特許 6495821 ペプチドおよびそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6495821

(24)【登録日】2019年3月15日

(45)【発行日】2019年4月3日

(54)【発明の名称】ペプチドおよびそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/00 20060101AFI20190325BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20190325BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20190325BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20190325BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/00ZNA

   A61K38/10

   A61P31/04

   A61P31/10

【請求項の数】20

【全頁数】49

(21)【出願番号】特願2015-531049(P2015-531049)

(86)(22)【出願日】2013年9月9日

(65)【公表番号】特表2015-529221(P2015-529221A)

(43)【公表日】2015年10月5日

(86)【国際出願番号】SG2013000392

(87)【国際公開番号】WO2014039014

(87)【国際公開日】20140313

【審査請求日】2016年8月29日

(31)【優先権主張番号】201206671-8

(32)【優先日】2012年9月7日

(33)【優先権主張国】SG

(73)【特許権者】

【識別番号】503231882

【氏名又は名称】エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ

(73)【特許権者】

【識別番号】508320723

【氏名又は名称】シンガポール ヘルス サービシーズ ピーティーイー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャンドラ シェーカル、ヴァーマ

(72)【発明者】

【氏名】リー、ジャングオ

(72)【発明者】

【氏名】ラジャマニ、ラクシミナラヤナン

(72)【発明者】

【氏名】ビュールマン、ロジャー ウィルマー

(72)【発明者】

【氏名】リウ、ショウピーン

(72)【発明者】

【氏名】コウ、チュン チエ

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／１２１２８９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１１−５２１９０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５１７９８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５１０７０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１２０３５９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

Ａ６１Ｋ ４１／００−４５／０８

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ５０／００

Ａ６１Ｋ ５１／００

Ａ６１Ｋ ５１／０２

Ａ６１Ｋ ５１／０４

Ａ６１Ｋ ５１／０６

Ａ６１Ｋ ５１／０８

Ａ６１Ｋ ５１／１０

Ａ６１Ｋ ５１／１２

Ａ６１Ｐ ３１／０４

Ａ６１Ｐ ３１／１０

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式ＩＩＩ（配列番号６）：
［ＲＧＲＫＧＧＲＲ］_２ＫＫ
を含む、ペプチド。

【請求項2】

前記ペプチドが化学的に改変され、該改変が、アミド化、アセチル化、ステープリング、少なくとも１つのＬアミノ酸の対応するＤアミノ酸での置き換え、ならびに脂質化からなる群より選択される、請求項１記載のペプチド。

【請求項3】

前記改変が、脂質化である、請求項２記載のペプチド。

【請求項4】

式ＶＩＩＩ（配列番号２７）：
Ｘ^７［ＲＧＲＫＧＧＲＲ］_２ＫＫ、またはＸ^７［ＲＧＲＫＧＧＲＲ］_２ＲＲ
（式中、Ｘ^７は脂質基である）
を含む、ペプチド。

【請求項5】

前記Ｘ^７が−ＲＣＯＮＨであり、式中、Ｒは、ヒドロキシル基またはカルボニル基により随意に置換されたアルキルである、請求項４に記載のペプチド。

【請求項6】

前記ペプチドがＸ^７［ＲＧＲＫＧＧＲＲ］_２ＫＫであり、Ｘ^７が、以下からなる群より選択される、請求項５に記載のペプチド：
Ｃ_５Ｈ_１１−ＣＯ−ＮＨ；
Ｃ_７Ｈ_１５−ＣＯ−ＮＨ；および
Ｃ_９Ｈ_１９−ＣＯ−ＮＨ。

【請求項7】

式ＶＩＩＩ（配列番号２７）：
Ｘ^７［ＲＧＲＫＶＶＲＲ］_２ＫＫ、またはＸ^７［ＲＧＲＫＶＶＲＲ］_２ＲＲ
（式中、Ｘ^７は、脂質基であり、
Ｘ^７は、Ｃ_３Ｈ_７−ＣＯ−ＮＨ、Ｃ_５Ｈ_１１−ＣＯ−ＮＨ、Ｃ_７Ｈ_１５−ＣＯ−ＮＨ、Ｃ_９Ｈ_１９−ＣＯ−ＮＨ、およびＣ_１３Ｈ_２３−ＣＯ−ＮＨからなる群より選択される）
を含む、ペプチド。

【請求項8】

医薬品として使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項9】

請求項１〜７のいずれかに記載のペプチドを含有している組成物。

【請求項10】

さらなる抗微生物剤を含有している、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記抗微生物剤が抗生物質である、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドを有効量与えることを含む、以下からなる群より選択される、表面から、バイオフィルムを除去する方法：
船、造船所、フ−ドプロセサー、ミキサー、機械、コンテナ、水槽、水濾過装置、浄化システム、食品業界における防腐剤、パーソナルケア製品、外科用メス、針、鋏、および侵襲的外科手術、治療的または診断的手順において使用される他のデバイス；患者からの流体の除去または患者への流体の送達のための人工血管、カテーテル、および他のデバイス、人工心臓、人工腎臓、整形外科用の釘、プレート、およびインプラントを含む埋め込み型医療用装置；カテーテル、泌尿器科用の管および胆汁用の管、気管内チューブ、末梢血管から挿入可能な中心静脈カテーテル、透析用カテーテル、長期治療用中心静脈カテーテル、末梢静脈カテーテル、短期治療用中心静脈カテーテル、動脈カテーテル、肺カテーテル、Ｓｗａｎ−Ｇａｎｚカテーテル、尿カテーテル、腹膜カテーテル、長期治療用尿用デバイス、組織接合尿用デバイス、人工尿道括約筋、尿道拡張器、心室シャントまたは動静脈シャント；乳房インプラント、陰茎プロテーゼ、血管移植プロテーゼ、心臓弁、人工関節、人工咽頭、耳鼻科用インプラント、血管カテーテルポート、創部排液チューブ、水頭症シャント、ペースメーカーおよび埋め込み型除細動器、歯科用インプラント、充填物（ｆｉｌｉｎｇｓ）、総義歯、医療用機材、健康管理の設定において摩減したまたは人が持っている医療用ギア、医療用の手順に、あるいは、呼吸器の処置に使用される医療用装置、管、およびキャニスターの調製に使用される領域にあるカウンタートップならびに備品、ネブライザー、麻酔薬、手袋、エプロン、および安全マスク。

【請求項13】

細菌感染の処置、または細菌の除去、または内毒素の中和、または真菌感染もしくは蔓延の処置、あるいは真菌の除去のための医薬品の製造における、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドの使用。

【請求項14】

請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド、およびその説明書を含有しているキット。

【請求項15】

第２の治療薬をさらに含有している、請求項１４に記載のキット。

【請求項16】

前記細菌感染が、以下からなる群より選択される細菌感染である、請求項１３記載の使用：肺炎、肺結核、髄膜炎、下痢症、バイオフィルムの形成、化膿症（ｓｅｐｓｉｓ）、リステリア症、胃腸炎、毒素性ショック症候群、出血性大腸炎；溶血性尿毒症症候群、ライム病、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、ヒトエーリキア症、偽膜性大腸炎、コレラ、サルモネラ症、ネコ引っ掻き熱、壊死性筋膜炎（ＧＡＳ）、連鎖球菌毒素性ショック症候群、院内感染および市中感染症、アテローム性動脈硬化症、乳児突然死症候群（ＳＩＤＳ）、創傷感染、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、胃腸疾患、院内感染性心内膜炎（ｈｏｓｐｉｔａｌ−ａｃｑｕｉｒｅｄ ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、心内膜炎、感染性角膜炎、眼内炎、皮膚の細菌感染、感染性皮膚炎、丹毒、蜂窩織炎、膿痂疹、カルブンケル、毛包炎、および血流感染。

【請求項17】

前記細菌が、以下からなる群より選択される１またはそれ以上の細菌である、請求項１３に記載の使用：
Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌種、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｎａｐｌａｓｍａ菌種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌種、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ菌種、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌種、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ菌種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ菌種、Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ菌種、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ菌種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ菌種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌種、Ｃｏｘｉｅｌｌａ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ菌種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ菌種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌種、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｒｏｑｕｅｎｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ菌種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ菌種、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ菌種、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ菌種、Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ菌種、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌種、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌種、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌種、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ菌種、Ｖｉｂｒｉｏ菌種、Ｗｏｌｂａｃｈｉａ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ菌種。

【請求項18】

前記細菌が、以下からなる群より選択される細菌である、請求項１３に記載の使用：
Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒａｎｔｉｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ Ｉｓｒａｅｌｉｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｍａｒｇｉｎａｌｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｌａｍｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｍｉｎｏｇｅｎｉｃａ）、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｑｕｉｎｔａｎａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ菌群、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｍｅｔｉｉ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｌｏｒａｔｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｒｏｑｕｅｎｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ Ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｑｕｉｎｔａｎａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｅ、Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｈｅｎｓｅｌａｅ、Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａ、Ｒｏｔｈｉａ ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ａｖｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｃｅｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｏｍｍａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｗｏｌｂａｃｈｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ。

【請求項19】

前記真菌が、以下からなる群より選択される真菌である、請求項１３に記載の使用：
Ａｂｓｉｄｉａ、Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｈｏｒｔａｅａ、Ｉｓｓａｔｓｃｈｅｎｋｉａ、Ｍａｄｕｒｅｌｌａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｃｔｒｉａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、およびＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ。

【請求項20】

前記真菌が、以下からなる群より選択される真菌である、請求項１３に記載の使用：
Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ、Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｂｅｎｈａｍｉａｅ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｆｕｌｖｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｇｙｐｓｅｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｉｎｃｕｒｖａｔｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｏｔａｅおよびＡｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｖａｎｂｒｅｕｓｅｇｈｅｍｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣａｎｄｉｄａ ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ、Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｃａｒｒｉｏｎｉｉ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓおよびＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｐｏｓａｄａｓｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ Ｓｐ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｐｅｄｒｏｓｏｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ、Ｉｓｓａｔｓｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｍａｄｕｒｅｌｌａ ｇｒｉｓａｅ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｇｌｏｂｏｓａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｏｂｔｕｓａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｒｅｓｔｒｉｃｔａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｌｏｏｆｆｉａｅ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｆｕｌｖｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｅｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｎｅｃｔｒｉａ ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｐｉｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ、Ｓｐｏｒｏｔｈｎｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍおよびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、ならびにＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｉｎｋｉｎおよびＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｍｕｃｏｉｄｅｓ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年９月７日に提出されたシンガポール特許出願番号２０１２０６６７１−８の優先権の利益を主張し、その内容は全ての目的についてその全体が参照することにより本明細書中に組み込まれる。

【0002】

本発明は一般に、分子生物学および生化学の分野、そして特に、抗微生物ペプチドおよびそれらの使用のための方法およびその使用に関する。

【背景技術】

【0003】

抗微生物剤は、微生物の増殖を阻害するまたは微生物を死滅させるために使用される物質である。抗生物質または抗菌剤、抗真菌薬、抗ウイルス剤、あるいは抗寄生虫薬のような様々な抗微生物物質が当該分野で知られている。最も一般的に知られている抗微生物物質は抗生物質であり、これは、医療機関および医療機関以外で様々な用途に適用することができる。しかし、全ての社会的階層における抗生物質の見境のない使用が原因で、抗生物質耐性細菌が増加している。抗生物質に対する細菌のような微生物の耐性は、実質的により大きい耐性または低下した感受性から、抗生物質による影響を全く受けないまでの範囲であり得る。微生物を抗生物質剤または抗菌剤により制御できないかまたは死滅させることができない場合は、微生物は抗生物質の存在下であるにも関わらず、生存し、増幅し、そして宿主に疾患または損傷を引き起こすことができる。そのような抗生物質耐性微生物は、公衆衛生にとって相当の脅威となっている。

【0004】

上記を考慮すると、微生物に対して使用することができる代用ペプチドを提供することが必要である。

【発明の概要】

【0005】

１つの態様では、式Ｉ（配列番号１）：
［（Ｒ）_ａ（Ｘ^１）_ｂ（Ｘ^２）_ｃ（Ｘ^３）_ａ（Ｘ^４）_ｂ］_ｎ
を含むペプチドが提供される。１つの例では、Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^４は互いに独立して、Ｋ、Ｒ、Ｇ、およびＡからなる群より選択され；Ｘ^３はＫ、Ｒ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、またはＡである。１つの例では、ａおよびｂは独立して選択され、１〜１０までの整数である。１つの例では、ｃは、０〜５より選択される整数である。１つの例では、ｎは少なくとも１である。

【0006】

別の態様では、式ＶＩＩＩ（配列番号２７）：
Ｘ^７［ＲＧＲＫ（Ｘ^８）（Ｘ^９）（Ｒ）_ｆ］_ｎ（Ｘ^１０）_ｇ
を含むペプチドが提供される。１つの例では、Ｘ^７は脂質基である。１つの例では、Ｘ^８およびＸ^９は互いに独立して、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、およびグリシン（Ｇ）からなる群より選択される。１つの例では、Ｘ^１０は、リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）からなる群より選択される。１つの例では、ｅおよびｆは互いに独立して、０〜２より選択される整数である。１つの例では、ｎは少なくとも１である。

【0007】

別の態様では、医薬品としての使用のための本明細書中に記載されるペプチドが提供される。

【0008】

別の態様では、本明細書中に記載されるペプチドを含有している組成物が提供される。

【0009】

別の態様では、細菌感染を処置または細菌を除去する方法が提供される。この方法には、薬学的有効量の本明細書中に記載されるペプチドの投与が含まれる。

【0010】

別の態様では、内毒素を中和する方法が提供される。この方法には、薬学的有効量の本明細書中に記載されるペプチドの投与が含まれる。

【0011】

別の態様では、真菌感染または蔓延の処置、あるいは真菌を除去する方法が提供される。この方法には、薬学的有効量の本明細書中に記載されるペプチドの投与が含まれる。

【0012】

別の態様では、バイオフィルムを取り除く方法が提供される。この方法には、有効量の本明細書中に記載されるペプチドの投与が含まれる。

【0013】

別の態様では、細菌感染の処置、または細菌の除去、または内毒素の中和、または真菌感染もしくは蔓延の処置、あるいは真菌の除去のための医薬品の製造における本明細書中に記載されるペプチドの使用が提供される。

【0014】

別の態様では、本明細書中に記載されるペプチドを含有しているキットおよびその説明書が提供される。

【0015】

本発明は、非限定的な実施例と添付の図面と組み合わせて考察されると、詳細な説明を参照してさらに理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対するＣ８Ｖ２Ｄについてのｉｎ ｖｉｔｒｏでの時間−死滅反応速度アッセイのドットプロットを示す。したがって、図１は、本発明の例示的なペプチドが微生物を死滅させることにおいて有効であることを示す。

【図2】図２は、局所毒性試験後の角膜の写真画像を示す。局所毒性試験では、角膜の透明度を、Ｖ２ＤおよびＣ８ Ｖ２Ｄの適用後４日間の毎日の追跡調査でスリットランプ顕微鏡検査法によりチェックした。

【図3】図３（Ａ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のリポ多糖を有効に中和するその能力に対するペプチドの脂質の長さの改変の効果を説明しているドットプロットを示す。（Ｂ）は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のリポ多糖を有効に中和するその能力に対するペプチドの脂質の長さの改変の効果を説明しているドットプロットを示す。

【図4】図４は、本開示のペプチドおよび脂質改変ペプチドでのリポ多糖由来のボディパイＴＲカダベリン（ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）（ＢＣ）蛍光プローブの置換を示している曲線グラフを示す。図４は、本開示の脂質改変ペプチドによるＢＣの有効な置換を示す。したがって、本開示の脂質改変ペプチドがリポ多糖の中和に有効であることを説明している。

【図5】図５は、リポ多糖の透過化に対する本開示のペプチドおよび脂質改変ぺプチドの効果についての研究により得られた結果の棒グラフを示す。内側の左の棒は１．５６２５（μｇ／ｍｌ）を示し、ｘ軸の右側に向かって濃度が上昇する。図５は、本開示の脂質改変ペプチドがリポ多糖の透過化の誘導に有効であることを示す。

【図6】図６は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＤＭ４００１（Ａ）またはＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８７３９（Ｂ）の膜電位を変化させることについての本開示の脂質改変ペプチドの効果を示す。細菌における膜電位の変化は、計数毎秒（ｃ．ｐ．ｓ．）で示される、ＤｉＳＣ３−５の蛍光強度の変化で観察される。したがって、図６は、本開示の脂質改変ペプチドがＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＥ．ｃｏｌｉのいずれの膜電位においても変化を引き起こすことにおいて有効であることを示す。

【図7】図７は、バックライトアッセイにより観察されたように、本開示の脂質改変ペプチドによるＳ．ａｕｒｅｕｓの内膜の透過化の程度を示す。図７は、本開示のＣ１６−Ｖ２Ｄ脂質改変ペプチドがＳ．ａｕｒｅｕｓの内膜の透過化に有効であることを示す。

【図8】図８は、細菌膜（Ａ）または赤血球（Ｂ）を模倣するリポソームからのカルセインの漏出を引き起こすことにおける本開示の脂質改変ペプチドの効果についての研究の結果を示す。したがって、図８は、本開示の脂質改変ペプチドが、細菌膜については膜の漏出を選択的に引き起こし、哺乳動物の赤血球については引き起こさないことを示している。

【図9】図９は、本開示の脂質改変ペプチドまたはリポペプチドの設計を示す。本開示の脂質改変ペプチドまたはリポペプチドは、静電気的および疎水性相互作用によりリポ多糖と結合すると考えられている。（Ａ）は、本開示の脂質改変ペプチドの一例の構造を示す。（Ｂ）は、リポ多糖の構造を示す。（Ｃ）は、本開示の脂質改変ペプチドとリポ多糖との間での静電気的または疎水性相互作用を示す。

【図10】図１０は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ ９０２７）に感染したマウスの角膜に対する、第２の治療薬（ガチフロキサシンおよびＢ２０８８）と組み合わせた本開示のペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ試験の結果を示す。図１０は、本発明のペプチドと抗生物質の組み合わせがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの効率的な阻害をもたらすことを示す。

【図11】図１１は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ ９０２７）に感染したマウスの角膜に対する、第２の治療薬（ガチフロキサシンおよびＢ２０８８／９９）と組み合わせた本開示のペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ試験の結果を示す。図１１は、本発明のペプチドと抗生物質の組み合わせが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの最も有効な阻害を導く相乗効果を提供することを示す。

【図12】図１２は、（ａ）Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ９０２７株および（Ｂ）Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８５３株に対するＢ２０８８（すなわち、Ｖ２Ｄ）およびＢ２０８８＿９９（すなわち、Ｇ２二量体）の殺菌特性を示す。細菌細胞の生存性を５０％低下させるペプチドの有効用量（ＥＤ_５０）が、Ｂ２０８８（すなわち、Ｖ２二量体）に対してＢ２０８８＿９９（すなわち、Ｇ２二量体）については２分の１であることに留意されたい。したがって、図１２は、本開示のペプチドによる細菌の有効な死滅を示している。

【図13】図１３は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対するＢ２０８８（すなわち、Ｖ２二量体）およびＢ２０８８＿９９（すなわち、Ｇ２二量体）の時間−死滅反応速度を示す。Ｂ２０８８＿９９（すなわち、Ｇ２二量体）が、１×ＭＩＣおよび２×ＭＩＣでいずれのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株に対しても、速い死滅反応速度を示したことに留意されたい。したがって、図１３は、本開示のペプチドが対照よりも速く細菌の死滅を引き起こすことを示している。

【図14】図１４は、Ｂ２０８８（すなわち、Ｖ２二量体）およびＢ２０８８＿９９（すなわち、Ｇ２二量体）の外膜（ＯＭ）の透過性アッセイの結果を示す。ＮＰＮ蛍光強度の５０％の増大を引き起こすために必要なペプチド濃度（ＰＣ_５０）を測定した。Ｂ２０８８＿９９（すなわち、Ｇ２二量体）についてのＰＣ５０はＢ２０８８（すなわち、Ｖ２二量体）よりも高く、Ｂ２０８８（すなわち、Ｖ２Ｄ）がＢ２０８８ ９９（すなわち、Ｇ２二量体）と比較して優れた透過化効果を有していることを示している。

【図15】図１５は、Ｂ２０８８（すなわち、Ｖ２二量体）およびＢ２０８８＿９９（すなわち、Ｇ２二量体）の（Ａ）リポ多糖（ＬＰＳ）および（Ｂ）リピドＡとの相互作用を示す。ボディパイ置換アッセイ（Ｂｏｄｉｐｙ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｓｓａｙ）は、Ｂ２０８８ペプチドが、Ｂ２０８８＿９９（すなわち、Ｇ２二量体）よりも、ＬＰＳに対しては２倍強く、そしてリピドＡに対しては＞１０倍強く結合することを示唆していた。（Ｃ）は、ペプチドの阻害活性に対するＬＰＳの外からの付加の効果を示している競合阻害アッセイの結果を示す。結果は、Ｂ２０８８＿９９（すなわち、Ｇ２二量体）が、Ｂ２０８８（すなわち、Ｖ２二量体）のような優れたＬＰＳ中和効果は有していない可能性があることを示唆している。これらの結果によりさらに、Ｂ２０８８と比較して、ペプチドＢ２０８８＿９９（すなわち、Ｇ２二量体）がＬＰＳに弱く結合することがさらに確認される。（Ｄ）は、Ｂ２０８８（すなわち、Ｖ２二量体）およびＢ２０８８＿９９（すなわち、Ｇ２二量体）の最小発育阻止濃度値（ＭＩＣ）に対するＭｇ^２＋イオンの効果を示す。Ｍｇ^２＋は、グラム陰性細菌の外膜を安定化させ、陽イオン性物質の透過性をアンタゴナイズする。図１５Ｄは、リピドＡおよびＬＰＳに対するＢ２０８８（すなわち、Ｖ２二量体）の結合がＭｇ^２＋濃度に強く依存していることを示している。

【発明を実施するための形態】

【0017】

表の簡単な説明
表１Ａは、脂質改変されたＶ２二量体（Ｃ２−Ｃ１４ Ｖ２Ｄ）およびＶ２二量体（Ｖ２Ｄ）の最小阻害値（ＭＩＣ）により示す抗微生物活性の比較を示す。表１Ａは、改変されていないＶ２二量体ペプチドと比較した、脂質改変されたＣ８−Ｖ２二量体による微生物Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの阻害の有意な改善を示す。

【0018】

表１Ｂは、脂質改変されたＧ２二量体（Ｃ２−Ｃ１４ Ｇ２Ｄ）およびＧ２二量体（Ｇ２Ｄ）の最小阻害値の比較を示す。表１Ｂは、改変されていないＧ２二量体ペプチドと比較した、脂質改変されたＣ８−Ｇ２二量体およびＣ１０−Ｇ２二量体による、微生物Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）およびＫ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの阻害の有意な改善を示す。

【0019】

表２Ａは、メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）株およびメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）株のパネルに対するＶ２Ｄ、Ｃ８−Ｖ２Ｄ、およびＣ１０−Ｖ２Ｄの抗菌活性の比較を示す。表２Ａは、試験したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの１６の株のうち、Ｃ８−Ｖ２Ｄ二量体が、８つの株に対しては２倍の改善を、そして１つの株に対しては４倍の改善を提供したことを示している。これにより、全体として５６．３％の改善を提供している。Ｃ１０−Ｖ２Ｄ二量体は、１０の株に対して２倍の改善を提供した。これにより、全体として６２．５％の改善を提供している。

【0020】

表２Ｂは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのパネルに対するＶ２Ｄ、Ｃ８−Ｖ２Ｄ、およびＣ１０−Ｖ２Ｄの抗菌活性を示す。表２Ｂは、試験したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの１０の株のうち、Ｃ８−Ｖ２Ｄ二量体は、７つの株に対して２倍の改善を、そして１つの株に対しては４倍の改善を提供したことを示している。これにより、全体として、８０％の改善を提供している。Ｃ１０−Ｖ２Ｄ二量体は、７つの株に対しては２倍の改善を、そして１つの株に対しては４倍の改善を提供した。これにより、全体として、８０％の改善を提供している。

【0021】

表３Ａは、本開示のペプチドおよび脂質改変ペプチドの溶血活性を示す。表３Ａは、本開示の脂質改変ペプチドが有利なことに溶血を引き起こさないことを実証している。

【0022】

表３Ｂは、Ｖ２Ｄと比較したｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣ８Ｖ２Ｄの毒性研究の結果を示す。表３Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで非毒性である本開示の脂質改変ペプチドの一例を示す。

【0023】

表３Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏでの局所毒性試験および急性毒性試験におけるＣ８Ｖ２Ｄの安全濃度を示す。表３Ｃは、局所適用された場合に、本開示のペプチドが３ｍｇ／ｋｇを上回って寛容化されること、静脈内適用された場合は、本開示のペプチドが約６．２５ｍｇ／ｋｇで寛容化されること、腹腔内適用された場合は、本開示のペプチドが約１００ｍｇ／ｋｇで寛容化されることを示している。

【0024】

表４Ａは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のリポ多糖（ＬＰＳ）の５０％を中和するための、Ｖ２Ｄおよび脂質改変されたＶ２Ｄの有効濃度を示す。表４Ａは、本開示の脂質改変ペプチドがＥ．ｃｏｌｉ由来のリポ多糖の中和に有効であることを示している。

【0025】

表４Ｂは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のリポ多糖（ＬＰＳ）の５０％を中和するための、Ｖ２Ｄおよび脂質改変されたＶ２Ｄの有効濃度を示す。表４Ｂは、本開示の脂質改変ペプチドがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来のリポ多糖の中和に有効であることを示している。

【0026】

表５は、細菌に対する５種類の抗生物質を用いた、Ｖ２Ｄ、Ｃ６Ｖ２Ｄ、およびＣ８Ｖ２Ｄの部分阻害濃度指数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）を示す。表５は、本開示の脂質改変ペプチドのＣ６−Ｖ２二量体が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対して試験した５種類の抗生物質のうちの３種類において優れた相乗効果を有していたことを示している。Ｃ６−Ｖ２二量体と比較して、Ｃ８−Ｖ２二量体は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対してより弱い効果を有する。対照的に、本開示の脂質改変ペプチドのＣ８−Ｖ２二量体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに対して試験した場合は、脂質改変されていないペプチドよりもはるかに優れた相乗効果を有する。

【0027】

表６は、Ｂ２０８８（すなわち、Ｖ２Ｄ）およびＢ２０８８＿９９（すなわち、Ｇ２Ｄ）の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を示す。

【0028】

表７は、ＥＤ５０（細菌細胞の５０％を死滅させるための有効用量）により測定した場合の、Ｂ２０８８（すなわち、Ｖ２Ｄ）およびＢ２０８８＿９９（すなわち、Ｇ２Ｄ）の殺菌特性を示す。

【0029】

表８は、Ｂ２０８８（すなわち、Ｖ２Ｄ）およびＢ２０８８＿９９（すなわち、Ｇ２Ｄ）と様々なクラスの抗生物質との間で相乗作用を示す。多剤耐性株Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＤＲ４８７７を実験に使用した。部分阻害濃度（ＦＩＣ）指数を、本開示のペプチドと抗生物質との組み合わせの相乗効果を特性決定するために使用した。ＦＩＣ指数＜０．５、相乗的；加成性、０．５＜ＦＩＣ指数＞１．０；中立、１＜ＦＩＣ指数＜４；ＦＩＣ指数＞４、拮抗作用。

【0030】

抗微生物ペプチドは通常、小さい陽イオン性疎水性ペプチドとして特性決定される。当該分野で一般的に知られているように、疎水性部分を含むことは、細菌の膜に対する抗微生物作用に重要であると当該分野で考えられていた。そのような抗微生物ペプチドの一例が本明細書中で提供される。すなわち、１つの態様では、式Ｉ（配列番号１）：
［（Ｒ）_ａ（Ｘ^１）_ｂ（Ｘ^２）_ｃ（Ｘ^３）_ａ（Ｘ^４）_ｂ］_ｎ
を含むペプチドが提供される。式中、Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^４は互いに独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、およびアラニン（Ａ）からなる群より選択され、そしてＸ^３は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、グリシン（Ｇ）、またはアラニン（Ａ）である。

【0031】

同時に、人々が考えていることとは対照的に、本開示の発明者らは驚くべきことに、増強された抗微生物作用が疎水性アミノ酸を含まないペプチドにおいて観察され得ることを見出した。したがって、本開示はまた、疎水性アミノ酸の脱落により増強される有効な抗微生物作用を持つペプチドも提供する。例えば、式Ｉ（配列番号１）のＸ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４は、互いに独立して、非疎水性アミノ酸からなる群より選択され得る。１つの例では、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４は、互いに同じであってもまた異なっていてもよい。１つの例では、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４は、疎水性アミノ酸とは限らない。１つの例では、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）とは限らない。１つの例では、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４は、中性のアミノ酸であり得る。１つの例では、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４は、陽イオン性アミノ酸であり得る。１つの例では、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４は、互いに独立して、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、またはアラニン（ａｎａｌｉｎｅ）（Ａ）を含むがこれらに限定されるわけではないアミノ酸であり得る。１つの例では、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、またはアラニン（Ａ）であり得る。１つの例では、Ｘ^１は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、またはアラニン（Ａ）であり得る。１つの例では、Ｘ^２は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、またはアラニン（Ａ）であり得る。１つの例では、Ｘ^３は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、またはアラニン（Ａ）であり得る。１つの例では、Ｘ^４は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、またはアラニン（Ａ）であり得る。Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４は、上記アミノ酸の任意の組み合わせであり得る。すなわち、１つの例では、Ｘ^１はリジン（Ｋ）であり得、Ｘ^２はグリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）であり得、Ｘ^３はアルギニン（Ｒ）であり得、そしてＸ^４はリジン（Ｋ）であり得る。なお別の例においては、Ｘ^１は、グリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）であり得、Ｘ^２はリジン（Ｋ）であり得、Ｘ^３はグリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）であり得、そしてＸ^４はアルギニン（Ｒ）であり得る。

【0032】

１つの例では、ｎが少なくとも２である場合は、ペプチド配列のそれぞれが、少なくとも２つのリジン（Ｋ）残基で連結させられる。本明細書中で使用される場合は、「連結された（ｌｉｎｋｅｄ）」は、ペプチドの２つの配列が、それぞれのペプチドの枝が互いに自由に動くことを可能にする様式で互いにカップリングまたは結合されている場合をいう。「連結される」ためには、２つの配列が互いにすぐ隣接していることが不可欠である。１つの例では、本明細書中に記載されるペプチドの複数の単量体が、共有結合によってリジン（Ｋ）残基により連結される。

【0033】

本明細書中で使用される場合は、用語「ぺプチド」は、単離されたペプチドをいう。さらに、本明細書中で使用される場合は、用語「アミノ酸」には、自然界に存在するおよび自然界には存在しないＬアミノ酸およびＤアミノ酸、ペプチド模倣アミノ酸、ならびに、標準的な機械によっては作製されないか、または、翻訳後修飾後のタンパク質中に、もしくは代謝中間体としてのみ見られる標準的ではないアミノ酸が含まれる。

【0034】

１つの例では、リジン（Ｋ）連結はＣ末端にある。用語「Ｃ末端」は、当該分野で一般的に公知であるその定義にしたがって本明細書中で使用される。すなわち、カルボキシル末端、カルボキシ末端、Ｃ末端テール、Ｃ末端、またはＣＯＯＨ末端（これらは、遊離のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で終わるアミノ酸鎖の末端をいう）のような任意の技術用語と互換的に使用することができる。本明細書中に記述される場合は、本明細書中に記載されるペプチドは、右側にＣ末端、そして左側にＮ末端として表される。

【0035】

本開示のペプチドがリジン（Ｋ）連結により連結された分岐ペプチドとして提供される場合、例えば、ｎが２である場合は、ペプチドは二量体であり、構造：［（Ｒ）_ａ（Ｘ^１）_ｂ（Ｘ^２）_ｃ（Ｘ^３）_ａ（Ｘ^４）_ｂ］_２ＫＫまたは［（Ｒ）_ａ（Ｘ^１）_ｂ（Ｘ^２）_ｃ（Ｘ^３）_ａ（Ｘ^４）_ｂ］−Ｋ−Ｋ−［（Ｘ^４）_ｂ（Ｘ^３）_ａ（Ｘ^２）_ｃ（Ｘ^１）_ｂ（Ｒ）_ａ］を有し得る。

【0036】

一方、ｎが３である場合は、ペプチドは三量体であり、構造：［（Ｒ）_ａ（Ｘ^１）_ｂ（Ｘ^２）_ｃ（Ｘ^３）_ａ（Ｘ^４）_ｂ］_３Ｋ_２Ｋを有し得る。

【0037】

１つの例で、ｎが４である場合は、ペプチドは四量体であり、構造：［（Ｒ）_ａ（Ｘ^１）_ｂ（Ｘ^２）_ｃ（Ｘ^３）_ａ（Ｘ^４）_ｂ］_４Ｋ_３Ｋを有し得る。

【0038】

１つの例では、Ｘ^２はリジン（Ｋ）であり得、Ｘ^４はアルギニン（Ｒ）であり得る。そのような例では、ペプチドは式ＩＩ（配列番号２）：
［（Ｒ）_ａ（Ｘ）_ｃ（Ｋ）_ｂ（Ｘ）_ｃ（Ｒ）_ａ（Ｘ）_ｃ（Ｋ）_ｂ］_ｎ（Ｋ）_ｎＫ
を含み得る。

【0039】

１つの例では、式ＩＩ（配列番号２）のＸは、グリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）であり得る。１つの例では、式ＩＩ（配列番号２）のＸはグリシン（Ｇ）であり得る。１つの例では、式ＩＩ（配列番号２）のＸはアラニン（Ａ）であり得る。

【0040】

１つの例では、ａおよびｂは独立して１から１０までの整数より選択され得る。１つの例では、ａおよびｂは、互いに同じであってもまた異なっていてもよい。１つの例では、ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。１つの例では、ｂは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。したがって、１つの例では、ａは１であり得、そしてｂは１であり得る；ａは１であり得、そしてｂは２であり得る；ａは１であり得、そしてｂは３であり得る；ａは１であり得、そしてｂは４であり得る；ａは１であり得、そしてｂは５であり得る；ａは１であり得、そしてｂは６であり得る；ａは１であり得、そしてｂは７であり得る；ａは１であり得、そしてｂは８であり得る；ａは１であり得、そしてｂは９であり得る；ａは１であり得、そしてｂは１０であり得る；ａは２であり得、そしてｂは１であり得る；ａは３であり得、そしてｂは１であり得る；ａは４であり得、そしてｂは１であり得る；ａは５であり得、そしてｂは１であり得る；ａは６であり得、そしてｂは１であり得る；ａは７であり得、そしてｂは１であり得る；ａは８であり得、そしてｂは１であり得る；ａは９であり得、そしてｂは１であり得る；ａは１０であり得、そしてｂは１であり得る；ａは２であり得、そしてｂは２であり得る；ａは２であり得、そしてｂは３であり得る；ａは２であり得、そしてｂは４であり得；そしてそれらの任意の組み合わせでもあり得る。

【0041】

１つの例では、ｃは０から５より選択される整数であり得る。１つの例では、ｃは、０、１、２、３、４、または５であり得る。

【0042】

１つの例では、ｎは少なくとも１であり得、少なくとも２であり得、少なくとも３または４であり得る。１つの例では、ｎは、１から８より選択される整数であり得る。したがって、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、または８であり得る。別の例では、ｎは１から４より選択される整数ではなくてもよい。したがって、ｎは、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、または８であり得る。

【0043】

１つの例では、式ＩＩ（配列番号２）のペプチドは以下を含み得るが、これらに限定されるわけではない：［（Ｒ）_ａ（Ｘ）_ｃ（Ｋ）_ｂ（Ｘ）_ｃ（Ｒ）_ａ（Ｘ）_ｃ（Ｋ）_ｂ］_２ＫＫ（配列番号３、これは二量体である）、［（Ｒ）_ａ（Ｘ）_ｃ（Ｋ）_ｂ（Ｘ）_ｃ（Ｒ）_ａ（Ｘ）_ｃ（Ｋ）_ｂ］_２ＫＫ［（Ｋ）_ｂ（Ｘ）_ｃ（Ｒ）_ａ（Ｘ）_ｃ（Ｋ）_ｂ（Ｘ）_ｃ（Ｒ）_ａ］（配列番号４、これは三量体である）、および［（Ｒ）_ａ（Ｘ）_ｃ（Ｋ）_ｂ（Ｘ）_ｃ（Ｒ）_ａ（Ｘ）_ｃ（Ｋ）_ｂ］_４（Ｋ）_３Ｋ（配列番号５、これは四量体である）。

【0044】

１つの例で、Ｘ^３がアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ^４がリジン（Ｋ）であるとき、ペプチドは式ＩＩＩ（配列番号６）：
［Ｒ（Ｘ^５）_ｄＲＫ（Ｘ^６）_ｅＲＲ］_ｎ（Ｋ）_ｎ−１Ｋ
を含む。

【0045】

１つの例では、Ｘ^５およびＸ^６は、互いに同じであってもまた異なっていてもよい。１つの例では、Ｘ^５およびＸ^６は互いに独立して、以下を含むがこれらに限定されるわけではないアミノ酸である：アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、またはアラニン（Ａ）。１つの例では、Ｘ^５およびＸ^６は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、またはアルギニン（Ｒ）であり得る。１つの例では、Ｘ^５はグリシン（Ｇ）であり得、そしてＸ^６はグリシン（Ｇ）であり得る。１つの例では、Ｘ^５はアラニン（Ａ）であり得、そしてＸ^６はグリシン（Ｇ）であり得る。１つの例では、Ｘ^５はアルギニン（Ｒ）であり得、そしてＸ^６はグリシン（Ｇ）であり得る。１つの例では、Ｘ^５はグリシン（Ｇ）であり得、そしてＸ^６はアラニン（Ａ）であり得る。１つの例では、Ｘ^５はアラニン（Ａ）であり得、そしてＸ^６はアラニン（Ａ）であり得る。１つの例では、Ｘ^５はアルギニン（Ｒ）であり得、そしてＸ^６はアラニン（Ａ）であり得る。１つの例では、Ｘ^５はグリシン（Ｇ）であり得、そしてＸ^６はアルギニン（Ｒ）であり得る。１つの例では、Ｘ^５はアラニン（Ａ）であり得、そしてＸ^６はアルギニン（Ｒ）であり得る。１つの例では、Ｘ^５はアルギニン（Ｒ）であり得、そしてＸ^６はアルギニン（Ｒ）であり得る。

【0046】

１つの例では、ｄおよびｅは互いに独立して、０から２より選択される整数であり得る。１つの例では、ｄまたはｅは、０、１、または２であり得る。１つの例では、ｄは、０、１、または２であり得る。１つの例では、ｅは、０、１、または２であり得る。したがって、ｄは０であり得、そしてｅは０であり得る；ｄは０であり得、そしてｅは１であり得る；ｄは０であり得、そしてｅは２であり得る；ｄは１であり得、そしてｅは０であり得る；ｄは１であり得、そしてｅは１であり得る；ｄは１であり得、そしてｅは２であり得る；ｄは２であり得、そしてｅは０であり得る；ｄは２であり得、そしてｅは１であり得る；または、ｄは２であり得、そしてｅは２であり得る。

【0047】

１つの例では、Ｘ^５がアラニン（Ａ）であり、ｄが１である場合は、式ＩＩＩ（配列番号６）は式ＩＶ（配列番号７）：
［ＲＡＲＫ（Ｘ^６）_ｅＲＲ］_ｎ（Ｋ）_ｎ−１Ｋ
を含み得る。

【0048】

１つの例では、ｅは、０から２より選択される整数であり得る。１つの例では、ｅは、０、１、または２であり得る。

【0049】

１つの例では、ｎは少なくとも１であり得、少なくとも２であり得、少なくとも３であり得、または４であり得る。１つの例では、ｎは整数であり得る。１つの例では、ｎが整数である場合は、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、または８であり得る。１つの例では、ｎは整数でなくてもよい。したがって、ｎは、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、または８であり得る。

【0050】

１つの例では、Ｘ^６はグリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）であり得る。したがって、式ＩＶのペプチドは以下を含み得るが、これらに限定されるわけではない：（ＲＡＲＫＧＧＲＲ）_２ＫＫ（配列番号４４）、（ＲＡＲＫＧＲＲ）_２ＫＫ（配列番号４５）、（ＲＡＲＫＡＲＲ）_２ＫＫ（配列番号４６）、（ＲＡＲＫＡＡＲＲ）_２ＫＫ（配列番号８）、および（ＲＡＲＫＲＲ）_２ＫＫ（配列番号９）。

【0051】

１つの例では、Ｘ^５がグリシン（Ｇ）であり、そしてｄが１である場合は、式ＩＩＩ（配列番号６）は式Ｖ（配列番号１０）：
［ＲＧＲＫ（Ｘ^６）_ｅＲＲ］_ｎ（Ｋ）_ｎ−１Ｋ
を含み得る。

【0052】

１つの例では、Ｘ^６は、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）であり得る。１つの例では、式Ｖのペプチドに以下が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない：（ＲＧＲＫＧＧＲＲ）_２ＫＫ（配列番号１１；または用語「Ｂ２０８８＿９９」、「Ｂ２０８８／９９」、「Ｇ２Ｄ」および「Ｇ２Ｄ二量体」と互換的に使用される）、（ＲＧＲＫＧＧＲＲ）_２ＫＫ（配列番号１２）、（ＲＧＲＫＧＲＲ）_２ＫＫ（配列番号１３）、（ＲＧＲＫＲＲ）_２ＫＫ（配列番号１４）、（ＲＧＲＫＡＡＲＲ）_２ＫＫ（配列番号１５）、（ＲＧＲＫＡＲＲ）_２ＫＫ（配列番号１６）、（ＲＧＲＫＧＧＲＲ）_２ＫＫＲＲＧＧＫＲＧＲ（配列番号１７）、（ＲＧＲＫＧＲＲ）_２ＫＫＲＲＧＫＲＧＲ（配列番号１８）、（ＲＧＲＫＲＲ）_２ＫＫＲＲＫＲＧＲ（配列番号１９）、および（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）_２ＫＫ（配列番号４７；または用語「Ｂ２０８８」、「Ｖ２Ｄ」および「Ｖ２Ｄ二量体」と互換的に使用される）。

【0053】

１つの例では、ｄおよびｅが０である場合は、式ＩＩＩ（配列番号６）は式ＶＩ（配列番号２０）：
［ＲＲＫＲＲ］_ｎ（Ｋ）_ｎ−１Ｋ
を含み得る。

【0054】

１つの例では、式ＶＩのペプチドは、（ＲＲＫＲＲ）_２ＫＫ（配列番号２１）および（ＲＲＫＲＲ）_２ＫＫＲＲＫＲＲ（配列番号２２）を含み得るが、これらに限定されるわけではない。

【0055】

１つの例では、Ｘ^１がリジン（Ｋ）であり、Ｘ^３がアルギニン（Ｒ）であり、そしてＸ^４がリジン（Ｋ）である場合は、式ＩＩ（配列番号２）のペプチドは式ＶＩＩ（配列番号２３）：
［（Ｒ）_ａ（Ｋ）_ｂ（Ｘ）_ｃ（Ｒ）_ａ（Ｋ）_ｂ］_ｎ（Ｋ）_ｎ−１Ｋ
を含み得る。

【0056】

１つの例では、式ＶＩＩ（配列番号２３）のＸは、非疎水性アミノ酸であり得る。言い換えると、式ＶＩＩ（配列番号２３）のＸは疎水性アミノ酸でなくてもよい。１つの例では、式ＶＩＩ（配列番号２３）のＸは、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、またはアラニン（Ａ）であり得る。

【0057】

１つの例では、式ＶＩＩ（配列番号２３）のＸはＧまたはＡであり得る。１つの例では、式ＶＩＩのペプチドは、［（Ｒ）_ａ（Ｋ）_ｂＸ_ｃ（Ｒ）_ａ（Ｋ）_ｂ］_２ＫＫ（配列番号２４）、［（Ｒ）_ａ（Ｋ）_ｂＸ_ｃ（Ｒ）_ａ（Ｋ）_ｂ］_２ＫＫ［（Ｋ）_ｂ（Ｒ）_ａＸ_ｃ（Ｋ）_ｂ（Ｒ）_ａ］（配列番号２５）、および［（Ｒ）_ａ（Ｋ）_ｂＸ_ｃ（Ｒ）_ａ（Ｋ）_ｂ］_４Ｋ_３Ｋ（配列番号２６）を含み得るが、これらに限定されるわけではない。

【0058】

別の態様では、式ＶＩＩＩ（配列番号２７）：
Ｘ^７［ＲＧＲＫ（Ｘ^８）（Ｘ^９）（Ｒ）_ｆ］_ｎ（Ｘ^１０）_ｇ
を含むペプチドが提供される。

【0059】

１つの例では、Ｘ^７は脂質基である。１つの例では、Ｘ^７は−ＲＣＯＮＨであり得、式中、Ｒは、ヒドロキシル基、カルボニル基、またはアルケニル基により随意に置換されたアルキルを含み得るが、これらに限定されるわけではない。例えば、Ｘ^７は、Ｃ_ｍＨ_２ｍ−１−ＣＯＮＨであり得、式中、ｍは１から２５より選択される整数であり得る。本開示のペプチドのいくつかの例においては、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５であり得る。ｍが２５である場合は、脂質基はセロチン酸で改変される。脂質基としてはまた、１つのまたは複数の二重結合を持つ不飽和脂肪酸のシス形態あるいはトランス形態（これらは合成のものであっても、また自然界から導かれたもの（例えば、微生物により生産された脂肪酸）であってもよい）が挙げられ得る。

【0060】

例えば、Ｘ^７としては、（ＣＨ_３）−ＣＯＮＨ−、Ｃ_３Ｈ_７−ＣＯ−ＮＨ−、Ｃ_５Ｈ_１１−ＣＯ−ＮＨ−、Ｃ_７Ｈ_１５−ＣＯ−ＮＨ−、Ｃ_９Ｈ_１９−ＣＯ−ＮＨ−、Ｃ_１１Ｈ_２３−ＣＯ−およびＣ_１５Ｈ_３１−ＣＯ−ＮＨ−が挙げられ得るが、これらに限定されるわけではない。１つの例では、脂質基はペプチドに共有結合させられる。

【0061】

本開示では、脂質基に結合させられるペプチドは、用語「リポペプチド」または「脂質改変ペプチド」と互換的に記載され得る。

【0062】

本開示の脂質改変ペプチドの脂質基は、当該分野で公知の方法を使用することにより、例えば、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して、ペプチドにカップリングされ得る。簡単に説明すると、ＳＰＰＳの一般的な原理は、カップリング−洗浄−脱保護−洗浄プロセスのサイクルの繰り返しを使用することである。すなわち、ぺプチドは、不溶性および／または多孔性であり得る固相、例えば、小さい固体ビーズまたは樹脂上に固定される。固定化後、ペプチドは機能単位で処理される。次に、固定化されたペプチドの遊離のＮ末端アミンが、１つのＮ保護アミノ酸単位にカップリングされる。次に、この単位が、ピぺリジンのような適切な試薬を使用して脱保護されて遊離のＮ末端アミンが露わにされ、これが、遊離のカルボキシル基を伴う次のＮ保護アミノ酸との結合に使用され得る。反応混合物は各工程で濾過され、ビーズまたは樹脂上に固定化されたペプチドが濾過工程の間保持される。一方、液相試薬と合成の副生成物は洗い流される。脂質改変ペプチドを合成するためには、遊離のカルボン酸を持つＮ保護アミノ酸の代わりに、遊離のカルボン酸を持つ所望される炭素の長さの脂肪酸がカップリングプロセスにおいて使用される。カップリングプロセスに使用される試薬は、２つのアミノ酸のカップリングに使用されたものと同様である。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のような切断試薬によりビーズまたは樹脂からペプチドが切断される前、成長しつつあるペプチドはビーズまたは樹脂に共有結合したままであろう。切断後、ペプチドまたは脂質改変ペプチドが回収され、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して精製されるであろう。

【0063】

本開示のペプチドは、一方の末端にＣＯＯＨ基を有している脂肪酸にカップリングされ得る。例えば、ペプチドは、パルミチン酸：

【化1】

に対してカップリングされ得る。パルミチン酸は、本開示のペプチドのＮ末端のＮＨ_２基にカップリングされる。

【0064】

本開示のペプチドの脂質基は、例えば、限定されるわけではないが、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、Ν，Ν’−ジシクロヘキシルカルボジイミドなどのような適切なペプチドカップリング剤を使用してカップリングされ得る。

【0065】

１つの例では、Ｘ^８およびＸ^９は互いに独立していてもよい。１つの例では、Ｘ^８およびＸ^９は互いに同じであってもまた異なっていてもよい。１つの例では、Ｘ^８およびＸ^９は、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、またはバリン（Ｖ）であり得る。１つの例では、Ｘ^８およびＸ^９は、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、またはグリシン（Ｇ）であり得る。別の例では、Ｘ^８およびＸ^９は、バリン（Ｖ）またはグリシン（Ｇ）であり得る。

【0066】

１つの例では、Ｘ^１０は、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、またはバリン（Ｖ）であり得る。１つの例では、Ｘ^１０は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）のような陽イオン性アミノ酸であり得る。１つの例では、Ｘ^１０は、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）であり得る。

【0067】

１つの例では、ｆおよびｇは互いに独立して、０から２より選択される整数であり得る。１つの例では、ｆまたはｇは、０、１、または２であり得る。１つの例では、ｆは、０、１、または２であり得る。１つの例では、ｇは、０、１、または２であり得る。したがって、ｆは０であり得、そしてｇは０であり得；ｆは０であり得、そしてｇは１であり得る；ｆは０であり得、そしてｇは２であり得る；ｆは１であり得、そしてｇは０であり得る；ｆは１であり得、そしてｇは１であり得る；ｆは１であり得、そしてｇは２であり得る；ｆは２であり得、そしてｇは０であり得る；ｆは２であり得、そしてｇは１であり得る；また、ｆは２であり得、そしてｇは２であり得る。

【0068】

１つの例では、ｎは少なくとも１である。１つの例では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、または８であり得る。

【0069】

１つの例では、Ｘ^８およびＸ^９がバリン（Ｖ）である場合は、式ＶＩＩＩ（配列番号２７）は、脂質改変されたＶ２二量体、またはＶ２Ｄ、またはＢ２０８８（すなわち、（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）_２ＫＫ）；配列番号４７）と呼ばれ得る。１つの例では、ペプチドは、以下を含み得るが、これらに限定されるわけではない：（ＣＨ_３−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＶＶＲＲ）_２ＫＫ（配列番号２８またはＣ２−Ｖ２二量体）、（Ｃ_３Ｈ_７−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＶＶＲＲ）_２ＫＫ（配列番号２９またはＣ４−Ｖ２二量体）、（Ｃ_５Ｈ_１１−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＶＶＲＲ）_２ＫＫ（配列番号３０またはＣ６−Ｖ２二量体）、（Ｃ_７Ｈ_１５−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＶＶＲＲ）_２ＫＫ（配列番号３１またはＣ８−Ｖ２二量体）、（Ｃ_９Ｈ_１９−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＶＶＲＲ）_２ＫＫ（配列番号３２またはＣ１０−Ｖ２二量体）、（Ｃ_１１Ｈ_２３−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＶＶＲＲ）_２ＫＫ（配列番号３３またはＣ１２−Ｖ２二量体）、（Ｃ_１３Ｈ_２３−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＶＶＲＲ）_２ＫＫ（配列番号３４またはＣ１４−Ｖ２二量体）、および（Ｃ_１５Ｈ_３１−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＶＶ）_２ＫＫ（配列番号３５またはＣ１６−Ｖ２二量体）。１つの例では、ペプチドは、（Ｃ_７Ｈ_１５−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＶＶＲＲ）_２ＫＫ（配列番号３１またはＣ８−Ｖ２二量体）および（Ｃ_９Ｈ_１９−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＶＶＲＲ）_２ＫＫ（配列番号３２またはＣ１０−Ｖ２二量体）であり得る。表１Ａ、２Ａ、２Ｂ、４Ａ、および４Ｂに示すように、脂質改変されていないペプチドと比較して、これらの脂質改変ペプチドは改善された抗微生物活性を有する。

【0070】

１つの例では、Ｘ^８およびＸ^９がグリシン（Ｇ）である場合は、式ＶＩＩＩ（配列番号２７）は、脂質改変されたＧ２二量体、またはＧ２Ｄ、またはＢ２０８８＿９９、またはＢ２０８８／９９（すなわち、（ＲＧＲＫＧＧＲＲ）_２ＫＫ）（配列番号１１））と呼ばれ得る。１つの例では、ペプチドは以下を含み得るが、これらに限定されるわけではない：（ＣＨ_３−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＧＧＲＲ）_２ＫＫ（配列番号３６またはＣ２−Ｇ２二量体）、（Ｃ_３Ｈ_７−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＧＧＲＲ）_２ＫＫ（配列番号３７またはＣ４−Ｇ２二量体）、（Ｃ_５Ｈ_１１−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＧＧＲＲ）_２ＫＫ（配列番号３８またはＣ６−Ｇ２二量体）、（Ｃ_７Ｈ_１５−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＧＧＲＲ）_２ＫＫ（配列番号３９またはＣ８−Ｇ２二量体）、（Ｃ_９Ｈ_１９−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＧＧＲＲ）_２ＫＫ（配列番号４０またはＣ１０−Ｇ２二量体）、（Ｃ_１１Ｈ_２３−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＧＧＲＲ）_２ＫＫ（配列番号４１またはＣ１２−Ｇ２二量体）、（Ｃ_１３Ｈ_２３−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＧＧＲＲ）_２ＫＫ（配列番号４２またはＣ１４−Ｇ２二量体）、および（Ｃ_１５Ｈ_３１−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＧＧＲＲ）_２ＲＲ（配列番号４３またはＣ１６−Ｇ２二量体）。１つの例では、ペプチドは、（Ｃ_７Ｈ_１５−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＧＧＲＲ）_２ＫＫ（配列番号３９またはＣ８−Ｇ２二量体）および（Ｃ_９Ｈ_１９−ＣＯ−ＮＨ−ＲＧＲＫＧＧＲＲ）_２ＫＫ（配列番号４０またはＣ１０−Ｇ２二量体）であり得る。表１Ｂに示されるように、脂質改変されていないペプチドと比較すると、これらの脂質改変ペプチドは、改善された抗微生物活性を有する。

【0071】

１つの例では、本明細書中に記載されるペプチドは化学的に改変され得る。１つの例では、化学的改変には、アミド化、アセチル化、ステープリング（ｓｔａｐｌｉｎｇ）、少なくとも１つのＬアミノ酸の対応するＤアミノ酸での置き換え、少なくとも１つの非天然のアミノ酸の導入または少なくとも１つのアミノ酸の非天然のアミノ酸での置き換え、ならびに脂質化が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。本明細書中で使用される場合は、用語「脂質化」は、脂質基のペプチド鎖に対する共有結合を生じる改変をいう。脂質化には、Ｎ−ミリストイル化、パルミトイル化、ＧＰＩ−アンカー付加、プレニル化、細菌タンパク質（Ｓ−ジアシルグリセロール）の脂質化、および他のタイプの脂質化が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。

【0072】

１つの例では、本明細書中に記載されるペプチドはさらに、第２の治療薬を含み得る。本開示の発明者らは、本明細書中に記載されるペプチドを抗生物質のような第２の治療薬と組み合わせた場合の、驚くほどの相乗効果を見出した。理論に束縛されることは望ましくないが、本発明者らは、本明細書中に記載されるペプチドの脂質基がリポ多糖を感作させることにおいて重要であると考える。本開示のペプチドは、静電気的相互作用および疎水性相互作用の両方によりリポ多糖に有効に結合することによってリポ多糖を中和すると考えられる（本開示の脂質改変ペプチドとリポ多糖との間での相互作用の説明については図９Ｃを参照のこと）。リポ多糖は、リポ多糖構造の完全性を破壊することにより中和される。リポ多糖は抗微生物物質による攻撃からグラム陰性細菌を保護する主なバリアであるので、リポ多糖の中和は、グラム陰性細菌を他の抗微生物物質に対してより敏感にする。したがって、リポ多糖構造の完全性を破壊する能力は、本開示のペプチドが他の抗微生物薬と有効に相乗作用することを有利に可能にする。すなわち、本明細書中に記載されるペプチドの抗生物質のような第２の治療薬との組み合わせが、微生物を相乗効果により死滅させる。本明細書中で使用される場合は、用語「相乗作用の（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ）」は、本開示のペプチドと第２の治療薬とにより観察される抗微生物効果の合計よりも大きい効果をいう。すなわち、本開示のペプチドの第２の治療薬との組み合わせは、本開示のペプチドおよび第２の治療薬の個々の効果の合計よりも大きい抗微生物効果を提供する。

【0073】

相乗効果は、本開示のペプチドと第２の治療薬が（１）一緒に処方され、投与されるか、または１つに合わせられた処方物の中で同時に送達される場合；（２）別の処方物として交互に、または並行して送達される場合；あるいは、（３）いくつかの他のレジュメにより送達される場合に達成され得る。交互療法（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）において送達される場合は、相乗効果は、本開示のペプチドと第２の治療薬が連続して、例えば、別の錠剤、丸剤、またはカプセル剤の中で、あるいは、別の注射器で異なる注射により投与あるいは送達される場合に達成され得る。一般的には、交互療法の際には、本開示のペプチドおよび第２の治療薬のそれぞれの有効用量が連続して、すなわち、順次投与される。驚くほどの相乗効果を示している例示的な結果が、以下の実験のセクションの実施例８および１１に提供される。

【0074】

本明細書中で使用される場合は、用語「抗微生物物質（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ）」は、微生物により引き起こされる疾患を排除する、軽減する、または防止することができる、本開示のペプチドのような物質をいう。本明細書中で使用される場合は、用語「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」はそのもっとも広い意味で使用され、したがって、その範囲は原核生物に限定されない。むしろ、用語「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」には、細菌、古細菌、酵母、真菌、原生動物、および藻類が、その範囲に含まれる。

【0075】

別の態様では、細菌感染の処置または細菌の除去の方法が提供される。この方法には、薬学的有効量の本明細書中に記載されるペプチドの投与が含まれる。用語「処置する」、「処置」、およびそれらの文法上のバリエーションは、治療的処置、および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または防止的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）措置の両方をいう。ここでは、目的は、望ましくない生理学的状態、障害、もしくは疾患を防止するかまたは遅らせる（減じる）こと、あるいは、有用なまたは望ましい臨床結果を得ることである。そのような有用なまたは望ましい臨床結果には、症候の緩和；状態、障害、または疾患の程度の縮小；状態、障害、または疾患の安定化された（すなわち、悪化していない）状態；状態、障害、または疾患の進行の遅延または減速；状態、障害、または疾患状態の改善、寛解（部分的であるか全体としてであるかは問わない）（検出可能であるかまたは検出不可能であるかは問わない）；あるいは、状態、障害、または疾患の改良（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）または改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。処置には、過剰なレベルの副作用を伴わない、臨床的に有意義な細胞性の応答を誘発することが含まれる。処置にはまた、処置を受けていない場合に予想される生存と比較した、生存の延長も含まれる。

【0076】

１つの例では、細菌はグラム陽性細菌であってよく、またグラム陰性細菌であってもよい。したがって、細菌は以下を含むがこれらに限定されるわけではない属の細菌であり得る：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌種、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｎａｐｌａｓｍａ菌種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌種、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ菌種、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌種、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ菌種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ菌種、Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ菌種、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ菌種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ菌種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌種、Ｃｏｘｉｅｌｌａ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ菌種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ菌種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌種、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｒｏｑｕｅｎｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ菌種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ菌種、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ菌種、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ菌種、Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ菌種、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌種、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌種、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌種、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ菌種、Ｖｉｂｒｉｏ菌種、Ｗｏｌｂａｃｈｉａ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ菌種。
１つの例では、細菌感染は、以下を含むがこれらに限定されるわけではない細菌により引き起こされ得る：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒａｎｔｉｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ Ｉｓｒａｅｌｉｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｍａｒｇｉｎａｌｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｌａｍｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｍｉｎｏｇｅｎｉｃａ）、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｑｕｉｎｔａｎａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ菌群、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ．（例えば、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、ｔｅｔａｎｉ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｍｅｔｉｉ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｌｏｒａｔｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｒｏｑｕｅｎｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ Ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｑｕｉｎｔａｎａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｅ、Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｈｅｎｓｅｌａｅ、Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａ、Ｒｏｔｈｉａ ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ａｖｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｃｅｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｏｍｍａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｗｏｌｂａｃｈｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ。

【0077】

１つの例では、細菌には薬剤耐性があり得る。１つの例では、細菌感染は、限定されるわけではないが、肺炎、肺結核、髄膜炎、下痢症、バイオフィルムの形成、化膿症（ｓｅｐｓｉｓ）、リステリア症、胃腸炎、毒素性ショック症候群、出血性大腸炎、溶血性尿毒症症候群、ライム病、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、ヒトエーリキア症、偽膜性大腸炎、コレラ、サルモネラ症、ネコ引っ掻き熱、壊死性筋膜炎（ＧＡＳ）、連鎖球菌毒素性ショック症候群、院内感染および市中感染症、アテローム性動脈硬化症、乳児突然死症候群（ＳＩＤＳ）、創傷感染、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、胃腸疾患、院内感染性心内膜炎（ｈｏｓｐｉｔａｌ−ａｃｑｕｉｒｅｄ ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、および血流感染のような状態を引き起こし得る。

【0078】

強力な免疫賦活特性を有しているリポ多糖（ＬＰＳ）内毒素は、グラム陰性細菌の外膜リーフレット（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｅａｆｌｅｔ）における必須の構造成分である。ＬＰＳは、微生物の細胞増殖および分裂の間、減り続け、多くの場合は細菌感染に対する抗生物質療法の結果として、細胞死の際に多量に遊離させられる。血流に放出されると、ＬＰＳの凝集がＬＰＳに結合する血漿タンパク質（ＬＢＰ）により解離させられて、宿主の単球およびマクロファージを、様々なサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８）およびプロ炎症性媒介因子（例えば、ＮＯおよび反応性酸素種）を分泌するように刺激するＬＰＳ−ＬＢＰ複合体を形成する。自然免疫系のこの活性化は、敗血症ショック（ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）として知られている深刻な臨床症候群を引き起こす過度の免疫応答のカスケードを誘発する。これは、多臓器不全を突然引き起し得、処置しないまま放置すれば死亡する可能性がある。したがって、内毒素の中和方法を提供することが必要である。したがって、別の態様では、内毒素の中和方法が提供される。この方法には、薬学的有効量の本明細書中に記載されるペプチドの投与が含まれる。

【0079】

１つの例では、内毒素は細菌の内毒素または真菌の内毒素であり得る。１つの例では、内毒素は、多糖、リポテイコ酸、リポ多糖、またはリポオリゴ糖であり得る。

【0080】

細菌が人に対して有し得る別の問題点は、バイオフィルムの形成である。バイオフィルムの形成は、医療分野および医療以外の分野のいずれの様々な状況においても関係している重大な問題である。バイオフィルムの形成は、微生物細胞が互いに接着し、表面上の細胞外高分子物質（ＥＰＳ）のマトリックスに包埋されると起こる。生体高分子（例えば、多糖類、核酸、およびタンパク質）ならびに栄養素を多く含むそのような保護された環境下での微生物の増殖は、微生物のクロストークの増加および病原性の増大を可能にする。バイオフィルムは任意の支援的環境下で発生し得るので、バイオフィルム形成を除くかまたは防ぐことができる方法あるいは組成物が必要である。したがって、バイオフィルム形成を除くかまたは防ぐ方法を提供する必要がある。

【0081】

別の態様では、バイオフィルムを取り除く方法が提供される。この方法には、有効量の本明細書中に記載されるペプチドの投与が含まれる。１つの例では、バイオフィルムが表面上に生じ得る。本明細書中で使用される用語「表面（ｓｕｒｆａｃｅ）」または「表面（ｓｕｒｆａｃｅｓ）」は、医学的であるかまたは工業的であるかに関わらず、流体（例えば、液体または空気）と固体との間の界面を提供する任意の表面をいう。流体と固体との間の界面は間欠的であり得、流動または滞留流体、エアロゾル、または空気中の流体への暴露のための他の手段により起こり得る。表面は、いくつかの例においては、その力学的構造が細菌または真菌の付着に適合性がある平面をいう。本明細書中に記載するペプチドおよび方法の状況では、技術用語「表面」には、様々な機器およびデバイスの内側および外側の面、使い捨てのものおよび使い捨てではないものの両方、ならびに、医療用のものおよび医療用ではないものが含まれる。医療用ではない使用の例として、船の船体、造船所、フ−ドプロセサー、ミキサー、機械、コンテナ、水槽、水濾過装置、浄化システム、食品業界における防腐剤、シャンプー、クリーム、モイスチャライザー、手指消毒剤、石鹸などのようなパーソナルケア製品が挙げられる。医療用の用途の例としては、全てのあらゆる医療用デバイスが挙げられる。そのような「表面」には、使い捨ての用途であるかまたは反復使用が意図されるかを問わず、様々な機器およびデバイスの内側および外側の面が含まれ得る。例として、外科用メス、針、鋏、および侵襲的外科手術、治療的または診断的手順において使用される他のデバイスを含む医療用途に適合させた製品の全ての領域；患者からの流体の除去または患者への流体の送達のための人工血管、カテーテル、および他のデバイス、人工心臓、人工腎臓、整形外科用の釘、プレート、およびインプラントを含む、埋め込み型医療用デバイス；カテーテルおよび他の管（泌尿器科用の管、および胆汁用の管、気管内チューブ、末梢血管から挿入可能な中心静脈カテーテル、透析用カテーテル、長期治療用中心静脈カテーテル、末梢静脈カテーテル、短期治療用中心静脈カテーテル、動脈カテーテル、肺カテーテル、Ｓｗａｎ−Ｇａｎｚカテーテル、尿カテーテル、腹膜カテーテルを含む）、尿用デバイス（長期治療用尿用デバイス、組織接合尿用デバイス、人工尿道括約筋、尿道拡張器を含む）、シャント（心室シャントまたは動静脈シャントを含む）；プロテーゼ（乳房インプラント、陰茎プロテーゼ、血管移植プロテーゼ、心臓弁、人工関節、人工咽頭、耳鼻科用インプラントを含む）、血管カテーテルポート、創部排液チューブ、水頭症シャント、ペースメーカー、および埋め込み型除細動器、歯科用インプラント、充填剤（ｆｉｌｉｎｇｓ）、総義歯などが挙げられる。他の例は、これらの分野の専門家に容易に明らかとなろう。医療環境下でみられる表面にはまた、医療用機材の部品の内面および外面、健康管理の設定において摩減したまたは人に持ち運ばれる医療用ギアも含まれる。そのような表面には、医療用の手順に、あるいは、酸素の、ネブライザーの中の溶解させた薬物の、および麻酔薬の投与を含む、呼吸器の処置に使用される医療用装置、管、およびキャニスターの調製に使用される領域にあるカウンタートップならびに備品が含まれ得る。医療機関において感染性生物に対する生物学的障壁として意図される表面、例えば、手袋、エプロン、および安全マスクもまた、そのような表面に含まれる。生物学的障壁に一般的に使用される材料は、ラテックス系のものであっても、ラテックス系ではないものであってもよい。ラテックス系ではない生物学的障壁の材料の一例として、ビニルを挙げることができる。他のそのような表面には、滅菌されるようには意図されていない医療用または歯科用機材の柄およびケーブル線が含まれ得る。さらに、そのような表面は、チューブの滅菌されていない外面、および血液もしくは体液または他の危険な生体材料に一般的に遭遇する領域に見られる他の装置を含み得る。１つの例では、バイオフィルムは、カテーテルおよび医療用インプラント上に構成され得る。

【0082】

別の態様では、真菌感染もしくは蔓延の処置、または真菌の除去の方法が提供される。この方法には、薬学的有効量の本明細書中に記載されるペプチドの投与が含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語「真菌」（および「真菌感染」のようなその派生語）には、以下の属の生物（またはそれらの生物が原因である感染）についての言及が含まれるが、これらに限定されるわけではない：Ａｂｓｉｄｉａ、Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｈｏｒｔａｅａ、Ｉｓｓａｔｓｃｈｅｎｋｉａ、Ｍａｄｕｒｅｌｌａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｃｔｒｉａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、およびＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ。
１つの例では、真菌として以下を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない：Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ、Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｂｅｎｈａｍｉａｅ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｆｕｌｖｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｇｙｐｓｅｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｉｎｃｕｒｖａｔｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｏｔａｅおよびＡｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｖａｎｂｒｅｕｓｅｇｈｅｍｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣａｎｄｉｄａ ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ、Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｃａｒｒｉｏｎｉｉ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓおよびＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｐｏｓａｄａｓｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ Ｓｐ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｐｅｄｒｏｓｏｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ、Ｉｓｓａｔｓｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｍａｄｕｒｅｌｌａ ｇｒｉｓａｅ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｇｌｏｂｏｓａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｏｂｔｕｓａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｒｅｓｔｒｉｃｔａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｌｏｏｆｆｉａｅ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｆｕｌｖｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｅｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｎｅｃｔｒｉａ ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｐｉｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ、Ｓｐｏｒｏｔｈｎｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍおよびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、ならびにＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｉｎｋｉｎおよびＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｍｕｃｏｉｄｅｓ。

【0083】

別の態様では、本明細書中に記載されるペプチドを含有しているキットおよびその説明書が提供される。

【0084】

別の態様では、医薬品として使用される本明細書中に記載されるペプチドが提供される。１つの例では、医薬品はさらに第２の治療薬を含有し得る。

【0085】

別の態様では、本明細書中に記載されるペプチドを含有している組成物が提供される。１つの例では、組成物はさらに第２の治療薬を含有し得る。

【0086】

１つの例では、本明細書中に記載される方法、使用、またはキットはさらに、第２の治療薬を含有し得る。１つの例では、本明細書中に記載される方法はさらに、第２の治療薬の投与を含み得る。１つの例では、本明細書中に記載される医薬品はさらに、第２の治療薬を含み得る。１つの例では、医薬品は第２の治療薬とともに投与され得る。１つの例では、キットにはさらに、第２の治療薬が含まれ得る。

【0087】

１つの例では、第２の治療薬は、本開示のペプチドとは別に投与されてよく、また、本開示のペプチドと一緒に投与されてもよい。１つの例では、第２の治療薬はさらなる抗微生物剤であってよく、また、異なる抗微生物剤であってもよい。１つの例では、抗微生物剤として、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、または抗生物質、および抗寄生虫剤を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。１つの例では、抗微生物剤は抗生物質である。

【0088】

１つの例では、抗生物質として以下を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない：アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリンインダニル、メズロシリン、ピペラシリン、チカルシリン、アモキシシリン・クラブラン酸、アンピシリン・スルバクタム、ベンジルペニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、メチシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン・タゾバクタム、チカルシリン・クラブラン酸、ナフシリン、第１世代セファロスポリン、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、セファクロル、セファマンドール、セフォニシド、セフォテタン、セフォキシチン、セフプロジル、セフトメタゾール、セフロキシム、ロラカルベフ、セフジニル、セフチブテン、セフォペラゾン、セフィキシム、セフォタキシム、セフポドキシムプロキセチル、セフタジジム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、リンコマイシン、トロレアンドマイシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、トロバフロキサシン、オキソリン酸、ゲミフロキサシン、ペフロキサシン、イミペネム・シラスタチン、メロペネム、アズトレオナム、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、テイコプラニン、バンコマイシン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、クロロテトラサイクリン、マフェニド、スルファジアジン銀、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリン・スルファメトキサゾール、スルファメチゾール、リファブチン、リファンピン、リファペンチン、リネゾリド、ストレプトグラミン、キヌプリスチン・ダルホプリスチン、バシトラシン、クロラムフェニコール、ホスホマイシンン、イソニアジド、メテナミン、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、ニトロフラゾン、ノボビオシン、ポリミキシン、スペクチノマイシン、トリメトプリン、コリスチン、シクロセリン、カプレオマイシン、エチオナミド、ピラジナミド、パラアミノサリチル酸、コハク酸エリスロマイシンエチル、ミコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、テルコナゾール、テルビナフィン、アモロルフィン、ナフチフィン、ブテナフィン、アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギン、安息香酸、シクロピロックス、トルナフテート、ウンデシレン酸、フルシトシン、または５−フルオロシトシン、グリセオフルビン、ハロプロジン、およびこれらの組み合わせ。
１つの例では、抗生物質として、ナリジクス酸、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、およびカナマイシンを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。

【0089】

用語「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「低下（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、「減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「除去（ｒｅｍｏｖａｌ）」、または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」は全て、一般的には、統計学的に有意な量の減少を意味するように本明細書中で使用される。しかし、疑義が生じるのを避けるために、「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「低下（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、または「減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「除去（ｒｅｍｏｖａｌ）」、または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、基準レベル（例えば、本明細書中に記載されるペプチドの非存在下）と比較した、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または１００％減少（例えば、基準試料と比較してレベルが存在しないこと）を含む１００％までの低下、あるいは基準レベルと比較した１０〜１００％の間の任意の低下を意味する。

【0090】

別の態様では、細菌感染の処置、または細菌の除去、または内毒素の中和、または真菌感染もしくは蔓延の処置、または真菌の除去のための医薬品の製造における本開示のペプチドの使用が提供される。１つの例では、この使用には、それが必要な被験体への投与のために本開示のペプチドを提供する工程がさらに含まれ得る。１つの例では、医薬品が、それが必要な被験体に投与される。

【0091】

１つの例では、被験体または患者は、動物、哺乳動物、ヒトであり得、これには、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、オオカミ、ネコ、マウス、ヒツジ、鳥、魚、ヤギ、カラス、ダニ（ａｃｒｉｎｅ）、またはイルカ（ｄｅｌｐｈｉｎｅ）として分類される動物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。１つの例では、患者はヒトであり得る。

【0092】

１つの例では、本明細書中に記載されるペプチドは、組成物または薬学的組成物として提供され得る。本明細書中に記載される組成物は、局所処置が望ましいか、または全身的処置が望ましいかに応じて、多数の方法で投与され得る。投与は、局所、肺（例えば、ネブライザーによる場合を含む、粉末もしくはエアロゾルの吸入または吹送による；気管内、鼻腔内、表皮、および経皮）、または全身（例えば、経口）ならびに／あるいは非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内への注射または注入；あるいは、頭蓋内、例えば、髄腔内、または心室内への投与が含まれる。１つの例では、投与経路は、全身投与、経口投与、静脈内投与、および非経口投与からなる群より選択され得る。

【0093】

経口投与のための組成物および処方物としては、粉末剤または顆粒剤、水もしくは非水性媒体中の懸濁剤または液剤、カプセル剤、小袋に入った薬（ｓａｃｈｅｔｓ）、または錠剤が挙げられる。増粘剤、着香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が所望され得る。

【0094】

非経口、髄腔内、または心室内投与のための組成物および処方物には、滅菌された水溶液が含まれ得、滅菌された水溶液には、緩衝液、希釈剤、および限定されるわけではないが、透過促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容され得る担体または賦形剤のような他の適切な添加剤もまた含まれ得る。

【0095】

本明細書中に記載される組成物として、液剤、糊状剤、軟膏、クリーム剤、ヒドロゲル、乳剤、リポソームを含有している処方物、およびコーティング剤（ｃｏａｔｉｎｇｓ）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。これらの組成物は、予め形成させた液体、自ら乳化する固体、および自ら乳化する半固体を含むがこれらに限定されるわけではない様々な成分から生成され得る。

【0096】

本明細書中に記載される処方物（好都合には単位剤形で提示され得る）は、薬学業界でよく知られている従来技術にしたがって調製され得る。このような技術には、有効成分の薬学的担体（単数または複数）または賦形剤（単数または複数）との会合をもたらす工程が含まれる。一般的には、処方物は、有効成分の液体担体もしくは微紛化された固体担体またはこれらの両方との均一かつ緊密な会合をもたらすこと、その後、必要であれば、生成物を成形することにより、調製される。

【0097】

本明細書中に記載される組成物は、錠剤、カプセル剤、液体シロップ、ソフトゲル、坐薬、および浣腸剤を含むがこれらに限定されるわけではない、多くの可能な剤形のうちの任意のものに処方され得る。本明細書中に記載される組成物はまた、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体中の懸濁剤としても処方され得る。水性懸濁剤にはさらに、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁剤の粘性を高める物質が含まれ得る。懸濁剤にはまた、安定剤も含まれ得る。

【0098】

１つの例では、薬学的組成物が処方され、発泡体として使用され得る。薬学的発泡体としては、限定されるわけではないが、乳剤、マイクロエマルジョン、クリーム剤、ゼリー、およびリポソームのような処方物が挙げられる。基本的には性質は類似しているが、これらの処方物は、最終的な生成物の成分や軟度が異なる。

【0099】

本明細書中に記載される組成物はさらに、薬学的組成物中に従来からみられる他の補助剤成分を含み得る。したがって、例えば、組成物は、かゆみ止め、収斂剤、局所麻酔薬、または抗炎症薬のようなさらなる適合性の薬学的活性がある材料を含み得るか、あるいは、着色料、着香料、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤のような、本発明の組成物の様々な剤形の物理的処方に有用なさらなる材料を含み得る。しかし、そのような材料は、添加されても、本開示の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨害しないものであるべきである。処方物は、滅菌することができ、所望される場合は、処方物のペプチド（単数または複数）と有害となるような相互作用をしない助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、色素、香料、および／または芳香物質などと混合することができる。

【0100】

用語「薬学的有効量」は、本明細書中で使用される場合、その意味に、所望される効果を提供する、すなわち、少なくとも１．０の微生物数におけるＬｏｇ減少を引き起こす（これは、１０のうちの１未満しか微生物が残らないことを意味する）ために十分であるが、毒性ではない、本明細書中に記載される化合物の量を含む。本開示の改変されたペプチドは、少なくとも約２．０、または少なくとも約３．０、または少なくとも約４．０、または少なくとも約５．０、または少なくとも約６．０、または少なくとも約７．０の、微生物数におけるＬｏｇ減少を提供し得る。必要とされる正確な量は、処置されている種、被験体の年齢および全身状態、処置されている状態の重篤度、投与されている特定の薬剤、投与の方式などの要因に応じて、被験体ごとに様々である。したがって、正確な「有効量」を具体的に記載することは不可能である。しかし、任意の所与の症例については、適切な「有効量」が日常的に行われる実験のみを使用して当業者により決定され得る。

【0101】

投薬は、処置される疾患状態の重篤度および反応性に依存し、処置の過程は数日から数か月間、または治癒が達成されるかもしくは疾患状態の縮小が達成されるまで継続する。最適な投薬スケジュールは、患者の体内での薬物の蓄積の測定により計算することができる。投与を行う医師は、最適用量、投薬方法、および反復速度を容易に決定することができる。最適用量は、組成物の相対的効力に応じて変わり得、一般的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの動物モデルにおいて有効であるとみられるＥＣ５０に基づいて、または本明細書中に記載される例に基づいて概算することができる。一般的に、用量は、０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重までであり、１日に、１週間に、１か月に、または１年に１回以上投与され得る。処置を行う医師は、体液または組織内での薬物の測定された滞留時間および濃度に基づいて投薬の反復速度を概算することができる。処置が成功した後、疾患状態の再発を防ぐために、被験体が維持療法を受けることが望ましい場合がある。ここでは、０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重までの範囲の維持量の組成物が、１日に１回以上から２年毎に１回までで投与される。

【0102】

１つの例では、組成物は、約０．０１μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ、０．５μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、１１０μｇ、１２０μｇ、１３０μｇ、１４０μｇ、１５０μｇ、１６０μｇ、１７０μｇ、１８０μｇ、１９０μｇ、２００μｇ、２１０μｇ、２２０μｇ、２３０μｇ、２４０μｇ、２５０μｇ、２６０μｇ、２７０μｇ、２８０μｇ、２９０μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇのうちのいずれか１つから、約０．０１μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ、０．５μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、１１０μｇ、１２０μｇ、１３０μｇ、１４０μｇ、１５０μｇ、１６０μｇ、１７０μｇ、１８０μｇ、１９０μｇ、２００μｇ、２１０μｇ、２２０μｇ、２３０μｇ、２４０μｇ、２５０μｇ、２６０μｇ、２７０μｇ、２８０μｇ、２９０μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ／ｋｇ患者体重のうちのいずれか１つまでの間の量で投与され得る。

【0103】

１つの例では、投与される組成物の濃度は、約１〜約１００ｍｇ／Ｋｇ患者体重、約５〜約１００ｍｇ／Ｋｇ患者体重、約１０〜約１００ｍｇ／Ｋｇ患者体重、約２０〜約１００ｍｇ／Ｋｇ患者体重、約３０〜約１００ｍｇ／Ｋｇ患者体重、約１〜約５０ｍｇ／Ｋｇ患者体重、約５〜約５０ｍｇ／Ｋｇ患者体重、および約１０〜約５０ｍｇ／Ｋｇ患者体重である。

【0104】

本明細書中で使用される場合、処方物の成分の量または濃度の状況における用語「約」は、典型的には、記載される値の＋／−５％、より典型的には、記載される値の＋／−４％、より典型的には、記載される値の＋／−３％、より典型的には、記載される値の＋／−２％、なおより典型的には、記載される値の＋／−１％、そしてなおより典型的には、記載される値の＋／−０．５％を意味する。

【0105】

本明細書中に実例として記載される発明は、本明細書中では具体的には開示されていない任意の要素（単数または複数）、限定（単数または複数）の非存在下で適切に実施され得る。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、拡張して、そして限定を伴わないものとして読まれるべきである。さらに、本明細書中で使用されるこれらの用語および表現は、限定ではなく、説明の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用において、示され、記載される特徴またはその一部との任意の等価物を排除する意図はないが、様々な改変が請求される本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態および随意の特徴により具体的に開示されているが、開示された本明細書中で具体化された本発明の改変およびバリエーションが当業者により行使され得ること、そのような改変およびバリエーションが本発明の範囲にあるとみなされるものと理解されるべきである。

【0106】

本明細書中で使用される場合、用語「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、所定の例について必要とされる要素をいう。この用語は、本発明のその例の基本的、かつ新規の、または機能的特徴（単数または複数）に実質的には影響を及ぼさないさらなる要素の存在を許容する。

【0107】

用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、その所定の例に記載されていない任意の要素を除外する、本明細書中に記載される組成物、方法、およびそれぞれの成分をいう。

【0108】

本発明は、本明細書中に概括的かつ一般的に記載されている。より狭い種、および属の開示に含まれる亜属の分類のそれぞれもまた、本発明の一部を構成する。切り取られた材料が本明細書中に具体的に記述されているかどうかにはかかわらず、ただし、属に由来する任意の目的物を除外する条件または消極的な限定付きで、これには、本発明の属の記述が含まれる。

【0109】

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲および非限定的な例に含まれる。加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群（Ｍａｒｋｕｓｈ ｇｒｏｕｐｓ）に関して記載されている場合は、それにより、本発明が、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはマーカッシュ群のメンバーのサブグループに関しても記載されていることを、当業者は認めるであろう。

【実施例】

【0110】

実施例１ 感受性試験−基本的なスクリーニング
材料および方法：
本研究で使用したＶ２二量体および全てのリポペプチド（図１Ａ）は、Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓから購入した。全てのペプチドを、滅菌水に溶解させて１０００μｇ／ｍＬのストック溶液とすることにより準備した。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）により記載されている微量液体希釈法（ｂｒｏｔｈ ｍａｃｒｏ−ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢ）中で行った。次に、陽イオンで調節したＭＨＢ（ＣＡ−ＭＨＢ）を使用して、試験管の中に化合物の段階的な２倍希釈物を調製した。接種源懸濁物の濃度もまた、ＭＨＢを使用しておよそ５×ｌ０^５コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬに調整した。細菌を、読み取りの前に３５℃で２４時間、化合物とともにインキュベートした。本研究では、使用したグラム陽性株は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＤＭ４００１およびメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）ＤＭ９８０８であった。使用したグラム陰性株は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＤＭ４２９９、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ２３１５５、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２７９２２であった。

【0111】

表１Ａ．抗菌活性：Ｖ２Ｄ、脂質改変されたＶ２Ｄ（Ｃ２〜Ｃ１４）のＭＩＣ値

【表1A】

【0112】

表１Ｂ．抗菌活性：Ｇ２Ｄ、脂質改変されたＧ２Ｄ（Ｃ２〜Ｃ１４）のＭＩＣ値

【表1B】

【0113】

Ｖ２Ｄと比較して、Ｃ８−Ｖ２ＤおよびＣ１０−Ｖ２Ｄは、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に対して改善された抗微生物活性を示す（表１Ａ）。Ｇ２Ｄと比較して、Ｃ８−Ｇ２ＤおよびＶ１０−Ｇ２Ｄの抗微生物特性は、グラム陽性細菌に対して改善された抗微生物特性を示す（表１Ｂ）。

【0114】

実施例２ 感受性試験−Ｖ２Ｄ、Ｃ８−Ｖ２Ｄ、およびＣ１０−Ｖ２Ｄについてのさらなるスクリーニング
材料および方法：
本研究で使用した細菌を以下の表２Ａおよび２Ｂに列挙する。使用した方法は上記実施例１に記載したとおりである。
結果：

【0115】

表２Ａ．メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）株およびメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ株のパネルに対するＶ２Ｄ、Ｃ８−Ｖ２Ｄ、およびＣ１０−Ｖ２Ｄの抗菌活性

【表2A】

【0116】

表２Ｂ．ＭＳＳＡ株およびＭＲＳＡ株のパネルに対するＶ２Ｄ、Ｃ８−Ｖ２Ｄ、およびＣ１０−Ｖ２Ｄの抗菌活性

【表2B】

【0117】

Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ）：
試験した全ての株：１６
ｉ）Ｃ８Ｖ２Ｄ−８つの株については２倍改善した。１つの株については４倍改善した。
改善率（％ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）＝５６．３％
ｉｉ）Ｃ１０Ｖ２Ｄ−１０の株については２倍改善した。
改善率（％）＝６２．５％

【0118】

Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：
試験した全ての株：１０
ｉ）Ｃ８Ｖ２Ｄ−７つの株については２倍改善した。１つの株については４倍改善した。
改善率（％）＝８０％
ｉｉ）Ｃ１０Ｖ２Ｄ−７つの株については２倍改善した。１つの株については４倍改善した。
改善率（％）＝８０％

【0119】

実施例３ 時間−死滅反応速度
材料および方法
時間−死滅研究に使用した細菌は、１８〜２０時間のトリプチックソイ寒天プレート（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ（ＴＳＡ）ｐｌａｔｅ）から単離された。その後、接種源を懸濁し、０．３１ｍＭのリン酸塩緩衝液中に、１０^５〜１０^６ＣＦＵ／ｍＬを含む細菌懸濁液が得られるように調整した。次に、接種源を様々な濃度のＣ８Ｖ２Ｄで処理した。この混合物を３５℃でインキュベートした。培養物のアリコートを、プレートの生菌計数のために、０、１０分、３０分、１時間、２時間、５時間、および２４時間で取り出した。これらのアリコートをＤｅｙ−Ｅｎｇｌｅｙ（Ｄ／Ｅ）Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｒｏｔｈを使用して１０倍に段階希釈し、その後、２０μＬの各希釈物を表面塗抹法を使用してＴＳＡプレート上に平板培養した。次に、これらのプレートを３５℃で４８〜７２時間インキュベートした。細胞の生存性を、プレート上に生育したコロニーを数え上げることにより評価した。殺菌活性は、それぞれのアッセイの開始時の未処理の対照と比較した、抗微生物物質で処理した培養物中での生菌数の３−ｌｏｇの減少と定義した。試験したプレート上への抗微生物剤の持越しの可能性を評価するために、５ｃおよび６の存在下、ならびに非存在下の段階希釈物中の対照とした株を試験した。本研究に使用した細菌はＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ２３１５５であった。

【0120】

図１に見られるように、２×および４×ＭＩＣで２０〜３０分で３−ｌｏｇの減少が、本実施例のｉｎ ｖｉｔｒｏでの時間−死滅反応速度アッセイにおいて観察された。これにより、Ｃ８Ｖ２ＤがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを迅速に死滅させることができることが明らかにされている。

【0121】

実施例４ ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの毒性
４Ａ．溶血アッセイ
材料および方法
ニュージーランド白ウサギの新鮮な赤血球（ＲＢＣ）を本実験に使用した。入手したＲＢＣを、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を取り除き、滅菌したＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７）で２回洗浄した。ＲＢＣをさらに、ＰＢＳ中の８％のストック溶液に希釈した。ペプチドを所望するストック濃度でＰＢＳ中に溶解させた。化合物をＲＢＣと混合したとき、所望する４％のＲＢＣの濃度を得た。Ｃ１４Ｖ２ＤおよびＣ１６Ｖ２Ｄについては、これらを、所望するストック濃度でジメチルホルムアミド（（ＣＨ_３）_２ＮＣＨ；ＤＭＦ）中に溶解させた。化合物をＲＢＣと混合したとき、所望する濃度の４％のＲＢＣおよび０．５％のＤＭＦを得た。＜１％のＤＭＦ濃度を、これがＲＢＣに対して無視できるほどしか溶血活性を有していないので、使用した。この混合物を１．５ｍＬの遠心分離管に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、血液を４℃にて、３０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。１００μＬの上清を透明な９６ウェルプレートに移した。吸光度（ａｂｓ）を、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｍ Ｐｒｏ）を使用して５７６ｎｍで測定した。２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を陽性対照として使用した。ＰＢＳを陰性対照として使用した。放出されたヘモグロビンの量を、以下の方程式を使用して計算した：

【0122】

結果：

【0123】

表３Ａ．ペプチドおよび脂質改変ペプチド二量体の溶血活性

【表3A】

^ａ 溶血率（％）＝２０ｍｇ／ｍＬで３．３％
^ｂ ＰＢＳ中での値。ＤＭＦ中のＨＣ１０は１７３．３±３５．２ｍｇ／ｍＬである。
^ｃ ＤＭＦ中での値。Ｃ１６Ｖ２ＤはＰＢＳに溶解させることができなかった。
^ｄ 選択性＝ＨＣ１０／ＭＩＣ

【0124】

ＨＣ１０は、赤血球からの１０％のヘモグロビンの放出を誘導するペプチドの濃度である。表３Ａは、Ｖ２ＤおよびＣ２−Ｃ１０ Ｖ２Ｄが２０００μｇ／ｍＬまでは非溶血性であったことを示している。したがって、Ｖ２ＤおよびＣ２−Ｃ１０ Ｖ２Ｄは細菌膜に対して非常に特異的である。Ｃ１２Ｖ２Ｄはより強力な溶血活性を示し、Ｃ１４およびＣ１６Ｖ２Ｄは、より低い濃度でかなりの溶血を引き起こした。一般的には、溶血活性は、ペプチド二量体にカップリングした脂質の長さに伴い増大し、したがって、選択性は脂質の長さの増大に伴い低下した。

【0125】

４Ｂ．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの毒性試験
乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ
スクリーニングした個々の化合物の細胞傷害性を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイにより決定した。簡単に説明すると、ヒトの角膜の線維芽細胞を、９６ウェルの乳白色のプレート（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ）中に、１ウェルあたり１０，０００の細胞の密度で平板培養した。様々な濃度の試験化合物および対照を、最終的な容量が各ウェル中で１００μｌとなるように、適切なウェルに添加した。試験化合物への４時間の暴露の後、プレートを３７℃のインキュベータから取り出し、２２℃で３０分間平衡させた。１００μＬのＣｙｔｏ−ＴＯＸ Ｏｎｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を各ウェルに添加し、製造業者の説明書にしたがってＬＤＨアッセイを行った。蛍光を、５６０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ Ｐｒｏ、スイス国）を使用して評価した。１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に暴露した細胞を陽性対照として使用し、ＬＤＨの最大放出として処理した。各化合物の特異的細胞傷害性の百分率を以下の式を使用して決定した（Ｉ＝強度）：
％細胞傷害性＝［（Ｉ_実験）−（Ｉ_陰性対照）］／［（Ｉ_陽性対照）−（Ｉ_陰性対照）］×１００

【0126】

４Ｃ．細胞生存性（ＡＴＰ）アッセイ
細胞を、９６ウェルの乳白色のプレート（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、韓国）中に、１ウェルあたり１０，０００の細胞の密度で平板培養した。様々な濃度の試験化合物および対照を、最終的な容量が各ウェル中で１００μｌとなるように、適切なウェルに添加した。試験化合物への４時間の暴露の後、プレートを３７℃のインキュベータから取り出し、２２℃で３０分間平衡させた。１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を各ウェルに添加し、製造業者の説明書にしたがってＡＴＰアッセイを行った。発光を、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ Ｐｒｏ、スイス国）を使用して評価した。１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に暴露した細胞を陽性対照として使用した。各化合物の細胞生存性の百分率を以下の式を使用して決定した（Ｌ＝検出した発光）：
％生存性＝［（Ｌ_陰性対照）−（Ｌ_実験）］／［（Ｌ_陰性対照）−（Ｌ_陽性対照）］×１００

【0127】

結果：
表３Ｂ．Ｖ２Ｄと比較したＣ８Ｖ２Ｄのｉｎ ｖｉｔｒｏでの毒性

【表3B】

［ａ］細胞傷害性の５０％を誘導し、細胞生存性の５０％を低下させる毒性濃度（ＴＣ５０）。

【0128】

４Ｄ．ｉｎ ｖｉｖｏでの局所毒性試験および急性毒性試験
材料および方法：
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅから購入した野生型Ｃ５７ＢＬ６（６〜８週齢）（２０〜３０グラム重）のマウスを本研究に使用した。全ての動物を１週間の順化の後に利用し、温度制御された（２３±２℃）、１２時間の明暗サイクルおよび湿度（５５〜６０％）の、空調設備のある部屋に入れた。全ての動物を、Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｔｈｅ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）についてのＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（ＡＲＶＯ）の説明書にしたがい、Ｓｉｎｇｈｅａｌｔｈ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ（ＳＥＭＣ）の監督下で行った。角膜の毒性を調べるために、３匹の正常でありかつ健康な野生型マウスを無作為に選択し、１０ｍＭのＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌおよび３ｍｇ／ｍｌのＣ８Ｖ２Ｄで処置した。Ｃ８Ｖ２Ｄを、４日間、５回／日で局所適用した。角膜の透明度を、適用後４日まで毎日追跡調査のためにスリットランプ顕微鏡検査法によりチェックした。急性の全身毒性を研究するために、Ｃ８Ｖ２Ｄを、静脈内経路および腹腔内経路により投与した。それぞれの経路について２匹のマウスを選択し、全ての死亡率、罹患率、または毒性の兆候を観察し、記録するために、２４時間を通じて注意深くモニターした。全体の剖検を、全ての死亡例または瀕死の動物について行うことにした。

【0129】

結果
表３Ｃ．ｉｎ ｖｉｖｏでの局所毒性試験および急性毒性試験におけるＣ８Ｖ２Ｄの安全濃度

【表3C】

【0130】

ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの毒性プロフィールはいずれも、Ｃ８Ｖ２Ｄが安全であることを示している。Ｃ８Ｖ２Ｄは、新規の薬効範囲が広い抗微生物物質であり、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの研究に基づくと非毒性である。

【0131】

実施例５ グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）に対する本開示のペプチドおよび脂質改変ペプチドの可能性がある効果を研究するための、ＬＰＳの中和研究
材料および方法
リポ多糖（ＬＰＳ）の中和を、製造業者のプロトコールに重要ではない改変を加えて、ｐｉｅｒｃｅ Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）色素生成性内毒素定量化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して評価した。ＬＡＬは、ＬＰＳの存在下で一連の反応において活性化される酵素を含む。このカスケードにおいて活性化される最後の酵素は、発色団を色素生成性基質からパラニトロアニリン（ＰＮＡ）へと分割し、黄色を生じさせる。放出されたＰＮＡの量は４０５ｎｍで測光法により測定され、これは、このシステム中のＬＰＳの量に比例する。簡単に説明すると、マイクロプレートを最初に、３７℃で１０分間、加熱ブロック中で平衡させた。その後、所望する濃度の脂質改変ペプチドをマイクロプレートウェルにピペットし、３７℃で５分間インキュベートした。次に、この混合物をＬＡＬと３７℃で１０分間インキュベートし、続いて、３７℃で、２ｍＭの基質溶液とインキュベーションした。１０分後、２５％の酢酸を各ウェルに添加して反応を停止させ、４０５〜４１０ｎｍで吸光度を測定した。次に、ＬＰＳの５０％を中和するための有効濃度（ＮＣ５０）を決定した。本研究では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４由来のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）とＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １０由来のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。

【0132】

結果
表４Ａ．Ｅ．ｃｏｌｉのＬＰＳの５０％を中和するためのＶ２Ｄおよび脂質改変されたＶ２Ｄの有効濃度の値

【表4A】

【0133】

表４Ｂ．Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＬＰＳの５０％を中和するためのＶ２Ｄおよび脂質改変されたＶ２Ｄの有効濃度（ＮＣ５０）の値

【表4B】

【0134】

結果：
より長い脂質の長さ（ｎ≧６）を持つ脂質改変ペプチドは、ＬＰＳを効率よく中和することができた。ＬＰＳを有意に中和するための重要な鎖の長さは、ｎ＝６であった。Ｅ．ｃｏｌｉのＬＰＳについては、Ｖ２Ｄと比較して、ＬＰＳの中和の改善があった：Ｃ６Ｖ２Ｄ＝７．８倍；Ｃ８Ｖ２Ｄ＝２０倍、およびＣ１０Ｖ２Ｄ＝３８倍（図３および表４Ａを参照のこと）。

【0135】

類似するパターンが、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＬＰＳの中和について得られた（図２Ｂおよび表４Ｂ）。しかし、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＬＰＳの５０％を中和するために必要な濃度は、Ｅ．ｃｏｌｉのＬＰＳよりも高かった。Ｖ２Ｄと比較したＬＰＳの中和の改善は以下のとおりであった：Ｃ６Ｖ２Ｄ＝１．６倍、Ｃ８Ｖ２Ｄ＝２．６倍、およびＣ１０Ｖ２Ｄ＝３．２倍（図３Ａおよび表４Ａを参照のこと）。

【0136】

実施例６ リポ多糖を用いて脂質改変ペプチドの結合能力を研究するためのＬＰＳ−ボディパイ置換アッセイ
ボディパイＴＲカダベリン（ＢＣ）は、ＬＰＳ結合アッセイにおいて使用される蛍光プローブである。ＬＰＳのリピドＡ部分に対するＢＣの結合は、イオン性架橋を介して複合体を形成する。ポリミキシンＢのような外膜透過化物質（Ｏｕｔｅｒ−ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｓｅｒ）は、ＬＰＳのリピドＡからＢＣを置き換えて、蛍光強度の増大を引き起こす脱クエンチ効果を導くであろう。ボディパイＴＲカダベリンをＤＭＦに溶解させ、ＴＲＩＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）で希釈した。等容量の１００μｇ／ｍＬのＬＰＳおよび１０μΜのボディパイＴＲカダベリンを一緒に混合し、この混合物のアリコートを、ＳＰＬ ９６ブラックウェルプレート（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の所望する濃度の脂質改変ペプチドに添加した。４０μΜのポリミキシンＢをこの実験において陽性対照として使用した。蛍光の読み取り値を、ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００マイクロプレートリーダーにより、５８０ｎｍの励起波長および６２０ｎｍの発光波長で測定した。

【0137】

図４は、本開示のペプチドおよび脂質改変ペプチドによるＢｏｄｉｐｙからのＢＳの置換を示す。一般的には、Ｓ字状曲線を、ＬＰＳ結合がＣ８−Ｃ１６Ｖ２Ｄ（グラフはまだプラトーになっていない）についてはより強い全てのペプチドについて得た。データは、脂質ぺプチドがＬＰＳに結合でき、リピドＡからＢｏｄｉｐｙを置き換えることができることを示している。

【0138】

実施例７ 外膜またはＬＰＳの透過化に対するぺプチドおよびリポペプチドの効果を研究するためのＮＰＮ外膜透過化アッセイ
材料および方法
外膜の外葉を構成しているリポ多糖（ＬＰＳ）分子の存在が原因で、外膜は、１−Ｎ−フェニルナフチルアミン（ＮＰＮ）のような外部の疎水性分子の侵入を防ぐことができる。抗微生物性の脂質改変ペプチド（リポペプチド）が細菌の外膜を透過できるかどうかを調べるために、リン脂質環境中で高い蛍光を示すが、水性の環境下では蛍光を十分には発しないＮＰＮを使用した。臨床分離株Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９を、指数増殖期の初期に回収し、５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝溶液（２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７）に、６７０ｎｍで０．３５の光学密度［ＯＤ６３０］が得られるまで懸濁した。４０μＭのＮＰＮストック溶液（Ｃ_１０Ｈ_７ＮＨＣ_６Ｈ_５）を、アセトンにＮＰＮを溶解させることにより調製し、５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈した。次に、細菌懸濁物を、９６ブラックウェルプレート（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の４０μＭのＮＰＮ溶液に添加した。所望する濃度のリポペプチドをウェルプレートに添加し、十分に混合した。ウェルプレート中のＮＰＮの最終濃度は２０μΜであった。５ｍＭのＨＥＰＥＳの添加を、本実験において陰性対照として使用した。蛍光読み取り値を、ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００マイクロプレートリーダーにより、３５５ｎｍの励起波長および４０５ｎｍの発光波長で測定した。

【0139】

結果：
図５で観察されるように、ＮＰＮアッセイは、本開示の脂質改変ペプチドがリポ多糖を透過化できたことを示している。Ｃ８Ｖ２Ｄ−Ｃ１４Ｖ２ＤはＶ２Ｄよりも優れた透過化効果を有している。

【0140】

実施例８ 商業的に入手可能な抗生物質を用いたリポペプチドの相乗作用の研究
目的：相乗作用性物質（ＳＹＮＥＲＧＩＳＴＩＣ ＡＧＥＮＴ）としてのリポペプチドのＬＰＳ中和の有意性を研究するため
材料および方法
Ｖ２Ｄ、Ｃ８Ｖ２Ｄ、およびＣ１０Ｖ２Ｄの、他の商業的に入手可能な抗生物質との相乗的相互作用を、ＭＨＢを用いたチェッカーボード微量希釈法（ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して決定した。簡単に説明すると、相乗研究に使用した各抗生物質のＭＩＣを微量液体希釈法により決定した。濃度範囲は、先に決定したそれぞれの化合物およびそれぞれの抗生物質のＭＩＣにしたがって調製した。試験した濃度範囲は、１×ＭＩＣから０．０３×ＭＩＣまでの範囲であった（または、最小合計部分阻害濃度（ｍｉｍｉｍｕｍ Ｔｏｔａｌ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、ＦＩＣが得られるまでさらに希釈した）。化合物および抗生物質の２倍希釈物を調製し、滅菌した試験管中で混合した。その後、細菌を含有している懸濁物を添加して、およそ５×１０^５ＣＦＵ／ｍＬの最終的な接種源を形成させた。次に、試験管を３５℃で２４時間インキュベートした。各試験管由来のアリコート（２００μＬ）を滅菌した９６ウェル平底プレート（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に添加した。ＭＩＣ９０を、６００ｎｍの光学密度で吸光度を測定することにより、ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００マイクロプレートリーダーを使用して決定した。使用した抗生物質は、ナリジクス酸、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、およびカナマイシンであった。ＦＩＣの合計を、以下の式にしたがって式を使用して計算した：ΣＦＩＣ＝ＦＩＣ_Ａ＋ＦＩＣ_Ｂ（式中、ＦＩＣ_ＡまたはＦＩＣ_Ｂ＝組み合わせの中のＭＩＣ剤ＡまたはＢ／剤ＡまたはＢ単独のＭＩＣ）。ΣＦＩＣ値を以下のように解釈した：０．５≦ΣＦＩＣの値は相乗作用を示し、０．５〜０．７５のΣＦＩＣ値は部分的な相乗作用を示し、そして０．７５〜４は中立を示し、そして≧４のΣＦＩＣの値は拮抗作用を示した。

【0141】

結果：
表５．Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＥ．ｃｏｌｉに対する５種類の異なる抗生物質を用いたＶ２Ｄ、Ｃ６Ｖ２Ｄ、およびＣ８Ｖ２Ｄの部分阻害濃度指数

【表5】

【0142】

Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：

【0143】

Ｃ６Ｖ２Ｄは優れた相乗効果を有している（試験した５種類の抗生物質のうちの３種類）。Ｃ８Ｖ２Ｄはより弱い効果を有している。

【0144】

Ｅ．ｃｏｌｉ：

【0145】

Ｃ８Ｖ２Ｄは、Ｖ２Ｄよりもはるかに優れた相乗効果を有している（試験した５種類の抗生物質のうちの５種類）。Ｃ６Ｖ２Ｄもまた良好な相乗的相互作用を示す。

【0146】

本開示の脂質改変ペプチドはまた、耐性形態のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに対してさえも、既存の抗生物質の活性を増大させるように、マイクログラム未満の値およびＭＩＣ（最小発育阻止濃度）値未満で作用すると考えられた。相乗効果を以下の表で説明する。

【0147】

実施例９ リポペプチドの内膜標的化特性
目的：グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌とのリポペプチドの内膜相互作用を研究するため
９Ａ．ＤｉｓＣ３−５細胞質膜減極アッセイ
材料および方法
２．５ 細胞質膜減極アッセイ

【0148】

ＤｉｓＣ３−５（３、３’−ジプロピルチアジカルボシアニドヨージド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、細菌細胞の細胞質膜電位に従って細胞と培地との間に分配される膜電位感受性色素である。分極化した細胞質膜上でのＤｉｓＣ３−５の分配は、蛍光強度を自己クエンチする（ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈ）であろう。膜電位を分散させる膜活性抗微生物物質の添加は、周囲の培地への色素の放出を引き起こし、蛍光の増大が観察されるであろう。分離株Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＤＭ４００１）およびＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８７３９の膜電位に対するリポペプチドの効果を調べた。簡単に説明すると、臨床分離株Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＤＭ４００１）またはＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８７３９を、指数増殖期の初期に回収し、５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝溶液（０．１ＭのＫＣｌ、および０．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７）で、６２０ｎｍで０．０９の光学密度［ＯＤ６２０］が得られるまで懸濁した。リポペプチドについては、この細胞懸濁物を０．４μＭのＤｉＳＣ３−５とともに、ＤｉＳＣ３−５の取り込みが最大になるまで、３７℃で３０分間インキュベートした。Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｅｌ ８１４蛍光分光光度計を使用して、蛍光の読み取りを５００秒間、６６０ｎｍの励起波長および６７５ｎｍの発光波長で安定なベースラインが得られるまでモニターした。所望する濃度のリポペプチドを、撹拌キュベットに添加し、蛍光シグナルを、読み取り値が安定するまでモニターした。

【0149】

結果
図６は、（Ａ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓの臨床分離株ＤＭ４００１および（Ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９の存在下でのＤｉＳＣ３−５の蛍光強度に対する本開示の脂質改変ペプチドの効果を示す。図６により示すように、脂質改変ペプチドの脂質テールの長さが長ければ長いほど、より多くのＤｉｓＣ３−５の脱分極が観察される。実際、Ｃ１６Ｖ２Ｄに対してＣ８Ｖ２Ｄは、細菌の細胞膜の有効な脱分極を引き起こすことができた。

【0150】

９Ｂ．リポペプチドアナログの膜損傷作用（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄａｍａｇｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）
材料および方法：
細菌膜の損傷の程度を、健常な細菌細胞に浸潤するそれらの様々な能力においてＳＹＴＯ９緑色蛍光核酸染色剤および赤色蛍光核酸染色剤、ヨウ化プロピジウムの両方を利用する、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して評価した。ＳＹＴＯ９色素は、完全な膜および損傷を受けた膜を持つ細菌に浸透することができたが、ヨウ化プロピジウムは、損傷を受けた細菌を持つ細菌だけにしか浸潤することができず、それにより、両方の色素が存在する場合には、ＳＹＴＯ９染色剤の蛍光の減少が生じる。したがって、完全な細胞膜を持つ細菌は、緑色の蛍光に染色されるが、損傷を受けた膜を持つ細菌は、赤色の蛍光に染色される。簡単に説明すると、臨床分離株Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＤＭ４００１）を指数増殖期の初期に回収し、０．９％の生理食塩溶液で２回洗浄した（生きた培養菌（ｌｉｖｅ ｃｕｌｔｕｒｅ））。この培養物の一部を、完全に透過化された膜を持つ死滅した培養菌を調製するために、７０％の２−プロパノールに再懸濁した。生きた培養菌および死滅した培養菌の両方を、６７０ｎｍで０．３０の光学密度［ＯＤ６７０］が得られるまで、０．９％の生理食塩溶液に再懸濁する前に３７℃で１時間インキュベートした。所望する濃度のリポペプチドを、３７℃でそれぞれ１０分間および３０分間、生きた培養菌の懸濁物とともにインキュベートした。その後、混合物および標準物のアリコートを、９６フラットブラックウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の等容量の色素混合物（１０μΜのＳＹＴＯ９染色剤および６０μΜのヨウ化プロピジウム）に対して添加し、十分に混合した。ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００マイクロプレートリーダーを使用して、励起のための波長を４８５ｎｍに固定して、５００ｎｍから７００ｎｍまでの発光スペクトルを得た。赤色に対する緑色の比（Ｇ／Ｒ）を以下の式を使用して決定した：

【数1】

膜損傷の百分率（％）を、０、１０％、５０％、９０％、および１００％の生きた培養菌懸濁物の細菌混合物を使用して作成したＧ／Ｒ比の標準曲線を使用して定量化した。標準物の溶液のセットを、様々な容量の生きた培養菌の懸濁物および死滅した培養菌の懸濁物を一緒に混合することにより得た。

【0151】

結果
図７に示すように、Ｃ１４Ｖ２Ｄに対して、Ｖ２Ｄについては、膜の完全性に対する効果は観察されなかった。しかし、膜の完全性の低下が、高濃度のＣ１６Ｖ２Ｄについて観察された（１×ＭＩＣ以上）。したがって、１６の炭素長を持つ脂質基で改変されたペプチドが、細菌の膜完全性の崩壊を引き起こすことができたことが明らかにされている。結果は、細菌細胞膜の透過化には、非常に長い脂質テール（増大した疎水性）が必要であることを示唆している。したがって、Ｃ８−Ｃ１４Ｖ２Ｄは細菌膜を脱分極させることができることが示されたが、膜の完全性の崩壊にはより長い脂質基が必要である。

【0152】

実施例１０ カルセインを封入したリポソームを使用する膜の選択性の研究
材料および方法
自己クエンチ濃度のカルセインを、リポソームで水和してカルセインを封入した。蛍光強度が自己クエンチが原因で低いことが観察された。リポソームが抗微生物物質により崩壊されると、色素が放出され、溶媒により希釈される。これにより、自己クエンチの程度が低下し、蛍光強度の増大につながる。このアッセイに使用した全てのリン脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ）より購入し、それ以上精製することなく使用した。この研究で使用したリン脂質は、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ナトリウム塩）（ＤＯＰＧ）、およびＥ．ｃｏｌｉの全脂質抽出物であった。カルセインをロードした大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）を、膜水和法（ｆｉｌｍ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して調製した。細菌の内膜中の主要な構成要素がＤＯＰＥおよびＤＯＰＧであるので、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ＝３／１の比を持つ脂質分子が、細菌膜の一般的なモデルを模倣する一般的に許容されているモデルである。同様に、ＤＯＰＣのリポソーム組成が、化合物の選択性を研究するためのＲＢＣ膜の一般的なモデルを模倣するための一般的に許容されているモデルである。脂質ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ＝３／１またはＤＯＰＣを、メタノール／クロロホルム（容量で１：２）中に溶解させた。溶媒を窒素ガス下で乾燥させ、続いて、少なくとも１時間凍結乾燥させた。次に、乾燥させた脂質膜を、最終的な脂質濃度が３０ｍＭとなるようにカルセイン溶液（８０ｍＭのカルセイン、ｐＨ７の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液）で水和した。水和した脂質小胞を、７サイクルの、液体窒素の中で凍結および水浴中での解凍に供した。押し出し成形を、１００ｎｍの均一なＬＵＶを調製するために、ミニ押し出し機（ｍｉｎｉ−ｅｘｔｒｕｄｅｒ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｃ．）においてポリカーボネート膜（Ｗｈａｔｍａｎ、孔径１００ｎｍ）を使用して、１０サイクル行った。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を使用したゲル濾過カラムを使用して、カルセインを封入した小胞を遊離のカルセインから分離した。溶離したリポソームの濃度を、全リン決定アッセイ（ｔｏｔａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）により決定した。カルセインを封入したＬＵＶのアリコートを撹拌キュベットに移した。その後、所望する濃度のリポペプチド（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ中に溶解させた）を、１／２、１／４、および１／８のキサントンアナログに対する脂質の所望する比、ならびに、１／２、１／４、１／８、１／１６、１／３２、１／６４、および１／１２８のリポペプチドに対する脂質の所望する比がそれぞれ得られるように、添加した。キュベット中でのリポソームの最終濃度は、５０μΜであった。０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を、完全な漏出での強度を決定するために陽性対照として添加した。蛍光発光強度を、４９０ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長で３０分間、ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００マイクロプレートリーダーを使用してモニターした。漏出の百分率（％Ｌ）を以下の式を使用して計算した：％Ｌ＝［（Ｉ_ｔ ｃａｌ_０）／（Ｉ_∞−Ｉ_０）］×１００％（式中、Ｉ_０およびＩ_ｔは、キサントンアナログ／リポペプチドの、それぞれ、添加前および添加後の強度であり、Ｌ_∞は、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の添加後の強度である）。

【0153】

結果
本開示では、リポペプチドの脂質膜との相互作用を、人工的な脂質膜を使用して研究した。この膜選択性の研究では、細菌膜を模倣するためにＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ＝３／１の脂質組成を使用した。アッセイは、本開示のリポペプチドが細菌の内膜内でのカルセインの漏出を約５０％誘導できることを示していた（図８Ａ）。本開示の脂質改変ペプチドの選択性を観察するために、赤血球膜を模倣するリポソームもまた構築した。図８Ｂは、細菌膜を模倣しているリポソームにおいて観察されたカルセインの漏出（図８Ａ）と比較して、本開示の脂質改変ペプチドが、顕著な赤血球膜の崩壊を引き起こさなかったことを示している。したがって、本研究の結果は、ＤＯＰＥが脂質改変ペプチドとの静電気的相互作用を提供するための主要な構成要素であり、これにより、細菌膜に対する本開示の脂質改変ペプチドの優れた選択性がもたらされることを示唆している。

【0154】

実施例１１ 抗生物質と組み合わせた本開示のペプチドに対する相乗作用の研究
最小発育阻止濃度の決定：
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、微量液体希釈法を使用して決定した。細菌細胞（表６に示す）をＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢ）中で一晩増殖させた。１００μＬの、ＭＨＢ中の調整した接種源を、各ウェル中で１０５〜１０６ｃｆｕ／ｍＬの最終細胞密度が得られるように、培養液中に溶解させたペプチドまたは抗生物質の１００μＬの各希釈物に添加する。プレートを３５℃で２４時間インキュベートし、６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ６００）を３０分毎にモニターした。陽性対照であるウェルには培養液と生物（ペプチド／抗生物質は含まない）を含め、陰性対照である管には培養液だけを含める。各臨床分離株または参照生物についてのペプチドのＭＩＣを、試験生物の目に見える増殖を阻害したペプチド／抗生物質の最も低い濃度として記録した。分岐を持つペプチドのＭＩＣに対するＭｇ^２＋の効果を研究するために、ＭＨＢ中のＭｇＣｌ_２の濃度を変化させ、先と同様にＭＩＣを決定した。

【0155】

表６．Ｂ２０８８およびＢ２０８８＿９９の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）

【表6】

＊ａＰａは、Psudomonas aeruginosaおよびKpは、Klebsiella pneumoniae

【0156】

表７．ＥＤ５０（細菌細胞の５０％を死滅させるための有効用量）により測定したＢ２０８８およびＢ２０８８＿９９の殺菌特性

【表7】

【0157】

部分阻害濃度指数（ＦＩＣＩ）の決定：
他の抗生物質との組み合わせにおけるペプチドのＦＩＣＩの決定のために、多剤耐性株Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＤＲ４８７７を使用した。試験の前に、少なくとも２×ＭＩＣになるように、各薬物（多価ペプチドおよび抗生物質）のストック溶液をＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢ）中に調製した。チェッカーボード（ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ）を、抗生物質の段階希釈物（すなわち、横座標に沿って）に対して多価ペプチドの段階的な２倍希釈物を垂直に（すなわち、縦座標に沿って）重ねることにより、９６ウェルマイクロタイタープレート上に組み立てた。各ウェルは、１００μＬの段階希釈したペプチドまたは抗生物質のみ、ならびに、ＭＨＢおよび１００μＬの接種源（ＯＤ６００＝０．０８）中で組み合わせた１００μＬの段階希釈したペプチドまたは抗生物質による構成とした。マイクロタイタープレートを３５℃で２４時間インキュベートした。阻害を目視検査により、およびＯＤ６００の測定により、両方で決定した。部分阻害濃度指数を以下の方程式を使用して計算する：

【0158】

抗生物質の組み合わせを特性決定するために使用したＦＩＣ指数は以下の通りである：ＦＩＣ指数＜０．５、相乗的；加成性、０．５＜ＦＩＣ指数＞１．０；中立、１＜ＦＩＣ指数＜４；ＦＩＣ指数＞４、拮抗作用。標準物としてのポリミキシンＢとペプチドの相乗作用もまた比較した。

【0159】

ＭＩＣに対するＬＰＳおよびＭｇ２＋の効果：ペプチドとＬＰＳの相互作用を試験するために、後者の濃縮物を、１×ＭＩＣのペプチド濃度でＭＨＢ中に、（０．００１〜１００μｇ／ｍＬ）までで外部から添加した。阻害率（％）を概算し、５０％の抗菌活性に必要なＬＰＳの量（ＩＣ５０）を決定した。

【0160】

表８．Ｂ２０８８およびＢ２０８８＿９９と様々なクラスの抗生物質との間での相乗作用。多剤耐性株Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＤＲ４８７７を実験に使用した。

【表8】

【0161】

実施例１２ 本開示のペプチドの細菌活性についての研究
細菌の生存性アッセイ：
細胞生存性アッセイ（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を、２種類のグラム陰性細菌（Ｐａ９０２７およびＰａ２７８５３）について行った。培養物をＴＳ寒天中で一晩増殖させ、数個の単離したコロニーを、０．５ ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準物に等しい濁度が達成されるように接種した。細胞濃度を、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液で１０６ＣＦＵ／ｍｌに調整し、１０５ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度が得られるように、異なる管に分離した。ペプチドを、１／８ ＭＩＣ、１／４ ＭＩＣ、１／２ ＭＩＣ、１ ＭＩＣ、２ ＭＩＣ、および４ ＭＩＣの濃度が得られるように個々の管に添加した。管を３７℃で２２時間インキュベートした。段階希釈を行い、１００μＬの懸濁物をＭＨＡプレートにアリコートした。プレートをコロニー計数のために３７℃で２４時間インキュベートした。陽性対照を０時間および２２時間で行った。

【0162】

図１２は、様々なＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株に対するＢ２０８８およびＢ２０８８＿９９の両方の細菌特性を示している。図１２は、Ｂ２０８８＿９９の有効用量がＢ２０８８よりも有意に低いことを示している。

【0163】

時間−死滅反応速度アッセイ：
殺菌作用の反応速度論を先に報告したアッセイにより行った。簡単に説明すると、一晩増殖させたＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株の数個のコロニーを、トリプチックソイ寒天プレートから回収し、米国薬局方リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中に懸濁した。この懸濁物を、１０^６ＣＦＵ／ｍＬの最初の接種源になるように調整し、様々な濃度のＢ２０８８およびＢ２０８８＿９９とともに３５℃でインキュベートした。０．１ｍＬのアリコートを様々な時間間隔で抜き取り、同じ緩衝液を使用して１０２〜１０４倍に希釈し、トリプチックソイ寒天プレート上に平板培養し、３５℃でインキュベートした。コロニーを２４時間のインキュベーション後に計数し、ＣＦＵ／ｍＬとして表した。ペプチドを含まない緩衝液を陽性対照とし、細菌生存性の百分率（％）を以下の方程式を使用して概算する：
細菌生存性＝１−（ＣＦＵ／ｍＬ）_ペプチド／（ＣＦＵ／ｍＬ）_対照^＊１００

【0164】

図１３は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対するＢ２０８８および２０８８＿９９の時間−死滅反応速度論を示す。Ｂ２０８８＿９９は、１×ＭＩＣおよび２×ＭＩＣで、いずれのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株に対してもより速い死滅反応速度論を示した。

【0165】

外膜（ＯＭ）透過性アッセイ：
ペプチドのＯＭ透過性をプローブするために、膜不透過性プローブＮ−フェニル−１−ナフチルアミン（ＮＰＮ）を本研究において使用した。一晩培養したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ９０２７細胞を３０００ｒｐｍ、４℃での遠心分離により採取した。得られたペレットを２回洗浄し、０．４のＯＤ６００になるように、５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中に再懸濁した。細胞を１０ｍｍの撹拌キュベット中に入れ、１０μΜの最終濃度になるようにＮＰＮを添加した。適切な濃度のＢ２０８８を添加し、蛍光強度の増大をＱｕａｎｔａ Ｍａｓｔｅｒ蛍光分光光度計（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ニュージャージー、米国）でモニターした。励起波長および発光波長を、それぞれ、２ｎｍおよび５ｎｍのスリッド幅で、３５０ｎｍおよび４１０ｎｍに設定した。ＮＰＮの取り込み率（％）を、５０μΜのポリミキシンＢの添加後のＮＰＮ蛍光強度の増大と比較して計算した。

【0166】

図１４は、Ｂ２０８８が、外膜透過性を引き起こすことに関して、Ｂ２０８８＿９９よりも有効であることを示している。

【0167】

分岐を持つペプチドに対するＬＰＳおよびリピドＡの結合についてのボディパイＴＲカダベリン（Ｃａｄａｖａｒｉｎｅ）（ＢＣ）置換アッセイ：
ＢＣは、その蛍光強度のクエンチを生じるＬＰＳ／脂質との堅固な複合体を形成する。ＬＰＳと相互作用することができるペプチド／分子が添加されると、ＢＣはその蛍光の脱クエンチを伴って、複合体から置き換えられる。このアッセイを５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で行った。１０μΜの色素を、撹拌石英キュベット中のＬＰＳまたはリピドＡに添加した。蛍光の測定を５８０ｎｍの励起波長を使用して行い、６２０ｎｍでの発光強度をモニターした。置換アッセイを様々な濃度のペプチドの添加により行った。ポリミキシンＢを陽性対照として使用した。ＢＣ占有率を以下の方程式を使用して計算した。

【0168】

ＯＦ＝Ｆ_０−Ｆ／Ｆ_０−Ｆ_ｍａｘ

【0169】

式中、Ｆ_０は遊離のＢＣの蛍光強度であり、Ｆ_ｍａｘはＬＰＳ−ＢＣ複合体の蛍光強度であり、そしてＦは、ペプチドまたはポリミキシンＢの添加後の蛍光強度である。図１５は、Ｂ２０８８がリポ多糖に対してはＢ２０８８＿９９よりも２倍さらに強く結合し、リピドＡに対しては１０倍を上回ってさらに強く結合することを示している。

【0170】

まとめると、上記に提供した結果は、Ｂ２０８８からの疎水性バリン残基の除去（すなわち、Ｂ２０８８＿９９）が殺菌特性および死滅反応速度論の特性の増強を導くことを示していた。しかし、外膜透過性および強いリピドＡ結合は、疎水性バリン残基の除去により損なわれるとみられる。これらの結果を確認するために、Ｂ２０８８およびＢ２０８８＿９９についてのＦＩＣ指数を、様々なクラスの抗生物質を用いて研究した。表８に示すように、Ｂ２０８８はＢ２０８８＿９９と比較して、多剤耐性Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対して様々な抗生物質を感作させる優れた能力を有している。
感染の動物モデル：
Ｂ２０８８が、Ｂ２０８８＿９９と比較して優れた抗微生物活性を有するというｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果を確認するために、マウスモデルにおいて角膜感染を除去するそれらの能力を調べた。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ９０２７感染の動物モデルを使用した。図１０に示すように、１／２用量のガチフロキサシンと組み合わせた０．５ｍｇ／ｍＬのＢ２０８８で、感染の完全な滅菌が観察され、活性はＢ２０８８＿９９よりも優れていた（図１１）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]