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6513567肺腺癌の治療で使用するためのＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ、およびＲＥＴの阻害剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6513567
(24)【登録日】2019年4月19日
(45)【発行日】2019年5月15日
(54)【発明の名称】肺腺癌の治療で使用するためのＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ、およびＲＥＴの阻害剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7068 20060101AFI20190425BHJP
A61K 31/337 20060101ALI20190425BHJP
A61K 31/7028 20060101ALI20190425BHJP
A61K 33/24 20190101ALI20190425BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20190425BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7068
A61K31/337
A61K31/7028
A61K33/24
A61P35/00
【請求項の数】10
【全頁数】58
(21)【出願番号】特願2015-531283(P2015-531283)
(86)(22)【出願日】2013年9月9日
(65)【公表番号】特表2015-530389(P2015-530389A)
(43)【公表日】2015年10月15日
(86)【国際出願番号】US2013058768
(87)【国際公開番号】WO2014039971
(87)【国際公開日】20140313
【審査請求日】2016年9月8日
【審判番号】不服2018-7356(P2018-7356/J1)
【審判請求日】2018年5月30日
(31)【優先権主張番号】61/698,143
(32)【優先日】2012年9月7日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】504408797
【氏名又は名称】エクセリクシス， インク．
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】アフターブ， ダーナ ティー．
【合議体】
【審判長】
村上 騎見高
【審判官】
光本 美奈子
【審判官】
前田 佳与子
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１２／０５３６０６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
新しい肺がん治療標的遺伝子の発見，国立がん研究センター プレスリリース，２０１２年 ２月 ９日，インターネット：＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｊｐ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｐｒ＿ｒｅｌｅａｓｅ／ｐｒｅｓｓ＿ｒｅｌｅａｓｅ＿２０１２０２０９．ｈｔｍｌ
【文献】
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．１５、ｓｕｐｐ，Ａｂｓ．Ｎｏ．７５７８（２０１２．５月）
【文献】
Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ ２０１６，ｖｏｌ．１７，ｐ．１６５３−１６６０
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
A61K31/00-31/80
ＣＡｐｌｕｓ，ＲＥＧＩＳＴＲＹ
ＭＥＤＬＩＮＥ，ＥＭＢＡＳＥ
ＢＩＯＳＩＳ，ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
肺腺癌を治療するための医薬であって、有効量のＮ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ′−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミド（化合物１）
またはその薬学的に許容される塩を含み、前記肺腺癌が、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性の非小細胞肺癌である、医薬。
【請求項2】
化合物１が、（Ｌ）−リンゴ酸塩または（Ｄ）−リンゴ酸塩である、請求項１に記載の医薬。
【請求項3】
化合物１が、前記（Ｌ）リンゴ酸塩および／または前記（Ｄ）リンゴ酸塩の結晶性Ｎ−１型またはＮ−２型である、請求項２に記載の医薬。
【請求項4】
化合物１またはその薬学的に許容される塩が、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む薬学的組成物として投与される、請求項３に記載の医薬。
【請求項5】
化合物１が、別の形態の治療の後で投与される、請求項４に記載の医薬。
【請求項6】
化合物１が、シスプラチンおよび／またはゲムシタビン治療後に投与される、請求項４に記載の医薬。
【請求項7】
化合物１が、ドセタキセル治療後に投与される、請求項４に記載の医薬。
【請求項8】
化合物１が、シスプラチンおよび／またはゲムシタビンおよび／またはドセタキセル治療後に投与される、請求項４に記載の医薬。
【請求項9】
哺乳動物における異常細胞の成長の進行を阻害する、または逆転させるための医薬であって、有効量のＮ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ′−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミド（化合物１）
またはその薬学的に許容される塩を含み、前記異常細胞の成長がＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性の非小細胞肺癌である、医薬。
【請求項10】
化合物１またはその薬学的に許容される塩が、化合物１またはその薬学的に許容される塩および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物として投与される、請求項９に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照本出願は、２０１２年９月７日に出願された米国特許仮出願第６１／６９８，１４３号の優先権の利益を主張し、当該出願の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ、およびＲＥＴの阻害剤を使用する、癌、具体的には、肺腺癌の検出、診断、および治療に関する。
【背景技術】
【0003】
肺癌は、世界中で、癌に関連した死亡の主な原因である。標的療法における最近の発達は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療パラダイム変化をもたらした。Ｍｏｋ ＴＳ，Ｗｕ ＹＬ，Ｔｈｏｎｇｐｒａｓｅｒｔ Ｓ，Ｙａｎｇ ＣＨ，Ｃｈｕ ＤＴ，Ｓａｉｊｏ Ｎ，Ｓｕｎｐａｗｅｒａｖｏｎｇ Ｐ，Ｈａｎ Ｂ，Ｍａｒｇｏｎｏ Ｂ，Ｉｃｈｉｎｏｓｅ Ｙ，Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ Ｙ，Ｏｈｅ Ｙ，Ｙａｎｇ ＪＪ，Ｃｈｅｗａｓｋｕｌｙｏｎｇ Ｂ，Ｊｉａｎｇ Ｈ，Ｄｕｆｆｉｅｌｄ ＥＬ，Ｗａｔｋｉｎｓ ＣＬ，Ａｒｍｏｕｒ ＡＡ，Ｆｕｋｕｏｋａ Ｍ．Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ ｏｒ ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ−ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００９ Ｓｅｐ ３；３６１（１０）：９４７−５７。Ｍａｅｍｏｎｄｏ Ｍ，Ｉｎｏｕｅ Ａ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｋ，Ｓｕｇａｗａｒａ Ｓ，Ｏｉｚｕｍｉ Ｓ，Ｉｓｏｂｅ Ｈ，Ｇｅｍｍａ Ａ，Ｈａｒａｄａ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｚａｗａ Ｈ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ Ｉ，Ｆｕｊｉｔａ Ｙ，Ｏｋｉｎａｇａ Ｓ，Ｈｉｒａｎｏ Ｈ，Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｋ，Ｈａｒａｄａ Ｔ，Ｏｇｕｒａ Ｔ，Ａｎｄｏ Ｍ，Ｍｉｙａｚａｗａ Ｈ，Ｔａｎａｋａ Ｔ，Ｓａｉｊｏ Ｙ，Ｈａｇｉｗａｒａ Ｋ，Ｍｏｒｉｔａ Ｓ，Ｎｕｋｉｗａ Ｔ；Ｎｏｒｔｈ−Ｅａｓｔ Ｊａｐａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ ｏｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ｍｕｔａｔｅｄ ＥＧＦＲ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０ Ｊｕｎ ２４；３６２（２５）：２３８０−８。上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である、ゲフィチニブおよびエルロチニブ、ならびに未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）のＴＫＩである、クリゾチニブは、ＥＧＦＲ突然変異またはＡＬＫ遺伝子再構成を有するＮＳＣＬＣ患者において臨床活性を示した。Ｋｗａｋ ＥＬ，Ｂａｎｇ ＹＪ，Ｃａｍｉｄｇｅ ＤＲ，Ｓｈａｗ ＡＴ，Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｂ，Ｍａｋｉ ＲＧ，Ｏｕ ＳＨ，Ｄｅｚｕｂｅ ＢＪ，Ｊaｎｎｅ ＰＡ，Ｃｏｓｔａ ＤＢ，Ｖａｒｅｌｌａ−Ｇａｒｃｉａ Ｍ，Ｋｉｍ ＷＨ，Ｌｙｎｃｈ ＴＪ，Ｆｉｄｉａｓ Ｐ，Ｓｔｕｂｂｓ Ｈ，Ｅｎｇｅｌｍａｎ ＪＡ，Ｓｅｑｕｉｓｔ ＬＶ，Ｔａｎ Ｗ，Ｇａｎｄｈｉ Ｌ，Ｍｉｎｏ−Ｋｅｎｕｄｓｏｎ Ｍ，Ｗｅｉ ＧＣ，Ｓｈｒｅｅｖｅ ＳＭ，Ｒａｔａｉｎ ＭＪ，Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ Ｊ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＪＧ，Ｈａｂｅｒ ＤＡ，Ｗｉｌｎｅｒ Ｋ，Ｓａｌｇｉａ Ｒ，Ｓｈａｐｉｒｏ ＧＩ，Ｃｌａｒｋ ＪＷ，Ｉａｆｒａｔｅ ＡＪ．Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０ Ｏｃｔ ２８；３６３（１８）：１６９３−７０３。加えて、ＲＯＳ１遺伝子再構成は、ＮＳＣＬＣに罹患している患者の約２％において報告されており、この患者サブグループにおいてクリゾチニブを使用した臨床活性が報告されている。Ｂｅｒｇｅｔｈｏｎ Ｋ，Ｓｈａｗ ＡＴ，Ｏｕ ＳＨ，Ｋａｔａｙａｍａ Ｒ，Ｌｏｖｌｙ ＣＭ，ＭｃＤｏｎａｌｄ ＮＴ，Ｍａｓｓｉｏｎ ＰＰ，Ｓｉｗａｋ−Ｔａｐｐ Ｃ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ａ，Ｆａｎｇ Ｒ，Ｍａｒｋ ＥＪ，Ｂａｔｔｅｎ ＪＭ，Ｃｈｅｎ Ｈ，Ｗｉｌｎｅｒ ＫＤ，Ｋｗａｋ ＥＬ，Ｃｌａｒｋ ＪＷ，Ｃａｒｂｏｎｅ ＤＰ，Ｊｉ Ｈ，Ｅｎｇｅｌｍａｎ ＪＡ，Ｍｉｎｏ−Ｋｅｎｕｄｓｏｎ Ｍ，Ｐａｏ Ｗ，Ｉａｆｒａｔｅ ＡＪ．ＲＯＳ１ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ｄｅｆｉｎｅ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１２ Ｍａｒ １０；３０（８）：８６３−７０。Ｓｈａｗ ＡＴ，Ｃａｍｉｄｇｅ，Ｅｎｇｅｌｍａｎ ＪＡ，Ｓｏｌｏｍｏｎ ＢＪ，Ｋｗａｋ ＥＬ，Ｃｌａｒｋ ＪＷ，Ｓａｌｇｉａ Ｒ，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｂａｎｇ ＹＪ，Ｔａｎ Ｗ，Ｔｙｅ Ｌ，Ｗｉｌｎｅｒ ＫＤ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ Ｐ，Ｖａｒｅｌｌａ−Ｇａｒｃｉａ Ｍ，Ｂｅｒｇｅｔｈｏｎ Ｋ，Ｉａｆｒａｔｅ ＡＪ，Ｏｕ ＳＨ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ（ＮＳＣＬＣ）ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ＲＯＳ１ ｇｅｎｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１２ ３０（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ ７５０８）。ＫＩＦ５Ｂ（キネシンファミリー５Ｂ）遺伝子とＲＥＴ癌遺伝子の融合は、近年、ＮＳＣＬＣ患者の１〜２％においてドライバー突然変異（ｄｒｉｖｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ）として報告されており、治療標的として注目されている。Ｋｏｈｎｏ Ｔ，Ｉｃｈｉｋａｗａ Ｈ，Ｔｏｔｏｋｉ Ｙ，Ｙａｓｕｄａ Ｋ，Ｈｉｒａｍｏｔｏ Ｍ，Ｎａｍｍｏ Ｔ，Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｈ，Ｔｓｕｔａ Ｋ，Ｆｕｒｕｔａ Ｋ，Ｓｈｉｍａｄａ Ｙ，Ｉｗａｋａｗａ Ｒ，Ｏｇｉｗａｒａ Ｈ，Ｏｉｋｅ Ｔ，Ｅｎａｒｉ Ｍ，Ｓｃｈｅｔｔｅｒ ＡＪ，Ｏｋａｙａｍａ Ｈ，Ｈａｕｇｅｎ Ａ，Ｓｋａｕｇ Ｖ，Ｃｈｉｋｕ Ｓ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｉ，Ａｒａｉ Ｙ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｓ，Ｓｅｋｉｎｅ Ｉ，Ｏｇａｗａ Ｓ，Ｈａｒｒｉｓ ＣＣ，Ｔｓｕｄａ Ｈ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ，Ｙｏｋｏｔａ Ｊ，Ｓｈｉｂａｔａ Ｔ．ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１２ Ｆｅｂ １２；１８（３）：３７５−７。Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｋ，Ｓｏｄａ Ｍ，Ｔｏｇａｓｈｉ Ｙ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｒ，Ｓａｋａｔａ Ｓ，Ｈａｔａｎｏ Ｓ，Ａｓａｋａ Ｒ，Ｈａｍａｎａｋａ Ｗ，Ｎｉｎｏｍｉｙａ Ｈ，Ｕｅｈａｒａ Ｈ，Ｌｉｍ Ｃｈｏｉ Ｙ，Ｓａｔｏｈ Ｙ，Ｏｋｕｍｕｒａ Ｓ，Ｎａｋａｇａｗａ Ｋ，Ｍａｎｏ Ｈ，Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｙ．ＲＥＴ，ＲＯＳ１ ａｎｄ ＡＬＫ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１２ Ｆｅｂ １２；１８（３）：３７８−８１。Ｌｉｐｓｏｎ Ｄ，Ｃａｐｅｌｌｅｔｔｉ Ｍ，Ｙｅｌｅｎｓｋｙ Ｒ，Ｏｔｔｏ Ｇ，Ｐａｒｋｅｒ Ａ，Ｊａｒｏｓｚ Ｍ，Ｃｕｒｒａｎ ＪＡ，Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ｓ，Ｂｌｏｏｍ Ｔ，Ｂｒｅｎｎａｎ ＫＷ，Ｄｏｎａｈｕｅ Ａ，Ｄｏｗｎｉｎｇ ＳＲ，Ｆｒａｍｐｔｏｎ ＧＭ，Ｇａｒｃｉａ Ｌ，Ｊｕｈｎ Ｆ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＫＣ，Ｗｈｉｔｅ Ｅ，Ｗｈｉｔｅ Ｊ，Ｚｗｉｒｋｏ Ｚ，Ｐｅｒｅｔｚ Ｔ，Ｎｅｃｈｕｓｈｔａｎ Ｈ，Ｓｏｕｓｓａｎ−Ｇｕｔｍａｎ Ｌ，Ｋｉｍ Ｊ，Ｓａｓａｋｉ Ｈ，Ｋｉｍ ＨＲ，Ｐａｒｋ ＳＩ，Ｅｒｃａｎ Ｄ，Ｓｈｅｅｈａｎ ＣＥ，Ｒｏｓｓ ＪＳ，Ｃｒｏｎｉｎ ＭＴ，Ｊaｎｎｅ ＰＡ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＰＪ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ＡＬＫ ａｎｄ ＲＥＴ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｐｓｉｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１２ Ｆｅｂ １２；１８（３）：３８２−４。したがって、ＮＳＣＬＣにおける重要なドライバー遺伝子を特定し、患者のそれぞれのゲノムサブセットに対して治療法を開発することがより重要となっている。
【発明の概要】
【0004】
これらのおよび他の必要性は、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ、およびＲＥＴの阻害剤を使用して肺腺癌を治療するための方法を対象とする本発明によって、満たされる。本方法は、治療有効量の、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ、およびＲＥＴを調節する化合物を、そのような治療を必要とする患者に投与することを含む。一実施形態において、肺腺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。より具体的には、肺腺癌は、最も高い頻度で、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性のＮＳＣＬＣであり、ＣＣＤＣ６、ＮＣＯＡ４、およびＴＲＩＭ３３を含む他の既知のＲＥＴ融合、ならびに染色体１０における他のＲＥＴ融合である。
【0005】
一態様において、本発明は、ＮＳＣＬＣの治療をそのような治療を必要とする患者において行うための方法に関し、本方法は、患者に、治療有効量の、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ、およびＲＥＴを同時に調節する化合物を投与することを含む。
【0006】
この一実施形態および他の態様において、二重に作用するＭＥＴ／ＶＥＧＦＲ／ＲＥＴ阻害剤は、式ＩＲ１がハロであり、
Ｒ２がハロであり、
Ｒ３が（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、
Ｒ４が（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、
Ｑが、ＣＨまたはＮである。
【0007】
別の実施形態において、式Ｉの化合物は、式ＩａＲ１がハロであり、
Ｒ２がハロであり、
Ｑが、ＣＨまたはＮである。
【0008】
別の実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１：【0009】
化合物１は、ｃ−ＭＥＴ、ＲＥＴ、およびＶＥＧＦＲ２の強力な阻害剤である。Ｙａｋｅｓ ＦＭ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｔａｎ Ｊ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｋ，Ｓｈｉ Ｙ，Ｙｕ Ｐ，Ｑｉａｎ Ｆ，Ｃｈｕ Ｆ，Ｂｅｎｔｚｉｅｎ Ｆ，Ｃａｎｃｉｌｌａ Ｂ，Ｏｒｆ Ｊ，Ｙｏｕ Ａ，Ｌａｉｒｄ ＡＤ，Ｅｎｇｓｔ Ｓ，Ｌｅｅ Ｌ，Ｌｅｓｃｈ Ｊ，Ｃｈｏｕ ＹＣ，Ｊｏｌｙ ＡＨ。新規のＭＥＴおよびＶＥＧＦＲ２阻害剤であるカボザンチニブ（ＸＬ１８４）は、転移、血管形成、および腫瘍の成長を同時に抑制する。Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ｄｅｃ；１０（１２）：２２９８−３０８。前臨床試験において、キナーゼ活性の化合物１により媒介された阻害は、腫瘍血管系、腫瘍の浸潤性および転移の急速かつ強固な退行、ならびに生存期間の延長をもたらした。Ｓｅｎｎｉｎｏ Ｂ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ ｂｙ ｃ−ＭＥＴ／ＶＥＧＦＲ ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｇｏｒｄｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ：Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ；Ａｕｇｕｓｔ ２−７，２００９；Ｎｅｗｐｏｒｔ，ＲＩで発表された。Ｙｏｕ ＷＫ，Ｆａｌｃｏｎ Ｂ，Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｅｘａｇｇｅｒａｔｅｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ，ｈｙｐｏｘｉａ，ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒｓ ａｆｔｅｒ ｃ−ＭＥＴ ａｎｄ ＶＥＧＦＲ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌに提出。
【0010】
別の実施形態において、式Ｉ、Ｉａ、または化合物１の化合物は、薬学的に許容される添加剤、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物として投与される。
【0011】
別の態様において、本発明は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性のＮＳＣＬＣ、ならびにＣＣＤＣ６、ＮＣＯＡ４、およびＴＲＩＭ３３を含む他の既知のＲＥＴ融合、ならびに染色体１０上の他のＲＥＴ融合（Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｄｒｉｌｏｎ，Ｌｕ Ｗａｎｇ，Ａｄｎａｎ Ｈａｓａｎｏｖｉｃらの２０１３年３月２６日に初めてオンラインで公表される、ＤＯＩ：１０．１１５８／２１５９−８２９０．ＣＤ−１３−００３５、２０１３年６月の米国癌研究学会を参照）が含まれ、本方法は、治療有効量の、式Ｉの化合物または式Ｉの化合物のリンゴ酸塩または式Ｉの化合物の別の薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物を、そのような治療を必要とする患者に投与することを含む。特定の実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１または化合物１のリンゴ酸塩である。
【0012】
別の態様において、本発明は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性の非小細胞肺癌である肺腺癌の治療を、そのような治療を必要とする患者において行うための方法を提供し、本方法は、この患者に、有効量の、化合物１：【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1A】化合物１の漸増する単一用量または水ビヒクルを投与したＴＴの腫瘍を担持する動物におけるインビボでのＲＥＴのリン酸化反応の阻害を示す。
【図1B】ＴＴの腫瘍を担持するマウスにおける、腫瘍溶解物中のリン酸化レベルならびに全ＲＥＴ、ＡＫＴ、およびＥＲＫに対する化合物１の単一経口用量（１００ｍｇ／ｋｇ）の投与の効果を示す。
【図1C】代表的なウエスタンブロット画像とともに、ＲＥＴのリン酸化反応の阻害の持続時間対化合物１の血漿濃度の濃度定量を、代表的なウエスタンブロット画像とともに提供する。
【図2A】２１日間、水ビヒクル（□）、または３ｍｇ／ｋｇ（▽）、１０ｍｇ／ｋｇ（○）、３０ｍｇ／ｋｇ（◆）、または６０ｍｇ／ｋｇ（◇）でカボザンチニブを１日１回経口投与したＴＴ腫瘍を担持するｎｕ／ｎｕマウスにおいて、化合物１が、ＴＴ異種移植片の腫瘍増殖を阻害する（血清のカルシトニンの低下と相関する）ことを示す。
【図2B】最終の示される用量後に回収された全血からの血清調製物において決定された循環カルシトニンレベルを示す。
【図4A】治療前および治療後の腫瘍試料からのＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴゲノムＰＣＲおよびサンガー配列決定を示す。
【図4B】治療前および治療後の腫瘍試料からのＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ ＲＴ−ＰＣＲおよびサンガー配列決定を示す。
【図4C】腫瘍細胞中のＲＥＴ遺伝子座におけるｂｒｅａｋ−ａｐａｒｔＦＩＳＨを示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
略語および定義以下の略語および用語は、本出願の全体を通して示された意味を有する。
【0015】
記号「−」は、単結合を意味し、「＝」は、二重結合を意味する。
【0016】
化学構造が図示または記載される場合、別途明記されていない限り、すべての炭素は、４の原子価に一致するように水素置換を有すると想定される。例えば、以下の図式の左側の構造において、９個の水素があることが含意される。９個の水素は、右側の構造中に図示される。構造中の特定の原子は、置換として水素（１つまたは複数）（明確に定義された水素）有するように、例えば、−ＣＨ２ＣＨ２−のように、文字式で記載される場合もある。上述の説明的な技術は、そうでなければ複雑な構造の説明に簡潔さおよび単純さを提供するために、化学技術分野において一般的であることは、当業者によって理解されよう。【0017】
基「Ｒ」が、例えば、式：【0018】
基「Ｒ」が、例えば、式：【0019】
「ハロゲン」または「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を指す。
【0020】
「ＫＩＦ５Ｂ」は、ＫＩＦ５Ｂタンパク質、またはＫＩＦ５Ｂ遺伝子を指し得る。キネシン−１重鎖とも呼ばれるＫＩＦ５Ｂタンパク質は、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子によってコードされたタンパク質である。ＫＩＦ５Ｂタンパク質は、ヒト等の哺乳動物に由来し得る。ヒトＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするヒトＫＩＦ５Ｂ遺伝子は、染色体１０（１０ｑ１１．２２）に局在化され、２６エクソンを含有する。ＫＩＦ５Ｂは、本明細書にさらに記載される。
【0021】
「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合タンパク質または遺伝子」とは、ＫＩＦ５Ｂ等の融合パートナーのＮ末端ドメインおよびＲＥＴタンパク質のＣ末端ドメインを含む融合タンパク質を指す。融合パートナーのＮ末端ドメインは、融合タンパク質のＮ末端ドメインに位置し得、ＲＥＴタンパク質のＣ末端ドメインは、融合タンパク質のＣ末端ドメインに位置し得る。融合パートナーは、ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端ドメインであり得、融合タンパク質のＮ末端に位置し得る。この場合、融合タンパク質は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴとして表され得、Ｎ末端でＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端ドメインと、Ｃ末端でＲＥＴタンパク質のＣ末端ドメインとを含む。別の実施形態は、融合タンパク質をコードする融合遺伝子を提供し、融合パートナーのＮ末端ドメインをコードする遺伝子は、５′末端に位置し、ＲＥＴタンパク質のＣ末端ドメインをコードする遺伝子は、３′末端に位置する。
【0022】
本発明の目的のための「患者」には、ヒトおよび他の動物、特に、哺乳動物、ならびに他の生物が含まれる。したがって、本方法は、ヒトの治療および獣医学的用途の両方に適用できる。別の実施形態において、患者は、哺乳動物であり、別の実施形態において、その患者は、ヒトである。
【0023】
化合物の「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され、かつ親化合物の所望の薬理学的活性を保有している塩を意味する。薬学的に許容される塩は、無毒であることが理解されよう。好適な薬学的に許容される塩におけるさらなる情報は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８５（参照により本明細書に組み込まれる）、またはＳ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，」Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７；６６：１−１９に見出され得、これらは共に、参照により本明細書に組み込まれる。
【0024】
薬学的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、ならびに酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、ショウノウスルホン酸、グルコヘプトン酸、４、４’−メチレンビス（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、およびサリチル酸等の有機酸で形成されるものが挙げられる。
【0025】
「プロドラッグ」は、例えば、血液中での加水分解によってインビボで（通常急速に）変換されて、上記式の親化合物を得る、化合物を指す。一般的な例としては、カルボン酸部分を持つ活性型を有する化合物のエステルおよびアミド型が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物の薬学的に許容されるエステルの例としては、アルキル基が直鎖または分岐鎖であるアルキルエステル（例えば、約１個〜約６個の炭素を有する）が挙げられるが、これに限定されない。また、許容されるエステルには、ベンジル等が含まれるが、これに限定されないシクロアルキルエステルおよびアリールアルキルも含まれる。本発明の化合物の薬学的に許容されるアミドの例としては、一級アミド、二級および三級アルキルアミド（例えば、約１個〜約６個の炭素を有する）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物のアミドおよびエステルは、従来の方法に従って調製され得る。プロドラッグについての完全な考察は、Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ，「Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，」Ｖｏｌ．１４ ｏｆ ｔｈｅ Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ、およびＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，ｅｄ．Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８７に提供されており、これらの両方は、参照によりすべての目的のために本明細書に組み込まれる。
【0026】
「ＲＥＴ」または「ＲＥＴタンパク質」は、膜貫通受容体チロシンキナーゼであり、本明細書にさらに記載される。
【0027】
「治療有効量」は、患者に投与されるとき、疾患の症状を改善する本発明の化合物の量である。治療有効量は、単独でまたは他の活性成分と組み合わせて、ｃ−Ｍｅｔおよび／もしくはＶＥＧＦＲ２を調整するのに有効であるか、または癌を治療もしくは予防するのに有効である化合物の量を含むことが意図される。「治療有効量」を構成する本発明の化合物の量は、化合物、疾患状態およびその重症度、治療されるべき患者の年齢等に応じて異なるであろう。治療有効量は、それらの知識および本開示を考慮する当業者によって決定することができる。
【0028】
本明細書で使用される、疾患、障害、または症候群の「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」には、（ｉ）ヒトにおける疾患、障害、または症候群が生じることを防ぐこと、すなわち、疾患、障害、または症候群に曝露されるか、またはその素因を持つ可能性はあるが、疾患、障害、または症候群の症状をまだ経験していないか、または示していない動物において、疾患、障害、または症候群の臨床症状の発現を防ぐこと、（ｉｉ）疾患、障害、または症候群を逆転または阻害すること、すなわち、その発現を阻止すること、ならびに（ｉｉｉ）疾患、障害、または症候群を軽減すること、すなわち、疾患、障害、または症候群の退縮を引き起こすこと、が含まれる。当該技術分野で知られているように、全身的対局所的送達、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、薬物の相互作用、および状態の重症度に関しての調整が必要な場合があり、それらは通常の実験で確認できるであろう。
【0029】
本明細書に記載される反応のそれぞれに対する「収率」は、理論的収量に対するパーセンテージとして表される。
【0030】
実施形態一実施形態において、式Ｉの化合物は、式Ｉａ：
Ｒ１がハロであり、
Ｒ２がハロであり、
Ｑが、ＣＨまたはＮである。
【0031】
別の実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１：【0032】
他の実施形態において、式Ｉ、Ｉａ、もしくは化合物１の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、薬学的組成物として投与され、この薬学的組成物には、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤がさらに含まれる。特定の実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１である。
【0033】
本明細書に記載される式Ｉ、式Ｉａ、および化合物Ｉの化合物には、列挙される化合物、ならびに個々の異性体および異性体の混合物の両方が含まれる。それぞれの例において、式Ｉの化合物には、列挙される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、および／もしくは溶媒和物、ならびに任意の個々の異性体およびその異性体の混合物が含まれる。
【0034】
他の実施形態において、式Ｉ、Ｉａ、または化合物１の化合物は、（Ｌ）−リンゴ酸塩であり得る。式Ｉの化合物および化合物１のリンゴ酸塩は、国際公開ＰＣＴ／米国特許第２０１０／０２１１９４号および米国特許出願第６１／３２５０９５号に開示されており、これらの両方は参照により本明細書に組み込まれる。
【0035】
他の実施形態において、式Ｉの化合物は、（Ｄ）−リンゴ酸塩である。
【0036】
他の実施形態において、式Ｉａの化合物は、リンゴ酸塩である。
【0037】
他の実施形態において、式Ｉａの化合物は、（Ｌ）−リンゴ酸塩である。
【0038】
他の実施形態において、化合物１は、（Ｄ）−リンゴ酸塩である。
【0039】
他の実施形態において、化合物１は、リンゴ酸塩である。
【0040】
他の実施形態において、化合物１は、（Ｌ）−リンゴ酸塩である。
【0041】
別の実施形態において、リンゴ酸塩は、米国特許出願第６１／３２５０９５号に開示されるように、化合物１の（Ｌ）リンゴ酸塩および／または（Ｄ）リンゴ酸塩の結晶性Ｎ−１型またはＮ−２型である。また、化合物１のリンゴ酸塩のＮ−１および／またはＮ−２の結晶形態を含む結晶性光学異性体の特性については、国際公開第ＷＯ２００８／０８３３１９号（参照によりその全体が組み込まれる）を参照のこと。そのような形態を作製し、特徴付けるための方法は、国際公開ＰＣＴ／米国特許第１０／０２１１９４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において十分に記載されている。
【0042】
別の実施形態において、本発明は、ＮＳＣＬＣを逆転または阻害するための方法に関し、本方法は、本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかにおいて、治療有効量の式Ｉの化合物をそのような治療を必要とする患者に投与することを含む。特定の実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１である。
【0043】
別の実施形態において、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性のＮＳＣＬＣを逆転または阻害するための方法に関し、本方法は、本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかにおいて、治療有効量の式Ｉの化合物をそのような治療を必要とする患者に投与することを含む。特定の実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１である。
【0044】
別の実施形態において、式Ｉの化合物は、１つ以上の他の治療の前、同時に、その後に投与される。別の実施形態において、式Ｉの化合物は、１つ以上の他の治療の後に投与される。「治療」は、外科手術、化学療法剤、ホルモン療法、抗体、免疫療法、放射性ヨード療法、および放射線を含む治療選択のうちのいずれかが当業者に利用可能であることを意味する。とりわけ、「治療」は、別の化学療法剤または抗体を意味する。
【0045】
したがって、別の実施形態において、式Ｉの化合物は、シスプラチンおよび／またはゲムシタビン治療後に投与される。
【0046】
別の実施形態において、式Ｉの化合物は、ドエクタクセル（ｄｏｅｃｔａｘｅｌ）治療後に投与される。
【0047】
別の実施形態において、式Ｉの化合物は、ＨＥＲ−２抗体治療後に投与される。別の実施形態において、ＨＥＲ−２抗体は、トラスツズマブである。
【0048】
別の実施形態において、式Ｉの化合物は、シスプラチンおよび／またはゲムシタビンおよび／またはドセタキセル治療後に投与される。
【0049】
別の実施形態において、式Ｉ、Ｉａ、もしくは化合物１の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、錠剤またはカプセル剤として１日１回経口投与される。これらのおよび他の実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１である。
【0050】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、カプセル剤または錠剤として経口投与される。
【0051】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、最大１００ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0052】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、１００ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0053】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、９５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0054】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、９０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0055】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、８５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0056】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、８０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0057】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、７５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0058】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、７０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0059】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、６５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0060】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、６０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0061】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、５５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0062】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、５０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0063】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、４５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0064】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、４０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0065】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、３０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0066】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、２５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0067】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、２０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0068】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、１５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0069】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、１０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0070】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤として１日１回経口投与される。
【0071】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、以下の表に提供される錠剤として１日１回経口投与される。【0072】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、以下の表に提供される錠剤として１日１回経口投与される。【0073】
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、以下の表に提供される錠剤として１日１回経口投与される。【0074】
上記に提供される錠剤製剤のうちのいずれも、所望の化合物１の用量に応じて調節することができる。したがって、製剤成分のそれぞれの量は、前節に提供される様々な量の化合物１を含有する錠剤製剤を提供するために比例して調節することができる。別の実施形態において、製剤は、２０、４０、６０、または８０ｍｇの化合物１を含有することができる。
【0075】
これらのおよび他の実施形態において、本発明は、哺乳動物における異常細胞の成長の進行を阻害する、または逆転させるための方法を提供し、本方法は、化合物１またはその薬学的に許容される塩を投与することを含み、異常細胞の成長は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴによって媒介される癌である。一実施形態において、この癌は、肺腺癌である。別のものにおいて、肺腺癌は、非小細胞肺癌である。別の実施形態において、肺腺癌は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性の非小細胞肺癌である。別の実施形態において、化合物１またはその薬学的に許容される塩は、化合物１またはその薬学的に許容される塩および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物として投与される。別の実施形態において、式Ｉの化合物は、別の形態の治療後に投与される。別の実施形態において、化合物１は、シスプラチンおよび／またはゲムシタビン治療後に投与される。別の実施形態において、化合物１は、ドエクタクセル（ｄｏｅｃｔａｘｅｌ）治療後に投与される。別の実施形態において、化合物１は、シスプラチンおよび／またはゲムシタビンおよび／またはドセタキセル治療後に投与される。
【0076】
投与純粋な形態で、または適切な薬学的組成物での式Ｉ、式Ｉａ、もしくは化合物１の化合物、またはその薬学的に許容される塩の投与は、同様の有用性を提供するための許容される投与様式または薬剤のうちのいずれかによって実行することができる。したがって、投与は、例えば、錠剤、坐剤、丸剤、軟質カプセルおよび硬質ゼラチンカプセル（カプセル剤または錠剤であってもよい）、粉末、溶液、懸濁液、またはエアロゾル等の固体、半固体、凍結乾燥粉末、または液体の剤形で、特に、正確な投与量の単純投与に好適な単位剤形で、例えば、経口的、経鼻的、非経口的（静脈内、筋肉内、または皮下）、局所的、経皮的、膣内、膀胱内、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、または経直腸的であってもよい。
【0077】
組成物は従来の薬学的担体または賦形剤、および活性薬剤として式Ｉの化合物を含み、さらに、担体および補助剤等を含んでもよい。
【0078】
アジュバントは、保存剤、湿潤剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、乳化剤、および分散剤を含む。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の様々な抗菌剤および抗真菌剤によって確実にすることができる。また、等張剤、例えば、糖類、塩化ナトリウム等を含むことが望ましい場合がある。注射可能な薬学的形態の持続的吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の吸収を遅延させる薬剤の使用によってもたらすことができる。
【0079】
必要に応じて、式Ｉの化合物の薬学的組成物はまた、例えば、クエン酸、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、ブチル化ヒドロキシトルエン等の、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、抗酸化剤等の少量の補助物質を含有してもよい。
【0080】
組成物の選択は、薬剤投与様式（例えば、経口投与については、錠剤、丸剤、またはカプセル形態の製剤）および薬剤物質の生物学的利用能等の様々な要因に依存する。近年、表面積の増加、すなわち、粒径の減少によって生物学的利用能を増加させることができるという原理に基づいて、薬学的組成物が、生物学的利用能に劣る薬剤に対して特に開発された。例えば、米国特許第４，１０７，２８８号は、活性物質が巨大分子の架橋マトリックスに支持された、１０〜１，０００ｎｍの範囲のサイズの粒子を有する薬学的組成物を記載している。米国特許第５，１４５，６８４号は、薬剤物質が表面改質剤の存在下でナノ粒子（４００ｎｍの平均粒径）に微粉砕され、次いで、液体媒体中に分散させて、非常に高い生物学的利用能を示す薬学的組成物を得る薬学的組成物の製造を記載している。
【0081】
非経口的注射に適した組成物は、生理学的に許容される水性または非水性の滅菌溶液、分散液、懸濁液、または乳剤、および滅菌した注射用溶液または分散液に再構成するための滅菌粉末を含み得る。好適な水性および非水性担体、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等）、およびそれらの好適な混合物、植物油（オリーブ油等）、ならびにオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング材の使用によって、分散液の場合には要求される粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【0082】
特定の一投与経路は、治療される疾患状態の重症度に応じて調整することができる便利な毎日の投薬レジメンを使用する経口投与である。
【0083】
経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末、および顆粒が含まれる。そのような固体剤形では、活性化合物は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム等の少なくとも１つの不活性の通常の賦形剤（または担体）、または（ａ）充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸、（ｂ）結合剤、例えば、セルロース誘導体、デンプン、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシアガム、（ｃ）湿潤剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、クロスカルメロースナトリウム、複合ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、第４級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、およびモノステアリン酸グリセロール、ステアリン酸マグネシウム、（ｈ）吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、ならびに（ｉ）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはそれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形はまた、緩衝剤も含み得る。
【0084】
上述の固形剤形は、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶性コーティング、ならびに当技術分野で周知の他のものを用いて調製することができる。それらは、安定化剤を含有してもよく、それらが、遅延化する様式で、腸管の特定の部分で活性化合物または化合物を放出させるような組成物であり得る。使用することができる包埋組成物の例は、ポリマー物質およびワックスである。活性化合物はまた、適切であるならば、１つ以上の上述した賦形剤と共に、マイクロカプセル化形態であり得る。
【0085】
経口投与される液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルが含まれる。そのような剤形は、例えば、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、ならびに任意の製薬用アジュバントを、担体、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等；溶解剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド；油、特に綿実油、ラッカセイ油、コーン胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール類、およびソルビタンの脂肪酸エステル；またはこれらの物質の混合物に溶解または分散すること等によって調製され、それによって、溶液または懸濁液を形成する。
【0086】
懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロオキシド、ベントナイト、寒天、およびトラガカント、またはこれらの物質の混合物を含んでもよい。
【0087】
直腸投与のための組成物は、例えば、式Ｉの化合物と、通常の温度では固体であるが、体温では液体であり、したがって適切な体腔で溶解し、そこで活性成分を放出する、例えば適切な非刺激性賦形剤または担体、例えばココアバター、ポリエチレングリコール、もしくは坐薬ワックスとを混合することにより調製可能な坐薬である。
【0088】
式Ｉの化合物の局所適用のための剤形には、軟膏、パウダー、スプレー、および吸入剤が含まれる。活性成分は、生理学的に許容される担体、および必要な場合は任意の保存剤、緩衝液、または噴霧剤と滅菌条件下で混合される。眼用調製物、眼用軟膏、パウダー、および溶液もまた、本開示の範囲内に入ることが企図される。
【0089】
圧縮ガスを用いて、式Ｉの化合物をエアロゾル形態に分散させることができる。この目的に好適な不活性ガスは、窒素、二酸化炭素等である。
【0090】
一般に、意図される投与様式に応じて、薬学的に許容される組成物は、式Ｉの化合物（複数可）またはその薬学的に許容される塩を約１重量％〜約９９重量％、および好適な薬学的賦形剤を９９重量％〜１重量％含むであろう。一例において、本組成物は、式Ｉ、式Ｉａ、もしくは化合物１の化合物（複数可）、またはその薬学的に許容される塩が約５重量％〜約７５重量％の間であり、残りが好適な薬学的賦形剤である。
【0091】
そのような剤形を調製するための実際の方法は、当業者に知られているか、または明らかであり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）を参照されたい。投与される組成物は、いずれにしても、本開示の教示に従い、疾患状態の治療のために治療有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む。
【0092】
本開示の組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、使用される特定の化合物の活性、化合物の代謝安定性および作用期間の長さ、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与様式および時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、特定の疾患状態の重症度、および治療を受けている宿主を含む多様な要因に応じて変化するであろう、治療有効量で投与される。式Ｉ、式Ｉａ、または化合物１の化合物は、１日当たり約０．１〜約１，０００ｍｇの範囲の投薬量レベルで患者に投与することができる。約７０キログラムの体重の正常なヒトの成人の場合、例えば投薬量は、１日体重１キログラム当たり約０．０１〜約１００ｍｇの範囲とされる。しかしながら、使用される特定の投薬量は変わり得る。例えば、投薬量は、患者の必要性、治療される状態の重症度、および使用される化合物の薬理学的活性を含む多くの要因に依存し得る。特定の患者への最適量の決定法は、当業者にはよく知られている。
【0093】
他の実施形態において、式Ｉ、式Ｉａ、または化合物１の化合物は、他の癌治療と同時に患者に投与することができる。そのような治療には、他の癌化学療法、ホルモン補充療法、放射線療法。または免疫療法が含まれる。他の治療法の選択は、化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与様式および時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、特定の疾患状態の重症度、および治療を受けている宿主を含む多くの要因に依存する。
【0094】
別の態様において、本発明は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性のＮＳＣＬＣ等のＲＥＴ融合関連疾患を検出、診断、および治療するための方法を提供する。そのような障害の検出および診断のための方法を本明細書でさらに詳細に記載する。これらの障害の治療は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性のＮＳＣＬＣ等のＲＥＴ融合関連疾患を有すると特定または診断されている患者への、治療有効量の、式Ｉの化合物もしくは式Ｉの化合物のリンゴ酸塩または式Ｉの化合物の別の薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物の投与によりさらに良好に達成することができ、特定の実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１または化合物１のリンゴ酸塩であることを含む。ＲＥＴ融合の説明が以下に続く。
【0095】
ＲＥＴおよびＫＩＦ５Ｂ検出、診断の方法、検出および診断のためのキット、スクリーニングの方法、治療および予防の方法、肺癌患者のための様々な療法、治療剤および他の薬学的成分の有効性を測定するための方法を含むＲＥＴタンパク質、ＫＩＦ５Ｂタンパク質、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合（または単に「融合タンパク質および核酸」と呼ばれる場合がある）は、以下に記載される様々な治療と組み合わせて使用することができる。
【0096】
ＲＥＴタンパク質は、膜貫通受容体チロシンキナーゼである。ＲＥＴは、細胞外領域（カドヘリン様ドメインを含有する）、膜貫通ドメイン、およびチロシンキナーゼドメインを含有する細胞内領域からなる。ＲＥＴタンパク質は、共受容体およびリガンド、例えばグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）等と結合することによって二量化するとき、自動リン酸化反応によって活性化し、次いで、下流シグナル伝達経路をシミュレートする。
【0097】
ＲＥＴタンパク質は、ヒト等の哺乳動物に由来し得る。ヒトＲＥＴタンパク質をコードするヒトＲＥＴ遺伝子は、染色体１０（１０ｑ１１．２）に局在化され、変異体に応じて１９〜２１エクソンを含有する。ヒトＲＥＴタンパク質は、ヒトＲＥＴ遺伝子によってコードされ得る。ＲＥＴタンパク質のＣ末端ドメインは、ＲＥＴ遺伝子の１２番目のエクソンから最後のエクソン（例えば、２０番目のエクソン）のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含み得る。ＲＥＴタンパク質のＣ末端ドメインは、１２番目のエクソンの出発位置から連続して少なくとも約３００個のアミノ酸を含み得る。例えば、ＲＥＴタンパク質のＣ末端ドメインは、１２番目のエクソンの出発位置（例えば、７１３番目の位置）からＲＥＴタンパク質（２０エクソン）のＣ末端に向かって、約３００〜約４５０個のアミノ酸、連続して約３００〜約４２０個のアミノ酸、または連続して約３００〜約４０２個のアミノ酸を含み得る。
【0098】
キネシン−１重鎖とも呼ばれるＫＩＦ５Ｂタンパク質は、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＫＩＦ５Ｂタンパク質は、ヒト等の哺乳動物に由来し得る。ヒトＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするヒトＫＩＦ５Ｂ遺伝子は、染色体１０（１０ｑ１１．２２）に局在化され、２６個のエクソンを含有する。ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端ドメインは、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子の１番目のエクソンから１６番目のエクソン、または１番目のエクソンから１５番目のエクソン、または１番目のエクソンから２３番目のエクソンのポリヌクレオチドによってコードされたアミノ酸を含み得る。ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端ドメインは、ＫＩＦ５Ｂタンパク質の１番目のエクソンから連続して少なくとも約３２９個のアミノ酸（つまり、少なくとも１番目から３２９番目の位置のアミノ酸配列）を含み得る。ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端ドメインは、ＫＩＦ５Ｂタンパク質の３２９番目の位置のアミノ酸から開始する少なくとも２つの二重コイルドメインをさらに含み得る。例えば、さらに含まれるこの２つの二重コイルドメインは、ＫＩＦ５Ｂタンパク質の第２０の位置の３２９番目から６３８番目のアミノ酸配列を有し得る。ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端ドメインは、ＫＩＦ５Ｂタンパク質の第１の位置から連続して約３２９〜９００個のアミノ酸、連続して約３２９〜７００個のアミノ酸、連続して約３２９〜６５０個のアミノ酸、または連続して約３２９〜６３８個のアミノ酸を含み得る。
【0099】
ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合は、染色体１０上に逆転または転座によるＲＥＴ関連の染色体再配置である。融合タンパク質は、当業者に既知のまたは本明細書に記載される様々な方法を使用して検出および検証される。次いで、活性成分として、融合タンパク質に対する少なくとも１つの阻害剤、融合タンパク質をコードする融合遺伝子に対する少なくとも１つの阻害剤、ＲＥＴをコードする遺伝子に対する少なくとも１つの阻害剤、またはそれらの組み合わせを含む式Ｉの組成物が、肺癌を予防または治療するために記載されている。
【0100】
融合タンパク質において、融合または融合領域は、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子の様々なエクソン間で生じ得る。多くの融合が当業者に知られている。そのような融合の例には、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子の２０番目または１６番目のエクソンおよびＲＥＴ遺伝子の１２番目のエクソンが含まれ、これは融合点または切断点と呼ばれる。他のＲＥＴおよびＫＩＦ５Ｂの融合または切断点が知られている。「融合領域」という用語は、融合点周辺のポリヌクレオチド断片（約３０ヌクレオチド）またはポリペプチド断片（約３０アミノ酸）を指し得る。
【0101】
他の変異体では、融合タンパク質は、以下のうちのいずれかとして記載される。ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端ドメインが、本質的には、ＮＣＢＩによって記載されるＫＩＦ５Ｂタンパク質の第１の位置から連続して少なくとも約３２９個のアミノ酸からなる。ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端ドメインでが、ＫＩＦ５Ｂタンパク質の第３２９の位置のアミノ酸から開始する少なくとも２つのＫＩＦ５Ｂ二重コイルドメインを含む、融合タンパク質。ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端ドメイン２０が、本質的には、ＮＣＢＩによって記載されるように、１番目のエクソンから１６番目のエクソンのポリヌクレオチド、または１番目のエクソンから１５番目のエクソン、または１番目のエクソンから２３番目のエクソンのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる、融合タンパク質。染色体１０上の他の既知のＲＥＴ融合には、エクソン１５、１６、２２、２３、２４におけるＫＩＦ５Ｂを含み、すべては、エクソン１２におけるＲＥＴを伴うもの、エクソン２４におけるＫＩＦ５Ｂおよびエクソン１１ならびにエクソン８におけるＲＥＴを含む。全てが染色体１０上にある、エクソン１におけるＣＣＤＣ６およびエクソン１２におけるＲＥＴ、エクソン６におけるＮＣＯＡ４およびエクソン１２におけるＲＥＴ、ならびにエクソン１４におけるＴＲＩＭ３３およびエクソン１２におけるＲＥＴは、既知のＲＥＴ融合である。エクソン１２におけるＲＥＴを伴うエクソン１４におけるＴＲＩＭ３３は、肺癌に関与し、このタイプの癌は、カボザンチニブ投与に対してよく応答することが知られている。Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｄｒｉｌｏｎ，Ｌｕ Ｗａｎｇ，Ａｄｎａｎ Ｈａｓａｎｏｖｉｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ＯｎｌｉｎｅＦｉｒｓｔ Ｍａｒｃｈ ２６，２０１３、ＤＯＩ：１０．１１５８／２１５９−８２９０．ＣＤ−１３−００３５、２０１３年６月の米国癌研究学会を参照のこと。
【0102】
一実施形態において、融合タンパク質は、ＲＥＴタンパク質のＣ末端ドメインが、本質的に、融合タンパク質の１２番目のエクソンに対応するアミノ酸の出発位置からＲＥＴタンパク質のＣ末端に向かって連続して約３００〜４５０個のアミノ酸からなる。
【0103】
本明細書に使用される、エクソン番号は、ＮＣＢＩによって割り当てられたエクソン番号に従って番号付けされる。融合タンパク質ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴは、ＮＣＢＩによってそのようなものとして特定されるアミノ酸配列のうちのいずれかを有し得る。ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列およびＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、自動化ＤＮＡシーケンサーまたは自動化ペプチドシーケンサーによって決定され得る。そのような自動化配列決定手段によって決定された（ヌクレオチドまたはアミノ酸）配列は、実際の配列と比較して部分的な誤差を含み得る。通常、自動化配列決定によって決定された配列は、実際の配列と比較して、少なくとも約９０％、少なくとも２０の約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％の配列同一性を有し得る。したがって、融合タンパク質、融合遺伝子、または融合領域は、ＮＣＢＩによってそのようなものとして特定される配列と比較して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有し得る。
【0104】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＫＩＦ５Ｂの６３８個のＮ末端残基およびＲＥＴの４０２個のＣ末端残基からなり得る。融合遺伝子は、二重コイルドメインと一緒にタンパク質チロシンキナーゼドメインを有する。二重コイルドメインは、自動リン酸反応によって発癌性タンパク質チロシンキナーゼドメインを活性化するであろうホモ二量化を誘導する。ＫＩＦ５Ｂは、その活性プロモーターにより普遍的に発現する微小管ベースのモータータンパク質であり、真核細胞中の細胞小器官の輸送に関与する。つまり、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子は、高度に発現し、ＫＩＦ５Ｂにより翻訳後二量化され得る。次いで、二量化されたＲＥＴタンパク質チロシンキナーゼドメインは、異常に刺激を受け、そのため、発癌性経路の刺激を促進し得る。
【0105】
一旦融合が検出されると、それは、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴの融合タンパク質をコードするＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴの融合遺伝子として知られることとなる。対象から得られた試験試料において本明細書に記載される融合を検出するステップを含む、肺癌を診断するために情報を提供する方法。診断は、融合タンパク質をコードする融合遺伝子を比較し得、癌を有しない個体からの標準試料と比較した、ＲＥＴの過剰発現は、少なくとも１つの要素が試験試料中で選択され、検出されるとき、対象が、癌患者、肺癌患者、ＮＳＣＬＣ肺癌患者、ＲＥＴ融合関連ＮＳＣＬＣ患者、および／またはＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合関連ＮＳＣＬＣ患者のうちのいずれかまたはすべてとして特定されるのを可能にする。
【0106】
染色体１０の反転は、染色体１０における反転領域（への相補的結合）によりハイブリダイズすることができる、例えば、染色体１０における反転領域を含む連続する１００〜２００個のヌクレオチドを有するポリヌクレオチド断片を産生することができるポリヌクレオチド（プローブ）および／または染色体１０の反転を検出することができるプライマー対を使用することによって検出し得る。融合タンパク質、融合遺伝子、および融合領域が、本明細書に記載される。具体的な実施形態において、融合タンパク質はまた、融合タンパク質または融合遺伝子または融合遺伝子に対応するｍＲＮＡの存在を検出することによっても検出され得る。
【0107】
融合タンパク質の存在は、融合タンパク質と融合タンパク質に特異的に結合する材料（例えば、抗体またはアプタマー）との間の相互作用を測定する一般的なアッセイによって検出され得る。一般的なアッセイは、イムノクロマトグラフィー、免疫組織化学染色法、酵素結合（ｌｉｋｅｄ）免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、ウエスタンブロット法、ＦＡＣＳ等であり得る。
【0108】
加えて、融合遺伝子またはｍＲＮＡの存在は、融合遺伝子またはｍＲＮＡ（への相補的結合）でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを使用して、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）等の一般的なアッセイによって検出され得る。ＦＩＳＨは、以下にさらに詳細に記載される。融合遺伝子は、超並列シークエンシング技術を通して全トランスクリプトーム（ＲＮＡ）および／または全ゲノムＤＮＡシークエンシングの積分技法を使用することによって検出および／または検証され得る。融合遺伝子またはｍＲＮＡでハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡプローブ、またはＤＮＡプライマーであり得、試験試料中の融合もしくは切断遺伝子または転写物を用いた直接ハイブリダイゼーションによって融合遺伝子またはｍＲＮＡを検出することができる。
【0109】
ＦＩＳＨアッセイは、１つ以上のプローブセットを使用して行うことができ、実施形態は、例えば、（１）ＲＥＴ遺伝子を含む染色体部位（第１染色体部位）を標的とした第１のプローブセットであって、第１の蛍光物質で標識されたプローブ１Ａと第２の蛍光物質で標識されたプローブ１Ｂとからなり、プローブ１Ａは、前述の第１染色体部位内の５′領域である第１の領域に相補的であり、プローブ１Ｂは、前述の第１の領域からの距離で存在し、前述の第１染色体部位内の３′領域である第２の領域に相補的であり、ＫＩＦ５ＢとＲＥＴ遺伝子の間の転座によってＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子が生成するときのＲＥＴ遺伝子における切断点が、前述の第１の領域の３′末端部、前述の第１の領域と第２の領域の間、または前述の第２の領域の５′末端部に位置する、第１のプローブセット、（２）ＫＩＦ５Ｂ遺伝子を含む染色体部位（第２染色体部位）を標的とした第２のプローブセットであって、第１の蛍光物質で標識されたプローブ２Ａと第２の蛍光物質で標識されたプローブ２Ｂとからなり、プローブ２Ａは、前述の第２染色体部位内の５′領域である第１の領域に相補的であり、プローブ２Ｂは、前述の第１の領域からの距離で存在し、前述の第２染色体部位内の３′領域である第２の領域に相補的であり、ＫＩＦ５ＢとＲＥＴ遺伝子の間の転座によってＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子が生成するときのＫＩＦ５Ｂ遺伝子における切断点が、前述の第１の領域の３′末端部、前述の第１の領域と第２の領域の間、または前述の第２の領域の５′末端部に位置する、第２のプローブセット、（３）前述のプローブ２Ａと前述のプローブ１Ｂとからなる第３のプローブセット、ならびに（４）ＲＥＴ遺伝子を含む染色体部位（第３染色体部位）に相補的であるプローブ４ＡとＫＩＦ５Ｂ遺伝子を含む染色体部位（第４染色体部位）に相補的であるプローブ４Ｂとからなる第４のプローブセット、等が提供される。
【0110】
前述の第１染色体部位の長さは、０．５〜２．０Ｍｂであり得る。前述の第２染色体部位の長さは、０．５〜２．０Ｍｂであり得る。前述の第３染色体部位の長さは、０．５〜２．０Ｍｂであり得る。前述の第４染色体部位の長さは、０．５〜２．０Ｍｂであり得る。
【0111】
ＫＩＦ５ＢとＲＥＴ遺伝子の間の転座を検出するためのキットは、１つ以上のプローブセットを含むことができる。（１）第１のプローブセットは、第１の蛍光物質で標識されたプローブ１Ａと第２の蛍光物質で標識されたプローブ１Ｂとを含み、プローブ１Ａは、前述の第１染色体部位内の５′領域である第１の領域に相補的であり、プローブ１Ｂは、前述の第１の領域からの距離で存在し、前述の第１染色体部位内の３′領域である第２の領域に相補的であり、ＫＩＦ５ＢとＲＥＴ遺伝子の間の転座によってＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子が生成するときのＲＥＴ遺伝子における切断点が、前述の第１の領域の３′末端部、前述の第１の領域と第２の領域の間、または前述の第２の領域の５′末端部に位置する、（２）ＫＩＦ５Ｂ遺伝子を含む染色体部位（第２染色体部位）を標的とした第２のプローブセットであって、第１の蛍光物質で標識されたプローブ２Ａと第２の蛍光物質で標識されたプローブ２Ｂとからなり、プローブ２Ａは、前述の第２染色体部位内の５′領域である第１の領域に相補的であり、プローブ２Ｂは、前述の第１の領域からの距離で存在し、前述の第２染色体部位内の３′領域である第２の領域に相補的であり、ＫＩＦ５ＢとＲＥＴ遺伝子の間の転座によってＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子が生成するときのＫＩＦ５Ｂ遺伝子における切断点が、前述の第１の領域の３′末端部、前述の第１の領域と第２の領域の間、または前述の第２の領域の５′末端部に位置する、第２のプローブセット、（３）前述のプローブ２Ａと前述のプローブ１Ｂとからなる第３のプローブセット、ならびにＲＥＴ遺伝子を含む染色体部位（第３染色体部位）に相補的であるプローブ４ＡとＫＩＦ５Ｂ遺伝子を含む染色体部位（第４染色体部位）に相補的であるプローブ４Ｂとからなる第４のプローブセット。
【0112】
ＲＥＴ−ＫＩＦ５Ｂの転座に対して感受性を示す患者を特定するのに有用なキットは、プローブの使用についての説明、ＤＮＡ対比染色剤、ハイブリダイゼーション用緩衝液、封入剤、コントロールスライドを含む群から選択される１つ以上の要素を含む。このキットは、本発明の検出方法を適宜かつ有効に企図することを可能にする。このキットは、必要要素（必須要素）として、前述の第１のプローブセット、第２のプローブセット、第３のプローブセット、または第４のプローブセットを含むことができる。また、２つ以上のタイプのプローブセットもキットに含むことができる。例えば、このキットは、第１のプローブセットおよび第３のプローブセットを組み込むことができる。それぞれのプローブセットについての詳細は上で記載されているので、ここでは繰り返さない。
【0113】
「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在または不在の検出」は、前述の融合ポリペプチドまたはゲノムＤＮＡからの転写物をコードするゲノムＤＮＡを使用して直接的に行うことができるが、その転写物（前述の融合ポリペプチド）からの翻訳産物を使用して直接的に行われ得る。
【0114】
融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡが１０ｐ１１．２領域と１０ｑ１１．２領域の間の反転によって形成されるため、この反転の現象は、「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在または不在の検出」において検出され得る。この反転の検出では、例えば、ＲＥＴ遺伝子のキナーゼドメインコード領域よりも５′側の上流領域とＲＥＴ遺伝子のコード領域よりも３′側の下流領域との間の分裂が検出され得るか、またはカドヘリン反復をコードする領域とＲＥＴ遺伝子のコード領域よりも５′側の上流領域とＲＥＴ遺伝子のコード領域よりも３′側の下流領域との間の分裂が検出され得るか、または二重コイルドメインの一部もしくはすべてのコード領域とＫＩＦ５Ｂ遺伝子のコード領域よりも５′側の上流領域とＫＩＦ５Ｂ遺伝子の二重コイルドメインのコード領域よりも３′側の下流領域との間の分裂が検出され得る。
【0115】
当業者に知られており、利用可能な技術は、本発明において「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在または不在の検出」において使用され得る。「前述の融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ」が対象物である場合、例えば、蛍光等を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ゲノムＰＣＲ、直接配列決定、サザンブロット法、またはゲノムマイクロアレイが使用され得る。「前述のゲノムＤＮＡからの転写物」が対象物である場合、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、直接配列決定、ノーザンブロット法、ドットブロット法、またはｃＤＮＡマイクロアレイ分析が使用され得る。
【0116】
本発明のキットはまた、他の要素も含むことができる。これらの他の要素の例は、プローブの使用についての仕様書、ＤＡＰＩ等のＤＮＡ対比染色液、ハイブリダイゼーション用緩衝液、洗浄緩衝液、溶媒、封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉａ）、コントロールスライド、反応容器、および他の器具である。また、診断目的の仕様書も含むことができる。さらに、どのようにして癌患者からの染色体試料におけるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ転座の検出（陽性同定）が、ＲＥＴキナーゼ阻害剤を使用してこれらの患者において設定されるべきかを示す仕様書等もまた、含むことができる。さらに、この計画の治療コースおよび説明を決定するための計画もまた、含むことができる。
【0117】
比較的長いプローブ（約２００ｋｂ（プローブ１Ａ）〜約１，３７０ｋｂ（プローブ４Ｂ）が企図される。したがって、プローブと標的配列との間の相補性は、本発明において意図される特異的なハイブリダイゼーションが達成され得る限り、完全に制限される必要はない。標的配列間の類似性の一例は、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％である。
【0118】
第１のプローブセットおよび第２のプローブセットが使用される場合は、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子の間で転座が生じる染色体試料では、２つの蛍光シグナルが離れて別々に検出され、転座が生じなかった染色体試料では、典型的には、２つの蛍光シグナルが近接して観察されるか、または２つの蛍光シグナルの組み合わせであるシグナル（黄色）が観察される。したがって、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子の間の転座の有無は、蛍光シグナルのパターンに反映される。このため、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子の間の転座は、蛍光シグナルのパターンから判定することができる。
【0119】
上述の判定は、好ましくは、典型的には、対照（試験試料）との結果の比較に基づいて行われる。ここで、対照は、非小細胞肺癌に罹患している患者由来の染色体試料または前癌性の病変を示す患者由来の染色体試料である。加えて、前癌性の病変がない患者由来の染色体試料、癌に罹患していない患者由来の染色体試料、または正常な健常者から採取された染色体試料もまた、対照として使用することができる。また、細胞株由来の染色体試料も、対照として使用することができる。
【0120】
融合遺伝子がＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴの融合タンパク質をコードする融合遺伝子ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴであるとき、融合遺伝子ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴは、融合領域（への相補的結合）でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド（プローブ）および／または融合領域を含む連続的な１００〜２００ヌクレオチドを有するポリヌクレオチド断片を生成することができるプライマー対を使用することによって検出され得る。加えて、融合タンパク質ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴは、融合タンパク質ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴの融合領域に特異的に結合する抗体またはアプタマーを使用して検出され得る。
【0121】
加えて、検出は、発色性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）方法および銀ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）方法である融合アッセイによって行うことができる。本出願での「融合点」とは、ＫＩＦ５Ｂのそれぞれの遺伝子由来の一部がＲＥＴ遺伝子由来の一部と融合される点を指す。
【0122】
「融合領域（または反転領域）でハイブリダイズすることができる」という用語は、相補配列または融合領域（または反転領域）の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を指す。別の実施形態は、融合領域でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド、融合領域を含む連続して１００〜２００ヌクレオチドを有するポリヌクレオチド断片を生成することができるプライマー対からなる群から選択される１つ以上を含む、癌を診断するための組成物を提供する。また、染色体１０において反転領域でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド、染色体１０の反転領域を含む連続して１００〜２００ヌクレオチドを有するポリヌクレオチド断片を生成することができるプライマー対、および融合領域に結合する抗体またはアプタマー。別の実施形態は、癌を診断するために、融合タンパク質および／または融合遺伝子の使用を提供する。患者は、任意の哺乳動物、例えば、ヒトまたはサル等の霊長類、マウスまたはラット等の齧歯動物、とりわけ、ヒトであり得る。言及される任意のアッセイで使用するのに適している試験試料は、細胞（例えば、肺細胞）、組織（例えば、肺組織）、体液（例えば、血液）、循環腫瘍ＤＮＡ、循環腫瘍細胞であり得る。この試料は、腫瘍の外科生検、腫瘍のコア生検、腫瘍の微細針吸引、胸膜滲出液、細胞を分離する他の既知の方法、および患者由来の細胞および組織を分離する他の既知の方法を含む、当業者に既知の任意の様式で収集され得る。例えば、ＦＩＳＨアッセイ（本明細書に記載される）は、循環腫瘍細胞において行われ得る。
【0123】
患者は、キナーゼ阻害剤による治療を受けている、または治療される予定を有するものであり得る。試験試料は、ヒト癌細胞由来の細胞またはその抽出物を含み得る。
【0124】
別の実施形態は、５′末端で融合パートナーの位置のＮ末端ドメインをコードする遺伝子および３′末端でＲＥＴタンパク質の位置のＣ末端ドメインをコードする遺伝子である、融合タンパク質をコードする融合遺伝子を提供する。具体的な実施形態において、融合タンパク質がＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴタンパク質であるとき、融合遺伝子は、５′末端でＫＩＦ５Ｂの位置のＮ末端ドメインをコードする遺伝子および３′末端でＲＥＴタンパク質の位置のＣ末端ドメインをコードする遺伝子であるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ遺伝子として表され得る。
【0125】
別の実施形態は、融合遺伝子、および任意に、融合遺伝子に作動可能に連結した転写要素（例えば、プロモーター等）を含む、発現ベクターを提供する。別の実施形態は、発現ベクターで形質転換された形質転換細胞を提供する。
【0126】
治療または診断（生検試料等）のコースで得られた生物学的標本は、多くの場合、ホルマリンで固定されるが、この場合、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの使用が、検出対象物であるＤＮＡゲノムがホルマリン固定下で安定し、検出感度が高いため、有利である。
【0127】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、生物学的標本中のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下述の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドをハイブリダイズすることによって検出することができる：（ａ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブおよびＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択する少なくとも１つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドの融合部位にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド。
【0128】
しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、自然界（つまり、非人工的）に突然変異し得る。したがって、そのような自然変異体はまた、本発明の（以下、同様に）対象物であり得る。
【0129】
本発明の（ａ）に述べられたポリヌクレオチドは、ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドの標的塩基配列であるＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることによって、それが生物学的標本において前述のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出することができる場合、任意であり得る。それは、好ましくは、以下の（ａ１）〜（ａ４）に述べられたポリヌクレオチドである。
【0130】
（ａ１）二重コイルドメインの一部またはすべてのコード領域およびＫＩＦ５Ｂ遺伝子のコード領域よりも５′側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５′ＫＩＦ５Ｂプローブ１」とも称される）と、キナーゼドメインのコード領域およびＲＥＴ遺伝子のコード領域よりも３′側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３′ＲＥＴプローブ１」とも称される）との組み合わせ
【0131】
（ａ２）ＲＥＴ遺伝子のキナーゼドメインのコード領域よりも５′側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５′ＲＥＴプローブ１」とも称される）と、ＲＥＴ遺伝子のコード領域よりも３′側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３′ＲＥＴプローブ１」とも称される）との組み合わせ
【0132】
（ａ３）カドヘリン反復のコード領域とＲＥＴ遺伝子のコード領域よりも５′側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５′ＲＥＴプローブ２」とも称される）と、ＲＥＴ遺伝子のコード領域よりも３′側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３′ＲＥＴプローブ２」とも称される）との組み合わせ
【0133】
（ａ４）二重コイルドメインの一部またはすべてのコード領域およびＫＩＦ５Ｂ遺伝子のコード領域よりも５′側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５′ＫＩＦ５Ｂプローブ１」とも称される）と、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子のコード領域よりも３′側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３′ＫＩＦ５Ｂプローブ１」とも称される）との組み合わせ。
【0134】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて使用される（ａ１）のポリヌクレオチドへの領域（標的塩基配列）は、標的塩基配列への特異性および検出感度のため、好ましくは、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子およびＲＥＴ遺伝子の融合部位から１，０００，０００塩基以内の領域であり、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて使用される（ａ２）〜（ａ４）のポリヌクレオチドへの領域は、同じ理由のため、好ましくは、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子またはＲＥＴ遺伝子において、切断点から１，０００，０００塩基以内の領域である。
【0135】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用される上記の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、標的塩基配列への特異性および検出の感度から前述の標的塩基配列のすべてを網羅することができる複数種のポリペプチドからなる集団であることが好ましい。この場合、集団を構成するポリヌクレオチドの長さは、少なくとも１５塩基、好ましくは、１００〜１０００塩基である。
【0136】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用される上記の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、好ましくは、検出のため、蛍光色素等によって標識される。そのような蛍光色素の例としては、ＤＥＡＣ、ＦＩＴＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、およびＣｙ５が挙げられるが、これらに限定されない。また、蛍光色素以外にＤＡＢ等の色素（色原体）または酵素的金属沈着に基づく銀等によって、前述のポリヌクレオチドを標識してもよい。
【0137】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、５′ＫＩＦ１Ｂプローブ１および３′ＲＥＴプローブ１が使用される場合、または５′ＲＥＴプローブ１および３′ＲＥＴプローブ１が使用される場合、または５′ＲＥＴプローブ２および３′ＲＥＴプローブ２が使用される場合、または５′ＫＩＦ１Ｂプローブ１および３′ＫＩＦ１Ｂプローブ１が使用される場合、これらのプローブは互いに異なる色素により標識されることが好ましい。このように異なる色素で標識されたプローブの組み合わせを用いてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが行われるとき、５′ＫＩＦ１Ｂプローブ１の標識が発するシグナル（例えば、蛍光）と３′ＲＥＴプローブ１の標識が発するシグナルとが重なるとき、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出したと判定することができる。一方、５′ＲＥＴプローブ１の標識が発するシグナルと３′ＲＥＴプローブ１の標識が発するシグナルとが分離するとき、または５′ＲＥＴプローブ２の標識が発するシグナルと３′ＲＥＴプローブ２の標識が発するシグナルとが分離するとき、または５′ＫＩＦ１Ｂプローブ１の標識が発するシグナルと３′ＫＩＦ１Ｂプローブ１の標識が発するシグナルとが分離するとき、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出したと判定することができる。
【0138】
ポリヌクレオチドの標識は、既知の技術によって行われ得る。例えば、ニックトランスレーションまたはランダムプライム法により蛍光色素等によって標識された基質塩基は、ポリヌクレオチドに取り込ませ、そのポリヌクレオチドを標識され得る。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、上記の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドおよび前述の生体試料と、をハイブリダイズするときに使用される条件は、関連するポリヌクレオチドの長さ等の様々な要因により異なり得るが、高ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件の一例は、０．２ｘＳＳＣ、６５℃であり、低ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件の一例は、２．０ｘＳＳＣ、５０℃である。前述の条件と同じストリンジェンシーな条件は、当業者が塩濃度（ＳＳＣの希釈率）および温度、ならびに界面活性剤（ＮＰ−４０等）の濃度、ホルムアミドの濃度、およびｐＨ等の様々な条件を適切に選択することによって達成され得ることに留意すべきである。
【0139】
前述のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション以外に、上記の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを使用するＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出するための方法の例は、サザンブロット、ノーザンブロット、およびドットブロットである。これらの方法においては、前述の融合遺伝子は、前述の生物学的標本から得られる核酸抽出物を転写した膜に、上記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって検出される。（ａ）のポリヌクレオチドを使用するとき、ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリペプチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリペプチドとが膜上に展開された同じバンドを認識したときに、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出することができる。
【0140】
ゲノムマイクロアレイ分析およびＤＮＡマイクロアレイ分析は、上記（ｂ）のポリヌクレオチドを使用して、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出するためのさらなる方法である。これらの方法において、（ｂ）のポリヌクレオチドのアレイを基板上に固定し、アレイ上のポリヌクレオチドと接触する生物学的標本を置くことによって、関連ゲノムＤＮＡを検出する。ＰＣＲまたは配列決定において、下記（ｃ）のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）または鋳型として生物学的標本から調製したＲＮＡを使用して、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの一部またはすべてを特異的に増幅させるために使用され得る。（ｃ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドの融合部位を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド。「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的として作用する前述の融合ポリヌクレオチド等の塩基配列において、片方のプライマーがＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズし、他方のプライマーがＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーセットである。これらのポリヌクレオチドの長さは、通常、１５〜１００塩基であり、好ましくは、１７〜３０塩基である。
【0141】
ＰＣＲによる検出の精度および感度の観点から、本発明の（ｃ）に記載のポリヌクレオチドは、好ましくは、ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドの融合部位から５０００塩基以内の前述の融合ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列である。
【0142】
「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的として作用するＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて既知の技術によって適切に設計することができる。「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」の有利な例は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｆ１、ＫＩＦ５Ｂ−ｉｎｔ１５−Ｆ１、ＫＩＦ５Ｂ−ｉｎｔ１５−Ｆ２、ＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ１６−Ｆ１、ＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ２３−Ｆ１、ＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ２４−Ｆ１、ＫＩＦ５Ｂ−Ｆ−ｏｒｆ２４３８、およびＫＩＦ５Ｂ−ｉｎｔ１５−Ｆ３．５からなる群から選択される１つのプライマーと、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｒ１、ＲＥＴ−ｉｎｔ１１−Ｒ３、ＲＥＴ−ｉｎｔ７−Ｒ１、ＲＥＴ−ｉｎｔ１１−Ｒ０．５、ＲＥＴ−ｉｎｔ１１−Ｒ１、ＲＥＴ−ｉｎｔ７−Ｒ２、およびＲＥＴ−Ｒ−ｏｒｆ２３６４からなる群から選択される１つのプライマーとからなるプライマーセットである。より好ましくは、それは、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｆ１およびＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｒ１、ＫＩＦ５Ｂ−ｉｎｔ１５−Ｆ１およびＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｒ１、ＫＩＦ５Ｂ−ｉｎｔ１５−Ｆ２およびＲＥＴ−ｉｎｔ１１−Ｒ３、ＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ１６−Ｆ１およびＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｒ１、ＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ２３−Ｆ１およびＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｒ１、またはＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ２４−Ｆ１プライマーおよびＲＥＴ−ｉｎｔ７−Ｒ１プライマーである。
【0143】
本発明は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を特定、評定、または検出する方法；癌、例えば、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を有する癌に罹患している対象を特定、評定、評価、および／もしくは治療する方法；単離されたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ核酸分子、核酸構築物、核酸分子を含む宿主細胞；精製されたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴポリペプチドおよび結合剤；検出試薬（例えば、プローブ、プライマー、抗体、キット、例えば、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ核酸またはタンパク質の特定の検出が可能）；５′ＫＩＦ５Ｂ−３′ＲＥＴ融合、例えば、新規の阻害剤と相互作用する、例えば、阻害する分子を特定するためのスクリーニングアッセイ；ならびに、癌、例えば、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を有する癌に罹患している対象を評価、特定、評定、および／または治療するためのアッセイおよびキットを提供する。本明細書で特定される組成物および方法は、例えば、新しいＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ阻害剤を特定する、対象、例えば、癌に罹患している患者を評価、特定、または選択するため、ならびに癌を治療または予防するために使用することができる。
【0144】
ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ核酸分子。一態様において、本発明は、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子の断片およびＲＥＴプロトオンコジーンの断片を含む核酸分子（例えば、単離されたまたは精製された）核酸分子を特徴とする。一実施形態において、核酸分子には、融合、例えば、ＫＩＦ５Ｂのエクソン（例えば、キネシンモータードメインまたはその断片をコードする１つ以上のエクソン）、およびＲＥＴのエクソン（例えば、ＲＥＴチロシンキナーゼドメインまたはその断片をコードする１つ以上のエクソン）のインフレーム融合が含まれる。
【0145】
一実施形態において、５′ＫＩＦ５Ｂ−３′ＲＥＴ核酸分子は、コードされた５′ＫＩＦ５Ｂ−３′ＲＥＴ融合が、キナーゼ活性を有し、例えば、本明細書に称される癌の細胞中の野生型ＲＥＴと比較して、活性、例えば、キナーゼ活性を上昇させるように、十分なＫＩＦ５Ｂおよび十分なＲＥＴ配列を含む。一実施形態において、コードした５′ＫＩＦ５Ｂ−３′ＲＥＴ融合は、ＫＩＦ５Ｂ由来の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、９、１０、または１１エクソン、および少なくとも１、２、３、４、５、６、７、９、または１０のＲＥＴエクソンを含む。一実施形態において、コードされた５′ＫＩＦ５Ｂ−３′ＲＥＴ融合ポリペプチドは、キノシンモータードメイン、二重コイルドメイン、またはその機能的断片、およびＲＥＴチロシンキナーゼドメインまたはその機能的断片を含む。
【0146】
一実施形態において、核酸分子は、ＫＩＦ５Ｂのエクソン１５とＲＥＴのエクソン１２とのインフレーム融合を有するヌクレオチド配列（例えば、染色体１０上の１１ＭＢ挾動原体内の配列）を含む。他の実施形態において、核酸分子は、染色体１０のヌクレオチド４３，６１１，０４２−４３，６１１，１１８の領域において、ヌクレオチドに結合（例えば、並列）する染色体１０の３２，３１６，３７６−３２，３１６，４１６の領域内にヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、核酸分子は、切断点を含むヌクレオチド配列を含む。例えば、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合は、ＫＩＦ５Ｂまたはその断片の少なくともエクソン１５（例えば、ＫＩＦ５Ｂまたはその断片のエクソン１〜１５）のＲＥＴの少なくともエクソン１２（例えば、ＲＥＴまたはその断片のエクソン１２〜２０）とのインフレーム融合を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合は、５′−ＫＩＦ５Ｂから３′−ＲＥＴの構造内にある。一実施形態において、核酸分子は、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子のエクソン１〜１５、もしくはその断片のヌクレオチド配列、またはそれに実質的に同一である配列を含む。別の実施形態において、核酸分子は、ＲＥＴ遺伝子のエクソン１２〜２０、もしくはその断片のヌクレオチド配列、またはそれに実質的に同一である配列を含む。
【0147】
他の実施形態において、核酸分子は、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子の断片およびＲＥＴプロトオンコジーンの断片を含むＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、キネシンモータードメインまたはその機能的断片、およびＲＥＴチロシンキナーゼドメインまたはその機能的断片を含む、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードする。
【0148】
別の実施形態において、核酸分子は、ＲＥＴ転写物とＫＩＦ５Ｂ転写物との間の融合接合部を含むＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を含む。別の実施形態において、核酸分子は、融合、例えば、ＲＥＴの少なくともエクソン１１またはその断片（例えば、ＲＥＴのエクソン１〜１１またはその断片）、および少なくともエクソン１６またはその断片（例えば、ＫＩＦ５Ｂまたはその断片のエクソン１６〜２５）のインフレーム融合を含む。ある特定の実施形態において、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合は、５′−ＲＥＴから３′−ＫＩＦ５Ｂの構造内にある。一実施形態において、核酸分子は、ＲＥＴ遺伝子のエクソン１〜１１、もしくはその断片のヌクレオチド配列、またはそれに実質的に同一である配列に対応するヌクレオトドを含む。
【0149】
関連する態様において、本発明は、本明細書に記載されるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ核酸分子を含む核酸構築物を特徴とする。ある特定の実施形態において、核酸分子は、天然または異種調節配列に作動可能に連結される。また、本明細書に記載されるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞、例えば、本明細書に記載される核酸分子およびポリペプチドを生成するために適しているベクターおよび宿主細胞も含まれる。
【0150】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合をコードする核酸分子の発現を減少させるまたは阻害する核酸分子を特徴とする。そのような核酸分子の例には、例えば、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴをコードする核酸にハイブリダイズするアンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡｉ、三重らせん分子、またはＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴの転写調節領域を含み、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴのｍＲＮＡ発現を遮断もしくは減少させる。
【0151】
本発明はまた、本明細書に記載されるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を含む、側面に位置する、それにハイブリダイズする、プローブ、プライマー、おとり、またはライブラリーメンバーとして好適な核酸分子、例えば、核酸断片も特徴とし、これらは、本明細書に記載されるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を特定するのに有用であるか、別様に本明細書に記載されるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合に基づく。ある特定の実施形態において、プローブ、プライマー、またはおとり分子は、本明細書に記載されるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合核酸分子の捕捉、検出、または単離を可能にするオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合核酸分子の断片に実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含むことができる。核酸断片、例えば、オリゴヌクレオチドと、標的ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ配列との間の配列同一性は、配列が標的配列の捕捉、検出、または単離を可能にするのに十分に相補的である限り、正確である必要はない。一実施形態において、核酸断片は、約５〜２５、例えば、１０〜２０、または１０〜１５ヌクレオチド長さのオリゴヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーである。他の実施形態において、核酸断片は、約１００〜３００ヌクレオチド、１３０〜２３０ヌクレオチド、１５０〜２００ヌクレオチド、２００〜３５０、３５０〜９５０、３００〜６００、５００〜１０００、７５０〜２０００、ヌクレオチド００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含むおとりであるが、必ずしもＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合核酸を含まない。
【0152】
一実施形態において、核酸断片は、例えば、ハイブリダイゼーションによって、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を特定または捕捉するために使用することができる。例えば、核酸断片は、例えば、ハイブリダイゼーションによって、本明細書に記載されるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を特定するまたは捕捉するために使用するプローブ、プライマーであり得る。一実施形態において、核酸断片は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴの切断点を特定するまたは捕捉するために使用するために有用であり得る。１．一実施形態において、核酸断片は、ＫＩＦ５Ｂのエクソン１５のＲＥＴのエクソン１２とのインフレーム融合を生成する染色体再配置内のヌクレオチド配列（例えば、染色体１０上の１１ＭＢ挾動原体内の配列）にハイブリダイズする。一実施形態において、核酸断片は、染色体１０のヌクレオチド４３，６１１，０４２〜４３，６１１，１１８の領域内にヌクレオチドに結合する（例えば、並列する）す染色体１０の３２，３１６，３７６〜３２，３１６，４１６の領域内でヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
【0153】
本明細書に記載されるプローブまたはプライマーは、例えば、ＦＩＳＨ検出またはＰＣＲ増幅のために使用することができる。検出がＰＣＲに基づいている１つの例示的な実施形態において、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合接合点の増幅は、例えば、本明細書に記載されるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合接合点、例えば、本明細書に記載される染色体再配置の突然変異体または接合点の側面に位置する配列を増幅するために、プライマーまたはプライマー対を使用して行われ得る。一実施形態において、一対の単離されたオリゴヌクレオチドプライマーは、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合における位置を含むまたはそれに隣接する領域を増幅させることができる。例えば、順方向プライマーは、ＫＩＦ５ＢゲノムまたはｍＲＮＡ配列内にヌクレオチド配列をハイブリダイズするように設計することができる。
【0154】
核酸断片は、例えば、放射性標識、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識、酵素標識、結合対標識で検出可能に標識され得るか、または、親和性タグ、タグ、または識別子（例えば、アダプター、バーコード、または他の配列識別子）を含み得る。
【0155】
ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合核酸分子またはポリペプチドが対象由来の試料中に存在するという直接獲得する知識を含む、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合の存在を決定する方法。試料は、液体、細胞、組織、例えば、腫瘍組織からなる試料であり得、それは、核酸試料、タンパク質試料、腫瘍生検、または循環腫瘍細胞もしくは核酸を含み得、それは、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、ＳＣＣ、またはその組み合わせ、および腺癌または黒色腫を含む肺癌から選択され得る。
【0156】
核酸分子内のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合、および核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅系アッセイ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイ、リアルタイムＰＣＲ、配列決定、スクリーニングアッセイ、ＦＩＳＨ、分光による染色体解析、またはＭＦＩＳＨ、比較ゲノムハイブリダイゼーション）、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＳＳＰ、ＨＰＬＣ、または質量分光遺伝子型決定のうちのいずれかの使用による検出方法。
【0157】
タンパク質試料をＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドに特異的に結合する試薬と接触させることと、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドおよび試薬の複合体の形成を検出することとを含む、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドを検出する方法が記載される。ポリペプチドの検出方法は、結合および非結合試薬の検出を促進するために検出可能な基で標識された試薬を使用することを含み、この試薬は、抗体分子であり、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合のレベルおよび活性が評価され、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合は、対象における治療を開始する前、その間、またはその後に検出され、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合は、癌を有する診断時に検出され、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合は、所定間隔で、例えば、第１の時点および少なくともそれに続く時点で検出される。
【0158】
治療への応答はまた、具体的には、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合の存在の決定への応答も含まれ、（１）患者集団を階層化すること、（２）治療に応答する可能性が高い、もしくは可能性が低い対象を特定または選択すること、（３）治療の選択肢を選択すること、および／または（４）対象における経時的な疾患を予後予測すること、のうちの１つ以上が使用される。
【0159】
ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合またはその断片を含む切断点をコードする単離されたまたは精製された核酸分子。天然または異種調節配列に作動可能に連結される単離されたまたは精製された核ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ核酸分子。ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合またはその断片を含む切断点をコードする核酸分子を含む単離されたまたは精製されたベクター。ベクターを含む宿主細胞。アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、または三重らせん分子から選択することができる、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合をコードする核酸分子の発現を特異的に減少または阻害する核酸分子。単離されたまたは精製されたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドまたはその断片を含む断片点。ＲＥＴキナーゼ活性、および／または二量体化もしくは三量体化する活性を有する、単離されたまたは精製されたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチド。ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドに特異的に結合する単離されたまたは精製された抗体分子。ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドに対して単一特異的な抗体分子である、抗体分子。
【0160】
本発明におけるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴポリヌクレオチドの翻訳産物を検出するための方法の例は、免疫染色、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降、および抗体アレイ分析である。これらの方法において、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドに結合する抗体が使用される。そのような抗体の例は、ＫＩＦ５Ｂタンパク質とＲＥＴタンパク質との融合部位を含むポリペプチドに特異的な抗体（以下、「融合部位に特異的な抗体」とも称される）、ＲＥＴタンパク質の前述の融合部位からのＣ末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体（以下、「ＲＥＴ−Ｃ末端抗体」とも称される）、およびＫＩＦ５Ｂタンパク質の前述の融合部位からのＮ末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体（以下、「ＫＩＦ５Ｂ−Ｎ末端抗体」とも称される）である。ここで、「融合部位に特異的な抗体」とは、前述の融合部位を含むポリペプチドに特異的に結合するが、野生型（正常型）ＫＩＦ５Ｂタンパク質および野生型（正常型）ＲＥＴタンパク質のいずれにも結合しない抗体を意味する。
【0161】
ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドは、前述の融合部位に特異的な抗体または前述のＲＥＴ−Ｃ末端抗体とＫＩＦ５Ｂ−Ｎ末端抗体の組み合わせによって検出することができる。しかしながら、例えば、正常な肺細胞ではＲＥＴタンパク質の発現はほとんど検出されないため、免疫染色法において、ＲＥＴ−Ｃ末端抗体を単独で使用する場合でも、肺腺癌組織におけるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在を検出することができる。
【0162】
「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドに結合する抗体」は、当業者によって、適切な既知の方法を選択して調製することができる。そのような既知の方法の例は、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分からなる前述のポリペプチド、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチド、ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端部分からなる前述のポリペプチド等を免疫動物に接種し、それにより、動物の免疫系を活性化させ、次いで、動物の血清（ポリクローナル抗体）を回収する方法、ならびにハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、およびファージディスプレイ法等のモノクローナル抗体を生成する方法である。標識物質を結合させた抗体を使用する場合、標的タンパク質は、標識を検出することによって直接検出することができる。標識物質は、抗体に結合させることができ、検出することができるものであれば、特に制限されない。例としては、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペロキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、アルカリホスファターゼ、ビオチン、および放射性物質等が挙げられる。さらに、標識物質を結合させた抗体を使用して標的タンパク質を直接的に検出する方法に加えて、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ、または標識物質を結合させた二次抗体を使用して標的タンパク質を間接的に検出する方法も使用され得る。
【0163】
前述の方法によって対象から単離された標本において、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在が検出される場合、式Ｉ、Ｉａ、または化合物１等のＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤による癌治療の有効性が、その患者において高いと判定され、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在が検出されない場合、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤による癌治療の有効性が、その患者において低いと判定される。
【0164】
上述のように、少なくとも１５塩基の鎖長を有する、下記（ａ）〜（ｃ）に記載のポリヌクレオチドのうちのいずれもが、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在または非存在を検出するために有利に使用され得る：（ａ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブおよびＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択する少なくとも１つのプローブであるポリヌクレオチド、（ｂ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドの融合部位にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド、（ｃ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドの融合部位を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド。
【0165】
これらのポリヌクレオチドは、標的遺伝子の特定の塩基配列に相補的である塩基配列を有する。ここで、「相補的」とは、それがハイブリダイズするならば、完全に相補的でないことを意味し得る。例えば、これらのポリペプチドは、特定の塩基配列に対して、８０％以上、好ましくは、９０％、より好ましくは、９５％以上、最も好ましくは、１００％の相同性を有する。
【0166】
（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドでは、ＤＮＡまたはＲＮＡの一部またはすべてにおいて、ＰＮＡ（ポリアミド核酸、ペプチド核酸）、ＬＮＡ（商標、ロックされた核酸、架橋された核酸）、ＥＮＡ（商標、２′−Ｏ、４′−Ｃ−エチレン架橋された核酸）、ＧＮＡ（グリセロール核酸）、およびＴＮＡ（トレオース核酸）等の人工核酸によって、ヌクレオチドが置換され得る。
【0167】
さらに、上述のように、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドに結合する抗体は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの翻訳産物を検出するのに有利に使用される。したがって、本発明は、この抗体を含むＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤による癌治療の有効性を検出するための薬物を提供する。
【0168】
本発明の融合遺伝子の検出方法は、試験対象から得られた本出願のポリヌクレオチドの存在を検出するステップを含む。試験対象から得られた試料として、試験対象から収集された物質（生体から単離された試料）、具体的には、収集された任意の種類の体液（好ましくは血液）、肺胞および気管支洗浄、生検を行った試料、および痰試料が、使用される。好ましくは、試験対象の肺内の罹患領域からの生検試料または痰試料が、使用される。この試料から、ゲノムＤＮＡを抽出および使用することができる。加えて、その転写物（ゲノムの転写および翻訳の結果として生成された産物、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびタンパク質）を使用することができる。特に、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製および使用することが好ましい。
【0169】
ゲノムＤＮＡは、既知の方法によって検出することができ、この抽出は、市販のＤＮＡ抽出キットを使用して容易に行うことができる。
【0170】
検出のステップは、周知の遺伝子分析方法（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ（ストランド置換増幅）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）、ＩＣＡＮ（等温およびキメラプライマー開始核酸増幅）、ＬＡＭＰ（ループ媒介性等温増幅）法、ＴＭＡ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ′ｓ ＴＭＡ ｓｙｓｔｅｍ）法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、およびマイクロアレイ等の遺伝子検出方法として一般に使用される周知の方法）に従って行われ得る。例えば、検出されるべきポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸がプローブとして使用されるハイブリダイゼーション技術、検出されるべきポリヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮＡがプライマーとして使用される遺伝子増幅技術等が使用される。
【0171】
具体的には、試験対象から得られた試料由来の核酸、例えば、ｍＲＮＡ等を使用して、検出が行われる。ｍＲＮＡ量は、検出されるべきポリヌクレオチドの配列を特異的に増幅することができるように設計されたプライマーを使用することによって遺伝子増幅反応の方法によって測定される。本発明の検出方法に使用されるプライマー、または検出キットに含まれるプライマーは、プライマーが検出されるべきポリヌクレオチドの配列を特異的に増幅させることができる限り、特に制限されず、検出されるべきポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計される。ＰＣＲ増幅モニター法に使用されるプライマーは、プライマー設計ソフトウェア（例えば、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって製造されるＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ）等を使用して設計することができる。加えて、ＰＣＲ産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが増幅されるときに得られた増幅産物のサイズが１ｋｂ以下になるように設計されるのが適切である。
【0172】
より具体的には、センスプライマー（５′プライマー）は、ＫＩＦ５Ｂをコードする部分から設計され、アンチセンスプライマー（３′プライマー）は、ＲＥＴをコードする部分から設計される。本発明の検出キットに含まれるプライマーを使用することが好ましく、検出キットに最も好適に含まれるプライマーを使用することがより好ましい。ＰＣＲ増幅モニター法では、それぞれの遺伝子に対応する上記センスプライマーを混合することによって、単一の反応液においてすべての融合ポリヌクレオチドを検出するためにマルチプレックスＰＣＲを設計することも可能である。各増幅技術に適している方法によって、標的遺伝子（全遺伝子またはその特異的部分）が増幅されたかどうかを確認することが可能である。例えば、ＰＣＲ法では、ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動によって分析し、臭化エチジウム染色等に曝し、それによって、標的サイズを有する増幅された断片を得られたかどうかを確認することが可能である。標的サイズを有する増幅された断片を得られた場合は、検出されるべきポリヌクレオチドが試験対象から得られた試料中に存在することを示す。このようにして、検出されるべきポリヌクレオチドの存在を検出することができる。
【0173】
本発明の融合遺伝子の検出方法は、好ましくは、遺伝子増幅反応によって試験対象から得られた試料中に特定のポリヌクレオチドの存在を検出するステップと、標的サイズを有する増幅された断片を得られたかどうかを検出するステップとを含む。
【0174】
ハイブリダイゼーション技術を使用する検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、およびＲＮＡプロテクション法等を使用して行う。ハイブリダイゼーションに使用するプローブとして、配列を含むプローブを使用することが可能である。検出されるべきポリヌクレオチドまたはそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする連続した少なくとも３２塩基からなる核酸分子の中心として融合点の上流および下流のそれぞれ１６塩基からなる配列を含むか、またはそれらの相補鎖を含む、プローブを使用することが可能である。
【0175】
ハイブリダイゼーションは、当業者に既知の「ストリンジェントな条件下」または「よりストリンジェントな条件下」のいずれかで使用することができる。また、ＲＴ−ＰＣＲ等の遺伝子増幅技術を使用することも可能である。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、ＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法は、遺伝子増幅の過程中に行い、それによって、検出されるべきポリヌクレオチドの存在が、より定量的に分析され得る。ＰＣＲ増幅モニター法を使用することができる。リアルタイムＰＣＲは周知の方法であり、この方法のために市販の装置およびキットを使用して簡便に行うことができる。
【0176】
本発明の実施形態のいくつかの融合タンパク質の検出方法は、試験対象から得られた試料中の特定のポリペプチド、すなわち、検出されるべきポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（以下、検出されるべきポリペプチドと呼ばれる）の存在を検出するステップを含む。そのような検出ステップは、試験対象から得られた試料（例えば、試験対象から得られた癌組織または細胞）由来の可溶化液を調製し、その液体中に含まれる検出されるべきポリペプチドを抗ＫＩＦ５Ｂ抗体および抗ＲＥＴ抗体と混合することによって行われる免疫アッセイ法または酵素活性アッセイ法によって行うことができる。好ましくは、酵素免疫アッセイ法、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫アッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、およびウエスタンブロット法等の検出されるべきポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用する技術を使用することが可能である。
【0177】
本発明の検出方法において、検出されるべきポリヌクレオチドまたは検出されるべきポリペプチドが試験対象から得られた試料から検出される場合は、試験対象は、ポリヌクレオチド陽性である癌を有する対象（患者）であり、ＲＥＴ阻害剤を使用する治療を提供されるべき対象である。
【0178】
本発明の検出キットは、本発明の検出方法において、検出されるべきポリヌクレオチドを特異的に増幅させることができるように設計された少なくともセンスおよびアンチセンスプライマーを含む。センスおよびアンチセンスプライマーセットは、検出されるべきポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして作用するポリヌクレオチドのセットである。
【0179】
一実施形態において、本発明のプライマーセットは、（１）ＫＩＦ５Ｂをコードする部分から設計されたセンスプライマーと、ＲＥＴをコードする部分から設計されたアンチセンスプライマーとを含み、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは、「検出されるべきポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基からなる核酸分子）からなり、センスプライマーは、「検出されるべきポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基からなる核酸分子）からなる、プライマーセットを含む。
【0180】
以下のプライマーセット（２）および（３）は、プライマーセット（１）のより特異的な変異体としてプライマーに含まれる。
【0181】
（２）任意の連続する少なくとも１６塩基からなるオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマーのプライマーセット。
【0182】
（３）任意の連続する少なくとも１６塩基からなるオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマーのプライマーセット。
【0183】
これらのプライマーセット（１）〜（３）では、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーが選択される位置の間隔が、好ましくは、１ｋｂ以下であるか、またはセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーによって増幅される増幅産物のサイズが、好ましくは１ｋｂ以下である。
【0184】
加えて、プライマーは、通常、１５〜４０塩基からなり、好ましくは、１６〜２４塩基からなり、より好ましくは、１８〜２４塩基からなり、特に好ましくは、２０〜２４塩基からなる鎖長を有する。
【0185】
プライマーセットは、検出されるべきポリヌクレオチドを増幅および検出するために使用することができる。さらに、特に限定されるものではないが、本発明のプライマーセットに含まれる大乗的なプライマーは、例えば、化学合成によって調製することができる。
【0186】
抗癌剤をスクリーニングする方法には、融合タンパク質を発現する細胞に試料化合物を接触させることと、細胞中の融合タンパク質の発現レベルを測定することと、を含み、試料化合物で処理される細胞中の融合タンパク質の発現レベルが、試料化合物による処理前のものまたは非処理細胞中のものと比較して減少し、この試料化合物が抗癌剤の候補化合物として決定される。
【0187】
抗癌剤をスクリーニングする方法は、同じ化合物の処理前の細胞中の融合タンパク質の発現レベルのステップをさらに含み得る。この場合、試料化合物の処理後の融合タンパク質の発現レベルが同じ細胞中の試料化合物による処理前のものと比較して減少するとき、この試料化合物が、抗癌剤の候補化合物として決定され得る。あるいは、抗癌剤をスクリーニングする方法は、融合タンパク質を発現する細胞を提供することと、提供された細胞の一部に試料化合物を接触させることと、を含み得る。この場合、試料化合物と接触させた細胞中の融合タンパク質の発現レベルが同じ化合物と接触させなかった細胞中のものと比較して減少するとき、この試料化合物が、抗癌剤の候補化合物として決定され得る。
【0188】
スクリーニング法に使用される細胞は、融合遺伝子もしくは融合タンパク質が発現および／または活性化する癌細胞由来の細胞、細胞の抽出物、または細胞の培養物であり得る。癌細胞は、上述のように、とりわけ、肺癌、例えば、肺腺癌等の非小細胞肺癌の固体癌細胞であり得る。
【0189】
さらに別の実施形態は、肺癌に対して抗癌剤をスクリーニングする方法を提供し、本方法は、試料化合物により融合タンパク質を発現する細胞を処理することと、細胞中の融合タンパク質の発現レベルを測定することと、を含み、試料化合物で処理される細胞中の融合タンパク質の発現レベルが、試料化合物による処理前のものまたは非処理細胞中のものと比較して減少し、この試料化合物が肺癌に対する抗癌剤の候補化合物として決定される。
【0190】
ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合タンパク質は、肺癌を診断するためのマーカーとして、または肺癌を治療もしくは予防もしくは治療するために使用することができる。肺癌の治療または予防は、治療有効量の、融合タンパク質に対する少なくとも１つの阻害剤、融合タンパク質をコードする融合遺伝子に対する少なくとも１つの阻害剤、ＲＥＴをコードする遺伝子に対する少なくとも１つの阻害剤、またはそれらの組み合わせを、それを必要とする患者に投与するステップを含む。この阻害剤は、式Ｉ、Ｉａ、または化合物１であり得る。
【0191】
別の実施形態は、癌を予防および／または治療する方法を提供し、本方法は、薬学的（治療的）有効量の、融合タンパク質に対する少なくとも１つの阻害剤、融合タンパク質をコードする融合遺伝子に対する少なくとも１つの阻害剤、ＲＥＴをコードする遺伝子に対する少なくとも１つの阻害剤、またはそれらの組み合わせを、それを必要とする患者に投与するステップを含み、これらのうちのいずれも、式１の化合物および本明細書に開示される他の特定の化合物であり得る。本方法は、そのような治療を施すステップの前に、癌の予防および／または治療を必要とする患者を特定するステップをさらに含み得る。別の実施形態は、癌を予防および／または治療するための組成物を提供し、本方法は、式１を含む融合タンパク質に対する少なくとも１つの阻害剤を、単独でまたは融合タンパク質をコードする融合遺伝子に対する少なくとも１つの阻害剤、ＲＥＴをコードする遺伝子に対する少なくとも１つの阻害剤、またはそれらの組み合わせとともに投与することを含む。別の実施形態は、癌を予防および／または治療するために、融合タンパク質に対する阻害剤、融合タンパク質をコードする融合遺伝子に対する阻害剤、ＲＥＴをコードする遺伝子に対する阻害剤の使用を提供する。この阻害剤は、式Ｉ、Ｉａ、または化合物１であり得る。
【0192】
本発明では、癌は、肺癌、とりわけ、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、例えば、肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌、または大細胞肺癌であり得る。
【0193】
融合タンパク質に対する阻害剤が、融合タンパク質に特異的に結合するアプタマー、融合タンパク質に特異的に結合する抗体２０、および融合遺伝子またはＲＥＴをコードする遺伝子に対する阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つである組成物は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアプタマーからなる群から選択される少なくとも１つであり、これらは、融合遺伝子またはＲＥＴをコードする遺伝子に特異的に結合することができる。
【0194】
ＲＥＴおよび／またはＲＥＴキナーゼ活性（例えば、転写、翻訳、または安定性）の発現を阻害する任意のＲＥＴキナーゼ阻害剤が、単独でまたは式Ｉ、Ｉａ、または１の化合物と組み合わせて使用され得る。
【0195】
阻害剤は、ＲＥＴに特異的であり得るか、または非特異的（例えば、非特異的キナーゼ阻害剤、複数標的阻害剤）であり得る。いくつかのＲＥＴキナーゼ阻害剤が開発されており、それらの臨床的適用は、調査中である。ＲＥＴキナーゼ活性の下流、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）および細胞外シグナルキナーゼ１／２（ＥＲＫ）等のキナーゼ（Ｗｉｘｔｅｄ ＪＨ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１１）、およびＳＴＡＴ３（Ｈｗａｎｇ ＪＨ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２００３；１７：１１５５−１１６６）がある。そのような下流シグナル伝送経路を阻害する薬物はまた、ＲＥＴキナーゼ阻害剤への代替物として、またはアジュバントとして、単独または式１の化合物と組み合わせて使用することもできる。
【0196】
あるモードでは、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ転座を有すると判断される対象はまた、転座部位を越える部位でＲＥＴ突然変異体を有すると判断される。ＲＥＴ突然変異体の一例は、活性化突然変異体である。ＲＥＴ活性化突然変異体は、野生型突然変異体と比較して活性化の増加を引き起こす無作為の突然変異体である。例えば、ＲＥＴ活性化突然変異体は、永続的なＲＥＴ活性化をもたらし得る。さらに、ＲＥＴ阻害剤と関連する、またはその使用による二次的なＲＥＴ活性化突然変異体が存在し得る。ＲＥＴシグナル活性の増加を引き起こす突然変異体は、例えば、キナーゼドメイン点突然変異、欠失、挿入、複製、もしくは反転、またはこれらのうちの２つ以上の組み合わせにより生じ、ＲＥＴシグナルの増加を引き起こす。ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ転座およびＲＥＴ突然変異体の両方を有すると判定される対象については、ＲＥＴキナーゼ阻害剤で治療する決定もなされ得る。加えて、治療／療法は、その決定に基づいて実行され得る。
【0197】
上述のように、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤による癌治療の有効性は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドが本発明の方法によって検出される患者において高いと考えられる。このため、癌治療は、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子およびＲＥＴ遺伝子を有するそれらの癌患者に、選択的にＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を投与することによって効果的に行われ得る。したがって、本発明は、癌を治療するための方法を提供し、本方法は、式Ｉ、Ｉａ、または化合物１であるＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を、そのＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤による癌治療の有効性が本明細書に記載される前述の診断方法によって高いと判断された患者に投与するステップを含む。
【0198】
本発明では、「標本」は、生物学的標本（例えば、細胞、組織、器官、液体（血液、リンパ液等）、消化液、痰、肺胞／気管支洗浄液、尿、排泄物）だけでなく、核酸抽出物（ゲノムＤＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物、またはｍＲＮＡ抽出物から調製されるｃＤＮＡ調製物もしくはｃＲＮＡ調製物）、あるいはこれらの生物学的標本から得られたタンパク質抽出物も含まれる。この標本はまた、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理、またはパラフィン包埋処理を行うものであり得る。
【0199】
さらに、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはタンパク質は、標本のタイプ、状態等を考慮して好適な周知の技術を選択した後、当業者によって調製され得る。
【0200】
活性成分としての前述の物質（ポリヌクレオチド、抗体）に加えて、本発明の薬物は、他の薬学的に許容される成分を含み得る。そのような成分の例は、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、生理的食塩水等を含む。緩衝剤として、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等が使用され得る。乳化剤として、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等が使用され得る。懸濁剤として、グリセロールモノステアレート、アルミニウムモノステアレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等が使用され得る。安定剤として、プロピレングリコール、亜硫酸ジエチル、アスコルビン酸等が使用され得る。保存剤として、アジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等が使用され得る。
【0201】
さらに、ポリヌクレオチドおよび抗体を含む調製物に加えて、基剤、陽性対照（例えば、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチド、またはそれらを有する細胞等）、およびポリヌクレオチドおよび抗体に添付される標識の検出に必要な陰性対照、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等に使用される対比染色試薬（ＤＡＰＩ等）、抗体を検出する際に必要とされる分子（例えば、二次抗体、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ）、ならびに抗体の希釈もしくは洗浄に使用される緩衝液などの調製物が、本発明の方法において使用されるキットとして合わせられ得る。このキットには、キットの使用のための取扱説明書が含まれ得る。本発明はまた、本発明の方法で使用される前述のキットを提供する。
【0202】
本明細書に記載される検出方法は、本質的に融合パートナーのＮ末端ドメインおよびＲＥＴタンパク質のＣ末端ドメインからなる融合タンパク質が検出されるときに、特に有用である。融合タンパク質は、本質的にＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端ドメインおよびＲＥＴタンパク質のＣ末端ドメインからなるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合タンパク質であり得る。本方法は、肺癌、特に、非小細胞肺癌を診断するために使用することができ、本方法には、染色体１０上に反転または転座を含むＲＥＴ関連の染色体再配置、ＲＥＴタンパク質が他のタンパク質と融合される融合タンパク質、融合タンパク質をコードする融合遺伝子、および癌を有しない個体からの標準試料と比較したＲＥＴの過剰発現のうちの少なくとも１つを検出することを含む。上記群から選択される上述の再配置のうちの１つが試験試料中に検出されるとき、式Ｉ、Ｉａ、または化合物１等のＲＥＴ阻害剤の処置のための個体。
【0203】
化合物１の調製Ｎ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ′−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドおよびその（Ｌ）−リンゴ酸塩の調製。
【0204】
Ｎ−（４−［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ′−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドおよびその（Ｌ）−リンゴ酸塩の調製に使用される合成経路をスキーム１に示す。【0205】
４−クロロ−６，７−ジメトキシ−キノリンの調製反応器に、６，７−ジメトキシ−キノリン−４−オール（１０．０ｋｇ）およびアセトニトリル（６４．０Ｌ）を順次装填した。得られた混合物を約６５℃まで加熱し、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３、５０．０ｋｇ）を添加した。ＰＯＣｌ３の添加後、反応混合物の温度を約８０℃まで上昇させた。２パーセント未満の出発材料が残留したときに（工程内高性能液体クロマトグラフィー［ＨＰＬＣ］分析）、その反応は完了したと見なした（約９．０時間）。反応混合物を、約１０℃まで冷却し、次いで、ジクロロメタン（ＤＣＭ、２３８．０ｋｇ）、３０％ ＮＨ４ＯＨ（１３５．０ｋｇ）、および氷（４４０．０ｋｇ）の冷却溶液に入れて反応停止処理を行った。得られた混合物を約１４℃まで加温して、相を分離した。有機相を水（４０．０ｋｇ）で洗浄し、真空蒸留によって濃縮して、溶媒（約１９０．０ｋｇ）を除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、５０．０ｋｇ）をバッチに添加し、混合物を約１０℃まで冷却し、その間に、生成物が結晶化した。固体を遠心分離によって回収し、ｎヘプタン（２０．０ｋｇ）で洗浄し、約４０℃で乾燥させて、表題化合物（８．０ｋｇ）を得た。
【0206】
６，７−ジメチル−４−（４−ニトロ−フェノキシ）−キノリンの調製反応器に、４−クロロ−６，７−ジメトキシ−キノリン（８．０ｋｇ）、４ニトロフェノール（７．０ｋｇ）、４ジメチルアミノピリジン（０．９ｋｇ）、および２，６ルチジン（４０．０ｋｇ）を順次装填した。反応器の内容物を約１４７℃まで加熱した。この反応が完了したら（工程内ＨＰＬＣ分析によって判断して５パーセント未満の出発材料が残存する、約２０時間）、反応器の内容物を約２５℃まで冷却した。メタノール（２６．０ｋｇ）を添加し、続いて、水（５０．０ｋｇ）に溶解した炭酸カリウム（３．０ｋｇ）を添加した。反応器の内容物を約２時間撹拌した。得られた固体沈殿物を濾過し、水（６７．０ｋｇ）で洗浄し、２５℃で約１２時間乾燥させて、表題化合物（４．０ｋｇ）を得た。
【0207】
４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミンの調製ギ酸カリウム（５．０ｋｇ）、ギ酸（３．０ｋｇ）、および水（１６．０ｋｇ）を含有する溶液を、６，７−ジメトキシ−４−（４−ニトロ−フェノキシ）−キノリン（４．０ｋｇ）、１０パーセントのパラジウム炭素（５０パーセント含水、０．４ｋｇ）の約６０℃まで加熱したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、４０．０ｋｇ）中の混合物に添加した。反応混合物の温度が約６０℃に留まるように、添加を行った。工程内ＨＰＬＣ分析を使用して判断して、反応が完了したと見なしたら（２パーセント未満の出発材料が残留する、通常１５時間）、反応器の内容物を濾過した。濾液を約３５℃で真空蒸留によって半分まで濃縮し、結果として生成物の沈殿物を得た。生成物を濾過によって回収し、水（１２．０ｋｇ）で洗浄し、約５０℃で、真空下で乾燥させて、表題化合物（３．０ｋｇ；９７パーセントの曲線下面積（ＡＵＣ））を得た。
【0208】
１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボン酸の調製バッチ温度が１０℃を超えないような速度で、トリエチルアミン（８．０ｋｇ）を、ＴＨＦ（６３．０ｋｇ）中の市販のシクロプロパン−１，１−ジカルボン酸（２ １、１０．０ｋｇ）の冷却した（約４℃）溶液に添加した。その溶液を、約３０分間撹拌し、次いで、塩化チオニル（９．０ｋｇ）を、バッチ温度を１０℃未満に保ちながら添加した。添加が完了したら、バッチ温度が１０℃を超えないような速度で、ＴＨＦ（２５．０ｋｇ）中の４−フルオロアニリン（９．０ｋｇ）を添加した。混合物を約４時間撹拌し、次いで、酢酸イソプロピル（８７．０ｋｇ）で希釈した。この溶液を、水酸化ナトリウム水溶液（５０．０Ｌの水に溶解した２．０ｋｇ）、水（４０．０Ｌ）、および水性塩化ナトリウム（４０．０Ｌの水に溶解した１０．０ｋｇ）で順次洗浄した。有機溶液を真空蒸留によって濃縮し、続いて、ヘプタンを添加し、その結果、固体の沈殿物を得た。固体を遠心分離によって回収し、次いで、真空下で、約３５℃で乾燥させて、表題化合物を得た（１０．０ｋｇ）。
【0209】
１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボニルクロリドの調製バッチ温度が３０℃を超えないような速度で、塩化オキサリル（１．０ｋｇ）を、ＴＨＦ（１１ｋｇ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、０．０２ｋｇ）の混合物中の１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボン酸（２．０ｋｇ）の溶液に添加した。この溶液をさらなる加工を行わずに次のステップで使用した。
【0210】
Ｎ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ′−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドの調製１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボニルクロリドを含有する先のステップからの溶液を、バッチ温度が３０℃を超えないような速度で、ＴＨＦ（２７．０ｋｇ）および水（１３．０ｋｇ）中の４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミン（３．０ｋｇ）および炭酸カリウム（４．０ｋｇ）の混合物に添加した。反応が完了したら（通常１０分で）、水（７４．０ｋｇ）を添加した。混合物を１５〜３０℃で約１０時間撹拌し、その結果、生成物の沈殿物を得た。生成物を濾過によって回収し、ＴＨＦ（１１．０ｋｇ）および水（２４．０ｋｇ）の予め作製した溶液で洗浄し、真空下で、約１２時間約６５℃で乾燥させて、表題化合物（遊離塩基、５．０ｋｇ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ１０．２（ｓ，１Ｈ），１０．０５（ｓ，１Ｈ），８．４（ｓ，１Ｈ），７．８（ｍ，２Ｈ），７．６５（ｍ，２Ｈ），７．５（ｓ，１Ｈ），７．３５（ｓ，１Ｈ），７．２５（ｍ，２Ｈ），７．１５（ｍ，２Ｈ），６．４（ｓ，１Ｈ），４．０（ｄ，６Ｈ），１．５（ｓ，４Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ＝５０２。
【0211】
Ｎ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ′−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミド、（Ｌ）リンゴ酸塩の調製約２５℃のバッチ温度を維持しながら、水（２．０ｋｇ）中のＬ−リンゴ酸（２．０ｋｇ）の溶液を、エタノール中のシクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミド遊離塩基（１ ５、５．０ｋｇ）の溶液に添加した。次いで、炭素（０．５ｋｇ）およびチオールシリカ（０．１ｋｇ）を添加し、得られた混合物を約７８℃まで加熱し、この時点で水（６．０ｋｇ）を添加した。次いで、反応混合物を濾過し、続いて、イソプロパノール（３８．０ｋｇ）を添加し、約２５℃まで冷却した。生成物を濾過によって回収し、イソプロパノール（２０．０ｋｇ）で洗浄し、約６５℃で乾燥させて、表題化合物（５．０ｋｇ）を得た。
【0212】
Ｎ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ′−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドおよびその（Ｌ）−リンゴ酸塩の代替調製国際公開ＰＣＴ／米国特許第２０１２／０２４５９１号（この全内容は参照により組み込まれる）において記載されるような、Ｎ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ′−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドおよびその（Ｌ）−リンゴ酸塩の調製のために使用することができる、代替合成経路をスキーム２に示す。
【0213】
４−クロロ−６，７−ジメトキシ−キノリンの調製反応器に、６，７−ジメトキシ−キノリン−４−オール（４７．０ｋｇ）およびアセトニトリル（３１８．８ｋｇ）を順次装填した。得られた混合物を約６０℃まで加熱し、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３、１３０．６ｋｇ）を添加した。ＰＯＣｌ３の添加後、反応混合物の温度を約７７℃まで上昇させた。３％未満の出発材料が残存したときに（工程内高性能液体クロマトグラフィー［ＨＰＬＣ］分析）、その反応は完了したと見なした（約１３時間）。反応混合物を約２〜７℃まで冷却し、次いで、ジクロロメタン（ＤＣＭ、４８２．８ｋｇ）、２６パーセントのＮＨ４ＯＨ（２５１．３ｋｇ）、および水（９００Ｌ）の冷却溶液に入れて反応停止を行った。得られた混合物を約２０〜２５℃に加温し、相を分離した。有機相をＡＷ ｈｙｆｌｏ ｓｕｐｅｒ−ｃｅｌ ＮＦ（セライト、５．４ｋｇ）床に通して濾過し、濾床をＤＣＭ（１１８．９ｋｇ）で洗浄した。合わせた有機相をブライン（２８２．９ｋｇ）で洗浄し、水（１２０Ｌ）と混合した。相を分離し、有機相を真空蒸留によって濃縮し、溶媒を除去した（約９５Ｌの残量）。ＤＣＭ（６８６．５ｋｇ）を、有機相を含有する反応器に装填し、真空蒸留によって濃縮し、溶媒を除去した（約９０Ｌの残量）。次いで、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、２２６．０ｋｇ）を装填し、混合物の温度を−２０〜−２５℃の調整し、２．５時間保持し、その結果、固体の沈殿物を得、次いで、これを濾過し、ｎ−ヘプタン（９２．０ｋｇ）で洗浄し、窒素下で、約２５℃で、フィルタ上で乾燥させて、表題化合物を得た（３５．６ｋｇ）。
【0214】
４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミンの調製Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、１８４．３ｋｇ）に溶解した４−アミノフェノール（２４．４ｋｇ）を、４−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン（３５．３ｋｇ）、ナトリウムｔ−ブトキシド（２１．４ｋｇ）およびＤＭＡ（１６７．２ｋｇ）を含有する反応器に２０〜２５℃で装填した。次いで、この混合物を１００〜１０５℃まで約１３時間加熱した。工程内ＨＰＬＣ分析（２パーセント未満の出発材料が残存する）を使用して判断して、反応が完了したと見なした後、反応器の内容物を１５〜２０℃で冷却し、１５〜３０℃の温度を維持する速度で、水（前もって冷却した、２〜７℃、５８７Ｌ）を装填した。得られた固体の沈殿物を濾過し、水（４７Ｌ）およびＤＭＡ（８９．１ｋｇ）の混合物で洗浄し、最終的に、水（２１４Ｌ）で洗浄した。次いで、濾過ケーキを約２５℃で、フィルタ上で乾燥させて、粗物４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミン（５９．４ｋｇ含湿、ＬＯＤに基づいて計算して４１．６ｋｇ乾燥）を得た。粗物４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミンを、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２１１．４ｋｇ）およびＤＭＡ（１０８．８ｋｇ）の混合物中で約１時間還流し（約７５℃）、次いで、０〜５℃まで冷却し、約１時間熟成し、その後、固体を濾過し、ＴＨＦ（１４７．６ｋｇ）で洗浄し、フィルタ上で真空下に約２５℃で乾燥させて、４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミン（３４．０ｋｇ）を得た。
【0215】
４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミンの代替調製４−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン（３４．８ｋｇ）および４−アミノフェノール（３０．８ｋｇ）およびナトリウムｔｅｒｔペントキシド（１．８当量）８８．７ｋｇ、ＴＨＦ中３５重量パーセント）、続いて、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、２９３．３ｋｇ）を反応器に装填した。次いで、この混合物を１０５〜１１５℃まで約９時間加熱した。工程内ＨＰＬＣ分析（２パーセント未満の出発材料が残存する）を使用して判定して、反応が完了したと見なした後、反応器の内容物を１５〜２５℃で冷却し、２０〜３０℃の温度を維持しながら、水（３１５ｋｇ）を２時間にわたり添加した。次いで、反応混合物をさらに１時間２０〜２５℃で振とうした。粗生成物を濾過によって回収し、８８ｋｇの水および８２．１ｋｇのＤＭＡの混合物で洗浄し、続いて、１７５ｋｇの水で洗浄した。生成物をフィルタ上で５３時間乾燥させた。ＬＯＤは、１パーセントｗ／ｗ未満を示した。
【0216】
代替手順において、１．６当量のナトリウムｔｅｒｔ−ペントキシドを使用し、反応温度を１１０〜１２０℃上昇させた。加えて、低下した温度を３５〜４０℃上昇させ、水添加の初めの温度は３５〜４０℃に調整したが、発熱のため４５℃になった。
【0217】
１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボン酸の調製バッチ温度が５℃を超えない速度で、トリエチルアミン（１９．５ｋｇ）を、ＴＨＦ（８９．６ｋｇ）中のシクロプロパン−１，１−ジカルボン酸（２４．７ｋｇ）の冷却した（約５℃）溶液に添加した。溶液を約１．３時間撹拌し、次いで、バッチ温度を１０℃未満に保ちながら、塩化チオニル（２３．１ｋｇ）を添加した。添加が完了したら、温度を１０℃未満に保ちながら、溶液を約４時間撹拌した。次いで、バッチ温度が１０℃を超えない速度で、ＴＨＦ（３３．１ｋｇ）中の４−フルオロアニリン（１８．０ｋｇ）の溶液を添加した。混合物を約１０時間撹拌し、その後、その反応は完了したと見なした。次いで、反応混合物を酢酸イソプロピル（２１８．１ｋｇ）で希釈した。この溶液を、水性水酸化ナトリウム（１０．４ｋｇ、１１９Ｌの水に溶解した５０パーセント）で順次洗浄し、水（４１５Ｌ）、次いで、水（１００Ｌ）、最終的に、塩化ナトリウム（１００Ｌの水に溶解した２０．０ｋｇ）水溶液でさらに希釈した。有機溶液を真空蒸留によって４０℃未満で濃縮し（１００Ｌの残量）、続いて、ｎ−ヘプタン（１７１．４ｋｇ）を添加し、その結果、固体の沈殿物を得た。固体を濾過によって回収し、ｎ−ヘプタン（１０２．４ｋｇ）で洗浄し、その結果、湿った、粗物１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボン酸（２９．０ｋｇ）を得た。粗物、１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボン酸をメタノール（１３９．７ｋｇ）に約２５℃で溶解し、続いて、水（３２０Ｌ）を添加し、その結果、スラリーを得、これを濾過によって回収し、水（２０Ｌ）およびｎ−ヘプタン（１０３．１ｋｇ）で順次洗浄し、次いで、フィルタ上で、窒素下で、約２５℃で乾燥させて、表題化合物（２５．４ｋｇ）を得た。
【0218】
１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボニルクロリドの調製バッチ温度が２５℃を超えないような速度で、塩化オキサリル（１２．６ｋｇ）を、ＴＨＦ（９６．１ｋｇ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、０．２３ｋｇ）の混合物中の１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボン酸（２２．８ｋｇ）の溶液に添加した。この溶液をさらなる加工を行わずに次のステップで使用した。
【0219】
１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボニルクロリドの代替調製反応器に、１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボン酸（３５ｋｇ）、３４４ｇのＤＭＦ、および１７５ｋｇのＴＨＦを装填した。反応混合物を１２〜１７℃に調整し、次いで、この反応混合物に、１時間の期間にわたって１９．９ｋｇの塩化オキサリルを装填した。反応混合物は、１２〜１７℃で３〜８時間撹拌した。この溶液をさらなる加工を行わずに次のステップで使用した。
【0220】
シクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミドの調製１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボニルクロリドを含有する先のステップからの溶液を、バッチ温度が３０℃を超えないような速度で、ＴＨＦ（２４５．７ｋｇ）および水（１１６Ｌ）中の化合物４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミン（２３．５ｋｇ）および炭酸カリウム（３１．９ｋｇ）の混合物に添加した。反応が完了したら（通常２０分で）、水（６５３Ｌ）を添加した。混合物を２０〜２５℃で約１０時間撹拌し、その結果、生成物の沈殿物を得た。生成物を濾過によって回収し、ＴＨＦ（６８．６ｋｇ）および水（２５６Ｌ）の前もって作製した溶液で洗浄し、まず、窒素下で、約２５℃で、フィルタ上で乾燥させ、次いで、真空下で、約４５℃で乾燥させて、表題化合物（４１．０ｋｇ、３８．１ｋｇ、ＬＯＤに基づいて計算して）を得た。
【0221】
シクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミンの代替調製反応器に、４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミン（３５．７ｋｇ、１当量）、続いて、４１２．９ｋｇのＴＨＦを装填した。反応混合物に、１６９ｋｇの水中に４８．３のＫ２ＣＯ３の溶液を装填した。上記の１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボニルクロリドの代替調製に記載される酸塩化物溶液を、最低２時間にわたって２０〜３０℃の温度を維持しながら、４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミンを含む反応器に移した。反応混合物を、２０〜２５℃で最低３時間撹拌した。次いで、反応温度を３０〜２５℃に調整して、混合物を振とうした。振とうを停止し、混合物の相を分離させた。下の水相は除去し、廃棄した。残った上の有機相に、８０４ｋｇの水を添加した。この反応物は、１５〜２５℃で最低１６時間撹拌した。
【0222】
生成物が沈殿した。生成物を濾過し、１７９ｋｇの水および１５７．９ｋｇのＴＨＦの混合物で２回に分けて洗浄した。粗生成物を真空下で少なくとも２時間乾燥させた。次いで、乾燥した生成物を２８５．１ｋｇのＴＨＦに取り込んだ。得られた懸濁液を反応容器に移し、懸濁液が透明な（溶解した）溶液になるまで振とうし、これには、約３０分間の３０〜３５℃への加熱を要した。次いで、４５６ｋｇの水、ならびに２０ｋｇのＳＤＡＧ−１エタノール（メタノール変性したエタノール）を２時間にわたり溶液に添加した。この混合物を１５〜２５℃で少なくとも１６時間振とうした。生成物を濾過し、１４３ｋｇの水および１２６．７のＴＨＦの混合物で２回に分けて洗浄した。生成物は、４０℃の最高温度設定で乾燥させた。
【0223】
代替手順において、酸塩化物形成中の反応温度を１０〜１５℃に調整した。再結晶温度は、１時間の間に１５〜２５℃から４５〜５０℃まで変化させ、次いで、２時間にわたり１５〜２５℃に冷却した。
【0224】
シクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミド、リンゴ酸塩の調製シクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミド（１−５、１３．３ｋｇ）、Ｌ−リンゴ酸（４．９６ｋｇ）、メチルエチルケトン（ＭＥＫ、１８８．６ｋｇ）、および水（３７．３ｋｇ）を反応器に装填し、この混合物を約２時間加熱還流（約７４℃）した。反応器温度を５０〜５５℃に低下させ、反応器の内容物を濾過した。上記のこれらの連続ステップは、類似した量の出発材料（１３．３ｋｇ）、Ｌ−リンゴ酸塩（４．９６ｋｇ）、ＭＥＫ（１９８．６ｋｇ）、および水（３７．２ｋｇ）から出発し、さらに２回繰り返した。合わせた濾液を、ＭＥＫ（１１３３．２ｋｇ）（およその残量７１１Ｌ、ＫＦ≦０．５％ ｗ／ｗ）を使用して、大気圧で、約７４℃で、共沸で乾燥させた。反応器の内容物の温度を２０から２５℃に低下させ、約４時間保持し、その結果として固体沈殿物を得、これを濾過し、ＭＥＫ（４４８ｋｇ）で洗浄し、真空下で、５０℃で乾燥させて、表題化合物（４５．５ｋｇ）を得た。
【0225】
シクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミド、（Ｌ）リンゴ酸塩の代替調製シクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミド（４７．９ｋｇ）、Ｌ−リンゴ酸（１７．２）、６５８．２ｋｇのメチルエチルケトン、および１２９．１ｋｇの水（３７．３ｋｇ）を反応器に装填し、この混合物を５０〜５５℃で約１〜３時間加熱し、次いで、５５〜６０℃でさらに４〜５時間加熱した。この混合物は、１μｍのカートレッジを通して濾過することによって清澄化された。反応器の温度を２０〜２５℃に調整し、１５０〜２００ｍｍＨｇの真空で５５℃の最高ジャケット温度で５５８〜７３１Ｌの体積範囲に真空蒸留した。
【0226】
真空蒸留は、それぞれ、３８０ｋｇおよび３８０．２ｋｇのメチルエチルケトンを装填してさらに２回行った。３回目の蒸留の後、バッチの体積は、１５９．９ｋｇのメチルエチルケトンを装填することによって１８ｖ／ｗのシクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミドに調整して全体積で８８０Ｌが得られた。さらなる真空蒸留を２４５．７のメチルエチルケトンの調整により実行した。反応混合物は、２０〜２５℃で少なくとも２４時間穏やかに振とうした。生成物を濾過し、４１５．１ｋｇのメチルエチルケトンで３分割して洗浄した。生成物を、４５℃のジャケット温度設定で、真空下で乾燥させた。
【0227】
代替手順において、１２９．９ｋｇの水に溶解した１７．７ｋｇのＬ−リンゴ酸の溶液をメチルエチルケトン（６７３．３ｋｇ）中のシクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミド（４８．７ｋｇ）に添加するように添加の順序を変更した。
【0228】
本発明は、以下の特定の実施形態を含む。
【0229】
実施形態１。肺腺癌を治療するための方法であって、そのような治療を必要とする患者に、式Ｉ：Ｒ１がハロであり、
Ｒ２がハロであり、
Ｒ３が（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、
Ｒ４が（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、
Ｑが、ＣＨまたはＮである、方法。
【0230】
実施形態２。肺腺癌が、非小細胞肺癌である、実施形態１に記載の方法。
【0231】
実施形態３。肺腺癌が、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性の非小細胞肺癌である、実施形態１に記載の方法。
【0232】
実施形態４。二重のＭＥＴおよびＶＥＧＦの調節因子が、式ＩａＲ１がハロであり、
Ｒ２がハロであり、
Ｑが、ＣＨまたはＮである、実施形態１〜３に記載の方法。
【0233】
実施形態５。式Ｉの化合物が、化合物１：【0234】
実施形態６。Ｎ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ′−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドである、実施形態５に記載の方法。
【0235】
実施形態７。式（Ｉ）、式Ｉ（ａ）、および化合物Ｉの化合物が、（Ｌ）−リンゴ酸塩または（Ｄ）−リンゴ酸塩である、実施形態１〜６に記載の方法。
【0236】
実施形態８。式（Ｉ）の化合物が、（Ｌ）リンゴ酸塩および／または（Ｄ）リンゴ酸塩の結晶性Ｎ−１型またはＮ−２型である、実施形態１〜７に記載の方法。
【0237】
実施形態９。式Ｉ、Ｉ（ａ）、もしくは化合物１の化合物、またはその薬学的に許容される塩が、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む、薬学的組成物として投与される、実施形態１〜８に記載の方法。
【0238】
実施形態１０。式Ｉの化合物が、別の形態の治療の後で投与される、実施形態１〜９に記載の方法。
【0239】
実施形態１１。式Ｉの化合物が、シスプラチンおよび／またはゲムシタビン治療後に投与される、実施形態１〜９に記載の方法。
【0240】
実施形態１２。式Ｉの化合物が、ドエクタクセル（ｄｏｅｃｔａｘｅｌ）治療後に投与される、実施形態１〜９に記載の方法。
【0241】
実施形態１３。式Ｉの化合物が、白金（シスプラチンもしくはカルボプラチン）および／またはパクリタキセル、および／またはゲムシタビン、および／またはドセタキセル、および／またはビノレルビン、および／またはイリノテカン、およびおよび／またはペメトレキセド治療後に投与される、実施形態１〜９に記載の方法。
【0242】
実施形態１４。化合物１またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性の非小細胞肺癌である肺腺癌の治療を、そのような治療を必要とする患者において行うための方法。
【0243】
実施形態１５。哺乳動物における異常細胞の成長の進行を阻害する、または逆転させるための方法であって、化合物１またはその薬学的に許容される塩を投与することを含み、前記異常細胞の成長がＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴによって媒介される癌である、方法。
【0244】
実施形態１６。癌が、肺腺癌である、実施形態１５に記載の方法。１７。肺腺癌が、非小細胞肺癌である、実施形態１５に記載の方法。
【0245】
実施形態１８。肺腺癌が、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性の非小細胞肺癌である、実施形態１５に記載の方法。
【0246】
実施形態１９。化合物１またはその薬学的に許容される塩が、化合物１またはその薬学的に許容される塩および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物として投与される、実施形態１８に記載の方法。
【0247】
実施形態２０。化合物１またはその薬学的に許容される塩が、化合物１またはその薬学的に許容される塩および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物として投与され、薬学的組成物が３ヶ月超の間、毎日投与される、実施形態１８に記載の方法。
【0248】
実施形態２１。化合物１またはその薬学的に許容される塩が、化合物１またはその薬学的に許容される塩および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物として投与され、薬学的組成物が５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５ｍｇ／日の投薬量で投与される、実施形態１８に記載の方法。
【0249】
実施形態２２。ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性の非小細胞肺癌の検出が、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、またはＳＩＳＨアッセイを用いて行われる、実施形態１８に記載の方法。
【0250】
実施形態２３。ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性の非小細胞肺癌の検出が、任意の形態のゲノムＰＣＲ、直接配列決定、ＰＣＲ配列決定、ＲＴ−ＰＣＲ、または同様のアッセイを用いて行われる、実施形態１８に記載の方法。
【0251】
実施形態２４。患者を診断および治療する方法であって、前記患者がＮＳＣＬＣ腫瘍を有しており、その腫瘍が、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性のＮＳＣＬＣとして特定され、治療が、化合物１を含む式Ｉの化合物のうちのいずれか、またはその薬学的に許容される塩および少なくとも１つの薬学的に許容される担体の投与を含む、方法。
【0252】
実施形態２５。ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性の非小細胞肺癌である肺腺癌の治療を、そのような治療を必要とする患者において行うための方法であって、前記患者に、有効量の化合物１：【0253】
実施形態２６。有効量の式Ｉ、Ｉａ、および１の化合物が、腫瘍の大きさの減少、転移の減少、完全寛解、部分寛解、安定した疾患、全奏功率の増加、病理学的完全奏功からなる群から選択される少なくとも１つの治療効果をもたらす、実施形態１〜２５に記載の方法。
【0254】
生物学的実施例化合物１は、インビトロでＲＥＴの強力な阻害剤である
化合物１は、２７０ヒトキナーゼのタンパク質キナーゼパネルに対してプロファイルしたときに、ＭＥＴ（ＩＣ５０＝１．３ｎｍｏｌ／Ｌ）およびＶＥＧＦＲ２（ＩＣ５０＝０．０３５ｎｍｏｌ／Ｌ）のＡＴＰ競合的阻害剤であることを既に示している。Ｙａｋｅｓ，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ｄｅｃ；１０（１２）：２２９８−３０８を参照のこと。化合物１はまた、５．２ｎｍｏｌ／Ｌの生物学的ＩＣ５０値を有するＲＥＴの強力な阻害剤である。遺伝性および散発性甲状腺髄様癌と関連することが知られている、ＲＥＴを活性化するキナーゼドメイン突然変異体Ｍ９１８ＴおよびＹ７９１Ｆもまた、それぞれ、２７および１１７３ｎｍｏｌ／ＬのＩＣ５０値を有する化合物１によって阻害された。さらに、化合物１は、ＲＥＴ阻害剤に対して耐性を示すことが知られているＲＥＴ突然変異体Ｖ８０４Ｌ（ＩＣ５０＞５０００ｎｍｏｌ／Ｌ）に対して活性ではなかった。細胞アッセイにおいて、化合物１は、ＴＴ細胞においてＲＥＴの自己リン酸化を阻害し、カルシトニンを発現するヒト甲状腺髄様癌細胞株は、ＲＥＴの活性化するＣ６３４Ｗ突然変異体を内部に有し、８５ｎｍｏｌ／ＬのＩＣ５０値を有した。１０％の血清中で７２時間（３日間）成長させたＴＴ細胞の成長における化合物１の効果もまた、調査された。化合物１の処置により、増殖の用量依存性阻害をもたらし、９４ｎｍｏｌ／ＬのＩＣ５０値を有した。
【0255】
生物学的実施例化合物１は、インビボでＲＥＴのリガンド非依存的なリン酸化反応を阻害する
ＴＴの腫瘍を担持する動物に、化合物１の漸増する単一用量または水ビヒクルを投与し、腫瘍を、投与から４時間後に回収した。リン酸化反応のレベルおよび全ＲＥＴおよびは、ウエスタンブロット分析によってプールした溶解物において決定された。別個の試験において、ＴＴの腫瘍を担持するマウスに、カボザンチニブ（１００ｍｇ／ｋｇ）または水ビヒクルの単一経口用量を投与し、腫瘍溶解物中のリン酸化反応のレベルおよび全ＲＥＴ、ＡＫＴ、およびＥＲＫを、投与後の指示された時点で決定した。ＲＥＴのリン酸化反応の阻害の持続時間対カボザンチニブの血漿濃度の濃度定量。代表的なウエスタンブロット画像を示す。
【0256】
化合物１の漸増する単一経口用量の投与により、図１Ａに示されるように、ＴＴ異種移植片腫瘍における低下したＲＥＴタンパク質レベルの不在下でＲＥＴのリン酸化反応の用量依存性阻害をもたらした。この結果は、ｓｉＲＮＡによるＲＥＴおよびＲＥＴノックダウンに対して感受性を示す薬理学的阻害剤への複数の甲状腺髄様癌細胞株の感受性を示すデータと一致する。用量応答の関係に基づいて、この異種移植片腫瘍においてＲＥＴのリン酸化反応の５０％の阻害（ＩＣ５０）をもたらすと予測された血漿濃度は、約７μｍｏｌ／Ｌである。その後の試験において、図１Ｂに示されるように、１００ｍｇ／ｋｇの単一経口用量により、ＴＴ異種移植片腫瘍において投与から４〜２４時間後にＲＥＴのリン酸化反応の阻害をもたらした。図１Ｃに示されるように、ＲＥＴのリン酸化反応が処置から４８時間後までに基礎レベルに戻ったため、この効果は、可逆であった。加えて、化合物１は、投与から４〜２４時間後に、ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化反応レベルを低下させ、これは、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫ経路のＲＥＴ媒介性活性化の阻害と一致する。化合物１の血漿濃度は、それぞれ、ＲＥＴ（１５μｍｏｌ／Ｌ）、ＡＫＴおよびＥＲＫ（４２μｍｏｌ／Ｌ）の最大かつ持続した阻害と関連した。
【0257】
生物学的実施例化合物１は、ＴＴの腫瘍の成長を阻害する
ＴＴ異種移植片腫瘍の成長を阻害する化合物１の能力を、指数関数的腫瘍の成長に対応する期間にわたりｎｕ／ｎｕマウスにおいて評価した。ＴＴ腫瘍を担持するＮｕ／ｎｕマウスに、水ビヒクル（□）、または３ｍｇ／ｋｇ（▽）、１０ｍｇ／ｋｇ（○）、３０ｍｇ／ｋｇ（◆）、または６０ｍｇ／ｋｇ（◇）でカボザンチニブを２１日間、１日１回経口投与した。腫瘍の重量を週に２回判定した。データ点は、それぞれの処置群に対する平均腫瘍重量（ミリグラム単位）および標準誤差を表す。循環カルシトニンレベルは、最終の指示された用量後に回収された全血からの血清調製物において決定した（＊は、ビヒクルで処置された対照動物からの血清試料と比較したときの循環カルシトニンの有意なＰ＜０．０５の低下を示す）。
【0258】
図２Ａに示されるように、化合物１は、血清のカルシトニンの低下と相関するＴＴ異種移植片の腫瘍の成長を阻害し、用量依存性阻害が、１０および３０ｍｇ／ｋｇの用量に対して達成された。さらに、安定した疾患が、３，０００〜４５，０００ｎｍｏｌ／Ｌのピーク循環血漿濃度を伴った３０および６０ｍｇ／ｋｇの用量で観察された。化合物１の亜慢性投与は、投薬期間を通して収集された安定した体重によって判定されるように、良好な耐容性を示した。ＴＴ異種移植片腫瘍は腫瘍サイズと相関する豊富な量のヒトカルシトニンを分泌することが知られていることから、循環カルシトニンの血漿濃度を、投薬期間の終了時に決定した。図２Ｂに示されるように、ビヒクルで処置した対照動物からの血漿は高レベルの循環カルシトニンを示し、循環カルシトニンは、３０および６０ｍｇ／ｋｇの両方の用量で、ビヒクル対照動物と比較したときに著しく低下した（７５％、Ｐ＜０．００５）。さらに、循環血漿カルシトニンのこの低下は、上記のＴＴ腫瘍の成長の阻害と相関した。腫瘍の免疫組織化学分析は、低下したレベルの総タンパク質がない場合は、図２Ｃに示されるように、リン酸化したＲＥＴおよびＭＥＴのレベルの有意かつ用量依存的な減少を示した。さらに、化合物１での処置はまた、生存腫瘍組織中のＫｉ６７およびＣＤ３１の用量依存的抑制をもたらし、表１に要約されるように、細胞増殖および血管分布のマーカーにおける負の影響を示す。【0259】
事例研究以前喫煙者であった５１歳の日本人女性は、右胸膜滲出の評価について２００９年４月に検査した。胸部のコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンは、右中間葉の腫瘤および右胸膜滲出を示した。胸膜滲出の細胞学的検査は、腺癌を示し、ＥＧＦＲは、高分解能融解分析を使用して野生型であると判定された。全身精密検査では、遠隔転移の証拠を示さなかった。また、ＣＴスキャン上では首および甲状腺のいずれにも腫瘍はなかった。この患者は、肺腺癌のＩＩＩＢ期（ｃＴ４Ｎ０Ｍ０，６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）を有すると診断された。この患者は、４サイクルのシスプラチンおよびゲムシタビンにより治療され、原発腫瘍が部分応答を示した。しかしながら、原発腫瘍の再成長が療法の終了から８カ月後に報告された。その後、この患者は、第二次治療として１３サイクルのドセタキセル、および第三次治療として２サイクルの治験用薬物（抗ＨＥＲ２［ヒト上皮成長因子受容体２型］抗体）を受容した。２０１１年５月、化合物１の単剤療法の第一相試験に参加することに同意し、１日１回、４０ｍｇの開始用量でカボザンチニブを受容した。Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｎｏｋｉｈａｒａ，Ｈ．，Ｗａｋｕｉ，Ｈ．，Ｙａｍａｄａ，Ｙ．，Ｆｒｙｅ，Ｊ．，ＤｅＣｉｌｌｉｓ，Ａ．，ａｎｄ Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．Ａ ｐｈａｓｅ １ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｓｃｅｎｄｉｎｇ ｄｏｓｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ（ＸＬ１８４）ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１１ １０ ｓｕｐｐｌ １（ａｂｓｔｒ Ｃ２６）およびＮｏｋｉｈａｒａ，Ｈ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｎａｋａｍｉｃｈｉ，Ｓ．，Ｗａｋｕｉ，Ｈ．，Ｙａｍａｄａ，Ｙ．，Ｆｒｙｅ，Ｊ．，Ｄｅｃｉｌｌｉｓ，Ａ．，ａｎｄ Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｉｎ Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ９，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １７，２０１２．
【0260】
９週目の胸部ＣＴスキャンは、原発肺腫瘍の部分応答（４０．１％の腫瘍の減少）を示し（図３）、その後、１７週目で確認した。１０サイクル（ヶ月）のカボザンチニブ療法中、血清リパーゼがグレード３であるため、薬物中断を行い、腹部超音波検査における膵炎または異常所見の臨床症状もなかった。患者は、進行性疾患のため、２０１２年２月、カボザンチニブ単剤療法を終了した。
【0261】
ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合の検出この患者においては、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合の存在を、処理前および処理後の試料を使用して回顧的に評価した。ゲノムＤＮＡを、治療前の試料として胸膜滲出細胞から抽出し、ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡを、治療後の試料として進行時に胸膜滲出細胞から抽出した。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ゲノムＤＮＡを単離した。ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、製造業者の取扱説明書に従って全ＲＮＡの抽出のために使用し、モデル２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、質の検定を行った。この試料は、６．０超のＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒを示した。
【0262】
全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡ（１０ｎｇの全ＲＮＡに対応する）または１０ｎｇのゲノムＤＮＡをＫＡＰＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅に供した。反応を、以下の条件下で、サーマルサイクラー内で行った：９５℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、および７２℃で１分間（逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲについては）または３分間（ゲノムＰＣＲについては）を４０サイクル、７２℃で１０分間最終伸長反応。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードする遺伝子を増幅して、ｃＤＮＡ合成の効率を評価した。ＰＣＲ産物を、ＢｉｇＤｙｅ ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒキットおよびＡＢＩ ３１３０ｘｌ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、両方向に直接配列決定した。この試験は、国立癌センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の施設内治験審査委員会によって承認された。本試験で使用したＰＣＲプライマーを表２に示す。【0263】
ＫＩＦ５Ｂ（イントロン１５）およびＲＥＴ（イントロン１１）遺伝子の融合が、図４Ａに示されるように、処理前および処理後の両方の試料中のゲノムＤＮＡに検出された。図４は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴゲノムＰＣＲならびに処理前および処理後の腫瘍試料からのＳａｎｇｅｒシーケンシングを示す。ＲＴ−ＰＣＲ産物のＳａｎｇｅｒ配列決定は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ ＲＴ−ＰＣＲおよび治療後の腫瘍試料からのＳａｎｇｅｒ配列決定を示す図４Ｂに示されるように、腫瘍細胞において、最も一般的な種類のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合転写産物である、変異体１の転写産物（ＫＩＦ５Ｂエクソン１５；ＲＥＴエクソン１２）の発現を確認した。ＢＲ００２０（ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ変異体１融合陽性）およびＢＲ２００１（ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陰性）を、陽性および陰性対照として使用した。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）の転写産物を増幅して、ｃＤＮＡの量および質を評価した。Ｔ，Ｉｃｈｉｋａｗａ Ｈ，Ｔｏｔｏｋｉ Ｙ，Ｙａｓｕｄａ Ｋ，Ｈｉｒａｍｏｔｏ Ｍ，Ｎａｍｍｏ Ｔ，Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｈ，Ｔｓｕｔａ Ｋ，Ｆｕｒｕｔａ Ｋ，Ｓｈｉｍａｄａ Ｙ，Ｉｗａｋａｗａ Ｒ，Ｏｇｉｗａｒａ Ｈ，Ｏｉｋｅ Ｔ，Ｅｎａｒｉ Ｍ，Ｓｃｈｅｔｔｅｒ ＡＪ，Ｏｋａｙａｍａ Ｈ，Ｈａｕｇｅｎ Ａ，Ｓｋａｕｇ Ｖ，Ｃｈｉｋｕ Ｓ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｉ，Ａｒａｉ Ｙ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｓ，Ｓｅｋｉｎｅ Ｉ，Ｏｇａｗａ Ｓ，Ｈａｒｒｉｓ ＣＣ，Ｔｓｕｄａ Ｈ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ，Ｙｏｋｏｔａ Ｊ，Ｓｈｉｂａｔａ Ｔ．ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１２ Ｆｅｂ １２；１８（３）：３７５−７．Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｋ，Ｓｏｄａ Ｍ，Ｔｏｇａｓｈｉ Ｙ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｒ，Ｓａｋａｔａ Ｓ，Ｈａｔａｎｏ Ｓ，Ａｓａｋａ Ｒ，Ｈａｍａｎａｋａ Ｗ，Ｎｉｎｏｍｉｙａ Ｈ，Ｕｅｈａｒａ Ｈ，Ｌｉｍ Ｃｈｏｉ Ｙ，Ｓａｔｏｈ Ｙ，Ｏｋｕｍｕｒａ Ｓ，Ｎａｋａｇａｗａ Ｋ，Ｍａｎｏ Ｈ，Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｙ．ＲＥＴ，ＲＯＳ１ ａｎｄ ＡＬＫ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１２ Ｆｅｂ １２；１８（３）：３７８−８１．Ｌｉｐｓｏｎ Ｄ，Ｃａｐｅｌｌｅｔｔｉ Ｍ，Ｙｅｌｅｎｓｋｙ Ｒ，Ｏｔｔｏ Ｇ，Ｐａｒｋｅｒ Ａ，Ｊａｒｏｓｚ Ｍ，Ｃｕｒｒａｎ ＪＡ，Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ｓ，Ｂｌｏｏｍ Ｔ，Ｂｒｅｎｎａｎ ＫＷ，Ｄｏｎａｈｕｅ Ａ，Ｄｏｗｎｉｎｇ ＳＲ，Ｆｒａｍｐｔｏｎ ＧＭ，Ｇａｒｃｉａ Ｌ，Ｊｕｈｎ Ｆ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＫＣ，Ｗｈｉｔｅ Ｅ，Ｗｈｉｔｅ Ｊ，Ｚｗｉｒｋｏ Ｚ，Ｐｅｒｅｔｚ Ｔ，Ｎｅｃｈｕｓｈｔａｎ Ｈ，Ｓｏｕｓｓａｎ−Ｇｕｔｍａｎ Ｌ，Ｋｉｍ Ｊ，Ｓａｓａｋｉ Ｈ，Ｋｉｍ ＨＲ，Ｐａｒｋ ＳＩ，Ｅｒｃａｎ Ｄ，Ｓｈｅｅｈａｎ ＣＥ，Ｒｏｓｓ ＪＳ，Ｃｒｏｎｉｎ ＭＴ，Ｊaｎｎｅ ＰＡ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＰＪ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ＡＬＫ ａｎｄ ＲＥＴ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｐｓｉｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１２ Ｆｅｂ １２；１８（３）：３８２−４．処理前の胸膜滲出試料由来の細胞学的材料を、ｂｒｅａｋ−ａｐａｒｔＲＥＴプローブセット（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏ Ｉｎｃ，Ｓａｐｐｏｒｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析に供し、ＲＥＴ転座でのｂｒｅａｋ−ａｐａｒｔＦＩＳＨを示す図４Ｃに示されるように、ＲＥＴ遺伝子の隣接した５′セントロメア（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎで標識したＲＰ１１−３７９Ｄ２０）および３′テロメア（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄで標識したＲＰ１１−８７５Ａ４）の配列でハイブリダイズする。腫瘍細胞は、融合シグナル（元の倍率、１００×）に加えて、分離（５′緑色および３′橙色）シグナルを示す。５′および３′プローブによって画定された分離シグナルは、シグナルサイズが腫瘍細胞中で観察された１倍超の距離で観察された。したがって、腫瘍は、ＲＥＴ遺伝子の再配置を有すると判断され、これは上記のＰＣＲの結果と一致した。
【0264】
これは、ＲＥＴ ＴＫＩがＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性のＮＳＣＬＣに罹患している患者において著しい抗腫瘍活性を示した、最初の報告された症例である。これまでに、インビトロ研究では、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴにより媒介された成長およびシグナル伝達の特性が、バンデタニブ、スニチニブ、またはソラフェニブ等のＴＫＩによる処理後に低下したことを示している。しかしながら、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性のＮＳＣＬＣに罹患している患者がこれらの薬物に応答したという報告はなかった。報告では、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を内部に有する進行性ＮＳＣＬＣに罹患している患者が治療上のＲＥＴ阻害に対して非常に敏感であり得ることを示唆している。
【0265】
ＮＳＣＬＣ患者の約２％がＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を内部に有することを特定した。ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性のＮＳＣＬＣは、すべての肺癌の小さなサブセットのみを成すが、肺癌は、一般的な疾患であり、肺癌患者の数は毎年増加しており、そのため、このサブセットは、世界中の相当数の患者を意味する。したがって、筆者は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性のＮＳＣＬＣを特定するための系統的スクリーニング方法の開発を推奨する。ＮＳＣＬＣにおけるＥＭＬ４−ＡＬＫ再配置の発見は、２００７年に公開され、この疾患に対してクリゾチニブが米国食品医薬品局により２０１１年に承認され、２０１２年に日本で承認された。Ｓｏｄａ Ｍ，Ｃｈｏｉ ＹＬ，Ｅｎｏｍｏｔｏ Ｍ，Ｔａｋａｄａ Ｓ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｙ，Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｓ，Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｓ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｈ，Ｋｕｒａｓｈｉｎａ Ｋ，Ｈａｔａｎａｋａ Ｈ，Ｂａｎｄｏ Ｍ，Ｏｈｎｏ Ｓ，Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｙ，Ａｂｕｒａｔａｎｉ Ｈ，Ｎｉｋｉ Ｔ，Ｓｏｈａｒａ Ｙ，Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｙ，Ｍａｎｏ Ｈ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ＥＭＬ４−ＡＬＫ ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ．２００７ Ａｕｇ ２；４４８（７１５３）：５６１−６．このＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ陽性の患者は、化合物１に対して著しい臨床応答を有し、この所見は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合がＮＳＣＬＣにおいてドライバー癌遺伝子であり、有望な治療標的であることを示唆している。
【0266】
化合物１は、腫瘍病理生理において関与するとされているキナーゼのＲＥＴに対するＴＫの強力な阻害剤である。例えば、Ｙａｋｅｓは、化合物１が５．２±４．３ｎＭｏｌ／ＬのＩＣ５０でＲＥＴの強力な阻害を示すことを開示する。Ｙａｋｅｓ ＦＭ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｔａｎ Ｊ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｋ，Ｓｈｉ Ｙ，Ｙｕ Ｐ，Ｑｉａｎ Ｆ，Ｃｈｕ Ｆ，Ｂｅｎｔｚｉｅｎ Ｆ，Ｃａｎｃｉｌｌａ Ｂ，Ｏｒｆ Ｊ，Ｙｏｕ Ａ，Ｌａｉｒｄ ＡＤ，Ｅｎｇｓｔ Ｓ，Ｌｅｅ Ｌ，Ｌｅｓｃｈ Ｊ，Ｃｈｏｕ ＹＣ，Ｊｏｌｙ ＡＨ．Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ（ＸＬ１８４），ａ ｎｏｖｅｌ ＭＥＴ ａｎｄ ＶＥＧＦＲ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ｄｅｃ；１０（１２）：２２９８−３０８．ＲＥＴの活性化突然変異体は、甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）の腫瘍形成に重要な役割を果たす。Ｓｅｎｎｉｎｏ Ｂ，Ｎａｙｌｏｒ ＲＭ，Ｔａｂｒｕｙｎ ＳＰ，Ｙｏｕ ＷＫ，Ａｆｔａｂ ＤＴ，ＭｃＤｏｎａｌｄ ＤＭ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ＲＩＰ−Ｔａｇ２ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＶＥＧＦＲ ｐｌｕｓ ｃ−Ｍｅｔ ｂｙ ＸＬ１８４．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００９ ８ ｓｕｐｐｌ １（ａｂｓｔｒ Ａ１３）．カボザンチニブの第一相の用量漸増研究では、ＭＴＣに罹患している３７人の患者のうちの２５人（６８％）が、６ヶ月以上の間、部分応答または安定した疾患を確認した。Ｋｕｒｚｒｏｃｋ Ｒ，Ｓｈｅｒｍａｎ ＳＩ，Ｂａｌｌ ＤＷ，Ｆｏｒａｓｔｉｅｒｅ ＡＡ，Ｃｏｈｅｎ ＲＢ，Ｍｅｈｒａ Ｒ，Ｐｆｉｓｔｅｒ ＤＧ，Ｃｏｈｅｎ ＥＥ，Ｊａｎｉｓｃｈ Ｌ，Ｎａｕｌｉｎｇ Ｆ，Ｈｏｎｇ ＤＳ，Ｎｇ ＣＳ，Ｙｅ Ｌ，Ｇａｇｅｌ ＲＦ，Ｆｒｙｅ Ｊ，Ｍuｌｌｅｒ Ｔ，Ｒａｔａｉｎ ＭＪ，Ｓａｌｇｉａ Ｒ．Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＸＬ１８４（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ），ａｎ ｏｒａｌ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１１ Ｊｕｌ １；２９（１９）：２６６０−６．この試験では、腫瘍退縮が周知のＲＥＴ突然変異体を有する患者および有しない患者において観察され、このことは、一部の応答がＭＥＴおよび／もしくはＶＥＧＦＲ２等のＲＥＴ以外の標的の阻害によって、またはＲＥＴ経路におけるまだ知られていない異常によって生じたことを示唆した。
【0267】
要約すれば、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を有する我々が試験したＮＳＣＬＣ患者は、カボザンチニブへの臨床応答を有し、カボザンチニブがＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を内部に有する進行性ＮＳＣＬＣに罹患している患者において活性であり得ることを示す。ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性のＮＳＣＬＣに対するＲＥＴ−ＴＫＩの緊急の臨床評価が必要とされる。
【0268】
他の実施形態前述の開示は、明瞭さと理解のために、例証と実施例を用いて、ある程度詳細に記載さた。本発明は、様々な特定かつ好ましい実施形態および技術を参照して記載された。しかしながら、本発明の精神および範囲内でありながら、多くの変更および修正が行われ得ることが理解されるべきである。添付の特許請求の範囲内で、変更および修正を行うことができることは当業者には明らかであろう。したがって、上記の説明は、限定的ではなく例示的であることを意図すると理解されるべきである。
【0269】
したがって、本発明の範囲は、上記の記述を参照して決定されるべきではなく、むしろ、以下の添付の請求項の範囲の参照、およびそのような請求項の範囲が権利を与えられる同等物の範囲全体によって決定されるべきである。
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]