特許 6498480 熱ショックタンパク質発現誘導剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6498480

(24)【登録日】2019年3月22日

(45)【発行日】2019年4月10日

(54)【発明の名称】熱ショックタンパク質発現誘導剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/17 20060101AFI20190401BHJP

   A61K 36/02 20060101ALI20190401BHJP

   A61K 35/60 20060101ALI20190401BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190401BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20190401BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20190401BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20190401BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20190401BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20190401BHJP

   A61P 39/06 20060101ALI20190401BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20190401BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20190401BHJP

   A61Q 19/02 20060101ALI20190401BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20190401BHJP

   A61Q 19/10 20060101ALI20190401BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20190401BHJP

   A61K 8/65 20060101ALI20190401BHJP

   A23L 33/18 20160101ALN20190401BHJP

   A23L 33/185 20160101ALN20190401BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/17

   A61K36/02

   A61K35/60

   A61P35/00

   A61P25/28

   A61P11/00

   A61P1/04

   A61P17/02

   A61P29/00

   A61P39/06

   A61P17/00

   A61Q19/00

   A61Q19/02

   A61Q19/08

   A61Q19/10

   A61K8/64

   A61K8/65

   !A23L33/18

   !A23L33/185

【請求項の数】3

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2015-48540(P2015-48540)

(22)【出願日】2015年3月11日

(65)【公開番号】特開2016-169169(P2016-169169A)

(43)【公開日】2016年9月23日

【審査請求日】2017年12月4日

(73)【特許権者】

【識別番号】390010674

【氏名又は名称】理研ビタミン株式会社

(72)【発明者】

【氏名】吉永 恵子

(72)【発明者】

【氏名】村上 桂

【審査官】 岩下 直人

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１４−１０８９４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１６−１６９１６８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／１７

Ａ６１Ｋ ８／６４

Ａ６１Ｋ ８／６５

Ａ６１Ｋ ３５／６０

Ａ６１Ｋ ３６／０２

Ａ６１Ｐ １／０４

Ａ６１Ｐ １１／００

Ａ６１Ｐ １７／００

Ａ６１Ｐ １７／０２

Ａ６１Ｐ ２５／２８

Ａ６１Ｐ ２９／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３９／０６

Ａ６１Ｑ １９／００

Ａ６１Ｑ １９／０２

Ａ６１Ｑ １９／０８

Ａ６１Ｑ １９／１０

Ａ２３Ｌ ３３／１８

Ａ２３Ｌ ３３／１８５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ワカメ由来のペプチド又は魚類由来のコラーゲンペプチドを有効成分とする熱ショックタンパク質発現誘導剤であって、該熱ショックタンパク質がＨＳＰ７０である熱ショックタンパク質発現誘導剤。

【請求項2】

前記魚類由来のコラーゲンペプチドが魚類の皮由来のコラーゲンペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。

【請求項3】

前記魚類の皮由来のコラーゲンペプチドがスケトウダラ皮由来のコラーゲンペプチドであることを特徴とする請求項２に記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、熱ショックタンパク質発現誘導剤に関する。

【背景技術】

【0002】

生体の防御システムの一つとして、例えば一般的な生理的温度を３℃以上超える高温や種々の化学薬品、重金属、放射線、紫外線、飢餓、酸素欠乏等様々なストレスを受けた際に、該ストレスから細胞を保護するため熱ショックタンパク質（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、「ＨＳＰ」ともいう）と呼ばれる特異的タンパク質の発現（産生）が誘導されることが知られている。ＨＳＰにはいくつかの種類があり、その分子量に応じて、例えばＨＳＰ９０ファミリー（分子量９０ｋＤａ以上１１０ｋＤａ以下）、ＨＳＰ７０ファミリー（分子量７０ｋＤａ以上８０ｋＤａ未満）、ＨＳＰ６０ファミリー（分子量６０ｋＤａ以上７０ｋＤａ未満）及び低分子量ＨＳＰファミリー（分子量６０ｋＤａ未満）のように分類されている。

【0003】

ＨＳＰは、上記のような種々のストレスにより細胞内のタンパク質が変性した場合に、該タンパク質が再度正常な立体構造を形成（フォールディング）し、生理機能を回復することを助ける役割を果たす。また非ストレス下においても生体内に一定量存在し、フォールディングに問題のあるタンパク質を補助する等、生体防御や生体の恒常性維持に寄与している。従って、このような機能を有するＨＳＰの発現を意図的に誘導すれば、種々のストレスからの細胞の保護や、機能低下又は機能不全を来した細胞の生理機能回復促進、タンパク質のフォールディング異常に起因する各種疾患や症状の予防又は治療等の効果が期待される。具体的には、ＨＳＰの発現を誘導することにより、例えば癌、胃潰瘍、脳梗塞やアルツハイマー病等の脳疾患、潰瘍性大腸炎、肺線維症等の予防又は治療、創傷治癒促進、抗炎症、抗酸化、メラニン産生抑制、抗シワ等に効果があることが知られている。

【0004】

ＨＳＰの発現を誘導する方法としては、例えば温熱療法等、生体に対して故意にストレスを与えることが行われている。しかし、この方法では与えるストレスが強すぎると生体に過度の負担がかかるというリスクがある。そこで、このような外的ストレスによらずに生体内においてＨＳＰの発現を誘導する方法が提案されている。

【0005】

特に近年、例えば、生薬の性質である四気のうち、温または平に該当する性質を持つ生薬の起源となる植物抽出物を含有する熱ショックタンパク質誘導剤（特許文献１）、アルニカを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤（特許文献２）、ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ならびに、ウルソール酸からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする、熱ショックタンパク質発現誘導剤（特許文献３）、亜鉛化合物を１０ｍＭ以上含有する培地で培養した酵母の菌体抽出物を有効成分とするヒートショックプロテイン７０産生誘導剤（特許文献４）、ケール又はその加工品を有効成分とする熱ショックタンパク質発現促進剤（特許文献５）等、安全性の高い天然物由来の成分を利用する方法が注目されている。このような流れの中で、ＨＳＰの発現を誘導し得る新規な天然物由来の成分が求められていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００８−１２７２９６号公報

【特許文献2】特開２０１１−１９０２００号公報

【特許文献3】ＷＯ２０１２／０４３８０８号公報

【特許文献4】特開２０１４−１０８９４５号公報

【特許文献5】特開２０１４−０８８３７８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、熱ショックタンパク質の発現を誘導し得る新規な天然物由来の成分を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、機能性素材として健康食品やサプリメント、化粧料等に広く用いられている海産物由来のペプチドがＨＳＰの発現を誘導することを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。

【0009】

即ち、本発明は、次の（１）〜（４）からなっている。
（１）海産物由来のペプチドを有効成分とする熱ショックタンパク質発現誘導剤。
（２）前記海産物由来のペプチドが海藻類由来のペプチド又は魚類由来のペプチドであることを特徴とする前記（１）に記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
（３）前記海藻類由来のペプチドがワカメ由来のペプチドであることを特徴とする前記（２）に記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
（４）前記魚類由来のペプチドがコラーゲンペプチドであることを特徴とする前記（２）に記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。

【発明の効果】

【0010】

本発明の熱ショックタンパク質発現誘導剤は、生体におけるＨＳＰ、特にＨＳＰ７０の発現を誘導する。
本発明の熱ショックタンパク質発現誘導剤は、ＨＳＰの作用が関係する各種疾患等の予防又は治療剤等として利用できる。
本発明の熱ショックタンパク質発現誘導剤は、天然物である海産物に由来するペプチドを有効成分とするため、経口的にも非経口的にも安全に生体に対して投与することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】各試験区におけるＨＳＰ７０含有量の測定結果を示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明で言うところの海産物とは、海又は汽水域に生息する魚介類、海藻類及び海洋性哺乳類であれば特に限定されず、例えば魚介類としてはホタテ、シジミ、カキ等の貝類、イカ、タコ等の頭足類、タラ、スケトウダラ、タイ、イトヨリダイ、ニシン、カツオ、マグロ、サケ、フグ、サンマ、スズキ、イワシ、ナマズ、ウナギ等の魚類、エビ、カニ、オキアミ、シャコ等の甲殻類、ウニ、ナマコ等の棘皮動物、海藻類としては昆布、ワカメ、ヒジキ、ヒバマタ、カジメ、ノリ、マツモ等の褐藻類、ヒトエグサ、アオサ等の緑藻類、スサビノリ、ツノマタ等の紅藻類、スピルリナ、ヘマトコッカス等の微細藻類、海洋性哺乳類としてはクジラ、アザラシ等が挙げられる。

【0013】

本発明の熱ショックタンパク質発現誘導剤（以下、「ＨＳＰ発現誘導剤」ともいう）の有効成分である海産物由来のペプチドは、上記海産物を起源とするタンパク質を加水分解して得られるペプチドである。該タンパク質は海産物の肉、皮、鱗、骨、外骨格、殻、葉、茎等いずれの部位から得られたものであっても良く、またゼラチンやコラーゲンの構造をとるタンパク質を使用しても良いが、とりわけ海藻類又は魚類を起源とするタンパク質が好ましく、ワカメの葉、茎又はメカブに含まれるタンパク質又は魚類の魚類の皮、鱗、骨等に含まれるコラーゲン様のタンパク質がより好ましい。なお、コラーゲン様のタンパク質を加水分解して得られるペプチドは、一般にコラーゲンペプチドと呼ばれる。

【0014】

海産物を起源とするタンパク質を加水分解する方法に特に制限はなく、例えば慣用の装置を用いて、常法により実施することができる。タンパク質を加水分解する方法としては、酸又はアルカリによる分解、プロテアーゼによる酵素分解等が挙げられる。酸又はアルカリとしては、有機、無機いずれの酸、アルカリを用いてもよく、プロテアーゼとしては、例えばプロテアーゼＳ「アマノ」（天野製薬社製）、ブロメラインＦ（天野製薬社製）、サモアーゼ（大和化成社製）、スミチームＡＰ（新日本化学社製）、スミチームＭＰ（新日本化学社製）、スミチームＦＰ（新日本化学社製）、ペプシン、パンクレアチン、パパイン、その他一般的に用いられるプロテアーゼ活性を有する酵素を用いることができる。例えば、プロテアーゼによる酵素分解を利用した、ワカメ由来のペプチド（以下、「ワカメペプチド」ともいう）及び魚類由来のコラーゲンペプチド（以下、単に「コラーゲンペプチド」ともいう）の製造方法の好ましい概略は以下の通りである。

【0015】

＜ワカメペプチドの製造方法＞
ワカメを水に分散し、これをアルギン酸リアーゼで処理する。この処理により、ワカメに含まれるアルギン酸を予め分解し、その後の製造工程における処理液の粘度上昇を防ぐことができる。次に、アルギン酸リアーゼの被処理物を遠心分離し、タンパク質を含有する沈殿物を得、該沈殿物を水に分散し、プロテアーゼで処理する。プロテアーゼ処理の温度及びｐＨは常識的に許容される範囲内の条件であれば良いが、そのプロテアーゼの至適温度、至適ｐＨで行うことが反応時間の短縮や酵素の安定性上望ましい。プロテアーゼ処理後、酵素を失活させて得た酵素処理液から遠心分離、濾過等の方法で未分解のタンパク質を除去し、ワカメペプチド溶液を得る。得られたワカメペプチド溶液は、所望によりさらにエバポレーターによる濃縮、電気透析膜、イオン交換樹脂等による脱塩、濃縮、クロマトグラフィーによる単離精製等の処理を行っても良く、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥等により粉末化しても良い。

【0016】

＜コラーゲンペプチドの製造方法＞
コラーゲンを含有する魚皮、魚鱗等を熱水中で加熱してコラーゲンを溶出させ、これを遠心分離した上澄液をコラーゲン抽出液として得る。該抽出液を使用する酵素の至適温度まで加温し、ｐＨを使用する酵素の至適値に調整し、酵素を加えてインキュベートする。酵素分解の温度及びｐＨは、その酵素の至適温度、至適ｐＨで行うことが反応時間の短縮や酵素の安定性上望ましいが、それに限定されるものではなく、常識的に許容される範囲内の条件であれば良い。所定時間経過後、酵素を失活させて得た酵素処理液に活性炭を添加して脱臭、脱色処理し、これを濾過してコラーゲンペプチド溶液を得る。得られたコラーゲンペプチド溶液は、所望によりさらにエバポレーターによる濃縮、電気透析膜、イオン交換樹脂等による脱塩、濃縮、クロマトグラフィーによる単離精製等の処理を行っても良く、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥等により粉末化しても良い。

【0017】

また、海産物由来のペプチドは市販のものを用いても良く、例えばコラーゲンペプチドとしては、ペプタンＦ２０００ＨＤ(ルスロ社製)、フィッシュコラーゲンＰＦＡ（ルスロ社製）、イクオスＨＤＬシリーズ（新田ゼラチン社製）、フィッシュコラーゲンリッチＲＣＰ−０１Ｐ（ラビジェ社製）、サーモンコラーゲンペプチド（マルハニチロ社製）等が商業的に製造及び販売されており、本発明のＨＳＰ発現誘導剤にはこれらを用いることができる。

【0018】

海産物由来のペプチドの分子量に特に制限はないが、通常、重量平均分子量１０００００以下であり、例えばワカメペプチドとしては、重量平均分子量３００〜１００００の範囲、コラーゲンペプチドとしては、重量平均分子量３００〜５００００の範囲のものが用いられる。なお、上記重量平均分子量は、「パギイ法第１０版」（写真用ゼラチン試験法合同審議会、２００６年版）の「２０−１．分子量分布」及び「２０−２．平均分子量」に記載の方法に従って測定される。

【0019】

本発明のＨＳＰ発現誘導剤は、海産物由来のペプチドのみをそのまま用いても良く、或いは海産物由来のペプチド以外に本発明の効果を阻害しない範囲で他の任意の成分（医薬品添加物、食品添加物及び食品素材等）を配合し、少なくとも海産物由来のペプチドを含有する組成物として調製しても良い。

【0020】

上記組成物の調製に用いられる海産物由来のペプチド以外の任意の成分としては、例えば賦形剤（乳糖、デキストリン、コーンスターチ、結晶セルロース等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル等）、崩壊剤（カルボキシメチルセルロースカルシウム、無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等）、結合剤（デンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、アラビアガム液等）、溶解補助剤（アラビアガム、ポリソルベート８０等）、甘味料（砂糖、果糖ブドウ糖液糖、ハチミツ、アスパルテーム等）、着色料（β−カロテン、食用タール色素、リボフラビン等）、保存料（ソルビン酸、パラオキシ安息香酸メチル、亜硫酸ナトリウム等）、増粘剤（アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム等）、酸化防止剤（ＢＨＴ、ＢＨＡ、アスコルビン酸、トコフェロール等）、香料（ハッカ、ストロベリー香料等）、酸味料（クエン酸、乳酸、ＤＬ−リンゴ酸等）、調味料（ＤＬ−アラニン、５´−イノシン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム等）、ｐＨ調整剤（クエン酸、クエン酸三ナトリウム等）、乳化剤又は界面活性剤（グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、アルキル硫酸エステル塩、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム等）、油剤（高級アルコール、エステル油、流動パラフィン、ワセリン、スクワラン、ロウ、天然油脂、シリコーン油等）、低級アルコール類（エタノール、イソプロピルアルコール等）、多価アルコール類（プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、マルチトール等）、紫外線吸収剤（パラアミノ安息香酸エチル、サリチル酸オクチル、パラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシル、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン等）、無機粉末（タルク、カオリン、窒化ホウ素等）、有機粉末（セルロースパウダー、架橋型シリコーン末、ポリ四フッ化エチレン粉末等）、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸類等が挙げられる。

【0021】

本発明のＨＳＰ発現誘導剤を医薬品として調製する場合、その剤形に特に制限はなく、投与経路に応じて任意の剤形に調製することができる。経口投与に適した剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤等が挙げられ、非経口投与に適した剤形としては、例えば注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、パップ剤等が挙げられる。なお、注射剤は、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、点滴等のいずれに用いるものであっても良い。

【0022】

上記医薬品１００質量％中の海産物由来のペプチドの含有量はペプチドの種類や医薬品の剤形、投与経路等により異なるが、例えばワカメペプチドの場合、通常０．０００１〜５０質量％、好ましくは０．００１〜２０質量％、より好ましくは０．０１〜１０質量％の範囲内に設定することができる。。

【0023】

また、本発明のＨＳＰ発現誘導剤は飲食品、化粧料等に添加して使用することができる。

【0024】

本発明のＨＳＰ発現誘導剤を飲食品に添加して使用する場合、添加対象となる飲食品の形態に特に制限はないが、例えば清涼飲料、ドロップ、キャンディ、チューインガム、チョコレート、グミ、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン、ゼリー菓子、クッキー、錠菓等が挙げられる。

【0025】

上記飲食品に対する海産物由来のペプチドの添加量はペプチドの種類や飲食品の形態等により異なるが、例えばワカメペプチドの場合、飲食品１００質量％中、通常０．００１〜９５質量％、好ましくは０．５〜５０質量％の範囲内に設定することができる。

【0026】

本発明のＨＳＰ発現誘導剤を化粧料に添加して使用する場合、添加対象となる化粧料の形態に特に制限はないが、例えば化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム等の下地化粧料、乳液状、油性、固形状等の各剤型のファンデーション、アイカラー、チークカラー等のメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ネッククリーム、ボディローション等の身体用化粧料等が挙げられる。

【0027】

上記化粧料に対する海産物由来のペプチドの添加量はペプチドの種類や化粧料の形態等により異なるが、例えばワカメペプチドの場合、化粧料１００質量％中、通常０．０００１〜９９質量％、好ましくは０．００１〜５０質量％の範囲内に設定することができる。

【0028】

本発明のＨＳＰ発現誘導剤は、上記の通り医薬品として又は飲食品、化粧料等に添加して経口的若しくは非経口的に生体に投与することにより、生体内におけるＨＳＰの発現を誘導することができる。なお、本発明のＨＳＰ発現誘導剤の有効成分である海産物由来のペプチドは天然物を起源とし、健康食品等にも広く用いられている安全性の高い成分であることから、経口的に投与することが好ましい。

【0029】

本発明のＨＳＰ発現誘導剤が発現を誘導するＨＳＰに特に制限はないが、例えばＨＳＰ９０ファミリーに属するもの（分子量９０ｋＤａ以上１１０ｋＤａ以下；ＨＳＰ９０α、ＨＳＰ９０β、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ１１０等）、ＨＳＰ７０ファミリーに属するもの（分子量７０ｋＤａ以上８０ｋＤａ未満；ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７２、ＨＳＰ７３等）、ＨＳＰ６０ファミリーに属するもの（分子量６０ｋＤａ以上７０ｋＤａ未満；ＨＳＰ６０、ＨＳＰ６５等）及び低分子量ＨＳＰファミリーに属するもの（分子量６０ｋＤａ未満；ＨＳＰ４７、ＨＳＰ４０、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ２０等）が挙げられる。これらの中でも、ＨＳＰ７０ファミリーに属するもの、とりわけ分子量７０ｋＤａであるＨＳＰ７０に対して、本発明のＨＳＰ発現誘導剤は優れた発現誘導効果を発揮する。

【0030】

本発明のＨＳＰ発現誘導剤は、上記ＨＳＰの発現を誘導することによって、高温や種々の化学薬品、重金属、放射線、紫外線、飢餓、酸素欠乏等様々なストレスからの細胞の保護や、機能低下又は機能不全を来した細胞の生理機能回復促進、タンパク質のフォールディング異常に起因する疾患や症状の予防又は治療等に寄与する。具体的には、例えば癌、胃潰瘍、脳梗塞やアルツハイマー病等の脳疾患、潰瘍性大腸炎、肺線維症等の予防又は治療剤、創傷治癒促進剤、抗炎症剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤、抗シワ剤等として使用できる。

【0031】

本発明のＨＳＰ発現誘導剤の生体に対する投与量は、該ＨＳＰ発現誘導剤の配合組成や投与の目的、投与経路等により異なるが、例えばワカメペプチドを経口投与する場合、成人１日当たり１０〜６０００ｍｇの範囲である。

【0032】

以下に本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【実施例】

【0033】

［ワカメペプチドの製造］
フレーク状乾燥わかめ１００ｇを水３ｋｇに分散させ、これにアルギン酸リア−ゼ（ナガセ生化学工業社製）４ｍｇを添加して４５℃、ｐＨ７．０で８時間処理した。処理物を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物を得た。該沈殿物を水１．５ｋｇに懸濁分散させ、これにプロテアーゼ（商品名：プロテアーゼＳ「アマノ」；天野エンザイム社製）３０ｍｇを添加して７０℃、ｐＨ８．０で１６時間酵素処理を行った。該酵素処理液を室温まで放冷後、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄液を得た。該上澄液を濾過装置（型式：ＰＳ−２４００１；旭化成社製）を用いて分画分子量１万の設定で限外濾過し、濾過液をロータリーエバポレーターにて濃縮後、真空乾燥して粉末状のワカメペプチド（試作品１）１０ｇを得た。

【0034】

［コラーゲンペプチドの製造］
スケトウダラ皮１００ｇに水２００ｇを加え、８０〜８５℃で１時間加熱後、５０００×ｇで６分間遠心分離し、上澄液を得た。該上澄液にプロテアーゼ（商品名：ブロメラインF；天野エンザイム社製）０．１ｇを添加し、６５℃で１時間酵素処理を行った後、活性炭を添加して６０℃で３０分間処理した。該処理液を濾過助剤（珪藻土）を用いて引圧濾過し、濾過液をロータリーエバポレーターにて濃縮後、凍結乾燥して粉末状のコラーゲンペプチド（試作品２）２０ｇを得た。

【0035】

［ＨＳＰ７０の発現誘導試験］
（１）細胞の培養
ヒト子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ細胞；ＲＣＢ０００７；理化学研究所バイオリソースセンター）を５×１０^５個／０．５ｍＬの細胞濃度で２４ウェルプレートに播種し、１０容量％ＦＢＳ及び１容量％ペニシリン−ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ培地（ナカライテスク社製）中で３７℃、５％ＣＯ_２の条件で一晩培養した。その後、各種被験物質を規定の濃度で含有する新鮮な培地に交換し、同条件でさらに２４時間培養した（試験区１〜５）。これらの試験区のうち、試験区１〜４は海産物由来のペプチドを用いた本発明に係る実施例であり、試験区５は海産物由来でないペプチド（納豆菌由来のポリ−γ−グルタミン酸）を用いた比較例である。また、対照としていずれの被験物質も含有しない培地に交換して同様に処理した試験区（試験区６；陰性対照）と、被験物質を含有しない培地に交換し、培地交換後１７時間が経過した時点から１時間、４２℃の熱ストレスを与えた試験区（試験区７；陽性対照）を設けた。各試験区において使用した被験物質の種類及び添加濃度を表１に示す。

【0036】

【表1】

【0037】

（２）ＨＳＰ７０の発現誘導性の評価
上記試験区１〜５の細胞培養後、上清の培地を取り除き、トリプシンで細胞をウェルからはがし、氷冷ＰＢＳ（日水製薬社製）を添加、洗浄した後、細胞を回収した。回収した細胞にＨＳＰ７０ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｓｔｒｅｓｓ Ｘｐｒｅｓｓ社製）に付属したプロテアーゼ阻害剤含有Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、ボルテックスミキサーを用いて細胞を破壊した後、１２０００×ｇで１０分間遠心分離して上清をタンパク質抽出液として回収した。
得られた各タンパク質抽出液について、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用い、キット所定の手法に従ってタンパク質濃度を測定し、該タンパク質抽出液中の総タンパク質量を求めた。一方、ＨＳＰ７０ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用い、キット所定の手法に従って各タンパク質抽出液中のＨＳＰ７０含有量を測定し、各試験区の培養細胞中におけるタンパク質１μｇ当たりのＨＳＰ７０含有量を算出した。結果をグラフ化して図１に示す。

【0038】

図１の結果から明らかなように、陽性対照である試験区７の培養細胞は陰性対照である試験区６の培養細胞に比べてＨＳＰ含有量が多くなっていたが、同様に海産物由来のペプチドを添加した試験区１〜４の培養細胞においても試験区６と比べてＨＳＰ７０含有量の増加が認められた。一方、海産物由来でないペプチドを添加した試験区５の培養細胞については、試験区６と比べてＨＳＰ７０含有量に有意差は認められなかった。このことから、海産物由来のペプチドが細胞内のＨＳＰの発現を誘導することがわかった。

【図1】