特許 6502259 部位特異的酵素および使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6502259

(24)【登録日】2019年3月29日

(45)【発行日】2019年4月17日

(54)【発明の名称】部位特異的酵素および使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20190408BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20190408BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20190408BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20190408BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20190408BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20190408BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20190408BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20190408BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00ZNA

   C12N15/62 Z

   C12N15/52 Z

   C12N15/09 100

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

【請求項の数】17

【全頁数】83

(21)【出願番号】特願2015-543101(P2015-543101)

(86)(22)【出願日】2013年11月18日

(65)【公表番号】特表2015-535010(P2015-535010A)

(43)【公表日】2015年12月7日

(86)【国際出願番号】US2013070636

(87)【国際公開番号】WO2014078819

(87)【国際公開日】20140522

【審査請求日】2016年11月15日

(31)【優先権主張番号】61/727,652

(32)【優先日】2012年11月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/802,066

(32)【優先日】2013年3月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】315015586

【氏名又は名称】トランスポサジェン バイオファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】オスタータグ， エリック エム．

(72)【発明者】

【氏名】イーシー， ツェッテン

【審査官】 川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／０２７０２７３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１４６１２１（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ＤＮＡ標的配列に結合するドメインであって、前記ドメインが、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＸ_１Ｘ_２ＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１）の配列を有する少なくとも１つのアミノ酸配列であって、Ｘ_１Ｘ_２が反復可変性二残基（ＲＶＤ）を含み、前記ＲＶＤが、ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、ＮＨ、ＮＴ、ＮＫ、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、ＨＨ、ＲＮ、ＲＳ、ＮＧまたはＧＳからなる、少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、ドメインと
（ｂ）エフェクタードメインと
を含む融合タンパク質であって、
前記エフェクタードメインが、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、転写活性化因子、転写抑制因子、メチルトランスフェラーゼ、またはデアセチラーゼを含む、融合タンパク質。

【請求項2】

ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＸ_１Ｘ_２ＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１）の配列を有する第２のアミノ酸配列であって、Ｘ_１Ｘ_２が反復可変性二残基（ＲＶＤ）を含み、前記ＲＶＤが、ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、ＮＨ、ＮＴ、ＮＫ、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、ＨＨ、ＲＮ、ＲＳ、ＮＧまたはＧＳからなる、第２のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記（ａ）の少なくとも１つのアミノ酸配列または前記第２のアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記エフェクタードメインがヌクレアーゼを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記エンドヌクレアーゼがＦｏｋ Ｉエンドヌクレアーゼを含む、請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

前記エンドヌクレアーゼがＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼを含む、請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

前記エフェクタードメインが亜鉛フィンガーヌクレアーゼを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。

【請求項10】

請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター。

【請求項11】

プラスミドまたはＲＮＡ分子である、請求項１０に記載のベクター。

【請求項12】

レトロウイルスである、請求項１０または１１に記載のベクター。

【請求項13】

前記レトロウイルスが、長い末端反復、ｐｓｉパッケージングシグナル、クローニング部位、および選択可能マーカーをコードする配列を含む、請求項１２に記載のベクター。

【請求項14】

請求項９に記載の核酸を含む細胞。

【請求項15】

請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。

【請求項16】

キットであって、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む、キット。

【請求項17】

請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一部において、ラルストニアタンパク質、それをコードする核酸、それを含む組成物、それを含むキット、ならびにそれの使用方法を対象とする。

【背景技術】

【0002】

プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを有する転写因子は、内因性系における外因性の生物学的回路の作製、および所定のＤＮＡ配列または個々の核酸に結合するデザイナータンパク質の作製に向けたアプローチの可能性の１つを提案する。転写活性化因子様（ＴＡＬ）タンパク質は、近年、モジュラーおよび予想可能なＤＮＡ結合ドメインを有し、それにより目的とするＤＮＡ配列に結合する合成転写因子の新規作製を可能にし、望ましい場合、タンパク質またはポリペプチド上に存在する第２のドメインに、ＤＮＡに関連する活性を実行させることを示している。ＴＡＬタンパク質は、生物キサントモナスに由来している。しかしながら、キサントモナスに由来するＴＡＬタンパク質に類似した様式で機能するラルストニアタンパク質またはポリペプチドが本明細書に提供される。本発明は、ラルストニアアミノ酸配列に由来するポリペプチドまたはそれに関連するアミノ酸配列、それをコードする核酸、それを含む組成物、それを含むキット、それを含む非ヒトトランスジェニック動物、およびその使用方法に関する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本発明は、一部において、ラルストニアエフェクターの反復可変性二残基（ＲＶＤ）が、ある程度の縮重を伴い、明白な文脈依存性のない、直接の直鎖状様式でそれらの標的部位におけるヌクレオチドに対応する（１つのＲＶＤに１つのヌクレオチド）という事実に基づく。この発見は、新たな標的特異的ラルストニアエフェクターの標的部位の予測を可能にするタンパク質−ＤＮＡ認識のメカニズムを表す。本明細書に記載されるように、これらのタンパク質は、ヌクレアーゼ活性等の核酸に関連する補助活性を有するより大きな標的キメラタンパク質の一部として、研究およびバイオテクノロジーにおいて有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはプロヌクレアーゼ（ｐｒｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）は、ゲノム工学において相同組換えを容易にすることができる（例えば、植物または細菌のバイオ燃料もしくは生物由来の再生可能資源（ｂｉｏｒｅｎｅｗａｂｌｅｓ）、または動物ゲノムに有用な形質を追加もしくは強化するため）。これらのタンパク質は、例えば、転写因子として、特に、非限定的な例として病原体（例えばウイルス）に対する治療薬等の非常に高レベルの特異性を必要とする治療用途に有用でもあり得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも第１のドメインと、第２のドメインとを含み、第１のドメインは、核酸認識要素のための少なくとも１つのコード配列を含み、第２のドメインは、核酸エフェクター要素のための少なくとも１つのコード配列を含む。

【0004】

本発明は、配列番号１：ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＸ_１Ｘ_２ＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するタンパク質を提供し、
式中、Ｘ_１が、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸であり、
Ｘ_２が、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸である。

【0005】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１：ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＸ_１Ｘ_２ＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、
式中、任意の組み合わせで、Ｘ_１およびＸ_２は、独立して、可変であり、Ｘ_１＝Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、またはＧであり、Ｘ_２＝Ｉ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｄ、Ｓ、またはＰである。

【0006】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１：ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＸ_１Ｘ_２ＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、
式中、Ｘ_１＝Ｓであり、Ｘ_２＝Ｉである。

【0007】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１：ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＸ_１Ｘ_２ＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、
式中、Ｘ_１＝Ｓであり、Ｘ_２＝Ｎである。

【0008】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＳＩＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号２）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0009】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＳＮＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号３）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0010】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＳＨＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号４）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0011】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＮＰＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号５）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0012】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＮＨＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号６）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0013】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＮＴＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号７）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0014】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＮＫＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号８）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0015】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＮＰＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号９）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0016】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１０）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0017】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＮＤＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１１）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0018】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１２）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0019】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＨＮＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１３）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0020】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＨＹＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１４）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0021】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１５）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0022】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＨＨＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１６）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0023】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＲＮＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１７）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0024】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＲＳＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１８）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0025】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＧＳＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１９）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0026】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも第１のドメインと、第２のドメインとを含み、第１のドメインは、少なくとも１つの核酸認識要素を含み、第２のドメインは、少なくとも１つの核酸エフェクター要素を含む。

【0027】

本発明は、本明細書に記載される任意のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列に関する。

【0028】

本発明は、本明細書に記載される任意のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列のうちのいずれか１つ、または複数の核酸配列を含む組成物に関する。本発明は、本明細書に記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つ、または複数のアミノ酸配列を含む組成物に関する。

【0029】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１から本質的になる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１からなる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１を含み、Ｘ_１Ｘ_２は、単一の核酸に結合する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１を含み、Ｘ_１Ｘ_２は、少なくとも１つの核酸に結合する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１から本質的になり、Ｘ_１Ｘ_２は、核酸に結合する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１からなり、Ｘ_１Ｘ_２は、核酸に結合する。

【0030】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０から選択されるポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列の任意の組み合わせのうちの１つ以上を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０から選択されるポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列の任意の組み合わせのうちの１つ以上を含み、ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つの１２番目および１３番目のアミノ酸は、少なくとも１つの核酸に結合する。

【0032】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９から選択されるポリペプチドと８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列の任意の組み合わせのうちの１つ、または複数の任意の組み合わせを含む。

【0033】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、第１のドメインと、第２のドメインとを含み、第１のドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９から選択されるポリペプチドと８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列の任意の組み合わせのうちの１つ、または複数の任意の組み合わせを含む核酸認識ドメインである。

【0034】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、第１のドメインと、第２のドメインとを含み、第１のドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９から選択されるポリペプチドと８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列の任意の組み合わせのうちの１つ、または複数の任意の組み合わせを含む核酸認識ドメインであり、少なくとも１つのポリペプチド配列の１２番目および１３番目のアミノ酸は、核酸に結合する。

【0035】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９１％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９２％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９３％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９４％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0036】

いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９から選択されるポリペプチドのいずれかにおけるアミノ酸置換のうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９から選択されるポリペプチドのいずれかにおけるアミノ酸置換のうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９から選択されるポリペプチドのいずれかにおけるアミノ酸置換のうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９から選択されるポリペプチドのいずれかにおけるアミノ酸置換のうちの２つ以上を含む。

【0037】

いくつかの実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチドから選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つのポリペプチド配列を含む。

【0038】

本発明は、上述のタンパク質のいずれかをコードする核酸も提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチドから選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ以上のポリペプチドをコードする核酸配列を含む。

【0039】

本発明は、上述のタンパク質のいずれかをコードする、上述の核酸配列のいずれかを含むベクターも提供する。いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターはレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、長い末端反復、ｐｓｉパッケージングシグナル、クローニング部位、および選択可能マーカーをコードする配列を含む。

【0040】

本発明は、本明細書に記載される核酸またはベクターのいずれかを含む細胞も提供する。いくつかの実施形態では、細胞は精子または卵子である。

【0041】

本発明は、本明細書に記載されるタンパク質のいずれかをコードする核酸を含むベクターを含むキットも提供する。

【0042】

本発明は、本明細書に記載されるタンパク質のいずれかをコードする核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物も提供する。

【0043】

本発明は、多細胞性または単細胞性生物の細胞または少なくとも１つの細胞の遺伝物質を修飾する方法も提供し、本方法は、本明細書に記載される核酸の任意の１つ以上、または本明細書に記載される任意のポリペプチドを、多細胞性または単細胞性生物の細胞または少なくとも１つの細胞に直接投与することを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、タンパク質をコードする核酸として投与される。いくつかの実施形態では、タンパク質をコードする核酸は、エフェクターをコードする第２の核酸配列と共に投与される。いくつかの実施形態では、多細胞性または単細胞性生物は、脊椎動物である。いくつかの実施形態では、脊椎動物は哺乳類である。いくつかの実施形態では、脊椎動物は、非ヒト哺乳類である。いくつかの実施形態では、投与は、全身投与される。

【0044】

本発明は、本明細書に記載されるタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、非ヒトトランスジェニック動物の細胞内に導入することを含む、生殖系列変異を含む非ヒトトランスジェニック動物を作製する方法も提供する。

【0045】

本発明は、トランスジェニック動物を作製するのに十分な条件下で、本明細書に記載されるタンパク質のいずれかをコードする核酸分子を細胞内に導入することを含む、非ヒトトランスジェニック動物の生殖系を変異誘発する方法も提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質またはポリペプチド。
（項目２）
前記ポリペプチドが、配列番号１：ＬＳＴＥＱＶＶＡＩＡＳＸ_１Ｘ_２ＧＧＫＱＡＬＥＡＶＫＡＱＬＬＶＬＲＡＡＰＹＥ（配列番号１）と少なくとも少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をさらに含み、
式中、Ｘ_１が、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸であり、
Ｘ_２が、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
少なくとも７５％（または８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）の配列同一性の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９のうちの少なくとも１つ、またはこれらのうちのいずれかの組み合わせをさらに含む、項目１または２に記載のポリペプチド。
（項目４）
前記タンパク質が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９のうちの少なくとも１つ、もしくはこれらのうちのいずれかの組み合わせ、または表１に列記される配列のいずれも含まない、項目１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
（項目５）
配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ本明細書に記載される少なくとも１つのＲＶＤを含む、項目１〜４のいずれかに記載のタンパク質。
（項目６）
配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ本明細書に記載される少なくとも１つのＲＶＤを含む、項目１〜５のいずれかに記載のタンパク質。
（項目７）
配列番号１と少なくとも９９％の配列同一性を有し、かつ本明細書に記載される少なくとも１つのＲＶＤを含む、項目１〜６のいずれかに記載のタンパク質。
（項目８）
配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ表１に記載される少なくとも１つのアミノ酸配列をさらに含む、項目１〜７のいずれかに記載のタンパク質。
（項目９）
配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ表１に記載される少なくとも１つのアミノ酸配列をさらに含む、項目１〜８のいずれかに記載のタンパク質。
（項目１０）
配列番号１と少なくとも９９％の配列同一性を有し、かつ表１に記載される少なくとも１つのアミノ酸配列をさらに含む、項目１〜９のいずれかに記載のタンパク質。
（項目１１）
前記タンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、もしくは表１に列記される任意の配列、またはこれらの任意のバリアントもしくは類似体を含む、項目１〜１０のいずれかに記載のタンパク質。
（項目１２）
前記タンパク質が、核酸エフェクタードメインを含み、前記核酸エフェクタードメインが、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、転写活性化因子、転写抑制因子、メチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、またはこれらの任意の機能断片を含む、項目２〜１１のいずれかに記載のタンパク質。
（項目１３）
項目１〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。
（項目１４）
項目１〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸を含むベクター。
（項目１５）
プラスミドまたはＲＮＡ分子である、項目１４に記載のベクター。
（項目１６）
レトロウイルスである、項目１４または１５のいずれかに記載のベクター。
（項目１７）
前記レトロウイルスが、長い末端反復、ｐｓｉパッケージングシグナル、クローニング部位、および選択可能マーカーをコードする配列を含む、項目１６に記載のレトロウイルス。
（項目１８）
項目１３〜１７のいずれか一項に記載の核酸を含む細胞。
（項目１９）
項目１４〜１７のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
（項目２０）
キットであって、
項目１〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む、キット。
（項目２１）
項目１〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸分子を含む細胞。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】細菌株からのメチルトランスフェラーゼ配列に対するＢＬＡＳＴを介して整列されたキサントモナス（Ｘａｎｔｈａｍｏｎａｓ）からのＤＮＡ結合タンパク質のコンセンサス配列を示す。配列整列に基づき、配列のＤＮＡ結合機能が予測される。

【図2】ＲＴＮ機能性を示すゲルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0047】

いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも第１のドメインと、第２のドメインとを含み、第１のドメインは、核酸認識要素のための少なくとも１つのコード配列を含み、第２のドメインは、核酸エフェクター要素のための少なくとも１つのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも第１のドメインを含み、第１のドメインは、ラルストニアまたはそのバリアントに由来するアミノ酸配列に由来する核酸認識要素のための少なくとも１つのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも第１のドメインを含み、第１のドメインは、ラルストニアに由来するアミノ酸配列に由来する核酸認識要素のための少なくとも１つのコード配列を含む。

【0048】

用語「ＲＴＮ」は、少なくとも第１のドメインを含む本発明のポリペプチドまたはタンパク質を指し、第１のドメインは、ラルストニアに由来するアミノ酸配列に由来する核酸認識要素のための少なくとも１つのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、用語「ＲＴＮ」は、少なくとも第１のドメインと、第２のドメインとを含む本発明のポリペプチドまたはタンパク質を指し、第１のドメインは、ラルストニアに由来するアミノ酸配列に由来する核酸認識要素のための少なくとも１つのコード配列を含み、第２のドメインは、エフェクタータンパク質であるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、用語「ＲＴＮ」は、少なくとも第１のドメインと、第２のドメインとを含む本発明のポリペプチドまたはタンパク質を指し、第１のドメインは、ラルストニアに由来するアミノ酸配列に由来する核酸認識要素のための少なくとも１つのコード配列を含み、第２のドメインは、ヌクレアーゼであるアミノ酸を含む。ＲＴＮ ＤＮＡ結合特異性は、ＤＮＡ結合ドメイン内の反復ドメインの数および順序に依存する。反復は、一般的に、約３０〜約４０個のアミノ酸から構成される。いくつかの実施形態では、反復ドメインは、約３２〜約３８個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド結合特異性は、各反復ドメインの１２および１３個のアミノ酸によって決定される。いくつかの実施形態では、反復ドメインは、約３３〜約３７個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、反復ドメインは、約３４〜約３５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、反復ドメインは、約３３〜約３６個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、反復ドメインは、約３３〜約３５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、反復ドメインは、３４〜３５個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、反復ドメインは、３３〜３５個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、反復ドメインは、３４〜３６個のアミノ酸からなる。

【0049】

本明細書で使用されるとき、「核酸」、または「オリゴヌクレオチド」、または「ポリヌクレオチド」は、少なくとも２つのヌクレオチドが一緒に共有結合されることを意味する。一本鎖の記述も、相補鎖の配列を定義する。よって、核酸は、記述される一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くのバリアントが所与の核酸として同じ目的のために使用され得る。よって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズすることができるプローブを提供する。よって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であるか、または二本鎖および一本鎖配列の両方の一部を含むことができる。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってよく、核酸は、デオキシリボ−とリボ−ヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、合成され、天然ではないアミノ酸修飾を含む。核酸は、化学合成方法により、または組換え方法により得ることができる。

【0050】

本明細書で使用されるとき、「動作可能に連結される」は、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されるプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置付けられ得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子においてそれが制御するそのプロモーターと遺伝子との間の距離とほぼ同じであってよい。当該技術分野において既知であるように、この距離の変化は、プロモーター機能を損失することなく調整することができる。

【0051】

本明細書で使用されるとき、「プロモーター」は、細胞において核酸の発現をもたらすか、活性化するか、または強化することができる合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、その発現をさらに強化し、かつ／またはその空間的発現および／もしくはその時間的発現を変更するために、１つ以上の特定の転写調節配列を含み得る。プロモーターは、遠位エンハンサーまたは抑制因子要素も含み得、これは、転写の開始部位から数千ほどの塩基対に位置し得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは臓器に関して、または発現が生じる発達段階に関して、あるいは生理学的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘発剤等の外部刺激に応答して、遺伝子成分の発現を構成的もしくは差次的に調節することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、またはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ ＩＥ プロモーターが挙げられる。

【0052】

本明細書で使用されるとき、「実質的に相補的」は、第１の配列が８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の補体に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるか、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。

【0053】

本明細書で使用されるとき、「実質的に同一」は、第１の配列が第２の配列の補体に実質的に相補的である場合、第１および第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、または核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味する。

【0054】

核酸に関して本明細書で使用されるとき、「バリアント」は、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の一部分もしくは断片、（ｉｉ）参照されるヌクレオチド配列もしくはその一部分の補体、（ｉｉｉ）参照される核酸もしくはその補体に実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、参照される核酸、その補体、もしくはそれに実質的に同一な配列とハイブリダイズする核酸を意味する。

【0055】

本明細書で使用されるとき、「バリアント」は、ペプチドまたはポリペプチドに関して、アミノ酸の挿入、欠失、または保存置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するものである。バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照されるタンパク質に実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存置換、すなわち、アミノ酸を、類似する性質（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）を有する異なるアミノ酸と置き換えることは、典型的には多少の変化を伴うものとして、当該技術分野において認識されている。多少の変化は、一部において、当該技術分野において理解される、アミノ酸の疎水性親水性指数を考慮することにより特定することができる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指数は、その疎水性および電荷の考察に基づいている。類似する疎水性親水性指数のアミノ酸を置換することができ、尚もタンパク質機能を保持することが当該技術分野において既知である。一態様では、±２の疎水性親水性指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性は、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするようにも使用され得る。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考察は、抗原性および免疫原性と良好に相関することが報告された有用な手段である、そのペプチドの最大局所部平均親水性の計算を可能にする。米国特許第４，５５４，１０１号は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。

【0056】

同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該技術分野において理解されるように、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらすことができる。置換は、互いに±２内の親水性値を有するアミノ酸で行うことができる。アミノ酸の疎水性指数および親水性値の両方は、アミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。この見解と一致して、生物学的機能と互換性があるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさ、および他の性質によって明らかにされるように、アミノ酸の相対的類似性、特に、これらのアミノ酸の側鎖に依存すると考えられている。
ベクター

【0057】

本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、複製の起源を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってよい。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってよい。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであってよく、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。

【0058】

本発明は、特許請求される発明のポリペプチドまたはタンパク質のいずれかをコードするポリペプチド、タンパク質、および核酸配列を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも７５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも７５％の配列同一性を有し、配列番号１の１２番目および１３番目のアミノ酸に核酸結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、以下から選択される少なくとも１つのＲＶＤ配列を含む：ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、ＮＨ、ＮＴ、ＮＫ、ＮＮ、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、ＨＨ、ＲＮ、ＲＳ、およびＧＳ。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、以下から選択される任意の組み合わせの少なくとも１つまたは複数のＲＶＤ配列：ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、ＮＨ、ＮＴ、ＮＫ、ＮＮ、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、ＨＨ、ＲＮ、ＲＳ、ＮＧ、およびＧＳを含み、ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、およびＮＨは、任意の核酸塩基に結合し、ＮＴ、ＮＫ、およびＮＮは、アデニンに結合し、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、およびＨＨは、アデニンおよび／またはグアニンに結合し、ＮＧは、チミンに結合し、ＲＮ、ＲＳ、およびＧＳは、グアニンに結合する。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、以下から選択される任意の組み合わせの少なくとも１つまたは複数のＲＶＤ配列：ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、ＮＨ、ＮＴ、ＮＫ、ＮＮ、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、ＨＨ、ＲＮ、ＲＳ、ＮＧ、およびＧＳを含み、ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、およびＮＨは、任意の核酸塩基に結合し、ＮＫは、グアニンに結合し、ＮＮは、アデニンまたはグアニンに結合し、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、およびＨＨは、シトシンに結合し、ＮＧは、チミンに結合し、ＲＮ、ＲＳ、およびＧＳは、グアニンに結合する。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、以下から選択される任意の組み合わせの少なくとも１つまたは複数のＲＶＤ配列：ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、ＮＨ、ＮＴ、ＮＫ、ＮＮ、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、ＨＨ、ＲＮ、ＲＳ、ＮＧ、およびＧＳを含み、ＳＩは、アデニンに結合し、ＳＮは、グアニンおよび／またはアデニンに結合し、ＳＨ、ＮＰ、およびＮＨは、任意の核酸塩基に結合し、ＮＫは、グアニンに結合し、ＮＮは、アデニンおよび／またはグアニンに結合し、ＮＤは、シトシンに結合し、ＨＮは、グアニンに結合し、ＨＹ、ＨＤ、およびＨＨは、シトシンに結合し、ＮＧは、チミンに結合し、ＲＮは、グアニンおよび／またはアデニンに結合し、ＲＳおよびＧＳは、グアニンに結合する。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、ＲＶＤ配列のうちの少なくとも１つがＮＰ、ＮＤ、またはＨＮであり、かつＮＰがシトシン、アデニン、およびグアニンに結合し、ＮＤがシトシンに結合し、ＨＮがアデニンおよび／またはグアニンに結合する、任意の組み合わせの少なくとも１つまたは複数のＲＶＤ配列を含む。

【0059】

いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも７５％の配列同一性を有し、配列番号１のアミノ酸の１２位および１３位のうちの少なくとも一方に保存アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号１のアミノ酸の１２位および１３位のうちの少なくとも一方に保存アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有し、配列番号１のアミノ酸の１２位および１３位のうちの少なくとも一方に保存アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号１のアミノ酸の１２位および１３位のうちの少なくとも一方に保存アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも９１％の配列同一性を有し、配列番号１のアミノ酸の１２位および１３位のうちの少なくとも一方に保存アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも９２％の配列同一性を有し、配列番号１のアミノ酸の１２位および１３位のうちの少なくとも一方に保存アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも９３％の配列同一性を有し、配列番号１のアミノ酸の１２位および１３位のうちの少なくとも一方に保存アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも９４％の配列同一性を有し、配列番号１のアミノ酸の１２位および１３位のうちの少なくとも一方に保存アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号１のアミノ酸の１２位および１３位のうちの少なくとも一方に保存アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも９６％の配列同一性を有し、配列番号１のアミノ酸の１２位および１３位のうちの少なくとも一方に保存アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも９７％の配列同一性を有し、配列番号１のアミノ酸の１２位および１３位のうちの少なくとも一方に保存アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有し、配列番号１のアミノ酸の１２位および１３位のうちの少なくとも一方に保存アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１のアミノ酸の１２位および１３位のうちの少なくとも一方に保存アミノ酸置換を含む。

【0060】

いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１と少なくとも７５％の配列同一性を有する。

【0061】

いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸として、ベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号２において、前述のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸として、ベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号２と少なくとも８５％の配列同一性を有し、配列番号２において、前述のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸として、ベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２において、前述のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸として、ベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号２において、前述のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸として、ベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号２と少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号２において、前述のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。

【0062】

いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸によってコードされたもの、またはベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号３において、前述のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸によってコードされたもの、またはベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有し、配列番号３において、前述のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸によってコードされたもの、またはベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号３において、前述のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸によってコードされたもの、またはベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号３において、前述のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸によってコードされたもの、またはベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号３と少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号３において、前述のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸によってコードされたもの、またはベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９のうちのいずれかと少なくとも７５％の配列同一性を有し、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９において、前述のアミノ酸置換のうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸によってコードされたもの、またはベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９と少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９において、前述のアミノ酸置換のうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸として、ベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９と少なくとも８５％の配列同一性を有し、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９のうちのいずれか１つ以上において、前述のアミノ酸置換のうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸として、ベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９のうちのいずれか１つ以上と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９のうちのいずれか１つ以上において、前述のアミノ酸置換のうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸として、ベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９と少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９のうちのいずれか１つ以上において、前述のアミノ酸置換のうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質（核酸として、ベクター内の核酸として、または精製された組換えタンパク質として）は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９のうちのいずれか１つ以上と少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９のうちのいずれか１つ以上において、前述のアミノ酸置換のうちの２つ以上を含む。

【0064】

本明細書で使用されるとき、「配列同一性」は、２つの配列（ｂｌ２ｓｅｑ）をブラスト処理するために、独立型ＢＬＡＳＴエンジンプログラムを使用することにより決定され、これは、デフォルトパラメータを使用して（Ｔａｔｕｓｏｖａ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，１９９９，１７４，２４７−２５０；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ｆｔｐサイトから検索することができる。２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用されるとき、「同一」または「同一性」は、配列が特定の領域にわたって同じである残基の特定のパーセンテージを有することを意味する。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列する、特定の領域にわたって２つの配列を比較する、合致する位置の数を得るために、同一の残基が両方の配列に生じる位置の数を決定する、特定の領域において、合致した位置の数を位置の総数で割る、および配列同一性のパーセンテージを得るために、結果を１００で乗じることにより、計算することができる。２つの配列が異なる長さであるか、または整列が１つ以上の付着末端を生成し、かつ特定の比較領域が単一の配列のみを含む場合、単一配列の残基は、計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は、等価と考えられ得る。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０等のコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって行うことができる。

【0065】

本明細書で使用されるとき、「保存」アミノ酸置換は、下の表Ａ、Ｂ、またはＣに記載されるように定義され得る。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドおよび／またはそのような融合ポリペプチドをコードする核酸は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾により導入された保存置換を含む。アミノ酸は、物理的性質および２次および３次タンパク質構造への寄与により分類され得る。保存置換は、１個のアミノ酸を、類似する性質を有する別のアミノ酸と置換するものとして当該技術分野において認識されている。例示的な保存置換が表Ａに記載される。

【表A】

【0066】

あるいは、保存アミノ酸置換は、表Ｂに記載される、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９７５），ｐｐ．７１−７７）に記載されるように分類され得る。

【表B】

【0067】

あるいは、例示的な保存置換が表Ｃに記載される。

【表C】

【0068】

本明細書に記載されるポリペプチドは、アミノ酸残基の１つ以上の挿入、欠失、もしくは置換、またはその任意の組み合わせ、ならびにアミノ酸残基の挿入、欠失、もしくは置換以外の修飾を坦持するポリペプチドを含むことが意図されることを理解するべきである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドまたは核酸は、１つ以上の保存置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドまたは核酸は、２つ以上の保存置換を含む。

【0069】

本明細書で使用されるとき、前述のアミノ酸置換のうちの「２つ以上」は、列記されるアミノ酸置換のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０以上を意味する。いくつかの実施形態では、「２つ以上」は、列記されるアミノ酸置換のうちの２つ、３つ、４つ、または５つを意味する。いくつかの実施形態では、「２つ以上」は、列記されるアミノ酸置換のうちの２つ、３つ、または４つを意味する。いくつかの実施形態では、「２つ以上」は、列記されるアミノ酸置換のうちの２つ、または３つを意味する。いくつかの実施形態では、「２つ以上」は、列記されるアミノ酸置換のうちの２つを意味する。

【0070】

本明細書で使用されるとき、「内因性」は、標的遺伝子またはそれが導入される宿主細胞に天然に関連する核酸またはタンパク質配列を指す。

【0071】

本明細書で使用されるとき、「外因性」は、標的遺伝子またはそれが導入される宿主細胞に天然に関連しない核酸またはタンパク質配列を指し、天然に存在する核酸、例えばＤＮＡ配列、または天然に存在しないゲノム位置に位置する天然に存在する核酸配列の天然に存在しない複数のコピーを含む。

【0072】

本明細書で使用されるとき、「遺伝的に修飾された植物（またはトランスジェニック植物）」は、そのゲノム内に外因性ポリヌクレオチドを含む植物を指す。一般に、および好ましくは、外因性ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが後に続く世代に受け継がれるように、ゲノム内に安定して組み込まれる。外因性ポリヌクレオチドは、ゲノムのみに、または組換え発現カセットの一部として組み込まれ得る。「トランスジェニック」は、本明細書において、任意の細胞、細胞系、カルス、組織、植物部分、または植物を含むように使用され、その遺伝子型は、外因性核酸の存在によって変更され、最初にそのように変更されたそれらの遺伝子導入物（ｔｒａｎｓ ｇｅｎｉｅｓ）、ならびに初期トランスジェニックから性的交差または無性繁殖によって作製されたものを含む。本明細書で使用されるとき、用語「トランスジェニック」は、従来の植物交配方法、または無作為交差受精、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転位、または自然突然変異等の天然に生じる事象によるゲノム（染色体または染色体外）の変更を包含しない。

【0073】

本明細書で使用されるとき、用語「修飾」は、配列が単純にポリペプチドの結合によって修飾されたと考えられることを意味することが意図される。ヌクレオチドの配列は変更されるが、そのような変更（およびその他）はポリペプチドの目的とする核酸への結合後に起こり得ることを示唆することが意図されない。いくつかの実施形態では、核酸配列はＤＮＡである。目的とする核酸の修飾（モジュラー反復単位を含むように修飾されたポリペプチドによってそれに結合するという意味で）は、いくつかの方法のうちのいずれか（例えば、ゲル移動度シフトアッセイ、標識されたポリペプチドの使用、つまり標識は、放射、蛍光、酵素、またはビオチン／ストレプトアビジン標識を含み得る）において検出することができる。必要なのは、目的とする核酸配列の修飾（およびその検出）だけであり得る（例えば、疾患の診断において）。しかしながら、望ましくは、試料のさらなる処理が行われる。便宜上、ポリペプチド（およびそれに特異的に結合される核酸配列）は、残りの試料から分離される。有利に、ポリペプチド−ＤＮＡ複合体は、そのような分離を容易にするために、固相支持体に結合される。例えば、ポリペプチドは、アクリルアミドまたはアガロースゲルマトリックスに存在し得る、またはより好ましくは、膜の表面上、またはマイクロタイタープレートのウェル内に固定化される。

【0074】

いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、少なくとも２つのドメインを含み、第１のドメインは、ラルストニアＤＮＡ結合要素であり、第２のドメインは、メチラーゼである。

【0075】

本発明のＤＮＡ配列は、細菌、真菌、藻類、植物、および動物を含むが、これらに限定されない、任意の原核生物もしくは真核生物細胞および／または目的とする生物における発現のための発現カセットに提供され得る。カセットは、本発明のＤＮＡ配列に動作可能に連結される５’および３’調節配列を含む。「動作可能に連結される」は、２つ以上の要素間の機能的連結を意味するよう意図される。例えば、目的とするポリヌクレオチドまたは遺伝子と調節配列（すなわち、プロモーター）との間の動作可能な連結は、目的とするポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的連結である。動作可能に連結される要素は、隣接または非隣接であってよい。２つのタンパク質コード領域を結合することを指すように使用される場合、動作可能に連結されるとは、コード領域が同じリーディングフレームにあることが意図される。カセットは、生物内に同時に形質転換される少なくとも１つの追加遺伝子をさらに含み得る。あるいは、追加遺伝子（複数可）は、複数の発現カセット上に提供され得る。そのような発現カセットは、調節領域の転写調節下にあるＤＮＡ配列の挿入のための複数の制限部位および／または組換え部位と共に提供される。発現カセットは、選択可能マーカー遺伝子をさらに含み得る。

【0076】

発現カセットは、転写の５’−３’方向で、植物もしくは他の生物または非ヒト宿主細胞の転写および翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、本発明のＤＮＡ配列、ならびに転写および翻訳停止領域（すなわち、停止領域）機能性を含む。調節領域（すなわち、プロモーター、転写調節領域、および翻訳停止領域）および／または本発明のＤＮＡ配列は、宿主細胞に対して、または互いに天然であり得る／類似し得る。あるいは、調節領域および／または本発明のＤＮＡ配列は、宿主細胞に対してまたは互いに異種であってよい。本明細書で使用されるとき、配列に関して「異種」は、外来種を起源とするか、または同種からである場合、組成および／またはゲノム遺伝子座において、意図的なヒトの介在によりその天然の形態から実質的に変更される配列である。例えば、異種ポリヌクレオチドに動作可能に連結されたプロモーターは、ポリヌクレオチドが由来する種とは異なる種からであるか、または同じ／類似する種からである場合、１つまたは両方がそれらの元の形態および／またはゲノム遺伝子座から実質的に変更されるか、あるいはプロモーターは動作可能に連結されたポリヌクレオチドに対して天然プロモーターではない。本明細書で使用されるとき、キメラ遺伝子は、コード配列に異種である転写開始領域に動作可能に連結されるコード配列を含む。

【0077】

停止領域は、転写開始領域に対して天然であり得るか、目的とする動作可能に連結されたＤＮＡ配列に対して天然であり得るか、宿主に対して天然であり得るか、またはプロモーター、目的とするＤＮＡ配列、植物宿主、もしくはこれらの任意の組み合わせに対する別の源（すなわち、外来または異種）に由来し得る。植物に使用するための簡便な停止領域は、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ停止領域等、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉ−プラスミドから入手可能である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：６７１−６７４、Ｓａｎｆａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１−１４９、Ｍｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１−１２７２、Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：１５１−１５８、Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３、およびＪｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９も参照。

【0078】

適切な場合、ポリヌクレオチドは、形質転換生物における発現の増加に最適化され得る。つまり、ポリヌクレオチドは、改善された発現のために宿主により好まれるコドンを使用して合成され得る。例えば、宿主が好むコドンの使用の詳解に関しては、Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｎ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照。宿主が好む遺伝子、特に植物が好む遺伝子を合成するための方法が当該技術分野において利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号および第５，４３６，３９１号、ならびにＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照（参照により本明細書に組み込まれる）。

【0079】

さらなる配列修飾は、細胞宿主における遺伝子発現を強化することが知られている。これらは、偽性ポリアデニル化シグナル、エクソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復、および遺伝子発現に有害であり得る他のそのように十分に特徴付けされた配列をコードする配列の排除を含む。配列のＧ−Ｃ含量は、宿主細胞において発現される既知の遺伝子を参照に計算される、所与の細胞宿主に関して平均であるレベルに調節され得る。可能な場合、配列は、予測されたヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を避けるように修飾される

【0080】

発現カセットは、５’リーダー配列をさらに含み得る。そのようなリーダー配列は、翻訳を強化するように機能し得る。翻訳リーダーは、当該技術分野において既知であり、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：６１２６−６１３０）、ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １６５（２）：２３３−２３８）、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５４：９−２０）、およびヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０−９４）、アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡからの非翻訳リーダー（ＡＭＶ ＲＮＡ ４）（Ｔａｂｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６２２−６２５）、タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ，ｅｄ．Ｃｅｃｈ（Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２３７−２５６）、ならびにトウモロコシクロロティックモトルウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：３８２−３８５）を含む。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８も参照のこと。

【0081】

発現カセットの調製において、適切な配向で、かつ必要に応じて適切なリーディングフレームにおいてＤＮＡ配列を提供するように、様々なＤＮＡ断片が操作され得る。この端部に向かって、アダプターまたはリンカーがＤＮＡ断片を接合するために採用されるか、または簡便な制限部位、過剰なＤＮＡの除去、制限部位の除去等を提供するために他の操作が伴う場合がある。この目的のため、インビトロ変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、転位および塩基転換を伴うことができる。

【0082】

本発明は、単離された、もしくは実質的に精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質組成物を包含する。「単離された」もしくは「精製された」ポリヌクレオチド、またはタンパク質、あるいはその生物学的に活性な部分は、その天然に存在する環境において見られるポリヌクレオチドもしくはタンパク質に通常付随する、またはそれと相互作用する成分を実質的に、もしくは本質的に含まない。よって、単離された、もしくは精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え技法によって生成された場合、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まない、または化学的に合成された場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。最適には、「単離された」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡにおいてポリヌクレオチドに天然に隣接する配列（すなわち、ポリヌクレオチドの５’および３’端に位置する配列）（最適には、配列をコードするタンパク質）を含まない。例えば、様々な実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいてポリヌクレオチドに天然に隣接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満を含み得る。細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％、または１％（乾燥重量）未満の汚染タンパク質を有するタンパク質の調製を含む。本発明のタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質が組換えにより生成される場合、最適には、培養培地は、約３０％、２０％、１０％、５％、または１％（乾燥重量）未満の化学前駆体または目的とする非タンパク質化学物質を表す。

【0083】

開示されるＤＮＡ配列およびそれによってコードされるタンパク質の断片ならびにバリアントも本発明により包含される。「断片」とは、ＤＮＡ配列の一部分、またはアミノ酸配列の一部分、したがって、それによってコードされるタンパク質を意味する。コード配列を含むＤＮＡ配列の断片は、天然タンパク質の生物学的活性、したがって、本明細書に記載される標的ＤＮＡ配列に対してＤＮＡ認識もしくは結合活性を保持するタンパク質断片をコードし得る。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用であるＤＮＡ配列の断片は、一般に、生物学的活性を保持するタンパク質をコードしないか、またはプロモーター活性を保持しない。よって、ＤＮＡ配列の断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから、本発明の最大完全長ポリヌクレオチドの範囲であり得る。

【0084】

いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および／または配列番号１９を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および／または配列番号１９のうちのいずれか１つが少なくとも１回反復される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、表１の配列のいずれも含まない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、表１の単一の配列を含むが、表１の代替え配列の少なくとも１つ以上を含まない。いくつかの実施形態では、代替え配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９を含む。

【0085】

本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドタンパク質のいずれか１つをコードする核酸も提供する。よって、本発明は、配列番号１と少なくとも７５％（または８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％）の配列同一性を含むタンパク質をコードする核酸を提供する。

【0086】

いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１と少なくとも７５％（または８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％）の配列同一性を含むタンパク質をコードし、Ｘ_１Ｘ_２は、天然に存在するアミノ酸の天然に存在しないアミノ酸との任意の組み合わせである。

【0087】

遺伝コードにおける冗長を考えると、当業者は、任意の特定のタンパク質をコードする多くのヌクレオチド配列を生成することができる。全てのそのようなヌクレオチド配列は、本明細書において想定される。

【0088】

本発明は、前述の核酸のいずれかを含むベクターも提供する。よって、本発明は、配列番号１と少なくとも７５％（または８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％）の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。本発明は、配列番号１と少なくとも７５％（または８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％）の配列同一性を有し、かつ以下：ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、ＮＨ、ＮＴ、ＮＫ、ＮＮ、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、ＨＨ、ＲＮ、ＲＳ、およびＧＳから選択される配列番号１のその１２番目および１３番目のアミノ酸に少なくとも１つのＲＶＤ配列を含む、少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、以下から選択される任意の組み合わせの少なくとも１つまたは複数のＲＶＤ配列：ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、ＮＨ、ＮＴ、ＮＫ、ＮＮ、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、ＨＨ、ＲＮ、ＲＳ、ＮＧ、およびＧＳを含み、ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、およびＮＨは、任意の核酸塩基に結合し、ＮＴ、ＮＫ、およびＮＮは、アデニンに結合し、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、およびＨＨは、アデニンおよび／またはグアニンに結合し、ＮＧは、チミンに結合し、ＲＮ、ＲＳ、およびＧＳは、グアニンに結合する。いくつかの実施形態では、ＮＫはグアニンに結合し、ＮＧはチミンに結合し、ＮＮはグアニンもしくはアデニンに結合し、かつ／またはＨＤはシトシンに結合する。いくつかの実施形態では、ＳＩはアデニンに結合し、ＳＮはグアニンもしくはアデニンに結合し、ＮＤはシトシンに結合し、ＨＮはグアニンに結合し、かつ／またはＲＮはグアニンもしくはアデニンに結合する。

【0089】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも第１および第２のドメインを含み、第１のドメインは、上述の単一のＲＶＤ配列を含む、少なくとも１つのポリペプチドモノマーを含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０以上のモノマーを含み、各モノマーは、２個のアミノ酸からなる単一核酸結合ドメイン、またはＲＶＤを含む。本発明のいくつかの実施形態では、第１のドメインは、少なくとも２つのモノマーを含み、各モノマーは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個以上のアミノ酸のスペーサーによって分離される。

【0090】

いくつかの実施形態では、第２のドメインは、本発明の第１のドメインによって付与される核酸結合に相補的な別の機能を含む。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、ヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼの機能断片である。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、エンドヌクレアーゼ、またはエンドヌクレアーゼの機能断片である。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、ニッカーゼ、またはニッカーゼの機能断片である。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、抑制因子、または抑制因子の機能断片である。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、転写活性化因子、または転写活性化因子の機能断片である。

【0091】

いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載される各ポリペプチドの１つ以上をコードする配列を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９から選択される各ポリペプチドのうちの１つ以上をコードする配列を含む核酸を含む。

【0092】

いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドである。他の実施形態では、ベクターはレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、ベクターは、直鎖状ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、長い末端反復、ｐｓｉパッケージングシグナル、クローニング部位、および選択可能マーカーをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｐＬＸＩＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）等のウイルスベクターである。

【0093】

本発明は、前述の核酸のいずれかを含む細胞または生物も提供する。よって、本発明は、配列番号１と少なくとも７５％（または８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％）の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸を含む細胞または生物を提供する。本発明は、任意の組み合わせで、以下のポリペプチド：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のいずれか１つ以上と少なくとも７５％（または８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％）の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸を含む細胞または生物を提供する。本発明は、任意の組み合わせで、以下のポリペプチド：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のいずれか１つ以上と少なくとも７５％（または８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％）の配列同一性を有し、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のいずれかの１２位および１３位でＲＶＤドメインのうちの少なくとも１つに少なくとも１つの変異を含むタンパク質をコードする核酸を含む細胞または生物を提供する。本発明は、任意の組み合わせで、以下のポリペプチド：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のいずれか１つ以上と少なくとも７５％（または８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％）の配列同一性を有し、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のいずれかの１２位および１３位でＲＶＤドメインのうちの少なくとも１つに少なくとも１つの変異を含むタンパク質と接触することによって変異される核酸を含む細胞または生物を提供する。

【0094】

いくつかの実施形態では、細胞または生物は、配列番号１と少なくとも７５％（または８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％）の配列同一性を有する核酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、特許請求される発明のポリペプチドまたはタンパク質は、複数の反復ドメインを含み、少なくとも１つの反復ドメインは、配列番号１〜１９と少なくとも７５％（または８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％）の配列同一性を有する核酸配列、または配列番号１〜１９と７５％（または８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、細胞は、前述のベクターまたは核酸配列のいずれかを含む。

【0096】

本発明の一態様では、本発明のポリペプチドは、モノマーサブ単位を含み、少なくとも１つのモノマーサブ単位は、ヌクレオチド認識要素を含むラルストニアに由来する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、モノマーサブ単位を含み、少なくとも１つのモノマーサブ単位は、以下のポリペプチド：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のいずれか１つ以上と少なくとも７５％（または８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）の配列同一性を有するヌクレオチド認識要素を含むラルストニアに由来する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、モノマーサブ単位を含み、少なくとも１つのモノマーサブ単位は、以下のポリペプチド：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％（または８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）の配列同一性からなるヌクレオチド認識要素を含むラルストニアに由来する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、１つ以上のモノマーサブ単位をコードする核酸配列を含み、１つ以上のモノマーサブ単位は、コードされる場合、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、または１２以上の連続モノマーを含み、各モノマーは、ヌクレオチド認識要素を含むラルストニアに由来する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、１つ以上のモノマーサブ単位をコードする核酸配列を含み、１つ以上のモノマーサブ単位は、コードされる場合、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、または１２以上の連続モノマーを含み、各モノマーは、以下のポリペプチド：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％（または８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）の配列同一性からなるヌクレオチド認識要素、またはその任意のバリアントもしくは類似体を含むラルストニアに由来する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ラルストニアに由来する核酸認識要素を含む１つ以上のポリペプチド配列をコードする１つ以上の核酸配列、およびキサントモナス（Ｘａｎｔｈａｍｏｎｕｓ）に由来する核酸認識要素を含む１つ以上のポリペプチド配列をコードする１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ認識要素である、連続する、独立した（ｉｎｄｅｐｄｎｅｎｔｌｙ）可変モノマーサブ単位を含み、モノマーサブ単位のうちの少なくとも１つ以上は、本明細書に開示されるラルストニア配列に由来する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡ認識要素である、連続する、独立した可変モノマーサブ単位を含む融合タンパク質に関し、モノマーサブ単位のうちの少なくとも１つ以上は、表１に開示されるラルストニア配列に由来する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡ認識要素である、連続するモノマーサブ単位を含む融合タンパク質に関し、融合タンパク質は、以下のポリペプチド配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のうちの少なくとも１つから選択された連続するポリペプチドの組み合わせ、またはその任意のバリアントもしくは類似体を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡ認識要素である、連続するモノマーサブ単位を含む融合タンパク質に関し、融合タンパク質は、以下のポリペプチド配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のうちの少なくとも１つから選択された連続するポリペプチドの組み合わせ、またはその任意のバリアントもしくは類似体を含み、各モノマーは、ＤＮＡ標的配列の１つのヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡ認識要素である、連続するモノマーサブ単位を含む融合タンパク質に関し、融合タンパク質は、以下のポリペプチド配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のうちの少なくとも１つから選択された連続するポリペプチドの組み合わせ、またはその少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％パーセント相同であるその任意のバリアントもしくは類似体を含み、各モノマーは、核酸配列の存在下でＤＮＡ標的配列の１つのヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡ認識要素である、連続するモノマーサブ単位を含む融合タンパク質に関し、融合タンパク質は、以下のポリペプチド配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のうちの少なくとも１つから選択された連続するポリペプチドの組み合わせ、またはその少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％パーセント相同であるその任意のバリアントもしくは類似体を含み、各モノマーは、核酸配列の存在下でＤＮＡ標的配列の１つのヌクレオチドに結合し、融合タンパク質は、エフェクタータンパク質／ポリペプチドである少なくとも１つのポリペプチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ標的配列に結合する第１のドメインと、エフェクター機能を有する第２のドメインとを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡ認識要素である、連続するモノマーサブ単位を含む融合タンパク質に関し、融合タンパク質は、以下のポリペプチド配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のうちの少なくとも１つから選択された連続するポリペプチドの組み合わせ、またはその少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％パーセント相同であるその任意のバリアントもしくは類似体を含み、各モノマーは、核酸配列の存在下でＤＮＡ標的配列の１つのヌクレオチドに結合し、融合タンパク質は、エフェクタータンパク質／ポリペプチドである少なくとも１つのポリペプチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ標的配列に結合する第１のドメインと、ヌクレアーゼ機能を有する第２のドメインとを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡ認識要素である連続するモノマーサブ単位を含む融合タンパク質に関し、融合タンパク質は、以下のポリペプチド配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のうちの少なくとも１つから選択された連続するポリペプチドの組み合わせ、またはその少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％パーセント相同であるその任意のバリアントもしくは類似体を含み、各モノマーは、核酸配列の存在下でＤＮＡ標的配列の１つのヌクレオチドに結合し、融合タンパク質は、エフェクタータンパク質／ポリペプチドである少なくとも１つのポリペプチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ標的配列に結合する第１のドメインと、ニッカーゼまたはリガーゼ機能を有する第２のドメインとを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ標的配列に結合する第１のドメインと、ヌクレアーゼ機能を有する第２のドメインとを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡ認識要素である連続するモノマーサブ単位を含む融合タンパク質に関し、融合タンパク質は、以下のポリペプチド配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のうちの少なくとも１つから選択された連続するポリペプチドの任意の組み合わせ、またはその少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％パーセント相同であるその任意のバリアントもしくは類似体を含み、各モノマーは、核酸配列の存在下でＤＮＡ標的配列の１つのヌクレオチドに結合し、かつ融合タンパク質は、エフェクタータンパク質／ポリペプチドである少なくとも１つのポリペプチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡ認識要素である、連続するモノマーサブ単位を含む融合タンパク質に関し、融合タンパク質は、以下のポリペプチド配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のうちの少なくとも１つから選択された連続するポリペプチドの任意の組み合わせ、またはその少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％パーセント相同であるその任意のバリアントもしくは類似体を含み、各モノマーは、核酸配列の存在下でＤＮＡ標的配列の１つのヌクレオチドに結合し、かつ融合タンパク質は、エフェクタータンパク質／ポリペプチドである少なくとも１つのポリペプチド配列をさらに含み、任意の開示されるエフェクタータンパク質機能を有する少なくとも１つのポリペプチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡ認識要素である、連続するモノマーサブ単位を含む融合タンパク質に関し、融合タンパク質は、以下のポリペプチド配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のうちの少なくとも１つから選択された連続するポリペプチドの任意の組み合わせ、またはその少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％パーセント相同であるその任意のバリアントもしくは類似体を含み、各モノマーは、核酸配列の存在下でＤＮＡ標的配列の１つのヌクレオチドに結合し、かつ融合タンパク質は、エフェクタータンパク質／ポリペプチド機能を含むか、またはエフェクタータンパク質もしくはそのバリアントである少なくとも２つのポリペプチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡ認識要素である連続するモノマーサブ単位を含む融合タンパク質に関し、融合タンパク質は、以下のポリペプチド配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のうちの少なくとも１つから選択された連続するポリペプチドの任意の組み合わせ、またはその少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％パーセント相同であるその任意のバリアントもしくは類似体を含み、各モノマーは、核酸配列の存在下でＤＮＡ標的配列の１つのヌクレオチドに結合し、かつ融合タンパク質は、エフェクター／タンパク質機能を含む少なくとも３つ以上のポリペプチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡ認識要素である連続するモノマーサブ単位を含む融合タンパク質に関し、融合タンパク質は、以下のポリペプチド配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のうちの少なくとも１つから選択された連続するポリペプチドの任意の組み合わせ、またはその少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％パーセント相同であるその任意のバリアントもしくは類似体を含み、各モノマーは、核酸配列の存在下でＤＮＡ標的配列の１つのヌクレオチドに結合し、かつ融合タンパク質は、エフェクタータンパク質／ポリペプチドを含む少なくとも４つ以上のポリペプチド配列をさらに含む。

【0097】

本発明の核酸またはタンパク質は、最終目的のベクターに後に組み立てることができる標的ベクターにおいてモノマー単位および／または反復単位を予め組み立てることによるモジュラーアプローチによって構築することができる。本発明の一態様では、本発明のポリペプチドは、本発明の反復モノマーを含み、最終目的のベクターに後に組み立てることができる標的ベクターにおいて反復単位を予め組み立てることによるモジュラーアプローチによって構築することができる。本発明は、この方法によって生成されたポリペプチドならびにポリペプチドをコードする核酸配列、およびそのようなＤＮＡ配列を含む宿主生物および細胞を提供する。

【0098】

特定のアミノ酸に関して特定のコドンを得るために特異的にＤＮＡ配列を修飾するための技法は、当該技術分野において既知である。変異誘発およびポリヌクレオチド改変の方法は、広く説明されてきた。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ！．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、および本明細書において引用される参考文献を参照。全てのこれらの刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0099】

以下の例は、新たな反復単位を構築し、標的ＤＮＡ配列において塩基対を特異的に認識する人工的に構築された反復単位の特異的結合活性を試験するための方法を提供する。反復ドメインにおいて使用される反復単位の数は、日常的な実験により、当業者によって確認され得る。一般に、少なくとも１．５の反復単位が最小と考えられるが、典型的には、少なくとも約８つの反復単位が使用される。大きさが半分の反復単位を使用することができるため、反復単位は、完全な反復単位である必要はない。さらに、本明細書に開示される方法およびポリペプチドは、特定の数の反復単位を有する反復ドメインに依存する。よって、本発明のポリペプチドは、例えば、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４０．５、４１、４１．５、４２、４２．５、４３、４３．５、４４、４４．５、４６、４６．５、４７、４７．５、４８、４８．５、４９、４９．５、５０、５０．５以上の反復単位を含み得る。

【0100】

本発明では、反復単位を有する反復ドメインを含むポリペプチドが設計され得、反復単位において、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する超可変領域が含まれる。本発明の一実施形態では、各反復単位は、標的ＤＮＡ配列内の１つの塩基対の認識を決定する超可変領域を含む。さらなる実施形態では、反復ドメインにおいて、標的ＤＮＡ配列内の塩基対を特異的に認識しない１つまたは２つの反復単位が含まれる。発明者によって見出された認識コードを考慮すると、反復単位のモジュラー整列は、実現可能であり、各反復単位は、標的ＤＮＡ配列内の１つの塩基対の特異的認識に関与する。したがって、反復単位の配列は、１つの反復単位が１つの塩基対と合致するように、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の配列に対応する。

【0101】

本発明は、ポリペプチドにより標的ＤＮＡ配列内の塩基対を選択的に認識するための方法を提供し、該ポリペプチドは、反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含み、該反復単位において、各々は、該標的ＤＮＡ配列内の塩基対またはヌクレオチドの認識を決定する少なくとも１つのＲＶＤ領域を含む。より具体的には、発明者は、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の選択的認識に関与するＤＮＡ結合ポリペプチド内のこれらのアミノ酸を特定した。認識コードの解明により、ポリペプチド内の選択されたアミノ酸による標的ＤＮＡ配列内の特定の塩基対を認識するための一般原則が特定された。発明者は、様々なアミノ酸長の反復単位アレイ（またはポリマー）の一部である別個の種類のモノマーが定義された／特定の１つの塩基対を認識する能力を有することを発見した。反復ドメインを形成する各反復単位内で、ＲＶＤ領域は、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の特異的な認識に関与する。

【0102】

よって、本発明は、反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含むポリペプチドにより標的ＤＮＡ配列内の塩基対を選択的に認識する方法だけでなく、ポリペプチド内の反復ドメインにより選択的に認識される標的ＤＮＡ配列を生成することができる方法も提供する。これらのポリペプチドは、単離された核酸配列または研究室での他のインビボ配列をクローニングする、変異誘発する、ないしは別の方法で変更するために、分子生物学ツールとして有用である。これは、選択的変異誘発の効果的な手段を提供する。

【0103】

本発明は、特定のＤＮＡ配列を認識するポリペプチドを構築および／または作製するための方法も提供する。本発明のこれらのポリペプチドは、本発明の反復モノマーを含み、最終目的のベクターに後に組み立てることができる標的ベクターにおいて反復単位を予め組み立てることによるモジュラーアプローチによって構築することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物は、本明細書に開示されるポリペプチドを組換えにより生成および／または分泌するようにコドン最適化される。組換えタンパク質を生成するために、当該技術分野における任意の組換え系が使用され得る。例としては、バキュロウイルス細胞、哺乳類細胞等の他の真核生物細胞、または細菌細胞が挙げられる。

【0104】

標的ＤＮＡ配列が既知であり、タンパク質による認識が望ましい場合、当業者は、特定の認識アミノ酸配列を含む、一連のモジュラー反復単位を具体的に構築し、所望の標的ＤＮＡ配列の認識およびそれへの結合を可能にするように適切な順序で、これらの反復単位をポリペプチド内に組み込むことができる。本発明のモジュラー反復単位ＤＮＡ結合ドメインと組み合わせることにより、あらゆるポリペプチドを修飾することができる。そのような例としては、転写活性化因子および抑制因子タンパク質、耐性媒介タンパク質、ヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リゾルバーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、デメチラーゼ、デアセチラーゼであるポリペプチド、およびＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を修飾することが可能な任意の他のポリペプチドが挙げられる。

【0105】

本発明のモジュラー反復単位ＤＮＡ結合ドメインは、転写調節領域および翻訳停止領域を含むがこれらに限定されない任意の他の調節領域で機能するように、核局在化シグナル等の細胞コンパートメント局在化シグナルと組み合わせることができる。

【0106】

本発明のさらなる実施形態では、これらのモジュラーにより設計された反復単位は、反復ドメインによる結合の結果としてＤＮＡと近接する場合、ＤＮＡを切断することが可能なエンドヌクレアーゼドメインと組み合わせられる。そのようなヌクレオチド鎖切断は、真菌、植物、および動物を含む真核生物の相同組換えの速度を刺激することが知られている。部位特異的ヌクレオチド鎖切断の結果として特定の部位で相同組換えを刺激する能力は、部位特異的切断を作製することなしに可能であるよりも非常に高い頻度で、特定の部位に目的とするＤＮＡ配列を組み込んだ形質転換細胞の回復を可能にする。加えて、反復ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインから形成されたポリペプチドによって生じるもの等のヌクレオチド鎖切断は、時折、切断の部位の配列を変更するという方法で細胞ＤＮＡ代謝器官により、例えば、未変更の配列と比較して、切断の部位に短い挿入または欠失をもたらすことにより、修復される。これらの配列変更は、例えば、非機能タンパク質を作製するためにタンパク質コード配列を変更する、遺伝子転写物が適切に切断されないようにスプライス部位を修飾する、非機能転写物を作製する、もはや適切に転写されないように遺伝子のプロモーター配列を変更する等により、遺伝子またはタンパク質の機能の不活性化をもたらすことができる。

【0107】

特定のエンドヌクレアーゼを使用したＤＮＡの切断は、切断の領域の相同組換えの速度を増加することができる。いくつかの実施形態では、Ｆｏｋ Ｉ（フラボバクテリウム・オケアノコイテス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓ））エンドヌクレアーゼが、ＤＮＡ切断を誘発するためにエフェクターにおいて利用され得る。Ｆｏｋ Ｉエンドヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合ドメインから独立して機能し、典型的にはダイマーとして二本鎖ＤＮＡを切断する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ８９（１０）：４２７５−４２７９、およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９３（３）：１１５６−１１６０；その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一本鎖ＦｏｋＩダイマーも開発されており、同様に利用することができる（Ｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４０：１５６−１６１）。所望の標的ＤＮＡ配列を認識するための反復ドメイン、ならびに亜鉛フィンガーヌクレアーゼを採用して、前の研究が行ったものと類似する標的ＤＮＡ配列で、またはその付近でＤＮＡ切断を誘発するためのＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含むエフェクターが構築され得る（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４５９：４４２−４４５、Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４５９，４３７−４４１、その全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。そのようなエフェクターの利用は、Ｂｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００，７６４、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３５，６４６、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ４４：６９３−７０５、ならびに米国特許第７，１６３，８２４号および同第７，００１，７６８号（その全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により亜鉛フィンガーヌクレアーゼに関して報告されるこれらの使用に類似する、付加、欠失、および他の修飾を含むゲノムにおける標的変化の生成を可能にすることができる。

【0108】

ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインは、標準的な方法によって調製された海洋細菌フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ＡＴＣＣ）のゲノムＤＮＡからＰＣＲによってクローニングすることができる。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの配列は、Ｐｕｂｍｅｄ（受入番号Ｍ２８８２８および受入番号Ｊ０４６２３、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で入手可能である。酵母サッカロミセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＩ−Ｓｃｅ Ｉエンドヌクレアーゼが、相同組換えの速度を増加するＤＮＡ切断を生成するために使用された。Ｉ−Ｓｃｅ Ｉは、１８ｂｐの認識配列、したがって、所与のＤＮＡ内、たとえ大きなゲノム内においても非常に低い頻度の認識部位を有するミトコンドリアイントロンによってコードされるエンドヌクレアーゼである（Ｔｈｉｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９（１）：１８９−１９０；その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｉ−ＳｃｅＩによって認識される切断部位の低頻度は、相同組換えを強化するためにそれの使用を適切にする。該ＤＮＡ切断を誘発するためのＩ−Ｓｃｅ Ｉの使用に関するさらなる説明は、米国特許出願第２００９０３０５４０２号に見出すことができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0109】

Ｉ−Ｓｃｅ Ｉの認識部位は、広範な異なる系内に導入されてきた。この部位のＩ−Ｓｃｅ Ｉでの後の切断は、部位が導入された位置の相同組換えを増加させる。相同組換えの頻度の強化は、ツメガエル卵母細胞の染色体外ＤＮＡ、マウスゲノム、およびタバコ植物ニコチアナ・プルムバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）内に導入されたＩ−Ｓｃｅ Ｉ部位により得てきた。例えば、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２（３）：８０６−８１０、Ｃｈｏｕｌｉｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５（４）：１９６８−１９７３、およびＰｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（２２）：５０３４−５０４０（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照。異種ＤＮＡ結合ドメインと作用する任意の他のエンドヌクレアーゼがエフェクターにおいて利用され得、Ｉ−Ｓｃｅ Ｉエンドヌクレアーゼがそのような非限定的な例の１つであることを理解する。Ｉ−Ｓｃｅ Ｉ等のＤＮＡ認識および結合ドメインを有するエンドヌクレアーゼの使用の制限は、そのような部位が既に所望の位置に存在しない場合、その部位での相同組換えを強化するために、該エンドヌクレアーゼの使用前に相同組換えの標準的な方法によって認識部位が所望の位置に導入されなければならないことである。目的とする内因性標的ＤＮＡ配列を切断するために、新規標的ＤＮＡ配列を認識する既知のエンドヌクレアーゼを修飾する、または１つ以上のそのようなエンドヌクレアーゼのキメラ型を作製する等により、よって、そのような操作されたエンドヌクレアーゼドメインの生成を導く新規エンドヌクレアーゼの設計および合成を可能にする方法が報告された（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５、国際公開第ＷＯ２００７／０６０４９５号、同第ＷＯ２００９／０９５７９３号、Ｆａｊａｒｄｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：２１６３−２１７３、その両方は、参照によりその全体が組み込まれる）。そのため、そのようなエンドヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合活性に非機能性を付与するが、ＤＮＡ切断機能を活性に維持するように同様に操作され、上記のＦｏｋＩの使用に類似するＤＮＡ切断を誘発するために、エフェクターにおいて該同様に操作されたエンドヌクレアーゼ切断ドメインを利用することが想定され得る。そのような用途において、標的ＤＮＡ配列認識は、好ましくは、エフェクターの反復ドメインによって提供されるが、ＤＮＡ切断は操作されたエンドヌクレアーゼドメインによって達成されるだろう。

【0110】

上述のように、エフェクターは、所望の特定の標的配列に関して特異的な認識を有する反復ドメインを含む。好ましい実施形態では、エフェクターは、内因性染色体ＤＮＡ配列に特異的に結合する。特定の核酸配列、またはより好ましくは特定の内因性染色体配列は、相同組換えを強化することが望ましい核酸領域の任意の配列であってよい。例えば、核酸領域は、点変異もしくは欠失等の変異を導入することが望ましい遺伝子、または所望の表現型を付与する遺伝子を導入することが望ましい領域を含む領域であってよい。

【0111】

さらなる実施形態は、所望の付加が導入された、修飾された植物を生成する方法に関する。本方法は、修飾を導入することが望ましい内因性標的ＤＮＡ配列を含む植物細胞を得ることと、内因性標的ＤＮＡ配列およびエンドヌクレアーゼドメインに結合する反復ドメインを含むエフェクターを有する内因性標的ＤＮＡ配列内に二本鎖切断を生成することと、外因性核酸と内因性標的ＤＮＡ配列との間に相同組換えを生じさせる条件下で、内因性標的ＤＮＡの少なくとも一部分に相同である配列を含む外因性核酸を植物細胞に導入することと、相同組換えが生じた植物細胞から植物を生成することとを含み得る。他の実施形態は、上述および本明細書に記載される方法により作製された遺伝的に修飾された細胞および植物に関する。標的ＤＮＡ配列は人工であるか、または天然に存在し得ることに留意するべきである。そのような方法は、当該技術分野において既知の技法および方法を使用して、あらゆる生物（そのような非限定的な生物は、動物、ヒト、真菌、卵菌の細菌、およびウイルスを含む）において使用され、そのような生物においてそのような目的のために利用されることを理解する。

【0112】

本発明のさらなる実施形態では、これらのモジュラーにより設計された反復ドメインは、例えば、植物遺伝子、動物遺伝子、真菌遺伝子、卵菌遺伝子、ウイルス遺伝子、またはヒト遺伝子の遺伝子の発現の調節または制御に関与する１つ以上のドメインと組み合わされる。亜鉛フィンガードメインを含むＤＮＡ結合ポリペプチドを生成することにより遺伝子発現を調節する方法は、当該技術分野において既知である（米国特許第７，２８５，４１６号、同第７，５２１，２４１号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２７３，９２３号、同第７，２６２，０５４号、同第７，２２０，７１９号、同第７，０７０，９３４号、同第７，０１３，２１９号、同第６，９７９，５３９号、同第６，９３３，１１３号、同第６，８２４，９７８号、その各々は、本明細書において参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、ラルストニア様ファミリーのこれらのエフェクターは、特定の標的ＤＮＡ配列に結合するために修飾される。そのようなポリペプチドは、例えば、目的とする遺伝子の転写を活性化、抑制、ないしは別の方法で調節するために、該遺伝子のプロモーターまたは他の調節領域の遺伝的制御領域に特異的に結合するように本発明の方法によって修飾される転写の転写活性化因子、または抑制因子タンパク質であってよい。

【0113】

本発明のまたさらなる実施形態では、標的ＤＮＡ配列は、天然に存在する反復ドメインにより、または修飾された反復ドメインにより特異的に認識されるために修飾される。一例として、ラルストニア様ファミリーのメンバーの標的ＤＮＡ配列は、対応するエフェクターによって誘発され得る新規制御可能なプロモーターを生成するようにプロモーター内に挿入され得る。二次誘発性系は、トランス活性化因子および標的遺伝子を使用して構築することができ、トランス活性化因子はポリペプチドであり、該ポリペプチドは、該標的遺伝子に結合し、発現を誘発する本発明の反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含む。トランス活性化因子および標的遺伝子は、１つの細胞系内に導入され得るが、異なる細胞系にも存在し、後に遺伝子移入され得る。さらなる実施形態では、病気耐性植物は、本発明のポリペプチドを含む反復ドメインの標的ＤＮＡ配列を、耐性媒介遺伝子を活性化することにより発現後に植物の防御反応をもたらす遺伝子の前に挿入することにより構築され得る。

【0114】

さらなる実施形態では、特注ＤＮＡ結合ポリペプチドは、反復単位型を再整列し、よって、新規標的ＤＮＡ結合特異性を有する反復ドメインの生成を可能にすることによって構築することができる。個々の反復単位は、古典的なクローニング戦略を除外するＤＮＡレベルではほぼ同一である。本発明は、本発明の反復ドメインを有する特注ポリペプチドを組み立てるための迅速かつ安価な戦略を提供する。そのようなポリペプチドのクローニングの汎用性を改善するために、２工程アセンブリ法が設計された。この方法は、それらの標的ＤＮＡ認識および結合特異性を研究するために、新規反復型を有するポリペプチドを組み立てるために使用された。

【0115】

簡潔に、任意のＤＮＡ配列は、特定の認識および互いへの結合を容易にするために、塩基対を、遺伝子の任意のＤＮＡ領域もしくは特定の領域、または該修飾されたＤＮＡ配列に結合する反復単位から構成される反復ドメインを有するポリペプチドを特異的に標的とするための遺伝制御要素に導入することにより、本発明のポリペプチドを含む反復ドメインによる結合を可能にするように修飾され得る。

【0116】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、有機化学合成の当業者に知られている既知のアミノ酸の化学的性質を使用して合成的に製造され得る。そのような手順は、例えば、ＢｏｃおよびＦｍｏｃのいずれかの方法を使用する、溶液および固相手順の両方を含む。本発明の化合物は、固相合成法を使用して合成され得る。Ｆｍｏｃ−Ｎ保護されたβ−アミノ酸は、オルト−クロロ−トリチルクロリド樹脂を含む、任意の数の固体支持体上に、標準的な条件下で、従来の手動の固相合成法によりポリ−α／β−ペプチドを合成するために使用され得る。Ｆｍｏｃ−β−アミノ酸のオルト−クロロ−トリチルクロリド樹脂とのエステル化は、Ｂａｒｌｏｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９８９，３０，３９４３の方法により行うことができる。樹脂（１５０ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ Ｃｌ）を、１０分間、２ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２中で膨張させる。次いで、ＣＨ_２Ｃｌ_２中のＦｍｏｃ保護されたβ−アミノ酸およびｉＰｒ_２ＥｔＮの溶液を、連続的に添加し、アルゴン下で４時間、懸濁液を混合した。その後、樹脂を濾過し、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／ｉＰｒ_２ＥｔＮ（１７：２：１、３×３分）、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３×３分）、ＤＭＦ（２×３分）、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３ｘ３分）、およびＭｅＯＨ（２×３分）で洗浄した。樹脂の置換は、３００ｎｍでジベンゾフルベン付加物の吸光度を測定することにより、３ｍｇの試料上で決定された。Ｆｍｏｃ基は、Ａｒ気泡下で、ＤＭＦ（４ｍｌ、２×２０分）中２０％のピペリジンを使用して除去された。次いで、樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６×３分）で洗浄した。各カップリング工程に関して、ＤＭＦ（２ｍｌ）中のβ−アミノ酸（３当量）、ＢＯＰ（３当量）、およびＨＯＢＴ（３当量）およびｉＰｒ_２ＥｔＮ（９当量）の溶液を、樹脂に連続的に添加し、Ａｒ下で１時間、懸濁液を混合した。カップリング反応の監視は、２，４，６−トリニトロベンゼン−スルホン酸（ＴＮＢＳ）により行われた（Ｗ．Ｓ．Ｈａｎｃｏｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７６），７１，２６０）。ＴＮＢＳ試験が陽性の場合（不完全なカップリングを示す）、懸濁液をさらに１時間反応させた。次いで、樹脂を濾過し、以下のＦｍｏｃ脱保護工程の前にＤＭＦ（３×３分）で洗浄した。最後のＦｍｏｃ保護基を除去した後、樹脂を、ＤＭＦ（６×３分）、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３×３分）、Ｅｔ_２Ｏ（３×３分）で洗浄し、真空下で３時間乾燥させた。最後に、Ａｒ下で、ＣＨ_２Ｃｌ_２中２％のＴＦＡ（２ｍｌ、５×１５分）を使用して、ペプチドを樹脂から切断した。溶媒を除去し、油状残留物をエーテル中で粉砕し、粗ポリペプチドを得た。化合物は、ＨＰＬＣによりさらに精製される。

【0117】

本発明は、目的とする標的ＤＮＡ配列に特異的なモジュラー反復単位を構築することにより遺伝子発現を標的調節する、該反復モノマーを付加することによりポリペプチドを修飾し、該ポリペプチドが今や標的ＤＮＡを認識できるようにする、原核生物または真核生物（ｅｕｒｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞に該修飾されたポリペプチドを導入するまたは発現させ、該修飾されたポリペプチドが標的ＤＮＡ配列を認識できるようにする、およびそのような認識の結果として該細胞における該標的遺伝子の発現を調節する方法も提供する。

【0118】

本発明は、標的ＤＮＡ配列を認識する本発明の少なくとも１つの反復ドメインを含むポリペプチドの構築により、該標的ＤＮＡ配列を指向修飾するための方法も提供し、該ポリペプチドは、標的ＤＮＡを修飾することが可能な機能ドメインも含み（部位特異的組換え、ドナー標的配列の制限または組み込み等を介して）、それにより複雑なゲノムにおける標的ＤＮＡ修飾を可能にする。

【0119】

本発明は、反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含む修飾されたポリペプチドの生成をさらに提供し、反復単位の各々内の超可変領域は、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の選択的認識を決定する。本発明のさらなる実施形態では、上述の反復ドメインを含むポリペプチドをコードするＤＮＡが提供される。

【0120】

本発明の別の実施形態では、標的ＤＮＡ配列に位置する１つ以上の塩基対を含むように修飾され、その結果、該塩基対の各々は、対応する反復単位を有する反復ドメインを含むポリペプチドによって特異的に認識され得、各反復単位は、該ＤＮＡ内の対応する塩基対の認識を決定する超可変領域を含む、ＤＮＡが提供される。

【0121】

本発明のまた別の実施形態では、これらのポリペプチドおよびＤＮＡの使用が提供される。加えて、本発明の単離された核酸分子、および本発明のコード配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドで形質転換された植物、植物部分、タネ、植物細胞、および他の非ヒト宿主細胞が提供される。またさらに、本明細書に記載されるポリペプチドおよびＤＮＡは、動物およびヒト細胞ならびに真菌または植物のような他の生物内に導入され得る。要約すると、本発明は、ポリペプチドによって標的ＤＮＡ配列内の塩基対を選択的に認識するための方法に注目し、該ポリペプチドは、反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含み、各反復単位は、該標的ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する超可変領域を含み、連続する反復単位は、該標的ＤＮＡ配列内の連続する塩基対に対応する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるタンパク質もしくは核酸配列のうちのいずれか１つ、またはその組み合わせを含むヒト細胞に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示される１つ以上の核酸もしくはポリペプチドの導入によって生じた変異、異種遺伝子、バリアント、または他の遺伝的修飾を含むヒト細胞等の細胞に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示される１つ以上の核酸もしくはポリペプチドの導入によって生じた変異、異種遺伝子、バリアント、または他の遺伝的修飾を含む非ヒト動物細胞等の細胞に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示される１つ以上の核酸もしくはポリペプチドの導入によって生じた変異、異種遺伝子、バリアント、または他の遺伝的修飾を含む昆虫細胞等の細胞に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示される１つ以上の核酸もしくはポリペプチドの導入によって生じた変異、異種遺伝子、バリアント、または他の遺伝的修飾を含む植物細胞等の細胞に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示される１つ以上の核酸もしくはポリペプチドの導入によって生じた変異、異種遺伝子、バリアント、または他の遺伝的修飾を含む魚類細胞等の細胞に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示される１つ以上の核酸もしくはポリペプチドの導入によって生じた変異、異種遺伝子、バリアント、または他の遺伝的修飾を含む哺乳類細胞等の細胞に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示される１つ以上の核酸もしくはポリペプチドの導入によって生じた変異、異種遺伝子、バリアント、または他の遺伝的修飾を含む真核生物細胞等の細胞に関する。

【0122】

別の態様では、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法が提供される。細胞は、好ましくは、植物細胞、ヒト細胞、動物細胞、真菌細胞、または任意の他の生存細胞であってよい。細胞は、ポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含み、これらの反復単位は超可変領域を含み、各反復単位は、該標的ＤＮＡ配列内の１つの塩基対の認識に関与する。該ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするＤＮＡとして導入されるか、またはポリペプチドは、当該技術分野において既知の方法により、それ自体が細胞に導入されるかのいずれかである。どのように導入されるかにかかわらず、ポリペプチドは、塩基対の標的ＤＮＡ配列を特異的に認識し、好ましくはそれに結合し、標的遺伝子の発現を調節する少なくとも１つの反復ドメインを含むべきである。好ましい実施形態では、全ての反復単位は、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する超可変領域を含む。

【0123】

エフェクターの細胞内への取り込みを容易にするための本発明のポリペプチド（ｐｏｌｐｅｐｔｉｄｅ）またはＲＴＮに連結され得るペプチド配列の例としては、ＨＩＶのｔａｔタンパク質の１１のアミノ酸ペプチド、ｐ１６タンパク質のアミノ酸８４ １０３に対応する２０の残留ペプチド配列（Ｆａｈｒａｅｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：８４）；ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｈｅｌｉｘ ｏｆ ｔｈｅ ６０−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｌｏｎｇ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（Ｄｅｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４４４を参照）、カポジ線維芽細胞増殖因子（Ｋ−ＦＧＦ）ｈ領域等のシグナルペプチドのｈ領域、またはＨＳＶからのＶＰ２２転座ドメイン（Ｅｌｌｉｏｔ＆Ｏ’Ｈａｒｅ（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２２３ ２３３）が挙げられるが、これらに限定されない。強化された細胞取り込みを提供する他の好適な化学部分は、エフェクターに化学的にも連結され得る。本明細書に記載されるように、エフェクターは、選択の任意の内因性遺伝子の発現を調節するために、任意の好適な標的部位を認識するように設計され得る。調節に好適な内因性遺伝子の例としては、ＶＥＧＦ、ＣＣＲ５、ＥＲα、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＨＢＶ Ｃ、Ｓ、Ｘ、およびＰ、ＬＤＬ−Ｒ、ＰＥＰＣＫ、ＣＹＰ７、フィブリノーゲン、ＡｐｏＢ、Ａｐｏ Ｅ、Ａｐｏ（ａ）、レニン、ＮＦ−κＢ、Ｉ−κＢ、ＴＮＦ−α、ＦＡＳリガンド、アミロイド前駆体タンパク質、心房性ナトリウム利尿因子（ａｔｒｉａｌ ｎａｔｕｒｅｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、ｏｂ−レプチン、ｕｃｐ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、ＰＤＧＦ、ＰＡＦ、ｐ５３、Ｒｂ、胎児性ヘモグロビン、ジストロフィン、ユートロフィン（ｅｕｔｒｏｐｈｉｎ）、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ受容体ｆｌｔおよびｆｌｋ、トポイソメラーゼ、テロメラーゼ、ｂｃｌ−２、サイクリン、アンジオスタチン、ＩＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＳＴＡＴＳ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ＴＨ、ＰＴＩ−１、ポリガラクツロナーゼ、ＥＰＳＰシンターゼ、ＦＡＤ２−１、δ−１２デサチュラーゼ、δ−９デサチュラーゼ、δ−１５デサチュラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、デンプンシンターゼ、セルロースシンターゼ、スクロースシンターゼ、老化関連遺伝子、重金属キレート化剤、脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ、ウイルス性遺伝子、原生動物遺伝子、真菌遺伝子、および細菌遺伝子が挙げられる。一般に、調節される好適な遺伝子は、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、分裂促進因子、走化因子、存在活性因子、受容体、カリウムチャネル、Ｇ−タンパク質、シグナル伝達分子、疾患耐性因子、および他の疾患関連遺伝子を含む。

【0124】

毒素分子は、細胞膜にわたってポリペプチドを輸送する能力も有する。しばしば、そのような分子は、少なくとも２つの部分（「２成分毒素」と呼ばれる）から構成される：転座もしくは結合ドメインまたはポリペプチド、および別個の毒素ドメインもしくはポリペプチド。典型的には、転座ドメインまたはポリペプチドは、細胞受容体に結合し、その後、毒素は細胞内に輸送される。クロストリジウム−パーフリンジェンスイオタ毒素、ジフテリア毒素（ＤＴ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、百日咳毒素（ＰＴ）、炭疽菌毒素、および百日咳アデニル酸シクラーゼ（ＣＹＡ）を含むいくつかの細菌毒素は、ペプチドを、内部またはアミノ末端融合として細胞の細胞基質に送達する試みにおいて使用されてきた（Ａｒｏｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３３３４ ３３４１、Ｐｅｒｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：５１４７ ５１５６（１９９３）、Ｓｔｅｎｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１３：１０２５ １０３２（１９９１）、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３５３０ ３５３４、Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｂｓｔｒ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９５：２９５、Ｓｅｂｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：３８５１ ３８５７、Ｋｌｉｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０２７７ １０２８１、およびＮｏｖａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７１８６ １７１９３）。

【0125】

エフェクターは、免疫リポソーム等のリポソームおよびリポソーム誘導体を介して、動物細胞、好ましくは哺乳類細胞内にも導入され得る。用語「リポソーム」は、水相を封入する１つ以上の同心状に規則正しく並べられた脂質２重層から構成される小胞を指す。水相は、典型的には、細胞に送達される化合物を含み、この場合は、エフェクターである。リポソームは、原形質膜と融合し、それによりエフェクターを細胞基質内に放出する。あるいは、リポソームは、貪食されるか、または輸送小胞の細胞によって取り込まれる。一旦エンドソームまたはファゴソームに入ると、リポソームは、分解するか、または輸送小胞の膜と融合し、その内容物を放出するかのいずれかである。

【0126】

本発明は、特に、植物および農業技術の分野に関する。一態様では、本発明は、植物細胞における標的遺伝子の発現を調節するための方法を目的とし、この方法は、本発明により修飾されたポリペプチドを有する植物細胞を提供することを含み、該ポリペプチドは、標的遺伝子内の標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を特異的に認識することが可能であり、該ポリペプチドが該標的ヌクレオチド配列を認識し、特異的にそれに結合することを可能にし、それにより該植物細胞内の該標的遺伝子の発現が調節される。

【0127】

ポリペプチドは、当該技術分野において既知の任意の好適な方法を介して植物細胞に提供され得る。例えば、タンパク質は植物細胞に外因的に付加することができ、植物細胞は、ポリペプチドが植物細胞内に導入され、標的ヌクレオチド配列に結合し、植物細胞における標的遺伝子の発現を調節するような条件下で維持される。あるいは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡは、植物細胞において発現され得、植物細胞は、発現されたポリペプチドが標的ヌクレオチド配列に結合し、植物細胞における標的遺伝子の発現を調節するような条件下で維持される。

【0128】

植物細胞における標的遺伝子の発現を調節するための好ましい方法は、以下の工程を含む：ａ）本発明により修飾されたポリペプチドの発現系を有する植物細胞を提供することであって、該ポリペプチドは、標的遺伝子、好ましくはプロモーターの発現制御要素内の標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を特異的に認識し、好ましくはそれに結合することができる工程、およびｂ）条件下で該植物細胞を培養することであって、該ポリペプチドが生成され、該標的ヌクレオチド配列に結合し、それにより該植物細胞内の該標的遺伝子の発現が調節される工程。

【0129】

任意の標的ヌクレオチド配列は、本発明の方法によって調節され得る。例えば、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子に対して内因性または外因性であってよい。本発明の実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、生存細胞に存在するかまたはインビトロで存在し得る。特定の実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、植物に対して内因性である。標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子に関して、任意の好適な場所に位置し得る。例えば、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のコード領域の上流または下流であってよい。あるいは、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のコード領域内である。好ましくは、標的ヌクレオチド配列は、遺伝子のプロモーターである。

【0130】

任意の標的遺伝子は、本発明の方法によって調節され得る。例えば、標的遺伝子は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、オリゴ糖、炭水化物、脂質、または小分子の生合成、修飾、細胞輸送、代謝、および分解に影響を及ぼす生成物をコードすることができる。さらに、エフェクターは、病気耐性の増加、構造および貯蔵多糖類の修飾、風味、タンパク質、および脂肪酸、果実成熟、収率、色、栄養上の特性、保存能力の改善等の特質のために植物を操作するために使用され得る。

【0131】

したがって、本発明は、標的細胞内の目的とする遺伝子の発現を変更する方法を提供し、目的とする遺伝子の構造領域および／もしくは調節領域のＤＮＡ配列の少なくとも一部分を決定する（必要である場合）ことと、既知の配列のＤＮＡ上の特定の塩基対を認識するために、本発明により修飾された反復単位を含むポリペプチドを設計することと、該修飾されたポリペプチドを標的細胞に存在させる（好ましくはその核に）こととを含む。（ＤＮＡ配列が既に既知である場合、決定される必要はないことは明らかである。）

【0132】

本発明は、（１）前述のベクターのうちのいずれか、または（２）前述のタンパク質もしくはポリペプチドのうちのいずれかを含むキットも提供する。本発明は、（１）前述のベクターのうちのいずれか、または（２）前述のタンパク質もしくはポリペプチドのうちのいずれか、および（３）本明細書に開示される前述の細胞（修飾された、または未修飾のいずれか）のうちのいずれかを含むキットも提供する。

【0133】

別の実施形態では、本発明は、遺伝的に修飾された生物を生成するために使用され得る、幹細胞において部位特異的変異を生成するために使用されるキットに関する。キットは、典型的には、ＲＴＮ等の１つ以上の部位特異的遺伝操作技術を含む。キットは、部位特異的修飾のための１組以上の幹細胞または胚細胞も含み得る。幹細胞は、精原幹細胞（ＳＳＣ）、ならびにＳＳＣの成長に必要な培地および条件を含むがこれらに限定されない。キットは、これらに限定されないが、レポーター遺伝子または選択可能マーカー等の部位特異的ゲノム導入用の外因性配列を含み得る。キットは、（ｉ）ＲＴＮを幹細胞内に導入する、（ｉｉ）部位特異的に修飾された幹細胞を特定する、（ｉｉｉ）部位特異的に修飾された幹細胞を、必要な培地中または条件下で、および幹細胞が遺伝的に修飾された生物を生成するために必要とされる数に成長させる、（ｉｖ）遺伝的に修飾された生物を生成するために、成長した幹細胞を使用する、（ｖ）どの生物または子孫が目的とする部位特異的変異を保有するかを特定するための説明書を含み得る。

【0134】

いくつかの実施形態では、本発明は、特注であってよい異なるまたは個別の遺伝的に修飾されたＳＳＣの混合集団を含むキットを提供する。遺伝的に修飾されたＳＳＣの混合集団は、単一工程で複数の遺伝的に修飾された生物を生成するために、無精子の雄レシピエント内に直接注入するために好適な量で提供され得る。別個または個別の遺伝的に修飾されたＳＳＣの混合集団は、少なくとも２つの遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも２つの遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも３つの遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも４つの遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも５つの遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも６つの遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも７つの遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも８つの遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも９つの遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも１０の遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも２０の遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも３０の遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも４０の遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも５０の遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも１００の遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも１０００の遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも１万の遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも３万の遺伝的に修飾されたＳＳＣからなり、または生物ゲノムの各遺伝子内に遺伝的修飾を保有する遺伝的に修飾されたＳＳＣと一致してよい。

【0135】

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示される方法のいずれかによって特注され得る異なるもしくは個別の遺伝的に修飾された幹細胞または胚細胞の混合集団を含むキットを提供する。遺伝的に修飾された修飾された幹細胞または胚細胞の混合集団は、単一工程で複数の遺伝的に修飾された生物を生成するために、無精子の雄レシピエント内に直接注入するために好適な量で提供され得る。別個もしくは個別の遺伝的に修飾された幹細胞または胚細胞の混合集団は、少なくとも２つの遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞、少なくとも２つの遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞、少なくとも３つの遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞、少なくとも４つの遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞、少なくとも５つの遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞、少なくとも６つの遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞、少なくとも７つの遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞、少なくとも８つの遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞、少なくとも９つの遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞、少なくとも１０の遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞、少なくとも２０の遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞、少なくとも３０の遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも４０の遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞、少なくとも５０の遺伝的に修飾されたＳＳＣ、少なくとも１００の遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞、少なくとも１０００の遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞、少なくとも１万の遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞、少なくとも３万の遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞からなり、または生物ゲノムの各遺伝子内に遺伝的修飾を保有する遺伝的に修飾された幹細胞もしくは胚細胞と一致してよい。

【0136】

いくつかの実施形態では、本発明は、部位特異的修飾のための１組以上の幹細胞もしくは胚細胞またはＳＳＣを含むキットを提供する。複数組のＳＳＣは、異なる病気状態を有する十分に特徴付けされた生物に由来し得る。ＳＳＣは、遺伝的修飾もしくは天然に由来し得る、または任意の方法による複数の変異を含み得る。キットは、病気状態のＳＳＣを成長させる培地および条件、ならびに遺伝的に修飾された生物を生成するための無精子の雄レシピエントを含み得る。

【0137】

いくつかの実施形態では、本発明は、生物または組織試料からＳＳＣ系を得るために必要なツール、ならびに得たＳＳＣを遺伝的に修飾し、得たＳＳＣから遺伝的に修飾された生物を生成するために必要なツールを含むキットを提供する。キットは、採取用の精母細胞等の細胞収集ツール、およびラミニン選択等のＳＳＣ選択ツール、およびＳＳＣ繁殖および冷凍保存ツール、ならびに細胞表面マーカー染色を含み得るＳＳＣ検証ツールを含み得る。キットは、ＳＳＣを成長させるための培地および条件、ＳＳＣを遺伝的に修飾するためのツール、ならびにＳＳＣから遺伝的に修飾された生物を生成するための無精子の雄レシピエントも含み得る。

【0138】

いくつかの実施形態では、本発明は、誘発された多能性幹（ｉＰＳ）細胞から生成されたＳＳＣを含むキットを提供する。ｉＰＳ細胞は、病気状態を含む十分に特徴付けされた異なる遺伝的背景ならびに局所、株、民族遺伝的背景に由来し得る。キットは、ｉＰＳを成長させるための培地および条件、ｉＰＳを遺伝的に修飾するためのツール、ならびにｉＰＳから遺伝的に修飾された生物を生成するための無精子の雄レシピエントも含み得る。

【0139】

トランスジェニック動物または修飾された細胞の形質転換および生成のためのさらなる方法は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３８４６５号に見出され、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる。

【0140】

本発明の一態様は、融合タンパク質を標的細胞に送達するための方法に関し、融合タンパク質はエフェクタータンパク質を含む。本発明の融合タンパク質の作製は、１つ以上のポリペプチド成分を培地から単離し、引き続き、１つのポリペプチド成分の遊離アミノ末端を第２のポリペプチド成分のカルボキシ末端に結合することを伴う。他の実施形態では、融合タンパク質は、簡単なポリペプチド合成により作製される、および／または核酸配列の発現ベクター内へのクローニングを通して発現される。本発明の発現構築物を発現する細胞に基づく組換え系からタンパク質を精製する場合、当業者は、そのような発現構築物がタンパク質生成のために細菌宿主細胞内に形質転換される場合に採用される任意の特定のＩＩＩ型分泌系に関して容易に決定することができる適合性分泌シグナルを特定することができる。ＩＩＩ型分泌系によって通常分泌されるタンパク質を特定することにより、分泌系によって通常分泌される完全長タンパク質の様々な断片を欠落する欠失変異体を調製することが可能である。発現された様々な欠失断片のエピトープ（すなわち、Ｎ末端エピトープ、Ｃ末端エピトープ等）に対して産生された標識された抗体を使用することにより、分泌された欠失変異体および分泌されないものを特定することが可能である。よって、完全長タンパク質の分泌に必要なタンパク質ドメインは、容易に特定することができる。タンパク質ドメインが特定され、配列決定されたら、それらは、本発明の融合タンパク質の分泌シグナルとして利用することができる。

【0141】

典型的には、分泌シグナルは、特定のＩＩＩ型分泌系によって通常分泌されるタンパク質のＮ末端ドメイン、例えば、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）のＤｓｐＥタンパク質のＮ末端ドメインからの２０１アミノ酸配列である（例えば、１９９９年７月９日に出願された米国特許出願第０９／３５０，８５２号を参照、参照により本明細書に組み込まれる）。エルウィニア・アミロボーラＤｓｐＥの２０１アミノ酸分泌シグナルは、エルウィニア・アミロボーラのｈａφｉｎ分泌系に適合する。様々なＩＩＩ型分泌系に適合する他の分泌シグナルが当該技術分野において記載されており、他が絶えず特定されている。

【0142】

精製されたエフェクタータンパク質は、いくつかの方法によって得ることができる。タンパク質またはポリペプチドは、好ましくは、従来の技法により、精製された形態（少なくとも約８０％、９０％の純度）で生成される。組換え宿主細胞はＩＩＩ型分泌系を発現するため、タンパク質またはポリペプチドは、組換え宿主細胞の成長培地内に分泌される。そのような場合、タンパク質を単離するために、組換え宿主細胞を増殖させ、分泌されたタンパク質またはポリペプチドを含む上清から細胞成分を分離するために成長培地を遠心分離し、上清を除去する。次いで、上清は、連続硫酸アンモニウム沈殿を受ける。ポリペプチドまたはタンパク質を含む画分は、タンパク質を分離するために、適切に寸法決定されたデキストランまたはポリアクリルアミドカラムにおいてゲル濾過を受ける。必要であれば、タンパク質の画分はＨＰＬＣによりさらに精製され得る。

【0143】

タンパク質形質導入ドメインを坦持するエフェクタータンパク質は、組換え大腸菌細胞から多量の精製されたタンパク質を調製するために現在の最先端技術を使用することにより、ＩＩＩ型分泌系とは関係なく調製することもできる。そのような技術は、大腸菌可溶化物から組換えタンパク質の一工程親和性精製のために、Ｈｉｓ６等の強い誘発性プロモーターおよびペプチドタグを採用する。

【0144】

一実施形態では、標的細胞は、真核生物細胞である。真核生物細胞は、ＨｅＬａ細胞等の組織培養、または腹腔内注射を介してマウスに送達されるもの等の動物全体におけるものを含む（Ｓｃｈｗａｒｚｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：Ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｔｏ ａｌｌ Ｃｅｌｌｓ？”Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：２９０−２９５（２０００）、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0145】

本発明の一態様では、本発明のＤＮＡ結合または認識要素は、選択のＤＮＡ標的配列に結合するアミノ酸の鎖を作製するためにモジュラー様式で一緒に融合され得る。本発明の別の態様では、１つ以上のＤＮＡ結合認識要素は、１つ以上のエフェクタータンパク質に結合され得る。エフェクタータンパク質は、細菌植物病原体、動物病原体、または根圏細菌（腸管病原性の大腸菌、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シゲラ菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）、エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、エルウィニア・アミロボーラ、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、およびシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含むが、これらに限定されない）により生成され得る。好適なエフェクタータンパク質は、過敏性応答誘導因子、弱毒性タンパク質、過敏性応答および病原性依存外膜タンパク質、毒性タンパク質、および病原性タンパク質を含む。エフェクタータンパク質の例としては、ＨｏｐＰｓｙＡ ＡＡＦ７１４８１（Ｐ．シリンゲ）、ＨｏｐＰｔｏＡ ＡＦ２３２００６（Ｐ．シリンゲ）、Ｔｉｒ ＢＡＡ９６８１５（大腸菌）、ＥｘｏＳ ＡＡＧ０７２２８（Ｐ．エルギノーサ）、ＥｘｏＴ ＡＡＧ０３４３４（Ｐ．エルギノーサ）、ＥｘｏＹ ＡＡＧ０５５７９（Ｐ．エルギノーサ）、ＳｏｐＥ ＡＡＣ０２０７１（Ｓ．ティフィムリウム）、ＳｏｐＢ ＡＡＦ２１０５７（ＳｉｇＡ）（Ｓ．ティフィムリウム）、ＳｉｐＡ ＣＡＡ６３３０２（Ｓ．ティフィムリウム）、ＳｐｔＰ ＡＡＣ４４３４９（Ｓ．ティフィムリウム）、ＩｐａＢ Ａ３４９６５（シゲラ菌）、ＩｐａＡ ＡＡＡ２６５２５（シゲラ菌）、ＩｐａＤ ＳＩ ５５７９（シゲラ菌）、ＹｏｐＥ ＳＩ ４２４２（エルシニア菌）、ＹｏｐＨ ＡＡＣ６９７６８（エルシニア菌）、ＹｐｋＡ ＡＡＣ６９７６５（エルシニア菌）、ＹｏｐＪ ＡＡＣ６９７６６（ＹｏｐＰ）（エルシニア菌）、ＡｖｒＰｔｏ ＡＡＡ２５７２８（Ｐ．シリンゲ）、ＡｖｒＢｓ２ ＡＡＤ １ １４３４（Ｘ．カンペストリス）、およびＡｖｒＢｓ３ ＣＡＡ３４２５７（Ｘ．カンペストリス）が挙げられる（例えば、Ｇａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｍａｃｈｉｎｅｓ：Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｔｏ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１３２２−１３２８（１９９９）を参照、参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、エフェクタータンパク質は、標的細胞に異種である（すなわち、通常存在しない）。

【0146】

本発明の目的に従い、本明細書に具体化され、広範に記載されるように、本発明は、多能性細胞、全能性細胞、体性幹細胞、精原幹細胞（ＳＳＣ）、胚幹（ＥＳ）細胞、誘発性多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚芽、生殖細胞、原始性生殖細胞（ＰＧＣ）、植物管細胞、花粉細胞、および胞子を含むが、これらに限定されない幹細胞および生殖体のＲＴＮを使用した部位特異的遺伝操作のための方法に関する。幹細胞の部位特異的操作の方法は、部位特異的ＤＮＡ結合およびＲＴＮ等の切断タンパク質の使用を含むが、これらに限定されない。

【0147】

幹細胞の部位特異的操作は、遺伝子（複数可）または遺伝子生成物（複数可）の機能の変更、および遺伝的に修飾された生物をもたらし、細胞または組織培養モデルは、これらの操作された幹細胞から生成される。修飾された幹細胞および生物は、ノックアウトおよびノックイン細胞および生物を含む。

【0148】

別の態様では、本発明は、ラット、マウス、ブタ、ウサギ、モルモット、イヌ、非ヒト霊長類、ミニブタを含む哺乳類、ならびにトウモロコシ、大豆、米、ジャガイモ、小麦、タバコ、トマト、およびアラビドプシス、を含むが、これらに限定されない植物、ならびにそのような生物の子孫および祖先を含むがこれらに限定されない、ＲＴＮを使用して、部位特異的操作によって作製された遺伝的に修飾された生物に関する。

【0149】

別の実施形態では、本発明は、遺伝的に修飾された生物を生成するために使用され得る、幹細胞において部位特異的変異を生成するために使用されるキットを提供する。キットは、典型的には、ＲＴＮ等の１つ以上の部位特異的遺伝操作技術を含む。キットは、部位特異的修飾のための１組以上の幹細胞も含み得る。本発明のいくつかの実施形態では、幹細胞は、これらに限定されないが、精原幹細胞（ＳＳＣ）、ならびにＳＳＣの成長のために必要な培地および条件を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、これらに限定されないが、レポーター遺伝子または選択可能マーカー等の部位特異的ゲノム導入用の外因性配列を含む。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ＲＴＮ（またはＲＴＮをコードする核酸配列）を幹細胞に導入する、（ｉｉ）ＸＴＮによって部位特異的に修飾された幹細胞を特定する、（ｉｉｉ）部位特異的に修飾された幹細胞を、必要な培地中もしくは条件下で、および幹細胞が遺伝的に修飾された生物を生成する、または動物における生殖系列伝達をもたらすために必要とされる数に成長させる、（ｉｖ）遺伝的に修飾された生物を生成するために、成長した幹細胞を使用する、もしくは移植する、および／または（ｖ）どの生物または子孫が目的とする部位特異的変異を含むかを特定するための説明書を含む。本発明のいくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の幹細胞、または１つ以上の胚芽を含み、１つ以上の幹細胞、または１つ以上の胚芽は、以下の変異のうちの１つ以上を含む：（ｉ）欠失変異、（ｉｉ）ノックアウト変異、および／または（ｉｉｉ）異種核酸配列の付加。（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）のうちの１つ以上の変異は、ＲＴＮによって生じた部位特異的変異である。

【0150】

本発明のいくつかの実施形態では、異種核酸配列は、選択可能マーカーまたはオルソロガス遺伝子から選択される。本発明のいくつかの実施形態では、１つ以上の幹細胞は、精原幹細胞（ＳＳＣ）、胚性幹細胞、または誘発された多能性幹細胞から選択される。

【0151】

本発明のいくつかの実施形態では、１つ以上の幹細胞は、動物または植物の生殖系列の系統に由来する。本発明のいくつかの実施形態では、１つ以上の幹細胞または１つ以上の胚芽は、トランスポゾンまたはそのバリアントの少なくとも１つの逆方向タンデム反復をさらに含む。

【0152】

本発明のいくつかの実施形態では、１つ以上の幹細胞は、体性幹細胞である。本発明のいくつかの実施形態では、生物は１つ以上の幹細胞を含み、１つ以上の幹細胞は、以下の変異のうちの１つ以上を含む：（ｉ）欠失変異、（ｉｉ）ノックアウト変異、および／または（ｉｉｉ）異種核酸配列の付加。（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）のうちの１つ以上の変異は、ＲＴＮによって生じた部位特異的変異である。本発明のいくつかの実施形態では、１つ以上の幹細胞は、ＳＳＣを含む。

【0153】

本発明において、エフェクタータンパク質は、融合タンパク質を生成するために、本明細書に開示される少なくとも１つのＤＮＡ認識要素、またはその誘導体もしくは機能類似体と融合する。

【0154】

本発明の一態様は、エフェクタータンパク質を標的細胞内に送達するための方法に関する。この方法は、標的細胞内に、該標的ＤＮＡまたはその誘導体もしくは機能類似体を認識する本発明の少なくとも１つの反復ドメインまたはＤＮＡ認識要素を含むポリペプチドに融合するエフェクタータンパク質を導入することを伴う。本発明の別の態様は、エフェクタータンパク質をコードする第１のＤＮＡ分子と、第１のＤＮＡ分子と動作可能に関連し、該標的ＤＮＡまたはその誘導体もしくは機能類似体を認識する本発明の少なくとも１つの反復ドメインを含むポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ分子とを含むＤＮＡ構築物に関する。

【0155】

本発明の方法は、エフェクタータンパク質の細胞、特に哺乳類細胞への効率的な送達を可能にする。この方法は、医薬品、殺虫剤、殺真菌剤、除草剤、および他の用途における使用のためのエフェクタータンパク質の送達も可能にする。特に、本発明は、タンパク質療法の形態でエフェクタータンパク質の患者への送達を可能にする。生物学的に活性な完全長タンパク質を用いた療法は、それらの標的にそれらのタンパク質の組込み型進化的特異性へのアクセスを可能にし、それにより小分子療法において時折見られる非特異的作用を潜在的に回避する。さらに、組織特異的ウイルスベクターと併用される場合、本発明の使用は、エフェクタータンパク質の特定の細胞への標的送達を可能にし、最初の標的後にエフェクタータンパク質の二次的な再分布利益を追加する。このアプローチの前例は、ＶＰ２２タンパク質形質導入ドメインがｐ５３腫瘍抑制因子タンパク質に融合される実験において見出すことができる（Ｐｈｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐ５３ ｂｙ ｔｈｅ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＶＰ２２，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４４０−４４３（１９９８）、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0156】

いくつかの実施形態では、本発明は、挿入された核酸配列を有する１つ以上の核酸配列を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、挿入された核酸は、細胞内の条件下で発現することが可能であるコード配列、例えば、ゲノムが本明細書に記載されるポリペプチドのうちのいずれかに結合し、後のその作用によって修飾される標的細胞の細胞内環境において発現するために必要とされる任意の必須発現調節要素と組み合わせたコード配列である、少なくとも１つの転写活性遺伝子を含む。核酸の転写活性遺伝子は、ヌクレオチドのドメイン、すなわち、必須転写媒介または調節要素（複数可）と動作可能に連結されるヌクレオチドのコード配列を含む発現モジュールを含み得る。発現モジュールに存在し得る必須転写媒介要素は、プロモーター、エンハンサー、停止およびポリアデニル化シグナル要素、スプライシングシグナル要素等を含むが、これらに限定されない。本発明のいくつかの実施形態では、１つ以上の幹細胞は、トランスポゾンまたはそのバリアントの少なくとも１つの逆方向末端反復をさらに含む。

【0157】

いくつかの実施形態では、発現モジュールは、広範な宿主範囲において遺伝子の発現を提供する転写調節要素を含む。様々なそのような組み合わせが既知であり、特定の転写調節要素は、ＳＶ４０要素、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲに由来する転写調節要素、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＬＴＲに由来する転写調節要素、ｈｓｐ７０プロモーター等を含むが、これらに限定されない。

【0158】

いくつかの実施形態では、挿入された核酸に存在する少なくとも１つの転写活性遺伝子または発現モジュールは、選択可能マーカーとして機能する。様々な異なる遺伝子が選択可能マーカーとして採用されており、選択可能マーカーとして本明細書に記載されるベクターにおいて採用される特定の遺伝子は、主に便宜上選択される。既知の選択可能マーカー遺伝子は、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスポリボシル（ｐｈｏｓｐｏｒｉｂｏｓｙｌ）トランスフェラーゼ遺伝子、ＣＡＤ、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アスパラギンシンセターゼ遺伝子、多くの抗生物質耐性遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン等）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および発現が、直接的または間接的のいずれかで、例えばβ−ガラクトシターゼ、ＧＦＰ等の検出可能生成物の存在を提供する遺伝子を含むが、これらに限定されない。

【0159】

いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、最低１つの転写活性遺伝子を含み、核酸の一部分は、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位、例えば、外因性核酸の挿入のための部位として機能する制限部位も含む。様々な制限部位が当該技術分野において既知であり、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ等を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ベクターは、ポリリンカー、すなわち、本明細書に開示されるもの等の複数の異なる制限酵素によって認識される、近接して整列される一連の、または数々の部位を含む。他の実施形態では、挿入された外因性核酸は、それぞれ、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＰｈｉＣ３１リコンビナーゼによって認識されるＬｏｘＰ、ＦＲＴ、またはＡｔｔＢ／ＡｔｔＰ部位等のリコンビナーゼ認識部位を含み得る。

【0160】

別の態様では、本発明は、選択されたヌクレオチド配列の結合に特異的なポリペプチドをコードする核酸を生成するための方法に関し、（１）スタータープラスミドをＰｓｐＸｌまたはヌクレアーゼで直線化することであって、スタータープラスミドが、選択されたヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドに特異的なＲＶＤを含む第１のモノマーをコードするヌクレオチド配列を含み、第１のモノマーが、３’端に固有のＰｓｐＸｌまたはヌクレアーゼ部位を有することと、（２）スタータープラスミドＰｓｐＸｌ部位内に、選択されたヌクレオチド配列の次のヌクレオチド（複数可）に特異的なＲＶＤを含む１つ以上のモノマーをコードするＤＮＡモジュールを結合することであって、ＤＮＡモジュールが、Ｘｈｏｌ粘着末端を有することと、（３）核酸が選択されたヌクレオチド配列に結合することが可能なポリペプチドをコードするまで工程（１）および（２）を繰り返すこととを含む。本方法は、結合後、ＰｓｐＸｌ部位またはヌクレアーゼ部位のＤＮＡモジュールの配向を決定することをさらに含み得る。本方法は、１〜３０回、工程（１）および（２）を繰り返すことを含み得る。

【0161】

ＤＮＡ結合ドメインの供給源が本発明のポリペプチドをコードする核酸である場合、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸は、一般に、追加要素が必要に応じてトランスポサーゼの発現を提供する、上述の発現モジュールの一部である。

【0162】

いくつかの実施形態では、多細胞性生物は、本明細書に開示される組成物によって変異誘発（ｍｙｔｏｇｅｎｉｚｅｄ）された細胞を使用して作製され得る。いくつかの実施形態では、多細胞性または単細胞性生物は、植物または動物である。いくつかの実施形態では、多細胞性または単細胞性生物は、脊椎動物である。いくつかの実施形態では、脊椎動物は、例えば、ゲッ齒類（マウスまたはラット）、家畜（ブタ、ウマ、ウシ等）、ペット（イヌまたはネコ）、および例えばヒト等の霊長類等の哺乳類である。

【0163】

本明細書に記載される方法は、外因性核酸を標的細胞のゲノム内に導入し、安定して組み込むことが望ましい様々な用途において使用され得る。外因性核酸を標的細胞内に組み込むインビボ方法は既知である。核酸結合系の多細胞性または単細胞性生物への投与経路は、投与形式の共通の特徴が核酸結合系成分の標的細胞（複数可）へのインビボ送達を提供することである、系成分を保持するベクターの性質、送達ビヒクルの性質、多細胞性または単細胞性生物の性質等を含むいくつかのパラメータに依存する。ある特定の実施形態では、プラスミド等の直鎖状または環状化ＤＮＡが、核酸結合系を標的細胞に送達するためのベクターとして採用される。そのような実施形態では、プラスミドは、生理食塩水溶液等の水性送達ビヒクルにおいて投与され得る。あるいは、多細胞性または単細胞性生物におけるベクターの分布を調節する薬剤が採用され得る。例えば、対象の系成分を含むベクターがプラスミドベクターである場合、リポソーム等の脂質系ビヒクルが採用され、脂質系ビヒクルは、ベクターの細胞または組織特異的送達のための特定の細胞型を標的とし得る。交互に、ポリリシン系ペプチドが、担体等として採用され得、これは、標的部分により修飾されても、修飾されなくてもよい（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９８，８０，１３７−４７、およびＭｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１９９８，１，５５−６２）。系成分は、アデノウイルス由来ベクター、シンドビスウイルス由来ベクター、レトロウイルス由来ベクター、ハイブリッドベクター等のウイルスベクター上に組み込むこともできる。上記のベクターおよび送達ビヒクルは、単に例示である。核酸結合系の多細胞性または単細胞性生物および標的細胞へのインビボ投与を提供する限り、任意のベクター／送達ビヒクルの組み合わせを採用することができる。

【0164】

核酸結合要素を含むベクター核酸の量、および多くの実施形態において、細胞内に導入されるポリペプチドをコードするベクター核酸の量は、核酸結合核酸の標的細胞ゲノム内への所望の切除および挿入を提供するのに十分である。そのため、導入されるベクター核酸の量は、十分な量のＤＮＡ結合活性、および標的細胞内に挿入されることが望ましい十分なコピー数の核酸を提供するはずである。標的細胞内に導入されるベクター核酸の量は、採用される特定のインビボ投与プロトコル等の、採用される特定の導入プロトコルの効率により変動する。

【0165】

多細胞性または単細胞性生物に投与される系の各成分の特定の投与量は、核酸結合核酸の性質、例えば、発現モジュールおよび遺伝子の性質、成分要素が存在するベクターの性質、送達ビヒクルの性質等により変動する。投与量は、当業者により経験的に容易に決定され得る。例えば、マウスにおいて、核酸結合系成分が生理食塩水溶液ビヒクルにおいて哺乳類に静脈内投与される別個のプラスミド上に存在する場合、投与される核酸結合プラスミドの量は、多くの実施形態では、典型的には、約０．５〜４０μｇの範囲であり、典型的には、約２５μｇであり、一方、投与されるプラスミドをコードする核酸結合系の量は、典型的には、約０．５〜２５μｇの範囲であり、通常約１μｇである。

【0166】

対象の方法は、様々な大きさの核酸に結合し、作用するように使用され得る。一般に、対象の方法を使用して標的細胞ゲノム内に挿入されるＤＮＡの大きさは、約０．５ｋｂ〜１００．０ｋｂ、通常約１．０ｋｂ〜約６０．０ｋｂ、または約１．０ｋｂ〜約１０．０ｋｂの範囲である。

【0167】

本発明は、例えば、ラット、マウス、もしくは他の脊椎動物の生殖系列変異誘発、ラット、マウス、もしくは他の脊椎動物の体性変異誘発、ラット、マウス、もしくは他の脊椎動物の遺伝子組換え、およびヒト遺伝子療法の使用において使用され得る。これらの各々において、組成物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質として送達され得る。

【0168】

宿主細胞のＤＮＡ内に挿入されたＤＮＡを含むもの等の、形質転換された細胞および／またはトランスジェニック生物は、選択可能マーカーが導入されたＤＮＡ配列の一部として含まれる場合、形質転換されない細胞および／または形質転換された生物から選択され得る。選択可能マーカーは、例えば、抗生物質耐性を提供する遺伝子、変更された目に見える表現型を生成するために、例えば緑色蛍光タンパク質等の宿主の生理機能を修飾する遺伝子を含む。これらの遺伝子を含む細胞および／または生物は、形質転換されない細胞／生物を死滅させる抗生物質、殺虫剤、または除草剤濃縮物の存在下で生存するか、または変更された目に見える表現型を生成することが可能である。この分野に詳しい者に既知の標準的な技法、例えば、サザンブロットおよびポリメラーゼ連鎖反応等の技法を使用して、ＤＮＡは、導入されたＤＮＡが挿入されたかを確認するためにトランスジェニック細胞および／または生物から単離され得る。

【0169】

本明細書に開示される発明がより効率的に理解され得るために、以下に例が提供される。これらの例は単に例示目的のためであり、本発明を決して制限すると解釈されるものではないことを理解するべきである。これらの例を通して、分子クローニング反応、および他の標準的な組換えＤＮＡ技法は、別途記載される場合を除き、市販の試薬を使用して、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載される方法により実行された。

【0170】

本発明の他の態様では、本発明は、本明細書に開示されるいずれか１つ、または２つ以上の核酸配列を含むウイルスベクターに関する。ウイルスベクターは、任意に、本明細書に記載されるレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、スプーマウイルス、レンチウイルスベクター、およびプラスミド、またはトランスポゾン等の他のベクターを含む群から選択される。レトロウイルスベクターは、任意に、オンコレトロウイルスベクターを含む。レトロウイルスベクターは、任意に、レンチウイルスベクターを含む。

【0171】

本明細書は、細胞における分子の発現がコード核酸分子によってコードされるポリペプチドの生物学的活性をそれらの細胞に提供するように、ＲＴＮコード核酸分子を対象に提供するための組成物および方法を含む。本明細書で使用されるコード核酸は、対応するラルストニアアミノ酸配列のＲＴＮアミノ酸配列またはその一部分を特定するヌクレオチドを含む核酸を意味する。コード配列は、開始コドンおよび／または停止配列を含み得る。

【0172】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、薬学的組成物である。疾患、障害、または異常な身体的状態を有する患者を治療するために使用される本明細書の薬学的組成物は、許容可能な担体、助剤、または賦形剤を含み得る。

【0173】

薬学的組成物は、任意に、電気穿孔、ＤＮＡ微量注入法、リポソームＤＮＡ送達、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、セムリキ森林ウイルスを含むＲＮＡまたはＤＮＡゲノムを有するウイルスベクター等のエクスビボおよびインビボ法により投与される。これらのベクターの誘導体またはハイブリッドも有用である。

【0174】

投与される投与量は、患者の必要性、所望の作用、および選択された投与経路に依存する。発現カセットは、任意に、リポソームまたはＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスベクター等のエクスビボまたはインビボ送達ビヒクルを使用して、細胞またはそれらの前駆体内に導入される。それらはまた、任意に、微量注入法または共沈等の化学方法等の物理的技法を使用してこれらの細胞内に導入される。薬学的組成物は、典型的には、患者に投与される薬学的に許容される組成物を調製するための、および有効量の核酸分子が薬学的に許容されるビヒクルを含む混合物において組み合わされるように既知の方法によって調製される。好適なビヒクルは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ＵＳＡ）に記載されている。任意の選択可能なマーカー遺伝子が本発明において使用され得る。

【0175】

これに基づき、薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤と関連して、ならびに適切なｐＨ、および生理学的流体と等張の緩衝溶液に含まれる核酸分子等の活性化合物または物質を含み得る。発現カセットをビヒクルと混合する、またはそれらを希釈剤と混合する方法は、当業者に周知である。組成物は、活性化合物を細胞内の特定の部位に輸送するための標的剤を含み得る。発現カセットは、形質転換された細胞を選択するための選択可能マーカー遺伝子も含み得る。選択可能マーカー遺伝子は、形質転換された細胞または組織を選択するために利用される。マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするもの等の抗生物質耐性をコードする遺伝子、ならびにグルホシネ−トアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、および２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）等の除草化合物に耐性を付与する遺伝子を含む。さらなる選択可能マーカーは、．β．−ガラクトシターゼ、ならびに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｓｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８５：６１０−９およびＦｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６：２１５−２８）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＹＰ）（Ｂｏｌｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１７：９４３−５４およびＫａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２９：９１３−４２）、および黄色蛍光タンパク質（ＥｖｒｏｇｅｎのＰｈｉＹＦＰ．ＴＭ．、Ｂｏｌｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１７：９４３−５４を参照）等の蛍光タンパク質等の表現型マーカーを含む。さらなる選択可能マーカーに関しては、一般には、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ３：５０６−５１１、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６３１４−６３１８、Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：６３−７２、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２４１９−２４２２、Ｂａｒｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８０）ｉｎ Ｔｈｅ Ｏｐｅｒｏｎ，ｐｐ．１７７−２２０、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：５５５−５６６、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９：６０３−６１２、Ｆｉｇｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ ５２：７１３−７２２、Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４００−５４０４、Ｆｕｅｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２５４９−２５５３、Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４８０−４８３、Ｇｏｓｓｅｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｒｅｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１９１７−１９２１、Ｌａｂｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−３３５６、Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９５２−３９５６、Ｂａｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５０７２−５０７６、Ｗｙｂｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４６４７−４６５３、Ｈｉｌｌｅｎａｎｄ−Ｗｉｓｓｍａｎ（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１０：１４３−１６２、Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：１５９１−１５９５、Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１０９４−１１０４、Ｂｏｎｉｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１、Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：９１３−９１９、Ｈｌａｖｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７２１−７２４を参照。そのような開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0176】

多くの植物形質転換ベクターおよび植物を形質転換するための方法が利用可能である。例えば、Ａｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｐｙｓｉｏｌ．，８１：３０１−３０５、Ｆｒｙ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．６：３２１−３２５、Ｂｌｏｃｋ，Ｍ．（１９８８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．７６：７６７−７７４、Ｈｉｎｃｈｅｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｔａｄｌｅｒ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｍｐ．２０３２１２．２０３−２１２、Ｃｏｕｓｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８：４８１−４９４、Ｃｈｅｅ，Ｐ．Ｐ．ａｎｄ Ｓｌｉｇｈｔｏｍ，Ｊ．Ｌ．（１９９２）Ｇｅｎｅ．１１８：２５５−２６０、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２３９−２４６、Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：３０９−３１４、Ｄｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９９：８１−８８、Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１２１２−１１２１６、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．（１９９３）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ｐｌａｎｔ；２９Ｐ：１１９−１２４、Ｄａｖｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２：１８０−１８３、Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｍｃｈｕｇｈｅｎ，Ａ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９１：１３９−１４８、Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｃ．Ｉ．ａｎｄ Ｔｒｉｅｕ，Ｔ．Ｎ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１６７、Ｇｏｌｏｖｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９０：４１−５２、Ｇｕｏ Ｃｈｉｎ Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．３８：２０７２−２０７８、Ａｓａｎｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３、Ａｙｅｒｅｓ Ｎ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｄ．（１９９４）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｓｃｉ．１３：２１９−２３９、Ｂａｒｃｅｌｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：５８３−５９２、Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：２９９−３０７、Ｂｏｒｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｃｔａ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ．１６：２２５−２３０、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．（１９９４）Ａｇｒｏ．Ｆｏｏｄ．Ｉｎｄ．Ｈｉ Ｔｅｃｈ．５：１７−２７、Ｅａｐｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３：５８２−５８６、Ｈａｒｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：９１９９２３、Ｒｉｔａｌａ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３１７−３２５、およびＷａｎ，Ｙ．Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｍａｕｘ，Ｐ．Ｇ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：３７４８を参照。

【0177】

本発明の方法は、ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド構築物を宿主細胞内に導入することを伴う。「導入」とは、構築物が宿主細胞の内部へのアクセスを獲得するような様式で、ポリヌクレオチド構築物を植物に提示することが意図される。本発明の方法は、ポリヌクレオチド構築物を宿主細胞内に導入するための特定の方法に依存せず、ポリヌクレオチド構築物が宿主の１つの細胞の内部へのアクセスを獲得するのみである。ポリヌクレオチド構築物を細菌、植物、真菌、および動物内に導入するための方法は、当該技術分野において既知であり、安定した形質転換法、一過性の形質転換法、およびウイルス媒介法を含むが、これらに限定されない。

【0178】

「安定した形質転換」とは、植物内に導入されたポリヌクレオチド構築物が宿主のゲノム内に組み込まれ、その子孫によって受け継がれることが可能であることが意図される。「一過性の形質転換」とは、宿主内に導入されたポリヌクレオチド構築物が宿主のゲノム内に組み込まれないことが意図される。

【0179】

本明細書は、細胞内のコード核酸分子の発現がコード核酸分子によってコードされるポリペプチドの生物学的活性または表現型を提供するように、コード核酸分子を個々の細胞に提供するための方法および組成物を含む。本方法は、本明細書の核酸分子を投与することによって、疾患、障害、または異常な身体的状態を有する個人に生物学的に活性なポリペプチドを提供するための方法にも関する。本方法は、エクスビボまたはインビボで行うことができる。遺伝子療法および組成物は、例えば、米国特許第５，８６９，０４０号、同第５，６３９，６４２号、同第５，９２８，２１４号、同第５，９１１，９８３号、同第５，８３０，８８０号、同第５，９１０，４８８号、同第５，８５４，０１９号、同第５，６７２，３４４号、同第５，６４５，８２９号、同第５，７４１，４８６号、同第５，６５６，４６５号、同第５，５４７，９３２号、同第５，５２９，７７４号、同第５，４３６，１４６号、同第５，３９９，３４６号、および同第５，６７０，４８８号、同第５，２４０，８４６号に示される。ポリペプチドの量は、対象の必要性により変動する。ベクターの最適な投与量は、例えば、用量増大により経験的技法を使用して容易に決定することができる（用量増大の例に関しては米国特許第５，９１０，４８８号を参照）。本明細書の核酸分子を含むベクターは、典型的には、以下に記載される技法を使用して、遺伝子療法において、哺乳類、好ましくはヒトに投与される。核酸分子から生成されたポリペプチドは、任意に、哺乳類、好ましくはヒトにも投与される。本明細書は、本明細書のベクターまたは本明細書のベクターを含む細胞を哺乳類に投与することにより、薬物治療を必要とする哺乳類、好ましくはヒトにそれを行う方法に関する。移植片対宿主病等の有害事象を発症するレシピエント、好ましくは、ヒトは、典型的には、本明細書の修飾されたｔｍｐｋ分子の基質であるＡＺＴ等の薬物を投与される。容易に治療される血液疾患または神経性疾患（神経変性）等の疾患は、本明細書において記載され、当該技術分野において既知である（例えば、カナダ特許出願第２，２４６，００５号に記載されるグロビン遺伝子を投与することにより治療されるサラセミアまたは鎌状赤血球貧血等の疾患）。幹細胞移植により治療可能な血液疾患は、白血病、骨髄異形成症候群、幹細胞障害、骨髄増殖性障害、リンパ増殖障害、食細胞障害、遺伝性代謝障害、組織球障害、遺伝性赤血球異常、遺伝性免疫系障害、遺伝性血小板異常、形質細胞障害、悪性病変を含む（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ’ｓ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ Ｄｏｎｏｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎも参照）。神経性幹細胞移植により治療される幹細胞神経疾患は、神経性細胞損傷または損失、例えば、麻痺、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、多発性硬化症）をもたらす疾患を含む。本明細書のベクターは、幹細胞マーカーとして、および幹細胞を分化させる遺伝子を発現する（例えば、成長因子）ために有用である。

【0180】

遺伝子療法に対して様々なアプローチが使用され得る。本出願は、ヒト細胞をヒト内に導入することを含む、ヒトに治療用ポリペプチドを提供するためのプロセスを含み、該ヒト細胞は、その中に本出願のベクターを挿入するためにインビトロまたはエクスビボで処理されており、ヒト細胞は、治療有効量の該治療用ペプチドを該ヒトにおいてインビボで発現する。

【0181】

本方法は、修飾されたＤＮＡコードグロビンを含む遺伝子療法に適したウイルスを生成することにより、組換えウイルスのストックを生成するための方法にも関する。この方法は、好ましくは、ウイルス複製（修飾されたグロビンを含むウイルス）可能な細胞を形質移入し、生成されたウイルスを回収することを伴う。

【0182】

同時形質移入（別個の分子上のＤＮＡおよびマーカー）が採用され得る（例えば、米国特許第５，９２８，９１４号および米国特許第５，８１７，４９２号を参照）。同様に、検出カセットまたはマーカー（緑色蛍光タンパク質マーカーまたは誘導体、ＣＤ１９またはＣＤ２５）がベクター内自体（好ましくはウイルスベクター）に使用され得る。

【0183】

本発明の方法は、これらに限定されないが、半数体、２倍体、３倍体、４倍体、または異数体を含む、任意の真核生物の幹細胞を変異させるために使用され得る。一実施形態では、細胞は、２倍体である。本発明の方法が有利に使用され得る幹細胞は、体性幹細胞、ＳＳＣ、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、胚芽、または１つ以上の生物に発達することが可能な任意の細胞等の幹細胞を含むが、これらに限定されない。

【0184】

一実施形態では、本発明は、部位特異的ノックアウト、ノックイン、ないしは別の方法で遺伝的に修飾された幹細胞を生成するための方法に関する。部位特異的変異は、所望の部位、続いて、ＮＨＥＪを切断し、欠失変異をもたらすＲＴＮを用いて生成される。部位特異的変異は、ヘテロ接合性またはホモ接合性の遺伝的に修飾された生物を生成するために使用される精原幹細胞（ＳＳＣ）において生成され得る。

【0185】

別の実施形態では、本発明は、部位特異的ノックアウト、ノックイン、ないしは別の方法で遺伝的に修飾された幹細胞を生成するための方法に関する。部位特異的変異は、所望の部位を切断し、欠失変異をもたらすＲＴＮを用いて生成される。部位特異的変異は、ヘテロ接合性またはホモ接合性の遺伝的に修飾された生物を生成するために使用される胚性幹（ＥＳ）細胞において生成される。

【0186】

別の実施形態では、本発明は、部位特異的ノックアウト、ノックイン、ないしは別の方法で遺伝的に修飾された幹細胞を生成するための方法からなる。部位特異的変異は、所望の部位を切断し、欠失変異をもたらすＲＴＮを用いて生成される。部位特異的変異は、ヘテロ接合性またはホモ接合性の遺伝的に修飾された生物を生成するために使用される誘発された多能性幹（ｉＰＳ）細胞において生成される。

【0187】

別の実施形態では、本発明は、部位特異的ノックアウト、ノックイン、ないしは別の方法で遺伝的に修飾された幹細胞を生成するための方法からなる。部位特異的変異は、所望の部位を切断し、欠失変異をもたらすＲＴＮを用いて生成される。部位特異的変異は、ヘテロ接合性またはホモ接合性の遺伝的に修飾された生物を生成するために使用される胚芽において生成される。

【0188】

本発明のある特定の実施形態では、細胞は、生物内、または組織外植（例えば、インビボもしくは原位置）において見られるような天然環境内で変異され得る。あるいは、当該技術分野において既知の方法および遺伝子を使用して生物から単離された組織または幹細胞は、本発明の方法により変異され得る。組織または幹細胞は、培養物中で維持されるか（例えば、インビトロ）、または組織もしくは生物内に再移植される（例えば、エクスビボ）。

【0189】

ＲＴＮは、ヌクレアーゼ等のエフェクタータンパク質機能を含む。

【0190】

いくつかの実施形態では、本発明は、実施例２に記載される核酸もしくはポリペプチドまたはこれらの断片のうちのいずれか１つを含む組成物に関する。

【0191】

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される核酸またはポリペプチドのうちのいずれか１つを含む組成物に関する。

【0192】

本発明のいくつかの実施形態では、ＲＴＮを使用したＳＳＣの遺伝修飾は、別個のＳＳＣもしくはＳＳＣ系における複数変異の生成、続いて、別個のＳＳＣもしくはＳＳＣ系の貯蔵または混合、および単一雄レシピエント内への注入に関し、これは、他の系で可能であるよりも少ない実験工程および短い時間フレームで、１つ以上の変異を含む複数の遺伝的に修飾された生物を生成することに関する。別個の幹細胞または幹細胞系は、１５以上であってよい。本発明のいくつかの実施形態では、ＲＴＮを使用した幹細胞の遺伝修飾は、別個の幹細胞もしくは幹細胞系における複数変異の生成、続いて、別個の幹細胞もしくは幹細胞系の貯蔵または混合、および単一雄レシピエント内への注入に関し、これは、他の系で可能であるよりも少ない実験工程および短い時間フレームで、１つ以上の変異を含む複数の遺伝的に修飾された生物を生成することに関する。別個の幹細胞または幹細胞系は、１５以上であってよい。

【0193】

本発明のいくつかの実施形態では、遺伝的に修飾された生物を生成するために使用され得る遺伝的に修飾されたＳＳＣまたは修飾された幹細胞もしくは胚細胞の個別のまたは別個のプールもしくは系の数の増加は、試み、時間、および使用された供給源の量を増加せず、また遺伝的に修飾された生物生成の効率を低減しない。複数の別個のおよび個別の遺伝的に修飾されたＳＳＣは、単一の無精子のレシピエント内に移植され得る。２つ以上のプールから１５以上のプールの別個の細胞プールに由来する個別の遺伝的に修飾された細胞（ＳＳＣまたは幹細胞）の混合集団は、無精子レシピエント内で成熟する。次いで、無精子のレシピエントを、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上であってよい複数の野生型雌と交配させる。これらの多数の雌は、所望の変異をそれらの生殖系列内に組み込んだ子孫を生成する。

【0194】

本発明のいくつかの実施形態では、遺伝的に修飾された生物を生成するために使用され得る遺伝的に修飾された細胞の個別のまたは別個のプールもしくは系の数の増加は、試み、時間、および使用された供給源の量を増加せず、また遺伝的に修飾された生物生成の効率を低減しない。無精子のレシピエントラットは、多数回別個のまたは個別の遺伝的に修飾された細胞のレシピエントであってよい。無精子ラットは、１５匹以上の異なる遺伝的に修飾された細胞のレシピエントであってよく、１５匹以上の別個に遺伝的に修飾された生物を生成するために、２０匹以上の野生型の雌と交配される。最初の交配後、無精子の雄は、最初の遺伝的に修飾された細胞を排除するために処理することができ、別の回の１５匹以上の別個のまたは個別の遺伝的に修飾された細胞のレシピエントとなり、１５匹以上の別個の遺伝的に修飾された生物を生成するために２０匹以上の野生型の雌と交配される。無精子の雄は、１５以上の遺伝的に修飾された細胞の混合集団のレシピエントであってよく、２回以上、３回以上、４回以上、または５回以上、２０以上の野生型の雌と交配される。

【0195】

本発明のいくつかの実施形態では、遺伝的に修飾された生物を生成するために使用され得る遺伝的に修飾された細胞の個別のまたは別個のプールもしくは系の数の増加は、試み、時間、および使用された供給源の量を増加せず、また遺伝的に修飾された生物生成の効率を低減しない。遺伝的に修飾された細胞の数の増加は、試みおよび胚性幹（ＥＳ）細胞または胚芽等の他の細胞系の供給源を必要としない。遺伝的に修飾された生物生成のための遺伝的に修飾されたＥＳ細胞量の増加は、胚盤胞注入等の技術工程の数、ならびに卵管移植手術の数の増加を必要とする。本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、胚盤胞注入、卵管移植、ＤＮＡ微量注入、注入した接合体の再移植、またはキメラ子孫の交配を含まない。細胞系は、単一工程において、遺伝的に修飾された生物生成のために１５以上の別個の遺伝的に修飾された幹細胞集団を生成することができ、一方、１５以上の別個に遺伝的に修飾されたＥＳ細胞を生成するために、１５以上の別個の工程が手順の全てのレベルにおいて行われなければならず、これは、胚盤胞注入、卵管移植、接合体生成、ＤＮＡの調製、ＤＮＡ微量注入、注入した接合体の再移植、またはキメラ子孫の交配を含むが、これらに限定されない。

【0196】

本発明のいくつかの実施形態では、ＲＴＮを用いたＳＳＣの遺伝的修飾は、これらに限定されないが、胚性幹細胞、胚芽、誘発された多能性幹（ｉＰＳ）細胞、体性幹細胞を含む代替えの幹細胞から遺伝的に修飾された生物の生成に必要とされる工程を必要とすることなく、遺伝的に修飾された生物を生成することに関する。代替えの幹細胞における遺伝的修飾は、接合体生成、ＤＮＡの調製、ＤＮＡ微量注入、注入した接合体の再移植、またはキメラ子孫の交配を含むが、これらに限定されない。

【0197】

いくつかの実施形態では、本発明の幹細胞は、１つ以上のトランスポゾン、そのバリアントのトランスポゾンの１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の幹細胞は、１つ以上のトランスポゾン、表２の配列に由来するバリアントのトランスポゾンの１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。

【0198】

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のトランスポゾン、トランスポゾンの１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、変異配列の逆方向タンデム反復は、既知のＩＴＲおよび既知のトランスポゾン要素（表２に示される）に少なくとも７０％相同である。

【0199】

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のトランスポゾン、トランスポゾンの１つ以上の逆方向タンデム反復（ＩＴＲ）を含み、変異配列の逆方向タンデム反復は、既知のＩＴＲおよび既知のトランスポゾン要素（表２に示される）に少なくとも７５％相同である。

【0200】

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のトランスポゾン、トランスポゾンの１つ以上の逆方向タンデム反復（ＩＴＲ）を含み、変異配列の逆方向末端反復は、既知のＩＴＲおよび既知のトランスポゾン要素（表２に示される）に少なくとも８０％相同である。

【0201】

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のトランスポゾン、トランスポゾンの１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、変異配列の逆方向タンデム反復は、既知のＩＴＲおよび既知のトランスポゾン要素（表２に示される）に少なくとも８５％相同である。

【0202】

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のトランスポゾン、トランスポゾンの１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、変異配列の逆方向タンデム反復は、既知のＩＴＲおよび既知のトランスポゾン要素（表２に示される）に少なくとも９０％相同である。

【0203】

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のトランスポゾン、トランスポゾンの１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、変異配列の逆方向タンデム反復は、既知のＩＴＲおよび既知のトランスポゾン要素（表２に示される）に少なくとも９５％相同である。

【0204】

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のトランスポゾン、トランスポゾンの１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、変異配列の逆方向タンデム反復は、既知のＩＴＲおよび既知のトランスポゾン要素（表２に示される）に少なくとも９６％相同である。

【0205】

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のトランスポゾン、トランスポゾンの１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、変異配列の逆方向タンデム反復は、既知のＩＴＲおよび既知のトランスポゾン要素（表２に示される）に少なくとも９７％相同である。

【0206】

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のトランスポゾン、トランスポゾンの１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、変異配列の逆方向タンデム反復は、既知のＩＴＲおよび既知のトランスポゾン要素（表２に示される）に少なくとも９８％相同である。

【0207】

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のトランスポゾン、トランスポゾンの１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、変異配列の逆方向タンデム反復は、既知のＩＴＲおよび既知のトランスポゾン要素（表２に示される）に少なくとも９９％相同である。

【表2】

【0208】

本発明は、本明細書に開示される任意の数の反復単位を有する、本明細書に記載されるポリペプチドのうちのいずれか１つをコードするＤＮＡも含む。

【0209】

本発明の任意のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドをコードする核酸は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０００１５４号（参照によりその全体が組み込まれる）に記載される方法において使用され得る。

【0210】

本発明の態様において、本発明は、本明細書に開示される１つ以上のポリペプチドによって修飾された１つ以上の細胞を含む組成物に関する。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の組成物は、１つ以上の幹細胞を含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に開示される１つ以上のポリペプチドによって修飾された１つ以上の哺乳類の幹細胞を含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に開示される１つ以上のポリペプチドによって修飾された１つ以上のｉＰＳＣ細胞を含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に開示される１つ以上のポリペプチドによって修飾された１つ以上のヒト幹細胞を含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に開示される１つ以上のポリペプチドによって修飾された１つ以上の精原幹細胞を含む。本発明のいくつかの実施形態では、細胞は、哺乳類に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、ラットまたはミニブタからである。本発明のいくつかの実施形態では、哺乳類は、無精子の雄のラット、または無精子の雄のミニブタである。本発明のいくつかの実施形態では、ラットまたはミニブタは、ＤＡＺＬ欠損またはＤＡＺＬ−／−である。本発明のいくつかの実施形態では、本発明は、遺伝的に修飾された生物のコロニーに関し、
少なくとも１つの生物は、１つ以上の幹細胞を含み、１つ以上の幹細胞は、以下の変異のうちの１つ以上：（ｉ）欠失変異、（ｉｉ）ノックアウト変異、および／または（ｉｉｉ）異種核酸配列の付加を含み、（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）のうちの１つ以上の変異は、本明細書に開示される１つ以上のポリペプチド（１つ以上のＲＴＮ）、および（ｂ）下位区分（ａ）の生物の子孫によって生じた部位特異的変異である。

【0211】

本発明のいくつかの実施形態では、細胞またはトランスジェニック動物、そのコロニーまたは子孫は、選択可能マーカーまたはオルソロガス遺伝子を含む異種核酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの生物および子孫は、トランスポゾンまたはそのバリアントの少なくとも１つの逆方向末端反復をさらに含む。

【0212】

本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの生物および子孫は、配列番号１〜１９のうちのいずれか、もしくはもしくはこれらの組み合わせ、または表１の任意の配列、あるいはその任意のバリアントもしくは機能断片に少なくとも７０％相同である核酸配列を含む核酸をさらに含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）動物または植物の生殖系列系統に由来する少なくとも１つの幹細胞を、（ｉ）目的とする遺伝子を変異させる少なくとも１つのＲＴＮ、または（ｉｉ）目的とする遺伝子を変異させるＲＴＮをコードする少なくとも１つの発現ベクターを有する幹細胞と接触させ、それにより目的とする遺伝子に少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの幹細胞を作製することと、（ｂ）目的とする遺伝子に少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの幹細胞のインビトロ培養を拡張することと、（ｃ）工程（ｂ）の培養からの１つ以上の幹細胞を生物内に移植することと、を含む１つ以上の遺伝的に修飾された生物を生成する方法に関する。

【0213】

本発明のいくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）動物または植物の生殖系列系統に由来する少なくとも第１および第２の幹細胞一組を、（ｉ）目的とする遺伝子を変異させる少なくとも１つのＲＴＮ、または（ｉｉ）目的とする遺伝子を変異させるＲＴＮをコードする少なくとも１つの発現ベクターと接触させ、それにより目的とする遺伝子に少なくとも１つの変異を含む少なくとも第１および第２の幹細胞一組を作製することと、（ｂ）目的とする遺伝子に少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの幹細胞のインビトロ培養を拡張することと、（ｃ）工程（ｂ）の培養からの幹細胞の１組以上を生物内に移植することと、を含む１つ以上の遺伝的に修飾された生物を生成する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＴＮによって部位特異的様式で変異された３組、４組、５組、６組、７組、８組、９組、または１０組以上の幹細胞をさらに含み、この場合、３組、４組、５組、６組、７組、８組、９組、または１０組以上の変異された幹細胞のそれぞれを拡張した後に、各組が単一生物内に移植される。いくつかの実施形態では、変異された一組の幹細胞を含む単一生物は、無精子の雄である。

【0214】

本発明のいくつかの実施形態では、生物は、生殖系列伝達により目的とする遺伝子の少なくとも１つの変異を子孫に伝えることが可能である。本発明のいくつかの実施形態では、遺伝的に修飾された生物は、哺乳類である。本発明のいくつかの実施形態では、遺伝的に修飾された生物は、ラットまたはミニブタである。本発明のいくつかの実施形態では、遺伝的に修飾された生物は、無精子の雄のラットまたは無精子の雄のミニブタである。

【0215】

本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、目的とする変異された遺伝子を含む１匹以上の子孫を生成するために、１つ以上の幹細胞を移植された生物を、別の動物と交配することをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明は、変異された幹細胞系の各々に対応する目的とする１つ以上の変異された遺伝子を含む１匹以上の子孫を生成するために、１組以上の幹細胞を移植された生物を別の動物と交配することをさらに含む。

【0216】

本発明のいくつかの実施形態では、子孫は、哺乳類である。

【0217】

本発明のいくつかの実施形態では、遺伝的に修飾された生物のコロニーを交配する方法は、
（ａ）動物または植物の生殖系列系統に由来する少なくとも１つの幹細胞を、（ｉ）目的とする遺伝子を変異させる少なくとも１つのＲＴＮ、または（ｉｉ）目的とする遺伝子を変異させるＲＴＮをコードする少なくとも１つの発現ベクターを有する幹細胞と接触させ、それにより目的とする遺伝子に少なくとも１つの変異を含む幹細胞を作製することと、
（ｂ）目的とする遺伝子に少なくとも１つの変異を含む幹細胞のインビトロ培養を拡張することと、
（ｃ）工程（ｂ）の培養からの目的とする遺伝子に少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの幹細胞を、第１の生物に移植することと、
（ｄ）第１の生物を、同じ種の第２の生物と交配することと、
（ｅ）目的とする遺伝子に少なくとも１つの変異を含む第１および第２の生物の子孫を選択することと、
（ｆ）目的とする遺伝子に少なくとも１つの変異を含む生物のコロニーを作製するために、子孫を交配することと、を含む。

【0218】

本発明のいくつかの実施形態では、第１および第２の生物は、哺乳類である。

【0219】

本発明のいくつかの実施形態では、第１および第２の生物は、ラットまたはミニブタである。

【0220】

本発明のいくつかの実施形態では、本発明は、２つ以上の個別の生物のサブセットを含む遺伝的に修飾された生物の雑種第１代を製造する方法に関し、本方法は、
（ａ）第１の幹細胞を、（ｉ）目的とする第１の遺伝子を変異させるＲＴＮ、または（ｉｉ）目的とする第１の遺伝子を変異させるＲＴＮをコードする発現ベクターと接触させ、それにより第１の変異を含む第１の幹細胞を作製することと、
（ｂ）第２の幹細胞を変性剤と接触させ、それにより第２の変異を含む第２の幹細胞を作製することと、
（ｃ）第１および第２の幹細胞の各々のインビトロ培養を拡張することと、
（ｄ）第１および第２の幹細胞を含む幹細胞の混合集団を生物内に移植することと、
（ｅ）生物を、同じ種の別の生物と交配することとを含む。

【0221】

本発明のいくつかの実施形態では、遺伝的に修飾された生物の雑種第１代は、２組以上の生物を含み、各組は、生物の親に移植された個別の幹細胞のハプロタイプに由来する目的とする個別の変異を含む。

【0222】

本発明のいくつかの実施形態では、混合集団の少なくとも１つの幹細胞は、哺乳類の精原幹細胞である。

【0223】

本発明のいくつかの実施形態では、生物は、哺乳類である。

【0224】

本発明のいくつかの実施形態では、キットは、
（ａ）目的とする遺伝子で核酸配列を切断するＲＴＮ、またはＲＴＮをコードする核酸配列と、
（ｂ）説明を含む取り扱い説明書と、任意に、を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、キットは、
（ａ）本発明のいくつかの実施形態では、および任意に、
（ｂ）１つ以上の幹細胞または１つ以上の胚芽用の培養培地を含む。
発明のいくつかの実施形態では、キットは、
（ａ）目的とする遺伝子で核酸配列を切断するＲＴＮ、またはＲＴＮをコードする核酸配列と、任意に、
（ｂ）１つ以上の幹細胞または１つ以上の胚芽用の培養培地と、を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、キットは、
（ａ）目的とする遺伝子で核酸配列を切断するＲＴＮ、またはＲＴＮをコードする核酸配列と、
（ｂ）動物または植物の生殖系列系統に由来する１つ以上の幹細胞系と、任意に、
（ｃ）１つ以上の幹細または１つ以上の胚芽用の培養培地と、任意に、
（ｄ）１つ以上の幹細胞を、目的とする遺伝子で核酸配列を切断するＲＴＮまたはＲＴＮをコードする核酸配列でどのように変異させるかの説明書を含む、取り扱い説明書とを含む。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0225】

本明細書に記載されるものに加えて、本発明の様々な修正は、前述から当業者には明らかであろう。そのような修正は、付属の特許請求の範囲内に入ることも意図される。本明細書に引用される各参照（学術論文、米国および米国以外の特許、特許出願公開、国際特許出願公開、遺伝子バンク受入番号等）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0226】

実施例１：機能分析を用いたラルストニアＴＡＬ（ＲＴＡＬ）による核酸ベクターの生成
ラルストニアゲノムの配列相同性のクラスター分析および再考察は、既知のＴＡＬ配列に相同である配列番号１の配列を明らかにした。

【0227】

特許請求される発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、当業者に既知の分子生物学技法を通して作製される。例えば、ＤＮＡ配列は、本発明のポリタンパク質をコードする各核酸配列に隣接するＸｂａＩおよび／またはＳａｌＩ制限部位を用いて合成される。ポリメラーゼ連鎖反応は、ある特定の制限エンドヌクレアーゼ部位を用いてＤＮＡを増幅するために行われる。配列は、ゲル精製され、単離され、結合反応のために水中または好適な緩衝液中で再構築される。必要な調節要素を含むエフェクター機能（ヌクレアーゼ機能等）を有するタンパク質をコードするプラスミドは、プラスミド多重クローニング部位で以下の配列をコードする核酸配列のうちの１つ以上に結合される。

【化1】

【0228】

プラスミド配列は、高いプラスミドのコピー数を生成するために好適な細菌内に形質転換される。上記の少なくとも１つのポリペプチドを含むプラスミドは、抗生物質選択法を用いて選択され、当業者に既知の技法を用いて細菌細胞から単離され、精製され得る。

【0229】

プラスミドも構築することができ、発現されたＤＮＡ結合ポリペプチドのインビトロ試験は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１２ Ｍａｙ；３０（５）：４６０−５．“ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．”
Ｒｅｙｏｎ Ｄ，Ｔｓａｉ ＳＱ，Ｋｈａｙｔｅｒ Ｃ，Ｆｏｄｅｎ ＪＡ，Ｓａｎｄｅｒ ＪＤ，Ｊｏｕｎｇ ＪＫ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される方法を用いて検証される。
予め組み立てられたＴＡＬＥ反復をコードするプラスミドアーカイブの構築

【0230】

我々は、それらのアミノ酸およびＤＮＡ配列がわずかに異なる個別のＴＡＬＥ反復骨格が反復パターンにおいて生じる、最初にＭｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．“Ａ ＴＡＬＥ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．”，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；２９：１４３−１４８によって説明された同じ構造を用いて反復アレイを構築しようと試みた。いくつかの実施形態では、我々は、アレイ中の最初のアミノ末端ＴＡＬＥ反復をα単位と指定した。この後にβ、γ、およびδ単位、次いで、５’端上のＩＩＳ型制限部位の位置が異なることを除き（クローニングに必要なα単位上に固有のオーバーハングの作製を可能にするために必要）、α単位と本質的に同一であるε単位が続く。次いで、ε単位の後にβ、γ、δ、およびε単位の反復が再び続く。クローニングに必要な３’端の作製に関連する制限により、わずかに修飾されたＤＮＡ配列がカルボキシ末端γまたはε単位で終了するＴＡＬＥ反復アレイに必要とされる。
ＦＬＡＳＨアセンブリのためのＴＡＬＥ反復コードＤＮＡ断片の調製

【0231】

ＦＬＡＳＨアセンブリに使用するためのα単位をコードするＤＮＡ断片を調製するために、我々は、プライマーｏＪＳ２５８１（５’−ビオチン−ＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣ−３’）およびｏＪＳ２５８２（５’−
ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＴＣＴＴＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧ−３’）を使用して、テンプレートとして各α単位プラスミドを用いてＰＣＲを２０回行う。得られたＰＣＲ生成物を５’端上でビオチン化する。次いで、各αＰＣＲ生成物は、４ｂｐオーバーハングを生成するために４０単位のＢｓａＩ−ＨＦ制限酵素で消化され、最終生成物が５０μｌの０．１×ＥＢ中で溶出されることを除き、製造者の指示に従いＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製された。

【0232】

ポリペプチド反復をコードするＤＮＡ断片を調製するために、１０μｇのこれらのプラスミドの各々を、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２中の５０単位のＢｂｓＩ制限酵素で、２時間３７℃で消化させ、続いて、５分間隔で添加されるそれぞれ１００単位のＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ−ＨＦ、およびＳａｌＩ−ＨＦ酵素を使用して、３７℃でＮＥＢｕｆｆｅｒ ４中で連続制限消化を行った。後者の制限消化一式は、このより大きいＤＮＡ断片がＦＬＡＳＨアセンブリプロセス中に行われる後続の結合に干渉しないことを確実にするためにプラスミド骨格を切断するように設計される。これらの制限消化反応は、次いで、最終生成物が１８０μｌの０．１×ＥＢ中で溶出されることを除き、製造者の指示に従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製される。
自動ＦＬＡＳＨアセンブリ

【0233】

ＦＬＡＳＨアセンブリの全ての工程は、９６ウェルプレート中で、ＳＰＲＩｐｌａｔｅ ９６リングマグネット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびＤｙｎａＭａｇ−９６サイドマグネット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｓｃｉｃｌｏｎｅ Ｇ３液体ハンドリングワークステーション（Ｃａｌｉｐｅｒ）または別の会社が販売する類似する装置を使用して行われる。ＦＬＡＳＨの第１工程において、ビオチン化α単位断片を、最初のβγδε断片に結合し、次いで、得られたαβγδε断片を、２×Ｂ＆Ｗ緩衝液中のＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｃ１ストレプトアビジンコーティングした磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に結合する。次いで、マグネット上にプレートを設置することにより、ビーズをウェルの側面に引き寄せ、次いで、０．００５％のＴｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）を含む１００μｌのＢ＆Ｗ緩衝液、および１００μｌの０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で再度洗浄する。マグネットからプレートを取り外し、ビーズを各ウェル中の溶液に再懸濁し、ＢｓａＩ−ＨＦ制限酵素でビーズ結合断片を消化し、マグネット上にプレートを設置し、１００μｌのＢ＆Ｗ／Ｔｗｅｅｎ２０、続いて、１００μｌの０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡで洗浄し、次いで次の断片を結合することにより、さらなるβγδε断片が結合される。このプロセスは、複数回繰り返され、さらなるβγδε単位がビーズ結合断片を拡張する。結合される最後の断片は、完全長断片の発現ベクター内へのクローニングを可能にするために、常にβ、βγ^＊、βγδ、またはδε^＊単位である（δε^＊単位で終わる断片は、常にβγ単位の結合が先行することに留意する）。

【0234】

最終完全長ビーズ結合断片を、４０単位のＢｓａＩ−ＨＦ制限酵素、続いて、２５単位のＢｂｓＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化する。ＢｂｓＩによる消化は、ビーズから断片を解放し、断片のクローニング用の固有の５’オーバーハングを生成する。ＢｓａＩ−ＨＦによる消化は、クローニング用の固有の３’オーバーハングの作製をもたらす。
ＴＡＬＥ反復アレイコードＤＮＡ断片のＴＡＬＥＮ発現ベクター内へのサブクローニング

【0235】

我々のＦＬＡＳＨ組み立てされたＴＡＬＥ反復アレイをコードするＤＮＡ断片をＴＡＬＥ発現ベクター内にサブクローニングする。いくつかの実施形態では、４つ以上の別個のプラスミドが存在する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣＭＶプロモーター、哺乳類細胞発現に最適化された翻訳開始コドン、３重ＦＬＡＧエピトープタグ、核局在化シグナル、ＴＡＬＥ１３タンパク質からのアミノ酸１５３〜２８８（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．６による番付）、２つの固有かつ密接に位置するＩＩＳ型ＢｓｍＢＩ制限部位、ＲＶＤをコードする０．５ ＴＡＬＥ反復ドメイン、ＴＡＬＥ１３タンパク質からのアミノ酸７１５〜７７７、および野生型ＦｏｋＩ切断ドメインを含む。

【0236】

ＦＬＡＳＨにより組み立てられた全てのＤＮＡ断片は、ＢｓｍＢＩにより消化される発現ベクターのうちのいずれか内への方向性クローニングを可能にするオーバーハングを保有する。標準的なＴＡＬＥＮ発現ベクター（各々異なる０．５ＴＡＬＥ反復を保有する）は、Ａｄｄｇｅｎｅ等の供給元から入手可能であり、これらのプラスミドの完全な配列は、合成構成用のこれらの構成専用ウェブページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｔａｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ／から自由に入手可能である。

【0237】

サブクローニング用のＴＡＬＥＮ発現ベクターを調製するために、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ３中５０単位のＢｓｍＢＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で、５５℃で８時間、５μｇのプラスミドＤＮＡを消化する。消化されたＤＮＡは、製造者の指示に従い、９０μｌのＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を使用して精製され、１ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ中５ｎｇ／μｌの最終濃度に希釈される。ＦＬＡＳＨ組み立てされたＴＡＬＥ反復アレイは、４００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＴＡＬＥＮ発現ベクター内に結合される。結合生成物は、化学的に応答能のあるＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞内に形質転換される。典型的には、６つのコロニーが各結合用に選別され、プラスミドＤＮＡがアルカリ溶解ミニプレップ手順により単離される。同時に、プライマーｏＳＱＴ３４（５’−ＧＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＴＣＡＡＡＴＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＧ−３’）およびｏＳＱＴ３５（５’−
ＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＴＣＡＣＴＴＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＧＧＧ−３’）を使用して、ＰＣＲにより同じコロニーをスクリーニングする。ＰＣＲ生成物は、ＱＩＡｘｃｅｌキャピラリー電気泳動システム（Ｑｉａｇｅｎ）により分析される。正確に寸法決定されたＰＣＲ生成物を含むクローンからのミニプレップＤＮＡは、プライマーｏＳＱＴ１（５’−ＡＧＴＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＧＡＧＧＣＡＧ−３’）、ｏＳＱＴ３（５’−
ＡＴＴＧＧＧＣＴＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣ−３’）、およびｏＪＳ２９８０（５’−
ＴＴＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＡＴＴＣＡＴＧＡＧＧＣＡＣ−３’）を用いたＤＮＡ配列確認のために送られ、ｏＳＱＴ１は、ＴＡＬＥ反復アレイコード配列の５’端でアニールし、
組み立てられたアレイの半分のアミノ末端の配列決定を可能にし、ｏＳＱＴ３は、ＴＡＬＥ反復アレイコード配列の３’でアニールし、組み立てられたアレイの半分のカルボキシ末端の配列決定を可能にし、ｏＪＳ２９８０は、ＦｏｋＩドメイン（ｏＳＱＴ３の下流）のコード配列内を刺激し、カルボキシ末端の０．５ＴＡＬＥ反復ドメインの配列決定および検証を可能にする。

【0238】

上述のように各アセンブリ用の６つのコロニーをスクリーニングし、続いて、必要であれば、さらに６つのコロニーをスクリーニングする。このアプローチにより、アセンブリ反応の＞９０％に関して、１つ以上の配列検証されたクローン。これらのパーセンテージは、主に、１６．５ＴＡＬＥ反復をコードするＤＮＡ断片を構築するために設計された実験から導かれる。
ＥＧＦＰ ＴＡＬＥＮ活性および毒性アッセイ
ＥＧＦＰレポーターアッセイは、ＥＧＦＰ−ＰＥＳＴ融合タンパク質を構成的に発現する組み込まれた構築物を坦持するクローン性Ｕ２ＯＳヒト細胞系において行われる。このクローン性系は、多クローン性Ｕ２ＯＳ ＥＧＦＰ−ＰＥＳＴレポーター系に由来する。クローン性Ｕ２ＯＳ ＥＧＦＰ−ＰＥＳＴ細胞は、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、および４００μｇ／ｍｌのＧ４１８で補足されたＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養される。細胞は、製造者の指示に従い、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ、溶液ＳＥ、およびプログラムＤＮ−１００を使用して、５００ｎｇの各ＴＡＬＥＮプラスミドＤＮＡおよび５０ｎｇのｐｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｎ１プラスミドＤＮＡにより３つ組で遺伝子移入される。１μｇのｐｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｎ１プラスミドのみが陰性対照として３つ組で遺伝子移入される。細胞は、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩフローサイトメーターを使用して、遺伝子移入２日後および５日後にＥＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏ発現に関してアッセイされる。
内因性ヒト遺伝子のＰＣＲ増幅および配列検証
標的遺伝子座を増幅するためのＰＣＲ反応は、補足表５に示されるプライマーを使用して行われる。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を用いた標準的なＰＣＲ条件は、製造者の指示に従い、３５サイクル（９８℃、１０秒変性；６８℃、１５秒アニーリング；７２℃、３０秒伸長）で行われる。標準的な条件下で増幅されない遺伝子座に関しては、以下の修飾うちの１つを使用する：１）１．８Ｍの最終濃度にするためのベタインの添加、２）１．８Ｍのベタインを用いてタッチダウンＰＣＲ（［９８℃、１０秒；７２〜６２℃、−１℃／サイクル、１５秒；７２℃、３０秒］_{１０サイクル}、［９８℃、１０秒；６２℃、−１℃／サイクル、１５秒；７２℃、３０秒］_{２５サイクル}）、ならびに３）３％または５％のＤＭＳＯの添加および６５℃のアニーリング温度。ＰＣＲ生成物は、ＱＩＡｘｃｅｌキャピラリー電気泳動システムにより正確な大きさに関して分析される。正確に寸法決定された生成物は、組み込まれなかったヌクレオチドまたはプライマーを除去するためにＥｘｏＳａｐ−ＩＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で処理され、内因性遺伝子配列を確認するためにＤＮＡ配列決定に送られる。
内因性ヒト遺伝子のＮＨＥＪ媒介変異を定量化するためのＴ７エンドヌクレアーゼＩアッセイ

【0239】

Ｕ２ＯＳ−ＥＧＦＰ細胞を培養し、上述のように２つ組で遺伝子移入される。ゲノムＤＮＡは、製造者の指示に従い、高処理量磁気ビーズに基づく精製システム（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃｅ）を使用して、ＴＡＬＥＮコードプラスミドまたは対照プラスミドで遺伝子移入された細胞から単離された。内因性遺伝子座を増幅するためのＰＣＲは、上述のように３５サイクルで行われ、断片は、製造者の指示に従い、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）で精製された。２００ｎｇの精製されたＰＣＲ生成物を変性し、以下のプロトコル（９５℃、５分；−２℃／秒で９５〜８５℃；−０．１℃／秒で８５〜２５℃、４℃で維持）で、サーマサイクラーを使用して、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で再アニールした。３３のハイブリダイズしたＰＣＲ生成物を、２０μｌの反応容積中で、３７℃で１５分間、１０ＵのＴ７エンドヌクレアーゼＩで処理した。２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加して、反応を停止させ、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰで精製し、ＯＭ５００方法を使用して、ＱＩＡｘｃｅｌキャピラリー電気泳動システムで定量化した。ＴＡＬＥＮ特異的切断ピーク下面積の合計（親アンプリコンピークのパーセンテージとして表され、切断された画分として表される）は、前述されるように、以下の方程式を使用して、遺伝子修飾レベルを推定するために使用される。
（％遺伝子修飾＝１００×（１−（１−切断された画分）^1/2）
実施例２

【0240】

以下に示される５つの断片を分析し、各々を修飾されたｐＵＣ５７：ｐＵＣ５７−ΔＢｓａＩ（ＪｕｏｎｇらのＦＬＡＳＨアセンブリ文献に開示されるベクター）内にクローニングした。それは、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いてＢｓａＩ部位）を破壊するために単一の塩基対変化を含む。
ＲＴＮ１ ＥＢＥｓ：

【化2】

【0241】

原理の証明のために、これらのクローニングされた断片は、ＪｏｕｎｇのＦＬＡＳＨ ＴＡＬＥＮ文献のプロトコルに正確に従い、ＦｏｋＩヌクレアーゼに融合された６つの反復単位のキメラタンパク質、つまり、Ａ（Ｃ、Ｔ、およびＧ）ヌクレオチドの鎖を標的とするキメラタンパク質を生成するために使用される。これらのキメラタンパク質は、次いで、レポーター構築物を使用して、所望のＤＮＡ塩基への結合／標的効率に関して試験される。

【0242】

これらの単位の結合効率が確認されたら、ＦＡＬＳＨ ＴＡＬＥＮのキサントモナスＥＢＥライブラリの正確なコピーであるラルストニアＥＢＥのライブラリが生成される。このライブラリは、次いで、ＦＬＡＳＨ ＴＡＬＥＮシステムのプロトコルに正確に従い、ラルストニアＴＡＬＥＮを生成するために使用され得る。
実施例３．メチルエステラーゼを用いた核酸ベクターの生成

【0243】

他の種からクローニングされた、または同じ種からクローニングされたさらなる配列は、ＤＮＡ認識で本明細書に開示される実験のいずれかを行うために、それ自体酵素として、またはモノマーもしくはポリマー（タンパク質融合）として連続してのいずれかで機能的に使用され得る。ＲＶＤ特定コンセンサス配列は、当該技術分野において既知の配列最適化技法を使用して作製された。ＢＬＡＳＴ検索は、細菌種のメチルエステラーゼ（ｍｅｔｈｌｙｅｓｔｅｒａｓｅ）配列にわたって行われた（図１参照）。以下のポリペプチドは、本明細書に開示される核酸配列およびポリペプチド配列番号１〜１９に類似するＤＮＡ塩基対認識能力を有すると特定された。
メチルエステラーゼに対するＴＡＬ ＥＢＥ
＃１
キサントモナスコンセンサスＥＢＥ

【化3】

【化4】

【化5】

実施例４

【0244】

一対のＢｍｐｒ２特異的ＥＢＥ（ラルストニアＤＮＡ結合ドメイン、各１６ＥＢＥ）は、遺伝子合成され、ＸＴＮ−ＢＢ（ＦｏｋＩに融合されたキサントモナスＴＡＬ骨格）内にクローニングされた。これらの構築物を、ラットＣ６細胞内に同時に遺伝子移入し、Ｃｅｌ１ ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイ用に４８時間後にｇＤＮＡを抽出した。成功した場合、アッセイは、遺伝子座の元の４００ｂｐアンプリコンから２４０ｂｐおよび１５０ｂｐのサブ集団を生成するはずである。結果は図２に示される。

【0245】

アッセイは、ラルストニアおよびキサントモナスＴＡＬＥＮ遺伝子移入された細胞において、予測された２５０ｂｐおよび１５０ｂｐバンドを明らかにし、これは、ＷＴ陰性対照において不在である。これは、ラルストニアＥＢＥがこの遺伝子座を標的とし、ＦｏｋＩヌクレアーゼのラルストニアＥＢＥへの融合がゲノムＤＮＡの標的消化をもたらすことを示す。２５０ｂｐバンドを使用して、ＸＴＮに関しては５．７５％、ＲＴＮに関しては１．８２％である。１５０ｂｐバンドを使用して、ＸＴＮに関しては３．６６％、ＲＴＮに関しては５．４３％である。

【表3】

Ｂｍｐｒ２ ＦＷＤ ＲＴＮ ＥＢＥのアミノ酸配列：

【化6】

【化7】

【化8】

【化9】

実施例５

【0246】

ゴールデンゲートアセンブリ法を利用して、完全長ラルストニアＤＮＡ結合ドメインをラルストニアまたはキサントモナスＴＡＬＥＮ骨格内に組み込むために使用することができるラルストニアＥＢＥのライブラリおよび骨格ベクターが作製された。ＲＴＮは、ラットＣ６細胞系内に同時に遺伝子移入され、遺伝子移入４８時間後に分析用にｇＤＮＡが抽出された。ＲＴＮ結合部位を含む４２０ｂｐのｇＤＮＡ断片がＰＣＲによって増幅された。このアンプリコンは、次いで、製造者のプロトコルに従いＳｕｒｖｅｙｏｒ変異検出キット（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を使用して、Ｃｅｌ１アッセイを受けた。簡潔に、アンプリコンは、一本鎖ＤＮＡ内に変性され、二本鎖ＤＮＡにゆっくり再アニールされる。このプロセス中、元のプールがＷＴと変異された配列の混合物であることを考えると、ヘテロ二本鎖の形成をもたらすＷＴと変異体鎖との間に交差ハイブリダイゼーションが存在する。Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼによるこの再アニールされたプールの処理により、ヘテロ二本鎖を認識し、それらを切断し、これは元のアンプリコン（４２０ｂｐ）から２つの短い断片（２５５ｂｐおよび１６５ｂｐ）を生成する。
用語：

【0247】

ｐＲＶＤ：単一ラルストニアＥＢＥを含むプラスミド。個々のＥＢＥを遺伝子合成し、ＦＬＡＳＨ−ＸＴＮサブアレイ骨格（ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ）内にクローニングした。

【0248】

ｐＦｕｓ Ｘ：任意の所与のＲＴＮの最初の１０ＥＢＥを有するサブアレイプラスミド。必要とされる部分を遺伝子合成し、ｐＨＳＧ−２９８（ＳａｃＩ、ＳｂｆＩ）内にクローニングした。

【0249】

ｐＦＵＳ Ｚ：任意の所与のＲＴＮの最後から２番目のＥＢＥまでのＥＢＥ１１を有するサブアレイプラスミド。
Ｅｇ：Ｚ４はＥＢＥ１１〜１４を保持し、Ｚ５はＥＢＥ１１〜１５を保持し、Ｚ６はＥＢＥ１１〜１６を保持する。遺伝子合成し、ｐＨＳＧ−２９８（ＳａｃＩ、ＳｂｆＩ）内にクローニングした。

【0250】

ＸＴＮ−ｂｂ：ＦｏｋＩヌクレアーゼに融合されたＮ末端およびＣ末端キサントモナスＴＡＬドメインを含むキサントモナスＴＡＬ骨格。この骨格は、ＥＢＥによって特定される標的配列のＴヌクレオチド５’を特定する。標的配列の最後のヌクレオチドを特定するＥＢＥ後半も含む。したがって、４つのＸＴＮ−ｂｂプラスミドが存在し、各々、標的配列の異なる最終ヌクレオチド（ＦＬＡＳＨ ＸＴＮ骨格と同じ）を特定する。

【0251】

全てのプラスミドは、０．１×ＴＥ緩衝液中１５０ｎｇ／ｕｌで保管される。

【0252】

方法：（１６ＥＢＥ ＤＮＡ結合ドメインを構築し、それをキサントモナスＴＡＬＥＮ骨格内にクローニングする）。

【0253】

特注のＴＡＬＥＮまたはＴＡＬエフェクター構築物のアセンブリは、２つの工程を伴う：（ｉ）反復モジュール（ｐＲＶＤ）の１〜１０反復のサブアレイ内へのアセンブリ、および（ｉｉ）最終構築物を作製するために、サブアレイの骨格内への接合。

【0254】

我々は、１７ ＲＶＤアレイ（５’−ＴＧＡＴＡＧＴＣＧＣ−ＣＴＴＡＴＧ−Ｔ−３’）を有するＴＡＬＥＮモノマーを構成した。その順番で番付されるプラスミドを使用して、アレイ内にＲＶＤ１〜１０をコードするものをｐＲＶＤプラスミドから選択。例えば、最初のＲＶＤのプラスミドはｇＲＴＮ−１Ｔであり、第２はｇＲＴＮ−２Ｇ、第３はｇＲＴＮ−３Ａ等であろう。これらのプラスミドからのモジュールは、サブアレイプラスミドｐＦＵＳ−Ｘ内にクローニングされる。次に、１から番付されるプラスミドで再度開始する１６ ＲＶＤアレイのＲＶＤ１１〜１６のモジュールを選択する。よって、ＲＶＤ１１に関しては、ｇＲＴＮ−１Ｃが使用され、ＲＶＤ１２にはｇＲＴＮ−２Ｔ等が使用される。ｐＦＵＳ−Ｚプラスミドは、１〜１０まで番付され、入るＥＢＥの数により選択されるべきである。よって、我々の例において、ｐＦＵＳ−Ｚ６が使用されるべきである。

【0255】

ｐＲＶＤおよびサブアレイプラスミド（各１５０ｎｇ）は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）中１ｕｌのＢｓａＩ（１０Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）および１ｕｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（２０００Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を含む単一２０ｕｌ反応において消化および結合を受ける。サーモサイクラーにおいて、３７Ｃで５分、および１６Ｃで、１０分の１０サイクルで反応をインキュベートし、次いで、５分間５０Ｃに、次いで５分間８０Ｃに加熱した。次いで、１ｕｌの２５ｍＭ ＡＴＰおよび１ｕｌのＰｌａｓｍｉｄ Ｓａｆｅ ＤＮａｓｅ（１０Ｕ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を添加する。混合物を３７Ｃで１時間インキュベートし、次いで、大腸菌細胞を形質転換するために使用される。細胞を、３７℃で一晩、５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天上で平板培養した。

【0256】

完全長サブアレイを含むクローンを特定するために、コロニーＰＣＲを介して、各形質転換から最大６つのコロニーを、Ｍ１３順方向および逆方向プライマーでスクリーニングした。完全長ｐＦＵＳ−Ｘサブアレイクローンは、１．１ｋｂバンドを生成するはずであり、完全長ｐＦＵＳ−Ｚ６クローンは、７００ｂｐバンドを生成するはずである（各ＥＢＥに関して、およそ１０５ｂｐを加算または減算する）。培養は、完全長ｐＦＵＳ−Ｘおよび完全長ｐＦＵＳ−Ｚ６クローンの一晩培養を開始した。

【0257】

我々は、ｐＦＵＳ−ＸおよびｐＦＵＳ−Ｚ培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。サブアレイは、４つの骨格プラスミドのうちの１つの中に接合された。２０ｕｌの消化および結合反応混合物を、Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ緩衝液中の各々１５０ｎｇのｐＦＵＳ−ＸおよびｐＦＵＳ−Ｚプラスミド、１５０ｎｇの骨格プラスミド、この場合、ＸＴＮ−ｂｂＴ、１ｕｌのＥｓｐ３Ｉ（１０Ｕ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および１ｕｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（２０００Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて調製した。次いで、反応を、サーモサイクラーにおいて、３７Ｃで１０分、および１６Ｃで、１５分の３サイクルでインキュベートする。次いで、さらに３０分間、反応を３７Ｃでインキュベートし、５分間５０Ｃに、次いで、５分間８０Ｃに加熱する。室温に冷却した後、１ｕｌの２５ｍＭ ＡＴＰおよび１ｕｌのＰｌａｓｍｉｄ Ｓａｆｅ ＤＮａｓｅ（１０Ｕ、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）を添加し、３７Ｃで１時間インキュベートした。次いで、反応は、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓａｆｅを除き、上記のように、大腸菌を形質転換するために使用される。また、この工程において、形質転換体の選択のためにアンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）が、カナマイシンの代わりに使用される。

【0258】

我々は、ＸＴＮ−ＶＦおよびＸＴＮ−ＶＲ２プライマーを用いて、コロニーＰＣＲを介して、各形質転換から最大３つのコロニーをスクリーニングし、各ＲＴＮ（２．１ｋｂバンドは１７ＥＢＥアレイを示す）について１つの完全長クローンの一晩培養を開始した。我々は、次いで、プラスミドＤＮＡを単離し、ＸＴＮ−ＶＦ、ＸＴＮ−ＶＲ１、およびＸＴＮ−ＶＲ２を用いて、ＤＮＡ配列決定により最終完全長反復アレイを含むクローンを特定する。

【0259】

ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩはＸＴＮサブアレイ骨格（部位は下線付き）を消化した：

【化10】

【0260】

ＸＴＮ−ｂｂ（ＢｓｍＢＩは消化され、部位は消化中骨格から自己切除される）：
下線付き配列はサブアレイｐＦＵＳ−ＸおよびｐＦＵＳ−Ｚと重複する。
ＸＴＮ−ｂｂＡ：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮは、ＴＣＴＡＡＣＡＴＣと置き換えられる。
ＸＴＮ−ｂｂＣ：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮは、ＴＣＣＣＡＣＧＡＣと置き換えられる。
ＸＴＮ−ｂｂＧ：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮは、ＡＡＴＡＡＴＡＡＣと置き換えられる。
ＸＴＮ−ｂｂＴ：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮは、ＴＣＴＡＡＴＧＧＧと置き換えられる。

【化11】

【化12】

【化13】

【0261】

ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ隣接ｐＲＶＤ断片（遺伝子合成された、ＢａｍＨＩ−ＥＢＥ−ＸｂａＩ））：

【化14】

【化15】

【化16】

【化17】

【化18】

【化19】

【化20】

実施例７

【0262】

メチルエステラーゼおよびメチルトランスフェラーゼ ３４ａａコンセンサスＥＢＥ（ｎｎは適切なＲＶＤと置き換えられる）：
ＱＴＴＥＲＩＶＡＩＧＴ ｎｎ ＧＧＴＱＡＬＥＡＶＬＴＡＬＰＲＶＣＰＧＭＶ

３４ａａ ＱＴＴＥＲＩＶＡＩＧＴ ＳＨ ＧＧＴＱＡＬＥＡＶＬＴＡＬＰＲＶＣＰＧＭＶのＢａｃｋｔｒａｎｓｅｑ（ＳＨは非特異的ＲＶＤである）
ＣＡＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＴＣＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＧＧＴＧＴＧＣＣＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＧ
メチルエステラーゼＥＢＥ（ＸＴＮ骨格中の１４ＥＢＥ）：
青字体：メチルエステラーゼＥＢＥ。この例において、全ては非特異的ＲＶＤ ＳＨである。
黒字体：ＦＬＡＳＨ ＸＴＮ骨格。
配列は連続である：

【化21】

【化22】

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]