特許 6520954 イソプレンモノマーの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6520954

(24)【登録日】2019年5月10日

(45)【発行日】2019年5月29日

(54)【発明の名称】イソプレンモノマーの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20190520BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20190520BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20190520BHJP

   C12P 5/00 20060101ALI20190520BHJP

   C12P 9/00 20060101ALI20190520BHJP

   C08F 32/06 20060101ALI20190520BHJP

   C08L 9/00 20060101ALI20190520BHJP

   C08K 3/04 20060101ALI20190520BHJP

   B60C 1/00 20060101ALI20190520BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20190520BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21

   C12N9/12ZNA

   C12P21/02 C

   C12P5/00

   C12P9/00

   C08F32/06

   C08L9/00

   C08K3/04

   B60C1/00 Z

   !C12N15/54

【請求項の数】18

【全頁数】55

(21)【出願番号】特願2016-550891(P2016-550891)

(86)(22)【出願日】2015年3月27日

(65)【公表番号】特表2017-512460(P2017-512460A)

(43)【公表日】2017年5月25日

(86)【国際出願番号】JP2015060529

(87)【国際公開番号】WO2015147341

(87)【国際公開日】20151001

【審査請求日】2017年10月27日

(31)【優先権主張番号】2014112066

(32)【優先日】2014年3月28日

(33)【優先権主張国】RU

(73)【特許権者】

【識別番号】000000066

【氏名又は名称】味の素株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100089118

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 宏明

(74)【代理人】

【識別番号】100113103

【弁理士】

【氏名又は名称】香島 拓也

(72)【発明者】

【氏名】三原 洋子

(72)【発明者】

【氏名】良知 博昭

(72)【発明者】

【氏名】西尾 陽介

(72)【発明者】

【氏名】カタシュキナ， ジャンナ イオシフォヴナ

(72)【発明者】

【氏名】カジエバ， イェカチェリーナ デミティリアヴナ

(72)【発明者】

【氏名】アンドゥレェヴァ， イリーナ ゲオルオギエヴナ

【審査官】 吉田 知美

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０３１０６２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１０−１８７５５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０５９１４２４５（ＵＳ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５１５１６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１５１７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−２１６８５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Research in Microbiology，２０１１年，162，39-52

【文献】 Database UniProt [online], Accessin No. D1YZ39, <https://www.uniprot.org/uniprot/D1YZ39.txt?version=32> 19-FEB-2014 uploaded, [retrieved on 2018-09-25]

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ９／１２

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ ５／００−５／０２

Ｃ１２Ｐ ９／００

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

異種発現単位を含む宿主細胞であって、
該異種発現単位が、以下：
（ａ）メタノセラ属またはメタノセタ属に属する微生物由来のメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター；
を含む、宿主細胞。

【請求項2】

前記メバロン酸キナーゼが、配列番号１または配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつメバロン酸キナーゼ活性を有する、請求項１記載の宿主細胞。

【請求項3】

前記宿主細胞が、腸内細菌科に属する微生物である、請求項１または２記載の宿主細胞。

【請求項4】

第１の追加異種発現単位を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の宿主細胞であって、
該第１の追加異種発現単位が、以下：
（ａ１）メチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｂ１）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター；
を含む、宿主細胞。

【請求項5】

第２の追加異種発現単位を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の宿主細胞であって、
該第２の追加異種発現単位が、以下：
（ａ２）メバロン酸経路に関与する酵素をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｂ２）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター；
を含む、宿主細胞。

【請求項6】

前記宿主細胞がエシェリヒア属に属する微生物である、請求項３記載の宿主細胞。

【請求項7】

前記宿主細胞がエシェリヒア・コリである、請求項６記載の宿主細胞。

【請求項8】

前記宿主細胞が、パントエア属に属する微生物である、請求項３記載の宿主細胞。

【請求項9】

前記宿主細胞がパントエア・アナナティスである、請求項８記載の宿主細胞。

【請求項10】

前記宿主細胞が、ｃｒｔオペロンが破壊されたゲノム領域を含む、請求項１〜９のいずれか一項記載の宿主細胞。

【請求項11】

第３の追加異種発現単位を含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の宿主細胞であって、
該第３の追加異種発現単位が、以下：
（ａ３）イソプレンシンターゼをコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｂ３）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター；
を含む、宿主細胞。

【請求項12】

以下を含む、メバロン酸キナーゼの製造方法：
請求項１〜１１のいずれか一項記載の宿主細胞を培養すること；ならびに
培養物からメバロン酸キナーゼを抽出または精製すること。

【請求項13】

以下を含む、メバロン酸−５−リン酸の製造方法：
メバロン酸またはメバロン酸前駆体の存在下で請求項１〜１１のいずれか一項記載の宿主細胞を培養すること；ならびに
培養物からメバロン酸−５−リン酸を抽出または精製すること。

【請求項14】

以下を含む、イソプレノイド化合物の製造方法：
請求項１〜１１のいずれか一項記載の宿主細胞を培養すること；ならびに
培養物からイソプレノイド化合物を抽出または精製すること。

【請求項15】

イソプレノイド化合物がイソプレンモノマーである、請求項１４記載の方法。

【請求項16】

以下を含む、イソプレンポリマーの製造方法：
請求項１４記載の方法によりイソプレンモノマーを調製すること；ならびに
イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。

【請求項17】

以下（Ａ）および（Ｂ）を含む、ゴム組成物の製造方法：
（Ａ）請求項１６記載の方法によりイソプレンポリマーを調製すること；
（Ｂ）前記イソプレンポリマーを１以上のゴム組成物成分と混合すること。

【請求項18】

以下（ｉ）および（ｉｉ）を含む、タイヤの製造方法：
（ｉ）請求項１７記載の方法によりゴム組成物を生成すること；
（ｉｉ）前記ゴム組成物を利用してタイヤを製作すること。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、メバロン酸キナーゼ、メバロン酸−５−リン酸、およびイソプレノイド化合物を調製するために使用され得る宿主細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

タイヤ業界及びゴム工業界において、天然ゴムは非常に重要な原材料である。新興国を中心とするモータリゼーションで今後需要が拡大していく中で、森林伐採規制やパーム栽培との競合でゴムに特化した農園数の増加は困難である。したがって、需給バランスはタイトになっていくことが予想される。天然ゴムの代替として、合成ポリイソプレンがある。ポリイソプレンの原料モノマー（イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン））は、主にナフサのクラッキングにより得られたＣ５留分から抽出することで得られる。しかし近年、クラッカーのフィードのライト化に伴い、イソプレンの生産量は減少傾向にあり、信頼ある供給が懸念されている。また、近年では石油価格が生産に大きく影響することから、イソプレンモノマーの安定した確保のために、非石油資源由来でイソプレンを安価に生産する系の確立が要望されている。

【0003】

このような要望に鑑み、単離された葛又はポプラ由来のイソプレンシンターゼ遺伝子及びこれらの変異体を発酵生産用の菌に組み込むことにより得られる形質転換体を用いて、イソプレンモノマーを生産する方法が、特許文献１および２に記載されている。メバロン酸経路の酵素であるメバロン酸キナーゼはメバロン酸経路の代謝産物であるＤＭＡＰＰによる阻害を受けることが、非特許文献１に記載されている。

【0004】

単離されたメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）由来のメバロン酸キナーゼを発酵生産菌に組み込むことにより得られる形質転換体を用いてイソプレンモノマーを生産する方法が、特許文献３に記載されている。また、放線菌、乳酸菌由来のメバロン酸キナーゼを発酵生産菌に組み込むことにより得られる形質転換体を用いてイソプレンモノマーを生産する方法が、特許文献４に記載されている。

【0005】

また、非特許文献２に記載されているように、イソプレンはイソプレノイド類の一種であり、イソプレノイド類を微生物で発酵生産させる際に、メバロン酸キナーゼにより触媒される反応が律速段階である。

【0006】

他の関連する記載は、特許文献３および４、ならびに非特許文献３〜５に見出すことができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特表２０１１−５０５８４１号公報

【特許文献2】特表２０１１−５１８５６４号公報

【特許文献3】国際公開第２０１０／０３１０６２号

【特許文献4】国際公開第２０１０／０３１０７７号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｙｕｌｉｙａ Ａ．ら、ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、第７７巻（第２１号）、第７７７２−７７７８頁、２０１１年

【非特許文献2】Ｍａｒｔｉｎ ＶＪ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第２１巻（第７号），第７９６−８０２頁、２００３年

【非特許文献3】Ｋｅｓｓｅｌｍｅｉｅｒ Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３３巻、第２３−８８頁、１９９９

【非特許文献4】Ｍｏｎｓｏｎ Ｒ．Ｋ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第９８巻、第１１７５〜１１８０頁、１９９２年

【非特許文献5】Ｋｕｚｍａ Ｊ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第１０１巻、第４３５〜４４０頁、１９９３年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、種々の例示的な実施形態において、イソプレンモノマーの代替的な製造方法を提供するである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは鋭意研究した結果、所定の微生物由来のメバロン酸キナーゼが、イソプレンモノマーの生産に使用できることを発見した。

【0011】

本発明の種々の例示的な実施形態を採用して、イソプレンモノマーの優れた生産系を樹立することができる。

【0012】

種々の例示的な実施形態では、本発明の宿主細胞は、異種発現単位を含む。実施形態では、異種発現単位は、（ａ）メタノセラ属、コリネバクテリウム属、メタノセタ属、およびニトロソプミラス属より選ばれる属に属する微生物由来のメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド；ならびに（ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

【0013】

種々の例示的な実施形態では、本発明の宿主細胞において、メバロン酸キナーゼをコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号６、および配列番号９からなる群より選ばれるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するメバロン酸キナーゼをコードする。

【0014】

種々の例示的な実施形態では、本発明の宿主細胞は、腸内細菌科に属する微生物である。

【0015】

種々の例示的な実施形態では、本発明の宿主細胞は、第１の追加異種発現単位を含む。実施形態では、第１の追加異種発現単位は、（ａ１）メチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素をコードするポリヌクレオチド；ならびに（ｂ１）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

【0016】

種々の例示的な実施形態では、本発明の宿主細胞は、第２の追加異種発現単位を含む。実施形態では、第２の追加異種発現単位は、（ａ２）メバロン酸経路に関与する酵素をコードするポリヌクレオチド；ならびに（ｂ２）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

【0017】

種々の例示的な実施形態では、本発明の宿主細胞は、エシェリヒア属に属する微生物である。

【0018】

種々の例示的な実施形態では、本発明の宿主細胞は、エシェリヒア・コリである。

【0019】

種々の例示的な実施形態では、本発明の宿主細胞は、パントエア属に属する微生物である。

【0020】

種々の例示的な実施形態では、本発明の宿主細胞は、パントエア・アナナティスである。

【0021】

種々の例示的な実施形態では、本発明の宿主細胞は、ｃｒｔオペロンが破壊されたゲノム領域を含む。

【0022】

種々の例示的な実施形態では、本発明の宿主細胞は、第３の追加異種発現単位を含む。実施形態では、第３の追加異種発現単位は、（ａ３）イソプレンシンターゼをコードするポリヌクレオチド；ならびに（ｂ３）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

【0023】

種々の例示的な実施形態では、本発明のメバロン酸キナーゼの製造方法は、本発明の例示的な宿主細胞を培養すること、ならびに培養物からメバロン酸キナーゼを抽出または精製することを含む。

【0024】

種々の例示的な実施形態では、本発明のメバロン酸−５−リン酸の製造方法は、メバロン酸またはメバロン酸前駆体の存在下で本発明の例示的な宿主細胞を培養すること、ならびに培養物からメバロン酸−５−リン酸を抽出または精製することを含む。メバロン酸前駆体の例は、アセチル−ＣｏＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡおよびＨＭＧ−ＣｏＡである。

【0025】

種々の例示的な実施形態では、本発明のイソプレノイド化合物の製造方法は、本発明の例示的な宿主細胞を培養すること、ならびに培養物からイソプレノイド化合物を抽出または精製することを含む。

【0026】

種々の例示的な実施形態では、本発明のイソプレノイド化合物の製造方法は、イソプレンモノマーの製造に関する。

【0027】

種々の例示的な実施形態では、本発明のイソプレンポリマーの製造方法は、本発明の例示的な方法によりイソプレンモノマーを調製すること、ならびにイソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成することを含む。

【0028】

種々の例示的な実施形態では、本発明のポリマーは、本発明の例示的な方法により製造されるイソプレノイド化合物を重合することにより得られる。

【0029】

種々の例示的な実施形態では、本発明のゴム組成物は、本発明の例示的なポリマーを含む。

【0030】

種々の例示的な実施形態では、本発明のタイヤは、本発明のゴム組成物から調製される。

【0031】

本発明のより完全な理解、およびそれに付属する多くの利点は、容易に受け入れられる。なぜならば、これらは、添付の図面と関連付けて考慮するとき、以降の詳細な説明を参照することにより、より良く理解されるためである。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】図１は、ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ プラスミドの模式図である。

【図2】図２は、ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）の模式図である。

【図3】図３は、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）の模式図である。

【図4】図４は、ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）染色体改変体の構築の模式図である。Ａ）ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０ ＰＣＲ生成ＤＮＡフラグメントによるａｍｐＣ遺伝子のλＲｅｄ依存性置換。Ｂ）ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）プラスミドのｐｈｉ８０Ｉｎｔ依存性組込み。Ｃ）ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）のベクター部分のｐｈｉ８０Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性除去。

【図5】図５は、ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ染色体改変体の構築の模式図である。Ａ）ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０ ＰＣＲ生成ＤＮＡフラグメントによるａｍｐＨ遺伝子のλＲｅｄ依存性置換。Ｂ）ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳプラスミドのｐｈｉ８０Ｉｎｔ依存性組込み。Ｃ）ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳのベクター部分のｐｈｉ８０Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性除去。

【図6】図６は、ｐＥＡ３２０メガプラミドのΔｃｒｔ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）改変体の構築の模式図である。Ａ）ｐＥＡ３２０メガプラスミド中に配置されたＰ．ａｎａｎａｔｉｓ ｃｒｔローカスの構造。Ｂ）ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０ ＰＣＲ生成ＤＮＡフラグメントによるｃｒｔオペロンのλＲｅｄ依存性置換。Ｃ）ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）プラスミドのｐｈｉ８０Ｉｎｔ依存性組込み。Ｄ）ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）のベクター部分のｐｈｉ８０Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性除去。

【図7】図７は、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ組込み型発現ベクターの模式図である。

【図8】図８は、メバロン酸キナーゼ遺伝子を保有する組込み型プラスミドの模式図である。

【図9】図９は、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｘ）プラスミドのｐｈｉ８０Ｉｎｔ依存性組込みの模式図である。

【図10】図１０は、ＭＶＫ導入株ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｍａ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｃｌ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｃｖａ）、およびＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｎｍｒ）のジャー培養による経時的増殖を示す図である。

【図11】図１１は、ＭＶＫ導入株ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｍａ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｃｌ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｃｖａ）、およびＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｎｍｒ）のジャー培養によるイソプレン生産量（ｍｇ）を示す図である。

【図12】図１２は、ＭＶＫ導入株ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｓｃｅ）、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｍａ）、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）、およびＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｃｌ）のジャー培養による経時的増殖を示す図である。

【図13】図１３は、ＭＶＫ導入株ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｓｃｅ）、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｍａ）、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）、およびＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｃｌ）のジャー培養によるイソプレン生産量（ｍｇ）を示す図である。

【図14】図１４は、各精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。ｃｖａ（５μｇ）、ｍｃｌ（３μｇ）、ｍｍａ（３μｇ）、ｍｐｄ（３μｇ）、ｎｍｒ（３μｇ）、ｓｃｅ（３μｇ）由来の酵素を、１０％ゲルにロードした。ＣＢＢ−Ｒ２５０を染色に用いた。

【図15】図１５は、各酵素の活性（テルペニル二リン酸（ｔｅｒｐｅｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）無しの酵素活性を１００％としたときの各酵素の相対活性）に対するＤＭＡＰＰ、ＧＰＰ、およびＦＰＰのそれぞれの効果を示す図である。

【図16】図１６は、各ＭＶＫの活性に対するＤＰＭの効果を示す図である。酵素活性は、１ｍＭ ＤＰＭを反応液に添加することにより測定した。同様に測定したＤＰＭ無しの活性をコントロールとして用いて、相対活性を示した。

【図17】図１７は、ｍｃｌ由来酵素活性に対するＩＰおよびＤＭＡＰＰのそれぞれの添加の影響を示す図である。

【図18】図１８は、精製ＰＭＫのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。５μｇのタンパク質を５〜２０％ゲルにロードした。

【図19】図１９は、各ＭＶＫに対する生成物阻害の試験を示す図を含む。酵素を反応液に添加し、次いで３８６ｎｍでの吸光度の減少をプロットした。矢印で示した時点で精製ＰＭＫを添加した。ＭＶＫにより生成したホスホメバロン酸のジホスホメバロン酸への変換を、３８６ｎｍでの吸光度により確認した。

【発明を実施するための形態】

【0033】

本発明の他の特徴は、本発明の説明のために提示され、かつそれに限定することを意図しない例示的な実施形態に関する以下の記載とともに明らかになる。

【0034】

本発明の実施形態は、イソプレンモノマーの代替的な製造方法を提供する。より具体的には、本発明の実施形態は、メタノセラ属、コリネバクテリウム属、メタノセタ属、またはニトロソプミラス属に属する微生物由来のメバロン酸キナーゼを発現する形質転換体；
形質転換体を用いてメバロン酸キナーゼを生成することを含む、メバロン酸キナーゼの製造方法；形質転換体を用いて、メバロン酸からメバロン酸−５−リン酸を生成することを含む、メバロン酸−５−リン酸の製造方法；形質転換体を用いてイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法などを提供する。

【0035】

したがって、本発明の種々の例示的な実施形態は、以下を含む。

【0036】

〔１〕メタノセラ属、コリネバクテリウム属、メタノセタ属、またはニトロソプミラス属に属する微生物由来のメバロン酸キナーゼを発現する形質転換体。

【0037】

〔２〕メバロン酸キナーゼが、配列番号１、配列番号３、配列番号６、または配列番号９のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつメバロン酸キナーゼ活性を有するタンパク質である、上記の形質転換体。

【0038】

〔３〕形質転換体が、腸内細菌科に属する微生物である、上記の形質転換体。

【0039】

〔４〕形質転換体が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、上記の形質転換体。

【0040】

〔５〕形質転換体が、メバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、上記の形質転換体。

【0041】

〔６〕形質転換体がエシェリヒア属に属する微生物である、上記の形質転換体。

【0042】

〔７〕形質転換体がエシェリヒア・コリである、上記の形質転換体。

【0043】

〔８〕形質転換体が、パントエア属に属する微生物である、上記の形質転換体。

【0044】

〔９〕形質転換体がパントエア・アナナティスである、上記の形質転換体。

【0045】

〔１０〕ｃｒｔオペロンが破壊されたゲノム領域を保有する、上記の形質転換体。

【0046】

〔１１〕イソプレンシンターゼをさらに発現する、上記の形質転換体。

【0047】

〔１２〕メバロン酸キナーゼを上記の形質転換体を用いて生成することを含む、メバロン酸キナーゼの製造方法。

【0048】

〔１３〕上記の形質転換体を用いて、メバロン酸からメバロン酸−５−リン酸を生成することを含む、メバロン酸−５−リン酸の製造方法。

【0049】

〔１４〕上記の形質転換体を用いてイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法。

【0050】

〔１５〕以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、イソプレンポリマーの製造方法：
（Ｉ）上記の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。

【0051】

勿論、本発明は、前述の例示的な実施形態に限定されることを意図するものではない。

【0052】

実施形態では、本発明は、メバロン酸キナーゼを発現する形質転換体を提供する。メバロン酸キナーゼは、形質転換体宿主に対して異種の生物由来の遺伝子によりコードされ、例えば、メタノセラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノセタ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ）属、またはニトロソプミラス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ）属に属する微生物に由来する。好ましくは、メバロン酸キナーゼは、コリネバクテリウム・ヴァリアビル（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ）、メタノセラ・パルディコラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）、メタノセタ・コンキリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ ｃｏｎｃｉｌｉｉ）、またはニトロソプミラス・マリチマス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）に属する微生物に由来する。

【0053】

一実施形態では、メバロン酸キナーゼは、メタノセラ属に由来し得る配列番号１、コリネバクテリウムに由来し得る配列番号３、メタノセタ属に由来し得る配列番号６またはニトロソプミラス属に由来し得る配列番号９のアミノ酸配列に対して７０％以上のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつメバロン酸キナーゼ活性を有するタンパク質である。アミノ酸配列同一性％は、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。メバロン酸キナーゼ活性とは、メバロン酸をリン酸化してメバロン酸−５−リン酸を生成する活性（ＥＣ番号２．７．１．３６）をいう（以下同様）。

【0054】

アミノ酸配列の同一性％および後述するような塩基配列の同一性％は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡアルゴリズム（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、塩基配列およびアミノ酸配列の同一性％を計算してもよい。また、アミノ酸配列の相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ Ｓｉｚｅ ｔｏ Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。塩基配列およびアミノ酸配列の同一性％として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。

【0055】

別の実施形態では、メバロン酸キナーゼは、配列番号１、配列番号３、配列番号６または配列番号９のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が変異しているアミノ酸配列を含み、かつメバロン酸キナーゼ活性を有するタンパク質である。アミノ酸残基の変異としては、例えば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入が挙げられる。１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個もしくは数個」は、タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。タンパク質の場合における用語「１もしくは数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個であり得る。メバロン酸キナーゼは、ヒスチジンタグ等の精製用タグを有していてもよい。

【0056】

メバロン酸キナーゼは、同一条件で測定された場合、配列番号１、配列番号３、配列番号６または配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質のメバロン酸キナーゼ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。既知の方法を用いてメバロン酸キナーゼ活性を測定することができる（例、Ａｎｄｒｅａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３，１６４６１−１６４６６，２００４；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７，３７１５−３７２４，２００８；Ｐｒｉｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７，７７７２−７７７８）。

【0057】

また、メバロン酸キナーゼは、イソプレノイド生合成経路中の基質（例、ホスホメバロン酸、ジホスホメバロン酸、イソペンテニル二リン酸、ジメチルアリルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸、ファルネシルピロリン酸）によるフィードバック阻害の解除能を有するものが好ましく（Ｐｒｉｍａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７，７７７２−７７７８）、例えば、同一条件で測定された場合、配列番号１、配列番号３、配列番号６または配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質が保有するフィードバック阻害の解除能の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上のフィードバック阻害の解除能を有することが好ましい。

【0058】

メバロン酸キナーゼでは、目的活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に自明である（Ｂａｉら、米国特許出願公開第２００７０１４１６８５号公報、同第２００７０２８６８５０号公報）。具体的には、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号９、および配列番号１２のアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。

【0059】

アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。

【0060】

本発明の形質転換体の実施形態は、上記メバロン酸キナーゼ等の所望のタンパク質用の発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。実施形態では、所望のタンパク質を発現する本発明の形質転換体は、発現ベクター中に含まれる、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む。発現単位では、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびプロモーターの一方は、宿主細胞に固有のものではない。したがって、発現単位は、異種発現単位であり得る。好ましくは、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびプロモーターの双方が、宿主細胞に固有のものではない。プロモーターは、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して同種であっても異種であってもよい。発現単位はさらに、ターミネーター、リボソーム結合部位、および薬物耐性遺伝子等のさらなるエレメントを含んでいてもよい。発現単位はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。所望のタンパク質としては、例えば、メバロン酸キナーゼ、イソプレンシンターゼ、メチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素、およびメバロン酸経路に関与する１以上の酵素が挙げられるが、これらに限定されない。

【0061】

実施形態では、発現ベクターにおいて、メバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば、メタノセラ属に由来し得る配列番号２、コリネバクテリウムに由来し得る配列番号４または配列番号５、メタノセタ属に由来し得る配列番号７または配列番号８、あるいはニトロソプミラス属に由来し得る配列番号１０または配列番号１１の塩基配列と７０％以上の塩基配列同一性を有する塩基配列を含み、かつメバロン酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。塩基配列同一性％は、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。

【0062】

実施形態では、メバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドはまた、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、または配列番号１１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつメバロン酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、このような条件は、高い同一性を有する実質的に同一のポリヌクレオチド同士、例えば上述した同一性％を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。

【0063】

実施形態では、本発明の形質転換体はまた、イソプレンシンターゼ（ＥＣ：４．２．３．２７）を発現していてもよい。イソプレンシンターゼとしては、例えば、葛（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ）、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）、ムクナ（Ｍｕｃｕｎａ ｂｒａｃｔｅａｔａ）由来イソプレンシンターゼを用いることができる。

【0064】

一実施形態では、イソプレンシンターゼは、例えば、以下のタンパク質であってもよい：
１）葛に由来し得る全長タンパク質（配列番号１５のアミノ酸配列）；
２）上記１）の全長タンパク質から葉緑体移行シグナルが除去されたタンパク質（配列番号１５のアミノ酸配列において１〜４５番目のアミノ酸残基が除去されたアミノ酸配列）；
３）ポプラに由来し得る全長タンパク質（配列番号９８のアミノ酸配列）；
４）上記３）の全長タンパク質から葉緑体移行シグナルが除去されたタンパク質（配列番号９８のアミノ酸配列において１〜３７番目のアミノ酸残基が除去されたアミノ酸配列）；
５）ムクナに由来し得る全長タンパク質（配列番号９９のアミノ酸配列）；および
６）上記５）の全長タンパク質から葉緑体移行シグナルが除去されたタンパク質（配列番号９９のアミノ酸配列において１〜４４番目のアミノ酸残基が除去されたアミノ酸配列）。

【0065】

好ましい実施形態では、イソプレンシンターゼは、葛に由来し得る。別の好ましい実施形態では、イソプレンシンターゼは、ポプラに由来し得る。さらに別の好ましい実施形態では、イソプレンシンターゼは、ムクナに由来し得る。

【0066】

別の実施形態では、イソプレンシンターゼは、上記１）〜６）のタンパク質のアミノ酸配列に対して７０％以上のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質である。アミノ酸配列同一性％は、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。イソプレンシンターゼ活性とは、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からイソプレンを生成する活性をいう（以下同様）。既知の方法を用いてイソプレンシンターゼ活性を測定することができる（例、Ｓｈａｒｋｅｙ ＴＤ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１３７，７００−７１２，２００５）。

【0067】

さらに別の実施形態では、イソプレンシンターゼは、上記１）〜６）のタンパク質のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が変異しているアミノ酸配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質である。アミノ酸残基の変異としては、例えば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入が挙げられる。１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個もしくは数個」は、タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。タンパク質の場合における用語「１もしくは数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個である。メバロン酸キナーゼは、ヒスチジンタグ等の精製用タグを有していてもよい。

【0068】

イソプレンシンターゼでは、同一条件で測定された場合、上記１）〜６）のタンパク質のイソプレンシンターゼ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を好ましくは有し得る。また、イソプレンシンターゼは、安定性の観点から、所定の緩衝液〔例、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０，１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２溶液〕中で４℃にて４８時間保存した場合に、残存活性が３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上または６５％以上であることが好ましい。

【0069】

イソプレンシンターゼは、目的活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に自明である。具体的には、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、イソプレンシンターゼのアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、上述したような保存的置換であってもよい。

【0070】

本発明の例示的な形質転換体の作製に利用されるメバロン酸キナーゼ等の所望のタンパク質用の発現ベクターは、宿主においてタンパク質を発現させる細胞発現用ベクターである。発現ベクターはまた、非組込み型ベクター（例、プラスミド、ファージ、人工染色体）、または組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。

【0071】

細胞発現用ベクターとしては、宿主に適した公知の発現ベクターが用いられる。例えば、大腸菌においてはｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥ１系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミドが挙げられる。その他、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等を有する発現ベクターも挙げられる。

【0072】

細胞発現用ベクターを用いたタンパク質合成については、後述する。

【0073】

細胞発現用ベクターを用いて合成されたタンパク質を精製してもよい。精製方法としては、塩析法や各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。発現ベクターが目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ等のタグ配列を発現するように設計されている場合には、ニッケルやコバルト等、このタグに親和性を有する物質を用いたアフィニティーカラムによる精製方法を利用してもよい。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等、適宜組み合わせて精製のために利用してもよい。

【0074】

本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターが宿主に導入されたものである。宿主は、例えば腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する細菌等の細菌又は真菌であってもよい。また、細菌は、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。

【0075】

グラム陽性細菌としては、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌等が挙げられ、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が好ましい。

【0076】

バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）等が挙げられ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。

【0077】

コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）等が挙げられ、コリネバクテリウム・グルタミカムがより好ましい。

【0078】

グラム陰性細菌としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属細菌、ビブリオ（Ｖｉｖｒｉｏ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌等が挙げられ、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が好ましい。

【0079】

エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。

【0080】

パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌としては、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）等が挙げられ、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）が好ましい。また、パントエア属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された株を使用してもよい。パントエア属細菌の代表的な株としては、例えば、欧州特許出願公開０９５２２２１号に開示されるパントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）およびパントエア・アナナティスＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５）が挙げられる。

【0081】

エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられ、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｇｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）が好ましい。また、エンテロバクター属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された菌株を使用してもよい。エンテロバクター属細菌の代表的な株としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランスＡＴＣＣ１２２８７株、エンテロバクター・アエロゲネスＡＴＣＣ１３０４８株、エンテロバクター・アエロゲネスＮＢＲＣ１２０１０株（Ｓａｋａｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．９８，ｐｐ．３４０−３４８，２００７）、エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５５）株等が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７株は、２００７年８月２２日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３４８として寄託され、２００８年３月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５５の受領番号が付与されている。

【0082】

真菌としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物等が挙げられ、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物が好ましい。

【0083】

サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。

【0084】

シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）が好ましい。

【0085】

ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の微生物としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が好ましい。

【0086】

トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物としては、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｔｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）が挙げられ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が好ましい。

【0087】

その他、本発明に用いられる宿主としては、イソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸の合成に関与するメバロン酸（ＭＶＡ）経路および／またはメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路によるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の合成能を備えていれば特に限定されず、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等であってもよい。

【0088】

表現「ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の合成能」は、Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ｃ Ｙ Ｃｈａｎｇ およびＪａｙ Ｄ Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２，６７４−６８１（２００６）を参照して用いることができる。

【0089】

表現「メバロン酸（ＭＶＡ）経路」は、Ｋｕｚｕｙａｍａ ＴおよびＳｅｔｏ Ｈ， Ｐｒｏｃ Ｊｐｎ Ａｃａｄ Ｓｅｒ Ｂ Ｐｈｙｓ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．８８，４１−５２（２０１２）；Ｍｉｚｉｏｒｋｏ ＨＭ，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．５０５，１３１−１４３（２０１１）を参照して用いることができる。

【0090】

表現「メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路」は、Ｋｕｚｕｙａｍａ ＴおよびＳｅｔｏ Ｈ，Ｐｒｏｃ Ｊｐｎ Ａｃａｄ Ｓｅｒ Ｂ Ｐｈｙｓ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．８８，４１−５２（２０１２）；Ｇｒaｗｅｒｔ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６８，３７９７−３８１４（２０１１）を参照して用いることができる。

【0091】

本発明の形質転換体の実施形態では、さらにイソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を合成する経路が強化されていてもよい。このような強化のため、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）への変換能を有するイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼの発現ベクターが、本発明の形質転換体に導入されてもよい。また、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰの生成に関連するメバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の発現ベクターが、本発明の形質転換体に導入されてもよい。このような酵素の発現ベクターは、プラスミド、または組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。このような酵素の発現ベクターはまた、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。このような酵素の発現ベクターはさらに、メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する複数（例、１種、２種、３種または４種以上）の酵素を発現するものであってもよく、例えば、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現ベクターであってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の由来は、宿主に対して同種であってもよいし、異種であってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素の由来が宿主に対して異種である場合、例えば、宿主が上述したような細菌（例、大腸菌）であり、かつ、メバロン酸経路に関与する少なくとも１つの酵素が真菌（例、サッカロミセス・セレビシエ）に由来するものであってもよい。また、宿主が、メチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素を固有に産生するものである場合、宿主に導入される発現ベクターは、メバロン酸経路に関与する１または複数（例、１種、２種、３種または４種以上）の酵素を発現するものであってもよい。

【0092】

イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ（ＥＣ:５．３．３．２）としては、例えば、Ｉｄｉ１ｐ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１５２０８）、ＡＴ３Ｇ０２７８０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１８６９２７）、ＡＴ５Ｇ１６４４０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１９７１４８）、およびＩｄｉ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１７３６５）が挙げられる。

【0093】

メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関与する酵素としては、例えば、メバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．１．３６；例１、Ｅｒｇ１２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１３９３５；例２、ＡＴ５Ｇ２７４５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿００１１９０４１１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．４．２；例１、Ｅｒｇ８ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１３９４７；例２、ＡＴ１Ｇ３１９１０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿００１１８５１２４）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３３；例１、Ｍｖｄ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１４４４１；例２、ＡＴ２Ｇ３８７００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１８１４０４；例３、ＡＴ３Ｇ５４２５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿５６６９９５）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．９；例１、Ｅｒｇ１０ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１５２９７；例２、ＡＴ５Ｇ４７７２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿００１０３２０２８；例３、ＡＴ５Ｇ４８２３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿５６８６９４）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ：２．３．３．１０；例１、Ｅｒｇ１３ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１３５８０；例２、ＡＴ４Ｇ１１８２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１９２９１９；例３、ＭｖａＳ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＡＡＧ０２４３８）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．３４；例１、Ｈｍｇ２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１３５５５；例２、Ｈｍｇ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１３６３６；例３、ＡＴ１Ｇ７６４９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１７７７７５；例４、ＡＴ２Ｇ１７３７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１７９３２９、ＥＣ：１．１．１．８８、例、ＭｖａＡ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ Ｐ１３７０２）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：２．３．１．９／１．１．１．３４、例、ＭｖａＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＡＡＧ０２４３９）が挙げられる。

【0094】

メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関与する酵素としては、例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．２．１．７、例１、Ｄｘｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１４９５４；例２、ＡＴ３Ｇ２１５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿５６６６８６；例３、ＡＴ４Ｇ１５５６０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１９３２９１；例４、ＡＴ５Ｇ１１３８０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿００１０７８５７０）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ（ＥＣ：１．１．１．２６７；例１、Ｄｘｒ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１４７１５；例２、ＡＴ５Ｇ６２７９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿００１１９０６００）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＥＣ：２．７．７．６０；例１、ＩｓｐＤ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１７２２７；例２、ＡＴ２Ｇ０２５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿５６５２８６）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．１４８；例１、ＩｓｐＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１５７２６；例２、ＡＴ２Ｇ２６９３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１８０２６１）、２−Ｃ−メチル―Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロニリン酸シンターゼ（ＥＣ：４．６．１．１２；例１、ＩｓｐＦ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１７２２６；例２、ＡＴ１Ｇ６３９７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿５６４８１９）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−ニリン酸シンターゼ（ＥＣ：１．１７．７．１；例１、ＩｓｐＧ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１７０１０；例２、ＡＴ５Ｇ６０６００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿００１１１９４６７）、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２；例１、ＩｓｐＨ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１４５７０；例２、ＡＴ４Ｇ３４３５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿５６７９６５）が挙げられる。

【0095】

遺伝子が組込まれた発現ベクターの宿主への導入（形質転換）は、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。

【0096】

更に、本発明の形質転換体において、イソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸を合成するメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路の酵素をコードする遺伝子が導入されていてもよい。

【0097】

係る酵素としては、ピルビン酸塩とＤ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェートを１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−ホスフェートに転換する１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−ホスフェートシンターゼ；イソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リン酸に転換するイソペンチルジホスフェートイソメラーゼ等が挙げられる。

【0098】

本発明の形質転換体の実施形態では、１箇所または複数（例、２、３、４または５箇所）の特定のゲノム領域（例、コーディングまたはノンコーディング領域）が、破壊されていてもよい。このようなゲノム領域としては、例えば、ｃｒｔオペロン（ポリプレニルシンテターゼ、ベータ−カロテンヒドロキシラーゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ、リコペンシクラーゼ等のイソプレノイド生合成経路をコードする）、ａｍｐ遺伝子（例、ａｍｐＣ遺伝子、またはａｍｐＨ遺伝子）が挙げられる。例えば、ｃｒｔオペロンの破壊は、イソプレノイド化合物の生成を抑制できるので有利であり得る。ａｍｐ遺伝子の破壊は、アンピシリン耐性遺伝子（薬剤耐性選択マーカー）が利用可能になるので有利であり得る。

【0099】

遺伝子について用語「破壊」とは、遺伝子よりコードされるタンパク質の機能または発現を低下または完全消失させるように、遺伝子コーディング領域が改変されることを意味する。オペロンについて用語「破壊」とは、オペロンの機能を低下または完全消失させるように、オペロンに対応するゲノム領域が改変されることを意味する。エンハンサーとして作用し得るオペロン（例、上述したｃｒｔオペロン）の機能が低下または完全消失すると、当該オペロンに作動可能に連結されている遺伝子によりコードされるタンパク質の発現が低下または完全消失し得る。一方、リプレッサーとして作用し得るオペロンの機能が低下または完全消失すると、当該オペロンに作動可能に連結されている遺伝子によりコードされるタンパク質の発現が向上し得る。当該改変としては、例えば、挿入、欠失および交換が挙げられるが、これらに限定されない。

【0100】

ゲノム領域は、例えば、既知の遺伝子ターゲティング法にしたがい上述の遺伝子（例、メバロン酸キナーゼ遺伝子）を当該ゲノム領域に導入することにより、破壊されてもよい。

【0101】

本発明の形質転換体からメバロン酸キナーゼを抽出・精製して用いてもよく、メバロン酸キナーゼを発現する形質転換体を培養してイソプレンを生産してもよい。

【0102】

＜メバロン酸−５−リン酸、イソプレノイド化合物およびイソプレンポリマーの製造方法＞
本発明の実施形態は、メバロン酸−５−リン酸の製造方法を含む。実施形態では、本発明のメバロン酸−５−リン酸の製造方法は、本発明の形質転換体を用いて、メバロン酸からメバロン酸−５−リン酸を生成することを含む。本発明のメバロン酸−５−リン酸の製造方法では、メバロン酸−５−リン酸の原料となるメバロン酸は、本発明の形質転換体により、培地中の炭素源から効率的に供給され得る。例えば、メバロン酸は、培地中の炭素源を素に、宿主内のメバロン酸経路等の生合成経路において合成されてもよい。あるいは、メバロン酸を培地に加えてもよい。

【0103】

本発明の実施形態はまた、イソプレノイド化合物の製造方法を含む。実施形態では、本発明のイソプレノイド化合物の製造方法は、本発明の形質転換体を用いて、イソプレノイド化合物を生成することを含む。

【0104】

イソプレノイド化合物は、分子式（Ｃ_５Ｈ_８）_ｎを有する１以上のイソプレン単位からなる。イソプレン単位の前駆体は、イソペンテニルピロリン酸、またはジメチルアリルピロリン酸である。３０，０００種のイソプレノイド化合物が同定されており、新たな化合物が同定されている。イソプレノイドはまた、テルペノイドとしても知られている。テルペンとテルペノイドとの相違は、テルペンが炭化水素であるのに対し、テルペノイドはさらなる官能基を含む点にある。テルペンは、分子中のイソプレン単位数により分類される〔例えば、ヘミテルペン（Ｃ５）、モノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セステルテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、セスカルテルペン（Ｃ３５）、テトラテルペン（Ｃ４０）、ポリテルペン、ノルイソプレノイド〕。モノテルペンとしては、例えば、ピネン、ネロール、シトラール、カンファー、メントール、リモネン、およびリナロールが挙げられる。セスキテルペンとしては、例えば、ネロリドール、およびファルネソールが挙げられる。ジテルペンとしては、例えば、フィトール、およびビタミンＡ１が挙げられる。スクアレンはトリテルペンの例であり、カロテン（プロビタミンＡ１）はテトラテルペンである（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２，６７４〜６８１（２００６）；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，２８３〜２９１（２００９）；Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３，９３７〜９４７（２００５）；Ａｄｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｍｏｌ（ＤＯＩ：１０．１００７／１０＿２０１４＿２８８）。好ましくは、イソプレノイド化合物は、イソプレンモノマーである。

【0105】

イソプレノイド化合物がイソプレンモノマーである場合、本発明の形質転換体は、培地中の炭素源から、イソプレンモノマーを主にアウトガスとして生産してもよいため、形質転換体により発生するガスを採取することにより、イソプレンモノマーが回収される。イソプレンモノマーの原料となるジメチルアリル二リン酸は、培地中の炭素源を素に、宿主内のメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路で合成されてもよい。あるいは、ジメチルアリル二リン酸を培地に加えてもよい。

【0106】

本発明の形質転換体を培養する培地としては、メバロン酸またはイソプレンに転換されるための炭素源を含むことが好ましい。炭素源としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物；ショ糖を加水分解した転化糖；グリセロール；メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、一酸化炭素、二酸化炭素等の炭素数が１の化合物（以下、Ｃ１化合物という。）；コーン油、パーム油、大豆油等のオイル；アセテート；動物油脂；動物オイル；飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸；脂質；リン脂質；グリセロ脂質；モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル；微生物性タンパク質、植物性タンパク質等のポリペプチド；加水分解されたバイオマス炭素源等の再生可能な炭素源；酵母エキス；又はこれらを組み合わせたものが挙げられる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加されてもよい。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。

【0107】

単糖類としては、ケトトリオース（ジヒドロキシアセトン）、アルドトリオース（グリセルアルデヒド）等のトリオース；ケトテトロース（エリトルロース）、アルドテトロース（エリトロース、トレオース）等のテトロース；ケトペントース（リブロース、キシルロース）、アルドペントース（リボース、アラビノース、キシロース、リキソース）、デオキシ糖（デオキシリボース）等のペントース；ケトヘキソース（プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）、アルドヘキソース（アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース）、デオキシ糖（フコース、フクロース、ラムノース）等のヘキソース；セドヘプツロース等のヘプトースが挙げられ、フルクトース、マンノース、ガラクトース、グルコース等のＣ６糖；キシロース、アラビノース等のＣ５糖の炭水化物が好ましい。

【0108】

二糖類としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等が挙げられ、スクロース、ラクトースが好ましい。

【0109】

オリゴ糖類としては、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；アカルボース、スタキオース等の四糖類；フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）等のその他のオリゴ糖類が挙げられる。

【0110】

多糖類としては、グリコーゲン、デンプン（アミロース、アミロペクチン）、セルロース、デキストリン、グルカン（β１，３−グルカン）が挙げられる。デンプン、セルロースが好ましい。

【0111】

微生物性タンパク質としては、酵母または細菌から得ることができるポリペプチドが挙げられる。

【0112】

植物性タンパク質としては、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁から得ることができるポリペプチドが挙げられる。

【0113】

脂質としては、Ｃ４以上の飽和または不飽和脂肪酸を１以上含む物質が挙げられる。

【0114】

オイルとしては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸が１以上含み、室温で液体の脂質が好ましく、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁、油性微生物細胞、ナンキンハゼ、又はこれらの２以上の組み合わせから得ることができる脂質が挙げられる。

【0115】

脂肪酸としては、式ＲＣＯＯＨ（「Ｒ」は炭化水素基を表す。）で表される化合物が挙げられる。

【0116】

不飽和脂肪酸は、「Ｒ」に少なくとも１の炭素−炭素二重結合を有する化合物であり、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライジン酸、アラキドン酸等が挙げられる。

【0117】

飽和脂肪酸は、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物であり、ドコサン酸、イコサン酸、オクタデカン酸、ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、ドデカン酸等が挙げられる。

【0118】

中でも、脂肪酸としては、１以上のＣ２からＣ２２の脂肪酸が含まれるものが好ましく、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸が含まれるものがより好ましい。

【0119】

また、炭素源としては、これら脂肪酸の塩、誘導体、誘導体の塩も挙げられる。塩としては、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。

【0120】

また、炭素源としては、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、グリセリン脂肪酸エステルとグルコース等の炭水化物との組み合わせが挙げられる。

【0121】

再生可能な炭素源としては、加水分解されたバイオマス炭素源が挙げられる。

【0122】

バイオマス炭素源としては、木、紙、及びパルプの廃材、葉状植物、果肉等のセルロース系基質；柄、穀粒、根、塊茎等の植物の一部分が挙げられる。

【0123】

バイオマス炭素源として用いられる植物としては、コーン、小麦、ライ麦、ソルガム、トリティケイト、コメ、アワ、大麦、キャッサバ、エンドウマメ等のマメ科植物、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、タピオカ等が挙げられる。

【0124】

バイオマス等の再生可能な炭素源を細胞培地に添加する際には、前処理することが好ましい。前処理としては、酵素的前処理、化学的前処理、酵素的前処理と化学的前処理の組み合わせが挙げられる。

【0125】

再生可能な炭素源を細胞培地に添加する前に、その全部または一部を加水分解することが好ましい（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，４８，３７１３−３７２９，２００９）。

【0126】

また、炭素源としては、酵母エキス、または酵母エキスと、グルコース等の他の炭素源との組み合わせが挙げられ、酵母エキスと、二酸化炭素やメタノール等のＣ１化合物との組み合わせが好ましい。

【0127】

本発明に関する形質転換体の例示的な培養方法としては、細胞を生理食塩水と栄養源を含む標準的培地で培養することが好ましい。

【0128】

培養培地としては、特に限定されず、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス等の一般的に市販されている既成の培地が挙げられる。特定の宿主の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。

【0129】

細胞培地には適切な炭素源の他に、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、及び培養に適していること、またはイソプレン産出を促進することが当業者にとって公知の成分が含まれていることが望ましい。

【0130】

本発明の形質転換体において、目的タンパク質の発現を維持するために、糖、金属塩、抗菌物質等を培地に添加しておくことが好ましい。

【0131】

本発明の形質転換体の培養条件としては、目的タンパク質の発現が可能な条件であれば、特に限定されず、標準的な細胞培養条件を用いることができる。

【0132】

培養温度としては、２０℃〜３７℃が好ましく、ガス組成としては、ＣＯ_２濃度が約６％〜約８４％であることが好ましく、ｐＨが、約５〜約９であることが好ましい。

【0133】

形質転換体は、好ましくは、宿主の性質に応じて好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養される。

【0134】

形質転換体の培養方法としては、例えば、バッチ培養法、流加培養法、連続培養法等の公知の発酵方法を用いて培養する方法が挙げられる。

【0135】

バッチ培養法は、発酵開始時に培地組成物に仕込み、宿主を培地に植菌し、ｐＨや酸素濃度等の制御を行いながら形質転換体の培養を行う方法である。

【0136】

バッチ培養法による形質転換体の培養において、形質転換体は、穏やかな誘導期から対数増殖期を経て最終的に成長速度が減少または停止する定常期に至る。イソプレンは、対数増殖期や定常期の形質転換体によって産出される。

【0137】

流加培養法では、上述したバッチ法に加えて、発酵プロセスが進行するに従い徐々に炭素源が添加される。流加培養法は、カタボライト抑制により形質転換体の代謝が抑制される傾向があり、培地中の炭素源の量を制限することが好ましいときに有効である。流加培養法は、制限された量または過剰な量のグルコース等の炭素源を用いて行うことができる。

【0138】

連続培養法では、一定の速度でバイオリアクターに所定量の培地を連続的に供給しながら、同時に同量の培養液が抜き取られる。連続培養法では培養物を一定の高密度に保つことができ、培養液中の形質転換体は主に対数増殖期にある。

【0139】

適宜、培地の一部または全部を入れ換えることにより、栄養素の補給を行うことができ、形質転換体の生育に悪影響を及ぼす可能性のある代謝副産物、及び死細胞の蓄積を防ぐことができる。

【0140】

発現ベクターが有するプロモーターとしては、構成的プロモーターや誘導的プロモーターが挙げられる。発現ベクターがｌａｃプロモーター等の誘導的プロモーターを有している場合には、培養液中に、例えばＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を添加して、目的タンパク質の発現を誘導してもよい。

【0141】

本発明の形質転換体を培養することにより得られるイソプレンモノマーの生産量の評価方法としては、例えば、ヘッドスペース法により気相を採取し、この気相をガスクロマトグラフィー法で分析する方法が挙げられる。

【0142】

詳細には、密封したバイアル中で形質転換体を含む培養液を振蕩しながら培養したときのヘッドスペース中のイソプレンモノマーを、標準的なガスクロマトグラフィーを用いて分析する。次いで、検量線を用いて、ガスクロマトグラフィー測定カーブから得られる面積を、形質転換体のイソプレンモノマー生産量に換算する。

【0143】

本発明の形質転換体を培養することにより得られるイソプレンモノマーの回収方法としては、例えば、ガスストリッピング、分留、或いは、固相に吸着させたイソプレンモノマーの熱若しくは真空による固相からの脱着、又は溶媒による抽出等が挙げられる。

【0144】

ガスストリッピングでは、アウトガスから連続的にイソプレンガスを除去する。このようなイソプレンガスの除去は種々の方法で行うことができ、固相への吸着、液相への分離、又はイソプレンガスを直接凝縮させる方法が挙げられる。

【0145】

イソプレンモノマーは、一段階又は多段階で回収することができる。イソプレンモノマーを一段階で回収する場合には、アウトガスからのイソプレンモノマーの分離と、イソプレンモノマーの液相への変換を同時に行う。イソプレンモノマーをアウトガスから直接凝縮させて液相にすることもできる。イソプレンモノマーを多段階で回収する場合には、オフガスからのイソプレンモノマーの分離と、イソプレンモノマーの液相への変換とを順次行う。例えば、イソプレンモノマーを固相に吸着させ、溶媒で固相から抽出する方法が挙げられる。

【0146】

イソプレンモノマーの例示的な回収方法は、イソプレンモノマーを精製する工程をさらに含んでいてもよい。精製工程としては、液相抽出物からの蒸留による分離や各種クロマトグラフィーが挙げられる。

【0147】

本発明の実施形態は、イソプレンポリマーの製造方法を含む。本発明のイソプレンポリマーの製造方法は、以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含んでいてもよい：
（Ｉ）本発明の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。

【0148】

工程（Ｉ）は、上述した本発明のイソプレンモノマーの製造方法と同様にして行うことができる。工程（ＩＩ）におけるイソプレンモノマーの重合は、当該分野で公知の任意の方法（例、有機化学における付加重合等の合成法）により行うことができる。

【0149】

＜ゴム組成物の製造方法＞
実施形態では、本発明のゴム組成物は、本発明のイソプレンの例示的な製造方法により製造されるイソプレンに由来するポリマーを含む。イソプレンに由来するポリマーは、同種ポリマー（即ち、イソプレンポリマー）、またはイソプレンおよびイソプレン以外の１以上のモノマー単位を含む異種ポリマー（例、ブロック共ポリマー等の共ポリマー）であり得る。好ましくは、イソプレンに由来するポリマーは、本発明のイソプレンポリマーの例示的な製造方法により製造される同種ポリマー（即ち、イソプレンポリマー）である。実施形態では、本発明のゴム組成物はさらに、上記ポリマー以外の１以上のポリマー、１以上のゴム成分、および／または他の成分を含んでいてもよい。本発明のゴム組成物は、イソプレンに由来するポリマーを用いて製作することができる。例えば、本発明のゴム組成物は、イソプレンに由来するポリマーを、このポリマー以外の１以上のポリマー、１以上のゴム成分、ならびに／または他の成分（例、補強材、架橋剤、加硫促進剤、および抗酸化剤）と混合することにより調製することができる。

【0150】

＜タイヤの製造方法＞
実施形態では、本発明のタイヤは、本発明のゴム組成物を用いることにより製作される。本発明のゴム組成物は、制限されることなく、タイヤの任意の部分に利用することができ、その目的に応じて適切に選択され得る。例えば、本発明のゴム組成物は、タイヤのトレッド、ベーストレッド、サイドウォール、サイド補強ゴムおよびビードフィラーにおいて用いてもよい。タイヤを製造する方法としては、慣用の方法を用いることができる。例えば、タイヤ未加硫ゴムから構成されるカーカス層、ベルト層、トレッド層、および通常のタイヤ製造に用いられる他の部材をタイヤ成形用ドラム上に順次貼り重ねてもよく、ドラムを抜き去ってグリーンタイヤとしてもよい。次いで、このグリーンタイヤは、常法に従って加熱加硫されてもよく、所望のタイヤ（例、空気式タイヤ）を製造することができる。

【実施例】

【0151】

以下の実施例では、および本明細書を通じて、明示的にそれ以外であると記述しない限り、全ての割合および百分率は重量であり、全ての温度はセ氏である。分散物または溶液の固形含量を示すとき、それは、分散物または溶液の総重量に基づく固形物の重量を表す。分子量を特定するとき、それは、商業的供給者により製品に属するとされた確認済の分子量範囲である。一般に、これは、重量平均分子量であると考えられる。

【0152】

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0153】

実施例１：各種微生物由来メバロン酸キナーゼの発現プラスミドの調製
１−１）Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ由来メバロン酸キナーゼをコーする遺伝子の化学合成
Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ由来、メバロン酸キナーゼの塩基配列、及びアミノ酸配列は知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＮＣ＿０１３６６５．１（１６５６５６０．．１６５７４５９，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ，ＬＯＣＵＳ ＴＡＧ ＭＣＰ＿１６３９）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＹＰ＿００３３５６６９４（ＧｅｎＰｅｐｔ），メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ））。Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ由来ＭＶＫタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号１、及び配列番号２にそれぞれ示す。Ｍｐｄｍｖｋ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−Ｍｐｄｍｖｋと名付けた。

【0154】

１−２）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ由来メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子の化学合成
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ由来、メバロン酸キナーゼの塩基配列、及びアミノ酸配列は知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＮＣ＿０１５８５９．１（１０２４４２５．．１０２５６３９，Ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＣＶＡＲ＿０９０２）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＹＰ＿００４７５９３２８．１（ＧｅｎＰｅｐｔ））。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ由来ＭＶＫタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号３、及び配列番号４にそれぞれ示す。ＭＶＫ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したＭＶＫ遺伝子を設計し、これをＣｖａｍｖｋと名付けた。Ｃｖａｍｖｋの塩基配列を配列番号５に示す。Ｃｖａｍｖｋ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−Ｃｖａｍｖｋと名付けた。

【0155】

１−３）Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ ｃｏｎｃｉｌｉｉ由来メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子の化学合成
Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ ｃｏｎｃｉｌｉｉ由来、メバロン酸キナーゼの塩基配列、及びアミノ酸配列は知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＮＣ＿０１５４１６．１（２１８９０５１．．２１９０００４，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ，ＬＯＣＵＳ ＴＡＧ ＭＣＯＮ＿２５５９）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＹＰ＿００４３８４８０１．１（ＧｅｎＰｅｐｔ））。Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ ｃｏｎｃｉｌｉｉ由来ＭＶＫタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号６、及び配列番号７にそれぞれ示す。ＭＶＫ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したＭＶＫ遺伝子を設計し、これをＭｃｌｍｖｋと名付けた。Ｍｃｌｍｖｋの塩基配列を配列番号８に示す。Ｍｃｌｍｖｋ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−Ｍｃｌｍｖｋと名付けた。

【0156】

１−４）Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ ｍａｒｉｔｉｍｕｓ由来メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子の化学合成
Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ ｍａｒｉｔｉｍｕｓ由来、メバロン酸キナーゼの塩基配列、及びアミノ酸配列は知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＮＣ＿０１００８５．１（２７８３７１．．２７９３１２，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ，ＬＯＣＵＳ ＴＡＧ Ｎｍａｒ＿０３１５、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＹＰ＿００１５８１６４９．１（ＧｅｎＰｅｐｔ））。Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ ｍａｒｉｔｉｍｕｓ由来ＭＶＫタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号９、及び配列番号１０にそれぞれ示す。ＭＶＫ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したＭＶＫ遺伝子を設計し、これをＮｍｒｍｖｋと名付けた。Ｎｍｒｍｖｋの塩基配列を配列番号１１に示す。Ｎｍｒｍｖｋ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−Ｎｍｒｍｖｋと名付けた。

【0157】

１−５）Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ由来メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子の化学合成
Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ Ｇｏ１由来、メバロン酸キナーゼの塩基配列、及びアミノ酸配列は知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＮＣ＿００３９０１．１（２１０１８７３．．２１０２７７８、ＬＯＣＵＳ ＴＡＧ ＭＭ＿１７６２，アミノ酸配列の番号：ＮＰ＿６３３７８６．１））。Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ由来ＭＶＫタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号１２、及び配列番号１３にそれぞれ示す。ＭＶＫ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したＭＶＫ遺伝子を設計し、これをＭｍａｍｖｋと名付けた。Ｍｍａｍｖｋの塩基配列を配列番号１４に示す。Ｍｍａｍｖｋ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−Ｍｍａｍｖｋと名付けた。

【0158】

１−６）Ｐｕｅｒａｒｉａ ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛）由来イソプレンシンターゼをコードする遺伝子の化学合成
Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ由来、イソプレンシンターゼの塩基配列、及びアミノ酸配列は知られている（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ： ＡＡＱ８４１７０：Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛） ｉｓｏｐｒｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＩｓｐＳ））。Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ由来ＩｓｐＳタンパク質のアミノ酸配列、及びｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１５、及び配列番号１６にそれぞれ示す。ＩｓｐＳ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉで効率的に発現させる為にＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化し、更に葉緑体移行シグナルが切断されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、これをＩｓｐＳＫと名付けた。ＩｓｐＳＫの塩基配列を配列番号１７に示す。ＩｓｐＳＫ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＫと名付けた。

【0159】

１−７）発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐの構築
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、植物種由来のＩｓｐＳを発現させる為の発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを構築した。始めに、ｔａｃプロモーター（同意語：Ｐｔａｃ）領域（ｄｅＢｏｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９８３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，２１−２５）及びＥ．ｃｏｌｉ由来トリプトファンオペロンのターミネーター（同意語Ｔｔｒｐ）領域（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（１９７８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５，５４４２−５４４６）を含み、５’末端にＫｐｎＩサイト、３’末端にＢａｍＨＩサイトを有するＤＮＡ断片（Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ）を化学合成した（Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐの塩基配列を配列番号１８に示す）。得られたＰｔａｃ−ＴｔｒｐのＤＮＡ断片をＫｐｎＩ、及びＢａｍＨＩにて消化処理し、同様にＫｐｎＩ、及びＢａｍＨＩで消化処理したｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）をＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅによるライゲーション反応によって連結した。得られたプラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐと名付けた（塩基配列を配列番号１９に示す）。本プラスミドは、Ｐｔａｃ下流に発現させたい遺伝子をクローニングすることで、その遺伝子の発現増幅が可能となる。

【0160】

１−８）Ｐｕｅｒａｒｉａ ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛）由来イソプレンシンターゼと各微生物由来ＭＶＫ遺伝子発現用プラスミドの構築
Ｅ．ｃｏｌｉでＩｓｐＳＫ遺伝子とＭｐｄｍｖｋ遺伝子、Ｃｖａｍｖｋ遺伝子、Ｍｃｌｍｖｋ遺伝子、Ｎｍｒｍｖｋ遺伝子、Ｍｍａｍｖｋ遺伝子、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２遺伝子（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＮＣ＿００１１４５．３（６８４４６７．．６８５７９８、ＬＯＣＵＳ ＴＡＧ ＹＭＲ２０８Ｗ，アミノ酸配列の番号：ＮＰ＿０１３９３５．１））とを発現させる為のプラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＫを鋳型として、配列番号２０と配列番号２１の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を４０サイクル行った。その結果ＩｓｐＳＫ遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを、配列番号２２と配列番号２３の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて２１０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＩｓｐＳＫ遺伝子断片と、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＴｔｒｐのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＫ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫと命名した。次に、ｐＵＣ５７−Ｍｐｄｍｖｋを鋳型として、配列番号２４と配列番号２５の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−Ｃｖａｍｖｋを鋳型として、配列番号２６と配列番号２７の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−Ｍｃｌｍｖｋを鋳型として、配列番号２８と配列番号２９の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−Ｎｍｒｍｖｋを鋳型として、配列番号３０と配列番号３１の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−Ｍｍａｍｖｋを鋳型として、配列番号３２と配列番号３３の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型とし、メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２遺伝子を配列番号３４と配列番号３５の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＫＯＤ ｐｌｕｓポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９４℃にて１５秒、４５℃にて３０秒、６８℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果Ｍｐｄｍｖｋ遺伝子、Ｃｖａｍｖｋ遺伝子、Ｍｃｌｍｖｋ遺伝子、Ｎｍｒｍｖｋ遺伝子、Ｍｍａｍｖｋ遺伝子、ＥＲＧ１２遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ（ＷＯ２０１３／１７９７２２参照）を、配列番号３６と配列番号３７の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＭｐｄｍｖｋ遺伝子、Ｃｖａｍｖｋ遺伝子、Ｍｃｌｍｖｋ遺伝子、Ｎｍｒｍｖｋ遺伝子、Ｍｍａｍｖｋ遺伝子、ＥＲＧ１２遺伝子断片と、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＫ遺伝子とＭｐｄｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｐｄｍｖｋ、ＩｓｐＳＫ遺伝子とＣｖａｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｃｖａｍｖｋ、ＩｓｐＳＫ遺伝子とＭｃｌｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｃｌｍｖｋ、ＩｓｐＳＫ遺伝子とＮｍｒｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｎｍｒｍｖｋ、ＩｓｐＳＫ遺伝子とＭｍａｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｍａｍｖｋ、ＩｓｐＳＫ遺伝子とＥＲＧ１２ｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−ＥＲＧ１２ｍｖｋと名付けた。

【0161】

実施例２：メバロン酸経路を導入したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ７００９２６）における、微生物由来メバロン酸キナーゼ候補遺伝子の導入とメバロン酸キナーゼとしての機能の確認
実施例１で構築したメバロン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現プラスミドについて、我々が選択した遺伝子の機能は相同性検索による推定に基づくものであった。そこで、遺伝子の機能がメバロン酸キナーゼである事を実験的に確認した。具体的には、メバロン酸キナーゼが存在する事により初めてイソプレンを生産することが出来る菌株を構築し、その菌株に実施例１で構築したメバロン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現プラスミドを導入し、イソプレンの生産を確認したというものである。以下にその詳細を記す。

【0162】

２−１）メバロン酸経路下流の染色体固定株からのメバロン酸キナーゼ遺伝子欠損株の構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２遺伝子、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８遺伝子、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＥＲＧ１９遺伝子、イソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをコードするＩＤＩ１遺伝子からなる人工オペロンを染色体に固定した株である、ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株（ＷＯ２０１３／１７９７２２の実施例７−５）を参照）よりＥＲＧ１２遺伝子の欠損を行った。

【0163】

ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株に温度感受性の複製能を有するプラスミドｐＫＤ４６をエレクトロポレーション法により導入した。プラスミドｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，ｐ６６４０−６６４５］は、アラビノース誘導性ＰａｒａＢプロモーターに制御されるλＲｅｄシステムの遺伝子（λ、β、ｅｘｏ遺伝子）を含むλファージの合計２１５４塩基のＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号 Ｊ０２４５９，第３１０８８番目〜３３２４１番目）を含む。ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーション法によりｐＫＤ４６を導入し、１００（ｍｇ／Ｌ）のアンピシリンを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、得られたプレートから、アンピシリン耐性を示す形質転換体を取得した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤＤｙＩ株にｐＫＤ４６が導入された株をＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤＤｙＩ／ｐＫＤ４６株と名付けた。ａｔｔＬ−ｔｅｔＲ−ａｔｔＲ−Ｐｔａｃ遺伝子断片（配列番号３８）を鋳型とし、配列番号３９と配列番号４０から成る合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果、ａｔｔＬ−ｔｅｔＲ−ａｔｔＲ−Ｐｔａｃを含むＭＶＫ遺伝子欠損用断片を取得した。ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６株のコンピテントセルを調整後、精製したａｔｔＬ−ｔｅｔＲ−ａｔｔＲ−Ｐｔａｃを含むＭＶＫ遺伝子欠損用断片をエレクトロポレーション法により導入した。エレクトロポレーションの後、テトラサイクリン耐性を獲得したコロニーを取得した。配列番号４１と配列番号４２から成る合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、染色体上のＥＲＧ１２遺伝子が欠損していることを確認した。得られた変異体をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩと名付けた。

【0164】

２−２）Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ＫＤｙＩ株への微生物由来メバロン酸キナーゼの導入
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーション法によりｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｐｄｍｖｋ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｃｖａｍｖｋ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｃｌｍｖｋ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｎｍｒｍｖｋ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−ＥＲＧ１２ｍｖｋ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｍｍａｍｖｋ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ株にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｐｄｍｖｋが導入された株をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｐｄｍｖｋ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｃｖａｍｖｋが導入された株をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｃｖａｍｖｋ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｃｌｍｖｋが導入された株をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｃｌｍｖｋ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｎｍｒｍｖｋが導入された株をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｎｍｒｍｖｋ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｍａｍｖｋが導入された株をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｍａｍｖｋ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−ＥＲＧ１２ｍｖｋが導入された株をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−ＥＲＧ１２ｍｖｋ株と命名した。

【0165】

２−３）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥ遺伝子の化学合成
ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅとｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅをコードするＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥの塩基配列、及びアミノ酸配列は知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＦ２９００９２．１、（１４７９．．３８９０）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＡＧ０２４３９）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１５），４３１９−４３２７（２０００））。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号４３、及び配列番号４４にそれぞれ示す。ｍｖａＥ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したｍｖａＥ遺伝子を設計し、これをＥＦｍｖａＥと名付けた。この塩基配列を配列番号４５に示す。ｍｖａＥ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥと名付けた。

【0166】

２−４）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳ遺伝子の化学合成
ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ ｓｙｎｔｈａｓｅをコードするＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳの塩基配列、及びアミノ酸配列は知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＦ２９００９２．１、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（１４２．．１２９３）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＡＧ０２４３８）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１５），４３１９−４３２７（２０００））。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号４６、及び配列番号４７にそれぞれ示す。ｍｖａＳ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したｍｖａＳ遺伝子を設計し、これをＥＦｍｖａＳと名付けた。この塩基配列を配列番号４８に示す。ｍｖａＳ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳと名付けた。

【0167】

２−５）アラビノース誘導型ｍｖａＥＳ発現ベクターの構築
アラビノース誘導型メバロン酸経路上流遺伝子発現ベクターは次の手順で構築した。プラスミドｐＫＤ４６を鋳型として配列番号４９と配列番号５０に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥ．ｃｏｌｉ由来ａｒａＣとａｒａＢＡＤプロモーター配列からなるＰａｒａを含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥを鋳型として配列番号５１と配列番号５２に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳを鋳型として配列番号５３と配列番号５４に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを鋳型（プラスミド源）として配列番号５５と配列番号５６に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＴｔｒｐ配列を含むＰＣＲ断片を取得した。これら４つのＰＣＲ断片を得るためのＰＣＲにはＰｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いた。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。精製したＰａｒａを含むＰＣＲ産物とＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物を鋳型として配列番号４９と配列番号５２に示す合成オリゴヌクレオチドを、精製したＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ産物とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物を鋳型として配列番号５３と配列番号５６に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。その結果、ＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子、ＥＦｍｖａＳとＴｔｒｐ含むＰＣＲ産物を取得した。プラスミドｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製）は常法に従ってＳｍａＩ消化した。ＳｍａＩ消化後ｐＭＷ２１９と精製したＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物、ＥＦｍｖａＳ遺伝子とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたプラスミドは、ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐと命名した。

【0168】

２−６）微生物由来メバロン酸キナーゼ導入したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ＫＤｙＩ株へのアラビノース誘導型ｍｖａＥＳ発現ベクター導入株の構築
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｐｄｍｖｋ株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｃｖａｍｖｋ株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｃｌｍｖｋ株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｎｍｒｍｖｋ株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｍａｍｖｋ株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−ＥＲＧ１２ｍｖｋ株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーション法によりｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐを導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、得られたプレートから、クロラムフェニコールとカナマイシン耐性を示す形質転換体を取得した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｐｄｍｖｋ株にｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐが導入された株をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｐｄｍｖｋ株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｃｖａｍｖｋ株にｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐが導入された株をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｃｖａｍｖｋ株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｃｌｍｖｋ株にｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐが導入された株をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｃｌｍｖｋ株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｎｍｒｍｖｋ株にｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐが導入された株をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｎｍｒｍｖｋ株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｍａｍｖｋ株にｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐが導入された株をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｍａｍｖｋ株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−ＥＲＧ１２ｍｖｋ株にｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐが導入された株をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−ＥＲＧ１２ｍｖｋ株、と命名した。

【0169】

２−７）イソプレン生産能を持つＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株における微生物由来メバロン酸キナーゼの導入効果
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｐｄｍｖｋ株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｃｖａｍｖｋ株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｃｌｍｖｋ株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｎｍｒｍｖｋ株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｍａｍｖｋ株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−ＥＲＧ１２ｍｖｋ株を６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中のＭ９グルコース＋アラビノース培地１ｍＬに接種し、ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）で密栓後、往復振とう培養装置（１２０ｒｐｍ）で、３０℃にて２４時間培養を行った。Ｍ９グルコース＋アラビノース培地の組成は表１に記載のとおりである。

【0170】

【表1】

【0171】

培養終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。また、ＯＤ値は分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−２９００）によって６００ｎｍで測定した。表２に各菌株の培養終了時のイソプレン濃度とＯＤ値を記載した。以下にガスクロマトグラフィーの分析条件を記載する。

【0172】

Ｈｅａｄｓｐａｃｅ Ｓａｍｐｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製 Ｔｕｒｂｏ Ｍａｔｒｉｘ ４０）
バイアル保温温度 ４０℃
バイアル保温時間 ３０ｍｉｎ
加圧時間 ３．０ｍｉｎ
注入時間 ０．０２ｍｉｎ
ニードル温度 ７０℃
トランスファー温度 ８０℃
キャリアガス圧力（高純度ヘリウム） １２４ｋＰａ

【0173】

ガスクロマトグラフィー（島津社製 ＧＣ−２０１０ Ｐｌｕｓ ＡＦ）
カラム（Ｒｘｉ（登録商標）−１ｍｓ： 長さ３０ｍ、内径０．５３ｍｍ、液相膜厚１．５μｍ ｃａｔ♯１３３７０）
カラム温度 ３７℃
圧力 ２４．８ｋＰａ
カラム流量 ５ｍＬ／ｍｉｎ
流入方法 スプリット １：０（実測１：１８）
トランスファー流量 ９０ｍＬ
ＧＣ注入量 １．８ｍＬ（トランスファー流量×注入時間）
カラムへの試料注入量 ０．１ｍＬ
注入口温度 ２５０℃
検出機 ＦＩＤ（水素 ４０ｍＬ／ｍｉｎ、空気 ４００ｍＬ／ｍｉｎ、メイクアップガス ヘリウム ３０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出器温度 ２５０℃

【0174】

イソプレン標準試料の調整
試薬イソプレン（比重０．６８１）を冷却したメタノールで１０、１００、１０００、１００００、１０００００倍希釈し、添加用標準溶液を調整した。その後、水１ｍＬを入れたヘッドスペースバイアルに各添加用標準溶液を、それぞれ１μＬ添加し、標準試料とした。

【0175】

【表2】

【0176】

メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子を持たないＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ＫｄｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫはほとんどイソプレンを生産しなかった。これに対し、酵母のＥＲＧ１２遺伝子によりコードされるタンパク質、及び、Ｍ．ｍａｚｅｉのｍｖｋ遺伝子によりコードされるタンパク質はメバロン酸キナーゼ活性を有する事が知られている。これらの遺伝子を導入したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ＫｄｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−ＥＲＧ１２、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ＫｄｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｍａｍｖｋはそれぞれ３８．０ｍｇ／Ｌ、４５３ｍｇ／Ｌのイソプレンを蓄積した。このことから、メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子を持たないＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ＫｄｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫがほとんどイソプレンを生産しなかった理由は、この株がメバロン酸キナーゼをコードする遺伝子を持たない為であることが確認された。また、表２に示される結果から、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ ｃｏｎｃｉｌｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ ｍａｒｉｔｉｍｕｓのゲノム配列情報よりメバロン酸キナーゼをコードする遺伝子として我々が抽出した遺伝子が、実際にメバロン酸キナーゼをコードするのか、という事を実験的に確認することが出来た。すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ＫｄｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｐｄｍｖｋ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ＫｄｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｃｖａｍｖｋ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ＫｄｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｃｌｍｖｋ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ＫｄｙＩ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ／ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｎｍｒｍｖｋは、それぞれ５２．４ｍｇ／Ｌ、４３７．８ｍｇ／Ｌ、３２７．７ｍｇ／Ｌ、３６９．０ｍｇ／Ｌのイソプレン生産を示し、そのイソプレン生産量は、酵母のＥＲＧ１２遺伝子導入時と比べると高く、中でもＣｖａｍｖｋ、Ｍｃｌｍｖｋ、Ｎｍｒｍｖｋ各導入株は、Ｍ．ｍａｚｅｉのｍｖｋ遺伝子導入時とほぼ同等であった。

【0177】

実施例３：パントエア・アナナティスを用いたイソプレンモノマーの生産
３−１）ＭＶＫ発現プラスミドの構築
ＭＶＫ発現プラスミド（ｐＭＷ−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ−Ｔｔｒｐ）を構築した。
ｐＵＣ５７−Ｃｖａｍｖｋを鋳型として、ｃｖａ＿ｍｖｋ＿Ｎ（配列番号５７）とｃｖａ＿ｍｖｋ＿Ｃ（配列番号５８）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−Ｍｃｌｍｖｋを鋳型として、Ｍｃｌ＿ｍｖｋ＿Ｎ（配列番号５９）とＭｃｌ＿ｍｖｋ＿Ｃ（配列番号６０）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−Ｎｍｒｍｖｋを鋳型として、Ｎｍｒ＿ｍｖｋ＿Ｎ（配列番号６１）とＮｍｒ＿ｍｖｋ＿Ｃ（配列番号６２）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−Ｍｍａｍｖｋを鋳型として、ＭＭＶＫｆ（配列番号６３）とＭＭＶＫｒ（配列番号６４）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果Ｃｖａｍｖｋ遺伝子、Ｍｃｌｍｖｋ遺伝子、Ｎｍｒｍｖｋ遺伝子、Ｍｍａｍｖｋ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＭＷ２１９−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ（ＷＯ２０１３／０６９６３４Ａ１を参照）を、ＰｔＴｔ２１９ｆ（配列番号６５）とＰｔＴｔ２１９ｒ（配列番号６６）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果、ｐＭＷ２１９−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＣｖａｍｖｋ遺伝子、Ｍｃｌｍｖｋ遺伝子、Ｎｍｒｍｖｋ遺伝子、Ｍｍａｍｖｋ遺伝子と、ｐＭＷ２１９−Ｐｔａｃ−ＴｔｒｐのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＣｖａｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＭＷ−Ｐｔａｃ−Ｃｖａｍｖｋ−Ｔｔｒｐ、Ｍｃｌｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＭＷ−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋ−Ｔｔｒｐ、Ｎｍｒｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＭＷ−Ｐｔａｃ−Ｎｍｒｍｖｋ−Ｔｔｒｐ、Ｍｍａｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＭＷ−Ｐｔａｃ−Ｍｍａｍｖｋ−Ｔｔｒｐと名付けた。

【0178】

３−２）ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）の構築
先ず、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列を含む発現ベクターの構築を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。ｐＵＣ−ｍｖｋ−ｐｍｋ（ＷＯ２０１３／１７９７２２Ａ１の実施例７−２）を参照）を鋳型とし配列番号６７〜７０の塩基配列からなるプライマーを用いてメバロン酸キナーゼとホスホメバロン酸キナーゼ配列をＰＣＲ法により増幅し、ｐＴＷＶ−ｄｍｄ−ｙｉｄｉ（ＷＯ２０１３／１７９７２２Ａ１の実施例７−２）を参照）を鋳型とし配列番号６７〜７０の塩基配列からなるプライマーを用いてジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをＰＣＲ法により増幅した後、ｐＴｒｃＨｉｓ２ＢベクターにＩｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にてクローニングを行うことで４種の酵素遺伝子を直鎖状に並べた発現プラスミドの構築を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は、制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩで処理したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。構築した発現ベクターをｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）と名付けた。ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）の塩基配列を配列番号７１に示す。

【0179】

次いで、得られたｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）（配列番号７１）にＩｓｐＳ（Ｋ）を付加したプラスミドｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）の構築は以下の手順で行った。
ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）を制限酵素ＰｓｔＩ（タカラバイオ社製）で消化処理し、ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）／ＰｓｔＩを得た。ｐＵＣ５７−ｉｓｐＳＫを鋳型とし、ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＳＳ＿６０８３−１０−１（配列番号７２）、ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＳＡ＿６０８３−１０−２（配列番号７３）をプライマーとし、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を３０サイクル行った。その結果ＩｓｐＳＫ遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＩｓｐＳＫ遺伝子断片と、ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）／ＰｓｔＩを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたプラスミドをｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）（配列番号７４）と命名した。

【0180】

３−３）メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型コンディショナル複製プラスミドの構築
メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型プラスミドを構築するため、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ ｖｅｃｔｏｒ（Ｍｉｎａｅｖａ ＮＩ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）を用いた。

【0181】

ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐのＫｐｎＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ認識部位中にクローニングした。その結果、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐａｒａプロモーターおよびリプレッサー遺伝子ａｒａＣの制御下にあるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥＳオペロンを保有するｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳプラスミドを構築した（図１）。

【0182】

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼ遺伝子、および葛由来ｉｓｐＳ遺伝子のコーディング部分を含むｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）プラスミドのＥｃｌ１３６ＩＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ部位中にサブクローニングし、得られたプラスミドを、ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）と命名した（図２）。

【0183】

Ｐｔａｃの制御下にあるｉｓｐＳ（ムクナ）およびｍｖｋ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）遺伝子を含むｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ−ＭｍａｍｖｋのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、組込み型ベクターｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲのＢａｍＨＩ−Ｅｃｌ１３６ＩＩ認識部位中にサブクローニングした。得られたプラスミドｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）を、図３に示す。

【0184】

３−４）ｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位をゲノムの異なる部位に保有するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）誘導体の構築
ａｍｐＣ遺伝子、ａｍｐＨ遺伝子またはｃｒｔオペロンを置換したｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位を保有するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）誘導体を構築した（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＡＪ１３３５５の注釈付完全ゲノム配列は、ＰＲＪＤＡ１６２０７３またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１２３２．１およびＡＰ０１２０３３．１として入手可能）。これらの株を得るために、ゲノム中の標的部位に相同である４０ｂｐ領域に隣接したａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０を保有するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存性組込みを、既報の手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ Ｊ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）にしたがって行った。エレクトロポレーション後、５０ｍｇ／ｌカナマイシン含有Ｌ−アガー上で細胞を培養した。ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０によるａｍｐＣおよびａｍｐＨ遺伝子ならびにｃｒｔオペロンの置換に用いたＤＮＡフラグメントを、それぞれ、オリゴヌクレオチド１および２、３および４、ならびに５および６（表３）を用いた反応で増幅した。ｐＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド（Ｍｉｎａｅｖａ ＮＩ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）を、これらの反応で鋳型として用いた。得られた組込み体を、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、およびＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０と命名した。オリゴヌクレオチド７および８、９および１０、ならびに１１および１２（表３）を、それぞれ、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、およびＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０株のＰＣＲによる検証のために用いた。得られたΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、およびΔｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０のゲノム改変体のマップを、それぞれ、図４Ａ）、図５Ａ）および図６Ｂ）に示す。

【0185】

構築株からのカナマイシン耐性マーカーの除去を、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ Ｉ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）の手法にしたがい、ｐＡＨ１２９−ｃａｔヘルパープラスミドを用いて行った。オリゴヌクレオチド７および８、９および１０、ならびに１１および１２（表３）を、それぞれ、得られたＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、およびＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株のＰＣＲによる検証のために用いた。

【0186】

３−５）ＩＳＰ３−Ｓ株の構築
３−３）に記載されるｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）のプラスミドを、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ Ｉ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）の手法にしたがい、ヘルパープラスミドｐＡＨ１２３−ｃａｔを用いて、３−４）に記載されるＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株に組み込んだ。オリゴヌクレオチド１３および７、ならびに１４および８（表３）を、得られた組込み体のＰＣＲによる検証のために用いた。得られたＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）株を、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ Ｊ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の手法にしたがい、λファージのｉｎｔおよびｘｉｓ遺伝子を保有するｐＭＷｉｎｔｘｉｓ−ｃａｔヘルパープラスミドを用いて、ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）のベクター部分を除去した。その結果、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）株を得た。オリゴヌクレオチド７および１５（表３）を、テトラサイクリン感受性誘導体のＰＣＲによる検証のために用いた。ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）の構築を図４Ｃに示す。

【0187】

ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ細菌性ゲノムＤＮＡキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて上記ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０株から単離したゲノムＤＮＡを、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ Ｊ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の染色体エレクトロポレーションの方法にしたがって、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）株にエレクトロポレーションした。ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０変異の移入を、プライマー９および１０（表３）を用いたＰＣＲにより確認した。

【0188】

得られた株からのカナマイシン耐性マーカーの除去を、ｐｈｉ８０ Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性手法（Ａｎｄｒｅｅｖａ Ｉ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）を用いて行った。得られたＫｍＳ組換え体においてプライマー７および１５（表３）を用いてΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）改変体をＰＣＲにより検証した後、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ） ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株を選択した。

【0189】

上記ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳプラスミドを、ｐＡＨ１２３−ｃａｔヘルパープラスミド（Ａｎｄｒｅｅｖａ Ｉ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）を用いて、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０に組み込んだ。オリゴヌクレオチド１３および９、ならびにオリゴヌクレオチド１４および１０（表３）を、得られた組込み体のＰＣＲによる検証のために用いた。この組込み体を、ファージλ Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性技術（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ Ｊ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）を用いて、ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳのベクター部分を除去した。染色体からのベクターの除去は、プライマー９および１６（表３）を用いたＰＣＲにより確認した。その結果、マーカーを含まないＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ株を得た。ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ染色体改変体の構築物を、図５Ｃに示す。

【0190】

３−３）に記載されるｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）プラスミドを、既報に記載されるプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ Ｉ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）を用いて、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のゲノムに組み込んだ。プラスミド組込みを、プライマー１１および１３、ならびに、１２および１４（表３）を用いたポリメラーゼ連鎖反応で確認した。

【0191】

このようにして構築された染色体改変体ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）を、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ Ｊ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）のゲノムＤＮＡによるエレクトロポレーションの方法を用いて、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｍ）ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ株に移した。得られた組込み体について、ファージλ Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性技術（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ Ｊ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）を用いて、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）のベクター部分を除去した。最終構築物Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）の構造（図６Ｄ）は、プライマー１１および１７（表３）を用いたＰＣＲで確認した。

【0192】

この最終株に導入された組込み型発現カセットを再度ＰＣＲにより検証したところ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤおよびｙｌｄＩ遺伝子を含むＫＫＤｙＩオペロンの５’−部分で幾つか予想外に再構成していることが判明した。このカセットを修復するため、既報の手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ Ｊ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）にしたがい、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ細菌性ゲノムＤＮＡキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）株から単離したゲノムＤＮＡをこの株にエレクトロポレーションした。得られた株は、イソプレン産生に必要な全ての遺伝子を含んでいた。

【0193】

ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）（上記を参照）のベクター部分をファージλ Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性で除去した後、マーカーを含まないＩＳＰ３−Ｓ株（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０） ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）−ａｔｔＲｐｈｉ８０ ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ａｔｔＲｐｈｉ８０ Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）−ａｔｔＲｐｈｉ８０）を得た。

【0194】

３−６）ｔａｃプロモーターの挿入
続いてＰ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）（以下、ＡＧ９５７９）にλＲｅｄ法によりｔａｃプロモーターを導入した。
パントエア・アナナティスにおいてプロモーター置換を行うために、「Ｒｅｄ−ｄｒｉｖｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」あるいは「Ｒｅｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」と呼ばれる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７．６６４０−６６４５（２０００））を用いた。Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）はパントエア・アナナティス染色体へのＲｅｄ依存的インテグレーションのための好適な受容菌として使用できる事が知られている（ＵＳ７９１９２８４Ｂ２）。Ｒｅｄ依存的インテグレーションには、λのｇａｍ、ｂｅｔ及びｅｘｏの各遺伝子（以下、「λ Ｒｅｄ遺伝子」）を発現するヘルパープラスミドＲＳＦ−Ｒｅｄ−ＴＥＲを用いた（ＵＳ７９１９２８４Ｂ２）。ＲＳＦ−Ｒｅｄ−ＴＥＲプラスミドはレバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）遺伝子（ｓａｃＢ）を含んでおり、この遺伝子により、スクロースを含む培地で細胞からプラスミドを回収することができる。

【0195】

ＡＧ９５７９にＲＳＦ−Ｒｅｄ−ＴＥＲプラスミドを常法に従いエレクトロポレーションにより導入し、得られた株をＡＧ９５７９／ＲＳＦ−Ｒｅｄ−ＴＥＲと命名した。
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０） 株Ｐｔａｃ−ｌａｃＺ（ＲＵ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２００６１３４５７４，ＷＯ２００８／０９０７７０，ＵＳ２０１００６２４９６）よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲの鋳型として利用した。Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０） 株Ｐｔａｃ−ｌａｃＺにおいて、λａｔｔＬ−Ｋｍ^ｒ−λａｔｔＲの下流にＰｔａｃプロモーターが連結された、λａｔｔＬ−Ｋｍ^ｒ−λａｔｔＲ−ＰｔａｃがｌａｃＺ遺伝子の上流に組み込まれている（ＷＯ２０１１／８７１３９ Ａ１を参照）。Ｐ４０７１Ｒ＿６０８３−５４−１（配列番号７５）、Ｐ４０７１Ｆ（２）＿６０８３−５４−３（配列番号７６）をプライマーとし、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を３０サイクル行った。その結果、カナマイシン耐性遺伝子とｔａｃプロモーターを含むＰＣＲ断片を取得した。上記ＰＣＲ断片を精製し、常法に従い、エレクトロポレーションによりＡＧ９５７９／ＲＳＦ−Ｒｅｄ−ＴＥＲに導入した。

【0196】

ＰＣＲ断片を導入したＡＧ９５７９／ＲＳＦ−Ｒｅｄ−ＴＥＲ株を、４０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬ培地（バクトトリプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、寒天１５ｇを純水１Ｌに含む培地、ｐＨ７．０）にて選択し、約２０個のコロニーを形質転換体として取得した。ＫＫＤｙＩオペロン上流にＰＣＲ断片由来の配列が挿入されたことを、ＦＣＫ＿６０３８−５２−３（配列番号７７）とＲＣＫ＿６０３８−５２−４（配列番号７８）に示される合成ＤＮＡプライマー２本を用いたＰＣＲにより確認し、断片の挿入が確認できた菌株を取得した。続いて、ヘルパープラスミドＲＳＦ−Ｒｅｄ−ＴＥＲを脱落させた。この菌株を５ｇ／Ｌスクロース、１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬ培地に植菌し、シングルコロニーを形成させた。シングルコロニー形成後、２５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール及び４０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬ培地、及び４０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬ培地の両方にレプリカし、クロラムフェニコール感受性となった株を取得した。このようにして得られた菌株をＰ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）（Ｋｍｒ）と命名した。

【0197】

３−７）異なるメバロン酸キナーゼ遺伝子を保有する組込み型プラスミドの構築
ｐＭＷ−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋ−Ｔｔｒｐ、ｐＭＷ−Ｐｔａｃ−Ｎｍｒｍｖｋ−Ｔｔｒｐ、およびｐＭＷ−Ｐｔａｃ−Ｍｍａｍｖｋ−Ｔｔｒｐプラスミド（実施例３−１参照）のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ組込み型ベクターのＫｐｎＩ−Ｅｃｌ１３６ＩＩ認識部位中にサブクローニングした。
ｐＭＷ−Ｐｔａｃ−Ｃｖａｍｖｋ−Ｔｔｒｐ(実施例３−１参照)のＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ組込み型ベクターのＢａｍＨＩ−Ｅｃｌ１３６ＩＩ認識部位中にサブクローニングした。
Ｐｔａｃプロモーターを含有するＤＮＡフラグメントを、プライマー１８および１９（表３）を用いてＰＣＲで増幅し、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ組込み型ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ認識部位中にクローニングした。クローニングしたプロモーターフラグメントの配列を確認した。得られた組込み型発現ベクターｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃのマップを、図７に示す。
標準的ＳＤ配列に連結した、メタノセラ・パルディコラ株ＳＡＮＡＥ（完全ゲノム配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１１５３２を参照）由来の推定ｍｖｋ遺伝子を含有する化学合成ＤＮＡフラグメントを、ｐＡＨ１６２−ＰｔａｃのＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ認識部位中にクローニングした。
異なるｍｖｋ遺伝子を保有する組込み型プラスミドのマップを、図８に示す。

【0198】

３−８）ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）株の構築
上記で得られたｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）プラスミドを、ｐＡＨ１２３−ｃａｔヘルパープラスミド（上記を参照）を用いて、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のゲノム中に組み込んだ。
構築したΔｃｒｔ：：ｐＡＨ１２３−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）染色体改変体を、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）から単離したゲノムＤＮＡのエレクトロポレーションを介してＩＳＰ３−Ｓ株（上記を参照）に移入した。得られた組込み体を、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）と名付けた。

【0199】

３−９）ＩＳＰ２株の構築
ｐＡＨ１２９ヘルパープラスミド（上記を参照）を用いて、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）からｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）組込み型プラスミドを除去した。選択したＴｃＳ クローンにおけるＰ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）改変体の存在を、プライマー７および１３、ならびに８および１４（表３）を用いたＰＣＲにより確認し、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ａｔｔＲｐｈｉ８０改変体は、プライマー９および１３、ならびに１０および１４（表３）を用いたＰＣＲにより確認した。その結果、ＩＳＰ２株（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０） ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）−ａｔｔＲｐｈｉ８０ ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ａｔｔＲｐｈｉ８０ Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０）を選択した。

【0200】

３−１０）異なるｍｖｋ遺伝子を保有する一連のＩＳＰ２誘導体の構築
ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｃ．ｖａｒｉａｂｉｌｅ）、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｎ．ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）およびｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｃｏｎｃｉｌｉｉ）（上記を参照）を、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ Ｉ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）のとおり、ｐＡＨ１２３−ｃａｔヘルパープラスミドを用いてＩＳＰ２株に組み込んだ。その結果、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｍａ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｃｖａ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｎｍｒ）およびＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｃｌ）とそれぞれ名付けられた一連の株を得た。図９は、Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｘ）〔ここで、ｍｖｋ（Ｘ）は上述した任意のｍｖｋ遺伝子である〕の構造を示す。

【0201】

３−１１）ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）株の構築
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０） ΔａｍｐＣ：：Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）（Ｋｍｒ）株から単離されたゲノムＤＮＡを、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）株にエレクトロポレーションした。その結果、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）−ＫｍＲ株（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０） ΔａｍｐＣ：：λａｔｔＬ−ｋａｎ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ） ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ａｔｔＲｐｈｉ８０ Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ））を得た。
λＩｎｔ／Ｘｉｓ依存手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ Ｊ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）を用いて、カナマイシン耐性遺伝子をこの株から除去した。その結果、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）株を得た。

【0202】

３−１２）ＩＳＰ２．２株の構築
ｐＡＨ１２９ヘルパープラスミド（Ａｎｄｒｅｅｖａ Ｉ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）を用いて、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）プラスミドを、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）株から除去した。選択したＴｃＳクローンにおけるΔａｍｐＣ：：Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）改変体の存在を、プライマー７および１３、ならびに８および１４（表３）を用いたＰＣＲにより確認し、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ａｔｔＲｐｈｉ８０改変体を、プライマー９および１３、ならびに１０および１４（表３）を用いたＰＣＲにより確認した。その結果、ＩＳＰ２．２株（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０） ΔａｍｐＣ：：Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ） ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ａｔｔＲｐｈｉ８０ Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０）を選択した。

【0203】

３−１３）異なるｍｖｋ遺伝子を保有する一連のＩＳＰ２．２誘導体の構築
既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ Ｉ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）のとおり、ｐＡＨ１２３−ｃａｔヘルパープラスミドを用いて、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）およびｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｃｏｎｃｉｌｉｉ）（上記を参照）をＩＳＰ２．２株に組み込んだ。その結果、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｍａ）およびＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｃｌ）とそれぞれ名付けられた株を得た。

【0204】

【表3】

【0205】

３−１４）Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのイソプレン生産菌を利用したイソプレン発酵
３−１４−１）菌株の構築
上記菌株にＩｓｐＳプラスミドを導入する事によりイソプレン生産菌を構築した（表４）。

【0206】

【表4】

【0207】

３−１４−２）Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌のジャー培養条件
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌の培養には１Ｌ容積の発酵槽を使用した。グルコース培地は表５に示す組成になるように調整した。クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢプレートに新規ＭＶＫ導入株を塗布し、３４℃にて１６時間培養を実施した。０．３Ｌのグルコース培地を１Ｌ容積の発酵槽に投入後、充分に生育したプレート１枚分の菌体を接種し、培養を開始した。培養条件は、ｐＨ７．０（アンモニアガスにて制御）、３０℃、１５０ｍＬ／ｍｉｎあるいは３００ｍＬ／ｍｉｎの通気にて行い、培地中の酸素濃度が５％以上になるように撹拌制御を行った。培養中は、培地中のグルコース濃度が１０ｇ／Ｌ以上になるよう５００ｇ／Ｌに調整したグルコースを連続的に添加した。ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｘ）〔ここで、ｍｖｋ（Ｘ）は表４に示す任意のＭＶＫの由来となる微生物種である〕の培養において、７０時間の培養でＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）は６４．１ｇ、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｍａ）は７１．７ｇ、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｃｖａ）は７９．１ｇ、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｃｌ）は６４．３ｇ、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｎｍｒ）は７１．３ｇのグルコースを最終的に消費した。また、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｘ）〔ここで、ｍｖｋ（Ｘ）は表４に示す任意のＭＶＫの由来となる微生物種である〕の培養において、４８時間の培養でＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｍａ）は６４．３ｇ、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）は６０．１ｇ、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｃｌ）は６７．２ｇのグルコースを最終的に消費した。

【0208】

【表5】

【0209】

Ａ区とＢ区を０．１５Ｌ調整後、１１５℃、１０ｍｉｎで加熱滅菌を行った。放冷後Ａ区とＢ区を混合し、クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）を添加し、培地として使用した。

【0210】

３−１４−３）イソプレン生産期への誘導方法
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌は、メバロン酸経路上流遺伝子をアラビノース誘導型プロモーターにて発現させるため、Ｌ−アラビノース（和光純薬工業）存在下でイソプレン生産量が顕著に向上する。イソプレン生産期への誘導方法として、発酵槽におけるブロスを経時的に分析し、６００ｎｍの吸光度が１６になった時点で終濃度２０ｍＭとなるようにＬ−アラビノースを添加した。

【0211】

３−１４−４）発酵ガス中のイソプレンガス濃度測定方法
Ｌ−アラビノース添加後から適時、発酵ガスをガスバッグにて収集し、ガスクロマトグラフィー（島津社製 ＧＣ−２０１０ Ｐｌｕｓ ＡＦ）あるいはマルチガスアナライザー（ＧＡＳＥＲＡ社製 Ｆ１０）により、イソプレンガス濃度を定量した。

【0212】

３−１５）ＭＶＫ導入株のジャー培養におけるイソプレン生成量（評価１）
新規ＭＶＫ導入株ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｍａ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｃｌ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｃｖａ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｎｍｒ）を上記のジャー培養条件にて培養を行い、イソプレンの生成量を測定した。図１０、１１に示すように、培養開始後７０時間までの全イソプレン生産量を測定した。全イソプレン生産量の高い順に、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｃｌ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｎｍｒ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｃｖａ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｍａ）、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）であった（図１０、１１）。それぞれの全イソプレン生成量はＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｃｌ）が９０３ｍｇ、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｎｍｒ）が７０７ｍｇ、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｃｖａ）が６０６ｍｇ、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｍａ）が６０３ｍｇ、ＩＳＰ３−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）が４８６ｍｇであった。このことから、Ｍ．ｃｏｎｃｉｌｉｉ由来、Ｎ．ｍａｒｉｔｉｍｕｓ由来、Ｃ．ｖａｒｉａｂｌｅ由来のＭＶＫを導入したＰ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌は、既知Ｍ．ｍａｚｅｉ由来ＭＶＫを導入したＰ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌よりも優れたイソプレン生産能を示した。

【0213】

３−１６）ＭＶＫ導入株のジャー培養におけるイソプレン生成量（評価２）
新規ＭＶＫ導入株ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｍａ）、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｃｌ）を上記のジャー培養条件にて培養を行い、イソプレンの生成量を測定した。図１２、１３に示すように、培養開始後４８時間までの全イソプレン生産量を測定した。全イソプレン生産量の高い順に、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｃｌ）、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｍａ）であった（図１２、１３）。それぞれの全イソプレン生成量はＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｐｄ）が３０７ｍｇ、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｃｌ）が３０１ｍｇ、ＩＳＰ３．２−ｍｖｋ（Ｍｍａ）が２７５ｍｇであった。このことから、Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ由来、Ｍ．ｃｏｎｃｉｌｉｉ由来のＭＶＫを導入したＰ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌は、既知Ｍ．ｍａｚｅｉ由来ＭＶＫを導入したＰ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌よりも優れたイソプレン生産能を示した。

【0214】

実施例４：メバロン酸キナーゼの精製および活性測定
４−１．メバロン酸キナーゼ遺伝子のクローニング
各メバロン酸キナーゼ遺伝子をｐＥＴ−２１ａ（＋）（Ｃ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇ用：Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＥＴ−２８ｂ（＋）（Ｎ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇ用：Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングした。表６に示されるプラスミドを鋳型として用いて、表７に示されるオリゴヌクレオチドでＰＣＲを行った。ｍｐｄ−ｍｖｋはＯＲＦ中にＮｄｅＩ部位を含むので、サイレント変異を、オーバーラップＰＣＲによりＮｄｅＩ部位に導入した。ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）をＰＣＲに用いた。得られたＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＥＴ−２１ａ（＋）およびｐＥＴ−２８ｂ（＋）の対応部位中に挿入した。挿入ＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２遺伝子（表６におけるｓｃｅ−ｍｖｋ）を、ＳＭＶＫｆ（配列番号１００）およびＳＭＶＫｒ（配列番号１０１）のヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．製）で行ったＰＣＲにより増幅した。キットに添付の組成に従って反応液を調製し、１ｋｂあたり９８℃を１０秒間、５５℃を５秒間および７２℃を１分間の反応を３０サイクル行った。その結果、ＥＲＧ１２遺伝子含有ＰＣＲ産物を得た。同様に、ｐＭＷ２１９−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを、ＰｔＴｔ２１９ｆ（配列番号６５）およびＰｔＴｔ２１９ｒ（配列番号６６）のヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．製）で行ったＰＣＲにより増幅した。その結果、ｐＭＷ２１９−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ含有ＰＣＲ産物を得た。その後、ＥＲＧ１２遺伝子の精製ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いてｐＭＷ２１９−Ｐｔａｃ−ＴｔｒｐのＰＣＲ産物に連結した。得られたＥＲＧ１２遺伝子用発現プラスミドを、ｐＭＷ−Ｐｔａｃ−Ｓｃｅｍｖｋ−Ｔｔｒｐと命名した。

【0215】

ＥＲＧ１２ｍｖｋ遺伝子増幅用のプライマー１（ＳＭＶＫｆ）（配列番号１００）
５’−ｔｔｔｃａｃａｃａａ ｇｇａｇａｃｔｃｃｃ ａｔｇｔｃａｔｔａｃ ｃｇｔｔｃｔｔａａｃ−３’
ＥＲＧ１２ｍｖｋ遺伝子増幅用のプライマー２（ＳＭＶＫｒ）（配列番号１０１）
５’−ｃａｇｃｇｇａａｃｔ ｇｇｃｇｇｃｔｃｃｃ ｔｔａｔｇａａｇｔｃ ｃａｔｇｇｔａａａｔ−３’

【0216】

【表6】

【0217】

【表7】

【0218】

４−２．メバロノラクトンからのメバロン酸の調製、およびＨＰＬＣによる検証
２６０ｍｇのメバロノラクトン（ＡＤＥＫＡ）を、５ｍｌの水、次いで０．６ｍｌの１０Ｎ ＫＯＨとよく混合した。次いで、混合液を３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、塩酸での中和により溶液のｐＨを８．０に調整した。次いで、この溶液を終容量２０ｍｌに増量し、１００ｍＭメバロン酸カリウム溶液とした。得られたメバロン酸カリウム溶液を各々約２ｍｌに小分けし、次いで−２０℃で保存した。

【0219】

得られた１００ｍＭメバロン酸カリウム溶液を、ＨＰＬＣにより検証した。解析は、５０ｍＭ （Ｒ）−メバロン酸リチウム（認証済の調製物，ＳＩＧＭＡ）を標品として、および調製したメバロン酸カリウム（水で５０ｍＭに希釈）を試料として用いることにより行った。検証に用いたＨＰＬＣは、日立高速液体クロマトグラフィー（Ｌ−２０００）であった。ＨＰＬＣは、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（１５０×４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．：ＹＭＣ ＣＯ．，ＬＴＤ．）を固定相として、およびリン酸（ｐＨ２．５）を移動相として用いることにより行った。検出は、２１０ｎｍで行った。

【0220】

アルカリ加水分解により得られたメバロノラクトン、メバロン酸リチウム標品およびメバロン酸カリウムの５０ｍＭ溶液のＨＰＬＣクロマトグラムでは、認証済のメバロノラクトン調製物で見出された１１．２分のピークはほぼ消失し、認証済のメバロン酸調製物で見出された８．８分のピークが、調製したメバロン酸の主成分であった。凍結保存後、この調製したメバロン酸を、安定性の検証のため、ＨＰＬＣにより再度解析した。メバロン酸リチウム標品のピーク面積は、調製したメバロン酸カリウムのものにほぼ匹敵した。このことは、この調製したメバロン酸が凍結保存後でさえも安定であったことを示す。

【0221】

４−３．発現解析および活性確認
得られた各プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体に用いた。ｐＥＴ−２１ａ（＋）およびｐＥＴ−２８ｂ（＋）中にクローニングされたメバロン酸キナーゼの発現の解析のために、各トランスフェクト物を、０．１ｍｇ／ｍｌ アンピシリン（ｐＥＴ−２１ａ（＋）用）、または０．０５ｍｇ／ｍｌ カナマイシン（ｐＥＴ−２８ｂ（＋）用）を含有するＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母抽出物、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）中で、１４０ｒｐｍで往復振盪（ＴＩＴＥＣ往復振盪培養機）することにより２０℃で培養した。ＯＤ６００が約０．５に到達したとき、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを溶液に添加した。次いで、それを２０℃で一晩培養した。回収した細胞を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ イミダゾールからなる緩衝液中に懸濁した。次いで、細胞を超音波破砕機（ＴＯＭＹ：ＵＤ−２０１，出力レベル＝３．５）で破砕した。遠心分離（２０，０００×ｇ，２０分）後、破砕した細胞を、Ｈｉｓ−ｓｐｉｎＴｒａｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に吸着させた。同緩衝液での洗浄後、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび０．５Ｍ イミダゾールからなる緩衝液（ｐＨ７．５）でタンパク質を溶出させた。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および５０ｍＭ ＮａＣｌの組成の外液で、溶出液を４℃で一晩透析した。次いで、透析内液における各溶出液の酵素活性を測定した。

【0222】

透析内液（各々約０．２ｍｌ）の活性を、１０μｌの酵素液で測定した（表８）。酵素発現レベルを、ｐＥＴ−２１ａ（＋）とｐＥＴ−２８ｂ（＋）との間の活性基準に対して比較した。ｐＥＴ−２８ｂ（＋）で発現した酵素は、より高い活性を示した。発現レベルはｐＥＴ−２８ｂ（＋）がより高いと推察される。したがって、ｐＥＴ−２８ｂ（＋）で発現した精製酵素を、さらなる試験に用いた。

【0223】

【表8】

【0224】

４−４．メバロン酸キナーゼの発現および精製
得られた各プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換に用いた。ｃｖａ、ｍｍａ、ｎｍｒおよびｓｃｅ由来のメバロン酸キナーゼの発現の解析のために、各トランスフェクト物を、１４０ｒｐｍで往復振盪（ＴＡＩＴＥＣ往復振盪培養機）することにより、厚試験管（３ｃｍ Ｉ．Ｄ．×２０ｃｍ）において、２０ｍｌのＬＢ培地中で２０℃にて培養した。ｍｃｌおよびｍｐｄ由来のメバロン酸キナーゼの発現の解析のために、各トランスフェクト物を、１４０ｒｐｍでの旋回培養（ＩＮＯＶＡ４４，２インチストローク，Ｎｅｗｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ｓｃｅｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、バッフル付３Ｌ振盪フラスコにおいて、２Ｌ ＬＢ培地中で２０℃にて培養した。ＯＤ６００が約０．５に到達した後、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（ｃｖａ、ｍｍａ、ｎｍｒ、およびｓｃｅ用）または１ｍＭ ＩＰＴＧ（ｍｃｌおよびｍｐｄ用）を添加し、次いで、混合液を２０℃で一晩維持して、標的タンパク質を誘導した。回収した細胞を緩衝液Ａ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ イミダゾール）中に懸濁し、次いで細胞を超音波破砕機（ＴＯＭＹ：ＵＤ−２０１）で破砕した。ｃｖａ、ｍｍａ、ｎｍｒまたはｓｃｅ由来のメバロン酸キナーゼを発現するトランスフェクト物の超音波破砕は、出力レベル＝３．５で行った一方で、ｍｃｌまたはｍｐｄ由来のメバロン酸キナーゼを発現するトランスフェクト物のものについては出力レベル＝８であった。遠心分離（２８，０００×ｇ，３０分）後、上清をＨｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に吸着させて、線形濃度勾配のイミダゾール（終濃度 ０．５Ｍ）により標的タンパク質を溶出させた。得られたタンパク質は、１ｍＭ ＤＴＴおよび５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の組成の外液を用いることにより透析した。透析タンパク質を精製酵素とした。タンパク質の量は、Ｂｉｏ−ＲＡＤタンパク質アッセイキットおよびＢＳＡ標品条件で測定した。

【0225】

その結果、２０ｍｌの培養液から得られた精製ｃｖａ、ｍｍａ、ｎｍｒおよびｓｃｅ由来酵素の重量はそれぞれ、４、１、１．８および０．２ｍｇであった。２Ｌの培養液から得られた精製ｍｃｌおよびｍｐｄ由来酵素の重量はそれぞれ、４５および２ｍｇであった。図１４は、精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを示す。

【0226】

４−５．メバロン酸キナーゼの活性およびＫｍ値の測定
酵素活性の測定については、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）（ＷＡＫＯ）、０．４ｍＭ ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）（ＳＩＧＭＡ）、０．３３ｍＭ ＮＡＤＨ（ＯＲＩＥＮＴＡＬ ＹＥＡＴ ＣＯ．，ＬＴＤ．）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０５ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）（２０Ｕ／ｍｌ）（ＳＩＧＭＡ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）（２０Ｕ／ｍｌ）（ＳＩＧＭＡ）、５ｍＭ メバロン酸カリウムおよび５ｍＭ ＡＴＰ（ＯＲＩＥＮＴＡＬ ＹＥＡＴ Ｃｏ．，ＬＴＤ．）を含有する反応液に酵素を添加した。３０℃での３４０ｎｍの吸光度における減少を測定して、酵素活性を決定した。ＪＡＳＣＯ社の分光光度計（Ｖ−６５０）を本調査に用いた。本調査で用いたＮＡＤＨのミリモル濃度吸光係数は６．２２ｍＭ^−１ｃｍ^−１であった。Ｋｍ値（メバロン酸に対する）は以下のとおり測定した：前述の反応混合液中のＡＴＰ濃度を５ｍＭに設定し、３つの濃度レベルのメバロン酸カリウムは０．００２ｍＭ〜１ｍＭ範囲に設定した。Ｋｍ値（ＡＴＰに対する）は以下のとおり測定した：前述の反応混合液中のメバロン酸カリウム濃度を５ｍＭに設定し、３〜４つのＡＴＰ濃度レベルを、０．２ｍＭ〜５ｍＭ範囲に設定した。Ｋｍ値をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットにより算出した。

【0227】

各酵素のみかけ上のＫｍ値（ａｐｐ．Ｋｍ）の算出のため、測定した各酵素の活性（ｄＡＢＳ／分）を表９に示す。表１０は、ａｐｐ．Ｋｍ、Ｖｍａｘ、酵素タンパク質の分子量、酵素液中のタンパク質濃度、および算出したｋ_ｃａｔを示す。結果は、ｍｃｌおよびｍｐｄ由来酵素が他の酵素よりもメバロン酸およびＡＴＰに対してより高い親和性を有することを示す。

【0228】

【表9】

【0229】

活性は、１０μｌの各酵素を１ｍｌの反応液に添加したときのｄＡＢＳ／分により示した。ｍｃｌおよびｍｐｄメバロン酸キナーゼのｋｃａｔ／Ｋｍ値は、ｍｍａのものよりも高かった。この結果は、ｍｃｌおよびｍｐｄメバロン酸キナーゼにおけるより良好な触媒機能を示唆する。

【0230】

【表10】

【0231】

４−６．ＤＭＡＰＰ、ＧＰＰ、ＦＰＰまたはＤＰＭによる各酵素の阻害の確認
テルペニル二リン酸、またはメバロン酸経路の中間体によるメバロン酸キナーゼの阻害を、以下のとおり確認した：ジメチルアリル二リン酸アンモニウム塩（ＤＭＡＰＰ：５ｍＭ）（Ｃａｙｍａｎ，６３１８０）、ゲラニルピロリン酸アンモニウム塩（ＧＰＰ：０．１ｍＭ）（ＳＩＧＭＡ，６７７２−５ＶＬ）、ファルネシルピロリン酸アンモニウム塩（ＦＰＰ：０．１ｍＭ）（ＳＩＧＭＡ，Ｆ６８９２−５ＶＬ）、または（±）−メバロン酸 ５−二リン酸・テトラリチウム塩（ＤＰＭ：１ｍＭ）（ＳＩＧＭＡ，９４２５９−１０ＭＧ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．４ｍＭ ＰＥＰ、０．３３ｍＭ ＮＡＤＨ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０５ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ＬＤＨ（２０Ｕ／ｍｌ）、ＰＫ（２０Ｕ／ｍｌ）、５ｍＭ メバロン酸カリウムおよび５ｍＭ ＡＴＰからなる反応液中で別々に混合して、酵素活性を測定した。ＧＰＰおよびＦＰＰ溶液はメタノールを含有することから、反応系に添加する際に同じメタノールレベルを維持するのに必要とされるメタノールを、反応液に添加し、これをコントロールとした。

【0232】

各酵素の活性に対する添加した５ｍＭ ＤＭＡＰＰ、０．１ｍＭ ＧＰＰ、および０．１ｍＭ ＦＰＰの各効果を測定した。表１１は、各酵素の活性（ｄＡＢＳ／分）を示し、図１５は、コントロールに対する相対活性を示す。３つのテルペニル二リン酸の全てが、ｓｃｅ由来酵素を強く阻害した。ＦＰＰはｃｖａ由来酵素を阻害したが、他の酵素はＦＰＰにより強く阻害されなかった。対照的に、ｍｃｌ由来酵素は、５ｍＭ ＤＭＡＰＰにより活性化されたが、その活性は、コントロールのものから２０％増加した。

【0233】

【表11】

【0234】

各酵素に対する１ｍＭ ジホスホメバロン酸（ＤＰＭ）の効果もまた調査した。弱い阻害活性が、ｍｍａ由来酵素のみで確認された（表１２および図１６）。

【0235】

【表12】

【0236】

４−７．ｍｃｌ由来メバロン酸キナーゼ活性に対するイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の効果
イソペンテニルピロリン酸三アンモニウム塩溶液（ＳＩＧＭＡ，Ｉ０５０３−１ＶＬ）をＩＰＰとして用いた。ＩＰＰを反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．４ｍＭ ＰＥＰ、０．３３ｍＭ ＮＡＤＨ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０５ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ＬＤＨ（２０Ｕ／ｍｌ）、ＰＫ（２０Ｕ／ｍｌ））に添加して終濃度３３．６μＭおよび１６８μＭにして、メバロン酸キナーゼ活性を測定した。ＩＰＰ溶液は７０％メタノール液を含有していたことから、同量の７０％メタノール液を反応系に添加して、それをコントロールとして用いた。５ｍＭ ＤＭＡＰＰは活性を増加させることが確認されたことから、３３．６μＭおよび１６８μＭでのｍｃｌ由来メバロン酸キナーゼ活性に対するその効果を試験した。

【0237】

ＤＭＡＰＰ添加により活性の増加が確認されたｍｃｌ由来酵素に対するＩＰＰの効果を試験した（表１３）。図１７は、コントロールを１００としたときの相対活性を示す。同濃度のＤＭＡＰＰおよび高濃度（５ｍＭ）のＤＭＡＰＰを別々に添加したときの相対活性を同時に測定した。ＩＰＰまたはＤＭＡＰＰのいずれも、３３．６μＭおよび１６８μＭで酵素活性に影響しなかった。５ｍＭ ＤＭＡＰＰの添加は、酵素活性を２０％増加させた。

【0238】

【表13】

【0239】

４−８．各メバロン酸キナーゼに対する生成物阻害の試験
ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）の調製
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１８２７２７．１）を、ＰＭＫ−ＩＦＳ＿５７４２−３３−３（配列番号１２２）およびＰＭＫ−ＩＦＡ＿５７４２−３３−４（配列番号１２３）のヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ Ｐｒｅｍｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ製）で行ったＰＣＲにより増幅した。キットに添付の組成に従って反応液を調製し、１ｋｂあたり９８℃を１０秒間、５５℃を５秒間および７２℃を５秒間の反応を３０サイクル行った。その結果、ＥＲＧ８遺伝子含有ＰＣＲ産物を得た。プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを、標準法にしたがってＳｍａＩで消化した。次いで、ＳｍａＩで消化されたｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）により、ＥＲＧ８遺伝子含有ＰＣＲ産物に連結した。得られたプラスミドを、ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＰＭＫ−Ｔｔｒｐと命名した。

【0240】

ＰＭＫ−ＩＦＳ＿５７４２−３３−３（配列番号１２２）
５’−ＡＣＡＣＡＡＧＧＡＧＡＣＴＣＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＧＴＴＧＡＧＡＧＣＣＴＴＣＡ−３’
ＰＭＫ−ＩＦＡ＿５７４２−３３−４（配列番号１２３）
５’−ＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＣＡＡＧＡＴＡＡＧＴＴＴＣＣＧＧ−３’

【0241】

ＰＭＫコードＤＮＡを、ＰＭＫコードプラスミドｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ＰＭＫ−Ｔｔｒｐを鋳型として、ならびにオリゴヌクレオチド（５’−ＴＣＡＧＡＧＴＴＧＡＧＡＧＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＣＣＣＡＧ−３’（配列番号１２４）および５’−ＧＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＴＡＴＣＡＡＧＡＴＡＡＧＴＴＴＣＣＧＧＡＴＣＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１２５））をプライマーとして用いたＰＣＲにより調製した。得られたＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩにより消化し、ｐＥＴ２１ｄ中にクローニングした。ＮｃｏＩ消化後、ｐＥＴ２１ｄを平滑化し、次いでＥｃｏＲＩでさらに消化して、クローニングに用いた。挿入したＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定により確認した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を得られたプラスミドで形質転換し、往復振盪培養（１４０ｒｐｍ，ＴＡＩＴＥＣ往復振盪培養機）により、２０ｍｌのＬＢ培地中で３０℃にて培養した。ＯＤ６００＝約０．７のとき、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。次いで、この混合液を、同条件下で一晩培養した。回収した細胞を、緩衝液Ａ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）中に懸濁し、超音波破砕機（ＴＯＭＹ：ＵＤ−２０１）で破砕した。超音波破砕は、出力レベル＝３．５で行った。遠心分離後、得られた上清を、Ｈｉｓ−ｓｐｉｎ Ｔｒａｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に吸着させ、吸着したタンパク質を、溶出液であるイミダゾール濃度０．５Ｍの緩衝液Ａで溶出させた。溶出液を、５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を外液として用いることにより透析し、次いで、精製酵素とした。

【0242】

メバロン酸キナーゼに対する生成物阻害の試験
酵素を、反応液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ ＡＴＰ、２．５ｍＭ ＮＡＤＨ、４０ｍＭ ＰＥＰ、ＬＤＨ（２０Ｕ／ｍｌ）、ＰＫ（２０Ｕ／ｍｌ）、１ｍＭ メバロン酸）に添加し、３８６ｎｍでの吸光度の減少を測定した。吸光度の減少が停止したとき、精製ＰＭＫを添加して、３８６ｎｍでの吸光度のさらなる減少を測定した。

【0243】

図１８は、精製ＰＭＫのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを示す。各酵素に対する可能性のある生成物阻害を試験するために、１ｍＭメバロン酸を基質として用いた酵素反応から生じる３８６ｎｍでの吸光度の減少を測定した（図１９）。３８６ｎｍでのＮＡＤＨのミルモル濃度吸光係数を０．６１ｍＭ^−１ｃｍ^−１としたとき、基質濃度（１ｍＭ）（１．５−０．９＝０．６）に相当する吸光度の減少が全酵素で認められた。メバロン酸が枯渇したときに（または吸光度の減少が停止したときに）、ＰＭＫをさらに添加した。その後、吸光度はさらに減少し、最終的に、３８６ｎｍでの吸光度は、全反応系で０．３に減少した。したがって、ＰＭＫを各ＭＶＫに添加することにより、メバロン酸は、ホスホメバロン酸を介してジホスホメバロン酸に変換されることが推察される。ｃｖａ、ｓｃｅ、ｍｃｌ、ｍｍａおよびｍｐｄ由来ＭＶＫの反応では、ＰＭＫを添加するまで、吸光度においてほぼ線形の減少が認められた。一方で、ｎｍｒ由来酵素は、反応の進行（生成物の蓄積）に伴い反応速度の減少を示した。これは、ＤＰＭ誘導阻害はｎｍｒ由来酵素では認められないが、ホスホメバロン酸は、ｎｍｒ由来酵素に対する生成物阻害を引き起こし得ることを示唆する。

【0244】

実施例５：ポリイソプレンの製造
イソプレンを、発酵排気管を通過させることにより液体窒素冷却トラップで回収する。回収したイソプレンを、十分に乾燥した１００ｍＬガラス容器中で、窒素雰囲気下で３５ｇのヘキサン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２９６０９０）、ならびに１０ｇのシリカゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２３６７７２）、および１０ｇのアルミナ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２６７７４０）と混合する。得られた混合液を、室温で５時間放置する。次いで、上清液を採取し、十分に乾燥した５０ｍＬガラス容器中に加える。

【0245】

一方で、グローブ・ボックスにおいて窒素雰囲気下、４０．０μｍｏｌのトリス［ビス（トリメチルシリル）アミド］ガドリニウム、１５０．０μｍｏｌのトリブチルアルミニウム、４０．０μｍｏｌのビス［２−（ジフェニルホスフィノ）フェニル］アミン、４０．０μｍｏｌのトリフェニルカーボニウム・テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ボレート（（Ｐｈ_３ＣＢＣ_６Ｆ_５）_４）をガラス溶液に用意し、これを５ｍＬのトルエン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２４５５１１）中に溶解させて、触媒液を得る。その後、触媒液をグローブ・ボックスから採り、モノマー液に加え、次いで、これをポリマー反応（５０℃で１２０分間）に供する。

【0246】

ポリマー反応後、５質量％の２，２’−メチレン−ビス（４−エチル−６−ｔ−ブチルフェノール）（ＮＳ−５）を含む１ｍＬのイソプロパノール溶液を加えて、反応を停止させる。次いで、多量のメタノールをさらに加えて、ポリマーを単離し、７０℃で真空乾燥させて、ポリマーを得る。

【0247】

実施例６：ゴム組成物の製造
表１４に示されるように処方されるゴム組成物を調製し、１４５℃で３５分間加硫処理する。

【0248】

【表14】

【0249】

数値の限度または範囲が本明細書中で記述される場合、終点が含まれる。また、数値の限度または範囲以内にある種々の値および部分範囲は、明示的に摘記されているかのように、特に含まれる。

【0250】

明らかに、上記技術を考慮すると、本発明の多くの改変および変更が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲において、本発明は、本明細書中に具体的に記載された以外にも実施されてもよいことが理解されるべきである。

【0251】

上記の全ての特許および他の参考文献は、同じものが詳細に示されているかのように、参照により完全に援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]