特許 6520329 ヘマトコッカスの培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6520329

(24)【登録日】2019年5月10日

(45)【発行日】2019年5月29日

(54)【発明の名称】ヘマトコッカスの培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/12 20060101AFI20190520BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/12 A

【請求項の数】1

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2015-80296(P2015-80296)

(22)【出願日】2015年4月9日

(65)【公開番号】特開2016-198038(P2016-198038A)

(43)【公開日】2016年12月1日

【審査請求日】2018年3月16日

(73)【特許権者】

【識別番号】000000549

【氏名又は名称】株式会社大林組

(74)【代理人】

【識別番号】110000176

【氏名又は名称】一色国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】山本 縁

(72)【発明者】

【氏名】大島 義徳

(72)【発明者】

【氏名】千野 裕之

(72)【発明者】

【氏名】小川 幸正

【審査官】 池上 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０００−０６０５３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 土と微生物, 2008, Vol.62, No.2, pp.106-113

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／１２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヘマトコッカスの培養液の色が変化し始めたタイミングで、前記培養液にメタン発酵消化液を添加するヘマトコッカスの培養方法であって、
培養液に所定波長の第一の光を照射することにより、第一の吸光度を測定し、且つ当該第一の光とは異なる波長の第二の光を照射することにより、第二の吸光度を測定し、
前記第一の吸光度に対する前記第二の吸光度の比率を求め、当該比率の増加が止まり、且つ前記培養液の濃度が予め設定された閾値以上となった時点を前記タイミングとして決定することを特徴とするヘマトコッカスの培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヘマトコッカスの培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

微細藻類は食品や化粧品等に利用可能な物質を産生することが知られている。たとえば、ヘマトコッカスは、抗酸化物質として注目されているアスタキサンチンを産生する藻類である。このような微細藻類を培養することにより、所望の物質を大量に生産することが可能となる。

【0003】

しかし、微細藻類は、培養途中で雑菌（たとえば、カビ）の影響を受けやすい。具体的には、雑菌により、藻類の生育が阻害されたり、産生される物質の品質に悪影響が出る恐れがある。従って、微細藻類を培養する場合には雑菌による影響を極力抑えることが望まれる。

【0004】

雑菌の影響を避けるためには、滅菌施設等の密閉系で行うことも考えられる。しかし、施設の滅菌作業等にコストがかかる。また、滅菌施設のような特殊な施設は大規模化することが難しい。すなわち、滅菌施設を利用した培養では所望の物質を大量生産することが困難である。

【0005】

ここで、メタン発酵消化液は、栄養剤としての作用及び殺菌作用があることが知られている。たとえば、特許文献１にはトマトやレタスの育成にメタン発酵消化液を用いる例が示されている。また、特許文献２には、メタン発酵消化液が病原菌の増殖を抑制する効果があることが記載されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】甘利誠、他５名、「土壌および養液栽培へのメタン消化液施用が数種土壌病害発生に及ぼす影響」、土と微生物（Ｓｏｌｉ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ） Ｖｏｌ．６２ Ｎｏ．２， ｐｐ．１０６−１１３ （２００８）

【非特許文献2】岡原弘明、他４名、「メタン発酵消化液の液肥利用に関する経済的、技術的な側面からの調査検討結果について」、Ｗｉｎｔｅｒ ２０１２ ＪＡＲＵＳ ＪＯＵＮＡＬ ｏｆ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｎｏ．１０９，ｐｐ．２１−３０ （２０１２）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ところで、ヘマトコッカスのような生育速度が遅い微細藻類を培養する場合、雑菌の影響がより大きくなるという問題がある。雑菌の影響を抑制するために、上述のメタン発酵消化液を利用することも考えられるが、コストの面から出来る限り少量の使用が好ましい。

【0008】

本発明は、ヘマトコッカスを培養する際に、メタン発酵消化液の使用量を抑えつつ、雑菌の影響を抑制できる培養方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記課題を解決するために、本発明のヘマトコッカスの培養方法は、ヘマトコッカスの培養液の色が変化し始めたタイミングで、前記培養液にメタン発酵消化液を添加する。
また、本発明において、前記培養液に所定波長の光を照射することにより、吸光度を測定し、前記吸光度に基づく前記培養液の濃度が、予め設定された閾値以上となった時点を前記タイミングとして決定することでもよい。
また、本発明において、前記培養液に第一の光を照射することにより、第一の吸光度を測定し、且つ当該第一の光とは異なる波長の第二の光を照射することにより、第二の吸光度を測定し、前記第一の吸光度に対する前記第二の吸光度の比率を求め、当該比率の増加が止まり、且つ前記培養液の濃度が前記閾値以上となった時点を前記タイミングとして決定することでもよい。

【発明の効果】

【0010】

本発明に係るヘマトコッカスの培養方法によれば、培養液の色が変化し始めたタイミングでメタン発酵消化液を添加することにより、メタン発酵消化液の使用量を抑えつつ、雑菌の影響を抑制することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】実験例におけるガンボーグ培地及び添加ビタミンを説明する図である。

【図2】本実施形態に係る増殖曲線を示す図である。

【図3】緑色を呈するヘマトコッカスの吸光スペクトルを示す図である。

【図4】赤色を呈するヘマトコッカスの吸光スペクトルを示す図である。

【図5】ヘマトコッカスの培養液に特定波長の光を照射した場合に得られる吸光度を示す図である。

【図6】本実施形態に係るヘマトコッカスの培養方法を示すフローチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明は、ヘマトコッカスの培養液の色が変化し始めたタイミングで、培養液にメタン発酵消化液を添加する方法である。

【0013】

＝＝ヘマトコッカス＝＝
ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ＳＰ．）は、微細藻類の一種であり、数十ミクロンの単細胞体である。ヘマトコッカスは、窒素、リン酸、及び金属元素（カリウム等）といった無機物を栄養源として生育する。ヘマトコッカスは、通常、緑色を呈する。一方、ヘマトコッカスは、栄養源の欠乏等によるストレスが与えられると赤色を呈する。これは、シスト化により細胞内にアスタキサンチンを蓄積し、休止期に入ることによる。休止期とは、ヘマトコッカスが増殖を休止し、アスタキサンチンを細胞内に蓄えた状態にある時期をいう。なお、ヘマトコッカスは、休止期であっても光合成を行うことができる。すなわち、休止期にあるヘマトコッカスは、アスタキサンチンを生成することが可能である。

【0014】

アスタキサンチンは、天然の赤い色素として用いられるカロテノイドの一種である。アスタキサンチンは、活性酸素を除去する作用（抗酸化作用）があることから食品や化粧品等に利用されている。

【0015】

＝＝培養液＝＝
本実施形態に係る培養液は、ヘマトコッカスを培養する溶液である。培養液は、ヘマトコッカス、培地、添加ビタミン等を含む。培地は、ヘマトコッカスが生育するために必要な栄養源（窒素、リン酸、及び金属元素（カリウム等）といった無機物）を含む。添加ビタミンは、ビタミンＢ１２等である。

【0016】

＝＝メタン発酵消化液＝＝
メタン発酵消化液は、ふん尿をメタン発酵処理する際に得られる液体である。メタン発酵消化液は、カビ等の雑菌の繁殖を抑制する機能を有する。本実施形態に係るメタン発酵消化液は、ヘマトコッカスの培養液中における雑菌の繁殖を抑制するため、培養液の色が変化し始めたタイミングで培養液中に添加される（詳細は後述）。

【0017】

＝＝メタン発酵消化液を添加するタイミングの決定について＝＝
培養を開始した初期段階において、ヘマトコッカスは、培地の栄養源を元にして活発に生育する。また、培養液中は窒素等の無機物が大半を占めているため、雑菌は繁殖し難い（雑菌は有機物を栄養源として繁殖する）。

【0018】

一方、ヘマトコッカスの生育が進むと培養液中のヘマトコッカスの量が増えるため、ヘマトコッカスの濃度が高くなる。従って、ヘマトコッカスは、生育に必要な無機物が足りなくなることや、培地中の藻体密度が高くなること等によってストレスを受け、アスタキサンチンを生成して休止期に入る。この際、ヘマトコッカスは緑色から赤色に変化するため、培養液の色も徐々に赤色を呈する。一方、ヘマトコッカスの生育が弱まると、雑菌は繁殖し易くなる。雑菌は、ヘマトコッカスが産生する有機物の他、休止期にあるヘマトコッカス自体をも栄養源にできると考えられる。

【0019】

たとえば、図１に示すガンボーグ培地及び添加ビタミンに対し、ヘマトコッカス１１．７ｇ／ｍ２を投入した培養液を用いて実験を行った。培養液を展開したシャーレをインキュベータ内（温度２５℃）に入れ、二酸化炭素５％の雰囲気下、光量９０〜９３μｍｏｌ／ｍ²／ｓで２４時間照射し、５日間観察を行った。この場合、５日目にはカビが大量に発生し、ヘマトコッカス（アスタキサンチン）を回収できない状態となった。

【0020】

そこで、本発明においては、雑菌の繁殖を抑制するために、メタン発酵消化液を培養液の色が変化し始めたタイミングで添加する。

【0021】

タイミングの決定は、たとえば、吸光度に基づいて行うことができる。具体的には、ヘマトコッカスの培養液について吸光度を定期的に測定し、測定された吸光度に基づいて、タイミングを決定することができる。

【0022】

吸光度の測定は、分光光度計を使用する。分光光度計は、たとえば、フローセルに流した培養液に対して所定波長の光を照射し、当該波長に対応する吸光度を自動で測定することができる。所定波長の光は、たとえば、６００〜６８０ｎｍの帯域から選択された一の波長の光である。なお、１回の吸光度測定に使用する培養液は、コンマ数ｍＬ〜数ｍＬである。

【0023】

タイミングは、測定された吸光度に基づく培養液の濃度が、予め設定された閾値（後述）以上となった時点として決定される。タイミングの決定は、たとえば、測定された吸光度の値及び予め設定された閾値をコンピュータで演算処理することにより実行される。具体的に、コンピュータは、測定した吸光度から培養液の濃度を算出する。そして、コンピュータは、算出した濃度を閾値と比較し、閾値以上の場合にその時点を培養液中にメタン発酵消化液を添加するタイミングであると決定する。

【0024】

閾値は、培養液中のヘマトコッカスがある量（濃度）になったかどうかを判断するための値である。閾値は、たとえば増殖曲線を元に任意に設定することができる。図２は増殖曲線の一例である。横軸は培養開始からの経過時間（日）を示し、縦軸はヘマトコッカスの濃度を示す。増殖曲線は、投入するヘマトコッカスの量、培養槽のサイズ、二酸化炭素の供給量等により決定される。増殖曲線は、ヘマトコッカスが生育を開始する「誘導期」、生育が進む「対数増殖期」及び生育が止まる「休止期」に分けることができる。

【0025】

このような増殖曲線を元に、たとえば、対数増殖期と休止期との境界付近の濃度を閾値として設定する。ここで、ヘマトコッカスの濃度が閾値以上となった場合、培養液中ではヘマトコッカスがかなり増殖しており、ヘマトコッカスにストレスがかかっている状態（アスタキサンチンの生成を開始し、培養液の色が変化し始める状態）になっているといえる。このような状態は、雑菌が繁殖し易い状態であるともいえる。よって、このタイミングで培養液にメタン発酵消化液を添加することで、雑菌の繁殖を抑制しつつ、アスタキサンチンの生成を促すことができる。なお、閾値は、増殖曲線に基づいて、コンピュータが自動で設定してもよいし、観察者等が手動で設定してもよい。

【0026】

或いは、閾値によるタイミング決定の補助的な方法として、吸光度の比率を参照することも可能である。

【0027】

図３は、対数増殖期にあるヘマトコッカス（緑色を呈するヘマトコッカス）の吸収スペクトルを示す図である。図４は、休止期にあるヘマトコッカス（アスタキサンチンを生成し、赤色を呈するヘマトコッカス）の吸収スペクトルを示す図である。図３及び図４において、横軸は波長、縦軸は吸光度である。図３から明らかなように、対数増殖期にあるヘマトコッカスは６８０ｎｍ付近に吸収のピークを持つ（赤色を吸収する）。一方、図４から明らかなように、休止期にあるヘマトコッカスは６８０ｎｍ付近に吸収のピークを持たない（赤色を反射する）。

【0028】

従って、ある波長λ１（６８０ｎｍ付近の帯域ではない波長）の吸光度Ａλ₁に対する波長λ２（６８０ｎｍ付近の波長）の吸光度Ａλ₂の比率（Ａλ₂／Ａλ₁）を取った場合、ヘマトコッカスが対数増殖期にある間は、比率が徐々に増大すると考えられる。一方、ヘマトコッカスが休止期に入ると比率は徐々に減少すると考えられる。

【0029】

たとえば、図５は、緑色を呈するヘマトコッカス、及び赤色を呈するヘマトコッカスそれぞれについて、６００ｎｍ（波長λ１）の吸光度Ａλ₁及び６８０ｎｍ（波長λ２）吸光度Ａλ₂を測定し、比率Ａλ₂／Ａλ₁を求めた例である。この例からも明らかなように、ヘマトコッカスが緑色を呈する場合に比べ、ヘマトコッカスが赤色を呈する場合には比率が低い値となっている。

【0030】

本実施形態において、分光光度計は、培養液に第一の光を照射することにより、第一の吸光度を測定する。また、分光光度計は、第一の光とは異なる波長の第二の光を照射することにより、第二の吸光度を測定する。第一の光は、ヘマトコッカスの色が変化する前後で吸収ピークの変化が少ない波長である。第二の光は、ヘマトコッカスの色が変化する前後で吸収ピークの変化が大きい波長である。なお、第二の光は、上述の所定波長の光と同じ波長であってもよい。

【0031】

そして、コンピュータは、第一の吸光度に対する第二の吸光度の比率を求め、当該比率の増加が止まり、且つ培養液の濃度が閾値以上となった時点をタイミングとして決定する。

【0032】

このように、比率の増加が止まり、且つ培養液の濃度が閾値以上となったタイミングでメタン発酵消化液を添加することにより、雑菌の繁殖をより確実に抑制しつつ、アスタキサンチンの生成を促すことができる。

【0033】

＝＝ヘマトコッカスの培養方法＝＝
図６を参照して、メタン発酵消化液を添加して行うヘマトコッカスの培養方法の一例について述べる。図６は、ヘマトコッカスの培養手順の例を示すフローチャートである。

【0034】

まず、ヘマトコッカスを含む種液、培地及び添加ビタミン等を培養槽に投入する（培養の開始。ステップ１０）。

【0035】

培養は、たとえば数ｍ³〜数十ｍ³の培養槽を複数設けることにより行う。このように複数の培養槽を設けることにより、大量のヘマトコッカスを培養すること（すなわち大量のアスタキサンチンを回収すること）が可能となる。

【0036】

所定の培養条件下、培養槽中で培養液を攪拌しながら、ヘマトコッカスの培養を行う。ヘマトコッカスは、培養液中で徐々に生育する（ヘマトコッカスの生育。ステップ１１）。培養条件としては、光量、二酸化炭素（ＣＯ₂）への曝気、温度、培養期間等がある。

【0037】

光量は、たとえば、３０〜１００ｍｏｌ／ｍ²／Ｓが好ましい。また、光は人工光でも天然光でもよいが、たとえば、１２時間照射し、１２時間停止する等の明暗条件を設定することが好ましい。曝気は、たとえば、二酸化炭素を０．１〜数％含むガスを、１Ｌの培養液に対して０．１５〜１．５Ｌ／分行うことが好ましい。なお、曝気は、空気を用いて行うことも可能である。培養期間は、１週間程度が好ましい。温度は、常温（２０℃±１０℃）が好ましい。なお、培養液の一部（たとえば、培養液全体の１／４〜１／１０）は次回の培養で使用する種液（ヘマトコッカスを含む培養液）として使用するため回収してもよい。

【0038】

培養中の培養液について、定期的に色の変化を観察し、ヘマトコッカスの培養液の色が変化し始めるタイミングを決定する（タイミングの決定。ステップ１２）。タイミングの決定は上述の分光光度計やコンピュータを用いて機械的に決定する例に限られない。たとえば、観察者が目視により培養液中に赤色が生じてきたと判断した時点を所定のタイミングとして決定することでもよい。

【0039】

ステップ１２で決定されたタイミングで、培養液にメタン発酵消化液を添加する（メタン発酵消化液の添加。ステップ１３）。メタン発酵消化液は、たとえば、粗粒・夾雑物を０．１〜０．５ｍｍ程度の簡易ろ過で取り除き、これを一時貯留槽に補充しておいて、ポンプを用いて添加する。添加量は、流量計で自動管理を行う。メタン発酵消化液は、たとえば、培養液との混合比率で約０．３３〜２．７％（水で１／１５に希釈する場合、約５〜４０％）添加されることが好ましい。

【0040】

メタン発酵消化液により雑菌の増殖を抑制できる。一方、ヘマトコッカスの濃度が高くなるにつれ培養液中の栄養源が減少する。この場合、ヘマトコッカスは、ストレスの影響によりアスタキサンチンを生成して細胞内に蓄える。また、メタン発酵消化液を加えることで複数の培養槽の滅菌管理を厳密に行わなくとも培養が可能となる。

【0041】

更に、メタン発酵消化液を添加した培養液の一部に対して二次培養を行う（二次培養。ステップ１４）。

【0042】

二次培養とは、栄養制限を行うことでアスタキサンチンの生成をより活性化させる工程である。栄養制限とは、ヘマトコッカスに対して特定の必須栄養を意図的に与えないことをいう。栄養制限は、たとえば、リン酸やカリウムを添加しつつ窒素を供給しないという方法や、本来であればヘマトコッカスの生育に足りない量の栄養源だけを供給する方法がある。二次培養では、ヘマトコッカスの生育に必要な栄養源が慢性的に不足している。よって、ヘマトコッカス自体はほとんど増殖しない。一方、ヘマトコッカスは光合成を行い、アスタキサンチンを徐々に蓄えていく。よって、ヘマトコッカス毎に蓄えるアスタキサンチンの量を増大させることができる。なお、雑菌の繁殖をより確実に抑制するため、二次培養の段階でメタン発酵消化液を追加してもよい。

【0043】

最後に、二次培養したヘマトコッカスを回収し、精製することにより、アスタキサンチンを抽出する（アスタキサンチンの抽出。ステップ１５）。

【0044】

このように、培養液の色の変化を観察し、色が変化し始めたタイミングでメタン発酵消化液を添加することにより、雑菌の繁殖を効率よく抑えることができる。また、培養当初からメタン発酵消化液を投入する場合と比べ、メタン発酵消化液の使用量を減らすことができるため、コスト（メタン発酵消化液自体のコスト、及び輸送や保管のコスト）を削減できる。

【0045】

なお、培養当初からメタン発酵消化液を添加することにより、雑菌の繁殖を防止できる可能性はあるが、メタン発酵消化液は栄養剤としても機能する。よって、メタン発酵消化液自体がヘマトコッカスの生育時に消費され、雑菌が繁殖する時点で培養液中のメタン発酵消化液が足りなくなる可能性もある。また、メタン発酵消化液は、濃い茶褐色であるため、初めから添加すると光を遮り、光の供給効率を低下させる。従って、培養液の色が変化し始めたタイミングでメタン発酵消化液を添加することが適切である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】