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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6519056
(24)【登録日】2019年5月10日
(45)【発行日】2019年5月29日
(54)【発明の名称】膵腫瘍の検出方法、抗体及び膵腫瘍検出用キット
(51)【国際特許分類】
G01N 33/574 20060101AFI20190520BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20190520BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20190520BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20190520BHJP
【ＦＩ】
G01N33/574 A
G01N33/48 Z
C07K16/18ZNA
!C12P21/08
【請求項の数】13
【全頁数】42
(21)【出願番号】特願2015-540500(P2015-540500)
(86)(22)【出願日】2014年9月30日
(86)【国際出願番号】JP2014076035
(87)【国際公開番号】WO2015050107
(87)【国際公開日】20150409
【審査請求日】2017年9月19日
(31)【優先権主張番号】特願2013-206682(P2013-206682)
(32)【優先日】2013年10月1日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2014-166188(P2014-166188)
(32)【優先日】2014年8月18日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000003159
【氏名又は名称】東レ株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】510097747
【氏名又は名称】国立研究開発法人国立がん研究センター
(74)【代理人】
【識別番号】100091096
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100118773
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 節
(74)【代理人】
【識別番号】100180954
【弁理士】
【氏名又は名称】漆山 誠一
(72)【発明者】
【氏名】真田 光彰
(72)【発明者】
【氏名】小林 道元
(72)【発明者】
【氏名】高山 愛子
(72)【発明者】
【氏名】笹島 義志
(72)【発明者】
【氏名】鄭 基晩
(72)【発明者】
【氏名】山田 哲司
(72)【発明者】
【氏名】本田 一文
【審査官】
赤坂 祐樹
(56)【参考文献】
【文献】
特表２０１０−５３３８５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１０−１７５４５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００８−５２７３５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００９−１０３６８１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００４−３３３２７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
HONDA, K et al.，Altered plasma apolipoprotein modifications in patients with pancreatic cancer: protein characterization and multi-institutional validation，PLoS One，２０１２年１０月 ８日，7(10)，e46908
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験体の体液試料中におけるＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの量を測定して膵臓癌又は膵良性腫瘍を検出する方法であって、
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体と、該Ｃ末端領域以外のアミノ酸配列と結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ非末端抗体とを用いて、試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量を測定する第１の工程、
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体と、該Ｃ末端領域以外のアミノ酸配列と結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ非末端抗体とを用いて、試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量を測定する第２の工程、
（Ｃ）第１の工程で得たＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量の測定値と第２の工程で得たＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量の測定値とを予め設定したロジスティック回帰式に入力して得た被験体の判別値が、健常体の判別値と比較して統計学的に有意に差があるときに被験体が膵臓癌又は膵良性腫瘍に罹患していると決定する第３の工程、
を含む膵臓癌又は膵良性腫瘍の検出方法。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体と、該Ｃ末端領域以外のアミノ酸配列と結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ非末端抗体とを用いて、試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量を測定する第１の工程、
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体と、該Ｃ末端領域以外のアミノ酸配列と結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ非末端抗体とを用いて、試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量を測定する第２の工程、
（Ｃ）第１の工程で得たＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量の測定値と第２の工程で得たＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量の測定値とを予め設定したロジスティック回帰式に入力して得た被験体の判別値が、健常体の判別値と比較して統計学的に有意に差があるときに被験体が膵臓癌又は膵良性腫瘍に罹患していると決定する第３の工程、
を含む膵臓癌又は膵良性腫瘍の検出方法。
【請求項2】
ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質及びＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の前記Ｃ末端領域が、それぞれＣ末端を含む６以上の連続したアミノ酸を含む配列からなる、請求項１に記載の検出方法。
【請求項3】
前記ロジスティック回帰式が、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の前記測定値、及び／又はＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の前記測定値、及び／又はＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の前記測定値とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の前記測定値の積を変数として含む、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項4】
前記ロジスティック回帰式から得た被験体の判別値が、健常体の判別値の３分の２以下である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記第３の工程において、膵臓癌又は膵良性腫瘍に罹患していると決定された被験体について、当該被験体の体液試料中における膵臓癌マーカーＣＡ１９−９又はＤＵ−ＰＡＮ−２の量を測定し、その測定値が、所定の基準値を超える場合には、その被験体は膵臓癌に罹患していると決定し、当該基準値以下である場合には、その被験体は膵良性腫瘍に罹患していると決定する第４の工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項6】
前記体液試料が、血液、血漿又は血清である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項7】
前記膵臓癌が早期膵臓癌である請求項１〜６のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項8】
被験体試料中のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント量を測定するための組み合わせ抗体であって、
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体又はその断片、
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体又はその断片、及び
配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域以外のアミノ酸配列を認識する抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体又はその断片
を含む前記組み合わせ抗体。
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体又はその断片、
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体又はその断片、及び
配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域以外のアミノ酸配列を認識する抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体又はその断片
を含む前記組み合わせ抗体。
【請求項9】
前記抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体は、
重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４、５及び６で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号７、８及び９で示されるアミノ酸配列からなる、
モノクローナル抗体である、請求項８に記載の組み合わせ抗体。
重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４、５及び６で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号７、８及び９で示されるアミノ酸配列からなる、
モノクローナル抗体である、請求項８に記載の組み合わせ抗体。
【請求項10】
前記抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体は、
重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１及び１２で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１３、１４及び１５で示されるアミノ酸配列からなる、
モノクローナル抗体である、請求項８に記載の組み合わせ抗体。
重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１及び１２で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１３、１４及び１５で示されるアミノ酸配列からなる、
モノクローナル抗体である、請求項８に記載の組み合わせ抗体。
【請求項11】
前記抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体は、
重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１６、１７及び１８で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１９、２０及び２１で示されるアミノ酸配列からなる、
モノクローナル抗体である、請求項８に記載の組み合わせ抗体。
重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１６、１７及び１８で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１９、２０及び２１で示されるアミノ酸配列からなる、
モノクローナル抗体である、請求項８に記載の組み合わせ抗体。
【請求項12】
前記抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体は、
重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２２、２３及び２４で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２５、２６及び２７で示されるアミノ酸配列からなる、
モノクローナル抗体である、請求項８に記載の組み合わせ抗体。
重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２２、２３及び２４で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２５、２６及び２７で示されるアミノ酸配列からなる、
モノクローナル抗体である、請求項８に記載の組み合わせ抗体。
【請求項13】
請求項８〜１２に記載の組み合わせ抗体を１組以上含む、膵臓癌又は膵良性腫瘍の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＡＰＯＡ２タンパク質に特異的に結合する抗体（抗ＡＰＯＡ２抗体）を用いて被験体試料中のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの量を測定することを含む膵腫瘍、すなわち膵臓癌又は膵良性腫瘍を検出する方法、当該方法に用いる抗ＡＰＯＡ２抗体及び当該抗体を含む膵臓癌又は膵良性腫瘍検出用キットに関する。【背景技術】
【0002】
２０１２年の統計によると、日本における主要な死亡原因の第１位は癌である。癌は、正常な組織から発生し、癌細胞の異常増殖に起因する腫瘍塊の形成、腫瘍塊形成癌細胞による隣接組織への浸潤、及び血管やリンパ管を介しての多種臓器への遠隔転移を特徴とする。このような癌の発症と進展の際には、血液や尿など患者の体液中で様々なタンパク質の濃度が変動することが知られており、そのようなタンパク質は腫瘍マーカー（癌検出用マーカー）と呼ばれ、癌の早期発見や治療後の経過観察等の各種診断用途への応用が期待されている（例えば、特許文献１〜３）。しかし、臨床診断に用いられている従来の腫瘍マーカーは、その多くが陽性率５０〜７０％程度であり、特に早期癌においては、ほとんどの腫瘍マーカーが偽陰性を示すという問題があった。隣接組織への浸潤や遠隔転移を特徴とする進行癌や末期癌では、予後が不良となることから、癌の効果的な治療には早期発見が重要である。それ故に早期癌の検出が可能な、感度に優れた腫瘍マーカーの発見が期待されている。【0003】
膵腫瘍は、膵臓において形成される全ての腫瘍を指し、悪性腫瘍である膵臓癌と、良性腫瘍である膵良性腫瘍に分類される。【0004】
膵臓癌は、数ある癌の中でも難治性癌の一種として知られており、外科的手術以外の有効な治療法は確立されていないため、早期発見や未然にその発症を防ぐ事が特に重要となる。膵臓癌の診断方法としては、血清腫瘍マーカー、ヘリカルＣＴ、磁気共鳴装置（ＭＲＩ）、内視鏡的超音波検査法（ＥＵＳ）などが用いられている（非特許文献１）。しかしながら、膵臓癌は、早期の段階において症状に乏しく、多くの場合、既に進行癌となって発見されるため、一般的に治療は困難である。したがって、膵臓癌を、的確かつ簡易に発見することが可能な新たな診断技術の開発が望まれている。【0005】
一方、膵良性腫瘍は、膵臓癌の前段階の病態であって、膵臓癌発症への関与が示唆されている。ただし、膵良性腫瘍は、膵臓癌と比べて予後が良く、外科的手術で摘出することで膵臓癌の発症防止につながると期待されている。それゆえに、膵良性腫瘍も、その早期発見が重要と考えられている。【0006】
ＡＰＯＡ２（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２、又はＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−ＩＩ）タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＰ＿００１６３４．１）は、血漿リポタンパク質を構成するアポリポタンパク質ファミリーの一種である。アポリポタンパク質は、これまでに１０種以上が知られており、それらの主な機能は、リポタンパク質の構造の安定化、リポタンパク質代謝に関与する酵素の活性化、細胞表面に存在するリポタンパク質受容体に対するリガンドとしての作用などである。ＡＰＯＡ２タンパク質は、肝臓組織においてシグナルペプチドを含む１００アミノ酸の前駆体として合成され、血液中に存在する成熟型は、７７アミノ酸からなる。成熟型ＡＰＯＡ２タンパク質は、そのアミノ末端（Ｎ末端）にグルタミン残基（Ｑ）、Ｎ末端から７６番目にスレオニン残基（Ｔ）、その７７番目のＣ末端にグルタミン残基（Ｑ）を有している、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）を構成するアポリポタンパク質の一つである。また、ＡＰＯＡ２タンパク質には、完全長ＡＰＯＡ２タンパク質であるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質、Ｃ末端のグルタミン残基（Ｑ）を欠失したＡＰＯＡ２タンパク質であるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質、Ｃ末端のスレオニン・グルタミン残基（ＴＱ）を欠失したＡＰＯＡ２タンパク質であるＡＰＯＡ２−Ａタンパク質等の質量の異なるバリアントが存在することが報告されている（非特許文献２）。【0007】
タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）に登録されているＡＰＯＡ２タンパク質の立体構造データ（ＰＤＢ IＤ：１Ｌ６Ｌ）に基づく解析によれば、ＡＰＯＡ２タンパク質は、Ｎ末端側のシステイン残基を介したジスルフィド結合（ＳＳ結合）により二量体を形成するとされている。したがって、ＡＰＯＡ２タンパク質は、血液中で、前記３種のバリアントの組み合わせから生じる様々な分子量の二量体として存在することが分かっている。具体的には、完全長のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質からなる二量体（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴＱタンパク質二量体）、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の二量体（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴタンパク質二量体）、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質からなる二量体（ＡＰＯＡ２−ＡＴ／ＡＴタンパク質二量体）、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質とＡＰＯＡ２−Ａタンパク質の二量体（ＡＰＯＡ２−ＡＴ／Ａタンパク質二量体）、ＡＰＯＡ２−Ａタンパク質からなる二量体（ＡＰＯＡ２−Ａ／Ａタンパク質二量体）等が知られている。また、この他にも、ＡＰＯＡ２タンパク質は、ジスルフィド結合によりＡＰＯＤタンパク質、ＡＰＯＥタンパク質、ＡＰＯＡ１−Ｍタンパク質といった他のタンパク質と二量体を形成することや、単量体として存在することが知られている（非特許文献３、４）。【0008】
上記各種ＡＰＯＡ２タンパク質二量体は、健常者と比較すると膵臓癌患者の血中で量的変動を示すことが知られている。特にＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴタンパク質二量体は、質量分析の結果、分子量１７２５３±９（ｍ／ｚ）の質量値を有するタンパク質として見出され、健常者と比べて膵臓癌患者において有意に減少することや、本タンパク質二量体を膵臓癌マーカーとして利用することで、ＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ：曲線下面積）値が０．８５以上の高い精度で膵臓癌を検出できることが明らかとなっている（特許文献４、５、非特許文献５）。【0009】
しかし、前記ＡＵＣ値の判別精度を達成するためには、質量分析器による測定を含む３つの煩雑な工程が必要となる。例えば、最初の工程では、質量分析で用いる血液試料を、９Ｍ Ｕｒｅａ、２％ＣＨＡＰＳを用いた前処理を行う。しかし、Ｕｒｅａは分解しやすく、長期間の保存には向かないため、前処理条件を揃えるためには測定毎にＵｒｅａを含む溶液を調製する必要がある。また、次の工程では、前処理した試料を、プロテインチップ（サイファージェンバイオシステム社製）の表面に捕捉させる。この捕捉工程では、プロテインチップ表面の荷電状態や疎水性等の特性を利用した吸着を行うため、洗浄条件や試薬の調製条件が捕捉効率に大きな影響を与えることが知られている。最後の工程では、質量分析器による捕捉試料の測定を行う。質量分析器は、レーザー強度の調整等の操作に熟練が求められ、また検体を取り扱う上でのスループットが低い。さらに、試料中に多くの異なるタンパク質が含まれる場合、各タンパク質から得られるシグナル同士が干渉し合うため、シグナルの帰属が困難となる。加えて、定量性にも課題が残るため、高精度な測定を必要とする診断用途には不向きである。それゆえに、実用化への障壁が高いという問題があった。【0010】
ＥＬＩＳＡ法は、質量分析法と比較して、多数の試料を評価する上でスループットが高く、安価で実用的な方法として知られている。また、ＥＬＩＳＡ法は、汎用的手法であるために操作に熟練を必要とせず、その上、２種の抗体を用いるため特異性が高く、標準物質を用いた再現性の良い定量が可能である。そのため、試料中に様々な分子量で存在するＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの網羅的かつ定量性の高い解析が可能となる。【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】特開２００１−２８９８６１号公報
【特許文献2】特開２００２−３２３４９９号公報
【特許文献3】特開２００９−０３４０７１号公報
【特許文献4】国際公開第２００６／０９８０８７号
【特許文献5】特開２０１０−１７５４５２号公報
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】科学的根拠に基づく膵癌診療ガイドライン ２００９年版、日本膵臓学会膵癌診療ガイドライン改訂委員、金原出版
【非特許文献2】Ｐａｎｋｈｕｒｓｔ Ｇ．ら、２００３年、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ、第４４巻、ｐ．３４９−３５５
【非特許文献3】Ｂｌａｎｃｏ−Ｖａｃａ Ｆ．ら、２００１年、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ、第４２巻、ｐ．１７２７−１７３９
【非特許文献4】Ｒｏｃｃｏ ＡＧ．ら、２００６年、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ、第９１巻、ｐ．３０４３−３０４９
【非特許文献5】Ｈｏｎｄａ Ｋ．ら、２０１２年、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、第７巻、ｐ．ｅ４６９０８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
一般的に、腫瘍の検出には腫瘍マーカーが用いられるが、膵腫瘍は、腫瘍マーカーによる検出が困難であることが知られている。膵腫瘍の中でも、特に早期の膵臓癌患者は、健常者と見分けにくいため、腫瘍マーカーを用いた膵臓癌の早期検出は非常に難しい。また、膵良性腫瘍を検出できる腫瘍マーカーについては、これまでにほとんど知られていない。【0014】
本発明の課題は、膵腫瘍マーカーＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントを利用して、膵腫瘍、すなわち膵臓癌又は膵良性腫瘍の高い検出感度を有し、かつ前記特許文献４、５、及び非特許文献５に記載の検出方法よりも簡便で、スループットが高い膵腫瘍の検出方法、及び膵腫瘍検出用キットを提供することである。【課題を解決するための手段】
【0015】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、まず、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴタンパク質二量体を対象とするＥＬＩＳＡ測定法を利用した膵臓癌の検出方法の開発を目指した。そして、通常行われている方法に基づき、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴタンパク質二量体を構成するＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質及びＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のそれぞれのＣ末端領域に対する抗体（抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体）を用いて、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴタンパク質二量体を検出しようと試みた。ところが、おそらくは血中に存在する妨害物質や２種の抗体が同一抗原に結合する際におこる立体障害の影響により、この二量体を高精度に検出できないことが判明した。【0016】
そこで、本発明者らは鋭意検討を重ね、前記Ｃ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体と、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域以外と特異的に結合する抗体（抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体）とを組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を適用することにより、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の総量と、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の総量を別々に測定する方法を確立した。さらに、従来行われてきたＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴタンパク質二量体の量を測定するのではなく、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の総量の測定値と、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の総量の測定値をそれぞれ測定し、その結果を組み合わせる解析法を用いることで、膵臓癌患者と健常者を精度高く判別することを可能にした。さらには、本解析法を用いることで、これまでに報告されている腫瘍マーカーでは不可能であった膵良性腫瘍の検出という予期せぬ効果を見出した。この技術に基づいて、膵良性腫瘍や早期膵臓癌を含む膵腫瘍を極めて高感度に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。【0017】
本発明は、以下の発明を包含する。【0018】
（１）被験体の体液試料中におけるＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの量を測定して膵腫瘍を検出する方法であって、（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体と、該Ｃ末端領域以外のアミノ酸配列と結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ非末端抗体とを用いて、試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量を測定する第１の工程、（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体と、該Ｃ末端領域以外のアミノ酸配列と結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ非末端抗体とを用いて、試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量を測定する第２の工程、（Ｃ）第１の工程で得たＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量の測定値と第２の工程で得たＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量の測定値とを予め設定した判別式に入力して得た被験体の判別値が、健常体の測定値又は判別値と比較して統計学的に有意に差があるときに被験体が膵腫瘍に罹患していると決定する第３の工程、を含む膵腫瘍の検出方法。【0019】
（２）ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質及びＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の前記Ｃ末端領域が、それぞれＣ末端を含む６以上の連続したアミノ酸を含む配列からなる、（１）に記載の検出方法。【0020】
（３）前記判別式が、ロジスティック回帰式、サポートベクターマシーンの解析で作成された式、ニューラルネットワークの解析で作成された式、及び判別分析の解析で作成された式からなる群から選択されるいずれか１つである、（１）又は（２）に記載の検出方法。【0021】
（４）前記ロジスティック回帰式が、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の前記測定値、及び／又はＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の前記測定値、及び／又はＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の前記測定値とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の前記測定値の積を変数として含む、（３）に記載の検出方法。【0022】
（５）前記ロジスティック回帰式から得た被験体の判別値が、健常体の判別値の３分の２以下である、（４）に記載の方法。【0023】
（６）前記膵腫瘍が膵臓癌又は膵良性腫瘍である、（１）〜（５）のいずれかに記載の検出方法。【0024】
（７）前記第３の工程において、膵腫瘍に罹患していると決定された被験体について、当該被験体の体液試料中における膵臓癌マーカ−ＣＡ１９−９又はＤＵ−ＰＡＮ−２の量を測定し、その測定値が、所定の基準値を超える場合に被験体は膵臓癌に罹患していると決定し、当該基準値以下である場合に被験体は膵良性腫瘍に罹患していると決定する第４の工程をさらに含む、（６）に記載の検出方法。【0025】
（８）前記体液試料が、血液、血漿、又は血清である、（１）〜（７）のいずれかに記載の検出方法。【0026】
（９）前記膵臓癌が早期膵臓癌である（１）〜（８）のいずれかに記載の検出方法。【0027】
（１０）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体であって、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４、５及び６で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号７、８及び９で示されるアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片。【0028】
（１１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体であって、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１及び１２で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１３、１４及び１５で示されるアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片。【0029】
（１２）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域以外のアミノ酸配列を認識する抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体であって、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１６、１７及び１８で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１９、２０及び２１で示されるアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片。【0030】
（１３）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域以外のアミノ酸配列を認識する抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体であって、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２２、２３及び２４で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２５、２６及び２７で示されるアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片。【0031】
（１４）前記（１０）〜（１３）に記載の抗体又はその断片を１種類以上含む、膵腫瘍の検出用キット。【0032】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-206682号、2014-166188号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。【発明の効果】
【0033】
本発明によれば、血中の膵腫瘍マーカーＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの測定により、膵腫瘍の簡便かつハイスループットで高感度な検出が可能となる。例えば、患者から採取された血液等の体液試料中に含まれる特定のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの量を測定するだけで、その患者が膵臓腫瘍に罹患しているか否かを決定し、又は罹患の可能性を評価することができる。【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1】（Ａ）この図は、ＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアントに対する、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体であるクローン７Ｆ２の結合活性を測定したものである。（Ｂ）この図は、ＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアントに対する、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体であるクローン６Ｇ２の結合活性を測定したものである。
【図2】（Ａ）この図は、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質又はＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質に対する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体７Ｆ２、６Ｇ２、又は抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端ポリクローナル抗体（図中ではポリ抗体と表記）の結合活性を測定したものである。（Ｂ）この図は、（Ａ）で得られた前記抗体のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質に対する結合活性の測定値を、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質に対する結合活性の測定値で除して、抗体の結合特異性を評価したグラフである。
【図3】この図は、ＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアントに対する、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端ポリクローナル抗体の結合活性を測定したものである。
【図4】（Ａ）この図は、ＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアントに対する、抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端モノクローナル抗体であるＭＡＢ１の結合活性を測定したものである。（Ｂ）この図は、ＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアントに対する、抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端モノクローナル抗体であるＭＡＢ２の結合活性を測定したものである。
【図5】この図は、質量分析法により、膵臓癌患者と健常者各４０名の血漿中に含まれるＡＰＯＡ２タンパク質二量体（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴ）を測定したものである。
【図6】この図は、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域のアミノ酸配列を特異的に認識するモノクローナル抗体（抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体）とＡＰＯＡ２−ＡＴのＣ末端領域のアミノ酸配列を特異的に認識するポリクローナル抗体（抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端ポリクロ―ナル抗体）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、膵臓癌患者と健常者各４０名の血漿中に含まれるＡＰＯＡ２タンパク質二量体（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴ）を測定したものである。
【図7】この図は、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域のアミノ酸配列を特異的に認識するモノクローナル抗体（抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体）とＣ末端領域以外のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体（抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ非末端抗体）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、膵臓癌患者と健常者各４０名の血漿中に含まれるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質を測定したものである。
【図8】この図は、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域のアミノ酸配列を特異的に認識するポリクローナル抗体（抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端ポリクロ―ナル抗体）とＣ末端領域以外のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体（抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ非末端抗体）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、膵臓癌患者と健常者各４０名の血漿中に含まれるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質を測定したものである。
【図9】この図は、膵臓癌患者と健常者各４０名の血漿中に含まれる２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質）の量の積をプロットしたものである。
【図10】この図は、膵臓癌患者２４４名と健常者１０９名の血漿中に含まれる２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質）の濃度をプロットしたものである。
【図11】この図は、膵臓癌患者（ＵＩＣＣ分類におけるステージＩ、ＩＩ）と健常者の測定値を、ロジスティック回帰式に代入し、ＲＯＣ曲線を作成したものである。（Ａ）は２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質）のサンドイッチＥＬＩＳＡ法による測定値の積を、（Ｂ）は質量分析法により、ＡＰＯＡ２タンパク質二量体（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴ）を解析した結果を示している。
【図12】この図は、膵良性腫瘍患者と健常者の測定値を、ロジスティック回帰式に代入し、ＲＯＣ曲線を作成したものである。（Ａ）はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した、２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質）の測定値の積について、（Ｂ）はＣＡ１９−９の測定値について、解析した結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【0035】
本発明の測定対象となるのは膵腫瘍である。本明細書において「膵腫瘍」は膵臓において形成される全ての腫瘍を指す。具体的には、悪性腫瘍である「膵臓癌」と、良性腫瘍である「膵良性腫瘍」である。【0036】
本明細書において「膵臓癌」とは、膵臓において形成される全ての悪性腫瘍をいう。具体的には、浸潤性膵管癌、膵管内管状腺癌、膵腺房細胞癌、膵漿液性嚢胞腺癌、膵粘液性嚢胞腫瘍（膵粘液性嚢胞腫瘍の一種）、膵管内乳頭粘液性腫瘍（膵管内乳頭粘液性腫瘍の一種）、膵神経内分泌腫瘍（膵内分泌腫瘍の一種）等が含まれる（「膵癌取り扱い規約」、第６版補訂版、２０１３年、日本膵臓学会、金原出版）。対象とする膵臓癌の進行度は問わない。早期癌、進行癌、及び末期癌のいずれも包含する。【0037】
本明細書において「早期癌」とは、腫瘍が発生した局所（粘膜内）に限局していて、周囲組織への浸潤の無いもの、あるいは浸潤があってもその範囲が局所に限局しているものである。具体的には、ＵＩＣＣ（Ｕｎｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｉｓ Ｃｏｎｔｒａ Ｃａｎｃｒｕｍ）のステージ分類において、０、ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢであるものを指す（「ＴＮＭ悪性腫瘍の分類」、第７版 日本語版、２０１２年、ＵＩＣＣ日本委員会 ＴＮＭ委員会、金原出版）。前述のように膵臓癌は、極めて予後が悪い難治性癌であるが、早期膵臓癌を発見できれば５年生存率を著しく向上させることができる。【0038】
また「膵良性腫瘍」には、膵粘液性嚢胞腺腫（膵粘液性嚢胞腫瘍の一種）、膵管内乳頭粘液性腺腫（膵管内乳頭粘液性腫瘍の一種）、膵神経内分泌腫瘍（膵内分泌腫瘍の一種）、膵漿液性嚢胞腺腫、膵臓に発生する異型上皮及び上皮内癌が含まれる（「膵癌取り扱い規約」、第６版補訂版、２０１３年、日本膵臓学会、金原出版）。【0039】
１．抗ＡＰＯＡ２抗体及びその断片本発明の第一の実施形態は、抗ＡＰＯＡ２抗体（抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体及び抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体を含む）、及びその断片である。
【0040】
１−１．抗ＡＰＯＡ２抗体本明細書において「ＡＰＯＡ２タンパク質」とは、各生物種ＡＰＯＡ２タンパク質が該当するが、好ましくはヒト由来のＡＰＯＡ２タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＰ＿００１６３４．１）である。具体的には、配列番号１、２又は３に示されるヒト由来の野生型ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントが含まれ、さらに、それらの天然変異体、及びそれらの断片も含む。
【0041】
本明細書において前記「バリアント」とは、ヒト又は動物の血漿、血清、又は他の体液中に存在しえる、ＡＰＯＡ２タンパク質の異なる分子形態を意味する。例えば、ＡＰＯＡ２タンパク質においてＣ末端領域の構造が異なるＡＰＯＡ２タンパク質又はそれらの天然変異体が該当する。具体的には、例えば、配列番号１で示されるＣ末端領域のアミノ酸配列がＡＴＱで終わるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質、配列番号２で示されるＣ末端領域のアミノ酸配列がＡＴで終わるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質、又は配列番号３で示されるＣ末端領域のアミノ酸配列がＡで終わるＡＰＯＡ２−Ａタンパク質がＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントに該当する。【0042】
本明細書において「Ｃ末端領域（カルボキシル末端領域）」とは、アミノ酸配列においてＣ末端のアミノ酸及びその周辺の連続する数アミノ酸を含む、６〜２５アミノ酸、好ましくは８〜２０アミノ酸又は１０〜１７アミノ酸からなる領域をいう。【0043】
本明細書において「天然変異体」とは、自然界に存在する変異体であって、例えば、前記配列番号１、２又は３に示されるアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたもの、前記アミノ酸配列と９０％以上、９２％以上又は９４％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、一層好ましくは９８％以上又は９９％以上の同一性を有するものをいう。「同一性」とは、二つのアミノ酸配列が、最大の一致度となるようにギャップを導入して、又は導入しないで整列（アラインメント）させたときに、一方のアミノ酸配列の全アミノ酸残基数（ギャップ数も含む）に対する他方のアミノ酸配列の同一アミノ酸残基数の割合（％）をいう。「複数個」とは、２〜１０の整数、例えば、２〜７、２〜５、２〜４、２〜３の整数をいう。天然変異体の具体例としては、ＳＮＰ（一塩基多型）等の多型に基づく変異体やスプライス変異体（スプライスバリアント）等が挙げられる。また、前記置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的アミノ酸置換であれば、前記アミノ酸配列を有するＡＰＯＡ２タンパク質と実質的に同等な構造又は性質を有し得るからである。保存的アミノ酸とは、同じアミノ酸群に分類されるアミノ酸どうしの関係をいう。前記アミノ酸群には、非極性アミノ酸群（グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、トリプトファン）、極性アミノ酸群（非極性アミノ酸以外のアミノ酸）、荷電アミノ酸群（酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）及び塩基性アミノ酸群（アルギニン、ヒスチジン、リジン））、非荷電アミノ酸群（荷電アミノ酸以外のアミノ酸）、芳香族アミノ酸群（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、分岐鎖アミノ酸群（ロイシン、イソロイシン、バリン）、ならびに脂肪族アミノ酸群（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）等が知られている。【0044】
前記「それらの断片」とは、ＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアント、及びそれらの天然変異体のＣ末端領域を含むＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント及びその変異体の断片をいう。具体的には、ＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアント及びその変異体のプロテアーゼ消化物等がこれに該当する。【0045】
本発明は、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体及び抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体を含む、抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体を提供する。【0046】
「抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体」は、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域に存在するエピトープを特異的に認識し、かつ結合することができる抗体、又はその断片をいう。「特異的に認識し、かつ結合する」とは、他のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントとの交差反応性が無いか又は極めて弱いため、他のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントに対して認識も結合もできないか、又はほとんどしないことを意味する。具体的には、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域に特異的に結合するが、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域及びＡＰＯＡ２−Ａタンパク質等のＣ末端領域には結合を示さない抗体をいう。このような末端抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、又はその断片のいずれであってもよい。大量生産を可能にするため、及び均質の効果を得るためには、モノクローナル抗体が好ましい。【0047】
一方、「抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体」は、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域に存在するエピトープを特異的に認識し、かつ結合することができる抗体、又はその断片をいう。具体的には、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域に特異的に結合するが、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域、及びＡＰＯＡ２−Ａタンパク質等のＣ末端領域には結合を示さない抗体をいう。このような末端抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体又はその断片のいずれであってもよい。大量生産を可能にするため、及び均質の効果を得るためには、モノクローナル抗体が好ましい。【0048】
本発明は、さらに、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域以外のアミノ酸配列を認識する、「抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体」を提供する。【0049】
「抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体」とは、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントにおける全長アミノ酸配列において、前記Ｃ末端領域以外の領域に存在するエピトープを認識し、結合する抗ＡＰＯＡ２抗体をいう。つまり、抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体と抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体は、それぞれが認識するエピトープが完全に異なる。抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体は、「非末端」抗体と称するが、これは抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体に対する便宜的な名称である。したがって、Ｃ末端領域以外に存在するエピトープであれば特に限定はなく、Ｎ末端に存在するエピトープを認識し、結合する抗体も含まれ得る。【0050】
本発明で用いる抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体は、ある特定のＣ末端配列を持つＡＰＯＡ２タンパク質に対する結合活性と、そのＡＰＯＡ２タンパク質とは異なるＣ末端配列を持つＡＰＯＡ２タンパク質に対する結合活性を比較した場合に、両者の結合活性がほぼ同等であり、かつ、前記抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体のＣ末端領域への結合を阻害しないものが好ましい。具体的には、例えば、配列番号１で示されるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域以外のアミノ酸配列と結合する「抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ非末端抗体」と、配列番号２で示されるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域以外のアミノ酸配列と結合する「抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ非末端抗体」がＡＰＯＡ２タンパク質に対して同等の結合活性を有し、またいずれの抗体も抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体や抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体がＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域に結合することを阻害しないものが挙げられる。抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体又はその断片のいずれであってもよい。大量生産を可能にするため、及び均質な効果を得るためには、モノクローナル抗体が好ましい。【0051】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」とは、単一の免疫グロブリンからなる、又はそのフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅ ｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：以下、「ＦＲ」とする）及び相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：以下、「ＣＤＲ」とする）を含み、特定の抗原（エピトープ）を特異的に認識し、かつ結合することのできる、抗体をいう。【0052】
典型的な免疫グロブリン分子は、重鎖及び軽鎖と呼ばれる２本のポリペプチド鎖一組がジスルフィド結合によって２組相互接続された四量体として構成される。重鎖は、Ｎ末端側の重鎖可変領域（Ｈ鎖Ｖ領域：以下、「ＶＨ」とする）とＣ末端側の重鎖定常領域（Ｈ鎖Ｃ領域：以下、「ＣＨ」とする）からなり、軽鎖は、Ｎ末端側の軽鎖可変領域（Ｌ鎖Ｖ領域：以下、「ＶＬ」とする）とＣ末端側の軽鎖定常領域（Ｌ鎖Ｃ領域：以下、「ＣＬ」とする）からなる。このうち、ＶＨ及びＶＬは、抗体の結合特異性に関与する点で特に重要である。このＶＨ及びＶＬは、いずれも約１１０個のアミノ酸残基からなり、その内部に抗原との結合特異性に直接関与する３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と、可変領域の骨格構造として機能する４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）を有している。ＣＤＲは、抗原分子と相補的な立体構造を形成し、抗体の特異性を決定することで知られている（Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｖｏｌ．１、ｅｄｓ．５、ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）。定常領域のアミノ酸配列が種内抗体間ではほとんど一定なのに対して、ＣＤＲのアミノ酸配列は各抗体間において変異性が高く、それ故、超可変領域（Ｈｙｐｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）とも呼ばれている。可変領域において、前記ＣＤＲとＦＲは、Ｎ末端からＣ末端方向にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配列されている。免疫グロブリン分子内においてＶＬ及びＶＨは、相対して二量体を形成することによって抗原結合部位を形成している。免疫グロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤの各クラスが知られているが、本発明の抗体は、いずれのクラスであってもよい。好ましくはＩｇＧである。【0053】
本発明の抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体は、配列番号１で示されるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域には特異的に結合するが、配列番号２で示されるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質、及び配列番号３で示されるＡＰＯＡ２−Ａタンパク質には結合性を示さない。このような抗体の具体的な例としては、例えば、後述する実施例１に記載の、抗体クローン名７Ｆ２及び６Ｇ２で表される抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体クローン等が挙げられる。７Ｆ２クローンは、重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号４で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号５で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号６で示される配列からなり、かつ軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号７で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号８で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号９で示される配列からなる。また、６Ｇ２クローンは、重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号１０で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号１１で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号１２で示される配列からなり、かつ軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号１３で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号１４で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号１５で示される配列からなる。【0054】
本発明の抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体は、配列番号１〜３のいずれかで示されるＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントに対する結合活性を比較した場合、結合活性が同等であるものが好ましい。具体的な例としては、例えば、後述する実施例５に記載の、抗体クローン名ＭＡＢ１及びＭＡＢ２で表される抗ＡＰＯＡ２抗体クローン等が挙げられる。ＭＡＢ１クローンは、重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号１６で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号１７で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号１８で示される配列からなり、かつ軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号１９で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号２０で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号２１で示される配列からなる。また、ＭＡＢ２クローンは、重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２２で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号２３で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号２４で示される配列からなり、かつ軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２５で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号２６で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号２７で示される配列からなる。また、抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体としては、前記抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ非末端抗体や、前記抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ非末端抗体を使用することができる。【0055】
前記「ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体又はその断片」における「その断片」とは、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の部分断片であって、該抗体が有する抗原特異的結合活性と実質的に同等の活性を有するポリペプチド鎖又はその複合体をいう。例えば、前述の抗原結合部位を少なくとも１つ包含する抗体部分、すなわち、少なくとも１組のＶＬとＶＨを有するポリペプチド鎖、又はその複合体が該当する。具体例としては、免疫グロブリンを様々なペプチダーゼで切断することによって生じる多数の十分に特徴付けられた抗体断片等が挙げられる。より具体的な例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’等が挙げられる。Ｆａｂは、パパインによりＩｇＧ分子がヒンジ部のジスルフィド結合よりもＮ末端側で切断されることによって生じる断片であって、ＶＨ及びＣＨを構成する３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）のうちＶＨに隣接するＣＨ１からなるポリペプチドと、軽鎖から構成される。Ｆ（ａｂ’）２は、ペプシンによりＩｇＧ分子がヒンジ部のジスルフィド結合よりもＣ末端側で切断されることによって生じるＦａｂ’の二量体である。Ｆａｂ’は、Ｆａｂよりもヒンジ部を含む分だけＨ鎖が若干長いが実質的にはＦａｂと同等の構造を有する（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ ｅｄ．、３ｄ ｅｄ．、１９９３）。Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２をマイルドな条件下で還元し、ヒンジ領域のジスルフィド連結を切断することによって得ることができる。これらの抗体断片は、いずれも抗原結合部位を包含しており、抗原（すなわち本発明においてはＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアント）と特異的に結合する能力を有している。【0056】
本発明のモノクローナル抗体の断片は、化学的に、又は組換えＤＮＡ法を用いることによって、合成したものであってもよい。例えば、組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成された抗体断片が挙げられる。具体的には、限定はしないが、本発明のモノクローナル抗体の一以上のＶＬ及び一以上のＶＨを適当な長さと配列を有するリンカーペプチド等を介して人工的に連結させた一量体ポリペプチド分子、又はその多量体ポリペプチドが該当する。このようなポリペプチドの例としては、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４−１９９５、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ参照）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）又はテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）等の合成抗体等が挙げられる。免疫グロブリン分子において、ＶＬ及びＶＨは、通常別々のポリペプチド鎖（Ｌ鎖とＨ鎖）上に位置する。一本鎖Ｆｖは、これらの可変領域を十分な長さの柔軟性リンカーによって連結し、１本のポリペプチド鎖にＶＬ及びＶＨを包含した構造を有する合成抗体断片である。一本鎖Ｆｖ内において両可変領域は、互いに自己集合して１つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。一本鎖Ｆｖは、それをコードする組換えＤＮＡを、公知技術を用いてファージゲノムに組み込み、発現させることで得ることができる。ダイアボディは、一本鎖Ｆｖの二量体構造を基礎とした構造を有する分子である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８）。例えば、前記リンカーの長さが約１２アミノ酸残基よりも短い場合、一本鎖Ｆｖ内の２つの可変部位は自己集合できないが、ダイアボディを形成させることにより、すなわち、２つの一本鎖Ｆｖを相互作用させることにより、一方のＦｖ鎖のＶＬが他方のＦｖ鎖のＶＨと集合可能となり、２つの機能的な抗原結合部位を形成することができる（Ｍａｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ、２００５、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．、２６：６４９−６５８）。さらに、一本鎖ＦｖのＣ末端にシステイン残基を付加させることにより、２本のＦｖ鎖同士のジスルフィド結合が可能となり、安定的なダイアボディを形成させることもできる（Ａｌａｆｓｅｎ ｅｔ ａｌ、２００４、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｒ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．、１７：２１−２７）。このようにダイアボディは二価の抗体断片であるが、それぞれの抗原結合部位は、同一エピトープと結合する必要はなく、それぞれが異なるエピトープを認識し、特異的に結合する二重特異性を有していても構わない。トリアボディ、及びテトラボディは、ダイアボディと同様に一本鎖Ｆｖ構造を基本としたその三量体、及び四量体構造を有する。それぞれ、三価、及び四価の抗体断片であり、多重特異性抗体であってもよい。さらに、本発明の抗体断片は、ファージディスプレイライブラリーを用いて同定された抗体断片（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．３４８、５５２−５５４参照）であって、かつ抗原結合能力を有しているものが含まれる。この他、例えば、Ｋｕｂｙ、Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３ｒｄ Ｅｄ．、１９９８、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、も参照されたい。
【0057】
本発明において、抗ＡＰＯＡ２抗体又はその断片は、修飾することができる。ここでいう修飾は、抗ＡＰＯＡ２抗体又はその断片がＡＰＯＡ２タンパク質と特異的結合活性を有する上で必要な機能上の修飾（例えば、グリコシル化）、及び本発明の抗体又はその断片を検出する上で必要な標識のいずれをも含む。前記抗体標識には、例えば、蛍光色素（ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、蛍光タンパク質（例えば、ＰＥ、ＡＰＣ、ＧＦＰ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンによる標識が挙げられる。また、前記抗体のグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を調整するために改変されていてもよい。このような改変は、例えば、抗体配列内の一以上のグリコシル化部位を変更することで達成できる。より具体的に説明すると、例えば、ＦＲ内の一以上のグリコシル化部位を構成するアミノ酸配列に一以上のアミノ酸置換を導入して該グリコシル化部位を除去することにより、その部位のグリコシル化を喪失させることができる。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させる上で有効である（米国特許第５７１４３５０号、及び同第６３５０８６１号）。【0058】
１−２．免疫原の調製本発明において、抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体を作製する場合には、まず免疫原（抗原）としてのＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントを調製する。本発明において免疫原として使用可能なＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントは、例えば、配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するＡＰＯＡ２タンパク質若しくはその変異体又はそれらのポリペプチド断片、あるいはそれらと他のペプチド（例えば、シグナルペプチド、標識ペプチド等）との融合ポリペプチドが挙げられる。免疫原としてのＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントは、例えば、配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法等により合成することができる。例えば、以下の方法によって調製することができる。
【0059】
ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントとしては、天然型ＡＰＯＡ２タンパク質、組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質のいずれも用いることができ、その全部又は一部がペプチド合成のように化学的に合成された合成ＡＰＯＡ２タンパク質であってもよい。例えば、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端に結合する抗体（抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体）を取得するために調製するＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントは、天然型ＡＰＯＡ２タンパク質、組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質又は少なくともＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアントのＣ末端領域の連続した６アミノ酸以上のアミノ酸配列を含む限り、全部又は一部をペプチド合成のように化学的に合成した合成ＡＰＯＡ２タンパク質のいずれであってもよい。【0060】
天然型ＡＰＯＡ２タンパク質は、血液（血清、及び血漿を含む）のような体液をはじめとする試料、又は培養細胞の培養上清から公知のタンパク質分離・精製技術、例えば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを用いて回収することができる。【0061】
組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質は、該タンパク質をコードするＤＮＡを導入した微生物、昆虫細胞、又は動物細胞で発現させた後、当該細胞から公知のタンパク質分離・精製技術を用いて回収することができる。【0062】
合成ＡＰＯＡ２タンパク質は、例えば、公開されたＡＰＯＡ２タンパク質のアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば、固相ペプチド合成法等により合成することができる。この合成ＡＰＯＡ２タンパク質には、ＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）、ＯＶＡ（卵白アルブミン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のキャリアータンパク質に連結させてもよい。【0063】
抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体の作製において、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの断片を免疫原とする場合も、天然型ＡＰＯＡ２タンパク質断片、組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質断片、又は合成ＡＰＯＡ２タンパク質断片のいずれを使用することもできる。例えば、ＡＰＯＡ２タンパク質断片としては、配列番号１〜３のいずれかで示される配列において、Ｃ末端を含む６以上、好ましくは１０アミノ酸以上、好ましくは１８アミノ酸以上、より好ましくは３０アミノ酸以上の連続したアミノ酸残基を含むオリゴペプチド又はポリペプチドを抗原として使用することができる。例えば、配列番号２８又は２９で示されるアミノ酸配列を含むペプチドが使用できる。【0064】
天然型ＡＰＯＡ２タンパク質の断片を免疫原として用いる場合は、例えば、抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体の作製では、精製したＡＰＯＡ２タンパク質をトリプシン等の適切なプロテアーゼで処理した後、逆相カラムでピークを分離分取し、各ピークに含まれるペプチドのアミノ酸配列を質量分析器により決定して、配列番号１〜３のいずれかで示されるＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域の連続した６アミノ酸以上の配列を部分配列として含むペプチドのピークを免疫原として用いることができる。【0065】
組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質のアミノ酸部分配列を免疫原として用いる場合は、例えば、抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体の作製では、前述したＡＰＯＡ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列のうち、配列番号１〜３のいずれかで示されるＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端アミノ酸残基を含む連続した６アミノ酸以上の部分配列をコードするＤＮＡ配列部分を発現用ベクターに挿入し、各種細胞に導入することで、配列番号１〜３のいずれかで示される各種ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントのアミノ酸部分配列を得ることができる。【0066】
また、本発明において、抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体を作製する場合も、基本的な調製方法は、前記抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体の作製方法と同じでよい。ただし、ＡＰＯＡ２タンパク質の免疫原として使用可能な領域は、抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体の作製で使用する免疫原としての領域と異なる領域を用いる。すなわち、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域以外の領域の全部又は一部を免疫原として使用すればよい。抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体を作製する場合と同様に、抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体を作製する場合においても、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域以外の領域のアミノ酸残基を含むオリゴペプチド又はポリペプチドを抗原として使用することができる。【0067】
（組み換え型ＡＰＯＡ２タンパク質の調製）以下で、配列番号１〜３のいずれかで示される組み換え型ＡＰＯＡ２タンパク質（組み換え型ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント）の調製について詳述する。
【0068】
（ａ）組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントをコードするポリヌクレオチドの調製ＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアントの発現に用いるベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドを使用することができる。例えば、プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＥＴ３０ａ、ｐＧＥＸ６ｐ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）が挙げられる。また、ファージとしては、λファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターも用いることができる。
【0069】
上記ベクターにＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントをコードするポリヌクレオチドを挿入するには、例えば、精製した該ポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断し、適当な制限酵素で切断したベクター内部にＤＮＡリガーゼ等を用いて連結する方法がある。【0070】
（ｂ）ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント発現ベクターの宿主内への導入得られたＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント発現ベクターを、その発現ベクターを発現し得る宿主中に導入して、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント発現形質転換体を得る。使用する宿主については、使用したベクターに適する宿主であって、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌（例えば、エシェリヒア・コリ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（例えば、バチルス・サブチリス：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等）、酵母、昆虫細胞、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９８、Ｖｏｌ．１６０、３３９３−３４０２））等が好適に用いられる。細菌への前記ベクターの導入方法は、細菌に該ベクターを導入する公知の方法であれば特に限定されない。例えば、ヒートショック法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。これらの技術は、いずれも当該分野で公知であり、様々な文献に記載されている。例えば、Ｇｒｅｅｎ ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ、２０１２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。また、動物細胞の形質転換には、リポフェクチン法（ＰＮＡＳ、１９８９、Ｖｏｌ．８６、６０７７；ＰＮＡＳ、１９８７、Ｖｏｌ．８４、７４１３）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９７３、Ｖｏｌ．５２、４５６−４６７）、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
【0071】
細菌を宿主とする場合は、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント発現ベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントをコードするＤＮＡ配列、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する調節因子をコードする遺伝子が含まれていてもよい。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で機能できるものであればいずれを用いてもよい。【0072】
酵母、動物細胞、昆虫細胞等の真核細胞を宿主とする場合にも、同様に当技術分野で公知の手法に従ってＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント発現形質転換体を得ることができる。真核細胞において用いられるＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント発現ベクターには、プロモーター配列、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントをコードするＤＮＡ配列のほか、所望によりエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル（ドナー部位、アクセプター部位、ブランチポイント等）、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー配列、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等が連結されていてもよい。【0073】
（ｃ）形質転換体の培養及び組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの発現続いて、上記作製した形質転換体を培養する。形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、細菌を宿主とする場合、培地は、細菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、かつ生育、増殖可能なものであれば、特に限定はしない。天然培地、合成培地のいずれを用いることもできる。より具体的な例としては、ＬＢ培地が挙げられるが、もちろんこれに限定はされない。また、形質転換体の培養を選択的に行うために、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養は、通常、通気攪拌培養等の好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。形質転換体がＣＨＯ細胞等の動物細胞である場合には、Ｇｉｂｃｏ社製ＤＭＥＭ培地に１×１０５細胞／ｍＬとなるように宿主細胞を接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて培養すればよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【0074】
前記ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント発現ベクターがタンパク質発現制御システム（例えば、宿主が細菌の場合、リプレッサー遺伝子及びオペレーター等が該当する）を含むタンパク質発現誘導型ベクターである場合には、前記形質転換体に所定の処理を行い、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの発現を誘導させる必要がある。発現誘導の方法は、ベクターに含まれるタンパク質発現制御システムによって異なるため、そのシステムに適した誘導処理を行えばよい。例えば、細菌を宿主とするタンパク質発現誘導型ベクターにおいて最も一般的に利用されているタンパク質発現制御システムは、ｌａｃリプレッサー遺伝子及びｌａｃオペレーターからなるシステムである。本システムは、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｉｏ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）処理により発現を誘導することが可能である。このシステムを含むＡＰＯＡ２タンパク質発現ベクターを有する形質転換体において、目的とするＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントを発現させるためには、培地中に適当量（例えば、終濃度１ｍＭ）のＩＰＴＧを添加すればよい。【0075】
（ｄ）組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの抽出及び／又は回収培養後、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を回収して破砕することによりタンパク質を抽出することができる。また、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去し、上清を使用すればよい。その後、一般的なタンパク質の精製方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、又は適宜組合せて用いることにより、前記培養物中からＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントを単離精製することができる。ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントが得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認すればよい。
【0076】
１−３．抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体の作製１−３−１．抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体及びハイブリドーマ作製方法
本発明の抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下に記載する方法によって作製することができる。ただし、本方法に限定されるものではなく、当該分野で公知の他のあらゆる方法で作製することもできる。
【0077】
（１）抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体作製方法ＡＰＯＡ２タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１、２又は３で示されるＡＰＯＡ２タンパク質のいずれかのＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端モノクローナル抗体を作製するには、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント若しくはＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントのＣ末端領域を含むペプチドを免疫原としてモノクローナル抗体を作製し、その後、配列番号１〜３のいずれかで示されるＡＰＯＡ２タンパク質自体若しくはＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントのＣ末端領域を含むペプチドを用いてＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアントにのみ結合する抗体をスクリーニングすればよい。例えば、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体については、配列番号１で示されるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合し、配列番号２又は３で示されるＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントとは結合しないか、又はほとんどしないことを指標にスクリーニングできる。また、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端モノクローナル抗体については、配列番号２で示されるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合し、配列番号１又は３で示されるＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントとは結合しないか、又はほとんどしないことを指標にスクリーニングできる。
【0078】
また、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域以外のアミノ酸を認識する抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体を作製するには、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント若しくは部分配列を含むペプチドを免疫原としてモノクローナル抗体を作製し、その後、配列番号１〜３のいずれかで示されるＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント若しくはＣ末端の異なるペプチドに対する結合活性を比較した場合に結合活性が同程度であることを指標に、抗体をスクリーニングすることにより得ることができる。【0079】
（２）抗ＡＰＯＡ２抗体の産生細胞の作製前記１−２で得られた免疫原である組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質を、緩衝液に溶解して免疫原溶液を調製する。この際、免疫を効果的に行うために、必要であればアジュバントを添加してもよい。アジュバントの例としては、市販の完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）等が挙げられ、これらを単独で又は混合して用いてもよい。
【0080】
次に、前記調製した免疫原溶液を哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）、ウサギ等に投与し、免疫する。免疫原の投与方法としては、例えば、ＦＩＡ又はＦＣＡを用いた皮下注射、ＦＩＡを用いた腹腔内注射、又は０．１５ｍｏｌ塩化ナトリウムを用いた静脈注射が挙げられるが、この限りでない。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路等により適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０〜２００μｇである。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で、２〜６回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫より後に、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法等により行い、抗体価が充分な上昇を見せれば、免疫原を静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２〜５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。【0081】
１−３−２．抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ作製方法（１）免疫動物からの抗体産生細胞の回収と細胞融合
免疫動物から得た抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行うことで、ＡＰＯＡ２タンパク質の特定の領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製することができる。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、一般に入手可能なマウス等由来の株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生育できる性質を有するものが好ましい。また、株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株である、Ｐ３Ｘ６２−Ａｇ．８株（ＡＴＣＣＴＩＢ９）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１株（ＪＣＲＢ９０８５）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ０００９）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３株（ＪＣＲＢ００２８）又はＳＰ２／０−Ａｇ１４株（ＪＣＲＢ００２９）等が挙げられる。
【0082】
上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させるには、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地等の動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを約１：１〜２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤としては、平均分子量１，５００〜４，０００Ｄａのポリエチレングリコール等を約１０〜８０％の濃度で使用することができる。また、場合によっては、融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる（Ｎａｔｕｒｅ、１９７７、Ｖｏｌ．２６６、５５０−５５２）。【0083】
（２）目的とするハイブリドーマの選抜細胞融合処理後の細胞から目的とする抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する方法としては、細胞懸濁液を、例えば、ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地等で適当に希釈後、９６ウェルマイクロタイタープレート上に２×１０６個／ウェル程度播種し、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみを選択的に生育、増殖させることができるため、選択培地で培養開始後約１０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして選択することができる。
【0084】
ＨＡＴ培地で選択されたハイブリドーマは、まず、配列番号１〜３のいずれかで示されるＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアントに対する結合活性を指標としてスクリーニングを行う。次いでＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントへの結合活性を持つ抗体を産生するハイブリドーマについては、交差性の試験を行い、許容できるものを選択する。許容できる交差性とは、目的とする抗体の用途において、無視しうる程度の交差性を意味する。たとえば、免疫学的な測定に用いるためのモノクローナル抗体であれば、最終的な測定系において交差反応によるシグナル強度が、バックグラウンドレベルから特異的反応によるシグナル強度の１％未満に抑えられれば、事実上交差反応しないということができる。【0085】
ＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアントへの反応特異性を確認するには、例えば、ＥＬＩＳＡ法を利用することができる。ＥＬＩＳＡ法では、抗原となるＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアント又はその断片を、それぞれ異なるウェルに固相化したマイクロプレートを用意し、これに前記ハイブリドーマの培養上清を適当に希釈した試料を加えて反応させる。十分に反応させた後にウェルを洗浄し、免疫グロブリンに対する２次抗体の標識体を加えて更に反応させる。再度ウェルを洗浄し、最終的にウェルに結合した２次抗体の標識を利用して測定すれば、培養上清中に存在する抗体の、抗原に対する結合活性を定量的に知ることができる。例えば、抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端モノクローナル抗体を作製するには、特定のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントにおけるＣ末端領域にのみ結合活性を示し、ＡＰＯＡ２タンパク質の他のバリアントに交差性を示さないことを指標にして、特異性の判断を行えばよい。また、抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端モノクローナル抗体を作製するには、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端が異なるいずれのバリアントに対しても同程度の結合性を示し、かつ、作製した抗体によって、抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端モノクローナル抗体のＣ末端領域への結合を阻害しないことを指標に、抗体の選抜を行う。【0086】
ハイブリドーマは組換えＤＮＡ技術を用いて選抜することもできる。まず、前述の方法に従って取得したハイブリドーマ群からｍＲＮＡを抽出する。ｍＲＮＡの抽出は、当該技術分野で公知の方法を用いればよい。続いて、Ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマーやランダムプライマーを用いて前記ｍＲＮＡのｃＤＮＡを取得する。このｃＤＮＡを鋳型に、可変領域をコードする遺伝子の上流にあるシグナル配列の塩基配列と、定常領域側の塩基配列を含むプライマーセットを利用してＰＣＲを行う。得られた増幅産物を適当なクローニングベクターに挿入してクローン化し、そのハイブリドーマが生産する抗体の可変領域遺伝子のライブラリーを得ることができる。より具体的な例として、限定はしないが、Ｎｏｖａｇｅｎ社の提供するＭｏｕｓｅ Ｉｇ Ｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲを行い、増幅産物（マウス免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の提供するＺＥＲＯ ＢＬＵＮＴ ＰＣＲ ＴＯＰＯ ＶｅｃｔｏｒのＥｃｏＲＩ部位に挿入してクローン化し、得られたベクター群を、可変領域アミノ酸配列をコードする遺伝子ライブラリーとすることができる。次に、前記本発明で開示された可変領域又は各ＣＤＲのアミノ酸配列を元にプローブを設計し、前記ライブラリーからポジティブクローンをスクリーニングすることで、本発明の抗体を生産するハイブリドーマを選抜することができる。【0087】
（３）ハイブリドーマを用いた抗体産生本発明におけるハイブリドーマは、マウスを用いて腹水化することにより抗体生産に用いることができる。具体的には、ハイブリドーマを作製する際の融合パートナーに用いた細胞の由来のマウスや、ヌードマウスの腹腔内にハイブリドーマを接種し、腹水を適宜採取することにより、抗体を含む腹水液を回収することができる。より具体的には、ＳＰ２／０細胞を融合パートナーとしたハイブリドーマを、プリスタン接種後１０日間を経たＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔中に接種することにより、抗体を含む腹水液を回収できる。
【0088】
また、本発明におけるハイブリドーマは、適した培地を用いて培養を行うことにより抗体生産に用いることができる。具体的には、Ｇｉｂｃｏ社製のハイブリドーマＳＦＭ培地中に１×１０５細胞／ｍＬとなるようにハイブリドーマを接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにてハイブリドーマが死滅するまで培養することにより抗体を含む培養液上清を得ることができるが、この限りではない。【0089】
（４）組換え抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体又はその断片の組換えＤＮＡ操作による作製方法本発明の抗体又はその断片は、当該抗体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列を利用して、組換えＤＮＡ操作によって得ることもできる。
【0090】
抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ由来、例えば、上記「１−３−２（２）」の手法で取得した抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ由来の該抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を用いて、ＶＨ及びＶＬの塩基配列を任意のＣＬ、及びＣＨをコードする塩基配列にそれぞれ連結し、それぞれのポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入後、完全な免疫グロブリン分子として発現させることもできる。また、ＣＤＲグラフト抗体技術を用いて、上記「１−３−２（２）」の手法で取得した可変領域のアミノ酸配列のうち、ＣＤＲ配列のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入後、完全な免疫グロブリン分子として発現させてもよい。このとき重鎖と軽鎖とが同一宿主細胞内で発現し、重鎖／軽鎖からなる二量体として産生できるようにすると便利である。具体的には、例えば、軽鎖発現ベクター及び重鎖発現ベクターにより細胞を共形質転換し、この形質転換細胞から本発明による抗体を得ることもできる。又は、上記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをそのまま適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入後、免疫グロブリン分子の断片として発現させることもできる。あるいは、上述したように、前記アミノ酸配列を含むＶＬ及びＶＨ、又は軽鎖及び重鎖をそれぞれコードするポリヌクレオチドを適当なリンカーで連結してファージに組み込んだ一本鎖Ｆｖとして、又はダイアボディ等の合成抗体断片として発現させてもよい。その他、近年開発された、遺伝子工学技術を活用して組換え抗体をファージ表面に発現させるファージディスプレイ抗体技術（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ、１９９５、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２、４１−５０、国際公開ＷＯ９７／１３８４４号、同９０−０２８０９号）により、人工的に重鎖、軽鎖をコードする遺伝子をシャッフリングさせ多様化した一本鎖Ｆｖ抗体をファージ融合タンパクとして発現させ、特異抗体を得ることもできる。【0091】
組換え抗ＡＰＯＡ２抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドの調製、該ポリヌクレオチドを組み込んだベクター、該ベクターの宿主導入法については、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術を用いて行えばよい。目的とする組換え抗ＡＰＯＡ２タンパク質抗体又はその断片は、形質転換細胞の培養液中又は当該細胞内から得ることができる。【0092】
免疫グロブリン発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター（例えば、ＳＶ４０ ｖｉｒｕ ｂａｓｅｄベクター、ＥＢ ｖｉｒｕｓ ｂａｓｅｄベクター、ＢＰＶ ｂａｓｅｄベクター）等を用いることができるが、これらに限定されない。例えば、ＢＰＶ ｂａｓｅｄベクターの１種であるＢＣＭＧＳ Ｎｅｏベクターは、ＣＯＳ７細胞等に形質転換することによって外来遺伝子を効率良く発現する望ましいベクターである（烏山一「ウシパピローマウイルスベクター」、村松正実及び岡山博人編、実験医学別冊：遺伝子工学ハンドブック、１９９１、羊土社、２９７−２９９）。【0093】
前記ベクターは、抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドの他に、前記抗体又はその断片を発現する上で必要な制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化部位、スプライシング部位）、又は、必要であれば選択マーカーを含むことができる。【0094】
形質転換の宿主としては、上記「１−２．免疫原の調製」に記載した宿主の他、ＳＰ２／０（マウスミエローマ）細胞（Ｅｕｒｏｐｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（１９９６） Ｖｏｌ．５、５１２−５１９；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓａｒｃｈ（１９９０）Ｖｏｌ．５０、１４９５−１５０２）が好適に用いられる。
【0095】
本発明における、抗体又はその断片を発現するベクターを含有する宿主細胞は、常法に従って培養を行うことにより、その培養液上清又は宿主細胞内に抗体を産生させることができる。具体的には、ＣＨＯ細胞を宿主とした場合にはＧｉｂｃｏ社製ＤＭＥＭ培地に１×１０５細胞／ｍＬとなるように宿主細胞を接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて培養することにより抗体を含む培養液上清を得ることができる。また、例えば、宿主細胞を大腸菌とした場合には、ＬＢ培地等大腸菌の培養に用いられる一般的な培地に接種して培養し、タンパク質の発現を誘導することにより、培養液上清又は宿主細胞内に抗体を産生することができる。【0096】
発現産物である抗体又はその断片が定常領域を含む場合には、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、抗イムノグロブリン抗体アフィニティーカラム等を用いて培養液上清や、細胞破砕液から精製・回収することができる。一方、可変領域のみで構成され、定常領域を含まない状態で発現させた場合には、前記精製方法は適用できないので、他の適当な精製方法を応用する。例えば、そのＣ末端にヒスチジンタグ等の精製に有利なタグ配列を融合させた構造として発現させれば、対応するリガンドを利用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製することが可能である。タグとの融合タンパク質ではない場合は、硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーといったタンパク質精製の常法に従って精製することができる。【0097】
なお、本発明で使用されるモノクローナル抗体又はその断片は、ＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアント又はその断片に対する特異性を確認するため、前述のように使用前に予め他のバリアントとの交差反応性を検証しておくことが好ましい。例えば、本発明の抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質末端モノクローナル抗体又はその断片において、交差性を確認すべき抗原は、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質とＡＰＯＡ２−Ａタンパク質である。【0098】
また、前記タンパク質以外にも、部分構造がＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントと共通する他のタンパク質についても本発明で使用される抗体又はその断片の交差反応性を確認しておくことがより好ましい。交差反応の確認には、例えば、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質を抗原としたＥＬＩＳＡ法を使うことが可能である。反応特異性を試験すべき抗体、すなわち、抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体、及びその断片とＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントとの反応の場に、交差性を確認すべき他の抗原タンパク質を共存させれば、両者の競合状態を観察することによって交差性の確認を行うことができる。競合阻害の原理を利用したこのような交差性の確認方法は、すべての抗原について反応系を調製する必要がないのでスクリーニングを迅速に行うことができる。【0099】
１−３−３．得られた抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端モノクローナル抗体が認識するＡＰＯＡ２タンパク質の領域構造の確認得られた抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体が特異的に認識するＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの種類については、該タンパク質の遺伝子をもとにＰＣＲ反応等を用いて各種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント遺伝子を作製し、該遺伝子から得られるＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアントとモノクローナル抗体の結合性を解析することにより決定できる。
【0100】
抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端モノクローナル抗体の場合は、具体的には、次のような方法により行われる。まずＡＰＯＡ２遺伝子全長、又はＡＰＯＡ２遺伝子の終始コドンから、５’末端側に終始コドンを含む６塩基、若しくは９塩基が欠失した種々の長さの断片を調製し、これら断片を挿入した発現ベクターを作製する。このような欠失変異を伴う遺伝子断片の調製法は「続生化学実験講座、第１巻、遺伝子研究法ＩＩ、２８９−３０５頁、日本生化学会編」に記載されている。次に、それぞれのＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント発現ベクターを導入した宿主細胞から、前述の方法によりＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアントを調製する。続いて、これらのタンパク質を抗原としてＥＬＩＳＡ法により、抗ＡＰＯＡ２タンパク質モノクローナル抗体の各種ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントへの結合性の評価を行う。特定のバリアントに対してのみ結合性が見られ、その他のバリアントへの結合性は見られないか、若しくはほとんど見られない場合、該モノクローナル抗体は特定のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントにのみ特異的に結合する末端モノクローナル抗体であると判断できる。【0101】
得られた抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端モノクローナル抗体が認識するＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントは、次のような方法によって確認することもできる。【0102】
まず、公知の方法で、各種ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントのＣ末端領域の配列ペプチドを、それぞれ固相合成する。続いて、これらペプチドを抗原としてＥＬＩＳＡ法により、抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端モノクローナル抗体の各種ペプチドへの結合性の評価を行う。特定のＣ末端領域の配列ペプチドにのみ、抗ＡＰＯＡ２タンパク質モノクローナル抗体の結合性が見出された場合、該モノクローナル抗体は特定のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントにのみ特異的に結合する、抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端モノクローナル抗体であると判断できる。【0103】
１−４．抗ＡＰＯＡ２ポリクローナル抗体の作製抗ＡＰＯＡ２ポリクローナル抗体は、当該技術分野で公知の方法によって作製することができる。以下に、例として、ＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアントのみと特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体の取得法を具体的に示す。
【0104】
１−４−１．抗血清の取得抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端ポリクローナル抗体を作製するためには、まず、特定のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント配列上の少なくとも６アミノ酸以上の長さを持つＣ末端断片、例えば配列番号２８又は２９で示されるペプチドを緩衝液に溶解して免疫原溶液を調製する。必要であれば、免疫を効果的に行うためにアジュバントを添加してもよい。アジュバントの例としては、市販の完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）等が挙げられ、これらを単独で又は混合して用いることができる。
【0105】
次に、前記調製した免疫原溶液を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢａｌｂ／ｃ）、ウサギ等に投与し、免疫する。免疫原溶液の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路等により適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０〜２００μｇの免疫原を含んでいればよい。免疫原溶液の投与方法としては、例えば、ＦＩＡ又はＦＣＡを用いた皮下注射、ＦＩＡを用いた腹腔内注射、又は１５０ｍＭの塩化ナトリウムを用いた静脈注射が挙げられるが、この限りでない。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で、２〜１０回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法等により繰り返し行い、抗体価の上昇が充分見られたとき、免疫原溶液を静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。免疫後は、血液からＡＰＯＡ２タンパク質を認識するポリクローナル抗体を含む抗血清が回収できる。【0106】
１−４−２．抗ＡＰＯＡ２抗体の精製（１）ペプチド固定化カラムの作製
ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域ペプチド、及びＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域ペプチドのＣ末端にアミド基を付加したペプチドをそれぞれ固定化したアフィニティーカラムを作製する。詳しい方法は「抗ペプチド抗体実験プロトコール」、第２版、秀潤社に記載されている。アフィニティーカラムに使用する担体は、ホルミルセルロファインやＣＮＢｒアガロースのように、担体上の官能基をペプチドのアミノ基へ結合可能なもの、若しくは担体に共有結合させたマレイミド基を介して、ペプチド配列上のシステイン残基へ結合可能なものなどが利用可能である。また、固定化するペプチドの長さは、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端を含む限り、６アミノ酸以上、好ましくは１０アミノ酸以上、好ましくは１８アミノ酸以上、より好ましくは３０アミノ酸以上である。
【0107】
（２）抗体精製抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端ポリクローナル抗体は、前記抗血清からペプチド固定化アフィニティーカラムを用いて精製することができる。例えば、前記抗血清を適切な緩衝液で希釈し、抗血清に含まれるＩｇＧ抗体を、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域ペプチドを固定化したアフィニティーカラムに吸着させ、この吸着画分を回収する。続いて、Ｃ末端をアミド化したＡＰＯＡ２タンパク質ペプチドを固定化したアフィニティーカラムを用いて、ペプチドのＣ末端領域以外への結合性を示すイムノグロブリンを吸着除去する。最終的に、この非吸着画分を特定のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントを特異的に認識する抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端ポリクローナル抗体として取得する。
【0108】
２．膵腫瘍の検出方法 本発明の第二の態様は、膵腫瘍、すなわち膵臓癌又は膵良性腫瘍をインビトロで検出する方法に関する。本発明は、２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント、すなわちＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質及びＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の両方、若しくはどちらか一方の血中量が健常者よりも膵腫瘍患者で有意に低下する知見に基づき、それぞれのＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントのＣ末端領域を特異的に認識する末端抗体（抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体）又はその断片と、Ｃ末端領域以外の領域のアミノ酸配列を認識する抗ＡＰＯＡ２タンパク質抗体（抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体）又はその断片を使用して、前記２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントを測定することを特徴とする。さらに、測定した２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの測定値を用いた多変量解析により、膵腫瘍を検出する方法を特徴とする。
【0109】
本発明の方法は、膵腫瘍検出用マーカー測定工程、及び罹患決定工程を含む。以下、それぞれの工程について詳細に説明をする。【0110】
２−１．膵腫瘍検出用マーカー測定工程「膵腫瘍検出用マーカー測定工程」とは、被験体由来の体液中に存在する膵腫瘍検出用マーカー、すなわち、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質及びＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質からなる、２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの量をインビトロで測定する工程である。
【0111】
本明細書において、「被験体」は、膵腫瘍の検出対象となる個体、好ましくは膵腫瘍に罹患している疑いのある個体を指す。ここでいう個体の例として、脊椎動物が挙げられる。好ましくは哺乳動物、例えば霊長類（ヒト、サル、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ等）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモット等）、有蹄類（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等）など、より好ましくはヒトである。本明細書において、被験体がヒトの場合には、被験体を、以降、特に「被験者」と称する。【0112】
本明細書において「体液」とは、膵腫瘍の検出のために供される試料であって、生物学的流動体を意味する。体液は、本発明の膵腫瘍検出用マーカーが含まれる可能性のある生物学的流動体であればよく、特に限定はされない。例えば、血液、尿、リンパ球培養上清、髄液、消化液（例えば、膵液、大腸液、食道腺分泌液、唾液を含む）、汗、腹水、鼻水、涙、膣液、精液等が含まれる。好ましくは、血液又は尿である。本明細書中、「血液」とは、全血、血漿及び血清を含む。全血は、静脈血、動脈血又は臍帯血等の種類を問わない。体液は、同一個体から得られる異なる二以上の組合せであってもよい。本発明の膵腫瘍の検出方法は、侵襲性の低い血液や尿からも検出可能であることから、簡便な検出法として非常に有用である。【0113】
「被験体由来の体液」とは、被験体から既に採取された体液をいい、体液を採取する行為自体は、本発明の態様には包含されない。被験体由来の体液は、被験体から採取されたものを直ちに本発明の方法に供してもよいし、採取後、直接、又は適当な処理を施した後に、冷蔵又は凍結したものを本発明の方法に供する前に、室温に戻して使用してもよい。冷蔵又は凍結前の適当な処理としては、例えば、全血にヘパリン等を添加して抗凝固処理を施した後、又は血漿若しくは血清として分離すること等が含まれる。これらの処理は、当該分野で公知の技術に基づいて行なえばよい。【0114】
本明細書において「ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの量」とは、被験体由来の体液中に存在する前記２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントにおけるそれぞれの分量をいう。この分量は、絶対量又は相対量のいずれであってもよい。絶対量の場合、所定の体液量中に含まれる前記２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントにおける質量又は容量が該当する。相対量の場合、例えば、標準物質を使用し、その標準物質の測定値に対する被験体由来の２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの測定値の相対的な値をいう。例えば、濃度、蛍光強度、吸光度等が挙げられる。【0115】
ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの量は、インビトロで公知の方法を用いて測定することができる。例えば、２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントのそれぞれと特異的に結合可能な物質を用いて測定する方法が挙げられる。【0116】
本明細書において「特異的に結合可能」とは、ある物質が、本発明の標的であるＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアントのみと実質的に結合し得ることを意味する。この場合、特定のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの検出に影響を与えない程度の非特異的な結合が存在してもよい。【0117】
「特異的に結合可能な物質」としては、例えば、ＡＰＯＡ２結合タンパク質が挙げられる。より具体的には、例えば、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントを抗原とし、Ｃ末端領域の構造の違いを認識して結合する「抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体」、好ましくは配列番号１、２又は３のアミノ酸配列を含むヒトＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントを抗原とした時、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントのいずれか１種のみを認識して結合する「抗ヒトＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体」又はそれらの抗体断片である。あるいは、それらの化学修飾誘導体であってもよい。ここで、「化学修飾誘導体」とは、例えば、前記抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体又はその抗体断片において、ＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアントとの特異的な結合活性を獲得又は保持する上で必要な機能上の修飾、又は前記抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体又はその抗体断片を検出する上で必要な標識のための修飾のいずれをも含む。【0118】
機能上の修飾には、例えば、グリコシル化、脱グリコシル化、ＰＥＧ化が挙げられる。標識上の修飾には、例えば、蛍光色素（ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、蛍光タンパク質（例えば、ＰＥ、ＡＰＣ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、又はビオチン、アビジン、ストレプトアビジンによる標識が挙げられる。【0119】
ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの測定に用いる抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれであってもよい。特異的検出を可能にするため、好ましくはモノクローナル抗体である。例えば、ＡＰＯＡ２タンパク質末端と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端ポリクローナル抗体等は、前述の方法によって作製することができる。【0120】
２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントは、ＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアントにのみ結合する抗ＡＰＯＡ２抗体を用いた免疫学的方法により測定可能である。免疫学的方法は、抗ＡＰＯＡ２抗体を用いる限り、いずれの方法でも良いが、好ましくは、抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体を固相化抗体又は標識抗体として用い、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端以外の領域と結合するもう一つの抗体（抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体）と組み合わせて行うＥＬＩＳＡ法である。例えば、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量は、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体を標識抗体として用い、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ非末端抗体を固相化抗体として用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定できる。また、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質は、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体を固相化抗体として用い、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ非末端抗体を標識抗体として用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定可能である。抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体は、Ａｂｃａｍ社、ＦＩＴＺＧＥＲＡＬＤ社等より市販されており、それらを利用することもできる。 【0121】
２−２．罹患決定工程「罹患決定工程」とは、前記膵腫瘍検出用マーカー測定工程で測定されたタンパク質の量に基づいてインビトロで膵臓癌又は膵良性腫瘍の罹患を決定（又は評価）する工程である。測定された膵腫瘍検出用マーカー、すなわち、被験体の体液試料中におけるＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの量（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質及びＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量）を測定して、膵腫瘍の検出を行い、膵腫瘍の罹患の有無を決定し、又は罹患の可能性を評価する。本工程は、さらに第１工程〜第３工程の３つの工程で構成される。以下、それぞれの工程について詳細に説明する。
【0122】
第１の工程では、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体と、該Ｃ末端領域以外のアミノ酸配列と結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ非末端抗体を用いて、被験体の体液試料中におけるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量を測定する。【0123】
次に、第２の工程では、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体と、該Ｃ末端領域以外のアミノ酸配列と結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ非末端抗体を用いて、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量を測定する。ここで、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質及びＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の前記Ｃ末端領域は、それぞれＣ末端を含む６以上の連続したアミノ酸を含む配列であることが望ましい。ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの量は、例えばＥＬＩＳＡ法により測定することができるが、この方法に限定されない。さらに、第１の工程において抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体と共に用いる抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ非末端抗体と、第２の工程において抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体と共に用いる抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ非末端抗体は、抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体として同一であってもよい。つまり、第１の工程において抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ非末端抗体を、また第２の工程において抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ非末端抗体を用いることができる。【0124】
第３の工程では、第１の工程で得たＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量の測定値と第２の工程で得たＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量の測定値を、予め設定した判別式に入力して被験体における判別値を求め、健常体における判別値と比較して統計学的に有意に差があるときに膵腫瘍に罹患していると決定する。ここで用いる判別式は、後述する方法にて設定することができる。【0125】
また、判別値を求めなくても、被験者から採取された試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質又はＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のどちらか一方の量が、健常者から採取された検体中の量と比べて有意に差がある場合、具体的には測定された量が有意に少ない場合にも、被験者が膵腫瘍に罹患していると簡便に決定できる場合がある。【0126】
本発明による膵腫瘍の検出方法は、上記第３の工程において膵腫瘍に罹患していると決定された被験体について、さらに第４の工程を行うことができる。第４の工程では、該被験体の体液試料中における既知の膵臓癌マーカーの量を測定することにより、被験体が膵臓癌又は膵良性腫瘍のいずれに罹患しているのかを区別して決定することができる。この方法で使用する既知の膵臓癌マーカーとしては、膵臓癌を検出できるが、膵良性腫瘍を検出できないことが知られているものを使用する。具体的には、シアリルＬｅｗｉｓＡ抗原である「ＣＡ１９−９」（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ １９−９）や、ムチン様糖蛋白である「ＤＵ−ＰＡＮ−２」（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ−２）を用いることができる（臨床検査データブック ２０１３−２０１４、高久史麿監修、医学書院、ｐ．６３６−６３８）。膵臓癌判別を行う際の基準値は、ＣＡ１９−９では３７（Ｕ／ｍＬ）であり、ＤＵ−ＰＡＮ−２では１５０（Ｕ／ｍＬ）である。ＣＡ１９−９、ＤＵ−ＰＡＮ−２の量は、例えばＥＬＩＳＡ法によって測定することができるが、この方法に限られない。【0127】
上記第４の工程における罹患の決定は、具体的には、以下の通りに行うことができる。まず、被験者の体液試料中におけるＣＡ１９−９又はＤＵ−ＰＡＮ−２の量を測定する。次に、そのＣＡ１９−９又はＤＵ−ＰＡＮ−２の量の測定値が、上記膵臓癌判別のための各基準値を超える場合には、被験体は膵臓癌に罹患していると決定することができる。また、測定値が各基準値以下である場合には、被験体は膵良性腫瘍に罹患していると決定することができる。これは、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの量を測定する本発明の方法が、従来は不可能であった膵良性腫瘍を検出することができることによるものである。【0128】
本発明による膵腫瘍の検出方法は、ＡＰＯＡ２−Ａタンパク質など、ＡＰＯＡ２タンパク質のその他のバリアント、又はＡＰＯＡ２タンパク質の総量と組み合わせて利用することもでき、本発明にはかかる態様も包含される。【0129】
「健常体」とは、少なくとも膵腫瘍に罹患していない個体、好ましくは健康な個体をいう。さらに、健常体は、被験体と同一の生物種であることを要する。例えば、検出に供する被験体がヒト（被験者）の場合には、健常体もヒト（本明細書では、以降「健常者」とする）でなければばらない。健常体の身体的条件は、被験体と同一又は近似することが好ましい。身体的条件とは、例えば、ヒトの場合であれば、人種、性別、年齢、身長、体重等が該当する。【0130】
健常体の体液中における膵腫瘍検出用マーカーの濃度は、前記膵腫瘍検出用マーカー測定工程で説明をした被験体の体液中における膵腫瘍検出用マーカーの濃度の測定方法と同様の方法で測定することが好ましい。健常体の体液中における膵腫瘍検出用マーカーの濃度は、被験体の体液中における膵腫瘍検出用マーカーの濃度を測定する都度、測定することもできるが、予め測定しておいた膵腫瘍検出用マーカーの濃度を利用することもできる。特に、健常体の様々な身体的条件における膵腫瘍検出用マーカー質の濃度を予め測定しておき、その値をコンピューターに入力してデータベース化しておけば、被験体の身体的条件を当該コンピューターに入力することで、その被験体との比較に最適な身体的条件を有する健常体の膵腫瘍検出用マーカーの濃度を即座に利用できるので便利である。【0131】
本明細書において、「統計学的に有意」とは、例えば、得られた値の危険率（有意水準）が小さい場合、具体的には、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１又はｐ＜０．００１の場合が挙げられる。ここで、「ｐ」又は「ｐ値」とは、統計学的検定において、統計量が仮定した分布の中で、仮定が偶然正しくなる確率を示す。したがって「ｐ」又は「ｐ値」が小さいほど、仮定が真に近いことを意味する。「統計学的に有意に差がある」とは、被験体と健常体のそれぞれから得られた膵腫瘍検出用マーカーの量、又は判別式に入力して得た判別値の差異を統計学的に処理したときに両者間に有意に差があることをいう。健常体との比較において、統計学的に有意に差がある場合、その被験体は膵腫瘍に罹患していると評価する。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。【0132】
本明細書において、「判別式」は、多変量解析の最終生成物であり、１つ以上の値セットによって特徴づけられ、最終的に判別値を算出する。「多変量解析」とは、本明細書では膵腫瘍検出用マーカーの測定値を使用して判別式を構築するために使用される数学的手法である。また、明細書において、「値セット」とは、膵腫瘍検出用マーカーの特徴についての値の組み合わせ又は値域である。この値セット及びその中の値の性質は、膵腫瘍検出用マーカーに存在する特徴のタイプ及び値セットを指示する判別式を構築するために使用される多変量解析に依存的である。【0133】
本明細書において、「判別値」は、対象検体が膵腫瘍に罹患しているであろう予測の指標として利用できる値である。一つの具体例において、判別値により、対象検体が膵腫瘍に罹患していると予測できる。もう一つの例において、判別値により、対象検体が膵腫瘍に罹患していないと予測できる。【0134】
判別式は、データ解析アルゴリズムを用いた多変量解析によって構築することができる。判別式の構築に使用できるデータ解析アルゴリズムとしては、ロジスティック回帰分析を含む一般化線形モデル、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシーン（ＳＶＭ）、判別分析、ノンパラメトリック手法、ＰＬＳ （Ｐａｒｔｉａｌ Ｌｅａｓｔ Ｓｑｕａｒｅｓ）、決定木、主成分分析、一般化加法モデル、ファジィ論理、ＳＯＭ（Ｓｅｌｆ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｍａｐｓ）、又は遺伝的アルゴリズムが挙げられる。中でもロジスティック回帰分析、ニューラルネットワーク、ＳＶＭ又は判別分析を好ましく用いることができる。ただし、これらのデータ解析アルゴリズムに限定されない。これらの統計的方法に関する詳細は、以下の参考文献：Ｒｕｃｚｉｎｓｋｉ，Ｉ．ら、２００３年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｇｒａｐｈｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，第１２巻、ｐ．４７５−５１１；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９８９年、第８４巻、ｐ．１６５−１７５；Ｈａｓｔｉｅ，Ｔ．ら著、２００１年、Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ；Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｌ．著、１９８４年、Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒｅｅｓ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ：Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｌ．、２００１年、Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，第４５巻、ｐ．５−３２；Ｐｅｐｅ，Ｍ．著、２００３年、Ｔｈｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ；ならびにＤｕｄａ，Ｒ．ら著、２０００年、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，第２版中に見られる。【0135】
本発明において、判別式を用いた解析は、以下に示す工程で行われる。まず、判別を行いたい事象を目的変数として設定する。「目的変数」とは、判別式において判別を行いたい事象である。本発明においては、被験者の膵腫瘍への罹患の有無を示す。例えば、ロジスティック回帰分析の場合には、判別を行いたい事象が被験者の膵腫瘍の罹患の有無であった場合、目的変数は、被験者が膵腫瘍患者である場合に「１」、健常者である場合に「０」、と設定することができる。次に、目的変数を予測するための説明変数を設定する。「説明変数」とは、判別式において、前記目的変数の予測のために使用する変数である。例えば、ロジスティック回帰分析の場合には、説明変数として、膵腫瘍検出用マーカー、すなわち、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質及びＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の測定値を設定することができる。次に、前述したいずれかのデータ解析アルゴリズムを使用して、説明変数を組み合わせた判別式を構築し、判別値を算出する。得られた判別値に基づいて、判別を行いたい事象の予測を行う。例えば、ロジスティック回帰分析の場合には、判別値により、被験者が膵腫瘍患者（すなわち「１」）、又は健常者（すなわち「０」）であると予測できる。最終的に、事象の予測結果と、目的変数の値を比較し、判別式の判別性能を評価する。ここで、「判別性能」とは、判別を行いたい事象をどの程度正確に予測できたかという指標のことを指す。判別性能としては、症例データの判別成績（感度、特異度）、又はＡＵＣ値を利用することができる。膵腫瘍の罹患の有無を決定し、又は罹患の可能性を評価するためには、判別式から得られた判別値を基準に行うと良い。【0136】
本明細書において、「ＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ：曲線下面積）値」とは、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）下の面積を意味し、患者を陽性群と陰性群に分けるための予測、判定、検出又は診断の方法の精度を測る指標となる。これらの曲線では、評価対象となる方法が示す結果に関して、陽性患者において陽性の結果がでる確率（感度）と、陰性患者において陰性の結果がでる確率（特異性）を１から減算した値（偽陽性率）がプロットされる。【0137】
本明細書において、「感度」とは、（真陽性の数）／（真陽性の数＋偽陰性の数）の値を意味する。感度が高ければ膵臓癌の早期発見や膵良性腫瘍の発見が可能となり、完全な患部の切除や再発率の低下につながる。【0138】
本明細書において、「特異度」とは、（真陰性の数）／（真陰性の数＋偽陽性の数）を意味する。特異度が高ければ健常体を早期膵臓癌患者又は膵良性腫瘍患者と誤判別することによる無駄な追加検査の実施を防ぎ、患者の負担の軽減や医療費の削減につながる。【0139】
以下に、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの測定値を用いて、ロジスティック回帰分析を使用した判別式によって、被験者の膵腫瘍の罹患の有無を解析する方法を具体的に示す。【0140】
２−２−１．ロジスティック回帰分析を用いた判別法膵腫瘍への罹患の有無を決定し又は罹患の可能性を評価するための分析法としては、ロジスティック回帰分析を用いて判別式を得る方法を使用できる。
【0141】
まず、臨床情報から、全被験者を膵腫瘍患者と、健常者の２群に群分けし、目的変数として膵腫瘍患者を「１」、健常者を「０」と設定する。次に、それらの臨床情報を持つ生体試料から得たＡＰＯＡ２タンパク質の２種のバリアントの測定値から判別式を設定する。判別式は、説明変数としてＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の測定値とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の測定値、及び/又はＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の測定値とＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の測定値の積を変数として含むロジスティック回帰式として、予め設定することができる。ロジスティック回帰式の判別式としての妥当性は、最尤法（ｍａｘｉｍｕｎ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｍｅｔｈｏｄ）の範疇に属するＡＩＣ値（赤池情報量規準）、又はＳｃｈｗａｒｚのＢＩＣ値等などの指標を用いて評価できる。【0142】
ロジスティック回帰式としては、数式１、数式２、数式３のように、説明変数としてＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の測定値、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の測定値、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の測定値とＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の測定値の積が含まれる式が利用できる。数式１：a x (ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ) + b x (ＡＰＯＡ２−ＡＴ) + d
数式２：a x (ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ) + b x (ＡＰＯＡ２−ＡＴ)+ c x (ＡＰＯＡ２−
ＡＴＱ) x (ＡＰＯＡ２−ＡＴ) +d
数式３：c x (ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ) x (ＡＰＯＡ２−ＡＴ) + d
(数式１〜３において、ａ，ｂ，ｃ，ｄはゼロでない任意の実数、(ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ)はＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の測定値、(ＡＰＯＡ２−ＡＴ)はＡＰＯＡ２−ＡＴ
タンパク質の測定値である。)
【0143】
ロジスティック回帰式として判別式を得た場合には、被験者と健常者から得られたＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質又はＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の測定値を前記ロジスティック回帰式に入力して得た判別値を比較し、被験者が膵腫瘍に罹患していると決定することができる。例えば、前記統計学的に有意に差のあるときの被験者の判別値が、健常者の判別値の３分の２以下である場合に、より好ましくは２分の１以下、さらに好ましくは４分の１以下である場合に、被験者が膵腫瘍に罹患していると決定することができる。【0144】
３．膵腫瘍検出用キット本発明の第三の態様は、膵腫瘍検出用キットである。
【0145】
本明細書において「膵腫瘍検出用キット」とは、膵腫瘍への罹患の有無、罹患の程度若しくは改善の有無や改善の程度を評価するために、また膵腫瘍の予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接又は間接的に利用されるものをいう。【0146】
本態様のキットは、その構成物として、膵腫瘍への罹患に関連して体液試料中、特に血液、血清、血漿において発現が変動するＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント、好ましくは配列番号１及び２で示されるＡＰＯＡ２タンパク質の２種のバリアントを特異的に認識し、また結合可能な物質が包含される。具体的には、例えば、抗ＡＰＯＡ２タンパク質末端抗体等若しくはその断片又はそれらの化学修飾誘導体が含まれる。これらの抗体は、上記のような固相担体に結合されていてもよく、この場合、好ましくは上記のような検査用ストリップに結合されていてもよい。その他、例えば、標識二次抗体、さらには標識の検出に必要な基質、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、精製された標準物質としてのＡＰＯＡ２タンパク質、使用説明書等を含んでいてもよい。【実施例】
【0147】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、この実施例によって制限されないものとする。【0148】
（実施例１）ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域を特異的に認識するモノクローナル抗体（抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体）の作製（ａ）ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域を認識する抗体産生細胞の作製
ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域の配列である配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、水に対して難溶性であり、抗原性も低いため、Ｎ末端側に、３つのアルギニン残基を付加することで親水性を付与し、さらにそのＮ末端にシステイン残基を付加したペプチドを合成した。続いて、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ピアス社製）を用いて、前記ペプチドのシステイン残基に、ＯＶＡタンパク質を結合させた。これを免疫原とし、免疫原が１匹当たり１００μｇとなるように、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に２週間間隔で腹腔内投与を行った。免疫の初回から４回目までは、前記免疫原溶液に、さらにＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（シグマ社製）を混合し、投与した。４回目の投与の後、ＥＬＩＳＡ法により、マウスの血清中の抗体価の測定を行った。
【0149】
前記免疫原をＰＢＳ溶液で０．３μｇ／ｍＬに調製した後、イムノプレートマキシソープ（ＮＵＮＣ社製）のウェルに１００μＬずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、ブロッキングバッファーＡ溶液（０．５％ＢＳＡ、０.０５％ＴＷＥＥＮ２０、ＰＢＳ）４００μＬを添加して１時間室温で静置した。ウェル内の溶液を廃棄後、ＰＢＳ−Ｔ（０.０５％ＴＷＥＥＮ２０、ＰＢＳ）４００μＬを添加して洗浄し、ブロッキングバッファーＡ溶液で希釈した前記マウス血清を１００μＬ添加して１時間室温で反応させた。ウェル内の溶液を廃棄後、ＰＢＳ−Ｔによる洗浄を行った後、ブロッキングバッファーＡ溶液で５０００倍希釈したＰｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＨＲＰ（ダコ・ジャパン社製）１００μＬを添加して、１時間室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液（ピアス社製）５０μＬを添加して酵素反応を行った。その後、０．５Ｎ硫酸溶液５０μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、充分な抗体価の上昇を見出したため、さらに前記マウスに前記免疫原溶液を投与し、最終免疫とした。そして、最終免疫の日から３日後に、脾臓から抗体産生細胞を取得した。【0150】
（ｂ）マウスからの抗体産生細胞の回収と細胞融合ＲＰＭＩ１６４０培地中で、前記（ａ）でマウスから得た抗体産生細胞と、ＳＰ２／０（マウスミエローマ）細胞を１：１０の割合で混合し、８０％ポリエチレングリコールの存在下にて融合反応を行った。続いて、ＨＡＴ培地にて約１週間培養し、ハイブリドーマを選別した。
【0151】
（ｃ）ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域を認識する抗体を産生するハイブリドーマの選抜次に、ＨＡＴ培地で選択されたハイブリドーマから、組換え型ヒト由来のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質又はＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質に対する結合活性の違いを指標として、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域を特異的に認識する抗体の選抜を行った。前記（ａ）と同様にＥＬＩＳＡ法にてスクリーニングを行った結果、クローン７Ｆ２とクローン６Ｇ２の２種のハイブリドーマを取得した。モノクローナル抗体をコードする遺伝子の配列解析の結果、７Ｆ２のＣＤＲ配列は配列番号４〜９、６Ｇ２のＣＤＲ配列は配列番号１０〜１５、で示されるアミノ酸配列であることが明らかとなった。
【0152】
（実施例２）抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の検出実施例１で取得した抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体７Ｆ２又は６Ｇ２を用いて、ＥＬＩＳＡ法によるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の検出を行った。組換え型ヒト由来、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質又はＡＰＯＡ２−Ａタンパク質を、ＰＢＳ溶液で１μｇ／ｍＬに調製した後、イムノプレートマキシソープのウェルに１００μＬずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、ブロッキングバッファーＡ溶液４００μＬを添加して１時間室温で静置した。ウェル内の溶液を廃棄後、ＰＢＳ−Ｔ４００μＬを添加して洗浄し、希釈液（１％ＮＰ４０、５０ｍＭ トリス塩酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＢＳＡ、ｐＨ８．０）で０．２μｇ／ｍＬに希釈した抗体７Ｆ２又は６Ｇ２を１００μＬ添加して２時間室温で反応させた。ウェル内の溶液を廃棄後、ＰＢＳ−Ｔによる洗浄を行った後、希釈液で５０００倍希釈したＰｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＨＲＰ１００μＬを添加して、１時間室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを添加して酵素反応を行った。その後、０．５Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0153】
結果を図１に示す。本発明において取得した抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体クローン７Ｆ２とクローン６Ｇ２は、いずれもＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質を特異的に認識することが確かめられた。【0154】
（実施例３）ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質に対する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体と抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端ポリクローナル抗体の結合特異性の評価実施例１で取得した抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体クローン７Ｆ２、クローン６Ｇ２と、前記「１−４．抗ＡＰＯＡ２ポリクローナル抗体の作製」（方法の詳細は「抗ペプチド抗体実験プロトコール」、第２版、秀潤社に記載）に記載した方法を用いて取得した抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端ポリクローナル抗体の計３種の抗体について、抗原に対する特異性を評価した。本実験では、クローン７Ｆ２、クローン６Ｇ２、及び抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端ポリクローナル抗体のＰＯＤ標識体を用いた。抗体のＰＯＤ標識化は、ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ ＬＡＢＥＬＩＮＧ ＫＩＴ−ＳＨ（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）を用いて行った。
【0155】
組換え型ヒト由来ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質、又はＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質を、ＰＢＳ溶液で１μｇ／ｍＬに調製した後、イムノプレートマキシソープのウェルに１００μＬずつ加え、２時間固相化した。ＰＢＳ−Ｔで洗浄の後、ブロッキングバッファーＢ溶液（１％スキムミルク、０.０５％ＴＷＥＥＮ２０、ＰＢＳ）４００μＬを添加して１時間室温で静置し、ウェル内の溶液を廃棄した。続いて、希釈液で０．５μｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体７Ｆ２、６Ｇ２、又は抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端ポリクローナル抗体のＰＯＤ標識体を、１００μＬ加え、２時間室温で反応させた。さらに、ＰＢＳ−Ｔによる洗浄を行った後、ＴＭＢ溶液１００μＬを添加して発色させた。最後に、０．５Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【0156】
図２（Ａ）に、各抗体を、タンパク質を固相化していないウェル（ブランク）、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質を固相化したウェル、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質を固相化したウェルで反応させた際の測定値を示す。図２（Ｂ）には、各抗体のＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質を固相化したウェルの測定値からブランクを差し引いた値をＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質に対する結合活性値、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質を固相化したウェルの測定値からブランクを差し引いた値をＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質に対する結合活性値として算出し、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質に対する結合活性値をＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質に対する結合活性値で乗じた値を抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体の結合特異性として表したグラフである。抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体７Ｆ２と６Ｇ２はいずれも、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端ポリクローナル抗体と比較して、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質に対する結合特異性が強いことが確かめられた。【0157】
（実施例４）抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の検出ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域を特異的に認識する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端ポリクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ法によるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の検出を行った。
【0158】
（ａ）抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端ポリクローナル抗体の作製抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端ポリクローナル抗体は、前記「１−４．抗ＡＰＯＡ２ポリクローナル抗体の作製」（方法の詳細は「抗ペプチド抗体実験プロトコール」、第２版、秀潤社に記載）に記載した方法を用いて取得した。免疫原は、配列番号２８で示されるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域を示すペプチドのＮ末端にシステイン残基を付加し、さらにキャリアータンパク質であるＫＬＨと結合させたものを用いた。この免疫原をウサギに対して１週間間隔で投与を行った。４回目の投与の後、前記実施例１と同様に、ＥＬＩＳＡ法によりウサギ血清中の抗体価の測定を行った。その結果、充分な抗体価の上昇を見出したため、最終免疫の日から１週間後に抗血清を回収した。
【0159】
前記ペプチドをホルミルセルロファイン担体に結合させたものをアフィニティーカラムとして用いて、前記抗血清の精製を行った。具体的には、精製後の抗血清を、前記ペプチドのＣ末端をアミド化したものをホルミルセルロファイン担体に結合させたアフィニティーカラムに通して、ペプチドのＣ末端領域以外への結合性を示すイムノグロブリンを吸着除去した。最終的に、この非吸着画分を抗ＡＰＯＡ２―ＡＴ末端ポリクローナル抗体として取得した。【0160】
（ｂ）ＥＬＩＳＡ法を用いたＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の検出組換え型ヒト由来、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質、又はＡＰＯＡ２−Ａタンパク質を、ＰＢＳ溶液で１μｇ／ｍＬに調製した後、イムノプレートマキシソープのウェルに１００μＬずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、ブロッキングバッファーＡ溶液４００μＬを添加して１時間室温で静置した。ウェル内の溶液を廃棄後、４００μＬのＰＢＳ−Ｔを添加して洗浄し、希釈液で０．２μｇ／ｍＬに希釈した上記抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端ポリクローナル抗体を１００μＬ添加して２時間室温で反応させた。ウェル内の溶液を廃棄後、ＰＢＳ−Ｔによる洗浄を行った後、希釈液で１００００倍希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ，ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｄｏｎｋｅy（ＧＥヘルスケア社製）１００μＬを添加して、１時間室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを添加して酵素反応を行った。その後、０．５Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0161】
結果を図３に示す。本発明において取得した抗体は、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントのうち、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のみを特異的に認識することが確かめられた。【0162】
（実施例５）抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によるＡＰＯＡ２タンパク質の検出前記実施例１に記載の方法を用いて、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域以外のアミノ酸配列を認識する抗体を作製した。
【0163】
ハイブリドーマのスクリーニングにおいては、ＡＰＯＡ２タンパク質非末端領域に対して結合活性を持つことを指標に、抗体の選抜を行った。スクリーニングの結果、クローンＭＡＢ１とクローンＭＡＢ２の２種の抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得した。また当該モノクローナル抗体をコードする遺伝子の配列解析の結果、ＭＡＢ１のＣＤＲ配列は配列番号１６〜２１、ＭＡＢ２のＣＤＲ配列は配列番号２２〜２７、で示されるアミノ酸配列であることが明らかとなった。【0164】
前記抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端モノクローナル抗体ＭＡＢ１又はＭＡＢ２を用いて、ＥＬＩＳＡ法によるＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの検出を行った。組換え型ヒト由来、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質、又はＡＰＯＡ２−Ａタンパク質を、ＰＢＳ溶液で１μｇ／ｍＬに調製した後、イムノプレートマキシソープのウェルに１００μＬずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、ブロッキングバッファーＡ溶液４００μＬを添加して１時間室温で静置した。ウェル内の溶液を廃棄後、４００μＬのＰＢＳ−Ｔを添加して洗浄し、ブロッキングバッファーＡで０．５μｇ／ｍＬに希釈した抗体を１００μＬ添加して１時間室温で反応させた。ウェル内の溶液を廃棄後、ＰＢＳ−Ｔによる洗浄を行った後、ブロッキングバッファーＡで５０００倍希釈したＡｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｄｏｎｋｅy（ＧＥヘルスケア社製）１００μＬを添加して、１時間室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを添加して酵素反応を行った。その後、０．５Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【0165】
図４（Ａ）と（Ｂ）にＭＡＢ１抗体とＭＡＢ２抗体をそれぞれ用いたＥＬＩＳＡ法による、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの測定結果を示す。本発明によって取得したモノクローナル抗体ＭＡＢ１、ＭＡＢ２はいずれも、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントに対する結合活性が同程度であったことから、Ｃ末端領域以外のアミノ酸配列を認識する抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端抗体であることが確かめられた。【0166】
（比較例１）質量分析法を用いた血中ＡＰＯＡ２タンパク質二量体（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴ）の検出国立がんセンター中央病院において、インフォームドコンセントを得て、膵臓癌患者と健常者各４０名から採取した血漿から、特許第５２００２４６号公報に記載された実験１と同様の手法に従い、ＳＥＬＤＩ−ＱｑＴＯＦ−ＭＳ（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｈｙｂｒｉｄ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）法を用いて、１７２５２（ｍ／ｚ）の質量を有するペプチドピークのイオン強度を測定した。
【0167】
図５に、健常者と膵臓癌患者の判別を行った結果を示す。本手法はＡＵＣ値＝０．８９４を示し、高い膵臓癌判別精度を持つことが確かめられた。【0168】
（比較例２）サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた血中ＡＰＯＡ２タンパク質二量体（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴ）の検出前記比較例１と同様の血漿を対象に、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域を特異的に認識する前記抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体７Ｆ２とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域を特異的に認識する前記抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端ポリクローナル抗体のＰＯＤ標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、ＡＰＯＡ２タンパク質二量体（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴ）の検出を試みた。
【0169】
抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体のＰＯＤ標識化はＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ ＬＡＢＥＬＩＮＧ ＫＩＴ−ＳＨを用いて行い、詳細は付属のプロトコールに従った。抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端ポリクローナル抗体をＰＢＳ溶液で５μｇ／ｍＬに調製した後、イムノプレートマキシソープのウェルに１００μＬずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、ＰＢＳ−Ｔを４００μＬ添加して洗浄し、ブロッキングバッファーＣ溶液（１％ＢＳＡ、０.０５％ＴＷＥＥＮ２０、ＰＢＳ）４００μＬを添加して１時間室温で静置した。前記溶液を廃棄し、抗体固相化プレートとした。次に、希釈液を用いて１６倍希釈した血漿を、各ウェルに１００μＬずつ添加し１時間室温で反応させた。ウェル内の溶液を廃棄後、ＰＢＳ−Ｔによる洗浄を行い、希釈液で０．４μｇ／ｍＬに希釈した抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体のＰＯＤ標識体１００μＬを添加し、１時間室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔによる洗浄を行った後、ＴＭＢ溶液１００μＬを添加して酵素反応を行った。その後、０．５Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【0170】
図６に、健常者と膵臓癌患者の判別を行った結果を示す。本手法はＡＵＣ値＝０．５２９を示し、前記比較例１の質量分析法と同等の膵臓癌判別精度は得られなかった。本結果は、ＡＰＯＡ２―ＡＴＱ／ＡＴタンパク質二量体は、２つのＣ末端領域が互いに近接しているため、立体障害によって抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端ポリクローナル抗体と抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体が同時に結合できない可能性を示すものである。【0171】
（比較例３）サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた血中ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の検出前記比較例１と同様の血漿を対象に、前記抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体７Ｆ２のＰＯＤ標識体と、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域以外の部位を認識する抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端ポリクローナル抗体（ＦＩＴＺＧＥＲＡＬＤ社）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の測定を行った。
【0172】
抗体７Ｆ２のＰＯＤ標識化は前記比較例２と同様に行った。抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端ポリクローナル抗体をＰＢＳ溶液で２μｇ／ｍＬに調製した後、イムノプレートマキシソープのウェルに１００μＬずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、ＰＢＳ−Ｔを４００μＬ添加して洗浄し、ブロッキングバッファーＣ溶液４００μＬを添加して１時間室温で静置した。その後、前記溶液を廃棄し、抗体固相化プレートとした。次に、希釈液を用いて１００００倍希釈した血漿を、各ウェルに１００μＬずつ添加し１時間室温で反応させた。ウェル内の抗原溶液を廃棄後、ＰＢＳ−Ｔによる洗浄を行い、希釈液で０．２μｇ／ｍＬに希釈した抗体７Ｆ２のＰＯＤ標識体１００μＬを添加し、１時間室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔによる洗浄を行った後、ＴＭＢ溶液１００μＬを添加して酵素反応を行い、０．５Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【0173】
図７に、健常者と膵臓癌患者の判別を行った結果を示す。本手法はＡＵＣ値＝０．５１５を示し、優れた膵臓癌判別精度は得られなかった。【0174】
（比較例４）サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた血中ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の検出前記比較例１と同様の血漿を対象に、前記抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端ポリクローナル抗体と前記抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端ポリクローナル抗体のＰＯＤ標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の測定を行った。抗ＡＰＯＡ２タンパク質非末端ポリクローナル抗体のＰＯＤ標識化、及びサンドイッチＥＬＩＳＡについては、前記比較例３と同様に行った。血漿の希釈倍率は６０００倍とした。
【0175】
図８に、健常者と膵臓癌患者の判別を行った結果を示す。本手法はＡＵＣ値＝０．８１４を示し、前記比較例１の質量分析法と比べると判別性能は劣っていたものの、高い膵臓癌判別精度を持つことが確かめられた。【0176】
（実施例６）血中ＡＰＯＡ２タンパク質２種（ＡＰＯＡ２―ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２―ＡＴタンパク質）の測定値の組み合わせによる膵臓癌の判別図９に、前記比較例３と比較例４で得られたＡＰＯＡ２―ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２―ＡＴタンパク質の測定値の積をプロットし、健常者と膵臓癌患者の判別を行った結果を示す。本手法はＡＵＣ値＝０．９０６を示し、前記比較例１の質量分析法と比べても優れており、高い膵臓癌判別精度を示すことが確かめられた。
【0177】
（実施例７）サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた膵臓癌の判別国立がんセンター中央病院において、インフォームドコンセントを得て、膵臓癌患者２４４名と健常者１０９名から採取した血漿を対象に、前記実施例６の手法に従い、２種の血中ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント（ＡＰＯＡ２―ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２―ＡＴタンパク質）の測定を行った。さらに、組換え型ヒト由来タンパク質ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の抗原溶液を標品として、血漿中の前記２種のタンパク質濃度を算出した。
【0178】
図１０に、各血漿における２種のタンパク質をプロットした散布図を示す。前記２種のタンパク質を用いて、膵臓癌患者と健常者を高精度で判別可能であることが示された。【0179】
（実施例８）測定値のデータ解析アルゴリズム処理による膵臓癌判別前記実施例７で得られた測定値の統計解析処理により、膵臓癌判別精度が高い判別式を得ることが可能である。以下の統計処理を行い、前記比較例１と同様の質量分析法を用いた膵臓癌判別法との比較を行った。
【0180】
（ａ）ロジスティック回帰分析を用いた膵臓癌の判別目的変数として、膵臓癌患者を「１」、健常者を「０」と定義し、前記（１）で得られた２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント（ＡＰＯＡ２―ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２―ＡＴタンパク質）の血中濃度を説明変数として、ロジスティック回帰分析を行い、判別式を算出した。表１に、得られた判別式における、ＡＵＣ値、症例データの判別成績（感度、特異度）の算出結果を示す。この中で、早期の膵臓癌（ステージＩ）の判別性能が良かったのは、前記実施例６と同様、２種のタンパク質の濃度（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質）の積を説明変数とした判別式を構築した場合であった。ＡＰＯＡ２―ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２―ＡＴタンパク質の各検体の測定値を、この判別式に入力し得られた判別値を用いて、健常者と膵臓癌患者（ステージＩとＩＩ）を判別した際のＲＯＣ曲線を図１１（Ａ）に示す。図１１（Ｂ）は、前記質量分析法により測定したＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴタンパク質二量体の量を用いて、健常者と膵臓癌患者を判別した際のＲＯＣ曲線である。また、表２に、膵臓癌の各ステージにおける判別性能を比較した結果を示す。表２において、膵臓癌のステージはＵＩＣＣのステージ分類に従い、ステージIは、ＵＩＣＣのステージ分類におけるＩＡ、ＩＢを指し、ステージIIは、ＵＩＣＣのステージ分類におけるＩＩＡ、ＩＩＢを指す。表２において、「ＥＬＩＳＡ法」は、ＥＬＩＳＡ法により得られた２種のタンパク質（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質）の量の積を説明変数とする判別式を用いた場合の解析結果を示し、「質量分析法」は、質量分析法により得られたＡＰＯＡ２タンパク質二量体（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴ）の量を用いた場合の解析結果を示す。本手法は、前記質量分析法と比較して、極めて高い感度で早期膵臓癌を検出可能であることが確認された。
【表1】
【表2】
【0181】
（実施例９）測定値のデータ解析アルゴリズム処理による膵良性腫瘍の判別ＡＰＯＡ２による健常者と各種膵良性腫瘍患者の判別を行い、ＣＡ１９−９との判別性能の比較を行った。
【0182】
ＡＰＯＡ２を用いた判別では、前記実施例８において健常者と膵臓癌患者の判別に用いた際と同様の判別式（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量の積）を用いた。ＡＰＯＡ２を用いた判別性能については、表１において判別成績（感度、特異度）を算出した際と同様の方法で算出した。【0183】
被験者の体液試料中におけるＣＡ１９−９の量は、免疫学的方法により測定した。通常、ＣＡ１９−９により健常者と膵臓癌患者の判別を行う際、判別の基準値は３７（Ｕ／ｍＬ）であり、ＣＡ１９−９の量が基準値以下である場合は健常者、基準値を上回る場合は膵臓癌患者であると判別される（臨床検査データブック ２０１３−２０１４、高久史麿監修、医学書院、ｐ．６３６−６３７）。本実施例では、前記基準値をもとに、ＣＡ１９−９を用いて膵良性腫瘍患者と健常者との判別が可能であるかを検証するために、ＣＡ１９−９の量が前記基準値を上回る場合に、膵良性腫瘍患者であるとして判別した。【0184】
ＡＰＯＡ２により、健常者と膵良性腫瘍患者を判別した際のＲＯＣ曲線を図１２（Ａ）に示す。ＣＡ１９−９により、健常者と膵良性腫瘍患者を判別した際のＲＯＣ曲線を図１２（Ｂ）に示す。また、表３に各膵良性腫瘍の判別性能を比較した結果を示す。本発明のＡＰＯＡ２を用いた判別方法は、極めて高い感度で膵良性腫瘍を検出可能であることが確認された。その一方で、ＣＡ１９−９を用いた場合には、感度はほぼゼロに等しく、膵良性腫瘍を検出することは困難であることが判明した。【表3】
【0185】
（実施例１０）ＡＰＯＡ２とＣＡ１９−９を組み合わせた膵臓癌と膵良性腫瘍の判別ＡＰＯＡ２とＣＡ１９−９を組み合わせた膵臓癌と膵良性腫瘍の判別を行った。まず、前記実施例８及び９に記載の方法を用いて、ＡＰＯＡ２により、膵良性腫瘍、早期膵臓癌（ステージＩ、ＩＩ）、及び膵臓癌（全ステージ）の検出を行い、いずれかが検出された罹患者の人数をＡＰＯＡ２の陽性数として算出した。次に、ＡＰＯＡ２陽性の患者について、前記実施例９に記載の方法を用いてＣＡ１９−９による判別を行い、ＣＡ１９−９の基準値を上回った数としてＣＡ１９−９の陽性数を算出した。さらに、ＡＰＯＡ２陽性数に占めるＣＡ１９−９陽性数の割合を算出した。これらの結果を表４に示す。
【0186】
本手法により、ＡＰＯＡ２陽性かつＣＡ１９−９陽性である患者を膵臓癌に罹患していると決定し、ＡＰＯＡ２陽性かつＣＡ１９−９陰性である患者を膵良性腫瘍に罹患していると決定できる確率が高いことが確認された。すなわち、本発明の方法により、ＡＰＯＡ２とＣＡ１９−９とを組み合わせることにより、膵臓癌の罹患と膵良性腫瘍の罹患とを区別して判別することができることが示された。【表4】
【0187】
（実施例１１）ＡＰＯＡ２とＤＵ−ＰＡＮ−２を組み合わせた膵臓癌と膵良性腫瘍の判別ＡＰＯＡ２とＤＵ−ＰＡＮ−２を組み合わせた膵臓癌と膵良性腫瘍の判別を行った。ＣＡ１９−９の代わりにＤＵ−ＰＡＮ−２を用い、前記実施例１０に記載の方法と同様にして判別を行った。被験体の体液試料中におけるＤＵ−ＰＡＮ−２の量は、免疫学的方法により測定した。通常、ＤＵ−ＰＡＮ−２により健常者と膵臓癌患者の判別を行う際、判別の基準値は１５０（Ｕ／ｍＬ）であり、ＤＵ−ＰＡＮ−２の量が基準値以下である場合は健常者、基準値を上回る場合は膵臓癌患者であると判別される（臨床検査データブック ２０１３−２０１４、高久史麿監修、医学書院、ｐ．６３７−６３８）。本実施例では、ＤＵ−ＰＡＮ−２について、この基準値を使用して判別を行った。その結果を表５に示す。
【表5】
【0188】
本手法により、ＡＰＯＡ２陽性かつＤＵ−ＰＡＮ−２陽性である患者を膵臓癌に罹患していると決定し、ＡＰＯＡ２陽性かつＤＵ−ＰＡＮ−２陰性である患者を膵良性腫瘍に罹患していると決定できる確率が高いことが確認された。すなわち、本発明の方法により、ＡＰＯＡ２とＤＵ−ＰＡＮ−２とを組み合わせることにより、膵臓癌の罹患と膵良性腫瘍の罹患とを区別して判別することができることが示された。【0189】
以上、実施例７〜１１の結果から、本発明は、ＡＰＯＡ２のバリアントの測定値について判別式を用いた解析を行うことで、これまで困難とされてきた早期膵臓癌（ステージＩ、ＩＩ）を含む膵臓癌、又は膵良性腫瘍の高感度検出において有用であることが判明した。また、本発明は、前記検出結果について、膵臓癌マーカー（ＣＡ１９−９又はＤＵ−ＰＡＮ−２）を組み合わせた解析を行うことで、従来は不可能であった膵臓癌と膵良性腫瘍の高精度判別が可能となる点で有用であることが判明した。【産業上の利用可能性】
【0190】
本発明により、簡易かつ非侵襲的な方法で、膵腫瘍をハイスループットに検出することができ、膵腫瘍の早期発見が可能になる。【0191】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]