特許 6495940 Ｌ−リシン生産能を有する微生物及びそれを用いたＬ−リシンの生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6495940

(24)【登録日】2019年3月15日

(45)【発行日】2019年4月3日

(54)【発明の名称】Ｌ−リシン生産能を有する微生物及びそれを用いたＬ−リシンの生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20190325BHJP

   C12P 13/08 20060101ALI20190325BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20190325BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20190325BHJP

   C12N 15/52 20060101ALN20190325BHJP

   C12R 1/15 20060101ALN20190325BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21ZNA

   C12P13/08 A

   !C12N15/31

   !C12N15/54

   !C12N15/52

   C12R1:15

【請求項の数】7

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2016-561009(P2016-561009)

(86)(22)【出願日】2015年4月7日

(65)【公表番号】特表2017-510280(P2017-510280A)

(43)【公表日】2017年4月13日

(86)【国際出願番号】KR2015003478

(87)【国際公開番号】WO2015156583

(87)【国際公開日】20151015

【審査請求日】2016年10月5日

(31)【優先権主張番号】10-2014-0042397

(32)【優先日】2014年4月9日

(33)【優先権主張国】KR

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM11480P

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】514158497

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100126354

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 尚

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】バエ，ヒュン ウォン

(72)【発明者】

【氏名】ムーン，ジュン オク

(72)【発明者】

【氏名】ソン，スン キ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ヒョン ジョン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ヒョ ジン

(72)【発明者】

【氏名】リム，ソン ジョ

【審査官】 小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−２２２１６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０６０７９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Microbiology，１９９９年，Vol. 145，p. 503-513

【文献】 J. Biotechnol.，２００３年，Vol. 104，p. 99-122

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００ − １／３８

Ｃ１２Ｐ １３／００ − １３／２４

Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

改変されていない微生物と比較してより強化されたＬ−リシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であって、
その内在的活性に比較して酢酸キナーゼ（Acetate kinase）タンパク質活性がより強化されており、
前記酢酸キナーゼタンパク質活性が、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる方法、前記タンパク質をコードする遺伝子の調節配列における変異を導入する方法、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の調節配列を活性が強力な配列に置換する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子を変異した遺伝子で置換して前記タンパク質の活性を増加させる方法、及び前記タンパク質活性が強化されるように前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子に変異を導入する方法からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって強化される、微生物。

【請求項2】

前記微生物は、さらに、
（ｉ）ホスホトランスアセチラーゼ（Phosphotransacetylase）タンパク質活性が内在的活性より強化されているか、
（ｉｉ）アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（Acetyl-CoA synthetase）タンパク質活性が導入もしくは強化されているか、又は
（ｉｉｉ）ホスホトランスアセチラーゼタンパク質活性が内在的活性より強化され、かつアセチル−ＣｏＡシンテターゼタンパク質活性が導入もしくは強化されている、請求項１に記載の微生物。

【請求項3】

前記酢酸キナーゼは、配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の微生物。

【請求項4】

前記ホスホトランスアセチラーゼは、配列番号１３のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の微生物。

【請求項5】

前記アセチル−ＣｏＡシンテターゼは、配列番号１４のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の微生物。

【請求項6】

前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１に記載の微生物。

【請求項7】

（ｉ）請求項１〜６のいずれかに記載のコリネバクテリウム属微生物を培地中で培養するステップと、
（ｉｉ）前記培養された微生物又は培養された培地からＬ−リシンを回収するステップとを含む、Ｌ−リシンの生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｌ−リシン生産能を有する微生物及びそれを用いたＬ−リシンの生産方法に関する。

【背景技術】

【0002】

コリネバクテリウム属菌株は、炭素源としてグルコース（glucose）、スクロース（sucrose）、フルクトース（fructose）だけでなく、グルコン酸（gluconate）、酢酸（acetate）、ピルビン酸（pyruvate）などの有機酸を用いることができる。このうち酢酸は、モノカルボン酸に属する有機酸であり、コリネバクテリウム属微生物が利用すると、受動拡散（passive diffusion）又はモノカルボン酸トランスポーター（MctC, monocarboxylic acid transporter）により細胞内に入り、酢酸キナーゼ（acetate kinase, ackA）によりリン酸化されてアセチルリン酸（acetyl phosphate）に変換され、その後ホスホトランスアセチラーゼ（phosphotransacetylase, pta）によりアセチル−ＣｏＡ（acetyl coenzymeA）を生成する。生成されたアセチル−ＣｏＡは、直ちにＴＣＡ（tricarboxylic acid）回路とグリオキシル酸（glyoxylate）回路に入り（非特許文献１）、リシンの前駆体であるオキサロ酢酸（oxaloacetate）を生成する。

【0003】

しかし、コリネバクテリウム属菌株において酢酸を単独又は混合炭素源として用いて培養する場合には、その濃度によって生長阻害現象が現れるという問題がある。酢酸の代謝速度がグルコースなどの糖類と比較して遅いだけでなく、細胞内に所定濃度以上で存在すると細胞の生長を阻害するので、培養液中の酢酸濃度が増加するに伴って誘導期（lag phase）が長くなり、全体的な培養時間が長くなるという限界があった（非特許文献２）。よって、培養液中の酢酸を迅速に細胞内のアセチル−ＣｏＡに変換する方法の必要性が高まっている。

【0004】

しかし、酢酸活性化経路に用いられる酢酸キナーゼ及びホスホトランスアセチラーゼが双方向性を有することから（可逆反応）、アセチル−ＣｏＡが再び酢酸に変換されるという問題があると共に、Ｌ−リシンの生成に否定的な影響が生じ得ることが報告されているので、効果的な酢酸利用方法の開発は依然として不十分である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】韓国登録特許第１０−０９３０２０３号公報

【特許文献2】韓国登録特許第１０−０３９７３２２号公報

【特許文献3】韓国登録特許第１０−０９２４０６５号公報

【特許文献4】韓国登録特許第１０−００７３６１０号公報

【特許文献5】韓国登録特許第１０−１１２６０４１号公報

【特許文献6】韓国登録特許第１０−０１５９８１２号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】J. Bacteriol. 2009. 191:940-948

【非特許文献2】Arch. Microbiol. 1991. 155:505-510

【非特許文献3】Microbiol. 1999 145:503-513

【非特許文献4】Appl Microbiol Biotechnol. 2006. 71:870-4

【非特許文献5】Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40

【非特許文献6】Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981

【非特許文献7】"Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は以下を提供する。
［１］酢酸キナーゼ（Acetate kinase）タンパク質活性が内在的活性より強化された、Ｌ−リシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
［２］上記微生物は、さらに、
（ｉ）ホスホトランスアセチラーゼ（Phosphotransacetylase）タンパク質活性が内在的活性より強化されるか、
（ｉｉ）アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（Acetyl-CoA synthetase）タンパク質活性が導入もしくは強化されるか、又は
（ｉｉｉ）ホスホトランスアセチラーゼタンパク質活性が内在的活性より強化され、かつアセチル−ＣｏＡシンテターゼタンパク質活性が導入もしくは強化された、上記［１］に記載の微生物。
［３］上記酢酸キナーゼは、配列番号１２のアミノ酸配列を有する、上記［１］に記載の微生物。
［４］上記ホスホトランスアセチラーゼは、配列番号１３のアミノ酸配列を有する、上記［２］に記載の微生物。
［５］上記アセチル−ＣｏＡシンテターゼは、配列番号１４のアミノ酸配列を有する、上記［２］に記載の微生物。
［６］上記微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、上記［１］に記載の微生物。
［７］（ｉ）上記［１〜６のいずれかの微生物を培養して培養物を得るステップと、
（ｉｉ）上記培養物又は微生物からＬ−リシンを回収するステップとを含む、Ｌ−リシンの生産方法。
本発明者らは、発酵過程中に生成される酢酸又は新たな炭素源として提供される酢酸の効率的な利用のための微生物を開発すべく鋭意努力した結果、酢酸活性化経路における酢酸キナーゼ活性を強化した微生物の酢酸利用能とＬ−リシン生産能が増加したことを確認し、本発明を完成するに至った。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、酢酸キナーゼ（Acetate kinase）タンパク質活性が内在的活性より強化された、Ｌ−リシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供することを目的とする。

【0009】

また、本発明は、前記微生物を用いてＬ−リシンを生産する方法を提供することを目的とする。

【発明の効果】

【0010】

本発明による微生物は、酢酸活性化経路が強化されて酢酸利用能が増加した菌株であり、炭素源として酢酸を用いると高い収率でＬ−リシンを生産できる微生物であるので、製造されたＬ−リシンは、動物飼料又は動物飼料添加剤だけでなく、ヒトの食品又は食品添加剤、医薬品など、様々な製品に応用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1a】対照区であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐとｐｔａ、ｐｔａ−ａｃｋが導入されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ変異株の酢酸非添加培地における酢酸利用能を分析した図である。

【図1b】対照区であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐとｐｔａ、ｐｔａ−ａｃｋが導入されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ変異株の酢酸添加培地における酢酸利用能を分析した図である。

【図2】強力なプロモーターであるｌｙｓＣＰ１プロモーターによりａｃｋＡを過剰発現させるのためのベクターであるｐＤＺＴｎ−ｌｙｓＣＰ１−ａｃｋＡを示す図である。

【図3】対照区であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐとｐｔａ、ｐｔａ−ａｃｋ、ａｃｓが導入されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ変異株の酢酸利用能を分析した図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の一態様は、酢酸利用能が増加した、Ｌ−リシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。具体的には、前記微生物は、酢酸キナーゼ（Acetate kinase）タンパク質活性が内在的活性より強化された、Ｌ−リシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物である。

【0013】

本発明における「Ｌ−リシン」とは、塩基性α−アミノ酸の１つであり、体内で合成されない必須アミノ酸であり、化学式がＮＨ_２（ＣＨ_２）_４ＣＨ（ＮＨ_２）ＣＯＯＨである、Ｌ−アミノ酸の一種を意味する。

【0014】

酢酸は、モノカルボン酸に属する有機酸であり、コリネバクテリウム属微生物が利用すると、受動拡散又はモノカルボン酸トランスポーターにより細胞内に入り、酢酸キナーゼによりリン酸化されてアセチルリン酸に変換され、その後ホスホトランスアセチラーゼによりアセチル−ＣｏＡを生成する。生成されたアセチル−ＣｏＡは、直ちにＴＣＡ（tricarboxylic acid）回路とグリオキシル酸（glyoxylate）回路に入り、リシンの前駆体であるオキサロ酢酸（oxaloacetate）を生成する。一方、酢酸は、コリネバクテリウム属微生物において炭素源として用いられるが、酢酸を単独又は混合炭素源として用いて培養する場合には、その濃度によって生長阻害現象が現れるという欠点があった（非特許文献２）。

【0015】

細胞内で酢酸をアセチル−ＣｏＡに変換する酢酸活性化（activation）経路としては大きく２つの経路があるが、前述したように、コリネバクテリウム属菌株においては酢酸キナーゼとホスホトランスアセチラーゼの２つの酵素が順次作用する。酢酸キナーゼをコードする遺伝子としてはａｃｋＡ、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子としてはｐｔａが知られている（非特許文献３）。他の経路としては、エシェリキア属菌株においてアセチル−ＣｏＡシンテターゼ（acetyl-coA synthetase）が関与するが、これをコードする遺伝子としてはａｃｓが知られている（非特許文献４）。しかし、コリネバクテリウム属の活性化経路は可逆的な反応によるものであるので、この経路を単に強化しようとする試みはなかった。

【0016】

しかし、驚くべきことに、本発明者らは、酢酸キナーゼの活性を強化すると、細胞内で酢酸が迅速にアセチル−ＣｏＡに変換されるだけでなく、前述した生長阻害の欠点が克服され、Ｌ−アミノ酸生産能が増加することを確認することにより、酢酸キナーゼタンパク質活性が内在的活性より強化された、Ｌ−リシン生産能を有する新規なコリネバクテリウム属微生物を提供することができた。

【0017】

本発明の具体的な実施例によれば、ａｃｋＡ遺伝子の活性が強化された微生物の酢酸消費速度が速く、菌株の生長においても誘導期が大幅に短縮されることが確認された。それに対して、ｐｔａ遺伝子の活性が強化された場合は酢酸消費速度が対照区と大差ないことが確認され（図１ａ及び図１ｂ）、酢酸活性化により酢酸利用能が増加し、生長阻害がなく、Ｌ−リシン生産能を増加させる重要なタンパク質は酢酸キナーゼであることが確認された。すなわち、これらの結果から、様々な公知の方法により酢酸キナーゼの活性を強化すると、酢酸利用能が増加し、生長阻害がなく、Ｌ−リシンを高収率で生成できる微生物を製造できることが確認された。

【0018】

本発明における、前記酢酸利用能が増加し、Ｌ−リシン生産能が増加したコリネバクテリウム属微生物は、酢酸キナーゼ（Acetate kinase）タンパク質活性が内在的活性より強化された、Ｌ−リシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。

【0019】

また、前記酢酸利用能が増加し、Ｌ−リシン生産能が増加したコリネバクテリウム属微生物は、酢酸キナーゼ（Acetate kinase）タンパク質活性が内在的活性より強化された微生物に、さらに（ｉ）ホスホトランスアセチラーゼ（Phosphotrasnacetylase）タンパク質活性が内在的活性より強化された微生物、（ｉｉ）アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（Acetyl-CoA synthetase）タンパク質活性が導入もしくは強化された微生物、又は（ｉｉｉ）ホスホトランスアセチラーゼタンパク質活性が内在的活性より強化され、かつアセチル−ＣｏＡシンテターゼタンパク質活性が導入もしくは強化された微生物であってもよい。

【0020】

本発明者らは、酢酸利用能増加及びＬ−リシン生産能増加に最も重要な酢酸キナーゼ（Acetate kinase）タンパク質活性が内在的活性より強化された微生物に、さらにホスホトランスアセチラーゼを内在的活性より強化し、及び／又はアセチル−ＣｏＡシンテターゼ（Acetyl-CoA synthetase）タンパク質活性を導入もしくは強化すると、酢酸利用能がさらに増加することを確認し、新規な前記微生物を提供するに至った。本発明の一実施例によれば、エシェリキア属菌株由来のアセチル−ＣｏＡをコードする遺伝子であるａｃｓをさらに導入すると、酢酸消費速度が速くなることが確認された（図３）。これらの結果は、アセチル−ＣｏＡシンテターゼタンパク質活性の導入又は強化も酢酸消費速度を速くし、Ｌ−リシン生産能を増加させることを示唆するものである。

【0021】

本発明における「酢酸キナーゼ（acetate kinase, EC 2.7.2.1）」とは、酢酸をリン酸化してアセチルリン酸（acetyl phosphate）を生成する機能を有する酵素を意味する。前記酢酸キナーゼをコードする遺伝子をａｃｋＡといい、前記タンパク質及び遺伝子配列は公知のデータベースから得られ、例えばＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記酢酸キナーゼタンパク質は、例えば配列番号１２のアミノ酸配列を有するが、酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質配列が制限なく含まれる。

【0022】

本発明における「ホスホトランスアセチラーゼ（phosphotransacetylase, EC 2.3.1.8）」とは、下記反応式によりアセチルリン酸をアセチル−ＣｏＡに変換する機能を有する酵素を意味する。

【0023】

【化1】

【0024】

前記ホスホトランスアセチラーゼは、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ（phophate acetyltransferase）やホスホアシラーゼ（phosphoacylase）などと混用される。前記ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子をｐｔａといい、前記タンパク質及び遺伝子配列は公知のデータベースから得られ、例えばＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記ホスホトランスアセチラーゼタンパク質は、例えば配列番号１３のアミノ酸配列を有するが、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するタンパク質配列が制限なく含まれる。

【0025】

本発明における「アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（acetyl-CoA synthetase, EC 6.2.1.1）」とは、下記反応式によりアセテートをアセチル−ＣｏＡに合成する活性を有する酵素を意味する。

【0026】

【化2】

【0027】

前記アセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードする遺伝子をａｃｓといい、前記タンパク質及び遺伝子配列は公知のデータベースから得られ、例えばＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記アセチル−ＣｏＡシンテターゼタンパク質は、例えば配列番号１４のアミノ酸配列を有するが、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ活性を有するタンパク質配列が制限なく含まれる。

【0028】

本発明の上記各タンパク質は、上記各配列番号で表されるアミノ酸配列だけでなく、上記配列と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、特に具体的には９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。このような相同性を有する配列であって、実質的に上記各タンパク質と同一又は相当する効能を示すタンパク質を示すアミノ酸配列であれば、制限なく含まれる。また、このような相同性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列も本発明の範囲に含まれることは言うまでもない。

【0029】

また、本発明の上記各タンパク質をコードする遺伝子は、上記各配列番号で表されるアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列だけでなく、上記配列と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すポリヌクレオチド配列であって、実質的に上記各タンパク質と同一又は相当する効能を示すタンパク質をコードする遺伝子配列であれば、制限なく含まれる。さらに、このような相同性を有するポリヌクレオチド配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたポリヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれることは言うまでもない。

【0030】

本発明における「相同性」とは、タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列やアミノ酸配列の類似の程度を意味するが、相同性が十分に高いと、該当遺伝子の発現産物は同一又は類似の活性を有する。

【0031】

本発明における「内在的活性」とは、本来微生物が改変されていない状態、すなわち天然状態で有するタンパク質の活性状態を意味する。

【0032】

本発明において「タンパク質活性を内在的活性より強化」するとは、微生物がそのタンパク質活性を有する天然状態より細胞内の活性が向上するように改変することにより、微生物の天然状態より前記タンパク質の細胞内の活性を増加させることを意味する。また、本発明における「タンパク質活性の強化」とは、内在的活性より強化させるだけでなく、特定のタンパク質活性を有さない微生物にそのタンパク質活性が付与されたら、その細胞内の活性がさらに向上するように改変することにより、前記タンパク質の細胞内の活性を増加させることを意味する。

【0033】

このような「強化」には、タンパク質自体の活性が増大して本来の機能以上の効果を発揮することが含まれるだけでなく、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子調節配列に変異を導入する方法、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子調節配列を活性が強力な配列に置換する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子を代替して前記タンパク質活性が増加するように突然変異した遺伝子にする方法、及び前記タンパク質活性が強化されるように前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子に変異を導入する方法からなる群から選択される少なくともいずれかの方法により行われるが、タンパク質活性を内在的活性より強化できるか、導入された活性を強化できる公知の方法が制限なく含まれる。

【0034】

本発明において「タンパク質活性を導入」するとは、特定のタンパク質活性を有さない微生物にそのタンパク質活性を付与することを意味する。

【0035】

このような「タンパク質活性の導入」は、当該分野で周知の様々な方法で行われ、例えば前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを染色体に挿入する方法、前記ポリヌクレオチドをベクターシステムに導入して微生物に導入する方法などによりポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の上流に改良された活性を示すプロモーターを導入するか、プロモーターに変異を加えた前記タンパク質を導入する方法、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の変異体を導入する方法などを用いることができるが、タンパク質活性を導入できる公知の方法が制限なく含まれる。

【0036】

前記ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれらに限定されるものではないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることにより行われる。具体的には、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターが宿主細胞に導入されることにより行われるか、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターが宿主細胞に導入されることにより前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法で行われる。

【0037】

前記ベクターは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ産物であり、前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製又は機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。

【0038】

本発明に用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当業界で公知の任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。本発明において使用可能なベクターが特に限定されるわけではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。例えば、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。

【0039】

また、宿主細胞内の染色体挿入用ベクターにより、染色体内に内在的な標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異したポリヌクレオチドに置換することができる。あるいは、染色体に導入する外来標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異したポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができる。本発明のベクターは、相同組換えを起こして染色体内に挿入されるので、前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換した細胞を選択、すなわち標的ポリヌクレオチドが挿入されたか否か確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーを用いることができる。選択剤（selective agent）で処理された環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、他の表現形質を示すので、形質転換した細胞を選択することができる。

【0040】

本発明における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換したポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それら全てを含むものである。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入される。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよい。

【0041】

また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本発明の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。

【0042】

本発明のベクターを形質転換する方法は、ポリヌクレオチドを細胞に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈殿、微量注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、カチオン性リポソーム法及び酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0043】

前記宿主細胞としては、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主を用いることが好ましく、本発明の目的上、コリネバクテリウム属微生物であることが好ましい。

【0044】

次に、ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列に変異を導入することは、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現調節配列の活性がさらに強化されるように、ポリヌクレオチド配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より高い活性を有するポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。

【0045】

前記ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結される。異種プロモーターの例としては、ｐｃｊ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡプロモーター、ａｃｅＢプロモーターなどが挙げられ、コリネバクテリウム由来のプロモーターであるｐｃｊ７プロモーター又はｌｙｓＣＰ１プロモーターを用いることが好ましい。このようなｌｙｓＣＰ１プロモーターの配列及び製造方法は特許文献１に記載されており、上記特許はその全体が本発明の参照例として含まれる。本発明の具体的な実施例によれば、強力なプロモーターであるｌｙｓＣＰ１プロモーターにａｃｋＡ遺伝子を連結した際に対照区に比べて向上した酢酸利用能が確認された（図３）。これらの結果は、ａｃｋＡ遺伝子の発現量が増加するにつれて酢酸利用速度が速くなることを示唆するものである。

【0046】

また、染色体上のポリヌクレオチド配列の改変は、特にこれらに限定されるものではないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性がさらに強化されるように、ポリヌクレオチド配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より高い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。

【0047】

このようなタンパク質活性の導入又は強化は、対応するタンパク質活性又は濃度が野生型タンパク質や初期の微生物菌株における活性又は濃度に比べて、一般に少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％、最大で１０００％又は２０００％まで増加したものであってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0048】

本発明における「Ｌ−リシン生産能を有する微生物」とは、本発明の目的上、Ｌ−リシンを生産できる微生物菌株であり、本発明の操作により培地中の酢酸を効率的に用いて生長速度の低下なくＬ−酢酸を蓄積できる菌株を意味する。前記微生物には、本発明の酢酸キナーゼタンパク質活性が内在的活性より強化されたあらゆるコリネバクテリウム属微生物が含まれ、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）などが用いられるが、これらに限定されるものではない。例えば、前記コリネバクテリウム属微生物としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）を用いることができ、前記コリネバクテリウム・グルタミカムの具体例としては、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（特許文献２）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（特許文献３）、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（特許文献４）又はＣＪ３Ｐ（非特許文献５）を用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明の具体的な実施例によれば、代表的なコリネバクテリウム属微生物としてコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐを母菌株とし、ａｃｋＡ遺伝子を過剰発現させると、酢酸利用能が増加し、生長阻害現象が生じることなく、Ｌ−リシン生産量が増加することが確認された（実施例２〜６）。また、様々なコリネバクテリウム属微生物であるＫＣＣＭ１０７７０Ｐ、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ又はＣＪ３ＰにおいてａｃｋＡ遺伝子を過剰発現させた場合もＬ−リシン生産能が増加することが確認された（実施例７）。これらの結果は、ａｃｋＡ遺伝子がコードする酢酸キナーゼが酢酸利用に用いられるコリネバクテリウム属微生物においては、前記タンパク質活性強化によりＬ−リシン生産能が増加することを示唆するものである。また、ａｃｋＡ遺伝子がコードする酢酸キナーゼの活性強化に、さらにホスホトランスアセチラーゼ活性の強化及び／又はアセチル−ＣｏＡ活性の導入もしくは強化を行うことにより、酢酸利用能及びＬ−リシン生産能が増加することが確認された。

【0049】

本発明の他の態様は、（ｉ）酢酸利用能が増加し、Ｌ−リシン生産能が増加した、新規な前記コリネバクテリウム属微生物を培養して培養物を得るステップと、（ｉｉ）前記培養物又は微生物からＬ−リシンを回収するステップとを含む、Ｌ−リシンの生産方法を提供する。

【0050】

前記Ｌ−リシン生産能が増加したコリネバクテリウム属微生物については前述した通りである。

【0051】

本発明における「培養」とは、微生物を人工的に調節した好適な環境条件で生育させることを意味する。本発明において、コリネバクテリア属微生物を用いてＬ−リシンを培養する方法は、当業界で周知の方法を用いることができる。具体的には、前記培養は、バッチプロセス又は流加もしくは反復流加プロセス（fed batch or repeated fed batch process）で連続して培養することができるが、これらに限定されるものではない。

【0052】

培養に用いられる培地は、好適な方法で特定菌株の要件を満たすものでなければならない。コリネバクテリア菌株の培養培地は公知である（例えば、非特許文献６）。用いることのできる糖源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油脂、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセリン、エタノールなどのアルコール、グルコン酸、酢酸、ピルビン酸などの有機酸が挙げられる。これらの物質は単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。用いることのできる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及び尿素、又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源は、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。用いることのできるリン源としては、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム、若しくはそれらに相当するナトリウム含有塩が挙げられる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウム又は硫酸鉄などの金属塩を含有してもよい。前記物質以外にも、アミノ酸及びビタミンなどの必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に好適な前駆体が用いられてもよい。前述した原料は、培養過程において培養物に好適な方法でバッチ式に又は連続式に添加されてもよい。このような様々な培養方法は、例えば非特許文献７に開示されている。

【0053】

水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの塩化合物、又はリン酸、硫酸などの酸化合物を好適な方法で用いて培養物のｐＨを調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために、培養物内に酸素又は酸素含有気体（例えば、空気）を注入してもよい。培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、具体的には２５℃〜４０℃であるが、条件に応じて変更することができる。培養は、所望のＬ−アミノ酸の最大の生成量が得られるまで続ける。これらの目的は通常１０〜１６０時間で達成される。Ｌ−リシンは、培養培地中に排出されるか、細胞中に含まれている。

【0054】

本発明のＬ−リシンを生産する方法は、微生物又は培養物からリシンを回収するステップを含んでもよい。微生物又は培養物からＬ−リシンを回収する方法は、当業界で公知の方法、例えば遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。

【0055】

前記回収ステップは、精製工程を含んでもよい。
［実施例］

【0056】

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明を例示するためのものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例1】

【0057】

ａｃｋＡ、ｐｔａ、又はｐｔａ及びａｃｋＡ染色体追加挿入用ベクターの作製
コリネバクテリウム染色体上にａｃｋＡ遺伝子とｐｔａ遺伝子をそれぞれ又は同時に追加導入するためのベクターを作製するために、トランスポゾンの遺伝子位置に標的遺伝子を挿入できるようにｐＤＺベクターから考案されたｐＤＺＴＮベクター（特許文献５）を基本ベクターとして用いた。２つの遺伝子は染色体上でｐｔａ−ａｃｋＡ形態のオペロンを形成しているので、追加導入するａｃｋＡ遺伝子の単独過剰発現のために、ｐｔａ−ａｃｋＡオペロンのプロモーター部位をａｃｋＡ遺伝子ＯＲＦ（open-reading frame）の上流に作動可能に連結した。本実施例に用いたプライマー配列を下記表１に示す。

【0058】

ａｃｋＡ遺伝子追加挿入用ベクターを作製するために、既に報告されているポリヌクレオチド配列に基づいてａｃｋＡ遺伝子部位を増幅するためのプライマー（配列番号１及び２）を合成し、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型としたＰＣＲにより約１３００ｂｐのａｃｋＡ遺伝子のＯＲＦ部位を増幅した。ここで、ＰＣＲは、９４℃で５分間の変性を行い、その後９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。ポリヌクレオチド配列の下線部分は制限酵素の認識部位を示す。

【0059】

【表1】

【0060】

さらに、ｐｔａ−ａｃｋＡオペロンのプロモーター部位を増幅するためのプライマー（配列番号３及び４）を合成し、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより約３５０ｂｐのプロモーター部位を増幅した。ここで、ＰＣＲは、９４℃で５分間の変性を行い、その後９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。

【0061】

ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩとＮｄｅＩで処理することによりそれぞれのＤＮＡ断片を得て、さらに制限酵素ＳｐｅＩ末端を有するｐＤＺＴＮベクターに連結し、その後大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後周知のプラスミド抽出法を用いてプラスミドを得て、そのプラスミドをｐＤＺＴＮ−Ｐｐｔａ＿ａｃｋＡと命名した。

【0062】

ｐｔａ遺伝子追加挿入用ベクターを作製するために、ｐｔａ遺伝子のＯＲＦ末端部位のプライマー（配列番号５）を合成し、ｐｔａ遺伝子プロモーターからＯＲＦ末端までを増幅するためのプライマー（配列番号３及び５）を用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型としたＰＣＲにより、約１７５０ｂｐのｐｔａ遺伝子部位を増幅した。ここで、ＰＣＲは、９４℃で５分間の変性を行い、その後９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。

【0063】

ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩで処理することによりＤＮＡ断片を得て、さらに制限酵素ＳｐｅＩ末端を有するｐＤＺＴＮベクターに連結することによりプラスミドを得て、そのプラスミドをｐＤＺＴＮ−ｐｔａと命名した。

【0064】

２つの遺伝子をオペロン形態で同時に追加導入するためのベクターとして、ｐｔａ−ａｃｋＡ遺伝子オペロン（配列番号１０）のプロモーター予測区間からａｃｋＡ遺伝子のＯＲＦ末端までを増幅するためのプライマー（配列番号３及び２）を用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型としたＰＣＲにより、約３０００ｂｐのｐｔａ−ａｃｋＡ遺伝子部位を増幅した。ここで、ＰＣＲは、９４℃で５分間の変性を行い、その後９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３分間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。ＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩで処理することによりＤＮＡ断片を得て、さらに制限酵素ＳｐｅＩ末端を有するｐＤＺＴＮベクターに連結することによりプラスミドを得て、そのプラスミドをｐＤＺＴＮ−ｐｔａ−ａｃｋＡと命名した。

【実施例2】

【0065】

ａｃｋＡ、ｐｔａ遺伝子染色体導入菌株の酢酸利用能の分析
実施例１で作製した３種のベクターであるｐＤＺＴＮ−Ｐｐｔａ＿ａｃｋＡ、ｐＤＺＴＮ−ｐｔａ、ｐＤＺＴＮ−ｐｔａ−ａｃｋＡを電気パルス法によりコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（上記微生物は、ＫＦＣＣ１０８８１として公開されたが、ブダペスト条約上の国際寄託機関に再寄託され、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐの寄託番号が与えられた。特許文献２，６）に形質転換し、相同組換えにより染色体上に標的遺伝子が挿入された菌株をＰＣＲ法で選択的に分離し、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｐｐｔａ＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｐｔａ（Ｔｎ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｐｔａ−ａｃｋＡ（Ｔｎ）と命名した。

【0066】

下記の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに上記３種の菌株と対照区を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。その後、下記の生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３７℃、２００ｒｐｍで９６時間振盪培養した。培養中に１２時間毎に培養液を採取し、培養液中のグルコース、酢酸の残量、及び５６２ｎｍにおける吸光度を分析した。その結果を図１ａ及び図１ｂに示す。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖２０ｇ，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ １０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ_２ＰＯ_４４ｇ，Ｋ_２ＨＰＯ_４ ８ｇ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖１００ｇ，酢酸アンモニウム７．１ｇ（添加又は非添加），（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（corn steep solid）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ_２ＰＯ_４１ｇ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ_３３０ｇ（蒸留水１リットル中）

【0067】

図１ａに示すように、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｐｐｔａ＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）菌株は、酢酸を添加しない培地において、母菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐとは異なり、グルコースの消費中に酢酸を生成し、グルコースを全て消費すると酢酸を消費した。それにより、酢酸キナーゼが酢酸生成に関与していることが確認された。また、酢酸を生成すると共に培養速度が遅くなる現象が観察された。

【0068】

しかし、図１ｂに示すように、酢酸を添加した培地で培養した場合、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｐｐｔａ＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）菌株は、対照区であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐと比較して、培養初期に酢酸をむしろ早く消費する傾向を示し、それにより、菌株の生長において対照区に比べて誘導期が大幅に短縮された。ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｐｔａ（Ｔｎ）菌株は、酢酸消費速度において対照区と大きな差がなかった。ただし、２つの遺伝子がオペロン形態で全て導入されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｐｔａ−ａｃｋＡ（Ｔｎ）菌株は、ａｃｋＡのみ導入されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｐｐｔａ＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）菌株より酢酸消費速度がわずかに増加することが確認された。

【0069】

これらの結果から、酢酸生成又は活性化において、ａｃｋＡ遺伝子がコードする酢酸キナーゼが主要酵素であり、培地中に酢酸が存在しない場合は酢酸生成に関与するが、培地中に酢酸が存在する場合は酢酸活性化経路として用いられることが確認された。また、ａｃｋＡを過剰発現させると、活性化経路の強化により酢酸利用能が大きく増加し、酢酸による生長阻害が減少し、誘導期が短縮されることが確認された。

【実施例3】

【0070】

強力なプロモーターによるａｃｋＡ遺伝子過剰発現菌株の作製及び効果の確認
ａｃｋＡ遺伝子を過剰発現させた場合の酢酸利用能及びその効果を再確認するために、既に報告されている強力なプロモーターであるｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献１）を用いて追加導入するａｃｋＡ遺伝子の発現を誘導した。本実施例で用いたプライマーを下記表２に示す。

【0071】

実施例１に示すｐＤＺＴｎベクターを基本ベクターとして染色体挿入用ベクターを作製した。既に報告されているポリヌクレオチド配列に基づいてｌｙｓＣＰ１プロモーター部位を増幅するためのプライマー（配列番号６及び７）を合成し、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣＰ１（特許文献１）の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより約４５０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。ここで、ＰＣＲは、９４℃で５分間の変性を行い、その後９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。

【0072】

【表2】

【0073】

ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＮｄｅIで処理することによりＤＮＡ断片を得て、さらに実施例１で作製したＮｄｅＩとＳｐｅＩ末端を有するａｃｋＡ遺伝子のＯＲＦ部位のＤＮＡ断片と共に、制限酵素ＸｈｏＩとＳｐｅＩ末端を有するｐＤＺＴＮベクターに連結し、その後大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後周知のプラスミド抽出法を用いてプラスミドを得て、そのプラスミドをｐＤＺＴＮ−ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡと命名した（図２）。

【0074】

作製したベクターｐＤＺＴＮ−ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡを染色体上での相同組換えによりＬ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換した。その後、ＰＣＲ法でｐＤＺＴＮ−ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡが染色体上に相同組換えにより挿入されたコロニーを選択的に分離し、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）と命名した。

【0075】

ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）菌株、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｐｐｔａ＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）及び対照区ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株を実施例２と同様に培養し、１２時間毎に培養液中の酢酸残量を分析した。その結果を図３に示す。

【0076】

その結果、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｐｐｔａ＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）菌株は、実施例２の結果と同様に、対照区に比べて向上した酢酸利用能を示した。また、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）菌株は、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｐｐｔａ＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）菌株と比較して、酢酸消費速度がさらに増加することが確認された。

【0077】

これらの結果は、ａｃｋＡ遺伝子の発現量が増加するにつれて酢酸利用速度が速くなることを示唆するものである。それにより、ａｃｋＡ遺伝子の過剰発現が酢酸利用能増加の主な原因であることが再確認された。

【実施例4】

【0078】

ａｃｋＡ遺伝子過剰発現菌株のリシン生産能の分析
実施例３で作製したコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）菌株のリシン生産能を確認するために、対照区ＫＣＣＭ１１０１６Ｐと共に実施例２と同様に培養し、培養終了後にＨＰＬＣを用いて分析したＬ−リシン濃度を下記表３に示す。

【0079】

【表3】

【0080】

その結果、表３に示すように、酢酸を添加せずにグルコースのみ炭素源として用いて培養した場合、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）は対照区と同レベルのリシン生産能を示した。しかし、酢酸が含まれる培地で培養した場合、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）菌株は対照区に比べてリシン収率（総炭素源収率＝リシン濃度／(グルコース＋酢酸添加量)）が平均１２％増加することが確認された。

【0081】

これらの結果は、酢酸活性化経路が強化されると、酢酸利用能の増加だけでなく、Ｌ−リシン生産能も増加することを裏付けるものである。また、これらの結果は、炭素源として酢酸を用いる場合に、本発明のａｃｋ遺伝子が強化された菌株を用いると、細胞の生長阻害がなく、培養時間を短縮できると共に、リシンを高収率で生産できることを示唆するものである。

【0082】

よって、本発明者らは、前記酢酸利用能及びＬ−リシン生産能が増加したＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）菌株をコリネバクテリウム・グルタミカム「ＣＡ０１−２２７８」と命名し、２０１３年１１月２２日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ１１４８０Ｐとして寄託した。

【実施例5】

【0083】

ａｃｓ遺伝子導入菌株の作製及び効果分析
エシェリキア由来の酢酸活性化経路をコリネバクテリウムの染色体上に挿入するために、エシェリキア由来の酢酸活性化経路として知られるａｃｓ遺伝子（配列番号１１）を得て、実施例１のｐＤＺＴｎベクターを基本ベクターとして染色体挿入用ベクターを作製した。コリネバクテリウム由来ｐｔａ−ａｃｋＡ遺伝子のプロモーターをａｃｓ遺伝子開始コドンの上流に作動可能に連結することにより発現を誘導した。本実施例で用いたプライマーを下記表４に示す。

【0084】

既に報告されているポリヌクレオチド配列に基づいてａｃｓ遺伝子部位を増幅するためのプライマー（配列番号８及び９）を合成し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ菌株（ＡＴＣＣ９６３７）の染色体を鋳型としたＰＣＲにより約２０００ｂｐのａｃｓ遺伝子のＯＲＦ部位を増幅した。ここで、ＰＣＲは、９４℃で５分間の変性を行い、その後９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。

【0085】

【表4】

【0086】

実施例１で用いたｐｔａ−ａｃｋＡオペロンのプロモーターＤＮＡ断片と共に制限酵素ＳｐｅＩとＮｄｅＩで処理することにより各ＤＮＡ断片を得て、さらに制限酵素ＳｐｅＩ末端を有する染色体挿入用ｐＤＺＴＮベクターに連結し、その後大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後周知のプラスミド抽出法を用いてプラスミドを得て、そのプラスミドをｐＤＺＴＮ−Ｐｐｔａ−ａｃｓと命名した。

【0087】

前述したように作製したベクターを電気パルス法により実施例２で作製したコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｐｐｔａ＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）に形質転換し、相同組換えにより染色体上にａｃｓ遺伝子が挿入された菌株を選択したが、ここでＰｐｔａ＿ａｃｋＡ遺伝子が既に挿入されているトランスポゾンとは異なるトランスポゾンに挿入されたコロニーをＰＣＲ法で選択的に分離し、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｐｐｔａ＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）−Ｐｐｔａ＿ａｃｓ（Ｔｎ）と命名した。

【0088】

ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｐｐｔａ＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）−Ｐｐｔａ＿ａｃｓ（Ｔｎ）菌株及び対照区ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｐｐｔａ＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）菌株を実施例２と同様に培養し、１２時間毎に培養液中の酢酸残量を分析した。

【0089】

その結果、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｐｐｔａ＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）−Ｐｐｔａ＿ａｃｓ（Ｔｎ）菌株は対照区と比較して酢酸消費速度がわずかに増加することが確認された（図３）。

【0090】

これらの結果は、コリネバクテリウム属微生物にａｃｋＡ遺伝子過剰発現だけでなく、エシェリキア属由来の外来遺伝子であるａｃｓ遺伝子導入も酢酸消費速度を速くし、Ｌ−リシンの生産能を増加させることを示唆するものである。

【実施例6】

【0091】

Ｌ−リシン生産菌株由来のａｃｋＡ遺伝子過剰発現菌株のＬ−リシン生産能の比較
ａｃｋＡ過剰発現菌株のリシン生産能増加効果を確認するために、コリネバクテリウム属由来の様々なリシン生産菌株を対象にＬ−リシン生産能を比較した。

【0092】

代表的なリシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（特許文献３）、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（上記微生物は、ＫＦＣＣ１０７５０として公開されたが、ブダペスト条約上の国際寄託機関に再寄託され、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐが与えられた。特許文献４）、ＣＪ３Ｐ（非特許文献５）の３種に挿入し、その後Ｌ−リシン生産能を比較した。

【0093】

実施例３で作製したベクターｐＤＺＴＮ−ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡを染色体上での相同組換えによりコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ、ＣＪ３Ｐにそれぞれ形質転換した。その後、ＰＣＲ法でコロニーを選択的に分離し、各菌株をＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）、ＣＪ３Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）と命名した。

【0094】

上記菌株のリシン生産能を比較するために、各対照区と共に実施例２と同様に培養し、培養終了後にＨＰＬＣを用いて分析したＬ−リシン濃度を下記表５に示す。

【0095】

【表5】

【0096】

その結果、表５に示すように、リシン生産菌株由来のａｃｋＡ過剰発現菌株は全てＬ−リシン生産能が増加した。ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）菌株は、対照区ＫＣＣＭ１０７７０Ｐと比較してリシン濃度が約１１％増加した。ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）菌株は、対照区ＫＣＣＭ１１３４７Ｐと比較してリシン濃度が約１０％増加した。ＣＪ３Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿ａｃｋＡ（Ｔｎ）菌株は、対照区ＣＪ３Ｐと比較してリシン濃度が約１１％増加した。

【0097】

よって、これらの結果から、グルタミカム属由来の様々な系列のＬ−リシン生産菌株において、酢酸キナーゼの活性増加はＬ−リシン生産能を増加させる効果があることが分かった。

【0098】

以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。

【表6】

【図1a】

【図1b】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]