特許 6510074 ＮＡＤＰＨの精製プロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6510074

(24)【登録日】2019年4月12日

(45)【発行日】2019年5月8日

(54)【発明の名称】ＮＡＤＰＨの精製プロセス

(51)【国際特許分類】

   C07H 21/02 20060101AFI20190422BHJP

   C12P 19/36 20060101ALI20190422BHJP

   B01J 41/14 20060101ALI20190422BHJP

   B01J 41/05 20170101ALI20190422BHJP

   B01J 49/07 20170101ALI20190422BHJP

   B01J 49/57 20170101ALI20190422BHJP

   B01J 49/60 20170101ALI20190422BHJP

   B01D 61/02 20060101ALI20190422BHJP

   B01D 61/14 20060101ALI20190422BHJP

   B01D 63/02 20060101ALI20190422BHJP

   B01D 63/10 20060101ALI20190422BHJP

   B01D 69/00 20060101ALI20190422BHJP

   B01D 61/58 20060101ALI20190422BHJP

   C12P 1/00 20060101ALN20190422BHJP

   C07H 1/06 20060101ALN20190422BHJP

【ＦＩ】

   C07H21/02

   C12P19/36

   B01J41/14

   B01J41/05

   B01J49/07

   B01J49/57

   B01J49/60

   B01D61/02 500

   B01D61/14 500

   B01D63/02

   B01D63/10

   B01D69/00

   B01D61/58

   !C12P1/00 A

   !C07H1/06

【請求項の数】10

【全頁数】8

(21)【出願番号】特願2017-559118(P2017-559118)

(86)(22)【出願日】2016年12月14日

(65)【公表番号】特表2019-503334(P2019-503334A)

(43)【公表日】2019年2月7日

(86)【国際出願番号】CN2016109849

(87)【国際公開番号】WO2018107377

(87)【国際公開日】20180621

【審査請求日】2017年11月7日

(73)【特許権者】

【識別番号】516184986

【氏名又は名称】邦泰生物工程（深▲セン▼）有限公司

(73)【特許権者】

【識別番号】517389159

【氏名又は名称】江西邦泰緑色生物合成生態産業園発展有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100142804

【弁理士】

【氏名又は名称】大上 寛

(72)【発明者】

【氏名】張▲チー▼

(72)【発明者】

【氏名】張冬民

(72)【発明者】

【氏名】傅栄昭

【審査官】 三木 寛

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０５４６３０４３（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０４８９２７１０（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０４８７６９９３（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０４８７６９９４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０３２３３０５１（ＣＮ，Ａ）

【文献】 米国特許第０３７４９７０９（ＵＳ，Ａ）

【文献】 Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic，２００３年，Vol.24-25，p.39-52

【文献】 Current Analytical Chemistry，２００６年，Vol.2(4)，p.379-388

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｈ ２１／０２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＮＡＤＰを基質とし、デヒドロゲナーゼで触媒して製造されたＮＡＤＰＨ粗生成物を、孔径０．１〜０．５μｍの中空糸膜である精密ろ過膜を通過させる、前処理工程Ａと、
工程Ａで精密ろ過されたＮＡＤＰＨ粗生成物を陰イオン交換樹脂カラムに通液する、イオンカラム通液工程Ｂと、
通液終了後、溶出液に陽イオンが含まれなくなるまでイオンカラムを純水でリンスする、陽イオン溶出工程Ｃと、
溶出液に波長２６０ｎｍにおいて紫外吸収がある物質が含まれなくなるまでイオンカラムを０．０７〜０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液でリンスする、不純物溶出工程Ｄと、
０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムと、７％（Ｖ／Ｖ％）エタノールとを含有する水溶液でイオンカラムをリンスし、波長３４０ｎｍにおいて紫外吸収がある溶出液を収集する、製品溶出工程Ｅと、
工程Ｅで得られた溶出液を濃縮し、乾燥させた後、精製されたＮＡＤＰＨ完成品が得られる工程Ｆと、
を順に含むことを特徴とする、ＮＡＤＰＨの精製プロセス。

【請求項2】

前記陰イオン交換樹脂が、マクロポア型スチレン系第四級アミンＩ型強アルカリ性陰イオン交換樹脂であることを特徴とする、請求項１に記載のＮＡＤＰＨの精製プロセス。

【請求項3】

前記ＮＡＤＰＨ粗生成物の通液量は、ＮＡＤＰＨで陰イオン交換樹脂１ｇあたり９〜１５ｇであることを特徴とする、請求項２に記載のＮＡＤＰＨの精製プロセス。

【請求項4】

前記ＮＡＤＰＨ粗生成物のｐＨが低い場合に、工程Ａの前に前記ＮＡＤＰＨ粗生成物のｐＨを８．０〜１１．０に調整することをさらに含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のＮＡＤＰＨの精製プロセス。

【請求項5】

前記ＮＡＤＰＨ粗生成物のｐＨが低い場合に、工程Ａの前に前記ＮＡＤＰＨ粗生成物のｐＨを９．０〜１０．０に調整することをさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載のＮＡＤＰＨの精製プロセス。

【請求項6】

水酸化ナトリウム溶液に前記陰イオン交換樹脂を浸漬させ、その後、純水で中性に近くまでリンスする、という前記陰イオン交換樹脂に対する前処理工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のＮＡＤＰＨの精製プロセス。

【請求項7】

前記陰イオン交換樹脂を再生する工程をさらに含み、再生過程で使用される再生液が１．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムと、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を含有する水溶液であり、リンス速度が０．８〜１．５ＢＶ／Ｈであり、再生液の用量が２．０ＢＶであり、再生後、純水で樹脂を中性に近くまでリンスすることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＮＡＤＰＨの精製プロセス。

【請求項8】

工程Ｃ及び工程Ｄは全過程で紫外可視分光光度計により検出を行い、前記溶出液の収集方式は、前記紫外可視分光光度計の示した値が上がり始める時に収集を開始し、示した値が下がり始める時に収集を停止することを特徴とする、請求項１又は２に記載のＮＡＤＰＨの精製プロセス。

【請求項9】

前記濃縮処理は、精密ろ過と、限外ろ過と、ナノろ過とを順に含み、前記精密ろ過処理には孔径０．１〜０．５μｍの中空糸膜を使用し、前記限外ろ過処理には分画分子量が１０Ｋの限外ろ過膜を使用し、前記ナノろ過処理には分画分子量が１００〜４００のスパイラル膜を使用することを特徴とする、請求項１又は２に記載のＮＡＤＰＨの精製プロセス。

【請求項10】

前記乾燥処理が真空凍結乾燥であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＮＡＤＰＨの精製プロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヌクレオチド系補酵素の精製プロセスの技術分野に関し、特にバイオ触媒法で製造されたＮＡＤＰＨ粗生成物を精製するプロセスに関する。

【背景技術】

【0002】

ＮＡＤＰＨは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ Ａｄｅｎｉｎｅ Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の英語略語で、ヒト細胞を含むあらゆる活細胞に存在する非常に重要な生理物質であり、酸化−還元反応を触媒できる数多くの酵素の補助因子であり、還元型補酵素ＩＩと呼ばれる。

【0003】

ＮＡＤＰＨは、生体細胞内で様々な合成代謝反応、例えば脂類、脂肪酸及びヌクレオチドの合成に関与し、これらの反応において、ＮＡＤＰＨは還元剤、水素負イオン供与体として必要なものである。また、ＮＡＤＰＨは、生体内で水素移動の担体として働くほか、リン酸移動の媒介として各種の合成反応に関与している。

【0004】

現在、ＮＡＤＰＨは、各種の医薬生化学企業の製品の製造に広く適用されている。また、ＮＡＤＰＨによる疾患の治療と予防についての研究が進むにつれて、ＮＡＤＰＨの医薬保健品としての重要性が益々目立ってきており、市場ニーズが年々増えている。

【0005】

これまで、ＮＡＤＰＨの製造方法は主に、１、サッカロマイセス発酵法、２、化学的合成法、３、バイオ触媒法の三つを含む。そのうち、化学的合成法にはコストが高くてキラル化合物を生成するという欠点があり、サッカロマイセス発酵法で生産されたＮＡＤＰＨには一定の有機溶剤が残っている。これに対して、バイオ触媒法は、有機溶剤の残留もなく、キラルの問題もなく、かつ製造されたＮＡＤＰＨが生体内のものと相同であるため、今まで環境に最も優しくて公害がないＮＡＤＰＨの製造方法となる。

【0006】

従来のＮＡＤＰＨを製造するためのバイオ触媒法では、一般的にＮＡＤＰを基質とし、デヒドロゲナーゼの触媒作用で製造する。この方法で製造されたＮＡＤＰＨ粗生成物に対して、比較的純粋なＮＡＤＰＨ完成品を得るために、更なる精製処理が必要である。現在、通常適用される精製処理方法は、液体クロマトグラフィー及びイオン交換樹脂法を含む。液体クロマトグラフィーには、精製生成物の純度が高く、収率が高い利点があるが、ＮＡＤＰＨ自身が有する官能基が極めて強い極性及び親水性を有するため、液体クロマトグラフィーによる精製処理中にイオン対試薬及び緩衝塩が導入されてしまい、イオン対試薬の分離が困難であり、かつ、精製過程で有機試薬の使用が必要である。したがって、液体クロマトグラフィーは、新たな不純物を導入し、またコストが高いので、工業的生産に適さない。そして、現在当業界で通常採用されているイオン交換樹脂法によるＮＡＤＰＨの純度は９５％程度が限界であり、収率は６０％程度が限界であり、生産能力が大きく制限され、市場ニーズを満たせない。

【発明の概要】

【0007】

従来技術の上記欠点に鑑みて、従来のイオン交換樹脂法に存在する収率が低くて精製生成物の純度が低いという技術問題を解決するために、本発明は、収率が高く、生成物の純度が高く、バイオ触媒法で製造されたＮＡＤＰＨ粗生成物を精製処理するための新規なイオン交換樹脂法を提供することを目的とする。

【0008】

前記目的を実現するために、本発明は、以下の工程を順に含むことを特徴とするＮＡＤＰＨの精製プロセスを提供する。

【0009】

バイオ触媒法で製造されたＮＡＤＰＨ粗生成物を、孔径０．１〜０．５μｍの中空糸膜である精密ろ過膜を通過させる、前処理工程Ａ。

【0010】

本発明で提供するＮＡＤＰＨの精製プロセスの適用処理対象は、バイオ触媒法でＮＡＤＰＨを製造して得られたＮＡＤＰＨ粗生成物である。当該バイオ触媒法とは、具体的に、生体酵素で基質を触媒してＮＡＤＰＨに変換させる方法をいう。その中で、生体酵素としては、デヒドロゲナーゼ、又はデヒドロゲナーゼと一種類以上の他の酵素とを併用し、基質としては、ＮＡＤＰであっても、ＮＡＤＰに変換可能な前駆体であってもよい。ＮＡＤＰＨ粗生成物とは、酵素により基質を触媒して完全に反応させた後に得られた、いかなる処理も行っていない酵素反応液のことをいう。反応過程における微生物及び固体触媒が精製の純度及び収率に影響を及ぼすため、反応過程における固体顆粒及び微生物を除去するように、精密ろ過膜によりＮＡＤＰＨを初歩的に精製する。選択される膜の孔径が大きすぎると、一部の固体や微生物がきれいに除去されないことがあり、膜の孔径が小さすぎると、ＮＡＤＰＨが通過できない。

【0011】

工程Ａで精密ろ過されたＮＡＤＰＨ粗生成物を陰イオン交換樹脂カラムに通液する、イオンカラム通液工程Ｂ。

【0012】

ＮＡＤＰＨ粗生成物を陰イオン交換樹脂カラムに通液するとは、主にＮＡＤＰＨをイオン結合としてイオン交換樹脂に吸着させ、そして異なる溶出条件で不純物とＮＡＤＰＨとをそれぞれ溶出させ、比較的純粋な製品を得ることである。

【0013】

通液終了後、溶出液に陽イオンが含まれなくなるまでイオンカラムを純水でリンスする、陽イオン溶出工程Ｃ。

【0014】

ＮＡＤＰＨ粗生成物には、金属イオン及び有機陽イオンが含まれる。陽イオン自身が陰イオン交換樹脂に吸着されにくいが、ＮＡＤＰＨを吸着した陰イオン交換樹脂が陽イオンと親吸着しやすいので、陽イオンを溶出させないと、製品の含有量と純度が低くなる。

【0015】

溶出液に波長２６０ｎｍにおいて紫外吸収がある物質が含まれなくなるまでイオンカラムを０．０７〜０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液でリンスする、不純物溶出工程Ｄ。

【0016】

ＮＡＤＰＨ粗生成物には、原料と若干の反応副生成物を含む不純物が含まれており、これらの不純物は点電荷が異なる。点電荷の差異によって、濃度の低い塩化ナトリウム溶液によりイオン結合が弱い不純物を溶出させることができる。使用中、塩化ナトリウム溶液の濃度が高すぎると、ＮＡＤＰＨを溶出させてしまい、収率が低下するので、好ましくない。また、塩化ナトリウム溶液の濃度が低すぎると、イオン結合が弱い不純物を溶出させることができず、その結果、ＮＡＤＰＨの純度が低く要求を満たせなくなるので、好ましくない。ＮＡＤＰＨも不純物も波長２６０ｎｍにおいて紫外吸収があるため、２６０ｎｍの波長を検出波長として選択する。

【0017】

０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムと、７％（Ｖ／Ｖ％）エタノールとを含有する水溶液でイオンカラムをリンスし、波長３４０ｎｍにおいて紫外吸収がある溶出液を収集する、製品溶出工程Ｅ。

【0018】

製品の溶出濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、７％（Ｖ／Ｖ％）エタノールの水溶液を選択する。溶出条件を低下させると、製品のテーリング又は溶出不完全となり、製品の収率が低く過ぎる。また、塩化ナトリウムの濃度又はエタノールの濃度をさらに増大させると、若干のイオン結合が強い不純物を製品に溶出させて純度を低下させる。波長３４０ｎｍにおいて製品は紫外吸収があるが、不純物は紫外吸収がないため、３４０ｎｍの波長で製品を収集することにする。

【0019】

工程Ｅで得られた溶出液を濃縮し、乾燥させた後、精製されたＮＡＤＰＨ完成品が得られる工程Ｆ。

【0020】

好ましくは、前記陰イオン交換樹脂が、マクロポア型スチレン系第四級アミンＩ型強アルカリ性陰イオン交換樹脂である。本発明者は、大量の陰イオン交換樹脂に対して実験を行い、スクリーニングした後、マクロポア型スチレン系第四級アミンＩ型強アルカリ性陰イオン交換樹脂がＮＡＤＰＨに対して担持容量が非常に高く、それに当該精製プロセスに応用されて得られたＮＡＤＰＨ完成品の収率が高く、純度が９８％以上となり、実際のプロセス操作及び樹脂の再生処理も簡単であることを見出した。

【0021】

より好ましくは、前記ＮＡＤＰＨ粗生成物の通液量は、ＮＡＤＰＨでマクロポア型スチレン系第四級アミンＩ型強アルカリ性陰イオン交換樹脂１ｇあたり、９〜１５ｇである。

【0022】

前記ＮＡＤＰＨ粗生成物のｐＨが低い場合に、前記プロセスは、生成物の安定性を保持するように、工程Ａの前に前記ＮＡＤＰＨ粗生成物のｐＨを８．０〜１１．０に調整することをさらに含むことが好ましい。より好ましくは、前記ＮＡＤＰＨ粗生成物のｐＨを９．０〜１０．０に調整する。

【0023】

ＮＡＤＰＨは、アルカリ環境で安定であるため、前記プロセスは、水酸化ナトリウム溶液に前記陰イオン交換樹脂を浸漬させることにより、樹脂をＣｌ−からＯＨ−に転化させ、その後、純水で中性に近くまでリンスする、という前記陰イオン交換樹脂に対する前処理工程をさらに含むことが好ましい。その中で、水酸化ナトリウム溶液の濃度は、０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。

【0024】

生産のコストを低下させるように陰イオン交換樹脂をリサイクルするために、好ましくは、前記プロセスは、前記陰イオン交換樹脂を再生する工程をさらに含み、再生過程で使用される再生液が１．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムと、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を含有する水溶液であり、リンス速度が０．８〜１．５ＢＶ／Ｈであり、再生液の用量が２．０ＢＶであり、再生後、純水で樹脂を中性に近くまでリンスする。

【0025】

好ましくは、前記精製プロセス中の工程Ｃ及び工程Ｄは全過程で紫外可視分光光度計により検出を行い、前記溶出液の収集方式は、前記紫外可視分光光度計の示した値が上がり始める時に収集を開始し、示した値が下がり始める時に収集を停止する。

【0026】

前記精製プロセスにおいて、工程Ｆにおける濃縮処理には、本分野において既知の適用できる任意の濃縮方式を採用してよい。好ましくは、前記濃縮処理は、精密ろ過、限外ろ過及びナノろ過を順に含む。製品精製後に得られた収集液は含有量が低く、大量の水、塩、エタノールが含まれており、ナノろ過により塩及びエタノールを除去する、並びに濃縮効果を達成する。その中で、前記精密ろ過処理には孔径０．１〜０．５μｍの中空糸膜を使用し、固体顆粒及び若干の微生物を除去することを目的とする。前記限外ろ過処理には分画分子量が１０Ｋの限外ろ過膜を使用し、エンドトキシン及び微生物を除去することを目的とする。前記ナノろ過処理には分画分子量が１００〜４００のスパイラル膜を使用し、小分子の不純物を除去することを目的とする。

【0027】

前記精製プロセスにおいて、工程Ｆにおける乾燥処理には、本分野において既知の適用できる任意の乾燥方式を採用してよい。好ましくは、前記乾燥処理が真空凍結乾燥である。

【発明の効果】

【0028】

従来技術に比べ、本発明で提供するＮＡＤＰＨの精製プロセスは、収率が高く、精製生成物の純度が高いという利点を有する。工業的実施より、当該精製プロセスの収率は８５％以上に達せ、精製されたＮＡＤＰＨの純度は９８％以上と高いと証明された。また、当該プロセスは、有毒有害の有機溶剤を使用せず、環境に優しく、プロセスが簡単で操作しやすく、生産のコストが低いので、精製された製品は非常に市場競争力がある。当該プロセスは、バイオ触媒法でＮＡＤＰＨを製造して得られたＮＡＤＰＨ粗生成物の精製に対して一般的適用性を有する。

【発明を実施するための形態】

【0029】

以下に、具体的な実施例を参照して本発明をさらに詳しく説明するが、以下の実施例は本発明に対する解釈であり、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0030】

実施例１
処理対象はＢｏｎｔａｃ Ｂｉｏ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（深セン）株式会社が生体酵素触媒法（ＮＡＤＰを基質とし、デヒドロゲナーゼで触媒してＮＡＤＰＨを製造する）で製造された４種類のＮＡＤＰＨ粗生成物溶液であり、これらの４種類のＮＡＤＰＨ粗生成物溶液中のＮＡＤＰＨの含有量の測定結果を表１に示す。

【0031】

前記４種類のＮＡＤＰＨ粗生成物溶液の精製過程は以下のとおりである。
１、樹脂前処理：マクロポア型スチレン系第四級アミンＩ型強アルカリ性陰イオン交換樹脂をイオンカラムに充填し、０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を加えて浸漬を行い、その後、純水で中性に近くまでリンスした。
２、ＮＡＤＰＨ粗生成物前処理：バイオ触媒法で製造されたＮＡＤＰＨ粗生成物のｐＨを９．０〜１０．０に調整し、そしてｐＨが調整されたＮＡＤＰＨ粗生成物を孔径０．４５μｍの中空糸膜を通過させて精密ろ過処理を行った。
３、イオンカラム通液：工程２で精密ろ過を行ったＮＡＤＰＨ粗生成物を、工程１で前処理されたイオンカラムに通液し、通液速度が０．８〜１．５ＢＶ／Ｈであり、通液量が陰イオン交換樹脂１ｇあたり９〜１５ｇであった。
４、陽イオン溶出：通液終了後、純水でイオンカラムをリンスし、リンス速度が０．５〜２．０ＢＶ／Ｈであり、全過程で硬水指示薬を用いて溶出液をオンラインで検出し、硬水指示薬が変色しなくなるまでリンスし続けた（硬水指示薬が青色から赤色に変化したことは、陽イオンがきれいに除去されたことを示し、青色が変化しないことは、多価陽イオンがないことを示す）。
５、不純物溶出：０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液でイオンカラムをリンスし、全過程で紫外可視分光光度計を用いて溶出液をオンラインで検出し、検出波長は２６０ｎｍとし、紫外可視分光光度計の示した値の変化を観察し、示した値が上がってから下がり、示した値が変化しなくなるときにリンスを停止した。
６、製品溶出：０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムと、７％（Ｖ／Ｖ％）エタノールとを含有する水溶液でイオンカラムをリンスし、全過程で紫外可視分光光度計を用いて溶出液をオンラインで検出し、検出波長は３４０ｎｍとし、紫外可視分光光度計の示した値の変化を観察し、示した値が上がり始める時に溶出液を収集し、示した値が下がり始める時に収集を停止し、溶出液の収集が完成した後イオンカラムに対して再生処理を施した。
７、後処理：工程６で収集された溶出液を順に精密ろ過、限外ろ過及びナノろ過処理により、１００〜１５０ｇ／Ｌまで濃縮させた後、真空凍結乾燥機で乾燥させてＮＡＤＰＨ完成品を得た。その中で、精密ろ過過程に孔径０．４５μｍの中空糸膜を使用し、限外ろ過過程に分画分子量が１０Ｋの限外ろ過膜を使用し、ナノろ過過程に分画分子量が１００〜４００のスパイラル膜を使用した。

【0032】

高速液体クロマトグラフィーにより、これらの４種類の精製されたＮＡＤＰＨ完成品の含有量及び純度を測定し、収率を計算した。その結果を表１に示す。
表１
ＮＡＤＰＨ粗生成物溶液 精製されたＮＡＤＰＨ完成品
種類 通液体積／Ｌ ＮＡＤＰＨ含有量／ｇ ＮＡＤＰＨ含有量／ｇ 酵素活性／％ 純度／％ 収率／％
１ １３０００ １０２８９ ８８７９．４ ９８．３ ９８．７ ８６．３
２ １５０００ １２００６ １０４６９．２ ９８．１ ９８．５ ８７．２
３ ３６０００ ２３０６９ ２００００．８ ９８．２ ９８．４ ８６．７
４ ３８０００ ２５７３６ ２２０８１．５ ９８．５ ９９．１ ８５．８

【0033】

実施例２
イオンカラムの再生過程は以下のとおりである。
１、リンス：紫外可視分光光度計の示した値が０．５以下に下がるまで、大量の純水で樹脂に残存した副生成物を流した。
２、再生：１．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムと、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を含有する水溶液を再生液として調製し、再生弁を開け、再生ポンプを開け、再生液でイオンカラムをリンスした。リンス速度が０．８〜１．５ＢＶ／Ｈであり、再生液の用量が２．０ＢＶであった。
３、水洗：再生液による再生が完成した後、カラム容量の２〜３倍の純水でイオンカラムを中性に近くまでリンスした後、当該イオンカラムが次の精製処理に用いられることができ、吸着性が良好である。