特許 6509618 サーチュイン遺伝子活性化剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6509618

(24)【登録日】2019年4月12日

(45)【発行日】2019年5月8日

(54)【発明の名称】サーチュイン遺伝子活性化剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/03 20060101AFI20190422BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20190422BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190422BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20190422BHJP

   A61K 8/9711 20170101ALI20190422BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20190422BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/03

   A61K38/02

   A61P43/00 111

   A61P43/00 105

   A23L33/105

   A61K8/9711

   A61Q19/08

【請求項の数】2

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2015-84414(P2015-84414)

(22)【出願日】2015年4月16日

(65)【公開番号】特開2016-204273(P2016-204273A)

(43)【公開日】2016年12月8日

【審査請求日】2018年2月15日

(73)【特許権者】

【識別番号】390010674

【氏名又は名称】理研ビタミン株式会社

(72)【発明者】

【氏名】吉永 恵子

(72)【発明者】

【氏名】村上 桂

(72)【発明者】

【氏名】久保 幸也

【審査官】 春田 由香

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００４−０９７０２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５００５５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０２−０５３７３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−１５８１５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−０１２５５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０６７７０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０３−０８６８３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−１６９１３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１６／１３５４００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 白澤 卓二，長寿社会における基礎老化学の役割，日本老年医学会雑誌，２０１２年，第４９巻，第１号，ｐ．３６−３９

【文献】 Mattagajasingh I et al.，SIRT1 promotes endothelium-dependent vascular relaxation by activating endothelial nitric oxide synthase，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，２００７年 ９月１１日，Vol.104, No.37，p.14855-14860

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ２３Ｌ ３３／００−３３／２９

Ａ６１Ｋ ８／００− ８／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

医中誌ＷＥＢ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

わかめから分離したタンパク質であって、水、エタノール及び油のいずれにも溶解しないタンパク質を有効成分とすることを特徴とするサーチュイン遺伝子活性化剤。

【請求項2】

寿命延長剤であることを特徴とする請求項１に記載のサーチュイン遺伝子活性化剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、サーチュイン遺伝子活性化剤に関する。

【背景技術】

【0002】

ＳＩＲ２（ｓｉｌｅｎｔ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ２）ファミリー（サーチュイン）は、酵母の老化の原因であるゲノム不安定性を抑制するヒストン脱アセチル化酵素として最初に同定された。それ以降、サーチュインは、全ての生命体で見いだされ、ストレスや老化から保護するように働くことが示されている。例えば、哺乳類には、７つのサーチュイン（ＳＩＲＴ１〜７）が存在し、中でもＳＩＲＴ１を強制発現させることで、老化に伴う遺伝子の発現変化が抑制されることが明らかとなっている。また、カロリー制限をすることは、霊長類を含む多岐にわたる生物種において、老化を遅延させ、寿命が延長させることが知られているが、カロリー制限により、脳や腎臓、肝臓、白色脂肪組織、骨格筋を含む種々の組織において、ＳＩＲＴ１を含むサーチュインの発現が上昇することが報告されている。これらの研究結果より、サーチュインは寿命延長作用を媒介することから、その遺伝子は長寿遺伝子とも呼ばれ、近年、盛んに研究がされている。

【0003】

サーチュイン遺伝子を活性化する物質としては、赤ワインに含まれる成分であるレスベラトロールが以前より知られているが、レスベラトロール以外にもこのような活性を有する化合物や素材が多数提案されている。

【0004】

例えば、フラボノイド類を有効成分とするサーチュイン活性化剤（特許文献１）、乳酸菌由来成分を有効成分とするサーチュイン発現増強剤（特許文献２）、スダチより抽出される化合物を有効成分とするＮＡＤ依存性脱アセチル化酵素活性化剤（特許文献３）、カッコンエキスを有効成分とするサーチュイン１活性化剤（特許文献４）、グネツム科植物の抽出物及びグネチンCからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とするサーチュイン活性化剤（特許文献５）、卵殻膜成分を含有することを特徴とするサーチュイン遺伝子活性化剤（特許文献６）等、安全性の高い天然物由来の成分が知られている。

【0005】

このような状況下、サーチュイン遺伝子を活性化し得る更なる新規な素材が求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００７−３２６８７２号公報

【特許文献2】特開２００８−１９５６７３号公報

【特許文献3】特開２００９−１２６７９９号公報

【特許文献4】特開２０１０−２７００１２号公報

【特許文献5】特開２０１１−０７９７９７号公報

【特許文献6】特開２０１４−２３１４８７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、サーチュイン遺伝子を活性化し得る新規な素材を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討を行った結果、わかめ由来成分がサーチュイン遺伝子を活性化することを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。

【0009】

すなわち、本発明は、
（１）わかめ由来成分を有効成分とすることを特徴とするサーチュイン遺伝子活性化剤、
（２）前記わかめ由来成分が、わかめを含水エタノール溶液で洗浄してなることを特徴とする前記（１）に記載のサーチュイン遺伝子活性化剤、
（３）前記わかめ由来成分が、タンパク質を４０質量％以上含有することを特徴とする前記（１）に記載のサーチュイン遺伝子活性化剤、
（４）寿命延長剤であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載のサーチュイン遺伝子活性化剤、
からなっている。

【発明の効果】

【0010】

本発明のサーチュイン活性化剤は、サーチュイン遺伝子を活性化することができる。
本発明のサーチュイン活性化剤は、サーチュイン遺伝子を活性化することにより寿命を延長することができる。
本発明のサーチュイン活性化剤は、サーチュインの作用が関係する各種疾患等の予防又は治療剤等として利用できる。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明で言うところのわかめとは、分類学的にはコンブ目チガイソ科ワカメ属に属する海藻類である。わかめの種類としては、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、ヒロメ（Ｕ．ｕｎｄａｒｉｏｉｄｅｓ）、アオワカメ（Ｕ．ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）があり、本発明ではいずれも好ましく用いられる。また、本発明に用いられるわかめの部位に特に制限はなく、葉、芽かぶ等のいずれを用いても良い。また、本発明に用いられるわかめとしては、例えば乾燥わかめ（例えば乾燥カットわかめ、素干しわかめ等）、ボイル塩蔵わかめ、塩蔵わかめ、生わかめ等のいずれでもよく、葉の厚さや色あるいは原料産地、形態も問わない。

【0012】

本発明のサーチュイン遺伝子活性化剤は、わかめ由来成分を有効成分とするものである。わかめ由来成分としては、サーチュイン遺伝子活性化作用を有するものであれば特に制限はないが、例えば、わかめを含水エタノール溶液で洗浄することにより脱塩処理したもの（以下、「脱塩わかめ」という）、わかめから分離したタンパク質（以下、「わかめタンパク質」という）を４０質量％以上、好ましくは６０質量％以上、より好ましくは８０質量％以上含有する組成物（以下、「わかめタンパク質含有組成物」という）等が挙げられる。以下、脱塩わかめ及びわかめタンパク質含有組成物の製造方法の概略を示す。

【0013】

＜脱塩わかめの製造方法＞
先ず、濃度が１０〜６０％（ｖ／ｖ）の含水エタノールでわかめを洗浄する。洗浄方法に特に制限はないが、例えばわかめを含水エタノールに浸漬し攪拌する方法や、超音波等で処理する方法等が挙げられる。また、洗浄されるわかめの形状に特に制限はないが、洗浄処理の効率の観点から、チップ状に切断してあるものが好ましい。また、洗浄時間は、洗浄方法やわかめの形状等に応じて適宜設定すれば良く、例えば、チップ状に切断したわかめを含水エタノールに浸漬し、撹拌する方法であれば５〜６０分間とすることができる。また、洗浄温度は、わかめに含まれる有効成分の流出に影響しない程度に設定すれば良く、例えば０〜３０℃であることが好ましい。また、洗浄後、濾過したわかめを再び含水エタノールで洗浄する操作を１回〜３回実施しても良い。また、洗浄後、濾過したわかめを乾燥し、自体公知の方法により粉末化しても良い。

【0014】

＜わかめタンパク質含有組成物の製造方法＞
わかめタンパク質含有組成物は、自体公知のタンパク質分離法により、わかめからタンパク質を分離して製造することができる。タンパク質分離法としては、例えば、（１）ｐＨ３．０〜５．０の緩衝液に浸漬して組織を軟化し、かつ糖類、色素などを溶出・除去した後、アルカリ類を用いて溶解し、酸を加えてｐＨを４．５〜５．０に調整して沈殿として回収する酸沈工程を含む方法、（２）等電点よりも高いｐＨの水性抽出剤で抽出し、該タンパク質抽出液を等電点付近のｐＨに調整する酸沈処理により、タンパク質を沈殿させて回収する等電点沈殿法、（３）イオン交換体吸着法、（４）膜分離法、（５）アルギン酸リアーゼ等の酵素で処理し、これを遠心分離処理して上清を廃棄し沈殿物を回収することにより、粘質多糖類を除去し、該沈殿物をエタノールを用いて洗浄し、色素、脂質等を除去することにより、タンパク質を分離する方法が挙げられる。中でも、本発明においては、前記（５）の方法が簡便に実施でき、風味の良好なわかめタンパク質含有組成物が得られるため好ましい。尚、前記（５）の方法により分離されるわかめタンパク質は、不溶性のものである。不溶性とは、水、エタノール及び油のいずれにも溶解しないことをいう。

【0015】

上記製造方法において、わかめタンパク質含有組成物の原料として脱塩わかめを用いると、わかめタンパク質の抽出率が高まるとともに、海藻独特の臭いが低減したわかめタンパク質含有組成物が得られるため好ましい。また、上記製造方法において、得られたわかめタンパク質含有組成物をセルラーゼ等の酵素で処理することにより、セルロース等の水溶性成分を除去すると、わかめタンパク質の抽出率が高まるため好ましい。アルギン酸リアーゼ及びセルラーゼ等による酵素処理の温度及びｐＨは常識的に許容される範囲内の条件であれば良いが、その酵素の至適温度、至適ｐＨで行うことが反応時間の短縮や酵素の安定性上望ましい。

【0016】

ここで、わかめタンパク質含有組成物のタンパク質の含有量は、ケルダール法（日本食品科学工学会 新食品分析法編集委員会編、「新・食品分析法」、光琳、平成８年１１月３０日発行、ｐ．３３−３８）により試料の全窒素量を測定し、係数６．２５を乗じてタンパク質含有量とすることにより算出できる。

【0017】

本発明のサーチュイン遺伝子活性化剤は、わかめ由来成分のみをそのまま用いても良く、或いはわかめ由来成分以外に本発明の効果を阻害しない範囲で他の任意の成分（医薬品添加物、食品添加物及び食品素材等）を配合し、少なくともわかめ由来成分を含有する組成物として調製しても良い。

【0018】

上記組成物の調製に用いられるわかめ由来成分以外の任意の成分としては、例えば賦形剤（乳糖、デキストリン、コーンスターチ、結晶セルロース等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル等）、崩壊剤（カルボキシメチルセルロースカルシウム、無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等）、結合剤（デンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、アラビアガム液等）、溶解補助剤（アラビアガム、ポリソルベート８０等）、甘味料（砂糖、果糖ブドウ糖液糖、ハチミツ、アスパルテーム等）、着色料（β−カロテン、食用タール色素、リボフラビン等）、保存料（ソルビン酸、パラオキシ安息香酸メチル、亜硫酸ナトリウム等）、増粘剤（アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム等）、酸化防止剤（ＢＨＴ、ＢＨＡ、アスコルビン酸、トコフェロール等）、香料（ハッカ、ストロベリー香料等）、酸味料（クエン酸、乳酸、ＤＬ−リンゴ酸等）、調味料（ＤＬ−アラニン、５´−イノシン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム等）、ｐＨ調整剤（クエン酸、クエン酸三ナトリウム等）、乳化剤又は界面活性剤（グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、アルキル硫酸エステル塩、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム等）、油剤（高級アルコール、エステル油、流動パラフィン、ワセリン、スクワラン、ロウ、天然油脂、シリコーン油等）、低級アルコール類（エタノール、イソプロピルアルコール等）、多価アルコール類（プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、マルチトール等）、紫外線吸収剤（パラアミノ安息香酸エチル、サリチル酸オクチル、パラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシル、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン等）、無機粉末（タルク、カオリン、窒化ホウ素等）、有機粉末（セルロースパウダー、架橋型シリコーン末、ポリ四フッ化エチレン粉末等）、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸類等が挙げられる。

【0019】

本発明のサーチュイン遺伝子活性化剤を医薬品として調製する場合、その剤形に特に制限はなく、投与経路に応じて任意の剤形に調製することができる。経口投与に適した剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤等が挙げられ、非経口投与に適した剤形としては、例えば注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、パップ剤等が挙げられる。尚、注射剤は、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、点滴等のいずれに用いるものであっても良い。

【0020】

上記医薬品１００質量％中のわかめ由来成分の含有量は、その成分の種類や医薬品の剤形、投与経路等により異なるが、通常０．１〜１００質量％、好ましくは１〜９５質量％、より好ましくは５〜５０質量％の範囲内に設定することができる。

【0021】

また、本発明のサーチュイン遺伝子活性化剤は飲食品、化粧料等に添加して使用することができる。

【0022】

本発明のサーチュイン遺伝子活性化剤を飲食品に添加して使用する場合、添加対象となる飲食品の形態に特に制限はないが、例えば清涼飲料、ドロップ、キャンディ、チューインガム、チョコレート、グミ、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン、ゼリー菓子、クッキー、錠菓等が挙げられる。

【0023】

上記飲食品に対するサーチュイン遺伝子活性化剤の添加量はわかめ由来成分の種類や飲食品の形態等により異なるが、通常０．１〜９５質量％、好ましくは０．５〜８０質量％、より好ましくは１〜５０質量％の範囲内に設定することができる。

【0024】

本発明のサーチュイン遺伝子活性化剤を化粧料に添加して使用する場合、添加対象となる化粧料の形態に特に制限はないが、例えば化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム等の下地化粧料、乳液状、油性、固形状等の各剤型のファンデーション、アイカラー、チークカラー等のメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ネッククリーム、ボディローション等の身体用化粧料等が挙げられる。

【0025】

上記化粧料に対するサーチュイン遺伝子活性化剤の添加量はわかめ由来成分の種類や化粧料の形態等により異なるが、通常０．００１〜９５質量％、好ましくは０．１〜５０質量％、より好ましくは０．５〜１０質量％の範囲内に設定することができる。

【0026】

本発明のサーチュイン遺伝子活性化剤は、上記の通り医薬品として又は飲食品、化粧料等に添加して経口的若しくは非経口的に生体に投与することにより、生体内におけるサーチュイン遺伝子の発現を活性化することができる。尚、本発明のサーチュイン遺伝子活性化剤の有効成分であるわかめ由来成分は、食品として広く食されているわかめに由来し、安全性の高い成分であることから、経口的に投与することが好ましい。

【0027】

本発明のサーチュイン遺伝子活性化剤が発現を活性化するサーチュインに特に制限はないが、例えば哺乳類ではＳＩＲ２ファミリーに属する遺伝子としてＳＩＲＴ（ｓｉｒｔｕｉｎ）１〜７が見出されている。これらの中でも、とりわけＳＩＲＴ１に対して、本発明のサーチュイン遺伝子活性化剤は優れた発現活性化効果を発揮する。

【0028】

ここで、サーチュイン遺伝子の発現を活性化することによって、寿命延長効果以外にも、例えば、代謝改善（特に、インスリンや糖の恒常性が高まること又はインスリン感受性が亢進すること）、抗癌効果、心血管疾患（特に、動脈硬化）の予防、抗炎症効果、抗老化効果、白内障、骨粗鬆症、腎障害等の発症遅延の効果があることが報告されている。従って、本発明のサーチュイン遺伝子活性化剤は、特にこのような効果を得るための用途に好ましく用いることができる。即ち、本発明のサーチュイン遺伝子活性化剤は、例えば、寿命延長剤に加え、代謝改善剤、抗癌剤、血管疾患予防剤、抗炎症剤、抗老化剤、白内障予防剤、骨粗鬆症予防剤、腎障害予防剤として用いることができる。

【0029】

本発明のサーチュイン遺伝子活性化剤の生体に対する投与量は、該サーチュイン遺伝子活性化剤の配合組成や投与の目的、投与経路等により異なるが、例えば脱塩わかめを経口投与する場合、成人１日当たり１０〜５００００ｍｇの範囲であり、わかめタンパク質含有組成物を経口投与する場合、成人１日当たり２〜１００００ｍｇの範囲である。

【0030】

以下、実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【実施例】

【0031】

［製造例１］
［脱塩わかめの製造］
フレーク状乾燥わかめ２００ｇに２５％の含水エタノール４０００ｍＬを加え、これをスリーワンモーター（型式：ＢＬｈ６００；新東科学社製）を用いて速度「３」で６０分間撹拌し、洗浄した。洗浄後、濾過して液部を除去し、固形部に２５％（ｖ／ｖ）の含水エタノール４０００ｍＬを加え、更に同一の条件にて洗浄した。その後濾過して液部を除去し、固形部を９０℃で１時間真空乾燥し、更に４０℃で２４時間真空乾燥し、得られた乾燥物を粉砕し、粉末状の脱塩わかめ約１４６．４ｇを得た。以上の操作を計６回繰り返し、粉末状の脱塩わかめ（試作品１）約８７８ｇを得た。尚、得られた脱塩わかめのタンパク質含有量は２８％であった。

【0032】

［製造例２］
［わかめタンパク質含有組成物の製造］
水道水８０００ｍＬにクエン酸三ナトリウム二水和物１６０ｇ、無水クエン酸１．６ｇ、アルギン酸リアーゼ（製品名：アルギン酸リアーゼＳ；２８０００ｕｎｉｔｓ／ｇ；アマノエンザイム社製）４０ｍｇ及び脱塩わかめ（試作品１）２０１．５ｇを加え、撹拌しながら４５℃で４時間処理した。処理物を５０００×ｇ、１５℃で５分間遠心分離し、上清液を廃棄し、沈殿物を回収した。
得られた沈殿物に水道水６０００ｍＬ、クエン酸三ナトリウム二水和物８０ｇ、無水クエン酸０．８ｇ及びアルギン酸リアーゼ（製品名：アルギン酸リアーゼＳ；２８０００ｕｎｉｔｓ／ｇ；アマノエンザイム社製）４０ｍｇを加え、撹拌しながら４５℃で１７時間処理した。処理物を５０００×ｇ、１５℃で５分間遠心分離し、上清液を廃棄し、沈殿物を回収した。得られた沈殿物に超純水３０００ｍＬを加えて撹拌した後、５０００×ｇ、１５℃で５分間遠心分離し、沈殿物を回収する操作を４回繰り返すことにより、該沈殿物を洗浄した。洗浄後、沈殿物を凍結乾燥して粉砕し、７２．６ｇの粉砕物を得た。得られた粉砕物に１００％エタノール７００ｍｌを加えて１０分間撹拌し、濾過して液部を除去し、固形部を回収する操作を６回繰り返した。
得られた固形部を４０℃で２４時間真空乾燥し、６１．９ｇの乾燥物を得た。得られた乾燥物のうち６１．０ｇに水道水１５００ｍＬを加え、これに１Ｎ塩酸を加えｐＨ４．８に調整した後に、セルラーゼ（製品名：セルラーゼＴ「アマノ」４；アマノエンザイム社製）２ｇを加え、４５℃で５時間撹拌した。処理物を５０００×ｇ、１５℃で５分間遠心分離し、上清液を廃棄し、沈殿物を回収した。
得られた沈殿物に超純水１２００ｍＬを加えて撹拌した後、５０００×ｇ、１５℃で５分間遠心分離し、沈殿物を回収する操作を３回繰り返すことにより、該沈殿物を洗浄した。
洗浄した沈殿物に５０％エタノール１０００ｍＬを加えて撹拌した後、５０００×ｇ、１５℃で５分間遠心分離し、沈殿物を回収する操作を４回繰り返すことにより、沈殿物を更に洗浄した。洗浄した沈殿物に１００％エタノール１０００ｍＬを加えて撹拌した後、５０００×ｇ、１５℃で５分間遠心分離し、沈殿物を回収する操作を２回繰り返すことにより、沈殿物を更に洗浄した。
洗浄後、沈殿物を真空乾燥し、５０．２ｇのわかめタンパク質含有組成物（試作品２；タンパク質含有量約８０％）を得た。

【0033】

［試験例１］
［わかめ由来成分の長期摂取によるサーチュイン遺伝子発現活性化の評価］

【0034】

（１）わかめ由来成分混合飼料の調製
ＡＩＮ−９３Ｇ飼料（オリエンタル酵母工業社製）に脱塩わかめ（試作品１）を加えて均一になるように混合し、脱塩わかめを１質量％含有するわかめ由来成分混合飼料を調製した。

【0035】

（２）被検動物及び飼育環境
生後１９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄）７４匹にＡＩＮ−９３Ｇ飼料（オリエンタル酵母工業社製）及び水道水を自由に摂取させて７日間予備飼育し、下記の群分けを行った後試験に供した。予備飼育期間及び試験期間を通してマウスは室温２３±１℃、相対湿度４５．５±５％、換気回数２０回／時、照明時間８時〜２０時に維持された飼育室で飼育した。

【0036】

（３）群分け及び飼育期間
予備飼育したマウスの群分けを行った。群分けでは、各群の平均体重値がほぼ等しくなるように、わかめ由来成分混合飼料摂取群（以下、「ＷＣ摂取群」という）及び対照群の２群（各群３７匹）に分けた。ＷＣ摂取群にはわかめ由来成分混合飼料及び水道水を、対照群にはＡＩＮ−９３Ｇ飼料（オリエンタル酵母工業社製）及び水道水を自由摂取させて８８週間飼育した。飼育終了日に、生存していたマウスの体重を測定した後、解剖して肝臓を摘出した。尚、飼育終了日におけるマウスの生存率は、ＷＣ摂取群では５６．３％であり、対照群では４８．３％であった。即ち、わかめ由来成分として脱塩わかめを摂取したマウスは、寿命が延長したことが分かった。

【0037】

（４）ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現量の測定
飼育終了日に、生存していたマウスより血清コレステロール値が平均的な４匹の肝臓を各群から摘出し、摘出した肝臓を、その約１０倍容量のＲＮＡレーター試薬（Ａｍｂｉｏｎ社製）に浸漬し、４℃で一晩静置した。静置後の肝臓は、その後ＲＮＡの抽出に供するまでの間、−８０℃で保存した。次に、トリゾール試薬（商品名：ＴＲＩｚｏｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて各々の肝臓から全ＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ キット （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、添付の手順書に従いＲＮＡを精製した。
続いて、精製したＲＮＡについて、ＤＮＡマイクロアレイ（商品名：ＧｅｎｅＣｈｉｐｍｉＲＮＡ Ａｒｒａｙ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて、添付の手順書に従い、ＧｅｎｅＣｈｉｐ工程及びＡｒｒａｙのスキャンを実施した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ工程では、Ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ ４３０ ２．０を用いた。Ａｒｒａｙのスキャンの際は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ ３０００ Ｓｃａｎｎｅｒを用いて画像データを取得し、ＧｅｎｅＣｈｉｐデータ解析システムＧＣＯＳ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、各サンプルのＡｒｒａｙ画像データを確認した。更に、統計解析ソフトウェアＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）及び統計解析ソフトウェアＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／）を用いてサーチュイン遺伝子（ＳＩＲＴ１）の発現量を数値として抽出し、対照群の発現量（平均値）を１とした場合のＷＣ摂取群の発現量（平均値）を算出した。結果を表１に示す。

【0038】

【表1】

【0039】

表１の結果から、わかめ由来成分として脱塩わかめを摂取したマウスは、サーチュイン遺伝子（ＳＩＲＴ１）の発現が活性化することが分かった。

【0040】

［試験例２］
［わかめ由来成分の短期摂取によるサーチュイン遺伝子発現活性化の評価］

【0041】

（１）わかめ由来成分混合飼料の調製
ＡＩＮ−９３Ｇ飼料（オリエンタル酵母工業社製）に脱塩わかめ（試作品１）を加えて均一になるように混合し、脱塩わかめを１質量％含有するわかめ由来成分混合飼料１を調製した。また、ＡＩＮ−９３Ｇ飼料（オリエンタル酵母工業社製）にわかめタンパク質含有組成物（試作品２）を加えて均一になるように混合し、わかめタンパク質含有組成物を０．２５質量％含有するわかめ由来成分混合飼料２を調製した。

【0042】

（２）被検動物及び飼育環境
生後４週齢のＳＤラット（雄）１２匹にＡＩＮ−９３Ｇ飼料（オリエンタル酵母工業社製）及び水道水を自由に摂取させて７日間予備飼育し、下記の群分けを行った後試験に供した。予備飼育期間及び試験期間を通してラットは室温２３±１℃、相対湿度４５．５±５％、換気回数２０回／時、照明時間８時〜２０時に維持された飼育室で飼育した。

【0043】

（３）群分け及び飼育期間
予備飼育したラットの群分けを行った。群分けでは、各群の平均体重値がほぼ等しくなるように、わかめ由来成分混合飼料１摂取群（以下、「ＷＣ１摂取群」という）、わかめ由来成分混合飼料２摂取群（以下、「ＷＣ２摂取群」という）及び対照群の３群（各群４匹）に分けた。ＷＣ１摂取群にはわかめ由来成分混合飼料１及び水道水を、ＷＣ２摂取群にはわかめ由来成分混合飼料２及び水道水を、対照群にはＡＩＮ−９３Ｇ飼料（オリエンタル酵母工業社製）及び水道水を自由摂取させて２８日間飼育した。飼育終了日に、生存していたラットの体重を測定した後、解剖して肝臓を摘出した。

【0044】

（４）リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現量の測定
摘出した肝臓を、その約１０倍容量のＲＮＡレーター試薬（Ａｍｂｉｏｎ社製）に浸漬し、４℃で一晩静置した。静置後の肝臓は、その後ＲＮＡの抽出に供するまでの間、−８０℃で保存した。その後、ＭｉｃｒｏＳｍａｓｈ（型式：ＭＳ−１００；トミー精工社製）で肝臓を各々破砕処理し、得られた破砕液について、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、添付の手順書に従い全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡをＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて６２．５ｎｇ／μＬの濃度になるように希釈し、希釈した全ＲＮＡを１６μＬとＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）４μＬを混合した。その後、ＰＣＲ用サーマルサイクラー「ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用して｛２５℃ ５分 → ４２℃ ３０分 → ８５℃ ５分｝×１サイクルのプログラムにて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ溶液を得た。
続いて、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いてリアルタイムＲＣＲ解析を行った。具体的には、ＢｉｏＭａｒｋ ４８．４８ Ｄｙｎａｍｉｃ ＡｒｒａｙのＳａｍｐｌｅ ｉｎｌｅｔｓに、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ，ｎｏ ＵＮＧを３μＬ、ＧＥ Ｓａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔを０．３０μＬ、ｃＤＮＡ溶液を２．７０μＬ混合した溶液をアプライし、Ａｓｓａｙ ｉｎｌｅｔｓに、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙを３．０μＬ、Ａｓｓａｙ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔを３．０μＬ混合した溶液をアプライした。反応は、｛５０℃ ２分 → ９５℃ １０分｝×１サイクル → ｛９５℃ １５秒 → ６０℃ １分｝×４０サイクルのプログラムにて行った。得られたＴＡＴＡ ｂｏｘ結合タンパク質遺伝子とサーチュイン遺伝子（ＳＩＲＴ１）のＣｔ値（Ｔｈｅｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）から各群についてサーチュイン遺伝子（ＳＩＲＴ１）発現量（平均値）を算出し、更に対照群の発現量（平均値）を１とした場合のＷＣ１摂取群及びＷＣ２摂取群の発現量を算出した。結果を表２に示す。

【0045】

【表2】

【0046】

表２の結果から、わかめ由来成分として脱塩わかめ又はわかめタンパク質含有組成物を摂取したラットは、サーチュイン遺伝子（ＳＩＲＴ１）の発現が活性化することが分かった。また、その効果は、脱塩わかめを１質量％含有するわかめ由来成分混合飼料１を摂取したＷＣ１摂取群よりも、わかめタンパク質含有組成物を０．２５質量％含有するわかめ由来成分混合飼料２を摂取したＷＣ２摂取群のほうが高いことが確認された。