加するか、又は細胞系列の増殖、維持若しくは分化のために適合するように加工することができる培養培地中の１又は２以上の分化因子と接触させる。幹細胞の多能性を維持するために、例えば、本明細書に開示される幹細胞及び細胞系列を、条件培地、例えば、ｍＥＦ−ＣＭ、又は新鮮な無血清培地のみ、ｍＴｅｓＲ、又は当業界で公知である他のｈＰＳＣ維持培地又は異種由来成分非含有（xeno-free）培地、例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８中で培養することができる。幹細胞を分化させるために、本明細書に開示される幹細胞及び細胞系列を、フィーダーフリー培地又はフィーダー層を含む培地中で培養することができ、ここで、培養培地をIscove's Modified Dulbecco's Media（ＩＭＤＭ）、Ｆ１２、トランスフェリン、インスリン、濃縮脂質、又はポリビニルアルコール（ＰＶＡ、polyvinyl alcohol）を含有するものとして化学的に定義することができる。多能性維持培地を分化のために用いることができる。あるいは、分化のために、当業界で公知の細胞の生存及び増殖のための基本成分を含有し、分化を混乱させる追加の増殖因子／化学物質を含有しない最小基本培地から誘導される基本培地を用いることができる。

【0107】

一実施形態においては、培養培地は、フィーダー層から得られる条件培地であってもよい。フィーダー層は線維芽細胞を含み、一実施形態においては、胚性線維芽細胞を含むことが企図される。

【0108】

本発明の一実施形態においては、フィーダー細胞層は、フィーダー層を形成する細胞を培養し、該細胞を不活化することを本質的に含む方法により生成される。フィーダー細胞層を形成する細胞を、好適な培養基質上で培養することができる。一実施形態においては、好適な培養基質は、細胞外マトリックス成分、例えば、基底膜から誘導されるもの、又は接着分子受容体−リガンドカップリングの一部を形成することができるものなどである。一実施形態においては、好適な培養基質は、MATRIGEL（登録商標）（Becton Dickenson社）である。MATRIGEL（登録商標）は、室温でゲル化して再構成された基底膜を形成するEngelbreth-Holm-Swarm腫瘍細胞に由来する可溶性調製物である。別の実施形態においては、好適な培養基質は、ゼラチン（Sigma社）である。他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は、代替物として好適である。１つの他の実施形態は、Geltrex（商標）LDEV-Free hESC qualified reduced growth factor基底膜マトリックスである。増殖させる細胞型に応じて、これはラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、ビトロネクチン、エンタクチン、硫酸ヘパランなどを、単独で、又は様々な組合せで含んでもよい。

【0109】

代替的な培養系は、胚性幹細胞の増殖を促進することができる増殖因子を添加した無血清培地を用いる。例えば、幹細胞を、幹細胞自己複製を誘発することができる異なる増殖因子を添加した非条件化血清補充（ＳＲ、serum replacement）培地中で維持するフィーダーフリー、無血清培養系。

【0110】

一実施形態においては、培養培地は、フィーダー細胞を含有しなくてもよいフィーダーフリー培養培地又は培養物中にフィーダー細胞も外因的に添加されたフィーダー細胞も含まない培養物から取得された外因的に添加された条件培地であってもよい。勿論、培養される細胞がフィーダー細胞を含有した種培養から誘導される場合、偶発的な同時単離及び所望の細胞（例えば、未分化霊長類幹細胞）と共にいくらか小さい割合のこれらのフィーダー細胞の別の培養物へのその後の導入は、フィーダー細胞の意図的な導入と見なされるべきではない。そのような例においては、培養物はデミニミス数のフィーダー細胞を含有する。「デミニミス」とは、分化可能な細胞がフィーダー細胞上で培養されていてもよい以前の培養条件から現在の培養条件にわたって保持されるフィーダー細胞の数を意味する。同様に、培養物中に播種された幹細胞から発生するフィーダー細胞又はフィーダー様細胞は、培養物中に意図的に導入されたと見なされるべきではない。例えば、ＡＰＳ、ＤＥ、ＡＦＧ、ＰＦＧ（４日プロトコール）及びＭＨＧ分化のために、化学的に定義され、ＰＶＡ、インスリン、トランスフェリン、濃縮脂質、モノチオグリセロール、ＩＭＤＭ、又はＦ１２を含有してもよいフィーダーフリー培養培地を用いることができる。あるいは、ＰＦＧ、膵臓及び肝臓分化のために、化学的に定義され、ＰＶＡ、濃縮脂質、ノックアウト血清補充（ＫＯＳＲ、knockout serum replacement）、ＩＭＤＭ、Ｆ１２を含有してもよいフィーダーフリー培養培地を用いることができる。

【0111】

従って、一実施形態においては、幹細胞の増殖及び／又は分化のために本明細書に記載の本発明の方法において用いられる培養培地は、フィーダー細胞又はフィーダー層を実質的に含まなくてもよい。さらに、フィーダーフリー培養培地は、幹細胞を、好適な培養基質、例えば、細胞外マトリックス成分（すなわち、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、硫酸ヘパランなどを単独で、又は様々な組合せで）で被覆された任意の基質、又はMATRIGEL（商標）上で増殖させる必要があってもよい。そのようなものとして、別の実施形態においては、幹細胞を、培養基質としてマトリックス成分を使用しながら、フィーダー細胞層を含まない培養培地中で培養することができる。別の実施形態においては、幹細胞の増殖及び／又は分化のために本明細書に記載の本発明の方法において用いられる培養培地は、懸濁培養培地などの基質マトリックスを使用せずに、フィーダー細胞又はフィーダー層を実質的に含まなくてもよい。

【0112】

一実施形態においては、１又は２以上の下記因子：１又は２以上のＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビター；１又は２以上のヘッジホッグインヒビター；１又は２以上のＢＭＰインヒビター、１又は２以上のＷＮＴインヒビター、レチノイン酸、アクチビンＡ、及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリングの１又は２以上のインヒビターを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地が提供される。

【0113】

別の実施形態においては、本発明は、１又は２以上の下記因子：マトリックス成分、ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングの１又は２以上のアクチベーター、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングの１又は２以上のアクチベーター、及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリングの１又は２以上のインヒビターを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地を提供する。

【0114】

別の実施形態においては、本発明は、１又は２以上の下記因子：ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングの１又は２以上のアクチベーター、及びＢＭＰシグナリングの１又は２以上のインヒビターを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地を提供する。

【0115】

別の実施形態においては、本発明は、ＴＧＦβインヒビター及びＢＭＰインヒビターを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地を提供する。

【0116】

別の実施形態においては、本発明は、１又は２以上の下記因子：レチノイン酸、ＢＭＰインヒビター、Ｗｎｔインヒビター及びＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビターを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地を提供する。

【0117】

別の実施形態においては、本発明は、１又は２以上の下記因子：ＢＭＰ４、Ｗｎｔアクチベーター及びＦＧＦアクチベーターを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地を提供する。

【0118】

別の実施形態においては、本発明は、１又は２以上の下記因子：１又は２以上のＦＧＦ／ＭＡＰＫインヒビター；１又は２以上のヘッジホッグインヒビター；１又は２以上のＢＭＰインヒビター；１又は２以上のＷｎｔインヒビター；レチノイン酸（ＲＡ）、及びアクチビンＡを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地を提供する。

【0119】

別の実施形態においては、本発明は、１又は２以上の下記因子：１又は２以上のＴＧＦβインヒビター；１又は２以上のＢＭＰアクチベーター、及び１又は２以上のＷｎｔインヒビターを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地を提供する。

【0120】

別の実施形態においては、本発明は、１又は２以上の下記因子：Ｎｏｄａｌ／ＴＧＦβの１又は２以上のインヒビター；ＢＭＰの１又は２以上のインヒビター；ＦＧＦ／ＭＡＰＫの１又は２以上のインヒビター、及びＷｎｔの１又は２以上のインヒビターを含む、幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させるための細胞培養培地を提供する。

【0121】

別の実施形態においては、ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリング、ＢＭＰシグナリングのアクチベーター又は増殖因子シグナリングのモジュレーターを含む分化因子は、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌ、又は約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌ、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、又は約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、又は約１５ｎｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの範囲の量の細胞培養系中にあってもよい。さらに、ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナリングのインヒビター、Ｗｎｔシグナリングのアクチベーター、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリングのインヒビター、ＢＭＰシグナリングのインヒビター、レチノイン酸のアクチベーター、ＦＧＦ／ＭＡＰＫのインヒビター、ヘッジホッグのインヒビターを含む分化因子は、約０．１ｎＭ〜約２００ｍＭ、又は約０．５ｎＭ〜約１５０ｍＭ、又は約０．５ｎＭ〜約１００ｍＭ、又は約１ｎＭ〜約１００ｍＭの範囲の量の細胞培養系中にあってもよい。

【0122】

一実施形態においては、本明細書に記載の方法のいずれかに従って産生される細胞が提供される。

【0123】

一実施形態においては、本明細書に記載の細胞培養培地の１又は２以上の容器を使用説明書と一緒に含む、本明細書に記載の方法のいずれか１つにおける使用のためのキットが提供される。

【0124】

本明細書に例示的に記載される開示を、本明細書に特に開示されない、任意の要素又は複数の要素、限定又は複数の限定の非存在下で好適に実行することができる。かくして、例えば、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）」などは、広く、また限定なく読まれるべきである。さらに、本明細書で用いられる用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として用いられたものであり、示され、記載される特徴又はその一部の任意の等価物を含まないそのような用語及び表現の使用における意図はないが、様々な改変が特許請求される本発明の範囲内で可能であることが認識される。かくして、本発明は好ましい実施形態及び任意選択の特徴により特に開示されたが、当業者であれば本明細書に開示される本発明において実施される本発明の改変及び変更を用いることができ、そのような改変及び変更が本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるべきである。

【0125】

本開示は、本明細書に広く、一般的に記載されてきた。一般的開示内にあるより狭い種及び亜属群もそれぞれ、本発明の一部を形成する。これは、切り出された材料が本明細書に特に記載されたかどうかに関係なく、属から任意の主題を除去する条件又は負の限定で本発明の一般的記載を含む。

【0126】

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲及び非限定的例の中にある。さらに、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ形式を単位として記載される場合、当業者であれば、本発明もまたマーカッシュ形式の任意の個々のメンバー又はそのメンバーの亜群を単位としてそれにより記載されることも認識する。

【図面の簡単な説明】

【0127】

本発明は、非限定例及び添付の図面と共に考えた場合、詳細な説明を参照してより良く理解される。

【図1】Ｈ９ ｈＥＳＣのＡＦＢＬｙ処理及びＧＯ分析中に２倍を超えて上方調節された遺伝子のマイクロアレイ再分析の略図である。

【図2】ＰＳ形成に対する、増加するＦＧＦ２（１０〜４０ｎｇ／ｍＬ）、Ｗｎｔ３ａ（１５〜１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣＨＩＲ９９０２１（５０〜１０００ｎＭ）又はＢＭＰ４（３〜２０ｎｇ／ｍＬ）（それぞれ、パネルｉ、ii、iii及びiv）並びに対応するインヒビター（１００ｎＭのＰＤ１７３０７４、２μＭのＩＷＰ２、１５０ｎｇ／ｍＬのＤｋｋ１及び２５０ｎＭのＤＭ３１８９）の試験効果を示す図である。Ｈ１ ｈＥＳＣを、示されたシグナリング摂動と共にアクチビン（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍＬ）及び１０μＭのＬＹ２９４００２（「ＡＦＬｙ」又は「ＡＬｙ」）の示された基本的組合せを用いて２４時間、ＰＳに向かって分化させ、ｑＰＣＲを実施した（１日目）。

【図3】ＰＳからのＤＥと中胚葉発生に対する、増加するＢＭＰ、ＦＧＦ又はＷｎｔシグナリング（１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、３μＭのＣＨＩＲ及び５〜２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２；それぞれ、パネルｉ、ii及びiii）の試験効果を示す図である。Ｈ１ ｈＥＳＣを、ＡＦＢＬｙでＰＳに向かって２４時間最初に分化させた後、示されたシグナリング摂動と共にＡＦＬｙ、ＡＦＢＬｙ又はＡＬｙ＋２５０ｎＭのＤＭ３１８９（「ＡＤＬｙ」）で４８時間分化させ、ｑＰＣＲを実施した（３日目）。

【図4】原始線条、中胚葉及び胚体内胚葉の特定のための時間的動力学シグナリング論理を示す図である。（ｉ）ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ ＡＰＳ誘導のためのＢＭＰの必要性を示す；（ii）ＢＭＰ、ＦＧＦ、Ｗｎｔ及びＴＧＦβシグナリング並びに誘導された系列に対するその効果を示す；及び（iii）（ii）のグラフ表示を示す。

【図5】ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＦＯＸＡ２、ＥＯＭＥＳ及びＬＨＸ１（ＤＡＰＩによる核対抗染色）について染色された、２４時間にわたってＡＣＰにより分化させたＨ１ ｈＥＳＣを示す図である。スケールバーはこれ以降の図面の全てについて１００μｍである（左側）；実質的に全てのＨＥＳ３ ｈＥＳＣは、ＦＡＣＳにより示されるように、ＡＣＰ分化の２４時間後にＭＩＸＬ１−ＧＦＰ＋である（右側）。

【図6】独立した３つのマイクロアレイヒートマップを示す図である；未分化のＨＥＳ３ ｈＥＳＣ（０日目）、ＡＣＰにより誘導されたＡＰＳ（１日目）、ＳＲ１により誘導されたＤＥ（３日目）又はＡＦＢＬｙ若しくは血清により３日間分化させたｈＥＳＣ。

【図7】３日間の分化後にＳＲ１、血清又はＡＦＢＬｙで処理されたＨ１ ｈＥＳＣのＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７染色を示す図である（上）；７つのｈＰＳＣ株からのｈＰＳＣ中（灰色）又はＳＲ１分化後（青色）のＣＸＣＲ４＋ＰＤＧＦＲα−ＤＥパーセンテージの概要。ドットは実験反復物を表す（左下）；異なる分化プロトコール後のＣＸＣＲ４＋ＰＤＧＦＲα−ＤＥパーセンテージをまとめるヒストグラムである。エラーバーは標準偏差を表す（右下）。

【図8】Ｈ９ ＳＯＸ１７−ｍＣＨＥＲＲＹ ｈＥＳＣのＦＡＣＳ分析を示す図である；２日間のＳＲ１分化の前又は後のリポーター発現。

【図9】示されたｈＰＳＣ株からのＳＲ１分化の前又は後のＣＸＣＲ４及びＰＤＧＦＲα発現のＦＡＣＳ分析を示す図である。

【図10】ＳＲ１、ＡＦＢＬｙ又は血清による２日間の分化の前又は後の８０のＨ７ ｈＥＳＣの単一細胞ｑＰＣＲヒートマップを示す図である。

【図11】０〜２日間のＳＲ１誘導後のＨ１ ｈＥＳＣの神経分化能（neural competence）を示す図である。これを神経化培地（「Ｎ」、３日間）に移し（「→」）、神経遺伝子発現をＳＲ１により誘導されたＤＥと比較した（「３日目のＤＥ」）。

【図12】ｈＥＳＣ由来内胚葉の前後パターン化の模式図である。

【図13】転写因子がインビボで前後ドメインの境界を定めることを示す図である。

【図14】ＭＨＧ誘導に対する（ｉ）増加するＢＭＰ４（１０〜２５ｎｇ／ｍＬ）又は（ii）増加するＣＨＩＲ（３〜６μＭ）の効果を示す図である。３日目のＤＥを、示されたＡＦＧ及びＰＦＧ対照と共に７日目まで指定のシグナリング摂動と共に示された基本条件でその後４日間分化させた（図Ｓ４ａにより包含される）；（ｉ）ＦＧＦ＋ＣＨＩＲ＝１００ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２＋３μＭ ＣＨＩＲ；（ii）ＢＦ＝１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４＋１００ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２。

【図15】それぞれＨ１由来の７日目のＡＦＧ及びＭＨＧのＯＴＸ２、ＦＯＸＡ２及びＣＤＸ２免疫染色を定量と共に示す図である。

【図16】独立した３回における７日目のＨＥＳ３由来ＡＦＧ、ＰＦＧ、及びＭＨＧ集団のマイクロアレイヒートマップを示す図である。

【図17】Ｈ７及びＨＥＳ３ ｈＥＳＣ株に由来する７日目のＡＦＧ、ＰＦＧ、及びＭＨＧ集団のｑＰＣＲを示す図である。ＨＯＸ遺伝子を囲みで示す。

【図18】膵臓又は肝臓分化能を示す図である。３日目のＤＥが１〜２日でＡＦＧ又はＰＦＧにパターン化された場合、その後それぞれをさらに３日間で膵臓又は肝臓に向かって分化させた。

【図19】膵臓対肝臓誘導に対する増加する量の（ｉ〜iii）ＢＭＰ／ＴＧＦβシグナリング又は（iv）ＦＧＦ／ＭＡＰＫシグナリングの効果を示す図である。３日目のＤＥを、（ｉ〜ii）５〜２０ｎｇ／ｍＬのアクチビン又は（ii〜iii）５〜１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４及び示される場合、対応するインヒビター（１μＭのＡ８３０１、２５０ｎＭのＤＭ３１８９、１００ｎＭのＰＤ１７３０７４、５００ｎＭのＰＤ０３２５９０１）を用いる示された条件を用いて分化させた。基本条件に関する省略：（ｉ）ＲＳ＝２μＭのＲＡ＋ＳＡＮＴ１；（ii〜iii）ＲＳ＋ＰＤ＝ＲＳ＋ＰＤ０３２５９０１；（iv）ＤＲＫ＝ＤＭ３１８９＋ＲＡ＋ＫＡＡＤ−シクロパミン。

【図20】肝臓対膵臓誘導に関する（ｉ）動力学シグナリング入力、（ii）真理値表並びに（iii）ＢＭＰ及びＴＧＦβシグナリングの二分を示す図である。

【図21】Ａｆｐ^＋肝臓前駆体の効率的特定を示す図である。

【図22】ｈＥＳＣ由来後期肝臓子孫における、ＣＹＰ３Ａ４代謝活性に関する基質ルシフェラーゼアッセイ（ｉ）及びＬＤＬＲ発現及びＬＤＬ−ＤｙＬｉｇｈｔ５９４取込みに関する染色（ii）を示す図である。

【図23】ＣＡＧ−ＧＦＰ＋ｈＥＳＣが、移植された場合に初期肝臓前駆体又は後期肝臓子孫に分化したことを示す図である（左上）；マウス血清中のヒトアルブミンレベル、それぞれのドットは個々のマウスである（上手く生着したマウスの画分を示した；右上）；異なる小葉及び部分体に関するレシピエント全肝臓横断面を示す。スケールバー＝５ｍｍ（中央右）；４つの異なる肝葉におけるヒトアルブミン及びＧＦＰに関する同時染色、フィールドを上に番号付けた（下）。

【図24】示された系列移行で上方調節される段階特異的遺伝子のＲＮＡ−ｓｅｑヒートマップを示す図である。

【図25】ＡＰＳエンハンサーが分化の２４時間以内に迅速に活性化されることを示す図である。

【図26】異なる活性エンハンサープログラムが内胚葉発生の際に起動されることを示す図である。

【図27】別々の前後ドメインにおける相互排他的なエンハンサー活性化を示す図である。

【図28】予備選択を用いないＧＲＥＡＴによるＤＥ特異的活性エンハンサーと関連する上位ＧＯ用語を示す図である。

【図29】内胚葉エンハンサー活性化が近隣の遺伝子活性化と相関することを示す図である。

【図30】内胚葉特異的活性エンハンサーが保存されることを示す図である。

【図31】同時的内胚葉エンハンサーの比較一覧を示す図である。

【図32】内胚葉特異的活性エンハンサー内で富化される転写因子モチーフを示す図である。

【図33】内胚葉エンハンサー活性と関連する結合転写因子同時占有を示す図である。

【図34】転写因子及びシグナリングエフェクターが活性内胚葉エンハンサーを同時占有することを示す図である。

【図35】内胚葉エンハンサーが多能性細胞中で複数の異なる「プレエンハンサー」状態で存在することを示す図である。

【図36】ｈＥＳＣ中の所与のクロマチン因子による内胚葉プレエンハンサー標識化の頻度を示す図である。

【図37】Ｈ２Ａｚのみのプレエンハンサーが分化の際に内胚葉転写因子をより容易に誘引することを示す図である。

【図38】運命付けられていない細胞中の複数の「プレエンハンサー」状態のグラフ表示である。

【図39】ＡＦＢＬｙ条件で分化したｈＥＳＣ細胞中での中胚葉と内胚葉の両方の調節遺伝子の発現を示す図である。

【図40】ＡＦＢＬｙが中胚葉転写因子を優先的に上方調節することを示す図である。

【図41】原始線条からの効率的な内胚葉形成が内因性ＢＭＰシグナリングの阻害を必要とすることを示す図である。

【図42】独立したＨ１ ｈＥＳＣ株における後期ＢＭＰ遮断が中胚葉形成を編集することを示す図である。

【図43】ＢＭＰ阻害が内胚葉を拡張させることを示す図である。

【図44】初期ＢＭＰシグナリング動力学の概要を表す図である。

【図45】３つの独立したＷｎｔアンタゴニストが原始線条からの中胚葉形成を編集することを示す図である。

【図46】ＢＭＰ及びＷｎｔの二重の阻害が中胚葉形成を抑制するのに不必要であることを示す図である。

【図47】分化中の内因性シグナリングの上方調節を示す図である。

【図48】ＦＧＦが前部及び後部ＰＰＳ特定を許容することを示す図である。

【図49】ＦＧＦ及びＰＩ−１０３の発現レベルがＰＳ誘導から変化することを示す図である。

【図50】化学的ＰＩ３Ｋインヒビターの化学構造、特異性及び効能を示す図である。

【図51】ＰＳ分化におけるＰＩ３ＫインヒビターＬＹ２９４００２、ＰＩＫ−９０及びＰＩ−１０３の比較効能を示す図である。

【図52】核型的に正常であるフィーダーフリー条件での未分化増殖への民族的に多様なｈＥＳＣ株の適応を示す図である。

【図53】フィブロネクチンの内胚葉誘導を示す図である。

【図54】ＴＧＦβ及びＷｎｔシグナリング並びにＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害が線条前部を効率的に特定することを示す図である。

【図55】ＳＲ１によるＨＥＳ２及びＨＥＳ３の分化のＦＡＣＳを示す図である。

【図56】内胚葉におけるＣＤ９０及びＰｄｇｆｒａの放棄（relinquishing）を示す図である。

【図57】ＦＡＣＳ分析のためのゲーティング戦略を示す図である。

【図58】ＳＲ１が多様なｈＥＳＣ株から胚体内胚葉、中胚葉欠如又は他の外来性系列を効率的に特定することを示す図である。

【図59】異なる方法間でのＦＡＣＳ比較を示す図である。

【図60】ＳＲ１によるＳｏｘ１７^＋Ｆｏｘａ２^＋胚体内胚葉の効率的誘導を示す図である。

【図61】ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣがＳＲ１によって内胚葉に同等に効率的に分化することを示す図である。

【図62】ｈＥＳＣ由来胚体内胚葉の前後パターン化のための仮定的シグナリング要件を示す図である。

【図63】ＢＭＰ、ＦＧＦ／ＭＡＰＫ、Ｗｎｔ及びヘッジホッグシグナリングが膵臓特定化を協調的に抑制することを示す図である。

【図64】肝臓特定化中の膵臓の排除を示す図である。

【図65】ｈＥＳＣからの肝臓分化戦略の比較を示す図である。

【図66】６日の期間後のｈＥＳＣ分化の肝臓成熟中のアルブミンの誘導を示す図である。

【図67】初期ではなく、後期のｈＥＳＣ由来子孫生着を示す図である。

【図68】ｈＥＳＣ由来生着子孫によるＨｅｐＰａｒ１及びアルブミンの同時発現を示す図である。

【図69】生着したｈＥＳＣ由来肝臓細胞が検出可能なレベルのＡｆｐを発現しないことを示す図である。

【図70】内胚葉分化の統計学的分析を示す図である。

【図71】ＣＸＣＲ４エンハンサーでの片側性のＨ３Ｋ２７ａｃ活性化及び付随するＰＲＣ２抑制を示す図である。

【図72】前後パターン化中の細胞型特異的エンハンサー使用を示す図である。

【図73】Ｅｏｍｅｓ、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ４及びＦｏｘｈ１が内胚葉エンハンサーを同時占有することを示す図である。

【図74】他の系列エンハンサーがＳＲ１により誘導される内胚葉中で頻繁に不活化されることを示す図である。

【図75】神経関連エンハンサーが以前のｈＥＳＣ由来内胚葉集団中で活性であることを示す図である。

【図76】ｈＥＳＣにおけるＤＥプレエンハンサークラスの普及のグラフ表示である。

【図77】ＤＥプレエンハンサークラスのゲノム位置を示す図である。

【図78】中胚葉プレエンハンサークロマチン状態を示す図である。

【図79】前腸前部に限定される活性エンハンサーを示す図である。

【図80】前後パターン化中のＨｏｘａ遺伝子座のクロマチン構造を示す図である。

【実施例】

【0128】

実験セクション
材料及び方法
ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの未分化増殖
１．ＭＥＦ同時培養から規定の培養条件への初期適合化
本研究において用いられる多くのｈＥＳＣ株は、照射されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層上で元々培養されたものであった。ｈＥＳＣ株をフィーダーフリー培養物に適合させるために、ＭＥＦで増殖させたｈＥＳＣをMatrigel被覆プレート上で連続的に継代し、ＭＥＦ条件培地（ＣＭ、conditioned medium）中で増殖させた。ＭＥＦ−ＣＭを生成するために、集密なＭＥＦ培養物をＫＯＳＲ培地（２０％ＫＯＳＲ（Gibco社、ｖ／ｖ）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、non-essential amino acid）、α−メルカプトエタノール、ペニシリン、ストレプトマイシン及び４ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（ＭＥＦサイトカイン産生を刺激するため）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２）で処理し、２４時間後、ＫＯＳＲ条件培地を回収、濾過し、さらに１５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を添加した後、ｈＥＳＣ培養物に添加した。

【0129】

２．規定条件における長期未分化増殖（ｍＴｅＳＲ１）
一旦、ｈＥＳＣ株をＭＥＦ−ＣＭ培養条件に適合させた後、それらをｍＴｅＳＲ１（StemCell Technologies社）中での増殖に適合させた。これを達成するために、ｈＥＳＣをＭＥＦ−ＣＭ中に塗布した２日後に、それらをｍＴｅＳＲ１に移した。ＭＥＦ−ＣＭからｍＴｅＳＲ１への初期導入時に初めはわずかなｈＥＳＣ増殖の阻害が見られ、通常はいくらかの分化が同様に得られた。ｈＥＳＣをｍＴｅＳＲ１中で連続的に継代し、最終的に未分化のｈＥＳＣをｍＴｅＳＲ１中で安定に増殖させることができるまで、明らかに分化した細胞を機械的に擦り取った（図５２）。ｈＥＳＣが高品質でｍＴｅＳＲ１に適合した（すなわち、同時的分化が完全に排除された）後にのみ、それらを分化実験のために続けて用いた。これを行って、交絡下流分化に由来する未分化状態の動物フィーダー又は未規定の培地成分へのｈＥＳＣの曝露を防止した。最終的に、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、ＨＥＳ２及びＨＥＳ３ ｈＥＳＣ株がｍＴｅＳＲ１中での未分化増殖に最終的に適合し、核型的に正常であった（図５２）。

【0130】

ｈｉＰＳＣ株ＢＪＣ１及びＢＪＣ３を、ヒトＢＪ包皮線維芽細胞株に必須再プログラミング因子（obligatory reprogramming factor）（J Durruthy-Durruthy、V Sebastiano、非公開の研究）をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトすることにより誘導し、続いてそれらを、ｈＥＳＣを増殖させ、継代するために用いられるものと同一の技術によりｍＴｅＳＲ１を用いて未分化状態で増殖させた（図５２）。

【0131】

分化のための被覆細胞培養プラスチック
細胞培養プラスチックを、ヒトフィブロネクチン（Millipore社、FC010）又はMatrigel（BD Biosciences社）のいずれかで予め被覆した後、ＳＲ１分化のためにｈＰＳＣを上に塗布した。１２穴プレート中の単一のウェルについて、ウェルを１００μＬの滅菌ＰＢＳで簡単に湿らせて、ウェルの全表面積を覆った後、過剰のＰＢＳを除去した。次いで、２００μＬのヒトフィブロネクチン（ＰＢＳ中で１０μｇ／ｍＬに希釈されたもの）をウェルに添加し、３７℃で１時間、ウェルの表面に吸着させた。フィブロネクチン被覆が完了した後、全てのフィブロネクチン溶液を除去し、次いで、ｈＰＳＣを塗布した。Matrigel被覆のために、Matrigelを最初にＤＭＥＭ／Ｆ１２（Gibco社）中で１：１５に希釈した。ウェルを十分に希釈されたMatrigelで簡単に被覆して、全表面積を覆った後、Matrigelを回収し、将来の使用のために保存した。次いで、プレートを３７℃で１５分間インキュベートして、Matrigel層の集合を可能にした。これを２回繰り返した。つまり、再びウェルを、希釈されたMatrigelで簡単に覆った後、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、残留するMatrigelを吸引し、続いて、ｈＰＳＣを塗布した。

【0132】

ＳＲ１中での定義された胚体内胚葉特定化
全てのｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ株を、ｍＴｅＳＲ１中でフィーダーフリーで増殖させた（図５２）。完全に限定された無血清のＣＤＭ２基本培地中、フィーダーフリーで分化が行なわれた。分化の前に、集密なｈＰＳＣ培養物を、ヒトフィブロネクチン又はMatrigelのいずれかで被覆された新しいプレート上でコラゲナーゼIV（典型的には、１：３の分割比）を用いて小塊として継代した。ｍＴｅＳＲ１中に回収した１〜２日後、ｈＰＳＣをＦ１２（Gibco社）で洗浄して、全てのｍＴｅＳＲ１を排出させ、次いで、ＣＤＭ２中のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ、R&D Systems社）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ、Stemgent社）、及びＰＩ−１０３（５０ｎＭ、Tocris社）で２４時間処理して、ＡＰＳを特定した。その後、細胞を洗浄（Ｆ１２）した後、ＣＤＭ２中のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）及びＬＤＮ−１９３１８９／ＤＭ３１８９（２５０ｎＭ、Stemgent社）で４８時間処理して、３日目までにＤＥを生成させた。培地を２４時間毎に新しくした。

【0133】

７日目までその後４日間、ＤＥをＡＦＧ（Ａ−８３−０１、１μＭ及びＤＭ３１８９、２５０ｎＭ）、ＰＦＧ（ＲＡ、２μＭ及びＤＭ３１８９、２５０ｎＭ）、又はＭＨＧ（ＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍＬ；ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ；及びＦＧＦ２、１００ｎｇ／ｍＬ）のいずれかに前後パターン化させた。

【0134】

ＳＲ１中での胚体内胚葉の定義された前後パターン化
３日目のＤＥを、ＣＤＭ２中での継続的分化の４日目までにＡＦＧ、ＰＦＧ、又はＭＨＧにパターン化させた。ＤＥを洗浄（Ｆ１２）した後、以下のように分化させた：ＡＦＧ、Ａ−８３−０１（１μＭ、Tocris社）、及びＤＭ３１８９（２５０ｎＭ）；ＰＦＧ、ＲＡ（２μＭ、Sigma社）及びＤＭ３１８９（２５０ｎＭ）；ＭＨＧ、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ、R&D Systems社）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、及びＦＧＦ２（１００ｎｇ／ｍＬ）、７日目の前後ドメインを得た。

【0135】

ｈＥＳＣ由来肝臓前駆体（ＣＤＭ２＋ノックアウト血清補充（ＫＯＳＲ、１０％ｖ／ｖ、Gibco社）中）を誘導するために、３日目のＤＥを洗浄し、初期ＰＦＧに向かってＤＭ３１８９（２５０ｎＭ）、ＩＷＰ２（４μＭ、Stemgent社）、ＰＤ０３２５９０１（５００ｎＭ、Tocris社）、及びＲＡ（２μＭ）で１日処理した（全て「ＤＩＰＲ」として知られる；４日目）。続いて、細胞を洗浄（Ｆ１２）した後、Ａ−８３−０１（１μＭ）、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＷＰ２（４μＭ）、及びＲＡ（２μＭ）でさらに３日間分化させて、分化の７日目に肝臓前駆体を含有する集団を得た。図２５に詳述されるように、ＤＥからの一過的な１日のＤＩＰＲ処理の原理は、（ｉ）ＰＦＧドメインを区域化するためのＲＡ（Stafford, D., and Prince, V.E. (2002). Retinoic acid signaling is required for a critical early step in zebrafish pancreatic development. Curr Biol 12, 1215-1220）と共に、（ii）ＭＨＧ形成を抑制し、過剰の後方化（posteriorization）を防止するためのＢＭＰ、ＦＧＦ／ＭＡＰＫ及びＷｎｔシグナリングの阻害（それぞれ、ＤＭ３１８９、ＰＤ０３２５９０１及びＩＷＰ２を用いる）を用いることであった。図６３ivに示されるように、ＰＦＧを一時的に特定するための初日のＤＩＰＲ処理は、その後の膵臓発生を増強する。

【0136】

ＣＤＭ２基本分化培地の調製
１ｍｇ／ｍＬのポリビニルアルコール（Sigma社、Ａ１４７０又はEuropa Bioproducts社、ＥＱＢＡＣ６２）、１％ｖ／ｖの化学規定脂質濃縮物（Gibco社、１１９０５−０３１）、４５０ Ｍのモノチオグリセロール（Sigma社、Ｍ６１４５）、０．７μｇ／ｍＬのインスリン（Roche社、１３７６４９７）及び１５μｇ／ｍＬのトランスフェリン（Roche社、６５２２０２）を添加した、５０％ＩＭＤＭ（Gibco社）及び５０％Ｆ１２（Gibco社）を含むＣＤＭ２を滅菌濾過（２２μｍフィルター、Millipore社）し、２週間以内の分化のために用いた。化合物及び組換え増殖因子を添加して、上記のような異なるステップの分化を惹起した。ＡＰＳ、ＤＥ、ＡＦＧ、ＰＦＧ、及びＭＨＧへのｈＥＳＣ分化を、ＣＤＭ２のみの中で行った。初期ＰＦＧ（ＤＩＰＲ）へのｈＥＳＣ分化並びにその後の肝臓前駆体分化のために、１０％ｖ／ｖのＫＯＳＲを添加したＣＤＭ２を用いて細胞生存を補助した。

【0137】

別の系列への分化
ＡＦＢＬｙ（Touboul, T., Hannan, N.R.F., Corbineau, S., Martinez, A., Martinet, C., Branchereau, S., Mainot, S., Strick-Marchand, H., Pedersen, R., Di Santo, J., et al. (2010). Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology 51, 1754-1765）又は血清（D'Amour, K.A., Agulnick, A.D., Eliazer, S., Kelly, O.G., Kroon, E., and Baetge, E.E. (2005). Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol 23, 1534-1541）を用いるＤＥに向かうｈＥＳＣ分化を、以前に記載のように実行した。ＡＦＢＬｙについては、ｈＥＳＣを簡単に洗浄（Ｆ１２）した後、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）、及びＬＹ２９４００２（１０μＭ）で３日連続で同時に処理した。血清分化については、ｈＥＳＣを簡単に洗浄（Ｆ１２）した後、増加する量のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）−それぞれ、０％（１日目）、０．２％（２日目）、及び２％（３日目）ｖ／ｖと組み合わせた、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）で３日連続で持続的に処理した。ＳＲ１との直接比較のために、ＡＦＢＬｙ又は血清のいずれかにおける分化を、ＣＤＭ２基本培地中で行った。

【0138】

運命相互変換分化実験
前腸分化能実験（図１８）のために、３日目のＤＥを洗浄（Ｆ１２）し、ＡＦＧ（Ａ−８３−０１＋ＤＭ３１８９）又はＰＦＧ（ＲＡ＋ＤＭ３１８９）に１〜２日間、一過的に分化させた後、再度洗浄（Ｆ１２）し、続いて、さらに３日間、膵臓又は肝臓系列のいずれかに分化させた（上記のように）。

【0139】

ＲＮＡ抽出、逆転写、及び定量的ＰＣＲ
数分にわたって３５０μＬのＲＬＴバッファーを添加することにより、１２穴プレートの個々のウェル中で増殖させた付着細胞からＲＮＡは回収された。ＲＮＡは−８０℃で無期限に凍結するか、又は直接抽出することができた。ＲＮＡ抽出物はRNeasy Micro Kit（Qiagen社）にて行い、通常は製造業者の推奨通り、残留するゲノムＤＮＡを除去するために中間の１時間はカラム上でＤＮａｓｅ消化を行い、ＲＮＡは最終的に３０μＬのＨ２Ｏ中でカラムから溶出された。全ＲＮＡ濃度の評価後、通常は１００〜５００ｎｇの全ＲＮＡが、製造業者の説明書通りに逆転写（SuperScript Reverse Transcriptase、Invitrogen社）のために用いられた。最後に、ｃＤＮＡはＨ２Ｏ中で１：３０に希釈され、３８４穴ハイスループット形式でのｑＰＣＲのために用いられた。ウェルあたりそれぞれ個々のｑＰＣＲ反応液（１０μＬ）について、５μＬの2X SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems社）を使用し、０．４μＬの組み合わせたフォワード及びリバースプライマーミックスと混合した（組み合わせたプライマーミックス中、１０μＭのフォワード＋リバースプライマー）。ｑＰＣＲをＴｍ＝６０℃で４０サイクル行い、反応の終わりに解離曲線を生成して、プライマー対あたりただ１つの生成物が特異的に増幅されたことを確保した。ｄｄＣｔ法によりｑＰＣＲ分析を行った：それぞれのｃＤＮＡ試料について、実験遺伝子の発現を、その同じｃＤＮＡ試料のヒトハウスキーピング遺伝子（Ｐｂｇｄ）の発現に対して内部的に正規化した後、実験遺伝子の発現を、異なるｃＤＮＡ試料間で決定することができた。全ての分化した集団について、実験遺伝子の発現を、同じ実験セットのために塗布した未分化のｈＥＳＣと比較して、遺伝子発現の任意の気付かれた増加又は低下が未分化のｈＥＳＣ中でのその遺伝子のアブイニシオ（ab initio）の発現と有意に比例することを確保した。かくして、マトリックス（図１〜４）とヒストグラム（図３９〜６５）の両方における全てのｑＰＣＲデータについて、全ての遺伝子発現は、ｈＥＳＣ中での遺伝子（例えば、ＳＯＸ１７の）発現のレベル＝１となるように正規化される。それぞれの実験について、条件あたりの少なくとも２つの異なるウェルを回収し、それぞれのウェルについて、２又は３の技術的反復を、それぞれの遺伝子について実施し、その発現をｑＰＣＲにより分析した。

【0140】

「未定」の値に４０のＣＴ値を割り当て、かくして、その遺伝子の発現の保存的過剰評価を提供し、かくして、未定値と決定された値に達した試料との倍数機会（fold chance）を保存的に過少評価した。全てのｑＰＣＲプライマー対（表１に提供される配列）を、ｑＰＣＲ産物の増幅の直線性を確保するために広く検証した。

【0141】

【表1】

【0142】

細胞運命分岐の基礎となる発生シグナリング論理を推定するために、シグナリング摂動行列（図１〜２３）を作成して、様々なシグナリング摂動（列）に応答する発生遺伝子発現（行）のｑＰＣＲデータを視覚的に表した。シグナリング摂動行列を、GenePatternのHeatMapViewerモジュール（http://genepattern.broadinstitute.org）を用いて、上記のような未分化のｈＥＳＣ中での発生遺伝子発現のレベルに対して正規化されたシグナリング摂動ｑＰＣＲ応答の入力データ行列として用いて作成した。HeatMapViewerにおいて、遺伝子発現値を色に直線的に変換し（それぞれの行列の下の色の凡例により示される）、無色は低い遺伝子発現を表し、より強い色はより高い遺伝子発現を表し、最も強い影の色はその行列中で試験された全てのシグナリング摂動において発現された遺伝子の最も高いレベルと等しい。

【0143】

単一細胞ｑＰＣＲ
個々の未分化のＨ７ ｈＥＳＣ又はＳＲ１、ＡＦＢＬｙ若しくは血清レジメンにより４８時間分化させたものを、マウスピペットを用いて手動で採取した（全体で合計８０個の細胞について、条件あたり２０個の細胞）。次いで、それらを溶解させ、個々の細胞からのＲＮＡを逆転写し、CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit（Life Technologies社、１１７５３−５００）を用いてプールされた特異的プライマー対（Ａｃｔｂ、Ｙｕｈａｚｉ、Ｐｂｇｄ、Ｂｌｉｍｐ１、Ｆｏｘａ２、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｈｉｓａ２、Ｍｉｘｌ１、Ｇａｔａ４、Ｍｅｓｐ２、Ｐｄｇｆｒα、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＰｒｄｍ１４のため；表２）を用いる予備増幅を対象とした。

【0144】

【表2】

【0145】

このアッセイの前に、プライマー対を、直線的増幅について、及び鋳型なしの対照（ＮＴＣ、no template control）におけるシグナルの欠如について綿密に検証した。予備増幅後、使用されなかったプライマーを、エキソヌクレアーゼＩ（New England BioLabs社、ＰＮ Ｍ０２９３）を用いる清浄化ステップにおいて除去し、個々の細胞から得られるｃＤＮＡを、示されたプライマー対及びSsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX（Bio-Rad社）を用いるBiomark HD System（Fluidigm社）上のBiomark 96.96 Dynamic Array（Fluidigm社）中でのハイスループットｑＰＣＲのために調製した。続いて、Ｃｔ値を、それぞれの単一細胞に関するＹｕｈａｚｉ発現に対して内部的に正規化し、典型的には、逸脱したハウスキーピング遺伝子発現を示す個々のクローンを下流の分析から排除した。単一細胞のｑＰＣＲデータを、GenePatternのHeatMapViewerモジュール（http://genepattern.broadinstitute.org）を用いる遺伝子発現ヒートマップとして可視化した。有意なＦｏｘａ２レベルを発現する細胞を決定するために、全てのＣｔ値をＹｕｈａｚｉに対して内部的に正規化（全ての細胞についてｄＣｔＹｕｈａｚｉ＝０となるように）した後、６．５未満のｄＣｔＦｏｘａ２を有するいかなる細胞もＦｏｘａ２＋であると見なした。このカットオフで、ｈＥＳＣ（２０／２０）はＦｏｘａ２を発現しなかったが、全てのＳＲ１分化細胞（２０／２０）はＦｏｘａ２を発現し、わずかのＡＦＢＬｙ又は血清により誘導された細胞（それぞれ、１／２０及び２／２０）はＦｏｘａ２を発現した。

【0146】

蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析
６ウェル形式のＳＲ１分化又は未分化ｈＰＳＣを洗浄（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）し、TrypLE Express（Gibco社、６穴プレート中で０．７５ｍＬ／ウェル）で簡単に処理し、激しくタップして細胞を剥離させた。TrypLE中の細胞を収集した後、ウェルをＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋５ｍＭ ＥＤＴＡ）で複数回洗浄して残留する細胞を収集し、完全に粉砕したところ、単一細胞懸濁液が得られた。この細胞懸濁液を遠心分離（５分）し、ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁（個々の染色あたり３０〜５０μＬ）し、暗室中で氷上で３０分間、抗Ｃｘｃｒ４抗体ＰＥ Ｃｙ７（BD Biosciences社、５６０６６９、１：５に希釈）及び／又は抗Ｐｄｇｆｒα抗体ＰＥ（BD Biosciences社、５５６００５、１：５０に希釈）で染色した。続いて、細胞をＦＡＣＳバッファー（個々の染色あたり１．５ｍＬ）で２回洗浄し、遠心分離（５ｍｉｎ）により収集した。最後に、洗浄した細胞をＦＡＣＳバッファー（個々の染色あたり３００μＬ）中に再懸濁し、濾過（４０μｍフィルター、BD Biosciences社）し、ＤＡＰＩで数分染色し（細胞の生存能力を評価するため）、FACSAria II（Stranford Stem Cell Institute FACS Core Facility）上で分析した。デジタル補償を実施して、チャンネル裏抜けについて制御し、蛍光マイナス１（ＦＭＯ、fluorescence minus one）制御に基づいてゲートを綿密に設定した。未分化ｈＰＳＣ及びＳＲ１分化細胞を常に同一に染色し、同じ実験で並行して分析して、抗体染色の特異性を確保した。それぞれ個々の染色につき、最少で１０，０００の事象を分析した後、ＦＳＣ−Ａ／ＳＳＣ−Ａ分析に基づいて事象を解析した；ＦＳＣ−Ｗ／ＦＳＣ−Ｈ、次いで、ＳＳＣ−Ｈ／ＳＳＣ−Ｗ上でのゲーティングにより細胞シングレットを選択し、最後に死滅した細胞をＤＡＰＩ−細胞上でのみのゲーティングにより排除した（図５７に示されるゲーティング戦略）。ＣＤ９０は未分化のｈＰＳＣを同定するため（例えば、（Drukker, M., Tang, C., Ardehali, R., Rinkevich, Y., Seita, J., Lee, A.S., Mosley, A.R., Weissman, I.L., and Soen, Y. (2012). Isolation of primitive endoderm, mesoderm, vascular endothelial and trophoblast progenitors from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol、Tang, C., Lee, A.S., Volkmer, J.-P., Sahoo, D., Nag, D., Mosley, A.R., Inlay, M.A., Ardehali, R., Chavez, S.L., Pera, R.R., et al. (2011). An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nat Biotechnol 29, 829-834））、場合により、細胞を上記のように（図５６）抗ＣＤ９０抗体ＦＩＴＣ（BD Biosciences社、５５５５９５、１：５０に希釈）で同時染色した。

【0147】

ｈＰＳＣ由来ＤＥを、Ｃｘｃｒ４＋Ｐｄｇｆｒα−として、これらの細胞表面マーカーの対応する胎生発現ドメインに基づいて定義した。典型的には、Ｃｘｃｒ４＋のみを用いてｈＰＳＣ分化中のＤＥを割り当てるが（D'Amour, K.A., Agulnick, A.D., Eliazer, S., Kelly, O.G., Kroon, E., and Baetge, E.E. (2005). Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol 23, 1534-1541）、Ｃｘｃｒ４は、胚外及び胚内中胚葉を含む脊椎動物原腸胚中、インビボで胚外内胚葉並びに中胚葉のサブタイプにおいても発現される（Drukker, M., Tang, C., Ardehali, R., Rinkevich, Y., Seita, J., Lee, A.S., Mosley, A.R., Weissman, I.L., and Soen, Y. (2012). Isolation of primitive endoderm, mesoderm, vascular endothelial and trophoblast progenitors from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol、McGrath, K.E., Koniski, A.D., Maltby, K.M., McGann, J.K., and Palis, J. (1999). Embryonic expression and function of the chemokine SDF-1 and its receptor, CXCR4. Developmental Biology 213, 442-456）。かくして、Ｃｘｃｒ４＋のみでは、ｈＰＳＣ分化中のＤＥを正確に定義するには好適ではない（（Drukker, M., Tang, C., Ardehali, R., Rinkevich, Y., Seita, J., Lee, A.S., Mosley, A.R., Weissman, I.L., and Soen, Y. (2012). Isolation of primitive endoderm, mesoderm, vascular endothelial and trophoblast progenitors from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol）により主張されている）。しかしながら、Ｐｄｇｆｒαは、内臓内胚葉と体壁内胚葉の両方を含む胚外内胚葉（移植前及び移植後の両方）において発現され、さらに、Ｐｄｇｆｒαはインビボで初期の胚内中胚葉及び胚外中胚葉において広く発現される（Orr-Urtreger, A., Bedford, M.T., Do, M.S., Eisenbach, L., and Lonai, P. (1992). Developmental expression of the alpha receptor for platelet-derived growth factor, which is deleted in the embryonic lethal Patch mutation. Development 115, 289-303、Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., and Hadjantonakis, A.-K. (2008). Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development 135, 3081-3091）。かくして、Ｃｘｃｒ４＋Ｐｄｇｆｒα−は同時に、潜在的な中胚葉又は胚外内胚葉を排除することによりＤＥをより正確に説明する。

【0148】

ＡＰＳ及びＤＥ分化効率を正確に定量するために、蛍光リポーターが相同組換えにより示された遺伝子座に導入された、ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ ＨＥＳ３（Davis, R.P., Ng, E.S., Costa, M., Mossman, A.K., Sourris, K., Elefanty, A.G., and Stanley, E.G. (2008). Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood 111, 1876-1884）及びＳＯＸ１７−ｍＣＨＥＲＲＹ Ｈ９ノックインリポーター株（以下に記載）をそれぞれ用いた。ＳＲ１中での分化の２４時間後（ＡＰＳ）又はＳＲ１中での分化の４８時間後（ＤＥ）、分化及び未分化リポーターｈＥＳＣを単一の細胞中で解離させ、上記のようにフローサイトメトリーにより分析した。それぞれの分化処理後のＭＩＸＬ１−ＧＦＰ＋又はＳＯＸ１７−ｍＣＨＥＲＲＹ＋細胞の数を決定するために、並行して分析した未分化ｈＥＳＣ中でのこれらのリポーターの発現に基づいてゲーティングを綿密に設定した：全ての例において、１〜２％未満の未分化ｈＥＳＣがＭＩＸＬ１−ＧＦＰ＋又はＳＯＸ１７−ｍＣＨＥＲＲＹ＋となるようにゲートを設定した。

【0149】

Ｓｏｘ１７^{ｍＣＨＥＲＲＹ／ｗ}ｈＥＳＣリポーター株の作成
ＳＯＸ１７−ｍＣＨＥＲＲＹ標的化ベクターは、Ｓｏｘ１７翻訳開始部位のすぐ上流に位置するゲノム配列、ｍＣＨＥＲＲＹをコードする配列（Shaner, N.C., Campbell, R.E., Steinbach, P.A., Giepmans, B.N.G., Palmer, A.E., and Tsien, R.Y. (2004). Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol 22, 1567-1572）、ｌｏｘＰに隣接するＰＧＫ−Ｎｅｏ抗生物質耐性カセットを包含する８．３ｋｂの５’ホモロジーアーム及び３．６ｋｂの３’ＳＯＸ１７ホモロジーアーム（L Azolla, EG Stanley and AG Elefanty、未公開の結果）を含んでいた。Ｈ９ ｈＥＳＣ株に、線状化ベクターをエレクトロポレーションし、ＰＣＲに基づくスクリーニング戦略を用いて同定されたクローンを正確に標的化した（Costa, M., Dottori, M., Sourris, K., Jamshidi, P., Hatzistavrou, T., Davis, R., Azzola, L., Jackson, S., Lim, S.M., Pera, M., et al. (2007). A method for genetic modification of human embryonic stem cells using electroporation. Nature Protocols 2, 792-796）。抗生物質耐性カセットを、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて切り出した。用いたＳＯＸ１７^{ｍＣＨＥＲＲＹ／ｗ}ｈＥＳＣリポーター株（本明細書を通してＳＯＸ１７−ｍＣＨＥＲＲＹと呼ぶ）を、ＦＡＣＳにより選別された細胞の集団上でのＳＯＸ１７ ＲＮＡ及びタンパク質及びｍＣＨＥＲＲＹ発現の間の相関を証明することにより検証した（L Azolla, ES Ng, EG Stanley and AG Elefanty、原稿準備中）。

【0150】

ディープトランスクリプトームシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）
それぞれの系列の全細胞ＲＮＡを上記のように抽出し（RNeasy Micro Kit、Qiagen社）、１μｇの全ＲＮＡを用いて、それぞれ個々のＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを調製した。ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーの構築を、TruSeq RNA Library Preparation Kit（Illumina社）を用いて製造業者の説明書通りに行った。簡単に述べると、全ＲＮＡを２回、ポリＡ選択し、化学誘導及び熱誘導切断により３００〜５００ｂｐに断片化し、末端修復し、３’アデニル化した。その後、アダプターライゲーションを行い、ライブラリーを、アダプターに対するプライマーによりＰＣＲ増幅した（１５サイクル）。ライブラリー構築の後、挿入物のサイズをオンチップ電気泳動（Agilent Bioanalyzer）により評価し、読取り可能な断片を、アダプターに対するプライマーを用いるｑＰＣＲにより定量した。個々のＨｉ−Ｓｅｑレーンあたり２つのＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーが評価されるように、ライブラリーを多重化した。Genome Institute of Singapore's Solexa GroupによりHi-Seq 2000（Illumina社）上で１ｘ３６＋７サイクル（１回の読取り、多重化ライブラリーの３６ｂｐの挿入物、アダプターバーコード同定のための７ｂｐ）でハイスループット配列決定を行った。ＲＮＡ−ｓｅｑ読取りを、TopHat（Trapnell, C., Pachter, L., and Salzberg, S.L. (2009). TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics 25, 1105-1111）を用いてｈｇ１９ヒト参照ゲノムに対してマッピングした。整列された読取りを集合させ、ＦＰＫＭ（１００万のマッピングされた読取りあたりエクソン１キロベースあたりの断片）をCufflinksを用いて算出した。１を超えるＦＰＫＭの発現値を有する遺伝子を、その後の分析のために選択した。ＦＰＫＭ値を対数変換［ｌｏｇ２（ＦＰＫＭ＋１）］し、系列特異的遺伝子を全系列にわたって２を超えるｌｏｇ２（ＦＰＫＭ＋１）と定義した（図２４）。ライブラリー配列決定統計値を図７０に提供する。

【0151】

マイクロアレイ分析
それぞれの生物学的条件につき、４つの生物学的反復物をｈＥＳＣ分化（ＨＥＳ３ ｈＥＳＣ株）により産生し、ＲＮＡを抽出し（RNeasy Micro Kit、上記の通りQiagen社）、ＲＮＡの品質をBioanalyzerオンチップ電気泳動（Agilent社）により評価した。９．５を超えるＲＮＡ完全性（ＲＩＮ、RNA integrity）値を有する試料のみを、マイクロアレイ分析のために使用し、最終的に最も高いＲＮＡ品質の３つの生物学的反復物をマイクロアレイ分析のために選択し、Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 ArrayへのハイブリダイゼーションによりStanford PAN Microarray Core（Elizabeth Guo）により行った。生データ（．ｃｅｌファイル）をエクスポートし、Broad Institute's GenePatternオンラインプラットフォーム（http://genepattern.broadinstitute.org）にアップロードし、変換し（ExpressionFileCreatorモジュール）、予備プロセッシングし（PreprocessDatasetモジュール、フロア閾値＝２０、天井閾値＝２０，０００、試験したデータセット間の最小倍数変化＝３）、そのヒートマップを作出した（HeatMapViewerモジュール）。

【0152】

独立実験により行われるＨ９ ｈＥＳＣ株におけるＡＦＢＬｙ分化の分析のために（Touboul, T., Hannan, N.R.F., Corbineau, S., Martinez, A., Martinet, C., Branchereau, S., Mainot, S., Strick-Marchand, H., Pedersen, R., Di Santo, J., et al. (2010). Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology 51, 1754-1765）、その試験からの生のマイクロアレイデータをArrayExpressレポジトリ（http://www.ebi.ac.uk/microarray-as/ae/、受託番号Ｅ−ＭＥＸＰ−２３７３）からダウンロードし、GeneSpring GXソフトウェアを用いて分析した。生のマイクロアレイデータを正規化し、標準的な手順通りにプロセッシングし、最後に、少なくとも１つの集団中で最小に発現されるマイクロアレイにより検出される全ての遺伝子のうち、未分化のＨ９ ｈＥＳＣ及びＡＦＢＬｙにより分化したｈＥＳＣの発現データを比較した。ＡＦＢＬｙにより分化したｈＥＳＣと未分化のｈＥＳＣとの間で示差的に発現された遺伝子（２．０倍を超える変化）を列挙し、ＡＦＢＬｙにより上方調節された遺伝子の機能を、バックグラウンド「ＨｕｍａｎＲｅｆ−８＿Ｖ３＿０＿Ｒ２＿１１２８２９６３＿Ａ」の下で遺伝子オントロジー用語のＤＡＶＩＤ／ＥＡＳＥ割当てにより公平に確認した（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）。

【0153】

免疫化学
付着細胞をＰＢＳ（Gibco社）で１回洗浄し、室温で１５分間、４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）中で固定し、２回洗浄した（ＰＢＳで）。固定された細胞を、４℃で１時間、遮断溶液（ＰＢＳ中の５％ロバ血清＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）中で同時に遮断し、透過処理し、２回洗浄した（ＰＢＳ）。一次抗体染色を、４℃で一晩、遮断バッファー中に希釈した一次抗体を用いて行った。その後、細胞を２回洗浄した（ＰＢＳ）。二次抗体染色を、４℃で１時間、遮断バッファー中で行った。その後、二次抗体を除去し、核対抗染色を室温で５分間、ＤＡＰＩ（Invitrogen Molecular Probes社、ＰＢＳ中で希釈）を用いて行った。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄して、過剰の抗体及びＤＡＰＩを除去し、Zeiss Observer D1を用いて蛍光顕微鏡観察を行った。抗体及び有効濃度を表３に提供する。

【0154】

【表3】

【0155】

ウェスタンブロッティング
試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に移した（４℃で１００Ｖ、１時間）。膜を室温で１時間、ＴＢＳＴ＋５％ミルク中で遮断した後、室温で１時間、ヤギ抗Ｓｏｘ１７（R&D Systems社、ＡＦ１９２４）又はマウス抗Ｆｏｘａ１（Abcam社、ａｂ５５１７８）一次抗体（１：１０００）又は抗β−アクチン（Santa Cruz社、１：５０００）一次抗体と共にインキュベートした。β−アクチンを、内部ローディング対照として用いた。膜をＴＢＳＴ中で５回洗浄し、ヤギ抗マウス（Jackson ImmunoResearch社、１：５０００）又はロバ抗ヤギ（Santa Cruz社、１：２０００）ＨＲＰコンジュゲートＩｇＧ二次抗体と共に１時間インキュベートした。ＴＢＳＴ中で洗浄した後、タンパク質をECL Prime（GE Healthcare社）を用いて検出した。

【0156】

ｈＥＳＣ由来肝臓子孫の移植及びその後の分析
Ｈ７ ｈＥＳＣに、構成的に活性なＣＡＧ−ＧＦＰベクターを安定にトランスフェクトして、ＧＦＰを用いてそれら及びその子孫を消えないように標識した。ＳＲ１を用いて、それらを上記のように初期のＡｆｐ＋肝臓前駆体に分化させ（分化の６〜７日目）、又はその後、１２日間のさらなる経験的な分化：２日間のＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）、次いで、さらに１０日間のデキサメタゾン（Sigma社、１０μＭ）及びオンコスタチンＭ（１０ｎｇ／ｍＬ、R&D Systems社）を用いてより後の肝臓子孫に分化させた。初期のｈＥＳＣ分化前駆体又はより後の肝臓子孫を、単一の細胞に解離させ、５０，０００〜１００，０００個の細胞を以前に記載のように（Chen, Q., Khoury, M., Limmon, G., Choolani, M., Chan, J.K., and Chen, J. (2013). Human Fetal Hepatic Progenitor Cells Are Distinct from, but Closely Related to, Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Stem cells (Dayton, Ohio)）、新生児マウスの肝臓に移植した。簡単に述べると、新生児免疫不全ＮＯＤ−ＳＣＩＤ Ｉｌ２γｒ^−／−マウス（遺伝的に限定されたものではなく）を、亜致死的に照射し（１００ｒａｄ）、肝細胞を誕生の２４時間以内に肝臓に直接移植した。２〜３カ月後、血清を、ヒトアルブミンの存在についてＥＬＩＳＡにより分析し（（Chen, Q., Khoury, M., Limmon, G., Choolani, M., Chan, J.K., and Chen, J. (2013). Human Fetal Hepatic Progenitor Cells Are Distinct from, but Closely Related to, Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Stem cells (Dayton, Ohio)）により記載のように）、マウスを屠殺した。レシピエントの肝臓を固定（ホルマリン）し、包埋（パラフィン）した後、切片化し、ウサギ抗ヒトアルブミン抗体（Abcam社、ａｂ２４０６）、マウス抗ＧＦＰ抗体（Santa Cruz Biotechnology社、ｓｃ−９９９６）、マウス抗ＨｅｐＰａｒ１抗体（Abcam社、ａｂ７２０）又はウサギ抗Ａｆｐ抗体（Sigma社、ＨＰＡ０１０６０７）で染色して、レシピエント肝臓実質中のｈＥＳＣ由来肝臓子孫を検出した。ｈＥＳＣ由来初期肝臓前駆体又はより後の分化した肝細胞を移植したマウスにおけるヒトアルブミン血清濃度間の統計的有意性を、両側Whitney-Mann検定により評価した（図２３）。

【0157】

しかしながら、図６７について、抗ＧＦＰ抗体染色を、ウサギ抗ＧＦＰ抗体（Abcam社、ａｂ２９０）を用いて行った：これは、抗ヒトアルブミン抗体はウサギのバックグラウンドでも上昇し、両マーカーに関する同時染色を同時に実施することができず、むしろ、連続切片がそれぞれ対応する抗体で染色されたためである。

【0158】

低密度リポタンパク質（ＬＤＬ、low-density lipoprotein）取込みアッセイ
ｈＥＳＣ、ＨｅｐＧ２細胞又はｈＥＳＣ由来肝臓子孫を、ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を添加して２４時間、その対応する基本培地中でインキュベートした後、ＬＤＬを取り込むその能力を、LDL Uptake Cell-Based Assay Kit（Cayman Chemical社、１００１１１２５）を用いて評価した。簡単に述べると、１：１００のLDL-DyLight 594を、３７℃で３時間、３つ全ての細胞集団の対応する基本培地に添加した。ＬＤＬ染色を示さない陰性対照を同じ方法で処理したが、LDL-DyLight 594は添加しなかった。その後、細胞を固定し、抗ＬＤＬＲ抗体を４℃で一晩インキュベートしたこと以外は、製造業者の説明書（Cayman Chemical社）に従ってＬＤＬＲについて染色した。細胞を蛍光顕微鏡により可視化して、蛍光LDL-Dylight 594の取込み及びまた免疫蛍光によるＬＤＬＲ発現を評価した。

【0159】

Ｃｙｐ３ａ４代謝アッセイ
発光アッセイにおいてＣｙｐ３ａ４酵素活性を決定するために、ｈＥＳＣ、ＨｅｐＧ２細胞又はｈＥＳＣ由来肝臓子孫を簡単に洗浄し（ＰＢＳ）、次いで、３７℃で３０〜６０分間、３μＭの生物発光Ｃｙｐ３ａ４基質ルシフェリン−ＩＰＡ（Promega社）を含有するその対応する基本培地で処理した。続いて、２５μＬの培地を、９６穴不透明なルミノメータープレートの別々のウェルに移し、ウェルあたり２５μＬのルシフェリン検出試薬（Promega社）を添加し、プレートを暗室中で２０分間インキュベートした。ルミノメーター（Promega GloMax社、Ｅ９０３１）を用いて、発光を記録した。ルシフェリン−ＩＰＡ基質を含む基本培地のみを含有する陰性対照ウェルも記録して、技術的バックグラウンドを決定した。

【0160】

次いで、Ｃｙｐ３ａ４発光シグナルを、CellTiter-Gloキット（Promega社）を用いて決定された、各アッセイにおいて用いられた生細胞数に対して正規化した。簡単に述べると、ｈＥＳＣ後、ＨｅｐＧ２細胞又はｈＥＳＣ由来子孫を、ルシフェリン−ＩＰＡを含有する基本培地で処理し、２５μＬの培地を、９６穴乳白色ルミノメータープレートの別々のウェルに移し、２５μＬのCellTiter-Glo Reagentを各ウェルに添加した。２分間インキュベートした後、上記のようにルミノメーターを用いて発光を測定し、Ｃｙｐ３ａ４発光アッセイ値（上記）を、CellTiter-Gloアッセイ値で除算して、正規化されたＣｙｐ３ａ４活性結果を得た。正規化されたＣｙｐ３ａ４活性結果を、未分化のｈＥＳＣから得られたものと比較して提示する。

【0161】

クロマチン免疫沈降及び配列決定（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）
付着細胞を洗浄し（ＰＢＳ）、ＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒド中で固定し（１０ｍｉｎ）、０．２Ｍグリシンで中和し（５ｍｉｎ）、擦り取ることにより収集し、洗浄し（完全プロテアーゼインヒビター（Roche社）を添加した冷ＰＢＳ）し、ペレット化し、フラッシュ凍結し（液体Ｎ２）、保存した（−８０℃）。免疫沈降の前に、固定された細胞ペレットを解凍し、１％ＳＤＳ溶解バッファー（１Ｘ完全プロテアーゼインヒビターを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％Ｎａデオキシコレート、１％ＳＤＳ）中でそれぞれ３０分間で２回溶解して、核を抽出し、予め冷却したNext-Gen Bioruptor（Diagenode社）を含む１％ＳＤＳ溶解バッファー中で高い強度で１０サイクル（３０秒間のオン、６０秒間のオフ）にわたって超音波処理した。超音波処理効率を評価するために、少量の超音波処理されたクロマチンを、プロテイナーゼＫ（１時間、５０℃）で消化し、カラム精製し、電気泳動して、超音波処理が成功した（サイズ１００〜３００ｂｐの断片）ことを確認した。超音波処理されたクロマチンをｃｈＩＰ希釈バッファー（０．０１％ＳＤＳ、１．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１６．７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．１、及び１６７ｍＭ ＮａＣｌ）中で１０倍に希釈して、免疫沈降のための有効な約０．１％ＳＤＳ濃度を得て、遠心分離（１３，２００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して、細胞破片を除去し、プロテインＧ Dynabeads（Invitrogen社）を用いて一晩予備清浄した。

【0162】

同時に、それぞれ個々のｃｈＩＰについて、１００μＬのプロテインＧ Dynabeadsを２回洗浄し（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、４℃で一晩、ＣｈＩＰ正規抗体（表４）と複合体化し、さらに３回洗浄して、抗体−ビーズ複合体を得た。抗体−ビーズ複合体を予備清浄したクロマチンに添加した。

【0163】

【表4】

【0164】

一晩免疫沈降させた後（４℃）、抗原−抗体−ビーズ複合体を、それぞれ、低塩洗浄バッファー（０．１％ＳＤＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、高塩洗浄バッファー（０．１％ＳＤＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ）、ＬｉＣｌ洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ ＬｉＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）、最後に、ＴＥバッファー中で２回洗浄した。抗体をビーズから溶出させ、穏和な加熱（６５℃）により一晩、ホルムアルデヒド架橋を逆転させ、クロマチンをＲＮａｓｅ及びプロテイナーゼＫで連続的に処理した後、最後のカラム精製を行った。免疫沈降したクロマチンの最終濃度を、PicoGreen（Invitrogen社）により定量した。

【0165】

Illumina社の配列決定ライブラリーを、TruSeq ChIP Sample Preparation Kit（Illumina社）を用いて作成した。簡単に述べると、１０ｎｇのＣｈＩＰ富化ＤＮＡを末端修復し、３’アデニル化し、Illuminaアダプターを用いてライゲーションし、アダプターに対するプライマーと共にPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（Finnzymes社）を用いる１５サイクルのＰＣＲ増幅により増幅した。ライブラリー構築が完了した後、オンチップ電気泳動（Agilent Bioanalyzer）により挿入物のサイズを再検証し、読取り可能な断片を、アダプターに対するプライマーを用いるｑＰＣＲにより定量した。Genome Institute of Singapore's Solexa GroupによりHi-Seq 2000（Illumina社）上で１ｘ３６＋７サイクル（１回の読取り、多重化ライブラリーの３６ｂｐの挿入物、アダプターバーコード同定のための７ｂｐ）でハイスループット配列決定を行った。配列決定された読取りを、Bowtie（Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., and Salzberg, S.L. (2009). Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol 10, R25）を用いてｈｇ１９ヒト参照ゲノムに対してマッピングし、３ｂｐまでの不一致を許容し、１より多いゲノム遺伝子座に対してマッピングされる読取りを廃棄した。それぞれの整列された断片を２００ｂｐまで伸長させ、ＭＡＣＳ（Zhang, X., Huang, C.T., Chen, J., Pankratz, M.T., Xi, J., Li, J., Yang, Y., Lavaute, T.M., Li, X.-J., Ayala, M., et al. (2010). Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell 7, 90-100）を用いて入力正規化を行った。Broad Institute社からのIntegrative Genomics Viewerを用いて、ヒストンピーク可視化を行った（Thorvaldsdottir, H., Robinson, J.T., and Mesirov, J.P. (2012). Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform）。ライブラリー配列決定統計値を図２０に提供する。

【0166】

ＣｈＩＰ−ｓｅｑ分析中のエンハンサーの割当て及び分析
活性エンハンサーを、DFilter（Kumar, V., Muratani, M., Rayan, N.A., Kraus, P., Lufkin, T., Ng, H.H., and Prabhakar, S. (2013). Uniform, optimal signal processing of mapped deep-sequencing data. Nature Biotechnology 31, 615-622）を用いて整列され、入力正規化されたＨ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータから割り当てた。シグナル検出問題としてＣｈＩＰ−ｓｅｑデータからピークコーリングを処理することにより、DFilterは、変動する幅のＣｈＩＰ−ｓｅｑピークを同定するためにシグナルプロセッシング理論からの最適な解を正式に用いる。簡単に述べると、DFilterは、「真」陽性領域とノイズ領域とのＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナル差異を最大化するために線形検出フィルター（Ｈｏｔｅｌｌｉｎｇオブザーバー）を用いることによって受信者操作特性面積−曲線下面積（ＲＯＣ−ＡＵＣ、receiver area characteristic-area under the curve）を最大化することを試みることによりＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナル中のピークを検出する。６ｋＢのカーネルサイズ及びゼロ平均フィルターを用いて、６つの細胞型（ｈＥＳＣ、ＡＰＳ、ＤＥ、ＡＦＧ、ＰＦＧ、及びＭＨＧ）のそれぞれにおいてDFilterによりＨ３Ｋ２７ａｃピークを個々に同定し、全てのピークが、対応する入力ライブラリービン（対照局所タグ密度）におけるよりも、少なくとも１つの１００ｂｐビンにおいて１５倍以上のＨ３Ｋ２７ａｃタグを有することが必要であった。ｃｈｒ＿ｒａｎｄｏｍコンティグ、部分重複、サテライトリピート及びリボソームＲＮＡリピートにマッピングされるピークを除去した。その後、任意のＲｅｆＳｅｑ ＴＳＳ又はＵＣＳＣ Ｋｎｏｗｎ Ｇｅｎｅ ＴＳＳの１ｋＢ以内にあるピークを切り取り、遠位ピークを得た。次いで、６つの細胞型のそれぞれに由来する重複する遠位Ｈ３Ｋ２７ａｃピークを融合させ、試験した少なくとも１つの系列において活性な全てのエンハンサーの融合体を得た。この活性エンハンサー融合の結果を、図２６中に、バイナリークラスタリングの後に表示した。

【0167】

「細胞型特異的活性エンハンサー」（例えば、ＤＥ特異的活性エンハンサー）を同定するために、エンハンサーは、所与の系列（例えば、ＤＥ）と未分化のｈＥＳＣにおいてピーク領域内に４倍以上多いＨ３Ｋ２７ａｃタグを有する必要があった（かくして、分化の際に有意な量のＨ３Ｋ２７ａｃを獲得するエンハンサーを同定する）。次いで、１０，５４３の「ＤＥ特異的活性エンハンサー」のこのコホートを、遺伝子オントロジー及びモチーフ分析のために用いた。

【0168】

内胚葉特異的活性エンハンサーと関連する遺伝子オントロジー用語を、ＧＲＥＡＴにより確認した（McLean, C.Y., Bristor, D., Hiller, M., Clarke, S.L., Schaar, B.T., Lowe, C.B., Wenger, A.M., and Bejerano, G. (2010). GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nat Biotechnol 28, 495-501）：それぞれのエンハンサーについて、１００ｋＢ以内の最も近い遺伝子を用いた（ＴＳＳから１ｋＢ上流又は２ｋＢ下流のエレメントを除去する「ベーサルプラス伸長」）。図２８中に、最も有意に関連するＧＯ用語（生物学的プロセス及びＭＧＩ発現）を記載し、任意の用語の以前の予備選択又は予備フィルタリングなしにオンラインＧＲＥＡＴポータル（http://bejerano.stanford.edu/great/public/html/）上に示されたようにＰ値により順位付けた。

【0169】

内胚葉エンハンサーの平均進化的保存を、図３０に示されるようなエンハンサー中心の周囲の±３ｋＢのウィンドウ内でＣｉｓｔｒｏｍｅのＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｐｌｏｔ関数（http://cistrome.org/ap/）を用いて評価した。

【0170】

ＤＥ特異的エンハンサー中で富化された転写因子モチーフを、ＨＯＭＥＲ（Heinz, S., Benner, C., Spann, N., Bertolino, E., Lin, Y.C., Laslo, P., Cheng, J.X., Murre, C., Singh, H., and Glass, C.K. (2010). Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell 38, 576-589）（http://biowhat.ucsd.edu/homer/chipseq/）を用いて決定し、トップ３０ヒット内の代表的な転写因子モチーフを、図３２に示した。

【0171】

内胚葉ＴＦが活性ＤＥエンハンサーにどのように収束するかを理解するために、ＤＥ中のＥｏｍｅｓ、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ４及びＦｏｘｈ１ ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータ（Kim, S.W., Yoon, S.-J., Chuong, E., Oyolu, C., Wills, A.E., Gupta, R., and Baker, J. (2011). Chromatin and transcriptional signatures for Nodal signaling during endoderm formation in hESCs. Developmental Biology 357, 492-504、Teo, A.K.K., Arnold, S.J., Trotter, M.W.B., Brown, S., Ang, L.T., Chng, Z., Robertson, E.J., Dunn, N.R., and Vallier, L. (2011). Pluripotency factors regulate definitive endoderm specification through eomesodermin. Genes & Development 25, 238-250）をＧＥＯからダウンロードし（それぞれ、ＧＳＥ２６０９７及びＧＳＥ２９４２２）、上記のように整列、入力正規化し、最後にＨＯＭＥＲを用いてピークをコールした。全てのＤＥ ＴＦ ＣｈＩＰ−ｓｅｑピークの融合体を作出し、重複するピークを融合させ、ＲｅｆＳｅｑの１ｋＢ以内にある全てのピークを除去して、全部で５３，９０２の遠位ＤＥ ＴＦ結合部位を得た。ＨＯＭＥＲを用いて、それぞれのＤＥ ＴＦ結合部位の周囲のビン化されたタグ計数を抽出し、ｋ平均クラスタリングを適用して、３つの主要なクラスの結合事象：（ｉ）Ｅｏｍｅｓ結合のみ、（ii）Ｓｍａｄ２／３／４及びＦｏｘｈ１結合、並びに（iii）Ｅｏｍｅｓ、Ｓｍａｄ２／３／４及びＦｏｘｈ１による同時結合を同定し、これを図３３中のＤＥ及びｈＥＳＣ中のＨ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータと一緒に空間ヒートマップ中で可視化した。

【0172】

ＳＲ１により誘導された内胚葉エンハンサーサインと以前の内胚葉エンハンサーサインの比較
アクチビンＡ、Ｗｎｔ３ａ及び０．５％ＦＢＳ処理により４日間分化させたＨＵＥＳ６４由来ＤＥ集団のＣｈＩＰ−ｓｅｑデータは以前に報告されており（Gifford, Casey A., Ziller, Michael J., Gu, H., Trapnell, C., Donaghey, J., Tsankov, A., Shalek, Alex K., Kelley, David R., Shishkin, Alexander A., Issner, R., et al. (2013). Transcriptional and Epigenetic Dynamics during Specification of Human Embryonic Stem Cells. Cell, 1-28）、未分化のＨＵＥＳ６４及びＨＵＥＳ６４由来Ｃｘｃｒ４＋ＤＥに関するＨ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータをダウンロードした（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/roadmap/epigenomics/?view=matrix）。その後、ＨＵＥＳ６４ ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータを、ＳＲ１ ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータについて上記されたのと同一に処理した：Ｈ３Ｋ２７ａｃ読取りをｈｇ１９と整列させ、対応する対照ライブラリーに対して入力正規化した。ＨＵＥＳ６４由来ＤＥ中で富化された活性エンハンサーを同定するために、Ｈ３Ｋ２７ａｃピークをDFilter（Kumar, V., Muratani, M., Rayan, N.A., Kraus, P., Lufkin, T., Ng, H.H., and Prabhakar, S. (2013). Uniform, optimal signal processing of mapped deep-sequencing data. Nature Biotechnology 31, 615-622）により割り当て、ＤＥと未分化ＨＵＥＳ６４におけるＨ３Ｋ２ａｃタグ計数の倍数変化を算出した。上から１０，０００のＤＥ富化エンハンサー（ＤＥと未分化ＨＵＥＳ６４における最も高いＨ３Ｋ２７ａｃの倍数変化を有する）をコールして、偏りのない比較を提供し、ＳＲ１ ＤＥデータセットからの上から１０，０００のＤＥ富化エンハンサーを、未分化のＨＵＥＳ６４に対するＳＲ１ ＤＥ Ｈ３Ｋ２７ａｃタグ計数の倍数変化を比較することによりコールした。続いて、ＳＲ１データセット又はGifford et al.のデータセットから引き出した上から１０，０００のＤＥ富化活性エンハンサーを抽出し、富化されたＧＯ用語を、以下のパラメータ：単一の最も近い遺伝子、１，０００，０００ｂｐの最大伸長及びキュレートされた（curated）調節ドメインを含ませてＧＲＥＡＴ（McLean, C.Y., Bristor, D., Hiller, M., Clarke, S.L., Schaar, B.T., Lowe, C.B., Wenger, A.M., and Bejerano, G. (2010). GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nat Biotechnol 28, 495-501）を用いて対照的に関連させた。この対照ＤＥエンハンサー比較の結果を、図３１に提示する。

【0173】

ｈＥＳＣにおけるプレエンハンサークロマチン状態の同定
ＤＥエンハンサーが分化の前に未分化ｈＥＳＣ中でどのようにマークを付けられるかを確認するために、本発明者らは最初に１０，５４３のＤＥ特異的エンハンサーの上記一覧を予備フィルタリングして、ＴＳＳの±３ｋＢにあるピークを完全に廃棄して、プロモーターシグナルの裏抜けを最小化した。本発明者らは、それぞれ、ＧＥＯ（ＧＳＥ２９６１１）又はＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒダウンロードポータル（http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeBroadHistone）から、２４を超えるマークについてＣｈＩＰ−ｓｅｑデータをダウンロードした：１０のヒストン改変（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１、Ｈ３Ｋ９ａｃ、Ｈ３Ｋ２７ａｃ及びＨ２ＡＺ）（Ernst, J., Kheradpour, P., Mikkelsen, T.S., Shoresh, N., Ward, L.D., Epstein, C.B., Zhang, X., Wang, L., Issner, R., Coyne, M., et al. (2011). Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature 473, 43-49）並びに１４のクロマチン調節因子（Ｃｈｄ１、Ｃｈｄ７、Ｅｚｈ２、Ｈｄａｃ２、Ｈｄａｃ６、Ｊａｒｉｄ１ａ、Ｊｍｊｄ２ａ、ｐ３００、Ｐｈｆ８、Ｐｌｕ１、Ｒｂｂｐ５、Ｓａｐ３０、Ｓｉｒｔ６、Ｓｕｚ１２）（Ram, O., Goren, A., Amit, I., Shoresh, N., Yosef, N., Ernst, J., Kellis, M., Gymrek, M., Issner, R., Coyne, M., et al. (2011). Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell 147, 1628-1639）。全ての可能な「プレエンハンサー」状態を体系的に同定することを目的として、実質的に最も公知のヒストン改変及びクロマチン調節因子によるｈＥＳＣ中のＤＥエンハンサーの占有を包括的に評価するために、これを行った。「プレエンハンサー」クロマチン状態の理路整然としたパターンを同定するために、本発明者らは、クラスタリングのためのＣｈＩＰ−ｓｅｑデータを調製した：所与のエンハンサーでの複数のヒストン改変及びクロマチン調節因子ＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルをクラスター化するために、最初にそれぞれのＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルをエンハンサー領域にわたって２００ｂｐのビン中のタグ計数の形態に分解した。ビン化されたタグ計数シグナルを、全ライブラリー中の平均タグ計数により正規化した。正規化されたタグ計数シグナルの対数を用いて、さらなるクラスタリングのための空間ヒートマップ（図３５）を作製した。それぞれのＣｈＩＰ−ｓｅｑライブラリーについて、エンハンサー中心の１ｋＢ以内にある最大ビン化タグ計数を、２次元（ｎ ｘ ｋ）（ここで、ｎは分析されたＤＥエンハンサーの数であり、ｋは試験したＣｈＩＰ−ｓｅｑライブラリーの総数である）行列の列に示した。この２Ｄ行列をｋ平均クラスタリング（Ｍａｔｌａｂ）のために用いて、プレエンハンサークラスを学習した。プレエンハンサークラスを学習した後、１つの２Ｄ行列（ｎ ｘ ２ｗ）をそれぞれのＣｈＩＰ−ｓｅｑライブラリーについて作製し、行列の行としてそれぞれのエンハンサーの周囲のｗビン中のシグナルを取った。次いで、それぞれのＣｈＩＰ−ｓｅｑライブラリーについて、算出された２Ｄ行列（ｎ ｘ ２ｗ）を、ｉｍａｇｅｓｃ関数（Ｍａｔｌａｂ）を用いてプロットした。ヒストン改変及びクロマチン調節因子の相対的普及を評価するために、ｈＥＳＣ中のＤＥプレエンハンサーの「プレマーキング」、ヒストン改変及びクロマチン調節因子ＥＮＣＯＤＥピークコール（http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeBroadHistone）による全てのＤＥプレエンハンサーの被覆率を確認した（図３６）。容易な視覚的表示のために、ＤＥエンハンサーを約５％を超えてマークしたヒストン改変又はクロマチン調節因子のみを、図３５〜３６に示した。ｈＥＳＣにおける中胚葉プレエンハンサークラスを同定するために、中胚葉活性エンハンサーの一覧を、ＣＤ５６／ＮＣＡＭ１＋ｈＥＳＣ由来中胚葉集団の以前のＨ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰ−ｓｅｑプロファイリングから差し引いたこと以外は、内胚葉プレエンハンサーを評価するために用いたものと同様の手順を用いた（Gifford, Casey A., Ziller, Michael J., Gu, H., Trapnell, C., Donaghey, J., Tsankov, A., Shalek, Alex K., Kelley, David R., Shishkin, Alexander A., Issner, R., et al. (2013). Transcriptional and Epigenetic Dynamics during Specification of Human Embryonic Stem Cells. Cell, 1-28）。

【0174】

ＤＥ分化の際のＤＥ ＴＦによる異なるプレエンハンサークラスの占有を全体的に評価するために、ＤＥにおける平均Ｅｏｍｅｓ、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ４及びＦｏｘｈ１ ＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルを、６ｋＢのウィンドウサイズを用いて全てのクラス１プレエンハンサー（Ｈ２ＡＺのみ）及び全てのクラス５プレエンハンサー（大部分は潜在的）にわたってプロットした（図３７）。

【0175】

ＣｈＩＰ−ｓｅｑ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、及びマイクロアレイデータ寄託
内胚葉分化に関する生のＣｈＩＰ−ｓｅｑ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、及びマイクロアレイデータ（図２０にまとめる）を、ユーザー名「ｒｅｖｉｅｗ１２３」及びパスワード「ｒｅｖｉｅｗ」の下でhttp://collaborations.gis.a-star.edu.sg/~cmb6/kumarv1/endoderm/にオンラインで寄託した。生データは、受託時に公共オンラインリポジトリーにアップロードされる。

【0176】

実験結果
ＢＭＰ及びＷｎｔシグナリングにおける動的スイッチは原始線条を誘導し、続いて胚体内胚葉発生を抑制する
これは、アクチビンが、ＦＧＦ、ＢＭＰ及びＰＩ３Ｋインヒビター（「ＡＦＢＬｙ」）と共に（Touboul, T., Hannan, N.R.F., Corbineau, S., Martinez, A., Martinet, C., Branchereau, S., Mainot, S., Strick-Marchand, H., Pedersen, R., Di Santo, J., et al. (2010). Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology 51, 1754-1765）又は動物血清と一緒になって（D'Amour, K.A., Agulnick, A.D., Eliazer, S., Kelly, O.G., Kroon, E., and Baetge, E.E. (2005). Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol 23, 1534-1541）、ｈＥＳＣからＤＥを特定化するという知見から始まった。しかしながら、これらの方法は、５つのｈＥＳＣ株の分化中に明らかな、混合した系列の結果を依然としてもたらした（図１、図６〜７、図３９〜６１）。例えば、ＡＦＢＬｙ（Touboul, T., Hannan, N.R.F., Corbineau, S., Martinez, A., Martinet, C., Branchereau, S., Mainot, S., Strick-Marchand, H., Pedersen, R., Di Santo, J., et al. (2010). Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology 51, 1754-1765）は同時に中胚葉を生成し、骨格、血管及び心臓遺伝子を上方調節したが（Ｐ＜１０^−８；図１、図３９〜４２）、アクチビン及び血清処理（D'Amour, K.A., Agulnick, A.D., Eliazer, S., Kelly, O.G., Kroon, E., and Baetge, E.E. (2005). Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol 23, 1534-1541）は一定割合の未分化細胞をもたらした（図６〜８）。純粋でない初期ＤＥ集団の作出は、下流分化の後の非内胚葉系列の発生を説明することができる（Kroon, E., Martinson, L.A., Kadoya, K., Bang, A.G., Kelly, O.G., Eliazer, S., Young, H., Richardson, M., Smart, N.G., Cunningham, J., et al. (2008). Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol 26, 443-452、Rezania, A., Bruin, J.E., Riedel, M.J., Mojibian, M., Asadi, A., Xu, J., Gauvin, R., Narayan, K., Karanu, F., O'Neil, J.J., et al. (2012). Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes）。

【0177】

無血清条件におけるｈＰＳＣ分化の特定の胚段階で発生シグナルを選択的に摂動させ（個別に、又は組み合わせて、３，２００を超えるシグナリング条件）、ｑＰＣＲにより得られた系列の結果を評価した（１６，０００を超えるデータ点が得られる、図３９〜６３）。これらのシグナリング摂動は、ＤＥ誘導の基礎となるシグナリング論理の要素を示していた（図１〜２３）。

【0178】

インビボでは、ＤＥは原始線条（ＰＳ、約Ｅ６．５）から生じる（Levak-Svajger, B., and Svajger, A. (1974). Investigation on the origin of the definitive endoderm in the rat embryo. J Embryol Exp Morphol 32, 445-459）。最前部ＰＳ（ＡＰＳ）はＤＥを生成するが（約Ｅ７．０〜Ｅ７．５）、後部ＰＳ（ＰＰＳ）は中胚葉を形成する（Lawson, K.A., Meneses, J.J., and Pedersen, R.A. (1991). Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Development 113, 891-911、Tam, P.P., and Beddington, R.S. (1987). The formation of mesodermal tissues in the mouse embryo during gastrulation and early organogenesis. Development 99, 109-126）。

【0179】

ＡＰＳとＰＰＳは両方とも、ｈＥＳＣ分化の１日目にＢＭＰ、ＦＧＦ及びＷｎｔにより組合せで誘導された。これらのシグナルはＰＳ誘導において個々に関与していたが（Bernardo, A.S., Faial, T., Gardner, L., Niakan, K.K., Ortmann, D., Senner, C.E., Callery, E.M., Trotter, M.W., Hemberger, M., Smith, J.C., et al. (2011). BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell Stem Cell 9, 144-155、Blauwkamp, T.A., Nigam, S., Ardehali, R., Weissman, I.L., and Nusse, R. (2012). Endogenous Wnt signalling in human embryonic stem cells generates an equilibrium of distinct lineage-specified progenitors. Nat Commun 3, 1070、Gadue, P., Huber, T.L., Paddison, P.J., and Keller, G.M. (2006). Wnt and TGF-β signaling are required for the induction of an in vitro model of primitive streak formation using embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 103, 16806-16811）、ＰＳパターン化におけるそれらの役割は詳細に解明されていない。ＢＭＰ、ＦＧＦ又はＷｎｔのいずれかが阻害された場合、ＡＰＳとＰＰＳ形成は両方とも失敗し（図２）、ＢＭＰ及びＷｎｔ経路ノックアウトマウスにおけるＰＳの欠如を裏付けるものである（Beppu, H., Kawabata, M., Hamamoto, T., Chytil, A., Minowa, O., Noda, T., and Miyazono, K. (2000). BMP type II receptor is required for gastrulation and early development of mouse embryos. Dev Biol 221, 249-258、Liu, P., Wakamiya, M., Shea, M.J., Albrecht, U., Behringer, R.R., and Bradley, A. (1999). Requirement for Wnt3 in vertebrate axis formation. Nature Genetics 22, 361-365、Mishina, Y., Suzuki, A., Ueno, N., and Behringer, R.R. (1995). Bmpr encodes a type I bone morphogenetic protein receptor that is essential for gastrulation during mouse embryogenesis. Genes & Development 9, 3027-3037）。ＦＧＦシグナリングはＡＰＳとＰＰＳの両方の発生について同等に許容され、内因性ＦＧＦはいずれかの結果を駆動するのに十分なものであった（図２ｉ、図４７〜４９）。しかしながら、ＰＳ誘導を最大化するためには外因性Ｗｎｔ（Ｗｎｔ３ａ又はＧＳＫ３阻害のいずれか［ＣＨＩＲ］）が必要であり、ＷｎｔはＡＰＳとＰＰＳの両方を広く促進した（図２ii〜iii）。外因性Ｗｎｔがない場合、限られたＰＳ形成が起こり得たが、内因性Ｗｎｔに依存していた（図２ii）。ＢＭＰレベルはＡＰＳとＰＰＳの間を仲裁した：より低い（内因性）ＢＭＰレベルはＡＰＳを惹起したが、より高いＢＭＰはＰＰＳをもたらした（図２iv、図４８）。しかしながら、ＢＭＰは典型的には中胚葉形成と関連していたため（Bernardo, A.S., Faial, T., Gardner, L., Niakan, K.K., Ortmann, D., Senner, C.E., Callery, E.M., Trotter, M.W., Hemberger, M., Smith, J.C., et al. (2011). BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell Stem Cell 9, 144-155）、ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ^＋ＡＰＳ誘導にとってのＢＭＰの絶対的必要性（図４ｉ、Ｐ＜０．０２５）は予想外であった。従って、ＦＧＦ、Ｗｎｔ及び低いＢＭＰは、ＡＰＳ特定化にとって必須であった。

【0180】

ＡＰＳをＤＥに向かってさらに分化させるために、以前の研究は両方の系列を３〜５日間にわたって誘導する同様の因子を用いた（Nostro, M.C., Sarangi, F., Ogawa, S., Holtzinger, A., Corneo, B., Li, X., Micallef, S.J., Park, I.-H., Basford, C., Wheeler, M.B., et al. (2011). Stage-specific signaling through TGFβ family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development 138, 861-871、Touboul, T., Hannan, N.R.F., Corbineau, S., Martinez, A., Martinet, C., Branchereau, S., Mainot, S., Strick-Marchand, H., Pedersen, R., Di Santo, J., et al. (2010). Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology 51, 1754-1765）。その代わりに、ＡＰＳ及びＤＥを、分化の２４時間以内に正反対のシグナルにより連続的に駆動した。ＢＭＰ及びＷｎｔは１日目にｈＥＳＣからＡＰＳを初期に特定したが、２４時間後に、ＢＭＰ及びＷｎｔは中胚葉を誘導し、分化の２〜３日目にＰＳからのＤＥ形成を相互に抑制した（図３ｉ〜ii）。興味深いことに、外因性ＢＭＰを除去するだけでなく、内因性ＢＭＰを中和すること（ノギン又はＤＭ３１８９／ＬＤＮ−１９３１８９を用いて）は、中胚葉を除去し、ＤＥに一方的に向かうＰＳ分化を相互に逸らすために必要であった（図３ｉ）。これは、２つの別々のｈＥＳＣ株におけるＭＥＳＰ１の約３０００倍の下方調節並びにＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ、ＦＯＸＡ１及びＦＯＸＡ２の同時的上方調節により立証された（図４１〜４３）。長期的なＢＭＰ及びＷｎｔは中胚葉を誘導することが公知であったことを考慮すると（Bernardo, A.S., Faial, T., Gardner, L., Niakan, K.K., Ortmann, D., Senner, C.E., Callery, E.M., Trotter, M.W., Hemberger, M., Smith, J.C., et al. (2011). BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell Stem Cell 9, 144-155、Gadue, P., Huber, T.L., Paddison, P.J., and Keller, G.M. (2006). Wnt and TGF-β signaling are required for the induction of an in vitro model of primitive streak formation using embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 103, 16806-16811、Gertow, K., Hirst, C.E., Yu, Q.C., Ng, E.S., Pereira, L.A., Davis, R.P., Stanley, E.G., and Elefanty, A.G. (2013). WNT3A Promotes Hematopoietic or Mesenchymal Differentiation from hESCs Depending on the Time of Exposure. Stem Cell Reports 1, 53-65）、その結果は全て、ｈＥＳＣからＤＥを誘導するための以前の持続的ＢＭＰ処理に対して異議を唱えるものであり（Cheng, X., Ying, L., Lu, L., Galvao, A.M., Mills, J.A., Lin, H.C., Kotton, D.N., Shen, S.S., Nostro, M.C., Choi, J.K., et al. (2012). Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 10, 371-384、Goldman, O., Han, S., Sourrisseau, M., Dziedzic, N., Hamou, W., Corneo, B., D’souza, S., Sato, T., Kotton, Darrell N., Bissig, K.-D., et al. (2013). KDR Identifies a Conserved Human and Murine Hepatic Progenitor and Instructs Early Liver Development. Cell Stem Cell 12, 748-760、Nostro, M.C., Sarangi, F., Ogawa, S., Holtzinger, A., Corneo, B., Li, X., Micallef, S.J., Park, I.-H., Basford, C., Wheeler, M.B., et al. (2011). Stage-specific signaling through TGFβ family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development 138, 861-871、Touboul, T., Hannan, N.R.F., Corbineau, S., Martinez, A., Martinet, C., Branchereau, S., Mainot, S., Strick-Marchand, H., Pedersen, R., Di Santo, J., et al. (2010). Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology 51, 1754-1765）、本発明者らはＤＥの無効化及びその代わりに中胚葉を特定したことを示す。時宜を得たＢＭＰ阻害はまた、ｍＥＳＣからのＤＥ誘導も改善したが、ＢＭＰ阻害が作用する発生段階は依然として不明であった（Sherwood, R.I., Maehr, R., Mazzoni, E.O., and Melton, D.A. (2011). Wnt signaling specifies and patterns intestinal endoderm. Mech Dev 128, 387-400）。

【0181】

同様に、２〜３日目の内因性Ｗｎｔの阻害（ＩＷＰ２、Ｄｋｋ１又はＸＡＶ９３９を用いて）が２つのｈＥＳＣ株からの中胚葉形成を遮断するように、内因性Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルはＰＳを中胚葉に対して指向させた（図３ii、図４５〜４６）。しかしながら、ＢＭＰ又はＷｎｔのいずれかを個別に阻害することは、中胚葉を無効化するのに十分であり、これは両方の阻害が不必要であることを示していた（図４６）。かくして、続いて、ＰＳからＤＥを誘導するためにＢＭＰのみを阻害した。最後に、結果はＤＥを誘導するための長期のＷｎｔ処理と対照的であり（Sumi, T., Tsuneyoshi, N., Nakatsuji, N., and Suemori, H. (2008). Defining early lineage specification of human embryonic stem cells by the orchestrated balance of canonical Wnt/β-catenin, Activin/Nodal and BMP signaling. Development 135, 2969-2979）、本発明者らはその代わりにＰＳから中胚葉を特定し、ＤＥを遮断したことを示す。全体として、ＢＭＰ及びＷｎｔはＰＳから中胚葉を誘導し、内胚葉を抑制した；従って、その阻害は中胚葉を除去し、分化をＤＥに向かって逸らした。

【0182】

ＢＭＰ及びＷｎｔは中胚葉を特定したが、ＰＳからのＤＥ形成はＴＧＦβと共にＦＧＦにより一緒に駆動された（Bernardo, A.S., Faial, T., Gardner, L., Niakan, K.K., Ortmann, D., Senner, C.E., Callery, E.M., Trotter, M.W., Hemberger, M., Smith, J.C., et al. (2011). BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell Stem Cell 9, 144-155、D'Amour, K.A., Agulnick, A.D., Eliazer, S., Kelly, O.G., Kroon, E., and Baetge, E.E. (2005). Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol 23, 1534-1541）。ＦＧＦが阻害された場合、中胚葉形成はＢＭＰの非存在下であっても再度可能になった（さもなければ中胚葉形成にとって必須である）が、これはＦＧＦが将来のＤＥの中胚葉への非正統的な変換を防止したことを示している。ＦＧＦはまた、ｍＥＳＣからのＤＥ形成にとっても必須であり、逆説的ではあるが、外因性ＦＧＦはＤＥ誘導にとって有害であることが以前に見出されており（Hansson, M., Olesen, D.R., Peterslund, J.M.L., Engberg, N., Kahn, M., Winzi, M., Klein, T., Maddox-Hyttel, P., and Serup, P. (2009). A late requirement for Wnt and FGF signaling during activin-induced formation of foregut endoderm from mouse embryonic stem cells. Developmental Biology 330, 286-304）、これは観察されなかった（図３iii）。

【0183】

結論として、これらのデータは、ＢＭＰ及びＷｎｔと、ＦＧＦ及びＴＧＦβがそれぞれ、ＰＳから中胚葉と内胚葉を誘導し、別の運命を交叉抑制することによりそうしたシグナリング交叉拮抗作用を明らかにした（図４ii〜iii）。さらに、ＢＭＰ及びＷｎｔは曝露の発生時間に依存して二分された系列結果をもたらし、その効果は２４時間以内に逆転するようになった（図４、図４４）。

【0184】

連続的ＡＰＳ形成及び中胚葉抑制による多様なｈＰＳＣ株からの高度に精製されたＤＥの普遍的生成
ＡＰＳ及びＤＥが反対のシグナルにより連続的に特定されたという上記の知見は、ＰＳから中胚葉を除去するためのＢＭＰ阻害の必要性と一緒になって、ＤＥ誘導のための無血清単層手法（「ＳＲ１」）を動機付けた。最初に、高いアクチビン／ＴＧＦβを、ＣＨＩＲ（Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングを模倣する）及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害と組み合わせること（「ＡＣＰ」と省略される）により外胚葉を排除しながら（図４９〜５１）、ｈＰＳＣを２４時間でＡＰＳに分化させた（図５）。これにより、９９．３±０．１％のＭＩＸＬ１−ＧＦＰ^＋ＰＳ集団（Davis, R.P., Ng, E.S., Costa, M., Mossman, A.K., Sourris, K., Elefanty, A.G., and Stanley, E.G. (2008). Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood 111, 1876-1884）が得られ、全ＰＳ ＴＦ ＢＲＡＣＨＹＵＲＹがＡＰＳ特異的ＴＦ ＥＯＭＥＳ、ＦＯＸＡ２及びＬＨＸ１と同時発現された（図５、図５４）。２４時間後、ＣＨＩＲを取り出した後、ＡＰＳを、中胚葉を排除するためのＢＭＰ遮断剤（ＤＭ３１８９）と併用した高アクチビンによりＤＥに分化させた。内因性ＦＧＦが十分であった場合、外因性ＦＧＦは余分であった（図３iii、図４７）。

【0185】

連続的なＡＰＳ形成、次いで、ＤＥ誘導により、分化の３日以内に７つの多様なｈＥＳＣ（Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、ＨＥＳ２及びＨＥＳ３）並びにｈｉＰＳＣ（ＢＪＣ１及びＢＪＣ３）株から９３．９±３．１％のＣＸＣＲ４^＋ＰＤＧＦＲα⁻ＤＥ集団が普遍的に得られ（図６〜９、図５５）、株間の誘導変動性を克服した。ＳＲ１は広いＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７同時発現を惹起し（図７、図６０）、ｈＰＳＣマーカーであるＣＤ９０を下方調節した（図５６）。ｈＥＳＣ（９４．０±３．１％）及びｈｉＰＳＣ（９３．９±３．９％）は、ＤＥ誘導効率において有意に異ならなかった（Ｐ＞０．９７、図６１）。ＳＯＸ１７−ｍＣＨＥＲＲＹノックインｈＥＳＣリポーター株をさらに活用して（LA, ESN, AGE, EGS,未公開）、分化効率を定量し、ＳＲ１が９０％を超えるＳＯＸ１７−ｍＣＨＥＲＲＹ^＋ＤＥ集団を誘導したことがわかった（図８）。

【0186】

ＳＲ１によるＤＥ誘導を、５つの多様なｈＥＳＣ株にわたって２つの広まっているプロトコール、ＡＦＢＬｙ（Touboul, T., Hannan, N.R.F., Corbineau, S., Martinez, A., Martinet, C., Branchereau, S., Mainot, S., Strick-Marchand, H., Pedersen, R., Di Santo, J., et al. (2010). Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology 51, 1754-1765）又はアクチビン及び血清処理（D'Amour, K.A., Agulnick, A.D., Eliazer, S., Kelly, O.G., Kroon, E., and Baetge, E.E. (2005). Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol 23, 1534-1541）に対して直接比較し、得られる系列結果を追跡した（図５８ａ〜ｆ）。ＳＲ１分化により、最小中胚葉、胚外内胚葉又は神経外胚葉を含む全部で５つのｈＥＳＣ株からＤＥが一方的に得られた（ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＣＥＲ１、ＦＺＤ８）（図６、図５８ａ〜ｆ）。対照的に、他のＤＥプロトコールは混合した系列結果をもたらした：ＡＦＢＬｙは中胚葉ＴＦ（ＦＯＸＦ１、ＨＡＮＤ１、ＭＳＸ１、ＩＳＬ１）を上方調節したが、多能性ＴＦ発現（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ）は５つ全部の株にわたって血清誘導後に持続した（図６、図５８ａ〜ｆ）。従って、ＡＦＢＬｙ及び血清は両方とも、より低いＳＯＸ１７^＋ＦＯＸＡ２^＋ＤＥ収率をもたらし（図７、図６０）、内胚葉ＴＦを中程度に上方調節したに過ぎなかった（図６、図５８ａ〜ｆ）。ＦＡＣＳ定量により、ＳＲ１がＡＦＢＬｙ又は血清処理のいずれかよりも純粋なＤＥをもたらすことが確認された（Ｐ＜２．２ｘ１０^−１２；図７、図５８ａ〜ｆ）。クローンレベルで、単一細胞ｑＰＣＲは、内胚葉ＴＦが大部分のＳＲ１誘導細胞中で強固に上方調節されることを示した：２０／２０の細胞がＦＯＸＡ２^＋であり（図１０）、それぞれの細胞について、遺伝子発現値をＹｕｈａｚｉに対して正規化した（それ自身を０と設定した）。その後、＋６．５よりも低いものを全てＦＯＸＡ２＋陽性と見なした。対照的に、ＡＦＢＬｙ（１／２０の細胞）又は血清処理（２／２０の細胞）集団中のいくつかの細胞がＦＯＸＡ２を高度に発現した（図１０）。かくして、３つ全ての分化プロトコールが高アクチビンを用いたとしても、明らかにアクチビンだけでは純粋なＤＥを生成するには不十分であった。

【0187】

最後に、神経分化能は、ＳＲ１誘導の２４時間以内に放棄されたが（図１１）、これは相互排他的な系列潜在能力がＡＰＳ／ＤＥ運命付けの際に失われたことを示す。

【0188】

ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＲＡ、ＴＧＦβ及びＷｎｔシグナリングによるｈＥＳＣ由来ＤＥのＡＦＧ、ＰＦＧ及びＭＨＧドメインへの相互排他的な前後パターン化
インビボでのその初期の特定化の後、ＤＥは前後軸に沿って、内胚葉器官に対する領域的先祖である異なるドメインにパターン化される（Zorn, A.M., and Wells, J.M. (2009). Vertebrate endoderm development and organ formation. Annu Rev Cell Dev Biol 25, 221-251）。前腸前部（ＡＦＧ）は、肺及び甲状腺を生じさせ、前腸後部（ＰＦＧ）は膵臓及び肝臓を生じさせ、中腸／後腸（ＭＨＧ）は小腸及び大腸を生じさせる（図１２〜１３）。従って、３日目までにｈＰＳＣからほぼ均質なＤＥを誘導したら、本発明者らは次に、インビボ（Zorn, A.M., and Wells, J.M. (2009). Vertebrate endoderm development and organ formation. Annu Rev Cell Dev Biol 25, 221-251）及びインビトロ（例えば、（Green, M.D., Chen, A., Nostro, M.-C., D'Souza, S.L., Schaniel, C., Lemischka, I.R., Gouon-Evans, V., Keller, G., and Snoeck, H.-W. (2011). Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol、Sherwood, R.I., Maehr, R., Mazzoni, E.O., and Melton, D.A. (2011). Wnt signaling specifies and patterns intestinal endoderm. Mech Dev 128, 387-400、Spence, J.R., Mayhew, C.N., Rankin, S.A., Kuhar, M.F., Vallance, J.E., Tolle, K., Hoskins, E.E., Kalinichenko, V.V., Wells, S.I., Zorn, A.M., et al. (2011). Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature 470, 105-109））でのＤＥパターン化を制御するシグナルの増大する知識に基づいて、その後の４日間の分化によってそれを異なるＡＦＧ、ＰＦＧ又はＭＨＧ集団に前後パターン化させることを試みた（図１２）。

【0189】

脊椎動物の胚においては、尾芽中胚葉はＢＭＰ４、ＦＧＦ４／８及びＷＮＴ３Ａを発現し、後部内胚葉と並列しているが、これはこれらのシグナルがＭＨＧの近くで後部パターン化し得ることを示唆する。インビトロでは、ＢＭＰはＤＥを顕著に後方化し（図１４ｉ）、ＭＨＧ ＴＦ（例えば、ＣＤＸ２、ＥＶＸ１及び５’ＨＯＸ遺伝子）を誘導し、ゼブラフィッシュデータを反映している（Tiso, N., Filippi, A., Pauls, S., Bortolussi, M., and Argenton, F. (2002). BMP signalling regulates anteroposterior endoderm patterning in zebrafish. Mech Dev 118, 29-37）。Ｗｎｔ（ＣＨＩＲにより模倣される）は同様に後方化しており（図１４ii）、ＦＧＦはＰＦＧをＭＨＧに部分的に後方化することができたが（図６２）、これは以前の研究（Sherwood, R.I., Maehr, R., Mazzoni, E.O., and Melton, D.A. (2011). Wnt signaling specifies and patterns intestinal endoderm. Mech Dev 128, 387-400、Spence, J.R., Mayhew, C.N., Rankin, S.A., Kuhar, M.F., Vallance, J.E., Tolle, K., Hoskins, E.E., Kalinichenko, V.V., Wells, S.I., Zorn, A.M., et al. (2011). Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature 470, 105-109）を確認するものである。相互に、ＢＭＰ、ＦＧＦ及びＷｎｔは全て、前部内胚葉ＴＦのＳＯＸ２を抑制した（図１４、図６２）。従って、ＢＭＰ、ＣＨＩＲ及びＦＧＦの組合せを用いて、無血清条件で前腸（図１６）を抑制しながら、３日目のＤＥを、９９％を超えるＣＤＸ２^＋ＭＨＧ（図１５）にパターン化させた。

【0190】

逆に、後方化するＢＭＰシグナルの阻害は、前部内胚葉（前腸）を広くもたらした。ＢＭＰ阻害とＴＧＦβ阻害とを組み合わせると（Green, M.D., Chen, A., Nostro, M.-C., D'Souza, S.L., Schaniel, C., Lemischka, I.R., Gouon-Evans, V., Keller, G., and Snoeck, H.-W. (2011). Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol）、インビボでＯＴＸ２^＋最前部咽頭内胚葉を刺激する、分化の７日目までに９８％を超えるＯＴＸ２^＋ＡＦＧ（図１５）が得られた（表１）。別に、ＢＭＰ阻害はＲＡシグナリングと共に、ＰＦＧを生成し（図１６〜１７）、これはＲＡがインビボでＰＦＧをどのように認識するかと一致する（Stafford, D., and Prince, V.E. (2002). Retinoic acid signaling is required for a critical early step in zebrafish pancreatic development. Curr Biol 12, 1215-1220）。ＡＦＧとＰＦＧは機能的に異なっていたが、ＰＦＧのみが肝臓及び膵臓の潜在能力を担持し（図１８）、これはＰＦＧのみが肝臓及び膵臓をその後形成する能力を獲得したことを示す。

【0191】

上記シグナリング論理を発動すれば、マイクロアレイ及びｑＰＣＲ分析により立証されたように、ＤＥに由来する別々のＡＦＧ、ＰＦＧ及びＭＨＧ集団が相互排他的な様式で生成された。前後遺伝子発現は明らかに発生的に境界があった（図１６〜１７、２つのｈＥＳＣ株で再現された）。段階的な、空間的に同一線上のＨＯＸ遺伝子発現（Zorn, A.M., and Wells, J.M. (2009). Vertebrate endoderm development and organ formation. Annu Rev Cell Dev Biol 25, 221-251）が、インビトロパターン化の後に観察され、それによりＰＦＧは３’前部ＨＯＸ遺伝子（例えば、ＨＯＸＡ１）を発現し、対照的に、ＭＨＧは５’後部ＨＯＸ遺伝子及びＣＤＸ遺伝子を排他的に発現した（図１６〜１７）。

【0192】

ＴＧＦβは、膵臓及び肝臓運命の相互排他的な分岐を特定するＢＭＰ／ＭＡＰＫシグナリングと競合する
インビボでは、肝臓及び膵臓は、二分系列決定に向かう共通のＰＦＧ前駆体から発生する（Chung, W.-S., Shin, C.H., and Stainier, D.Y.R. (2008). Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision. Developmental cell 15, 738-748、Deutsch, G., Jung, J., Zheng, M., Lora, J., and Zaret, K.S. (2001). A bipotential precursor population for pancreas and liver within the embryonic endoderm. Development 128, 871-881）。膵臓及び肝臓誘導シグナルはインビボ及びインビトロで同定されているが、肝臓及び膵臓がＰＳＣ分化の間にどのように分離されるかはあまり明らかではない。ＢＭＰ及びＦＧＦは典型的には、肝臓を誘導するために用いられるが、ヘッジホッグ阻害及びＦＧＦは膵臓を生成するために適用される（例えば、（Cho, C.H.-H., Hannan, N.R.-F., Docherty, F.M., Docherty, H.M., Joao Lima, M., Trotter, M.W.B., Docherty, K., and Vallier, L. (2012). Inhibition of activin/nodal signalling is necessary for pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Diabetologia、Kroon, E., Martinson, L.A., Kadoya, K., Bang, A.G., Kelly, O.G., Eliazer, S., Young, H., Richardson, M., Smart, N.G., Cunningham, J., et al. (2008). Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol 26, 443-452））。５００を超える条件を包含するシグナリング摂動分析（図１９、図６３）により、膵臓と肝臓の相互排他的特定化のためのシグナリングスイッチが明確になった（図１９）。

【0193】

ＴＧＦβシグナリングは膵臓形成（ＰＤＸ１により追跡される）を促進することがわかったが、ＢＭＰ及びＦＧＦ／ＭＡＰＫシグナリングは肝臓を特定化した（ＡＦＰ）（図１９）。重要なことに、これらのシグナルのそれぞれが別の系列の形成を相互に抑制することが明確になった（図１９）が、これはＰＦＧ系列決定がどれぐらい双安定であるかを強調するものである（Chung, W.-S., Shin, C.H., and Stainier, D.Y.R. (2008). Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision. Developmental cell 15, 738-748）。そのような交叉抑制のため、前膵臓ＴＧＦβの除去は肝臓を相互に拡張したが（図１９ｉ〜ii）、前肝臓ＦＧＦ／ＭＡＰＫの阻害（Deutsch, G., Jung, J., Zheng, M., Lora, J., and Zaret, K.S. (2001). A bipotential precursor population for pancreas and liver within the embryonic endoderm. Development 128, 871-881）は分化を膵臓に向かって逸らした（図１９iv）。本明細書に提示される結果は、以前の研究と異なり、肝臓又は膵臓誘導における以前の不十分性を説明することができる。膵臓誘導のためのＦＧＦの以前の使用（Cho, C.H.-H., Hannan, N.R.-F., Docherty, F.M., Docherty, H.M., Joao Lima, M., Trotter, M.W.B., Docherty, K., and Vallier, L. (2012). Inhibition of activin/nodal signalling is necessary for pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Diabetologia、Kroon, E., Martinson, L.A., Kadoya, K., Bang, A.G., Kelly, O.G., Eliazer, S., Young, H., Richardson, M., Smart, N.G., Cunningham, J., et al. (2008). Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol 26, 443-452、Nostro, M.C., Sarangi, F., Ogawa, S., Holtzinger, A., Corneo, B., Li, X., Micallef, S.J., Park, I.-H., Basford, C., Wheeler, M.B., et al. (2011). Stage-specific signaling through TGFβ family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development 138, 861-871）は事実、胚研究により示唆されたように（Deutsch, G., Jung, J., Zheng, M., Lora, J., and Zaret, K.S. (2001). A bipotential precursor population for pancreas and liver within the embryonic endoderm. Development 128, 871-881）、膵臓を遮断し、その代わりに肝臓を特定化することができる（図１９iv）。他方、肝臓誘導のためのＴＧＦβの提供（Rashid, S.T., Corbineau, S., Hannan, N., Marciniak, S.J., Miranda, E., Alexander, G., Huang-Doran, I., Griffin, J., Ahrlund-Richter, L., Skepper, J., et al. (2010). Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest 120, 3127-3136）は、肝臓を無効化し、その代わりに膵臓を駆動してもよい（図１９ｉ〜ii）。

【0194】

機構的には、それぞれ膵臓と肝臓を特定化する際のＴＧＦβとＢＭＰにおける二分（図２０）は、以前には解明されておらず、これらのシグナリング経路が互いの伝達をしばしば交叉抑制する方法によく似ている（Candia, A.F., Watabe, T., Hawley, S.H., Onichtchouk, D., Zhang, Y., Derynck, R., Niehrs, C., and Cho, K.W. (1997). Cellular interpretation of multiple TGF-β signals: intracellular antagonism between activin/BVg1 and BMP-2/4 signaling mediated by Smads. Development 124, 4467-4480）。これらのモルフォゲン間で組合せ相互作用がさらに同定された。例えば、ＴＧＦβが同時に阻害された場合、ＦＧＦＭＡＰＫ阻害は無効であったため、ＴＧＦβシグナリングとＦＧＦ／ＭＡＰＫ阻害とが膵臓形成にとって必須であった（図６３ｉ）。逆に、ＦＧＦ／ＭＡＰＫが同時に阻害された場合、ＴＧＦβ阻害は肝臓を効率的に作出することができなかったため、肝臓誘導はＴＧＦβ阻害とＦＧＦ／ＭＡＰＫシグナリングを協働的に必要とした（図１９iv、図６３ｉ）。

【0195】

ｈＥＳＣ由来肝臓子孫は条件付けられていないマウス肝臓中で長期間生着する
膵臓を明確に阻害しながら肝臓に向かってＤＥを分化させるために、本発明者らは、ＤＥをＰＦＧに向かって１日間誘導し（図２０ｉ、図６３iv）、次いで、ＢＭＰ及び他の因子と共にＴＧＦβ阻害を用いて、膵臓夾雑を最少にしながらその後３日間にわたって肝臓に向かってＰＦＧを指向させた（図６４）。本発明者らは、分化の７日以内に４つのｈＥＳＣ株から７２．３±６．３％のＡＦＰ^＋初期肝臓前駆体（図６４）を生成し、これは以前の方法の２倍迅速であった（Rashid, S.T., Corbineau, S., Hannan, N., Marciniak, S.J., Miranda, E., Alexander, G., Huang-Doran, I., Griffin, J., Ahrlund-Richter, L., Skepper, J., et al. (2010). Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest 120, 3127-3136）：さらに肝臓マーカーは以前のプロトコールと比較して約６０〜２１０倍高く誘導された（図６５）。

【0196】

初期ＡＦＰ^＋肝臓前駆体の肝臓潜在能力を検証するために、それらをオンコスタチンＭ及びデキサメタゾン（Kamiya, A., Kinoshita, T., Ito, Y., Matsui, T., Morikawa, Y., Senba, E., Nakashima, K., Taga, T., Yoshida, K., Kishimoto, T., et al. (1999). Fetal liver development requires a paracrine action of oncostatin M through the gp130 signal transducer. EMBO J 18, 2127-2136）を用いてインビトロで混合アルブミン（ｈＡＬＢ）^＋肝芽細胞集団に経験的に成熟させたところ（図６６）、ある程度のＣＹＰ３Ａ４代謝活性を示し（図２２ｉ）、ＬＤＬＲを発現し、コレステロールを取り込むことができた（図２２ii）。新生児マウス肝臓に移植した場合、初期ＡＦＰ^＋肝臓前駆体は生着することができなかったが（図６７）、その分化したｈＡＬＢ^＋子孫を移植した場合、移植の２〜３カ月後にレシピエントの４７％の血中でヒトアルブミンが検出され（両側Mann-Whitney検定により決定された場合、平均７．２ｎｇ／ｍＬ）、長期的生着を示した（図２３）。実際、ｈＡＬＢ^＋ｈＥＳＣ由来肝細胞の巣（移植前に構成的に発現されるＧＦＰでマークされる）が成体肝臓の全ての小葉に存在していた（図２３、図６７）。これは、ｈＡＬＢ^＋肝細胞が肝臓を通して統合及び／又は移動し、それらが移植部位で単に局部的に持続していたのではないことを示唆していた。最後にｈＡＬＢ^＋細胞はヒト肝臓マーカーＨｅｐＰａｒ１を同時発現していたが（図６８）、胎児マーカーＡＦＰを検出可能に発現せず（図６９）、これはそれらが胎児段階を通過して進行したことを示唆している。これは、ｈＥＳＣ由来肝細胞がマウス肝臓中に長期間生着することができ、広範な薬理学的又は遺伝的損傷により損なわれなかったことを初めて証明するものである（（Yusa, K., Rashid, S.T., Strick-Marchand, H., Varela, I., Liu, P.-Q., Paschon, D.E., Miranda, E., Ordonez, A., Hannan, N.R.F., Rouhani, F.J., et al. (2011). Targeted gene correction of α1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature 478, 391-394）を参照されたい）。

【0197】

内胚葉誘導及び前後パターン化の包括的転写状態及びクロマチン状態のマッピング
ｈＥＳＣ由来内胚葉系列のむしろ同種の集団を取得する能力を利用して、４つのヒストンＨ３改変（Ｋ４ｍｅ３、Ｋ２７ｍｅ３、Ｋ２７ａｃ及びＫ４ｍｅ２；図２４〜３８、図６６〜８０）に関するＲＮＡ−ｓｅｑ及びＣｈＩＰ−ｓｅｑを用いて６つの純粋な前駆体集団（ｈＥＳＣ、ＡＰＳ、ＤＥ、ＡＦＧ、ＰＦＧ及びＭＨＧ）の階層をプロファイリングすることにより、転写及びクロマチン動力学を内胚葉発生中に捕捉した。これにより、４つの胚段階（胚盤葉上層、ＰＳ、ＤＥ及び前後パターン化）に広がる３０の転写及びクロマチン状態マップが得られ、合計１３億を超える整列された読取りであった（図７０）。

【0198】

この分析は、急性発生移行を捕捉した。ＲＮＡ−ｓｅｑは、インビトロでの多能性からＡＰＳへの同期的移行中の２４時間以内に劇的な転写的変化を示し（図２４）、どれぐらいの胚盤葉上層（約Ｅ５．５）及びＰＳ（約Ｅ６．５）がマウスにおいて１日以内に生じるかを反映している。ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ及びＮＯＤＡＬプロモーターは、ｈＥＳＣ中で活性化関連Ｋ４ｍｅ３及び抑制関連Ｋ２７ｍｅ３により二価的にマークされたが、ＡＰＳ誘導の２４時間以内に、それらは一方的に分解され、抑制的Ｋ２７ｍｅ３を失い、ＡＰＳにおける迅速なＢＲＡＣＨＹＵＲＹ及びＮＯＤＡＬ上方調節と共に活性マークＫ２７ａｃ及びＫ４ｍｅ３を獲得した（図２５）。

【0199】

内胚葉エンハンサー活性化はＥＯＭＥＳ、ＳＭＡＤ２／３／４及びＦＯＸＨ１同時占有と関連する
遠位Ｋ２７ａｃ富化により同定される異なる一連の活性エンハンサー（Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S.A., Flynn, R.A., and Wysocka, J. (2011). A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature 470, 279-283）はそれぞれの細胞運命移行中に発動された（図２６）。ＡＰＳエンハンサー（例えば、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ及びＮＯＤＡＬ）は２４時間以内に迅速に開始された（図２５）。ＤＥパターン化中に、異なるコホートのエンハンサーがＡＦＧ（ＳＩＸ１及びＴＢＸ１；図７９）、ＰＦＧ（ＨＯＸＡ１；図８０）及びＭＨＧ（ＣＤＸ２及びＰＡＸ９；図２７、図７２）中のそれぞれの前後ドメイン中で任命された。

【0200】

１０，５４３のＤＥエンハンサーがＤＥ特定化の際に活性化され、ｈＥＳＣ中で大部分不活性であるにも拘らずＫ２７ａｃを獲得した。活性ＤＥエンハンサーは、典型的なＤＥ調節因子、例えば、ＳＯＸ１７（図３４）及びＣＸＣＲ４（図７１）に隣接していた。遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析（McLean, C.Y., Bristor, D., Hiller, M., Clarke, S.L., Schaar, B.T., Lowe, C.B., Wenger, A.M., and Bejerano, G. (2010). GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nat Biotechnol 28, 495-501）はこれらのエンハンサーを内胚葉発生（Ｐ＜３．８４ｘ１０^−２６）及び原腸形成（Ｐ＜７．９２ｘ１０^−２６；図２８）と最も有意に関連付けたが、これは分化したＤＥ集団の純度を支持する。活性ＤＥエンハンサーに隣接する遺伝子は、インビボで原腸段階の内胚葉中で（Ｐ＜１．３８ｘ１０^−３９、図２８）及びインビトロでＤＥ分化の際に（図２９）上方調節された。真正染色質マークＫ４ｍｅ２と一致した活性ＤＥエンハンサー（図７３）は、抑制関連Ｋ２７ｍｅ３がなく（図７３）、進化的に保存され（図７５）、他の系列では広く不活性であった（図７４）。

【0201】

以前の研究のほとんどがプロモーターマークのみを評価したため（Kim, S.W., Yoon, S.-J., Chuong, E., Oyolu, C., Wills, A.E., Gupta, R., and Baker, J. (2011). Chromatin and transcriptional signatures for Nodal signaling during endoderm formation in hESCs. Developmental Biology 357, 492-504、Xie, R., Everett, L.J., Lim, H.-W., Patel, N.A., Schug, J., Kroon, E., Kelly, O.G., Wang, A., D'amour, K.A., Robins, A.J., et al. (2013). Dynamic chromatin remodeling mediated by polycomb proteins orchestrates pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 12, 224-237、Xie, W., Schultz, M.D., Lister, R., Hou, Z., Rajagopal, N., Ray, P., Whitaker, J.W., Tian, S., Hawkins, R.D., Leung, D., et al. (2013). Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell 153, 1134-1148）、ＤＥエンハンサーは以前には依然として理解しにくかった。しかしながら、ｈＥＳＣ由来ＤＥのエンハンサープロファイリングが最近報告され（Gifford, Casey A., Ziller, Michael J., Gu, H., Trapnell, C., Donaghey, J., Tsankov, A., Shalek, Alex K., Kelley, David R., Shishkin, Alexander A., Issner, R., et al. (2013). Transcriptional and Epigenetic Dynamics during Specification of Human Embryonic Stem Cells. Cell, 1-28）、従って、本発明者らの２つのＤＥデータベースを、同一の分析方法を用いて比較した。逆説的ではあるが、神経ＴＦ ＢＲＮ２及びＰＡＸ３のためのエンハンサーは活性化されたが、ＳＯＸ１７エンハンサーは実質的に沈黙化されたため（図７５）、前者のデータセット（Gifford, Casey A., Ziller, Michael J., Gu, H., Trapnell, C., Donaghey, J., Tsankov, A., Shalek, Alex K., Kelley, David R., Shishkin, Alexander A., Issner, R., et al. (2013). Transcriptional and Epigenetic Dynamics during Specification of Human Embryonic Stem Cells. Cell, 1-28）からのＤＥエンハンサーは、神経機能について高度に富化されていた（Ｐ＜３．９３ｘ１０^−２８；図３１）。ＤＥエンハンサーの神経遺伝子との結合は、内胚葉及び外胚葉発生が関連するという以前の結論（Gifford, Casey A., Ziller, Michael J., Gu, H., Trapnell, C., Donaghey, J., Tsankov, A., Shalek, Alex K., Kelley, David R., Shishkin, Alexander A., Issner, R., et al. (2013). Transcriptional and Epigenetic Dynamics during Specification of Human Embryonic Stem Cells. Cell, 1-28）を導いたが、これは胚葉分離のインビボでの順序と対照的である（（Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F.J., Wilson, V., and Nicolas, J.-F. (2009). Redefining the progression of lineage segregations during mammalian embryogenesis by clonal analysis. Developmental Cell 17, 365-376）を参照されたい）。対照的に、神経期間はＳＲ１由来ＤＥ中に大部分存在せず（図２８）、最終的にはわずか４．８％のＤＥエンハンサーが、本発明者らのデータセットと彼らのデータセットとの間で共有された。かくして、混合ＤＥ集団の分子プロファイリング（外胚葉について潜在的に富化される；（Gifford, Casey A., Ziller, Michael J., Gu, H., Trapnell, C., Donaghey, J., Tsankov, A., Shalek, Alex K., Kelley, David R., Shishkin, Alexander A., Issner, R., et al. (2013). Transcriptional and Epigenetic Dynamics during Specification of Human Embryonic Stem Cells. Cell, 1-28））は、内胚葉発生の正確な分子的説明を不可能にしてきた。

【0202】

ＤＥエンハンサーが分化の間にどのように開始されるかは依然として不明確である。ＤＥ特定因子ＥＯＭＥＳ及びＦＯＸＡ２並びにＴＧＦβシグナリングエフェクターＳＭＡＤ２／３及びＦＯＸＨ１（Ｐ＝１０^−５９〜１０^−１９７）などの複数のＴＦのためのモチーフはＤＥエンハンサー中で富化されていたが（図３２）、これはこれらのＴＦがインビボでＤＥをどのように特定するかと一致していた（例えば、（Dunn, N.R., Vincent, S.D., Oxburgh, L., Robertson, E.J., and Bikoff, E.K. (2004). Combinatorial activities of Smad2 and Smad3 regulate mesoderm formation and patterning in the mouse embryo. Development 131, 1717-1728、Teo, A.K.K., Arnold, S.J., Trotter, M.W.B., Brown, S., Ang, L.T., Chng, Z., Robertson, E.J., Dunn, N.R., and Vallier, L. (2011). Pluripotency factors regulate definitive endoderm specification through eomesodermin. Genes & Development 25, 238-250））。興味深いことに、本発明者らは、ＥＯＭＥＳ、ＳＭＡＤ２／３、ＳＭＡＤ４及びＦＯＸＨ１（Kim, S.W., Yoon, S.-J., Chuong, E., Oyolu, C., Wills, A.E., Gupta, R., and Baker, J. (2011). Chromatin and transcriptional signatures for Nodal signaling during endoderm formation in hESCs. Developmental Biology 357, 492-504、Teo, A.K.K., Arnold, S.J., Trotter, M.W.B., Brown, S., Ang, L.T., Chng, Z., Robertson, E.J., Dunn, N.R., and Vallier, L. (2011). Pluripotency factors regulate definitive endoderm specification through eomesodermin. Genes & Development 25, 238-250）がＳＯＸ１７エンハンサー（図３４）を含む、広範囲の一連のＤＥエンハンサー（図３３）を同時占有することを見出した。ＥＯＭＥＳはいくつかのエレメントに個々に関与したが、ＥＯＭＥＳと、ＴＧＦβシグナリングエフェクターＳＭＡＤ２／３／４及びＦＯＸＨ１との共局在化は、最大のエンハンサーであるアセチル化と相関していた（図３３、Fisherの直接確率検定により算出された場合、Ｐ＜１０^−３００、４ＴＦ対１〜３ＴＦクラス）。かくして、系列特定化及びシグナリングエフェクターＴＦの両方の収束は、分化の際に本格的なエンハンサー活性化を推進することができる（Calo, E., and Wysocka, J. (2013). Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Molecular Cell 49, 825-837）。

【0203】

内胚葉エンハンサーは活性化の前に運命付けられていない細胞中で多様な「プレエンハンサー」状態にある
ＤＥエンハンサーがｈＥＳＣ分化の際にどれぐらい迅速に関与するかは依然として不明確である。ＳＭＡＤ２／３／４及びＦＯＸＨ１は分化の際にＤＥエンハンサーを占有するが、運命付けられていない状態では稀にしかそうしない（図７３）。おそらく、その代わりにこれらのエンハンサーはクロマチンのレベルで活性化のためにプライミングされる。ＥＳＣ中の真正染色質Ｋ４ｍｅ１による発生エンハンサーのプレマーキングは、その後のエンハンサー活性化のための「機会のウィンドウ」を示す（Calo, E., and Wysocka, J. (2013). Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Molecular Cell 49, 825-837、Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S.A., Flynn, R.A., and Wysocka, J. (2011). A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature 470, 279-283）。発生の進行を再検討し、エンハンサー活性化の前にｈＥＳＣ中での２４を超えるヒストン改変及びクロマチン調節因子（Ernst, J., Kheradpour, P., Mikkelsen, T.S., Shoresh, N., Ward, L.D., Epstein, C.B., Zhang, X., Wang, L., Issner, R., Coyne, M., et al. (2011). Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature 473, 43-49）によるＤＥエンハンサーの占有を評価した（図３５）。予想外に、Ｋ４ｍｅ１はｈＥＳＣ中の将来のＤＥエンハンサーの１／３未満しか標識しなかったが、これはｈＥＳＣ中でのＫ４ｍｅ１による「平衡化（poising）」は、即時のエンハンサー活性化にとって常に必須であるというわけではないことを暗示している（図３５〜３６）。かくして、本発明者らは、ｈＥＳＣ中のＤＥエンハンサーの全ての可能な「プレエンハンサー」クロマチン状態を体系的に発見することを求めた。

【0204】

監視されていないクラスタリングにより、２５％のＤＥエンハンサーが、ヒストンバリアントＨ２ＡＺ及び他の公知でないクロマチンマークにより大部分定義されたｈＥＳＣ中で新しいプレエンハンサー状態（クラスター１）で存在していることが示された（図３５、図７６）。Ｋ４ｍｅ１の実質的な非存在にも拘らず、Ｈ２ＡＺマークされたプレエンハンサーは、ＤＥ誘導の３日以内に迅速に活性化されるようになった（図３５）。ＤＥエンハンサーは、異質染色質マークＫ９ｍｅ３により指定される抑制された状態（クラスター２）（Zhu, Y., van Essen, D., and Saccani, S. (2012). Cell-type-specific control of enhancer activity by H3K9 trimethylation. Molecular Cell 46, 408-423）又は公知のヒストン改変を大部分欠く「潜在的な」プレエンハンサー状態（クラスター５、図３５）（Ostuni, R., Piccolo, V., Barozzi, I., Polletti, S., Termanini, A., Bonifacio, S., Curina, A., Prosperini, E., Ghisletti, S., and Natoli, G. (2013). Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells. Cell 152, 157-171）で存在することはあまりなかった。わずか１０％のＤＥエンハンサーがｈＥＳＣ中でＫ２７ｍｅ３によりマークされたが（図３６）、これはポリコーム（Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S.A., Flynn, R.A., and Wysocka, J. (2011). A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature 470, 279-283）がｈＥＳＣ中の発生エンハンサーを抑制するのに常に必要であるわけではないことを示唆している：おそらく、Ｋ２７ａｃ／ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）の非存在は、不活性を与えるのに十分であった。ほんのわずかのＤＥエンハンサー（１０％）がＨＡＴ ｐ３００に予備充填されたが（Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S.A., Flynn, R.A., and Wysocka, J. (2011). A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature 470, 279-283）（図３６）、これは分化中の迅速なエンハンサーアセチル化がデノボでのＨＡＴ動員を大部分含んでもよいことを示唆している。

【0205】

他の検出可能な識別因子を用いずにＨ２ＡＺにより単に説明された「プレエンハンサー」状態は、以前には記載されていなかった。Ｈ２ＡＺは活性エンハンサーと関連することが多いが（Hu, G., Cui, K., Northrup, D., Liu, C., Wang, C., Tang, Q., Ge, K., Levens, D., Crane-Robinson, C., and Zhao, K. (2013). H2A.Z facilitates access of active and repressive complexes to chromatin in embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell 12, 180-192）、それはまた不活性エンハンサーを修飾することが見出された（図３５）。Ｈ２ＡＺを積んだヌクレオソームは不安定であり、ＴＦにより容易に置換される（Hu, G., Cui, K., Northrup, D., Liu, C., Wang, C., Tang, Q., Ge, K., Levens, D., Crane-Robinson, C., and Zhao, K. (2013). H2A.Z facilitates access of active and repressive complexes to chromatin in embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell 12, 180-192、Jin, C., Zang, C., Wei, G., Cui, K., Peng, W., Zhao, K., and Felsenfeld, G. (2009). H3.3/H2A.Z double variant-containing nucleosomes mark 'nucleosome-free regions' of active promoters and other regulatory regions. Nat Genet 41, 941-945）。これにより、内胚葉ＴＦは分化の際にＤＥエンハンサーに迅速に浸潤し、迅速なエンハンサー活性化を説明することができる。実際、ｈＥＳＣ中のＨ２ＡＺによりマークされたＤＥプレエンハンサーは、潜在的なプレエンハンサーと比較して、分化の際にＥＯＭＥＳ、ＳＭＡＤ２／３／４及びＦＯＸＨ１をより容易に誘引した（図３７、Ｐ＝１０^−１３〜１０^−１５）。これは、ｍＥＳＣ中のＨ２ＡＺによりマークされたプロモーターが、どれぐらい分化の際にＦＯＸＡ２結合により感受性であるかと同等である（Li, Z., Gadue, P., Chen, K., Jiao, Y., Tuteja, G., Schug, J., Li, W., and Kaestner, K.H. (2012). Foxa2 and H2A.Z Mediate Nucleosome Depletion during Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell 151, 1608-1616）。

【0206】

まとめると、初期のＫ４ｍｅ１「平衡化」は、その後のエンハンサー活性化の唯一の予測因子ではない。データは、クロマチンマークの異なる組合せにより特徴付けられるプレエンハンサー状態の多様性が存在することを示す（図３８）。

【0207】

考察
ＰＳＣ分化は、典型的には、ＰＳＣ株間で変化する一定範囲の発生結果をもたらす。ここで、単一系列の正確な誘導を、別の運命が発生分岐点で排除される方法を理解することにより、及び動的シグナリング移行の正確な時間的動力学を精査することにより達成することができる。本発明者らは、ＰＳＣからのヒト内胚葉の誘導及び前後パターン化に関する、並びに膵臓と肝臓のその後の分岐に関するシグナリング論理を説明し、それぞれのステップにおける別の系列の分離を明確にした。そのような知識により、多様なｈＥＳＣ／ｈｉＰＳＣ株からの精製された内胚葉の普遍的生成が可能になった。このレベルの内胚葉純度により、内胚葉発生の正確なクロマチン状態の分析及び長期間生着するｈＥＳＣ由来肝臓細胞の産生が可能になった。

【0208】

相互排他的な内胚葉運命の発生的分離
ＰＳＣから内胚葉と中胚葉の両方を惹起するために、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ及びＷｎｔシグナルが用いられ（Bernardo, A.S., Faial, T., Gardner, L., Niakan, K.K., Ortmann, D., Senner, C.E., Callery, E.M., Trotter, M.W., Hemberger, M., Smith, J.C., et al. (2011). BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell Stem Cell 9, 144-155、Cheng, X., Ying, L., Lu, L., Galvao, A.M., Mills, J.A., Lin, H.C., Kotton, D.N., Shen, S.S., Nostro, M.C., Choi, J.K., et al. (2012). Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 10, 371-384、Gertow, K., Hirst, C.E., Yu, Q.C., Ng, E.S., Pereira, L.A., Davis, R.P., Stanley, E.G., and Elefanty, A.G. (2013). WNT3A Promotes Hematopoietic or Mesenchymal Differentiation from hESCs Depending on the Time of Exposure. Stem Cell Reports 1, 53-65、Nostro, M.C., Sarangi, F., Ogawa, S., Holtzinger, A., Corneo, B., Li, X., Micallef, S.J., Park, I.-H., Basford, C., Wheeler, M.B., et al. (2011). Stage-specific signaling through TGFβ family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development 138, 861-871、Touboul, T., Hannan, N.R.F., Corbineau, S., Martinez, A., Martinet, C., Branchereau, S., Mainot, S., Strick-Marchand, H., Pedersen, R., Di Santo, J., et al. (2010). Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology 51, 1754-1765）、従って、これらのシグナルにより駆動される正確な系列結果は依然として不明瞭であった。これらの矛盾する知見は、ここで調整されるが、これは、これらの因子が実際にその時間的動力学に基づいて内胚葉又は中胚葉のいずれかを特定することを示している。４つの連続する段階の内胚葉発生を通して、所与の系列を指示するか、又は抑制するシグナルは正確に定義され、内胚葉系列の分岐がどのように駆動されるかのより明確な見解を提供する。事実、この正確な理解は、以前のプロトコールがＤＥ形成を抑制する不正確なシグナルを提供し、それによって、非効率的な分化をもたらすことを示唆した。

【0209】

本開示は、内胚葉発生のいくつかの連続する段階に広がる統合されたシグナリング「ロードマップ」を解決しようと試み、本発明者らはインビボで胚葉分離の階層後の全ての段階で別の運命を合理的に排除することができた（Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F.J., Wilson, V., and Nicolas, J.-F. (2009). Redefining the progression of lineage segregations during mammalian embryogenesis by clonal analysis. Developmental Cell 17, 365-376）。かくして、ＤＥ特定化の基礎となるシグナリング論理の解明により、典型的には現在の分化戦略から生じる外因性系列なしに、無血清条件で多様なｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ株からの高度に純粋なＤＥ集団の体系的生成が可能になった。例えば、ＤＥは、中胚葉又は外胚葉の実質的な非存在下で生成した。ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ及びＷｎｔシグナリングの組合せ（＄１０、Blauwkamp, T.A., Nigam, S., Ardehali, R., Weissman, I.L., and Nusse, R. (2012). Endogenous Wnt signalling in human embryonic stem cells generates an equilibrium of distinct lineage-specified progenitors. Nat Commun 3, 1070、＄４４）が、ＡＰＳ（９９％を超えるＭＩＸＬ１^＋）を特定し、外胚葉（Murry, C.E., and Keller, G. (2008). Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell 132, 661-680）を抑制するのに必要であり、ＡＰＳ誘導の２４時間以内に外胚葉分化能を無効化することがわかった。外胚葉の排除後、中胚葉はＢＭＰ阻害により連続的に除去され、ＴＧＦβ及びＦＧＦシグナリング（Bernardo, A.S., Faial, T., Gardner, L., Niakan, K.K., Ortmann, D., Senner, C.E., Callery, E.M., Trotter, M.W., Hemberger, M., Smith, J.C., et al. (2011). BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell Stem Cell 9, 144-155、D'Amour, K.A., Agulnick, A.D., Eliazer, S., Kelly, O.G., Kroon, E., and Baetge, E.E. (2005). Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol 23, 1534-1541）と組み合わせた場合、ＰＳをＤＥに向かって排他的に駆動した。重要なことに、純粋なＤＥ集団を達成するためには、ＰＳ内の内因性ＢＭＰ及びＷｎｔシグナリングを抑制することが必須であった。１つのシグナルの受容が他のシグナルへの応答を変化させたことを示す、シグナルの組合せの解釈における微妙な差異も明確化された。例えば、ＢＭＰ阻害は典型的には中胚葉を絶滅させたが、ＤＥを誘導するＦＧＦが並行して遮断された場合、中胚葉形成は再び可能となった。かくして、ＦＧＦはＤＥの運命付けを確立するために必須であった。

【0210】

ＰＦＧ形成の後、ＴＧＦβとＢＭＰシグナリングは、膵臓と肝臓を特定化するように争った。ある運命を特定化する誘導シグナルは別の運命を相互に交叉抑制し、胚形成の間の双安定の系列割当ての想起（Graf, T., and Enver, T. (2009). Forcing cells to change lineages. Nature 462, 587-594）を例示した。従って、効率的な肝臓誘導には、肝臓を積極的に駆動するＢＭＰ及びＦＧＦ／ＭＡＰＫと共に膵臓運命を除去するＴＧＦβ阻害及びその逆が必要であった。まとめると、抑制シグナルの阻害は、それぞれの分岐点で効率的なｈＰＳＣ分化を誘導するための誘導シグナルの提供と同等に重要である。

【0211】

それぞれの岐路での別の運命の除去は、以前のプロトコールにより典型的に誘導される外因性系列なしに、７つの多様なｈＥＳＣ／ｈｉＰＳＣ株を高度に純粋なＤＥ集団に普遍的に分化させるための単一の有効な戦略を定義した。これは、異なるｈＰＳＣ株が異なる分化の偏りを有し、それぞれが効率的な運命付けを駆動するためのカスタマイズされたシグナルを必要としてもよいという意見に反する。細胞補充療法のための必要条件は既定の無血清条件下でのｈＰＳＣからの均質なヒト系列の生成であるため、本明細書に記載の観察は時宜を得ている（Cohen, D.E., and Melton, D. (2011). Turning straw into gold: directing cell fate for regenerative medicine. Nature Reviews Genetics、McKnight, K., Wang, P., and Kim, S.K. (2010). Deconstructing pancreas development to reconstruct human islets from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 6, 300-308）。ｈＰＳＣから「自己複製する」ＤＥ（Cheng, X., Ying, L., Lu, L., Galvao, A.M., Mills, J.A., Lin, H.C., Kotton, D.N., Shen, S.S., Nostro, M.C., Choi, J.K., et al. (2012). Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 10, 371-384）又は肝芽（Takebe, T., Sekine, K., Enomura, M., Koike, H., Kimura, M., Ogaeri, T., Zhang, R.-R., Ueno, Y., Zheng, Y.-W., Koike, N., et al. (2013). Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature 499, 481-484）を生成するための最近の戦略は魅力的である；しかしながら、それらは異種フィーダーとの同時培養を必要とし、かくして、異なる型の適用を適合させる必要がある。

【0212】

必須の内胚葉シグナリング入力は高度に時間的に動的である
インビボ及びインビトロでの動的内胚葉シグナリング移行の重要性にも拘らず（Green, M.D., Chen, A., Nostro, M.-C., D'Souza, S.L., Schaniel, C., Lemischka, I.R., Gouon-Evans, V., Keller, G., and Snoeck, H.-W. (2011). Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol、Wandzioch, E., and Zaret, K.S. (2009). Dynamic signaling network for the specification of embryonic pancreas and liver progenitors. Science 324, 1707-1710）、そのようなシグナルの正確な配列及び動力学は依然として完全には解明されていない。例えば、ＢＭＰ及びＷｎｔは、数日にわたる長期的処理の研究により中胚葉誘導と伝統的に関連してきた（Bernardo, A.S., Faial, T., Gardner, L., Niakan, K.K., Ortmann, D., Senner, C.E., Callery, E.M., Trotter, M.W., Hemberger, M., Smith, J.C., et al. (2011). BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell Stem Cell 9, 144-155、Gadue, P., Huber, T.L., Paddison, P.J., and Keller, G.M. (2006). Wnt and TGF-β signaling are required for the induction of an in vitro model of primitive streak formation using embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 103, 16806-16811）。しかしながら、ＢＭＰ及びＷｎｔはＡＰＳを初期に特定するが、分化の２４時間以内に、シグナリング要件は逆転し、ＢＭＰ及びＷｎｔがＰＳからのＤＥ生成を抑制し、その代わりに中胚葉を誘導することがわかった。重要なことに、以前のスキームは単一の長さの段階にＡＰＳ及びＤＥ誘導を減少させ、３〜５日間にわたってＢＭＰを持続的に提供し（Nostro, M.C., Sarangi, F., Ogawa, S., Holtzinger, A., Corneo, B., Li, X., Micallef, S.J., Park, I.-H., Basford, C., Wheeler, M.B., et al. (2011). Stage-specific signaling through TGFβ family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development 138, 861-871、Touboul, T., Hannan, N.R.F., Corbineau, S., Martinez, A., Martinet, C., Branchereau, S., Mainot, S., Strick-Marchand, H., Pedersen, R., Di Santo, J., et al. (2010). Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology 51, 1754-1765）、同様により後の段階の中胚葉の夾雑をもたらし、ＤＥ形成を阻害した。注目すべきことに、ＢＭＰ及びＷｎｔがインビトロで（２４時間以内に）解釈された驚くべき時間的ダイナミズムは、胚盤葉上層、ＰＳ及びＤＥがマウス胚中で互いに２４時間以内にどのように生じるかを正確に追跡した。従って、前内胚葉又は抗内胚葉のいずれかとしてＢＭＰ及びＷｎｔを割り当てることは、これらのシグナルはちょうど２４時間以内に二分された結果を得るために動的に解釈されるため、誤った名称である。

【0213】

発生能力及びプレエンハンサー状態の多様性
発生能力に関するWaddingtonの形式主義以来（Waddington, C.H. (1940). Organisers and Genes (Cambridge, UK, Cambridge University Press)）、その分子的基礎は依然として謎が多い。運命付けられていない細胞中での発生エンハンサーの許容されるクロマチンプライミングは、能力の前兆となり得る（Calo, E., and Wysocka, J. (2013). Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Molecular Cell 49, 825-837）。様々なモデルが、活性化の前に「平衡化された」又は「潜在的な」クロマチン状態のいずれかにある迅速な誘導のためにプライミングされるエンハンサーを提唱した（Ostuni, R., Piccolo, V., Barozzi, I., Polletti, S., Termanini, A., Bonifacio, S., Curina, A., Prosperini, E., Ghisletti, S., and Natoli, G. (2013). Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells. Cell 152, 157-171、Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S.A., Flynn, R.A., and Wysocka, J. (2011). A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature 470, 279-283）。しかしながら、「平衡化された」又は「潜在的な」プレエンハンサー状態の相対的普及（及びそれらが全ての可能なプレエンハンサー状態を表すかどうか）は依然として不明確であった。

【0214】

ｈＥＳＣ中の全ての予想されるＤＥエンハンサーのクロマチン状態を、監視されていないクラスタリングを用いて問い合わせた。個々のＤＥエンハンサーは、「平衡化された」又は「潜在的な」状態を超えて伸長する、活性化の前に広く連続する示差的にマークされるプレエンハンサー状態で存在することがわかった。ＤＥエンハンサーのサブセットのみが、ｈＥＳＣ中のＫ４ｍｅ１、Ｋ２７ｍｅ３、ｐ３００又は他の提唱された「平衡化」因子によってプレマークされ、普遍的な平衡化サインは存在しないことを示した。

【0215】

驚くべきことに、多くの予想されるＤＥエンハンサーは、他の「開いた」又は「閉じた」クロマチンマークの全体的非存在下でＨ２ＡＺにより排他的にマークされることがわかった。これは、Ｈ２ＡＺがｍＥＳＣからのＤＥ誘導にとって機能的に必須であり、プロモーターでのその存在がＦＯＸＡ２動員の増加と相関したという最近の知見を補完するものである（Li, Z., Gadue, P., Chen, K., Jiao, Y., Tuteja, G., Schug, J., Li, W., and Kaestner, K.H. (2012). Foxa2 and H2A.Z Mediate Nucleosome Depletion during Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell 151, 1608-1616）。Ｈ２ＡＺは時には最も早く認識可能なエンハンサーマークであることが示された（Ｋ４ｍｅ１の代わりに）。従って、エンハンサー活性化の間のクロマチン変化の複数の可能な配列が存在し、従って、普遍的な初期エンハンサー「平衡化」事象は存在しない。ＤＥエンハンサーにＨ２ＡＺを予め配置することにより、分化の際に系列特定因子ＥＯＭＥＳ及びシグナリングエフェクターＳＭＡＤ２／３／４及びＦＯＸＨ１により最適な浸潤が可能となり、これらのＴＦの全てによる同時占有が最大のエンハンサー活性化と相関することがさらに推測された。要するに、これにより、ｈＥＳＣ中のＤＥエンハンサーの始原クロマチン状態が分化の際のその将来の関与に影響し得ることが証明された。

【0216】

複数の連続的内胚葉系列分岐の基礎となる発生シグナリング論理の説明は、多様なｈＰＳＣ株からの精製された内胚葉の普遍的生成において決定的であることが証明された。任意の運命付けられた細胞型の生成は、複数の前駆体の仲介によって起こる：従って、それぞれの中間体段階での高度に効率的な分化が、最終生成物の富化された収率を得るために必要である（McKnight, K., Wang, P., and Kim, S.K. (2010). Deconstructing pancreas development to reconstruct human islets from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 6, 300-308）。本発明者らは、高度に純粋な内胚葉集団が生着可能な内胚葉誘導体を生成し、内胚葉運命付けにおける正確な分子的洞察を得るための必須の基礎であることを示す。ＤＥ集団における異種性は以前には雑多な細胞型をもたらし、ＤＥ分化の分子サインを不明瞭にしてきた。発生ＴＦ及び細胞表面マーカー発現、クロマチン状態分析及び限定された発生能力の試験は全て、この研究において産生される内胚葉集団の純度及び同一性を実証及び確認するものである。

【0217】

まとめると、本明細書の開示は、内胚葉特定化及びパターン化を促進し、従って、ｈＰＳＣ分化を利用し、独特の視点からヒト発生生物学の知識を富化するシグナリング論理及びクロマチン動力学の理路整然とした見解を提供する。特に、ｈＰＳＣ分化から行われる観察は、独特な視点からの発生生物学の我々の知識を相互に富化するであろう。本明細書で報告されるシグナリング摂動、転写プロファイリング及びクロマチン分析はそれぞれ、ヒト内胚葉発生を活発にする外来シグナル、調節遺伝子及びゲノム調節エレメントを明らかにするものである。

【0218】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

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【図40】

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【図46】

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【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58-1】

【図58-2】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65】

【図66】

【図67】

【図68】

【図69】

【図70】

【図71】

【図72】

【図73】

【図74】

【図75】

【図76】

【図77】

【図78】

【図79】

【図80】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]