特許 6522711 ＦＳＨの安定化

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6522711

(24)【登録日】2019年5月10日

(45)【発行日】2019年5月29日

(54)【発明の名称】ＦＳＨの安定化

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/24 20060101AFI20190520BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20190520BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20190520BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20190520BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20190520BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20190520BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20190520BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/24

   A61K9/08

   A61K47/02

   A61K47/26

   A61K47/18

   A61K47/10

   A61P15/00

【請求項の数】4

【全頁数】41

(21)【出願番号】特願2017-212395(P2017-212395)

(22)【出願日】2017年11月2日

(62)【分割の表示】特願2015-245748(P2015-245748)の分割

【原出願日】2011年7月28日

(65)【公開番号】特開2018-48188(P2018-48188A)

(43)【公開日】2018年3月29日

【審査請求日】2017年12月1日

(31)【優先権主張番号】10171428.5

(32)【優先日】2010年7月30日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】500297535

【氏名又は名称】フェリング ベスローテン フェンノートシャップ

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(72)【発明者】

【氏名】シェーグレン，ヘレン ウルリカ

(72)【発明者】

【氏名】バッガー，ハイジ ルイ−セ

【審査官】 伊藤 基章

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００２−５２１３４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−２０３９９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特許第５８６００４７（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 特表２００７−５３２５１５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００

Ａ６１Ｋ ９／００

Ａ６１Ｋ ４７／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＦＳＨ液体製剤の安定化のための薬剤的に許容されるアルカリ金属カチオンを含む塩の使用であって、塩が、薬剤的に許容されるＮａ⁺塩およびＫ⁺塩、またはそれらの組合せからなる群から選択され、
ＦＳＨ液体製剤が、
５０ＩＵ／ｍｌ〜８００ＩＵ／ｍｌのｒＦＳＨ、
０．００１ｍｇ／ｍｌ〜０．０５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０、
０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニン、
０．５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌのフェノール、
１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの硫酸二ナトリウム、および
０．１ｍＭ〜１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を含み、ｐＨ６〜８である、
使用。

【請求項2】

ＦＳＨ液体製剤が、
１００ＩＵ／ｍｌ〜６００ＩＵ／ｍｌのｒＦＳＨ、
０．００５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０、
１．０ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニン、
５．０ｍｇ／ｍｌのフェノール、
１４ｍｇ／ｍｌの硫酸二ナトリウム、および
１ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を含み、ｐＨ６．５である、
請求項１に記載の使用。

【請求項3】

ＦＳＨ液体製剤であって、
５０ＩＵ／ｍｌ〜８００ＩＵ／ｍｌのｒＦＳＨ、
０．００１ｍｇ／ｍｌ〜０．０５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０、
０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニン、
０．５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌのフェノール、
１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの硫酸二ナトリウム、および
０．１ｍＭ〜１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を含み、ｐＨ６〜８である、
製剤。

【請求項4】

ＦＳＨ液体製剤であって、
１００ＩＵ／ｍｌ〜６００ＩＵ／ｍｌのｒＦＳＨ、
０．００５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０、
１．０ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニン、
５．０ｍｇ／ｍｌのフェノール、
１４ｍｇ／ｍｌの硫酸二ナトリウム、および
１ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を含み、ｐＨ６．５である、
製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は一般に、ＦＳＨ製剤、特にＦＳＨ液体製剤の安定化の分野に関する。安定化は、塩の添加によって実現され、好ましい実施形態においては、薬剤的に許容される塩のアルカリ金属カチオンとの塩、すなわちＮａ塩もしくはＫ塩またはそれらの組合せの添加によって実現される。

【背景技術】

【0002】

ゴナドトロピンは、女性および男性における受胎周期に本質的に主に関与するホルモンの１つのファミリーである。ゴナドトロピンは、研究と治療の両方の目的で尿から得ることができるが、いくつかのゴナドトロピンは、組換え技術によって作製することができる。

【0003】

特に、ゴナドトロピンは、不妊症の治療に使用することができる。

【0004】

この場合に関与する、全て同じ糖タンパク質ファミリーに属する４種類の主要なゴナドトロピンは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）である。これらのゴナドトロピンは全て、αサブユニットとβサブユニットからなる。αサブユニットは、全てに共通であり、すなわち上記の４種類全てのゴナドトロピンで同じである一方、βサブユニットはそれぞれ異なる。

【0005】

前述のように、ゴナドトロピンは、男性および女性において性腺機能を調節するヘテロ二量体糖タンパク質ホルモンの１つの群である。これには、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および（ヒト）絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）が含まれる。

【0006】

ＦＳＨは、脳下垂体前葉によって自然分泌され、卵胞発育および排卵を助けるように機能する。ＦＳＨは、他の糖タンパク質ホルモン、例えばＬＨおよびｈＣＧにも共通である、９２個のアミノ酸からなるαサブユニットと、ＦＳＨに独特であり、このホルモンの生物学的特異性を付与する、１１１個のアミノ酸からなるβサブユニットを含む（ＰｉｅｒｃｅおよびＰａｒｓｏｎｓ、１９８１年、Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５０巻：４６５〜４９５頁）。各サブユニットは、複合糖質残基の添加によって翻訳後修飾される。両サブユニットは、Ｎ−結合グリカン結合のための部位を２つ有する。αサブユニットはアミノ酸５２および７８に、βサブユニットはアミノ酸残基７および２４に有する（ＲａｔｈｎａｍおよびＳａｘｅｎａ、（１９７５年）、Ｐｒｉｍａｒｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ
ｈｏｒｍｏｎｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｇｌａｎｄｓ．Ｉ．ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２５０巻（１７号）：６７３５〜６７４６頁；ＳａｘｅｎａおよびＲａｔｈｎａｍ、（１９７６年）、Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｇｌａｎｄｓ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２５１巻（４号）：９９３〜１００５頁））。ＦＳＨは、このようにして約３０質量％までグリコシル化される（ＤｉａｓおよびＶａｎ Ｒｏｅｙ、（２００１年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｏｌｌｉｔｒｏｐｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ａｒｃｈ Ｍｅｄ Ｒｅｓ．、３２巻（６号）：５１０〜５１９頁；Ｆｏｘら、（２００１年）、Ｔ
ｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１５巻（３号）、３７９〜８９頁）。

【0007】

自然生殖における排卵を促進するおよび生殖補助医療（ａｓｓｉｓｔｅｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）用の卵母細胞を提供するという両方の目的で、ヒト閉経後尿から精製されたＦＳＨが不妊症治療において長年使用されてきた。組換え型ＦＳＨであるＧｏｎａｌ−ｆ（Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ）とＰｕｒｅｇｏｎ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）の２種類が、１９９０年代中頃に利用可能になった。これらは両方とも、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現される（Ｈｏｗｌｅｓ、Ｃ．Ｍ．、（１９９６年）、ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ−ｆ）、Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ．Ｕｐｄａｔｅ、２巻：１７２〜１９１頁）。ＣＧはＬＨ活性を有するため、不妊症治療で多用されている。

【0008】

ヒトＦＳＨとｈＣＧは両方とも、αサブユニットとβサブユニットから構成されるヘテロ二量体である。両ホルモンのαサブユニットは同一である。２種類のホルモン間の違いは、βサブユニットによってもたらされる。ＦＳＨの成熟したβサブユニットは、１１１個のアミノ酸から構成されるが、ｈＣＧの成熟したβサブユニットは、１４５個のアミノ酸から構成され、さらにＦＳＨおよびｈＣＧのβサブユニットの一次アミノ酸配列は、β鎖全体にわたって異なっている。ＦＳＨとｈＣＧの両方のβ鎖には、６個のジスルフィド架橋が含まれているが、それらのアミノ酸配列が異なるため、高次構造が異なり、荷電、極性、および疎水性領域のフォールディングおよび分布が異なることになる（Ｆｏｘら、（２００１年）、Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１５巻（３号）、３７９〜８９頁）。

【0009】

ＦＳＨのβサブユニットおよびｈＣＧのβサブユニットは両方とも、グリコシル化されるが、ＦＳＨのβサブユニットにはＮ−グリコシル化（Ｎ−７およびＮ−２４）しか含まれていないが、ｈＣＧのβサブユニットには、Ｎ−グリコシル化とＯ−グリコシル化の両方が含まれている（Ｎ−１３、Ｎ−３０、Ｏ−１２１、Ｏ−１２７、Ｏ−１３２、およびＯ−１３８）。ｈＣＧのβサブユニット中の余分なグリコシル化によって、ＦＳＨのグリコシル化より親水性になる。βサブユニットは、受容体相互作用に特異性をもたらす。

【0010】

ＣＨＯ細胞は、組換え医薬タンパク質の生成によく使用される。構造分析によって、シアル酸は、α２，３−結合で排他的に結合していることが確認された。多くのヒト糖タンパク質には、シアル酸残基についてα２，３−結合とα２，６−結合の両方の混合物が含まれている。したがって、ＣＨＯ系を使用して発現させた組換えタンパク質は、末端のシアル酸結合のタイプが天然のカウンターパートと異なることになる。

【0011】

不妊症
本発明との関連では、「不妊症」は、子孫を妊娠し、もうける能力の低下またはないことと定義されるものとする。妊娠はできるものの反復流産する女性も、不妊症であると言われる。不妊症はまた、具体的には、避妊することなく通常の性交を１年行った後に妊娠できないことと定義される。

【0012】

不妊症は、多くの原因によると考えられる。諸研究によって、不妊症の原因は、半数より少し多くが、女性の状態に起因することが明らかになった。残りは、精子障害および未解明の要因によって引き起こされる。現在、不妊症を治療する可能性がいくつかある。

【0013】

それらは、タイミングを合わせた性交、生殖補助医療（ａｓｓｉｓｔｅｄ ｒｅｐｒｏ
ｄｕｃｔｉｖｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ＡＲＴ）の使用、子宮内膜症、子宮筋腫および女性性機能不全（ＦＳＤ）の医学的管理、ならびに異常を治すための手術である。

【0014】

生殖補助医療では、排卵を刺激する薬物が使用される。ＬＨおよびｈＣＧに次いで、ＦＳＨは、これに関連して使用される化合物のうちの１つである。

【0015】

投与するには、これらの化合物の液体製剤が好適である。残念なことに、液体製剤に添加された保存剤、特にベンジルアルコール（ＢＡ）、フェノールおよびトリクレゾールは、タンパク質に不安定化作用を及ぼすことが過去に明らかになっている（Ｍａａ，Ｙ．Ｆ．およびＣｈｕｎｇ，Ｃ．Ｈ．、１９９６年、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．、１４０巻：１５５〜１６８頁；Ｌａｍ，Ｘ．Ｍ．、Ｐａｔａｐｏｆｆ，Ｔ．Ｗ．およびＮｇｕｙｅｎ，Ｔ．Ｈ．、１９９７年、Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｎ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１４巻：７２５〜７２９頁；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．およびＬｕ，Ｊ．、２００２年、ＦＳＨ ａｎｄ ＦＳＨ ｖａｒｉａｎｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ
ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ａｓ ａ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ、欧州特許第０９７４３５９号（Ｂ１）、１〜５０頁）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

したがって、特に、投与されるＦＳＨの投与量は免疫原性応答のような解離または凝集型の副作用のリスクを低下させるべきであるということを考えると、非天然ＦＳＨが存在する場合、安定化された製剤を提供することが重要である。しかし、保存剤によって生ずる不安定化事象は、液体製剤内の活性ゴナドトロピン、すなわちＦＳＨの実際のレベルを低下させる。したがって、本発明の目的は、安定なＦＳＨ製剤、特に液体製剤およびその安定化方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0017】

本発明は、ＦＳＨ液体製剤を安定化するために、ＦＳＨ液体製剤の安定化のための薬剤的に許容されるアルカリ金属カチオンを含む塩の使用に関する。安定化させる液体製剤は、保存剤を含むまたは含まない製剤であることができる。

【0018】

以下の実施形態が好ましい：
１．ＦＳＨ液体製剤の安定化のための薬剤的に許容されるアルカリ金属カチオンを含む塩の使用であって、塩が、薬剤的に許容されるＮａ⁺塩およびＫ⁺塩、またはそれらの組合せからなる群から選択される使用。
２．塩がＮａ⁺塩である、項目１に記載の使用。
３．塩がＮａＣｌまたはＮａ₂ＳＯ₄である、項目１または２のいずれかに記載の使用。
４．塩がＮａ₂ＳＯ₄である、項目１または２のいずれかに記載の使用。
５．塩がＮａＣｌとＮａ₂ＳＯ₄の組合せである、項目１または２のいずれかに記載の使用。
６．塩が、２０〜５００ｍＭの量、または３０〜３００ｍＭの量、または５０〜２００ｍＭの量で含まれる、項目１から５のいずれか１つに記載の使用。
７．ＦＳＨ製剤がｒＦＳＨ製剤である、項目１から６のいずれか１つに記載の使用。
８．製剤が、保存剤をさらに含む、項目１から７のいずれか１つに記載の使用。
９．製剤が、ベンジルアルコール、フェノール、および／またはｍ−クレゾールを含む、項目８に記載の使用。
１０．製剤が注射用製剤である、項目１から９のいずれか１つに記載の使用。
１１．ＦＳＨ液体製剤の安定化方法であって、薬剤的に許容されるアルカリ金属カチオンを含む塩を前記製剤に添加するステップを含み、前記塩は、Ｎａ⁺塩およびＫ⁺塩、またはそれらの組合せからなる群から選択される方法。
１２．塩が、上記の項目２から６で定義される、項目１１に記載の方法。
１３．安定化させるＦＳＨがｒＦＳＨである、項目１１および／または１２に記載の方法。
１４．製剤が、保存剤をさらに含む、項目１１から１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．保存剤が、ベンジルアルコール、フェノール、およびｍ−クレゾールからなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
１６．液体製剤が、凍結乾燥製剤から得られた再構成液体製剤である、項目１から１０のいずれか１つに記載の使用。
１７．塩を添加するステップが凍結乾燥ステップの前に実施される、項目１１から１５のいずれか１つに記載の方法。
１８．再構成ステップが、凍結乾燥ステップの後に実施される、項目１７に記載の方法。１９．塩が凍結乾燥製剤中に含まれ、または塩が再構成液体中に含まれる、項目１７および／または１８に記載の方法。
したがって、代替的実施形態において、安定化塩を含む製剤は凍結乾燥状態で貯蔵される。凍結乾燥は、当業者に一般的に知られているように実施される。次いで、凍結乾燥製剤を、患者が最終的に使用するまで貯蔵することができる。次いで、凍結乾燥製剤は、投与前に、公知の再構成媒体のいずれか１つ、例えば滅菌水で再構成する。塩は、凍結乾燥製剤中または再構成液体中に含まれる。
２０．液体製剤が、好ましくは注射用の単回使用製剤または複数回投与製剤である、上記の項目のいずれかに記載の使用または方法。

【0019】

好ましい実施形態において、塩は、凍結乾燥されておらず、液体として貯蔵されている液体製剤それ自体に含まれる。

【0020】

特に、好ましい実施形態において、本発明は、ＦＳＨ液体製剤の安定化方法であって、アルカリ金属カチオンが、Ｎａ⁺とＫ⁺からなる群から選択される方法に関する。特に好ましくは、塩がＮａＣｌまたはＮａ₂ＳＯ₄である。

【0021】

上述されたように、不妊症の治療にはＦＳＨ液体製剤が適している。その関連で、ＦＳＨ液体製剤が不安定であり得ることが明らかになってきた。これは、単回使用向けのものを含めて、ＦＳＨ液体製剤全てに当てはまる。ＦＳＨ液体製剤が、例えば全ての複数回投与製剤に必要な保存剤を含む場合、不安定性ははるかに著しいものとなるおそれがある。この保存剤は、ＦＳＨ製剤を保存するのに有用なあらゆる保存剤であり得る。したがって、保存剤は、例えばベンジルアルコール、フェノール、および／またはｍ−クレゾールのようなＦＳＨ製剤用にＦＤＡによって認可されたような保存剤、特に例えば非経口ＦＳＨ製剤用に認可されたＦＤＡ認可保存剤であることができる。しかし、保存剤は、決してそれらの例に限定されない。ＦＳＨの安定性は、例えばベンジルアルコール、フェノール、および／またはｍ−クレゾールによって低下する。

【0022】

したがって、本出願において特許請求および記載される、薬剤的に許容されるカチオンを含む塩を、単回使用ＦＳＨ製剤の安定化のために使用する。

【0023】

さらに、本出願において特許請求および記載される、薬剤的に許容されるカチオンを含む塩を、複数回投与ＦＳＨ製剤の安定化のために使用する。このような製剤は保存剤を含む必要はないが、保存剤も含んでよい。

【0024】

本出願において特許請求される、薬剤的に許容されるカチオンを含む塩、すなわちＮａ
⁺塩およびＫ⁺塩の添加によって、ＦＳＨ液体製剤が安定化する。特に好ましい実施形態において、塩は、薬剤的に許容される塩である。安定化が、単回使用または複数回投与の製剤において、特により長期間におよぶ貯蔵において実現され、別の可能な実施形態においては、ベンジルアルコール、フェノール、および／またはｍ−クレゾールのような保存剤の不安定化作用に対する対策として有利であり得る。

【0025】

好ましい実施形態において、本発明に従って使用することができる塩としては、ＮａＣｌまたはＮａ₂ＳＯ₄が挙げられる。

【0026】

塩は、好ましくは２０〜５００ｍＭの量で含まれ、さらにより好ましくは３０〜３００ｍＭの量で含まれ、特定の好ましい実施形態においては、５０〜２００ｍＭの量で含まれる。

【0027】

塩の最大添加量は、溶液オスモル濃度に制限される。注射時の疼痛を最小限に抑えるには、溶液は、好ましくは等張であるべきであり、または少なくとも高張であるべきでない。溶液中の添加剤は全て、オスモル濃度に寄与するので、溶液に添加することができる塩の最大量は、存在する他成分の量に左右される。

【0028】

塩は、好ましくは最高オスモル濃度３５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇをもたらす量、さらにより好ましくは最高オスモル濃度３２０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇをもたらす量で含まれ、特定の好ましい実施形態においては、最高オスモル濃度３００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇをもたらす量で含まれる。

【0029】

オスモル濃度理論
オスモル濃度は、溶液中に存在する種々の溶質の、溶液の浸透圧への寄与を測る全体的な基準を示す実用的手段である。オスモル濃度は、ヨーロッパ薬局方２．２．３５、第７版、補遺 ２０１１（７．２）、Ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ、０１／２００８：２０２３５に従って測定することができる。

【0030】

本発明との関連において、「塩」は、酸から、金属または電気陽性基による水素の全置換または部分置換によって得られる化学物質である。

【0031】

「薬剤的に許容される塩のカチオンを有する（または含む）塩」の定義は、ＦＤＡ不活性成分リストに従って筋肉内または皮下送達用に認可されたカチオンによって形成される全ての塩を指す。この群のアルカリ金属カチオンは、ナトリウム（Ｎａ⁺）およびカリウ
ム（Ｋ⁺）である。

【0032】

本発明者らは、驚くべきことに、まさに２つの特定のカチオンがＦＳＨ製剤の安定化に特に適していることを見出した。

【0033】

したがって、塩は、以下の薬剤的に許容されるカチオン：カリウム（一塩基性、二塩基性または三塩基性）、またはナトリウム（一塩基性または二塩基性または三塩基性）によって形成することができる。好ましくは、塩はナトリウム塩である。

【0034】

特に好ましいのは、ＮａＣｌおよびＮａ₂ＳＯ₄である。

【0035】

本発明に従って安定化することができるゴナドトロピンは、ＦＳＨ、すなわち卵胞刺激ホルモンであり、別の活性成分と場合によって組み合わせたものである。

【0036】

ＦＳＨは、尿由来もしくは血漿由来ＦＳＨ、または組換えＦＳＨ（ｒＦＳＨ）である。
好ましい実施形態において、ＦＳＨは、尿由来ＦＳＨまたはｒＦＳＨであり、特に好ましいのは、ｒＦＳＨである。

【0037】

前述のように、ＦＳＨを組換え技術によって作製することは、現在可能である。したがって、本明細書中でＦＳＨに言及する場合、一般的に尿由来ゴナドトロピンと組換え（ｒ）ゴナドトロピンとを常に包含する。したがって、ＦＳＨという言葉はｒＦＳＨも包含する。

【0038】

本発明の好ましい実施形態において、製剤は、ｒＦＳＨ液体製剤、最も好ましくは注射用製剤であり、Ｎａ₂ＳＯ₄またはＮａＣｌで安定化される。

【0039】

本発明の好ましい実施形態において、製剤は、ｒＦＳＨ液体製剤、最も好ましくは注射用製剤であり、Ｎａ₂ＳＯ₄またはＮａＣｌで安定化される。

【0040】

代替的実施形態において、全ての実施形態のｒＦＳＨは、長時間作用型のＦＳＨである。長時間作用型のＦＳＨ製剤は、当業者に一般的に知られているように、例えば、ＦＳＨ分子を修飾するまたは製剤を修飾することによって得ることができる。

【0041】

したがって、本明細書中で、ＦＳＨは、可能な全ての尿由来型または組換え型の上記ＦＳＨ、およびＦＳＨの型の可能な全ての組合せを包含する。単回使用製剤および（同じまたは異なるゴナドトロピンの）複数回投与使用の１種または複数の別の製剤も包含される。

【0042】

１つの可能な製品は、異なるバイアル中に（場合によってはＣＧ、ＬＨ、ＬＨ活性などを有する）ＦＳＨを全て含む製剤とすることができる。ＬＨ活性が存在する場合それは、ＬＨまたはＣＧに由来することがある。ＬＨは、等価用量のＣＧで置換することができ、逆の場合も同様である。それに関連して、「等価用量」は、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ Ｖａｎ Ｈｅｌｌ Ｂｉｏａｓｓａｙにおける１ＩＵのＣＧが５〜７ＩＵのＬＨに等しいということに基づいて算出することができる（Ｖａｎ Ｈｅｌｌ，Ｈら、Ａｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．、４７巻、４０９〜４１８、１９６４年）。

【0043】

好ましい組合せは、全てが異なるバイアル中に含まれる（ｒ）ＦＳＨ、（ｒ）ＬＨおよび（ｒ）ｈＣＧの組合せである。

【0044】

異なるバイアル中の可能な組合せにはまた、尿由来（ｕ）ＦＳＨおよびｕｈＣＧまたはｕＦＳＨおよびｕＬＨ；さらに（ｒｈＣＧまたはｒＬＨまたはｒＦＳＨ）および（ｕｈＣＧまたはｕＬＨまたはｒｈＣＧまたはｒＬＨ）、ならびに可能な全てのそれらの順列が含まれる。

【0045】

別の好ましい組合せは、それぞれ異なるバイアル中の（ｒ）ＦＳＨおよび（ｒ）ｈＣＧの組合せである。

【0046】

別の好ましい組合せは、それぞれ異なるバイアル中の（ｒ）ＦＳＨおよび（ｒ）ＬＨの組合せである。

【0047】

本発明のＦＳＨ製剤は液体製剤である。

【0048】

好ましくは、製剤は注射用製剤である。製剤は、別々にまたは一緒に投与するためのＦＳＨまたはＦＳＨ／ｈＣＧを含む１種または２種以上の医薬組成物を有する製品として供給することができる。別々に投与する場合、連続投与とすることができる。製品は、適切
な任意のパッケージで供給することができる。例えば、製品には、いくつかの充填済みシリンジを入れることができる。それぞれのシリンジには、ＦＳＨ（ＦＳＨ組成物）、またはさらにｈＣＧ（ｈＣＧ組成物）が入っており、例えば、注射器をブリスター包装または他の手段で包装して、滅菌状態を維持することができる。製品には、ＦＳＨ製剤を使用するための指示書を場合によっては入れることができる。別の態様によれば、本発明のＦＳＨ製剤は、複数回投与調製物として提供される。しかし、本発明が単回使用向けの製剤も対象とすることは明白である。本発明は、キットの一部分としての製剤の安定化にも関する。このようなキットは、１つもしくは複数の一日量のＦＳＨを含む少なくとも１つの容器、またはそれぞれに異なるゴナドトロピンが含まれている例えば２つの容器（例えば、バイアル）、ならびに例えば別の指示書（例えば、投与用指示書）、および例えば注射するための別の手段を備える。好ましい実施形態において、ＦＳＨ溶液が各カートリッジに充填される頻回注射用のペン型注射器を使用する。

【0049】

好ましい実施形態において、ＦＳＨは、３５〜８５０ＩＵ／ｍｌ、好ましくは５０〜８００ＩＵ／ｍｌ、さらにより好ましくは１００〜６００ＩＵ／ｍｌで含まれる。

【0050】

例えば、６００ＩＵ／ｍｌのｒＦＳＨについて特に好ましい製剤は、以下の組成を有する：
６００ＩＵ／ｍｌ ｒＦＳＨ
０．００１〜０．０５、好ましくは０．００５ｍｇ／ｍｌ ポリソルベート２０
０．１〜１０、好ましくは１．０ｍｇ／ｍｌ Ｌ−メチオニン
０．５〜５０、好ましくは５．０ｍｇ／ｍｌ フェノール
１〜１００、好ましくは１４ｍｇ／ｍｌ 硫酸二ナトリウム（すなわち、０．１Ｍ）
０．１〜１０、好ましくは１ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６〜８、好ましくはｐＨ ６．５）。

【0051】

溶液オスモル濃度は、好ましくは３００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇである。
（ｐＨは、溶液全体のｐＨを指す）

【0052】

注射可能なデポー剤形は、生分解性ポリマー中ＦＳＨ（および存在する場合には他の作用剤）のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製することができる。ポリマーベースのデポー剤形／徐放性システムは、それらの化学的性質に依存して、例えばマイクロ粒子もしくはナノ粒子、ヒドロゲル、ミセル、エマルジョンまたはインプラントであることができる。ＦＳＨとポリマーの比および使用する特定のポリマーの性質に応じて、ＦＳＨ放出速度を制御することができる。生分解性ポリマーの例としては、ポリラクチド／ポリグリコリドコポリマー系、ポリビニルピロリドン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）、ポリ（エチレングリコール）、ポリアミノ酸、多糖、例えばヒアルロン酸ナトリウム（ＮａＨＡ）またはこの他の塩、ゼラチン、キトサンなどが挙げられる。記載のポリマーは全て、誘導体化または修飾して、タンパク薬物送達またはその安定性を最適化することができる。デポー注射用製剤は、ＦＳＨを、脂質系に、または体組織と相溶性があるミセル、リポソーム、もしくはマイクロエマルジョンとしてのポリマー脂質混合物に閉じ込めることによっても調製される。

【0053】

注射用製剤は、例えば細菌保持フィルターに通す濾過によって、あるいは使用する直前に滅菌水または他の注射用滅菌媒体に溶解または分散することができる滅菌固体組成物の形で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。注射用製剤は、上述されたように適切な任意の容器、例えばバイアル、充填済みシリンジ、注射用カートリッジなどで供給することができる。

【0054】

医薬組成物の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度は、この分野の慣行に従って調整する
。ＧＯＯＤＭＡＮ ａｎｄ ＧＩＬＭＡＮ’ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＦＯＲ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＥＳ，７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎを参照のこと。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、非経口投与用の組成物として供給される。非経口製剤を調製する一般方法は、当技術分野において公知であり、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ；ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ、前掲、７８０〜８２０頁に記載されている。非経口組成物は、液体製剤で、または投与直前に注射用滅菌媒体と混合される固体として供給することができる。特に好ましい実施形態において、非経口組成物は、投与を容易にし、投与量を均一にするために投与単位形態で供給される。

【0055】

本発明のＦＳＨは、通常の手段で尿から得ることができ、または組換え技術によって作製することができる。可能な作製方法については、例えばＷＯ２００９／１２７８２６をさらに参照されたい。

【0056】

ｈＣＧは、当技術分野において公知である任意の手段で得ることができる。本明細書では、ｈＣＧは、ヒト由来ｈＣＧおよび組換えｈＣＧを包含する。ヒト由来ｈＣＧは、適切な供給源（例えば、尿および胎盤）から、当技術分野において公知である任意の方法で精製することができる。組換えｈＣＧを発現および精製する方法は、当技術分野において周知である。

【0057】

ＬＨは、当技術分野において公知である任意の手段で得ることができる。本明細書では、ＬＨは、ヒト由来ＬＨおよび組換えＬＨを包含する。ヒト由来ＬＨは、適切な供給源（例えば、尿）から、当技術分野において公知である任意の方法で精製することができる。組換えＬＨを発現および精製する方法は、当技術分野において公知である。

【0058】

医薬組成物は、不妊症の治療、例えば生殖補助医療（ａｓｓｉｓｔｅｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ＡＲＴ）、排卵誘発（ＯＩ）、または子宮内人工授精（ＩＵＩ）における使用を目的とすることができる。医薬組成物は、例えば、公知のＦＳＨ調製物が使用される医学的適応において使用することができる。本発明は、本明細書に記載される（本発明の態様による）安定化されたＦＳＨ調製物の不妊症治療のための使用または不妊症治療用医薬品の製造における使用も提供する。医薬組成物は、任意の薬物投与経路、例えば経口、直腸、非経口、経皮（例えば、パッチ技術）、静脈内、筋肉内、皮下、嚢内、腟内、腹腔内、局所（散剤、軟膏剤、またはドロップ剤）投与経路用の、またはバッカルもしくは鼻スプレー剤としての周知の組成物に製剤化することができる。典型的な組成物は、とりわけＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｆｉｆｔｅｅｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９７５年）、１４０５〜１４１２頁および１４６１〜８７頁、および米国国民医薬品集ＸＩＶ ｆｏｕｒｔｅｅｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（米国薬剤師会、１９７５年）に記載されているような、水溶液などの薬剤的に許容される担体、塩および保存剤を含めて非毒性添加剤、緩衝剤などを含む。

【0059】

好適な水性および非水性の医薬担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロース、およびそれらの好適な混合物、植物油（オリーブ油など）、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。

【0060】

組成物は、保存剤、湿潤化剤、乳化剤、緩衝剤、および分散剤などの添加物も含有することができるが、これらに限定されるものではない。微生物の増殖を防止するために、抗菌剤および抗真菌剤を含めることができ、その例としては、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などが挙げられる。さらに、等張化剤を含むことが望ましいこ
とがある。

【0061】

場合によっては、持続性作用をもたらすために、皮下または筋肉内注射からのＦＳＨ（および他の活性成分が存在する場合それら）の吸収を遅くすることが望ましい。これは、水溶性が不十分な結晶質または非晶質の材料の液体懸濁剤を使用することによって実現することができる。その場合、例えばＦＳＨの吸収速度はその溶解速度に依存し、溶解速度は結晶サイズおよび結晶形に依存することがある。あるいは、非経口投与されたＦＳＨ組合せの形の遅延吸収は、ＦＳＨ組合せを油ビヒクルに溶解または懸濁させることによって実施される。

【0062】

本発明によれば、本発明者らによって、ゴナドトロピン液体製剤の安定性に対する、ある種の化合物の効果を検討する取組みがなされた。ここで、ある種の化合物の安定化および不安定化作用が検討された。

【0063】

「安定性」という用語は、アミノ酸配列における共有結合的修飾が関与する化学的安定性を指すことがあるが、タンパク質安定性に関連して、タンパク質のフォールディング状態（すなわち、天然状態）の変化が関与するが、共有結合の開裂を伴わない物理的安定性を指すこともある。

【0064】

本発明において、「安定性」という用語は、本発明のゴナドトロピン、特にＦＳＨの製剤の物理的安定性を指す。タンパク質製剤の物理的不安定性は、高次の凝集塊を形成するタンパク質分子の凝集、ヘテロ二量体から単量体への解離、または本発明において含まれているＦＳＨタンパク質の少なくとも１つの生物活性を低減させる他の何らかのコンフォメーション変化によって引き起こされることがある。

【0065】

「安定な」溶液または製剤とは、その中に存在するタンパク質の凝集、解離、コンフォメーション改変、生物活性の喪失などの程度が、許容できる程度に制御され、経時的に許容できない程度に増加しないものである。安定性は、試料の光散乱、透明度および／もしくは呈色の目視検査、吸光度もしくは光学密度、分子サイズ決定（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはフィールドフローフラクショネーション）、インビトロもしくはインビボ生物活性の測定を含めて、当技術分野において周知である方法によって、かつ／または示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって評価することができる。安定性を評価する他の方法は、当技術分野において周知であり、本発明に従って使用することもできる。

【0066】

いくつかの保存剤は、ゴナドトロピン製剤に対する不安定化作用が顕著であることが知られており、驚くべきことに、塩、特にＮａＣｌまたはＮａ₂ＳＯ₄など、ＦＳＨ液体製剤の安定化に適していることが今回明らかになった、薬剤的に許容されるアルカリ金属カチオン、特にＮａ⁺またはＫ⁺を含む塩がさらに、医学的使用のための複数回投与ＦＳＨ液体製剤中に含める必要があるベンジルアルコール、フェノール、およびｍ−クレゾールのような保存剤の不安定化作用を防止するのに有用であることがわかった。本出願において特許請求される塩は、ＦＳＨ液体製剤に対する安定化作用を示し、その安定化作用は、有利にかつ驚くほど、例えばスクロースのような公知の安定化剤の安定化作用よりはるかに顕著である。スクロースのような公知の安定化剤に比べて改善された安定化作用は、特に驚くべきものである。さらに、全く予想外なことに、本発明の塩の安定化作用はＦＳＨ製剤に対して示すことができたが、非常に類似したｈＣＧに対しては安定化作用を示すことができなかった。さらに驚くべきことに、観測された安定性作用は、いわゆるホフマイスター系列（下記も参照のこと）に従うものではなく、実際には反するものであった。

【0067】

ＦＳＨの分解がＦＳＨ医薬製剤中で起こることは先行技術から公知であり、これは、本実施例の第１のセットで確認された。

【0068】

ＦＳＨは、時間に応じてかつ温度に応じて分解する。特に、室温を超える温度では、２次、３次、および４次構造が変化する。

【0069】

加熱したときに起こる３次および２次ＦＳＨ構造のコンフォメーションのアンフォールディングは、（タンパク質凝集が限定されているとき）２状態の遷移であると思われる。このアンフォールディングは、サブユニット解離（４次構造の変化）に依存しないことがある。

【0070】

さらに、ベンジルアルコールまたはフェノールのような保存剤が、例えばＦＳＨ液体製剤中に抗菌剤として必要な場合に、このような保存剤を含有するＦＳＨは、複数回投与ＦＳＨ製剤の安定性に明らかな悪影響を及ぼすことが、本発明で明らかになる。この場合、ＦＳＨの長期安定性は低下し、ＦＳＨの変性温度は低下し、すでに変性した形態は、２次構造のレベルが保存剤を含有しないＦＳＨ製剤より低下する。

【0071】

ＦＳＨ液体製剤の安定化のための薬剤的に許容されるアルカリ金属カチオン、すなわちＮａおよびＫを含む塩が、ＦＳＨ液体製剤の安定性に著しい効果があることも、本発明が初めて示す。これらの塩を含むＦＳＨ液体製剤中のＦＳＨの２次構造が、７６．５℃に加熱したとき著しく変化しないことを示すことができた。変性した形態は、例えばＮａ₂Ｓ
Ｏ₄の存在下で比較的明確な構造をもち、これによって変性がより可逆的になり、したが
って、タンパク質の速度論的安定性が大幅に向上する。これは、本発明において示されたリアルタイム安定性データによって裏付けられる。このデータから、ＦＳＨのヘテロ二量体構造に対する安定化作用が顕著であることが明らかである。

【0072】

ここでの結果から、本出願において特許請求される塩、例えば硫酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムは、ＦＳＨ分子の解離傾向を制限し、したがって貯蔵安定性を大幅に向上できることが明らかに示される。

【0073】

本発明はまた、ＦＳＨ液体製剤の安定化方法であって、上記の塩を前記製剤に添加するステップを含む方法に関する。

【0074】

全ての研究は、さらに実施されたリアルタイムデータによって確認された。

【図面の簡単な説明】

【0075】

【図1】ｒＦＳＨについて、種々の温度におけるＣＤ（円偏光二色性、下記を参照のこと）信号（ｍｄｅｇｒｅｅ）を波長（ｎｍ）の関数として示す図である。２４．０℃→４５．９℃のスペクトル間に有意差は認められなかったが、５０℃を超えると、ＣＤ信号の温度依存性低下が認められた。ｒＦＳＨタンパク質（０．９３ｍｇ／ｍｌ）を、０．００３６ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０を含有する３．５７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ６．３）に溶解した。２４．０℃（太い実線トレース）、５０．３℃（破線トレース）、５４．７℃（点線トレース）、５９．０℃（一点鎖線トレース）、６３．４℃（星印）、６７．８℃（菱形印）、および７６．５℃（実線トレース）における走査。

【図2】Ｎａ₂ＳＯ₄を含有するｒＦＳＨについて、種々の温度におけるＣＤ信号（ｍｄｅｇｒｅｅ）を波長（ｎｍ）の関数として示す図である。２４．０℃→４５．９℃のスペクトル間に有意差は認められなかった。ｒＦＳＨタンパク質を、０．００３６ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０および８．６ｍｇ／ｍｌ硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄）を含有する３．５７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ６．３）に溶解した。２４．０℃（太い実線トレース）、５０．３℃（破線トレース）、５４．７℃（点線トレース）、５９．０℃（一点鎖線トレース）、および７６．５℃（実線トレース）における走査。

【図3】ベンジルアルコールを含有するｒＦＳＨについて、種々の温度におけるＣＤ信号（ｍｄｅｇｒｅｅ）を波長（ｎｍ）の関数として示す図である。２４．０℃→４５．９℃のスペクトル間に有意差は認められなかった。ｒＦＳＨタンパク質（０．９３ｍｇ／ｍｌ）を、０．００３６ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０および０．１７ｍｇ／ｍｌベンジルアルコールを含有する３．５７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ６．３）に溶解した。２４．０℃（太い実線トレース）、４５．９℃（丸印）、５０．３℃（破線トレース）、５４．７℃（点線トレース）、５９．０℃（一点鎖線トレース）、６３．４℃（星印）、６７．８℃（菱形印）、および７６．５℃（実線トレース）における走査。

【図4】ｈＣＧおよびｒＦＳＨのその後のＤＳＣ走査を示す図である。０．００５ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｌ−メチオニン、１ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．５）中の５ｍｇ／ｍｌ ｈＣＧ、および０．００５ｍｇ／ｍｌ ポリソルベート２０、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｌ−メチオニン、０．２４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．５）中の２．４ｍｇ／ｍｌ ｒＦＳＨに関するＤＳＣデータ。走査速度２．０℃／分。１回目のｒＦＳＨ走査（実線トレース）、２回目のｒＦＳＨ走査（一点鎖線トレース）、１回目のｈＣＧ走査（破線トレース）、および２回目のｈＣＧ走査（点線トレース）。１回目の走査の後、２回目の走査を行う前に、試料を２０℃に冷却した。

【図5】種々の糖または塩を含むｈＣＧのＤＳＣ走査を示す図である。０．００５ｍｇ／ｍｌ ポリソルベート２０、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｌ−メチオニン、および１ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．５）中の５ｍｇ／ｍｌ ｈＣＧのＤＳＣデータ。糖も塩も添加せず（太い実線トレース）、０．１Ｍ Ｎａ₂ＳＯ₄（実線トレース）、０．１Ｍ ＮａＣｌ（点線トレース）、０．１Ｍ ＮａＣｌＯ₄（破線トレース）、および０．１Ｍ スクロース（一点鎖線トレース）。走査速度２．０℃／分。

【図6】種々の糖および塩を含むｒＦＳＨのＤＳＣ走査を示す図である。０．００５ｍｇ／ｍｌ ポリソルベート２０、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｌ−メチオニン、および１ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．５）中の２．４ｍｇ／ｍｌ ｒＦＳＨのＤＳＣデータ。糖も塩も添加せず（太い実線トレース）、０．１Ｍ Ｎａ₂ＳＯ₄（実線トレース）、０．１Ｍ ＮａＣｌ（点線トレース）、０．１Ｍ ＮａＣｌＯ₄（破線トレース）、および０．１Ｍ スクロース（一点鎖線トレース）。走査速度１．０℃／分。

【発明を実施するための形態】

【0076】

以下の実施例によって、本発明をさらに説明するが、実施例は、決してその範囲を限定するものと解釈してはならない。

【実施例】

【0077】

（実施例１） シンクロトロン放射光円偏光二色性分光法（ＳＲＣＤ）
方法
デンマークのオルフス大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａａｒｈｕｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）にて、シンクロトロン設備を使用して、円偏光二色性分光法を行った。全てのＣＤスペクトルは、光路長０．１ｍｍのスプラシル石英セル（Ｈｅｌｌｍａ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、波長範囲１８０〜２７０ｎｍにわたって、ステップ１ｎｍおよび滞留時間３秒／波長で記録した。ｒＦＳＨ試験と参照（プラセボ）試験の両方の各実験について、３つの同一ＣＤ走査を記録した。この報告で提示されたｒＦＳＨのＣＤスペクトルは、対応するプラセボの平均走査を平均タンパク質走査から引き算することによって得られた。ＣＤ走査の各セットについて、約１２０μｌの溶液（約１１２μｇのｒＦＳＨに相当する）を使用した。

【0078】

ｒＦＳＨのＣＤスペクトルに対する温度の影響を検討中に、加熱室の温度を、５℃間隔および平衡時間５分間で２５℃から８５℃に変更した。較正ファイルから、実際の実験温度（スプラシル石英セル中の温度）を決定した。

【0079】

ＣＤは、構造的非対称のため生ずる左回転および右回転の円偏光の吸収の差を測定する。

【0080】

タンパク質の２次構造を、ＣＤ分光法で遠ＵＶ領域（約１８０〜２５０ｎｍ）において検討することができる。一般に、規則正しい構造ほど、高い強度のＣＤ信号（正または負）に従う。しかし、異なる２次構造は異なるＣＤスペクトルを有するものであり、またα−ヘリックスはβ−構造より高いＣＤ信号強度を有するので、異なるタンパク質間で直接比較をして、規則構造の程度について結論を出すことはできない。

【0081】

構造変化に対する感受性が高いため、ＣＤ分光法は、タンパク質の物理的安定性を検討する際に強力なツールである。このような研究は、通常、外的要因、例えば温度、ｐＨ、変性剤、界面活性剤または安定化剤の濃度の変化に応じて、ＣＤスペクトルを検出することによって行われる。本研究において、ｒＦＳＨのＣＤスペクトルは、温度に応じて検討される。さらに、ｒＦＳＨの２次構造に対するベンジルアルコールおよび硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄）の効果を研究した。

【0082】

この実施例ならびに実施例２および３で使用されるゴナドトロピンは、組換え卵胞刺激ホルモン（ｒＦＳＨ）であるが、組換えＤＮＡ技術を使用して、ヒトＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株から発現させたヒトホルモンである。ｒＦＳＨは、ＦＳＨ、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に共通している、９２個のアミノ酸からなるαサブユニットと、ＦＳＨに特異的な１１１個のアミノ酸からなるβサブユニットの２種類のグリコシル化単量体からなるヘテロ二量体タンパク質である。ＦＳＨを含む糖タンパク質ホルモンは全て、非共有結合で結合している単量体が解離したとき、ホルモンの生物活性を失う。以前の結果から、ｒＦＳＨの不安定性は、主に二量体解離（４次構造の分解と、これに付随して免疫結合反応の低下）に基づくことが示された。

【0083】

使用目的に応じて、現在販売されているｒＦＳＨ製剤は、３７．５ＩＵ／ｍｌ（Ｇｏｎａｌ−ｆの場合、約２．８μｇ／ｍｌに相当する）から少なくとも８３３ＩＵ／ｍｌ（Ｐｕｒｅｇｏｎの場合、約８３．３μｇ／ｍｌに相当する）までの様々な濃度で提供されている。

【0084】

研究で使用されるｒＦＳＨは、皮下注射用の液体医薬品製剤（６００ＩＵ ｒＦＳＨ／ｍｌ）向けのものである。この製品は、複数回投与注射を目的としているので、保存剤の添加が必要である。

【0085】

検討される製剤は、様々な材料の原液を混合することによって作製した。タンパク質と添加剤の両方の検討される濃度間隔は、使用する方法によって制限される。すなわち、タンパク質濃度は、添加剤濃度に比べて比較的高く維持する必要があった。芳香族化合物が、検討される波長領域においてＵＶ吸収するため、ベンジルアルコール濃度は低く維持する必要があった。下記の表は、本発明者らによる第１の実験計画において検討された異なる３種類の製剤の概要を記す。

【0086】

【表1】

【0087】

試料１
ｒＦＳＨの試料１（表１を参照のこと）について、２４℃から７７℃の間で異なる１３の温度において、ＣＤスペクトルを記録した。明確にするため、これらのスペクトルのうち７つだけを図１に示す。試料１は、表１から推論できるように、塩も保存剤も含んでいなかった。スペクトルを図１に示す。結果は、ＣＤ信号の強度が温度に応じて低下することを明らかに示し、これは、高温（＞５０℃）においては２次構造が分解することを示している。２４．０℃→４５．９℃のスペクトル間では有意差は検出されなかった。これは、約４６℃に加熱したとき、測定時間（約２０分間）中では、タンパク質の２次構造が変化していないことを示している。加熱したときのＦＳＨのＳＲＣＤスペクトルは、約１９３ｎｍに等二色点（ｉｓｏｄｉｃｈｒｏｉｃ ｐｏｉｎｔ）を示す。等二色点は、試料２のスペクトルについても見られる。図２を参照のこと。

【0088】

試料２
ｒＦＳＨのＮａ₂ＳＯ₄を含有する試料２（表１）について、ＣＤスペクトルを記録した。スペクトルは、２４℃から７７℃の間で異なる１３の温度において得られ、図２に示される。明確にするため、これらのスペクトルのうち５つだけを図２に示す。結果は、温度に応じた２次構造の分解を示している。データから、（実験時間中）約４６℃に加熱したとき、試料２中のｒＦＳＨの２次構造は変化していないことが明らかである。重要なことに、データから、変性した形態がＮａ₂ＳＯ₄の存在下で比較的明確な構造をもつことも明らかである。

【0089】

試料３
ｒＦＳＨのベンジルアルコール（ＢＡ）を含有する試料３（表１）について、ＣＤスペクトルを記録した。ベンジルアルコールは、ＦＳＨ液体製剤用に非常によく選択される抗菌性保存剤である。例えば、ｍ−クレゾールに比べて保存能力が比較的低いため、ＢＡを高濃度（約１０〜１５ｍｇ／ｍｌ）で使用しなければならない。ｒＦＳＨの使用目的が１カ月以下期間にわたる複数回の注射であり、かつｒＦＳＨが通常は室温で貯蔵されるので、保存剤が必要である。

【0090】

０．１７ｍｇ／ｍｌ ＢＡの存在下ｒＦＳＨのスペクトルは、２４℃から７７℃の間で異なる１３の温度で得られ、図３に示される。明確にするため、これらのスペクトルのうちの８つだけを図３に示す。ベンジルアルコールの非常に高いＵＶ吸光度（および付随する低いＣＤ信号）のため、検討されるＢＡ濃度を上げることはできず、したがってｒＦＳＨ製剤を保存するのに使用することになる濃度に近づけることができなかった。それにもかかわらず、ＢＡの明らかな不安定化作用が認められた。ＣＤの結果は、試料３中のｒＦＳＨの２次構造が、試料１および２中のｒＦＳＨの初期変性温度より若干低い４２℃に加熱したとき変化していないことを示している。

【0091】

さらに、および重要なことに、データから、変性した形態には、規則構造が、保存剤の非存在下におけるＦＳＨを著しく上回るほどないことが明らかである。

【0092】

温度誘導構造変化に対する添加剤の効果
本出願において特許請求される塩の代表例としてここで使用されたＮａ₂ＳＯ₄塩は、温度で変性したタンパク質の構造に対して著しい効果を示した。これは、明らかに重要な発見である。変性した（アンフォールディングしたまたは部分的にアンフォールディングした）タンパク質は、天然タンパク質より、会合して、凝集塊を形成する傾向が高い（Ｆｉｎｋ，Ａ．Ｌ．、１９９８年、Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ．、３巻（１号）：Ｒ９〜Ｒ２３頁）、結果は、硫酸ナトリウムが、ｒＦＳＨ分子の変性する傾向を制限し、したがって凝集のリスクを制限することができ、それによって貯蔵安定性を大幅に増加させることを示している。一方、ベンジルアルコール（ＢＡ）は、高温において著しい構造分解を引き起こす。規則正しい２次構造は、ＳＲＣＤで検出されなかった。ＢＡの観測された効果（さらにアンフォールディングした構造）は、他のタンパク質系でベンジルアルコールを添加したときに見られる凝集の増大の理由を部分的に説明できる（Ｍａａ，Ｙ．およびＨｓｕ，Ｃ．Ｃ．、１９９６年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．、１４０巻：１５５〜１６８頁；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら、２００４年、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、９３巻（１２号）：３０７６〜３０８９頁）。

【0093】

しかし、保存剤の添加は、複数回投与製剤の開発に極めて重要であり、ｒＦＳＨ製品が市場に存在していることから、比較的高い含有量のベンジルアルコールを含む場合であっても、より安定な製剤が開発される必要があることがわかっている（Ｐｕｒｅｇｏｎ（登録商標）は、１０ｍｇ／ｍｌ ベンジルアルコールを含有する）。

【0094】

ベンジルアルコールは、ｒＦＳＨの安定性を低下させ、加熱したとき規則正しい２次構造の喪失を容易にすることがわかった。しかし、保存剤の添加は重要である。この研究によって、本出願において特許請求する塩は、加熱されたｒＦＳＨ製剤における規則構造のレベルを向上させることが明らかになった。したがって、これらの塩は、ｒＦＳＨ液体製剤中の安定化剤（単数または複数）として、例えばベンジルアルコールまたは他のフェノール系保存剤の作用を代償するのによく適している。

【0095】

（実施例２） 示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
この実施例において代表的に使用されるＦＳＨは、実施例１と同じである。一般に、タンパク質の天然（生理活性）構造は、その周囲の状況、例えば製剤の組成、容器システム、ｐＨおよび温度に非常に感受性である。本実施例において、ｒＦＳＨ変性温度Ｔ_mを液
体示差走査熱量測定（ＤＳＣ）で検討した。ｒＦＳＨ変性温度は、溶液状態のタンパク質の安定性の指標をもたらし、より高いＴ_mは、より安定なタンパク質を示唆する。

【0096】

タンパク質の３次および４次構造は、主に非共有結合的相互作用で安定化される。これらの分子内相互作用の多くは、アンフォールディング時に水分子との非共有結合的相互作用で置換されるので、異なる構造形態（すなわち、天然と変性）間の熱力学的バランスが微妙である。一般に、これは、天然タンパク質の安定性が限定されることを意味する。多くのタンパク質は、約７０℃で熱アンフォールディングする。タンパク質フォールディングまたは変性は、ＤＳＣを使用して直接研究および数量化することができる熱力学パラメータで説明することができる。したがって、ＤＳＣは、タンパク質安定性に対する添加剤の効果を研究し、したがってタンパク質治療に最適な製剤を特定するのに重要なツールである。

【0097】

液体示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
理論
液体ＤＳＣにおいて、タンパク質試料を加熱する（すなわち、試料温度を上げる）と、わずかに上昇するベースラインだけが得られるが、加熱を続ける（すなわち、温度の上昇を続ける）と、熱がタンパク質に吸収され、タンパク質は、その研究されたタンパク質にとって特徴的な温度範囲にわたって熱アンフォールディングする。これによって、吸熱ピークが生じる。タンパク質アンフォールディング時に、より疎水性の鎖が露出されるので、タンパク質を囲む水分子は再編成する。アンフォールディングが完了すると、熱吸収は低下し、新しいベースラインが形成される。

【0098】

試料の熱容量Ｃ_pの積算によって、式（１）のアンフォールディングプロセスに伴うエ
ンタルピー変化ΔΗが得られる。観測されたエンタルピー変化は、水素結合の破断などの吸熱過程およびタンパク質と周囲媒体の間の水素結合の形成などの発熱過程から生じる。熱転移の中点または転移中点Ｔ_m（タンパク質変性温度と呼ばれることが多い）は、タン
パク質分子の半分がフォールディングし、タンパク質分子の半分がアンフォールディングしている温度である。

【0099】

【数1】

【0100】

ＤＳＣ測定の生データ、すなわち、温度の関数としての熱発生率（単位：Ｗ）を、容易に部分モル熱容量（単位：Ｊ／ｍｏｌ Ｋ）に再計算することができ、使用するタンパク質のモル質量および濃度がわかる。

【0101】

試験方法
タンパク質変性温度Ｔ_mは、３００μｌのデュアルキャピラリーセルを装備した液体Ｄ
ＳＣ（ＴＡ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＮａｎｏ ＤＳＣ）で、以下のパラメータを使用して測定した：
走査速度：０．５〜２．０℃／分、他に何も記載されていない場合、走査速度１．０℃／分を使用する（実施例４の場合、２．０℃／分）
開始温度：２０℃
最終温度：１００℃
平衡：９００ｓ（または、実施例４の場合、９００ｓ（１回目走査）６００ｓ（２回目走査））
定圧：３ａｔｍ

【0102】

試料は全て、測定前に１５分間脱気した。各タンパク質試料後に、試料セルを５０％ギ酸で清浄した。さらに、各試料のランの後に、セルを１０００ｍｌの精製水ですすいだ。試料は全て、対照セル中の対応するプラセボとともに測定した。対照セルと試料セルの両方に充填したプラセボ溶液について別個の走査から得られた結果を、評価前にデータから差し引いた。すなわち、ブランクの差し引きを行った。

【0103】

ＭＡＬＤＸ−ＴＯＦ ＭＳ
酵素シアリダーゼで処理する前後のｒＦＳＨの試料を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳ）で分析して、脱シアリル化反応の程度を評価した。Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩ ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）で、スペクトルを取得した。シナピン酸をマトリックスとして使用した。分析は、ディレイドエクストラクションを利用して、正イオンリニアモードで行った。４０００〜２０８９３Ｄａの走査範囲を、外
部較正して使用した。

【0104】

この実施例の目的
この実施例の目的は、液体示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によってｒＦＳＨの熱安定性を検討すること、および保存剤（フェノールまたはベンジルアルコール）が添加された場合と添加されていない場合のｒＦＳＨに対する種々の塩の安定化作用を研究することであった。

【0105】

この研究は以前の円偏光二色性（ＣＤ）分光法の研究（上記実施例１）およびリアルタイム安定性の研究（下記の実施例３）とともに全て、溶液状態のｒＦＳＨの安定性に対する塩および保存剤の作用を研究することを目的とする。

【0106】

研究対象の製品
ｒＦＳＨバッチ情報
ｒＦＳＨ原薬（バッチ番号０８８０００２０およびバッチ番号０９ＰＤ８００１０）は、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｅｎｅｒａｌ（ＢＴＧ）、Ｉｓｒａｅｌで製造されたものである。

【0107】

ｒＦＳＨの生物活性の決定は、ヨーロッパ薬局方に従って行った。使用されたｒＦＳＨの２バッチの濃度は、それぞれバッチ０８８０００２０については１３，２２３ＩＵ／ｍｇ（９，２５６ ＩＵ／ｍｌが得られる）と、バッチ０９ＰＤ８００１０については１５，１０９ＩＵ／ｍｇ（１０，５７６ ＩＵ／ｍｌが得られる）と決定された。

【0108】

材料
添加剤
ｒＦＳＨ溶液中で使用される添加剤のリストを、表２に記載する。

【0109】

【表2】

【0110】

被検溶液の組成
被検ｒＦＳＨおよびプラセボ溶液の組成を、表３、表４および表５に記載する。保存剤の被検濃度は、ヨーロッパ薬局方、非経口使用を目的とする製剤の保存有効性に関する基準（Ｐｈ．Ｅｕｒ．Ａ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｉｍｅｄ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｕｓｅ）を満たすのに要する濃度に基づいて選択される。

【0111】

被検塩濃度は、被検溶液で等張性を得るのに必要とされた硫酸ナトリウムの濃度、すなわち０．１Ｍ 硫酸ナトリウムに基づいている。他の塩は全て、硫酸ナトリウムと同じモル濃度で試験した。さらに、より高いおよびより低い濃度の塩化ナトリウムを試験して、ｒＦＳＨ変性温度Ｔ_mに対する塩濃度の影響を評価する。

【0112】

被検溶液中のリン酸ナトリウム緩衝液の濃度を低く維持して、緩衝塩それ自体の安定化／不安定化作用のリスクを最小限に抑制する。

【0113】

【表3】

【0114】

【表4】

【0115】

【表5】

【0116】

製造手順
全ての溶液（表３、表４および表５）は、Ｆｅｒｒｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ａ／Ｓ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にて実験室スケールで製造する。製造手順を以下にまとめる。

【0117】

ｒＦＳＨ原液調製
リン酸緩衝液中のｒＦＳＨ原液は、出発材料としてバッチ０８８０００２０またはバッチ０９ＰＤ８００１０のｒＦＳＨ原薬溶液を使用して、濃縮ステップを加えることによって調製する。分画分子量（ＭＷＣＯ）１０ｋＤａの膜を備えたＶｉｖａｓｐｉｎ ２０デバイス（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、濃縮（ｕｐ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を行う。膜は、１ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ５．５、６．５または７．５）中に０．５ｍｇ／ｍｌ Ｌ−メチオニン、０．００５ｍｇ／ｍｌ ポリソルベート２０を含有する、対応するプラセボ溶液１５ｍｌを、フィルターに通して遠心分離することによって予洗する。遠心分離は、スイングアウト型ローターを使用して、３０００×ｇで２０分間行う。

【0118】

濃縮ステップを行うには、合計８０ｍｌのｒＦＳＨ試料を使用して、４個のＶｉｖａｓｐｉｎ ２０デバイス（２０ｍｌ／デバイス）を満たし、３０００×ｇで１５分間遠心分離する。各濃縮分を２０ｍｌのメスフラスコに移す。フィルターを、所望のプラセボ溶液の少量ずつで洗浄する。洗浄溶液をメスフラスコに移し、最後に同じプラセボ溶液を使用
して一定体積になるまで希釈する。こうして、それぞれ１ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ５．５、６．５または７．５）中に０．５ｍｇ／ｍｌ Ｌ−メチオニン、０．００５ｍｇ／ｍｌ ポリソルベート２０を含有する２．８ ｍｇ／ｍｌ ｒＦＳＨ原液が得られる。

【0119】

ｒＦＳＨ溶液およびプラセボ溶液の調製
保存剤を除く全ての添加剤の原液を、ミリＱ水中で調製する。
ｒＦＳＨ溶液およびプラセボ溶液の調製には、各添加剤の原液を混合して、表３、表４および表５に記載の所望の濃度を得る。保存剤を溶液に直接添加する。

【0120】

ｒＦＳＨの脱シアリル化
１ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．５）中に０．５ｍｇ／ｍｌ Ｌ−メチオニン、０．００５ｍｇ／ｍｌ ポリソルベート２０を含有する、ｒＦＳＨ濃度２．８ ｍｇ／ｍｌの濃縮ｒＦＳＨ溶液を使用して、ｒＦＳＨに結合している糖部分からシアル酸を取り除く。Ｓｉｇｍａのα（２→３，６，８，９）ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）を使用して、酵素的除去を行う。３７℃で振盪しながら、ｒＦＳＨをノイラミニダーゼで終夜処理する。ｒＦＳＨの濃縮のために上述したＶｉｖａｓｐｉｎデバイスを使用して、試薬を除去する。酵素を含有するｒＦＳＨ溶液を、予洗されたＶｉｖａｓｐｉｎデバイスに移す。デバイスを遠心分離し、濾液を捨て、濃縮分を、１ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．５）中に０．５ｍｇ／ｍｌ Ｌ−メチオニン、０．００５ｍｇ／ｍｌ ポリソルベート２０を含有するプラセボ溶液に再懸濁する。溶液を再度遠心分離する。この手順を３回繰り返した後、最終濃縮分をメスフラスコに移し、プラセボ溶液で一定体積になるまで希釈する。こうして、１ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．５）中に０．５ｍｇ／ｍｌ Ｌ−メチオニン、０．００５ｍｇ／ｍｌ ポリソルベート２０を含有する、２．８ｍｇ／ｍｌ 脱シアリル化ｒＦＳＨ原液が得られる。

【0121】

結果および考察
ｒＦＳＨ Ｔ_mに対するＤＳＣ走査速度の影響
ｒＦＳＨ変性温度に対するＤＳＣ走査速度の影響を検討するために、異なる３つの走査速度でＴ_m測定を行う。表６でわかるように、ｒＦＳＨ Ｔ_mは、測定時に使用されるＤＳＣ走査速度によって変わる。

【0122】

同一の走査速度で行われた測定から得られた変性温度を比較する限り、Ｔ_mが走査速度
によって変わることは、データの解釈に影響を及ぼさない。例えば、表７を参照のこと。

【0123】

【表6】

【0124】

１００℃までのＤＳＣ走査を繰り返すと、ｒＦＳＨの変性は、実験条件下で部分非可逆的であることが明らかになった（図４を参照のこと）。これは、リフォールディングが、２回のＤＳＣ走査間の平衡時間より遅いこと、またはアンフォールディングが、式２に示すように非可逆的ステップを伴うことを意味する。
天然←→アンフォールディング→非可逆的変性 （２）

【0125】

ｒＦＳＨ Ｔ_mに対する保存剤添加の影響
表７でわかるように、保存剤のｒＦＳＨ溶液への添加によって、変性温度Ｔ_mは、使用
した保存剤にもよるが２〜６℃低下する。これは、他の組換えタンパク質と尿由来ＦＳＨとについて以前に報告されたデータとよく符合する。

【0126】

フェノールを含むｒＦＳＨ溶液に比べて、ベンジルアルコールを含むｒＦＳＨ溶液は、得られたＴ_mの低下が大きい（表７を参照のこと）。これは、実験で使用されたフェノー
ル（５ｍｇ／ｍｌ）より、ベンジルアルコール（１５ｍｇ／ｍｌ）の濃度の方が高いことから説明することができる。

【0127】

【表7】

【0128】

ｒＦＳＨ Ｔ_mに対する種々の塩の添加の効果
タンパク質溶解性および安定性に対する一般的効果に従った塩のランク付けは、下記の式（３）のホフマイスター系列またはリオトロピック系列（lyothropic series）と呼ば
れる。左側の塩析剤、いわゆるコスモトロピックイオンは、安定化作用をタンパク質にもたらすことが知られている。一方、右側のカオトロピックイオンまたは塩溶イオンは、タンパク質を不安定化させることが知られている。
ＳＯ₄^2-＞ＨＰＯ₄^2-＞Ｆ^-＞Ｃｌ^-＞Ｂｒ^-＞ＮＯ₃^-＞Ｉ^-＞ＣｌＯ₄^-＞ＳＣＮ^- （３）

【0129】

保存剤を含まない溶液への種々の塩の添加がｒＦＳＨ Ｔ_mに及ぼす効果
種々のナトリウム塩のｒＦＳＨ Ｔ_mに対する効果を測定するとき、かなり驚くべきこ
とに、上述されたホフマイスター系列に従って予想される安定化／不安定化作用は、カチオンを変更すると認められなかった。表８および表９を参照のこと。最もコスモトロピックなイオンである硫酸イオンを使用したかまたはカオトロピックなイオンである過塩素酸イオンを使用したかにかかわらず、変性温度の上昇はほぼ同じであった。実際、ｒＦＳＨに対する不安定化作用が予想される過塩素酸イオンの塩の場合に、ｒＦＳＨ Ｔ_mの最大
の上昇が得られた。Ｔ_mの上昇は、硫酸イオン、塩化物イオンおよび過塩素酸イオンのよ
うな種々の無機アニオンとクエン酸イオン、酢酸イオンおよび酒石酸イオンのような有機アニオンとについて同じ範囲であった。

【0130】

【表8】

【0131】

【表9】

【0132】

異なるナトリウム塩を添加したとき、ホフマイスター系列中のアニオンの位置は、ｒＦＳＨ Ｔ_mの上昇に影響を及ぼさないという観測された傾向は、カリウムの場合にも認め
られる（表８および表９を参照のこと）。同じカチオンを有すると、一般にｒＦＳＨ Ｔ_mの変化に及ぼすアニオンの影響はわずかでしかなく、まったくホフマイスター系列に従
ったものではない。

【0133】

かなり驚くべきことに、他方では、カチオンはｒＦＳＨ Ｔ_mにまさに影響を及ぼして
いる。さらに具体的には、１価のカチオンを含む塩は、一般に２価イオンより高いｒＦＳＨ Ｔ_mを示す（表８を参照のこと）。特に、１価のアルカリ金属イオンは、高いｒＦＳ
Ｈ Ｔ_mをもたらす。言い換えれば、塩を添加したとき観測された安定化作用（すなわち
、ｒＦＳＨ Ｔ_mの上昇）は、被検アニオンとはまったく無関係であり（表８および９を
参照のこと）、一方、カチオンは、安定化の程度に大きな影響を及ぼしている。カリウムおよびナトリウムの塩は、特に大きな安定化作用を示す。

【0134】

上記の被検溶液は全て、塩濃度が０．１Ｍである。ｒＦＳＨ Ｔ_mに対する塩濃度の影
響を検討するために、異なる３つの塩化ナトリウム濃度をもつｒＦＳＨ溶液のＤＳＣ測定値を検討した。塩をｒＦＳＨ溶液に添加したときの安定化作用は、被検塩濃度の全範囲で認められる（表１０を参照のこと）。

【0135】

【表10】

【0136】

ＦＳＨ製剤に関する既存の特許では、ＦＳＨの安定化剤として例えばスクロースが使用されている。０．１Ｍ スクロースをｒＦＳＨ溶液に添加すると、ｒＦＳＨ Ｔ_mの変化
は微小であり（表８および表９を参照のこと）、カリウム塩またはナトリウム塩を添加したときのｒＦＳＨの安定化作用は、スクロースを添加したときに得られる作用より著しく高いことが示唆される。

【0137】

保存剤が添加された溶液への種々の塩の添加がｒＦＳＨ Ｔ_mに及ぼす効果
保存剤のタンパク質溶液への添加によって、溶液状態のタンパク質の安定性が低下することは周知である。しかし、非経口使用を目的とする複数回投与水性製剤では、保存剤は必要なものである。したがって、保存剤を添加したときのタンパク質安定性の低下を、塩のような安定化剤をｒＦＳＨ溶液に添加することによって代償することは非常に重要である。

【0138】

【表11】

【0139】

表１１でわかるように、保存剤をｒＦＳＨ溶液に添加することによって、ｒＦＳＨ変性温度が２〜３℃低下する。保存剤が添加されたｒＦＳＨ溶液に塩を添加すると、ｒＦＳＨ変性温度が約５℃上昇する。言い換えれば、保存剤をｒＦＳＨ溶液に添加したとき観測された不安定化作用は、本発明で定義される塩の添加によってよく代償される。実際は、フ
ェノールを含有するｒＦＳＨ溶液への塩の添加は、ｒＦＳＨ Ｔ_mに対する保存剤の作用
を相殺するのではなく、保存剤または塩が添加されていない水溶液中のｒＦＳＨに比べてＴ_mを実際に上昇させている（表１１を参照のこと）。

【0140】

ｒＦＳＨ Ｔ_mに対するｐＨ変更の影響
安定化塩が添加された場合と添加されていない場合のｒＦＳＨ Ｔ_mに対するｐＨの影
響を研究するために、異なる３つのナトリウム塩が添加された場合と添加されていない場合のｒＦＳＨ変性温度をｐＨ ５．５、６．５および７．５で決定した（表１２を参照のこと）。

【0141】

【表12】

【0142】

表１２でわかるように、異なるナトリウム塩を添加したときのｒＦＳＨ Ｔ_mの一般的
な傾向は、ｐＨ ５．５〜７．５の全範囲にわたって同じである。すなわち、ホフマイスター系列に従った塩の安定化／不安定化作用からの逸脱が、全ての被検ｐＨにおいて認められる。

【0143】

検討されたｐＨ範囲において、観測されたｒＦＳＨ変性温度は、塩が添加された場合と添加されていない場合との両方で溶液のｐＨが上昇するにつれて上昇する（表１２を参照のこと）。塩を添加したときのｒＦＳＨ変性温度の実際の上昇ΔＴ_m(塩₎は、ｐＨが高く
なるほど若干低くなる（表１２を参照のこと）。

【0144】

ｒＦＳＨ Ｔ_mに対するｒＦＳＨシアリル化の影響
上記から明らかなように、塩のｒＦＳＨ溶液への添加の影響は、上記のホフマイスター系列に全く従わず、過塩素酸イオンの塩は、タンパク質を不安定化するものと予想され（タンパク質Ｔ_mの低下をもたらす）、硫酸イオンは、タンパク質を安定化するものと予想
される（タンパク質Ｔ_mの上昇をもたらす）。

【0145】

ｒＦＳＨは、糖部分に結合している多数のシアル酸残基、したがってかなり高い正味負電荷を有するグリコシル化されたタンパク質であるので、塩の予想外の安定化挙動に対するシアル酸の影響を検討した。

【0146】

異なる塩を添加したときのｒＦＳＨ Ｔ_mに対するシアル酸の影響を研究するために、
シアル酸の酵素的除去を行った。次いで、塩が添加された場合と添加されていない場合の脱シアリル化ｒＦＳＨをＤＳＣによって分析した。

【0147】

シアル酸残基の除去が成功したことを検証するために、シアル酸の酵素的除去の前後のｒＦＳＨ試料を、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳによって分析した。

【0148】

ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳの酸試料条件下で、αサブユニットとβサブユニットを解離
させ、したがって別々に測定する。シアリダーゼ処理前のαサブユニットの平均分子量は１５０００Ｄａである。シアリダーゼで処理した後、平均分子量は１４０００Ｄａである。シアリダーゼ処理前のβサブユニットの平均分子量は１８０００Ｄａであり、シアリダーゼ処理後は１７０００Ｄａである。両サブユニットの質量のシフトは、シアル酸除去の結果であり、質量低減になる。実際に、シアル酸残基は全て、脱シアリル化中にｒＦＳＨから除去された。

【0149】

硫酸ナトリウムまたは過塩素酸ナトリウムを添加したときのｒＦＳＨ Ｔ_mの上昇は、
無修飾ｒＦＳＨおよび脱シアリル化ｒＦＳＨで同じ傾向に従う。すなわち、観測された安定化作用（ｒＦＳＨ Ｔ_mの上昇）は、上記のホフマイスター系列に従わない。一般に、
観測されたＴ_mは、無修飾ｒＦＳＨより脱シアリル化ｒＦＳＨの方が２〜６℃低い（表１
３を参照のこと）。塩を添加したときに観測された安定化作用も、無修飾ｒＦＳＨより脱シアリル化ｒＦＳＨの方が低い（表１３を参照のこと）。

【0150】

ｒＦＳＨの糖部分にシアル酸が存在していることが、ｒＦＳＨ安定性を向上させると考えられるので、得られるＴ_mは、無修飾ｒＦＳＨより脱シアリル化ｒＦＳＨの方が低いと
予想される。

【0151】

無修飾ｒＦＳＨも脱シアリル化ｒＦＳＨも、種々の塩を添加したとき同じ傾向に従う（ホフマイスター系列に従う安定化／不安定化作用から逸脱する）という事実から、この作用を引き起こすのは、ｒＦＳＨそれ自体におけるシアル酸の存在ではないことがわかる。

【0152】

【表13】

【0153】

結論
保存剤を添加したときのｒＦＳＨで観測された不安定化作用（ｒＦＳＨ Ｔ_mの低下）
は、この分野における技術水準の認識とよく符合する。

【0154】

しかし、異なるアニオンの塩を添加したときのｒＦＳＨ変性温度で観測されたホフマイスター系列からの逸脱は、予想外である。ホフマイスター系列に従って、（タンパク質溶解性および安定性に対する一般的効果に従って、塩をランク付けする）、硫酸イオンのようなコスモトロピックアニオンは、通常タンパク質を安定化し（Ｔ_mの上昇）、一方、過
塩素酸イオンのようなカオトロピックアニオンはタンパク質を不安定化する（Ｔ_mの低下
）。この研究では、同じカチオンを有する被検アニオンは全て、ｒＦＳＨ変性温度の同様な上昇を示す。ホフマイスター系列からの予測と全く正反対に、過塩素酸イオンの塩は、ｒＦＳＨ変性温度の最大の上昇を示す。

【0155】

言い換えれば、塩を添加したときに観測された安定化作用（すなわち、ｒＦＳＨ Ｔ_m
の上昇）は、被検アニオンとはまったく無関係である。ナトリウムおよびカリウムの塩は、特に大きな安定化作用を示す。特に、過塩素酸ナトリウムのｒＦＳＨ溶液への添加によって、ｒＦＳＨ変性温度の大きな上昇が生じる。しかし、過塩素酸塩は、通常反応性が高
く、酸化剤であり、したがって医薬製剤の不活性成分として認可されない。

【0156】

塩の添加時にｒＦＳＨについて得られた予想外の安定化作用は、ｒＦＳＨの糖部分にシアル酸が存在していることでは説明できない。脱シアリル化ｒＦＳＨについてのｒＦＳＨ変性温度の決定は、無修飾ｒＦＳＨとしての塩の添加時のｒＦＳＨの安定化作用において同じ傾向を示す。

【0157】

（実施例３） ｒＦＳＨ溶液についてのリアルタイム安定性
研究の目的
この研究の目的は、種々の製剤中のｒＦＳＨのリアルタイム安定性が、実施例２で説明されたように、液体ＤＳＣによるｒＦＳＨ変性温度の測定、また実施例１で説明されたように、ＣＤ分光法で測定された加熱時のｒＦＳＨの２次構造の変化で見られるのと同じ傾向に従うかどうかを確立することである。この研究では、いかにｒＦＳＨがその単量体に解離しやすいかについて測定して、ｒＦＳＨの貯蔵中の構造安定性を決定する。

【0158】

ｒＦＳＨ ６００ＩＵ／ｍｌの製剤の、異なる２つの貯蔵温度で貯蔵した後の安定性を、長期にわたる５±３℃／周囲ＲＨおよび促進３０±２℃／６５±５％ ＲＨ条件で６〜１２カ月研究した。全てのバイアルを倒立させて貯蔵した。対応する製剤を含有するが、ｒＦＳＨを添加しないプラセボ対照を、活性ｒＦＳＨについて説明したのと同じ条件下で貯蔵した。

【0159】

研究対象の製品
バッチ情報
ｒＦＳＨ原薬（バッチ番号０８８０００６０およびバッチ番号０９８０００２０）は、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｅｎｅｒａｌ（ＢＴＧ）、Ｉｓｒａｅｌで製造されたものである。
上記ｒＦＳＨバッチの生物活性の決定は、ヨーロッパ薬局方に従って行った。

【0160】

材料
添加剤
この研究で使用される添加剤のリストを、表１４に記載する。

【0161】

【表14】

【0162】

容器および施栓系
使用する主要なパッキング材料を、表１５に記載する。

【0163】

【表15】

【0164】

ｒＦＳＨ原液および異なる製剤（ｒＦＳＨおよびプラセボ）の組成を、表１６、表１７、および表１８に記載する。いずれの安定化剤／等張化剤も含有しない製剤を除いて、安定化剤／等張化剤の濃度を調整して、等張液を生じる。

【0165】

【表16】

【0166】

【表17】

【0167】

【表18】

【0168】

製造手順
全ての溶液（表１７および表１８）は、Ｆｅｒｒｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ａ／Ｓ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にて実験室スケールで製造する。製造手順を以下にまとめる。

【0169】

ｒＦＳＨおよびプラセボ製剤の調製
全ての添加剤の原液を、ミリＱ水中で調製する。

【0170】

プラセボ製剤の調製には、各添加剤の原液を混合して、表１８に記載の濃度を得る。一定体積になるまで希釈する前に、各製剤のｐＨを必要なときには調整する。

【0171】

ｒＦＳＨ製剤の調製には、希釈溶液を各添加剤の原液から調製する。希釈溶液のｐＨを調整する。希釈溶液をｒＦＳＨ原液（表１６を参照のこと）と混合して、表１７に記載の最終濃度を得る。

【0172】

無菌濾過および無菌充填
最終製剤は、０．２２μｍのＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して無菌濾過される。オートクレーブ処理したガラス瓶に、Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターを使用して、プラセボ製剤を無菌濾過する。オートクレーブ処理したガラスビーカーに、Ｓｔｅｒｉｖｅｘ−ＧＶフィルターおよび２０ ｍｌの無菌ルアーロック注射器（Ｂｒａｕｎ）を使用して、ｒＦＳＨ製剤を無菌濾過する。オートクレーブ処理したバイアルおよびゴム栓を使用して、バイアルの無菌濾過、充填および密封をＬＡＦベンチ中で行う。充填する前後に、０．２０μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＦＧ ＰＦＴＥフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通した窒素ガスで、バイアルを少なくとも６秒間パージする。バイアルに、バイアル１本あたり試料１．５ｍｌを充填する。全てのバイアルに無菌充填し、直ちにゴム栓およびアルミノフリップオフキャップで閉じる。

【0173】

保存条件
ｒＦＳＨ ６００ＩＵ／ｍｌを含有する試料およびプラセボを、５±３℃／周囲ＲＨで６〜１８カ月貯蔵する。さらに、試料を３０±２℃／６５±５％ ＲＨの促進条件で６〜１８カ月貯蔵する。各貯蔵温度において、バイアルを倒立させて貯蔵する。全てのバイアルを光から保護する。

【0174】

安定性プログラム
ｒＦＳＨ ６００ＩＵ／ｍｌおよびプラセボの安定性プログラムを、以下の表１９に示す。

【0175】

【表19】

【0176】

分析方法
この研究で使用される分析方法を、以下に説明する。各試験の際に、ｒＦＳＨのバイアル２本および対応するプラセボのバイアル１本を、各製剤について分析する。

【0177】

低分子量（ＬＭＷ）形態
ｒＦＳＨのＬＭＷ形態は、サイズ排除（ＳＥＣ）カラムで定組成溶離を利用するＬＣ−ＵＶによって決まる。分析は、シリカベースのカラムを使用し、トリス緩衝液を移動相として、ＵＶ検出で行う。ｒＦＳＨのＬＭＷ形態は、ｒＦＳＨの主ピークの分子量より（後に）低い分子量で溶離するピークである。ＬＭＷ形態は、全ピーク面積のピーク面積百分率として決定される。

【0178】

保存剤を含有する試料の場合、保存剤は、サイズ排除カラムに入る前に試料溶液から除去される。

【0179】

結果および考察
ｒＦＳＨの貯蔵中の解離
ｒＦＳＨは、非共有結合で結合している単量体が解離したとき、その生物活性を喪失するので、単量体解離によるｒＦＳＨ活性の喪失を追跡する簡単明瞭な方式は、溶液状態でｒＦＳＨ ＬＭＷ形態の量を測定することである。この情報は、ＳＥＣクロマトグラフィ
ーから回収することができ、ｒＦＳＨの主ピーク後に溶離するＬＭＷ形態ピークは、解離したｒＦＳＨから生じることが知られている。

【0180】

【表20】

【0181】

【表21】

【0182】

表２０でわかるように、保存剤が添加された場合と添加されていない場合の、異なる安定化剤を含有する新たに調製されたｒＦＳＨ溶液は、同様の相対量の解離ｒＦＳＨ（ＬＭＷ形態）を示す。ＳＥＣ方法の定量下限値は３％であるので、この下限値未満では、製剤間の明確な区別を行うことができない。これは、初期の時点で観測されたＬＭＷ形態の差が、方法に起因する変動の限界の範囲内であるという意味である。

【0183】

スクロースとともにまたは安定化剤なしでフェノールを含有する試料では、３０±２℃／６５±５％ ＲＨで１カ月貯蔵した後すでに、解離ｒＦＳＨの相対量が増加したが、硫酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムを含有する試料では、解離ｒＦＳＨの著しい増加が全く示されなかった（表２０を参照のこと）。

【0184】

フェノールを含有するが、安定化剤が添加されていないｒＦＳＨ試料には、３０±２℃／６５±５％ ＲＨで６カ月貯蔵した後、２０％を超える解離ｒＦＳＨ（ＬＭＷ形態）が含まれる。フェノールを含有し、スクロースを安定化剤として含むｒＦＳＨ試料も、解離
ｒＦＳＨの著しい増加を示す（１０％を超える解離ｒＦＳＨ）が、フェノールを含有し、塩化ナトリウムまたは硫酸ナトリウムで安定化されている試料は、解離ｒＦＳＨの微小の増加しか示さない（表２０を参照のこと）。保存剤を全く含有しない試料は、貯蔵中の解離に対して最も安定である。しかし、非経口使用を目的とする複数回投与水性製剤には、保存剤の添加が必要とされ、したがってこの製剤は、単に比較として加えられているに過ぎない。

【0185】

５±３℃／周囲ＲＨで６カ月貯蔵した後、被検ｒＦＳＨ製剤はどれも、解離ｒＦＳＨの相対量の増加を示さない（表２１を参照のこと）。しかし、市販のｒＦＳＨ製品として成功するには、５℃で少なくとも２４カ月貯蔵し、これに付随して室温で１カ月、好ましくは３〜４カ月貯蔵することが、必要とされる。

【0186】

ｒＦＳＨ変性温度、２次構造の変化、および解離度
この実施例の目的は、リアルタイム安定性研究データと、ＤＳＣによるｒＦＳＨ変性温度決定と、ＣＤ分光法で決定されたｒＦＳＨ２次構造データとの相関関係を決定することであったので、ＤＳＣデータの一部分（実施例２を参照のこと）およびＣＤデータの一部分（実施例１を参照のこと）を以下に示す。示したＤＳＣ結果に関する詳細は全て、実施例２に記載され、ＣＤデータに関する詳細は、実施例１に記載されている。

【0187】

【表22】

【0188】

表２２でわかるように、ＤＳＣで得られたｒＦＳＨ変性温度は、３０±２℃／６５±５％ ＲＨで６カ月貯蔵した後のリアルタイム安定性データとよく相関し、ＳＥＣで分析されたＤＳＣとリアルタイム安定性の同様の相関関係が、組換え抗体および組換え糖タンパク質について以前に示された（例えば、Ｂｕｒｔｏｎら、（２００７年）、Ｐｈａｒｍ，Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１２巻：２６５〜２７３頁およびＲｅｍｍｅｌｅら、（１９９８年）、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１５巻：２００〜２０８頁を参照のこと）。保存剤が添加されることなく、硫酸ナトリウムで安定化されたｒＦＳＨ溶液は、６カ月貯蔵した後に低いｒＦＳＨ解離度しか示さず、保存剤を含有する溶液より著しく高い変性温度も示す。保存剤（フェノール）を含有する溶液では、塩化ナトリウムまたは硫酸ナトリウムの塩が添加されることによって、６カ月貯蔵した後に、スクロースを含有するまたは安定化剤を含有しない溶液より著しく低いｒＦＳＨ解離度が得られることがさらにわかり得る。安定化剤が添加されていないｒＦＳＨの変性温度も、塩を含有する溶液のｒＦＳＨ Ｔ_mよ
り著しく低い。しかし、表２３からわかるように、フェノールが添加されるとともに、ス
クロースを含有する溶液のｒＦＳＨ変性温度は決定されなかったが、保存剤が添加されていない溶液のｒＦＳＨ Ｔ_mの測定は、３０±２℃／６５±５％ ＲＨで６カ月貯蔵した
後、リアルタイム安定性データと同じ傾向を示す（表２２を参照のこと）。結論として、ＮａＣｌおよびＮａ₂ＳＯ₄は、構造劣化に対して、スクロースより著しく良好な安定化剤である。これは、Ｔ_m測定（表２３を参照のこと）とリアルタイム安定性データ（表２２
を参照のこと）の両方によって明らかである。

【0189】

【表23】

【0190】

【表24】

【0191】

ベンジルアルコールを保存剤として含有する溶液のリアルタイム安定性データは、決定されなかった。しかし、ＤＳＣで決定したｒＦＳＨ変性温度およびＣＤ分光法で決定した、加熱したときのｒＦＳＨ２次構造の変化を比較すると、同じ傾向が認められる（表２４を参照のこと）。異なるタンパク質試料のｒＦＳＨの２次構造を決定した。２４℃で決定した２次構造を天然構造とみなすことができる。ここで、ベンジルアルコール（０．１７ｍｇ／ｍｌ）または硫酸ナトリウムを添加したとき、ｒＦＳＨ溶液についてｒＦＳＨ２次構造の差を観測することはできない。しかし、溶液を７６．５℃に加熱すると、ｒＦＳＨ２次構造の観測された喪失は、添加された添加剤によって変わる。保存剤（ベンジルアルコール）を添加すると、いずれの保存剤も含有しないｒＦＳＨ溶液の場合より、ｒＦＳＨ２次構造の喪失が大きくなるが、塩（硫酸ナトリウム）を添加すると、塩が添加されていないｒＦＳＨ溶液の場合より、ｒＦＳＨ２次構造の喪失が小さくなる。ｒＦＳＨの規則正しい２次構造の喪失は、タンパク質の部分変性または完全変性として解釈することができる。

【0192】

（実施例４） ｈＣＧの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）データ
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）は、ｈＣＧ、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に共通している、９２個のアミノ酸αサブユニットと、ｈＣＧに特異的な１４５個のアミノ酸βサブユニットの２種類のグリコシル化単量体からなるヘテロ二量体タンパク質である。ＦＳＨおよびｈＣＧを含む糖タンパク質ホルモンは全て、非共有結合で結合している単量体が解離したとき、ホルモンの生物活性を緩める。安定性分析の結果から、組換えＦＳＨ（ｒＦＳＨ）の不安定性は、主に二量体解離（４次構造の分解と、これに付随して免疫結合反応の低下）に基づ
くことが示唆された。

【0193】

この実施例の目的は、以前に観測された、ＤＳＣで決定され、上記の実施例１〜３に説明されているｒＦＳＨ変性温度への種々の糖および塩の依存が、非常に類似したタンパク質ｈＣＧの場合にも観測されているかどうかを確立することである。さらに、この研究で決定されたｈＣＧのＤＳＣ変性温度を、以前に公開されたリアルタイム安定性データと比較する（Ｓａｍａｒｉｔａｎｉ，Ｆ．、１９９５年、ｈＣＧ液体製剤。ＥＰ ０ ８１４，８４１）。

【0194】

ｈＣＧの変性温度を、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｌ−メチオニンおよび０．００５ｍｇ／ｍｌ
ポリソルベート２０を含有する１ｍＭ リン酸緩衝液中、０．１Ｍの種々のナトリウム塩またはスクロースの存在下および非存在下で検討した。スクロース、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および過塩素酸ナトリウムという異なる４種類の糖および塩を検討する。

【0195】

ヒト尿由来絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）
Ｍａｓｓｏｎｅ Ｓ．Ａ．（Ａｒｇｅｎｔｉｎａ）のヒト尿から精製されたｈＣＧ原薬（バッチ番号２８２３２８７５１０）（７０５９ＩＵ／ｍｇ）を使用した。材料を、２〜８℃で冷蔵して貯蔵した。

【0196】

上記ｈＣＧバッチの生物活性の決定は、ヨーロッパ薬局方に従って行った。

【0197】

ｒＦＳＨおよび別の材料を、実施例２〜３で記載されたように使用した。

【0198】

【表25】

【0199】

異なるｈＣＧ製剤の組成を表２６に記載する。

【0200】

【表26】

【0201】

製造手順
全ての溶液（表２６）は、Ｆｅｒｒｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ａ／Ｓ，（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にて実験室スケールで製造する。

【0202】

ｈＣＧ製剤の調製
全ての添加剤の原液を、ミリＱ水中で調製する。種々の添加剤を含むプラセボ溶液を原液から調製する。ｈＣＧ原薬をプラセボ溶液に溶解して、表２６に記載の濃度を得る。これらの製剤の安定性データは入手できなかったので、ＤＳＣ分析を、新たに調製された試料について常に行う；試料調製から１時間以内。

【0203】

図４および表２７でわかるように、ｈＣＧの変性温度Ｔ_mはｒＦＳＨのＴ_mより低い。さらに、変性過程のエンタルピー（すなわち、変性ピークのサイズ）は、ｒＦＳＨよりｈＣＧの方が著しく小さい。ｒＦＳＨ試料を１００℃に加熱した後の変性過程がほぼ完全に非可逆的であるｒＦＳＨの場合と違って、ｈＣＧを１００℃に加熱した後の変性過程は、より大部分が可逆的である（２）。
天然 ←→ アンフォールディングした → 非可逆的変性 （２）

【0204】

ｈＣＧ変性過程は、ＤＳＣ測定の時間枠の中で大部分が可逆的であるが、これはｒＦＳＨには当てはまらず、ｈＣＧ中の２種類のサブユニットが、ｒＦＳＨ中より解離しにくい場合に当てはまることができる。サブユニットがｈＣＧ試料を加熱している間に解離しない場合、天然構造は、室温に冷却したとき、より容易に再び再形成することができる。１００℃に加熱したときの転移のΔΗの大きさは、ｒＦＳＨがｈＣＧより著しく大きく、付随する走査（すなわち、試料を１００℃に加熱し、２５℃に冷却し、第２の走査を１００℃まで行う）における転移のΔΗの大きさは、ｒＦＳＨとｈＣＧとで同じサイズ範囲にある。

【0205】

ｈＣＧおよびｒＦＳＨ ＴＭに対する糖または塩の添加の効果
タンパク質水溶液への塩の添加は、溶液状態のタンパク質の安定性に影響を及ぼし、したがってタンパク質変性温度に影響を与えるものと予想される。

【0206】

種々のナトリウム塩の、ｈＣＧおよびｒＦＳＨ Ｔ_mに対する効果を測定するとき、か
なり驚くべきことに、ホフマイスター系列に従って予想される安定化／不安定化作用が、アニオンを変更すると観測されない。図５、図６、および表２７を参照のこと。ｈＣＧの場合、硫酸ナトリウムと塩化ナトリウムの両方が、実際にタンパク質を不安定化し、ｒＦ
ＳＨの場合、これらの塩はタンパク質を安定化する。ｈＣＧとｒＦＳＨの両方の場合、不安定化作用をタンパク質にもたらすと予想される過塩素酸ナトリウムは、全ての被検糖および塩の中で、実際に最もＴ_mを上昇させた。

【0207】

【表27】

【0208】

ＨＣＧおよびＲＦＳＨ純度に対する糖または塩の添加の効果
貯蔵中のｒＦＳＨサブユニットの解離、ｒＦＳＨ純度
ｒＦＳＨは、非共有結合で結合している単量体が解離したとき、その生物活性を失うので、単量体解離によるｒＦＳＨ活性の喪失を追跡する簡単明瞭な方式は、溶液状態でｒＦＳＨ ＬＭＷ形態の量を測定することである。この情報は、ＳＥＣクロマトグラフィーから回収することができ、ｒＦＳＨの主ピーク後に溶離するＬＭＷ形態は、解離したｒＦＳＨから生じることが知られている。

【0209】

検討された製剤において、ｒＦＳＨ凝集塊など他のタンパク質に関連した化合物が認められる。したがって、ｒＦＳＨタンパク質純度を下記のように算出することができる。
純度（％）＝１００％−ＬＭＷ形態（％） （４）

【0210】

【表28】

【0211】

表２８でわかるように、保存剤が添加された場合と添加されていない場合の、異なる糖または塩を含有する新たに調製されたｒＦＳＨ溶液は、同様の純度、すなわち同様の相対量の解離ｒＦＳＨ（ＬＭＷ形態）を示す。

【0212】

スクロースとともにまたは糖も塩もなしでフェノールを含有する試料では、３０℃で１カ月貯蔵した後すでに、ｒＦＳＨ純度が低下するが、フェノールおよび硫酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムを含有する試料ならびにフェノールが添加されていない試料では、ｒＦＳＨ純度の著しい低下は全く認められなかった（表２８を参照のこと）。３０℃で６カ月貯蔵した後、フェノールを含有するが、糖も塩も添加されていないｒＦＳＨ試料では、ｒＦＳＨ純度が８０％未満である。フェノールを含有し、スクロースを安定化剤として含むｒＦＳＨ試料も、ｒＦＳＨ純度の著しい低下を示すが、フェノールを含有し、塩化ナトリウムまたは硫酸ナトリウムで安定化されている試料は、ｒＦＳＨ純度の微小の低下しか示さない（表２８を参照のこと）。保存剤を全く含有していない試料は、貯蔵中の解離に対して最も安定である。すなわち、これらは、最高の純度を示す。しかし、非経口使用のための複数回投与水性製剤には、保存剤の添加が必要である。

【0213】

貯蔵中のｈＣＧ純度
貯蔵時のｈＣＧ純度の変化に関する以前に公表されたデータを使用して、上記に示されたｒＦＳＨ安定性データと比較する（Ｓａｍａｒｉｔａｎｉ、前掲）。５０℃で１カ月貯蔵した後すでに、ｈＣＧ純度は著しく低下する。これについては、塩化ナトリウムを含有する試料が、スクロースを含有する試料より著しく低下している（表２９を参照のこと）。５０℃で６カ月貯蔵した後、塩化ナトリウムを含有する試料のｈＣＧ純度は、スクロースを含有する試料のｈＣＧ純度より１０％を超えるほど低い。

【0214】

【表29】

【0215】

ｈＣＧおよびｒＦＳＨのＴ_Mおよび純度の比較
表３０でわかるように、ＤＳＣで得られたｒＦＳＨおよびｈＣＧの変性温度は、リアルタイム安定性データから得られたｒＦＳＨおよびｈＣＧの純度とよく相関する。ＤＳＣと、ＳＥＣで分析されたリアルタイム安定性との同様の相関関係は、組換え抗体および組換え糖タンパク質について以前に示された。

【0216】

ｒＦＳＨのリアルタイム安定性データを３０℃で決定する。ｒＦＳＨ製品は、長期冷蔵貯蔵のためのものなので、促進安定性研究には、２５〜３０℃が好適な範囲である。ｈＣＧのリアルタイム安定性データは、５０℃で最高１２週間まで貯蔵、２５℃および４０℃で１１週間貯蔵、ならびに５０℃．５で６週間貯蔵しか利用できない。４０℃以下の温度では、スクロースおよび塩化ナトリウムを含む両製剤について、ｈＣＧ純度の低下が貯蔵中６％未満であり、したがって１１〜１２週間貯蔵後にすでに、種々の糖および塩の効果間で区別することは困難である。５０℃より低い温度で観測された傾向は、５０℃の場合と同じであるが、５０℃においてのみ、様々な製剤を明確に区別することができる。

【0217】

【表30】

【0218】

結論
高温で貯蔵した後のｈＣＧおよびｒＦＳＨの変性温度ならびにｈＣＧおよびｒＦＳＨの純度による種々の溶液中におけるｈＣＧおよびｒＦＳＨの安定性の研究から、溶液状態でのｈＣＧおよびｒＦＳＨ安定性に及ぼす異なる糖および塩の影響についての明確な証拠が得られる。使用される２つの技法は液体ＤＳＣおよびＳＥＣクロマトグラフィーであり、両者は一致した結果を示す。これらの結果は、本リアルタイム安定性データで明らかに確認された。

【0219】

ｒＦＳＨ２次構造の変化（ＣＤ分光法−実施例１）、ｒＦＳＨ変性温度（ＤＳＣによる３次および４次構造の変化−実施例２）、または３０±２℃／６５±５％ ＲＨで貯蔵した後に形成された解離ｒＦＳＨの相対量（ＳＥＣによる４次構造の変化−実施例３）による種々の溶液中におけるｒＦＳＨ安定性の研究から、溶液状態でのｒＦＳＨの安定性に及ぼす保存剤および安定化剤の影響についての明確な証拠が得られる。使用される３つの技法は、ＣＤ、ＤＳＣおよびＳＥＣクロマトグラフィーであり、それらは全て一致した結果を示す。

【0220】

実施例１〜３の全ての結果の結論としては、保存剤、フェノールまたはベンジルアルコールの添加は、溶液状態でのｒＦＳＨの安定性を低下させることが明らかにわかる。ｍ−クレゾールおよびクロロクレゾールのような他のフェノール系保存剤は、同様な不安定化作用をもたらすと予想される。保存剤を添加したときのｒＦＳＨで観測された不安定化作用は、この分野における技術水準の認識とよく符合する。

【0221】

薬剤的に許容されるアルカリ金属Ｎａ⁺塩またはＫ⁺塩をｒＦＳＨ溶液に添加すると、ｒＦＳＨに対する保存剤の不安定化作用が相殺され、最も有利なことには、保存剤も塩も含有していないｒＦＳＨ溶液に比べて、溶液状態でのｒＦＳＨの安定性が向上する。全ての被検ナトリウム塩およびカリウム塩は、使用するアニオンとは無関係にｒＦＳＨの安定性を向上させる。例えば、硫酸イオン、塩化物イオンおよび過塩素酸イオンのような無機アニオン、ならびにまたクエン酸イオン、酢酸イオンおよび酒石酸イオンのような有機アニオン。塩のカチオンを変更すると、ｒＦＳＨの安定化度に大きな影響がもたらされる。１価のカチオン、特にナトリウムまたはカリウムのカチオンとの塩は、ｒＦＳＨに対して著しい安定化作用をもたらす。過塩素酸ナトリウムをｒＦＳＨ溶液に添加すると、最も安定
なｒＦＳＨ溶液が生成する。しかし、過塩素酸塩は、通常反応性が高く、酸化剤であり、したがって医薬製剤の不活性成分として認可されない。したがって、硫酸ナトリウムもしくは硫酸カリウムおよび塩化ナトリウムまたは塩化カリウムが、最も好ましい安定化剤である。

【0222】

スクロースをｈＣＧまたはｒＦＳＨ溶液に添加すると、ｈＣＧとｒＦＳＨの両方で、タンパク質安定性がわずかに向上するが、塩化ナトリウムを添加すると、ｈＣＧには不安定化作用が、ｒＦＳＨには安定化作用がもたらさせる（実施例４を参照のこと）。過塩素酸ナトリウムをｈＣＧおよびｒＦＳＨ溶液に添加すると、ｈＣＧとｒＦＳＨの両方に安定化作用がもたらされる（実施例４）。ｒＦＳＨ溶液に対するこれらの塩の安定化作用は、驚くべきことに、スクロースで観測される安定化作用より明らかに良好である。

【0223】

これらの結果の結論は、以下である：
１）研究条件下で、ｈＣＧおよびｒＦＳＨ安定性に対する塩の効果は、ホフマイスター系列に従わない；
２）ｈＣＧおよびＦＳＨは構造的に非常に類似している（すなわち、これらは、同じクラスのタンパク質に属し、両方ともグリコシル化されており、ともに２種類のサブユニットから、そのαサブユニットは、２つのタンパク質において同一である）ということにもかかわらず、スクロースおよび塩化ナトリウムのような種々の糖および塩の、タンパク質安定性に対する効果は、ｈＣＧとｒＦＳＨとで異なる。非常に驚くべきことに、ｈＣＧおよびｒＦＳＨのような非常に類似したタンパク質について、塩は同じ安定化作用を示さない。
３）Ｎａ⁺塩およびＫ⁺塩は、ＦＳＨ溶液に対する安定化作用を、使用するアニオンとは無関係に示す。
４）ＦＳＨ溶液に対するＮａ⁺塩およびＫ⁺塩の安定化作用は、保存剤の不安定化作用を弱めることができる。

【0224】

略語および定義
本文および実施例全体を通して、以下の略語および定義を使用する。
ΔＴ_m 保存剤または塩を添加したときの変性温度の変化、さらにＴ_mを参照のこと
ＡＲＴｓ 生殖補助医療（ａｓｓｉｓｔｅｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
ＢＡ ベンジルアルコール
ＢＴＧ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｅｎｅｒａｌ
ＣＤ 円偏光二色性
ＣＨＯ チャイニーズハムスター卵巣
ＣｏＡ 分析証明書
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＤＳＣ 示差走査熱量測定
ＦＳＤ 女性性機能不全
ＦＳＨ 卵胞刺激ホルモン
ｈＣＧ ヒト絨毛性ゴナドトロピン
ＩＵ 国際単位
ヨーロッパ薬局方および米国薬局方に準拠したＳｔｅｅｌｍａｎ− Ｐｏｈｌｅｙ Ｂｉｏａｓｓａｙで決定したｒＦＳＨバイオ活性の尺度
ＩＵＩ 子宮腔内授精
ＬＣ−ＵＶ 紫外検出を用いた液体クロマトグラフィー
ＬＨ 黄体形成ホルモン
ＬＭＷ 主にまたは単独に解離単量体タンパク質からなる低分子量の形態
ＯＩ 排卵誘発
ｐ．ａ．Ｐｒｏ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｐｈ．Ｅｕｒ．ヨーロッパ薬局方
ＲＨ 相対湿度
ｒＦＳＨ 組換えヒト卵胞刺激ホルモン
ＳＥＣ サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＲＣＤ シンクロトロン放射光円偏光二色性
Ｔ_m熱転移の中点または転移中点または変性温度
タンパク質分子の半分がフォールディングし、タンパク質分子の半分がアンフォールディングしているときの温度。
ＴＲＩＳ ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール
ＴＳＨ 甲状腺刺激ホルモン
ＵＳＰ 米国薬局方
ＵＶ 紫外線

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】