特許 6523312 病原体および有益な微生物を検出するための核酸および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6523312

(24)【登録日】2019年5月10日

(45)【発行日】2019年5月29日

(54)【発明の名称】病原体および有益な微生物を検出するための核酸および方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6888 20180101AFI20190520BHJP

   C12Q 1/689 20180101ALN20190520BHJP

   C12Q 1/6895 20180101ALN20190520BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20190520BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6888 ZZNA

   !C12Q1/689 Z

   !C12Q1/6895 Z

   !C12N15/09 Z

   !C12N15/09 200

【請求項の数】28

【全頁数】45

(21)【出願番号】特願2016-551031(P2016-551031)

(86)(22)【出願日】2014年11月5日

(65)【公表番号】特表2016-534756(P2016-534756A)

(43)【公表日】2016年11月10日

(86)【国際出願番号】EP2014073768

(87)【国際公開番号】WO2015067635

(87)【国際公開日】20150514

【審査請求日】2017年10月5日

(31)【優先権主張番号】13191823.7

(32)【優先日】2013年11月6日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】505018120

【氏名又は名称】オムヤ インターナショナル アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ディマイウータ，ニコラ

(72)【発明者】

【氏名】エグリ，コンラッド

(72)【発明者】

【氏名】グラウビッツ，ヨアヒム

(72)【発明者】

【氏名】ウルワイラー，シモン

【審査官】 堂畑 厚志

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／１４７０１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０１１１９７０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００８−００５７６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Plant Disease，２０１１年，vol. 95，p. 1547-1557

【文献】 Development of species-specific PCR primers on rDNA for the identification of European Armillaria species，For. Path.，２００３年，vol. 33，p. 287-297

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サンプルにおける少なくとも１つの病原体及び／又は１つの有益な微生物をハイブリダイゼーション技術により検出するための、
（ｉ）配列：

【化1】

を含む又はからなる核酸のセット；
（ｉｉ）配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列及び配列番号１００に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む又はからなる核酸のセット；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補的配列を含む又はからなる核酸のセットの使用。

【請求項2】

少なくとも１つの病原体が細菌及び／又は真菌から選択される、請求項１記載の使用。

【請求項3】

少なくとも１つの真菌及び／又は細菌が、アルミラリア・メレア（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａ）、アスコキタ・フレイナ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｐｈｌｅｉｎａ）、ビポラリス・ソロキニアナ（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、ブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、セルコスポラ・ゼブリン（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｚｅｂｒｉｎｅ）、クラビセプス・プルプレア（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、コレトトリクム・トリフォリイ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、コルチシウム・フシフォルメ（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ ｆｕｃｉｆｏｒｍｅ）、クルブラリア・アフィニス（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ａｆｆｉｎｉｓ）、ドレクスレラ・ジクチオイデス（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｄｉｃｔｙｏｉｄｅｓ）、ドレクスレラ・フレイ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｐｈｌｅｉ）、ドレクスレラ・ポエ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｐｏａｅ）、ドレクスレラ・シカンス（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｓｉｃｃａｎｓ）、ドレクスレラ・トリチシ−レペンチス（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｔｒｉｔｉｃｉ−ｒｅｐｅｎｔｉｓ）、エピクロエ・チフィナ（Ｅｐｉｃｈｌｏｅ ｔｙｐｈｉｎａ）、エクスセロヒルム・ツルシクム（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ ｔｕｒｃｉｃｕｍ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・ポエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｏａｅ）、ゲウマンノマイセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ギベレラ・インテルミディア（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、グリオクラジウム・カテヌラツム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、カバチエラ・カウリボラ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ ｃａｕｌｉｖｏｒａ）、レプトスフェリア・コルレ（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｋｏｒｒａｅ）、レプトスフェルリナ・アウストラリス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、マグナポルテ・ポエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｐｏａｅ）、マラスミウス・オレアデス（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ ｏｒｅａｄｅｓ）、ミクロドキウム・ボレイ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｂｏｌｌｅｙｉ）、ミクロドキウム・ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ）、ミクロスファエラ・トリフォリイ（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、ミロテシウム・ロリデゥム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｒｏｒｉｄｕｍ）、ネオチホジウム属種（Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ ｓｐ．）、オフィオスフェレラ・ヘルポトリチャ（Ｏｐｈｉｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈａ）、オフィオスフェレラ・ナルマリ（Ｏｐｈｉｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｎａｒｍａｒｉ）、ペロノスポラ・トリフォリオルム（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ）、フィラコラ・ブルガタ（Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａ ｖｕｌｇａｔａ）、フィトフトラ・ブラッシケ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、フィトフトラ・カクトルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍ）、フィトフトラ・シトリコラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｔｒｉｃｏｌａ）、フィトフトラ・ドレクスレリ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉ）、フィトフトラ・フラガリ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｆｒａｇａｒｉａｅ）、フィトフトラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）、フィトフトラ・ニコチアネ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、シュードペジザ・メディカギニス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｚｉｚａ ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）、プクキニア・コロナタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｃｏｒｏｎａｔａ）、プッシニア・コロナテ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｃｏｒｏｎａｔｅ）、プクキニア・グラミニス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、プクキニア・ポエ−ネモラリス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｐｏａｅ−ｎｅｍｏｒａｌｉｓ）、プクキニア・ポアルム（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｐｏａｒｕｍ）、プクキニア・レコンディテ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｒｅｃｏｎｄｉｔｅ）、プクキニア・ソルギ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉ）、プクキニア・ストリイフォルミス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）、プクキニア・トリチシナ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）、ピレノチェタ・リコペルシシ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、ピチウム・アファニデルマツマ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍａ）、ピチウム・デバリアヌム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ）、ピチウム・グラミニコラ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、ピチウム・イレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ピチウム・マストホルム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｓｔｏｐｈｏｒｕｍ）、ピチウム・スルカツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｕｌｃａｔｕｍ）、ピチウム・ウルチムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）、ラムラリア・コロ−シグニ（Ｒａｍｕｌａｒｉａ ｃｏｌｌｏ−ｃｙｇｎｉ）、リゾクトニア・セレアリス（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、リゾクトニア・フラガリエ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｆｒａｇａｒｉａｅ）、リンコスポリウム・オルトスポルム（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｏｒｔｈｏｓｐｏｒｕｍ）、リンコスポリウム・セカリス（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｅｃａｌｉｓ）、スクレロチニア・ボレアリス（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｂｏｒｅａｌｉｓ）、スクレロチニア・ホメオカルパ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）、スクレロチニア・スクレロチオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、スクレロチニア・トリフォリオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ）、セプトリア・マクロポダ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｍａｃｒｏｐｏｄａ）、セプトリア・トリチシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ）、ステムフィリウム・サルシネフォルメ（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｓａｒｃｉｎａｅｆｏｒｍｅ）、タナテホルス・ククメリス（Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ）、チエラビオプシス・バシコラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｂａｓｉｃｏｌａ）、チエラビオプシス・ポプリ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｐｏｐｕｌｉ）、チレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃａｒｉｅｓ）、チレチア・コントロベルサ（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ）、トリコデルマ・ハマツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｍａｔｕｍ）、チフラ・インカルナテ（Ｔｙｐｈｕｌａ ｉｎｃａｒｎａｔｅ）、チフラ・イシカリエンシス（Ｔｙｐｈｕｌａ ｉｓｈｉｋａｒｉｅｎｓｉｓ）、チフラ・イシカリエンシス（Ｔｙｐｈｕｌａ ｉｓｈｉｋａｒｉｅｎｓｉｓ）、ウロマイセス・ダクチリディス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｄａｃｔｙｌｉｄｉｓ）、ウロマイセス・トリフォリイ−レペンチス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｔｒｉｆｏｌｉｉ−ｒｅｐｅｎｔｉｓ）、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、ウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ）、ウスチラゴ・ストリイフォルミス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）、ウスチラゴ・トリチシ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｔｒｉｔｉｃｉ）、ベルチシリウム・ダーリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）；バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、セラチア・プリムチカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、ストレプトマイセス・アルビドフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ）、ストレプトマイセス・グラミノファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・グリセオビリディス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、ストレプトマイセス・リモスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ）、ストレプトマイセス・スカビエイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ）、キサントモナス・トランスルセンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ）からなる群から選択される、請求項２記載の使用。

【請求項4】

請求項３記載の真菌及び細菌の全ての検出のための、請求項１記載の使用。

【請求項5】

少なくとも１つの有益な微生物が植物成長促進性根圏細菌である、請求項１記載の使用。

【請求項6】

サンプルが芝草；土壌；自然肥料、特に動物の糞もしくは動物の糞尿のような動物由来の自然肥料、又は葉、茎、根、種子、果実体もしくは花のような植物もしくは薬草に由来する自然肥料；種子又は作物サンプルである、請求項１〜５のいずれか一項記載の使用。

【請求項7】

サンプルが芝草の根もしくは種子又は芝草サンプルの葉である、請求項６記載の使用。

【請求項8】

芝草が、フェスタセエ連（Ｆｅｓｔａｃｅａｅ）、アベネエ連（Ａｖｅｎｅａｅ）、トリチセエ連（Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ）、クロリデエ連（Ｃｈｌｏｒｉｄｅａｅ）、ゾイシエエ連（Ｚｏｙｓｉｅａｅ）、パニセエ連（Ｐａｎｉｃｅａｅ）及びアンドロポゴネエ連（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｅａｅ）からなる群から選択される、請求項６又は７記載の使用。

【請求項9】

ハイブリダイゼーション技術がマイクロアレイ・チップ、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＰＣＲから選択される、請求項１〜８のいずれか一項記載の使用。

【請求項10】

ハイブリダイゼーション技術が、マイクロアレイ・チップと組合されたＰＣＲを含み、ここで、ＰＣＲが感度を増加させ、バックグラウンドを減少させ、及び／又は検出標識をＰＣＲ産物に付加する、請求項１〜９のいずれか一項記載の使用。

【請求項11】

（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９及び配列番号１００の配列を含む又はからなる核酸のセット；
（ｉｉ）配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列及び配列番号１００に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む又はからなる核酸のセット；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補的配列を含む又はからなる核酸のセット
を含むマイクロアレイ・チップ。

【請求項12】

サンプルにおける少なくとも１つの病原体及び／又は有益な微生物を検出するための、請求項１１記載のマイクロアレイ・チップの使用。

【請求項13】

少なくとも１つの病原体が細菌及び／又は真菌から選択される、請求項１２記載の使用。

【請求項14】

少なくとも１つの真菌及び／又は細菌が、アルミラリア・メレア（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａ）、アスコキタ・フレイナ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｐｈｌｅｉｎａ）、ビポラリス・ソロキニアナ（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、ブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、セルコスポラ・ゼブリン（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｚｅｂｒｉｎｅ）、クラビセプス・プルプレア（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、コレトトリクム・トリフォリイ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、コルチシウム・フシフォルメ（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ ｆｕｃｉｆｏｒｍｅ）、クルブラリア・アフィニス（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ａｆｆｉｎｉｓ）、ドレクスレラ・ジクチオイデス（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｄｉｃｔｙｏｉｄｅｓ）、ドレクスレラ・フレイ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｐｈｌｅｉ）、ドレクスレラ・ポエ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｐｏａｅ）、ドレクスレラ・シカンス（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｓｉｃｃａｎｓ）、ドレクスレラ・トリチシ−レペンチス（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｔｒｉｔｉｃｉ−ｒｅｐｅｎｔｉｓ）、エピクロエ・チフィナ（Ｅｐｉｃｈｌｏｅ ｔｙｐｈｉｎａ）、エクスセロヒルム・ツルシクム（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ ｔｕｒｃｉｃｕｍ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・ポエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｏａｅ）、ゲウマンノマイセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ギベレラ・インテルミディア（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、グリオクラジウム・カテヌラツム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、カバチエラ・カウリボラ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ ｃａｕｌｉｖｏｒａ）、レプトスフェリア・コルレ（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｋｏｒｒａｅ）、レプトスフェルリナ・アウストラリス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、マグナポルテ・ポエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｐｏａｅ）、マラスミウス・オレアデス（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ ｏｒｅａｄｅｓ）、ミクロドキウム・ボレイ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｂｏｌｌｅｙｉ）、ミクロドキウム・ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ）、ミクロスファエラ・トリフォリイ（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、ミロテシウム・ロリデゥム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｒｏｒｉｄｕｍ）、ネオチホジウム属種（Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ ｓｐ．）、オフィオスフェレラ・ヘルポトリチャ（Ｏｐｈｉｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈａ）、オフィオスフェレラ・ナルマリ（Ｏｐｈｉｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｎａｒｍａｒｉ）、ペロノスポラ・トリフォリオルム（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ）、フィラコラ・ブルガタ（Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａ ｖｕｌｇａｔａ）、フィトフトラ・ブラッシケ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、フィトフトラ・カクトルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍ）、フィトフトラ・シトリコラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｔｒｉｃｏｌａ）、フィトフトラ・ドレクスレリ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉ）、フィトフトラ・フラガリ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｆｒａｇａｒｉａｅ）、フィトフトラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）、フィトフトラ・ニコチアネ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、シュードペジザ・メディカギニス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｚｉｚａ ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）、プクキニア・コロナタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｃｏｒｏｎａｔａ）、プクキニア・コロナテ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｃｏｒｏｎａｔｅ）、プクキニア・グラミニス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、プクキニア・ポエ−ネモラリス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｐｏａｅ−ｎｅｍｏｒａｌｉｓ）、プクキニア・ポアルム（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｐｏａｒｕｍ）、プクキニア・レコンディテ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｒｅｃｏｎｄｉｔｅ）、プクキニア・ソルギ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉ）、プクキニア・ストリイフォルミス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）、プクキニア・トリチシナ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）、ピレノチェタ・リコペルシシ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、ピチウム・アファニデルマツマ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍａ）、ピチウム・デバリアヌム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ）、ピチウム・グラミニコラ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、ピチウム・イレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ピチウム・マストホルム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｓｔｏｐｈｏｒｕｍ）、ピチウム・スルカツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｕｌｃａｔｕｍ）、ピチウム・ウルチムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）、ラムラリア・コロ−シグニ（Ｒａｍｕｌａｒｉａ ｃｏｌｌｏ−ｃｙｇｎｉ）、リゾクトニア・セレアリス（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、リゾクトニア・フラガリエ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｆｒａｇａｒｉａｅ）、リンコスポリウム・オルトスポルム（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｏｒｔｈｏｓｐｏｒｕｍ）、リンコスポリウム・セカリス（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｅｃａｌｉｓ）、スクレロチニア・ボレアリス（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｂｏｒｅａｌｉｓ）、スクレロチニア・ホメオカルパ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）、スクレロチニア・スクレロチオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、スクレロチニア・トリフォリオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ）、セプトリア・マクロポダ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｍａｃｒｏｐｏｄａ）、セプトリア・トリチシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ）、ステムフィリウム・サルシネフォルメ（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｓａｒｃｉｎａｅｆｏｒｍｅ）、タナテホルス・ククメリス（Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ）、チエラビオプシス・バシコラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｂａｓｉｃｏｌａ）、チエラビオプシス・ポプリ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｐｏｐｕｌｉ）、チレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃａｒｉｅｓ）、チレチア・コントロベルサ（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ）、トリコデルマ・ハマツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｍａｔｕｍ）、チフラ・インカルナテ（Ｔｙｐｈｕｌａ ｉｎｃａｒｎａｔｅ）、チフラ・イシカリエンシス（Ｔｙｐｈｕｌａ ｉｓｈｉｋａｒｉｅｎｓｉｓ）、チフラ・イシカリエンシス（Ｔｙｐｈｕｌａ ｉｓｈｉｋａｒｉｅｎｓｉｓ）、ウロマイセス・ダクチリディス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｄａｃｔｙｌｉｄｉｓ）、ウロマイセス・トリフォリイ−レペンチス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｔｒｉｆｏｌｉｉ−ｒｅｐｅｎｔｉｓ）、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、ウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ）、ウスチラゴ・ストリイフォルミス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）、ウスチラゴ・トリチシ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｔｒｉｔｉｃｉ）、ベルチシリウム・ダーリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）；バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモ ナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、セラチア・プリムチカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、ストレプトマイセス・アルビドフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ）、ストレプトマイセス・グラミノファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・グリセオビリディス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、ストレプトマイセス・リモスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ）、ストレプトマイセス・スカビエイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ）、キサントモナス・トランスルセンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ）からなる群から選択される、請求項１３記載の使用。

【請求項15】

請求項１４記載の真菌及び細菌の全ての検出のための、請求項１２記載の使用。

【請求項16】

少なくとも１つの有益な微生物が植物成長促進性根圏細菌である、請求項１２記載の使用。

【請求項17】

サンプルが芝草；土壌；自然肥料、特に動物の糞もしくは動物の糞尿のような動物由来の自然肥料、又は葉、茎、根、種子、果実体もしくは花のような植物もしくは薬草に由来する自然肥料；種子又は作物サンプルである、請求項１２〜１６のいずれか一項記載の使用。

【請求項18】

サンプルが芝草の根もしくは種子又は芝草サンプルの葉である、請求項１７記載の使用。

【請求項19】

芝草が、フェスタセエ連（Ｆｅｓｔａｃｅａｅ）、アベネエ連（Ａｖｅｎｅａｅ）、トリチセエ連（Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ）、クロリデエ連（Ｃｈｌｏｒｉｄｅａｅ）、ゾイシエエ連（Ｚｏｙｓｉｅａｅ）、パニセエ（Ｐａｎｉｃｅａｅ）及びアンドロポゴネエ連（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｅａｅ）からなる群から選択される、請求項１７又は１８記載の使用。

【請求項20】

ａ）病原体及び／又は有益な微生物のＤＮＡを含む標準物からの、及びサンプルからのＤＮＡ単離；
ｂ）ＰＣＲによる工程ａ）の単離ＤＮＡの増幅；
ｃ）得られたＰＣＲ産物の、請求項１１記載のマイクロアレイ・チップ上におけるハイブリダイゼーション；
ｄ）結合ＤＮＡの検出；ならびに
ｅ）サンプルが病原体及び／又は有益な微生物を含有するかどうかのそれからの推定
の工程を含む、有機サンプルにおける病原体及び／又は有益な微生物の検出方法。

【請求項21】

検出されるべき病原体が細菌及び／又は真菌から選択される、請求項２０記載の方法。

【請求項22】

真菌及び／又は細菌が、アルミラリア・メレア（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａ）、アスコキタ・フレイナ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｐｈｌｅｉｎａ）、ビポラリス・ソロキニアナ（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、ブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、セルコスポラ・ゼブリン（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｚｅｂｒｉｎｅ）、クラビセプス・プルプレア（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、コレトトリクム・トリフォリイ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、コルチシウム・フシフォルメ（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ ｆｕｃｉｆｏｒｍｅ）、クルブラリア・アフィニス（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ａｆｆｉｎｉｓ）、ドレクスレラ・ジクチオイデス（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｄｉｃｔｙｏｉｄｅｓ）、ドレクスレラ・フレイ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｐｈｌｅｉ）、ドレクスレラ・ポエ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｐｏａｅ）、ドレクスレラ・シカンス（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｓｉｃｃａｎｓ）、ドレクスレラ・トリチシ−レペンチス（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｔｒｉｔｉｃｉ−ｒｅｐｅｎｔｉｓ）、エピクロエ・チフィナ（Ｅｐｉｃｈｌｏｅ ｔｙｐｈｉｎａ）、エクスセロヒルム・ツルシクム（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ ｔｕｒｃｉｃｕｍ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・ポエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｏａｅ）、ゲウマンノマイセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ギベレラ・インテルミディア（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、グリオクラジウム・カテヌラツム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、カバチエラ・カウリボラ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ ｃａｕｌｉｖｏｒａ）、レプトスフェリア・コルレ（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｋｏｒｒａｅ）、レプトスフェルリナ・アウストラリス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、マグナポルテ・ポエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｐｏａｅ）、マラスミウス・オレアデス（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ ｏｒｅａｄｅｓ）、ミクロドキウム・ボレイ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｂｏｌｌｅｙｉ）、ミクロドキウム・ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ）、ミクロスファエラ・トリフォリイ（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、ミロテシウム・ロリデゥム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｒｏｒｉｄｕｍ）、ネオチホジウム属種（Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ ｓｐ．）、オフィオスフェレラ・ヘルポトリチャ（Ｏｐｈｉｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈａ）、オフィオスフェレラ・ナルマリ（Ｏｐｈｉｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｎａｒｍａｒｉ）、ペロノスポラ・トリフォリオルム（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ）、フィラコラ・ブルガタ（Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａ ｖｕｌｇａｔａ）、フィトフトラ・ブラッシケ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、フィトフトラ・カクトルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍ）、フィトフトラ・シトリコラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｔｒｉｃｏｌａ）、フィトフトラ・ドレクスレリ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉ）、フィトフトラ・フラガリ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｆｒａｇａｒｉａｅ）、フィトフトラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）、フィトフトラ・ニコチアネ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、シュードペジザ・メディカギニス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｚｉｚａ ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）、プクキニア・コロナタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｃｏｒｏｎａｔａ）、プクキニア・コロナテ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｃｏｒｏｎａｔｅ）、プクキニア・グラミニス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、プクキニア・ポエ−ネモラリス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｐｏａｅ−ｎｅｍｏｒａｌｉｓ）、プクキニア・ポアルム（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｐｏａｒｕｍ）、プクキニア・レコンディテ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｒｅｃｏｎｄｉｔｅ）、プクキニア・ソルギ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉ）、プクキニア・ストリイフォルミス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）、プクキニア・トリチシナ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）、ピレノチェタ・リコペルシシ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、ピチウム・アファニデルマツマ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍａ）、ピチウム・デバリアヌム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ）、ピチウム・グラミニコラ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、ピチウム・イレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ピチウム・マストホルム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｓｔｏｐｈｏｒｕｍ）、ピチウム・スルカツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｕｌｃａｔｕｍ）、ピチウム・ウルチムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）、ラムラリア・コロ−シグニ（Ｒａｍｕｌａｒｉａ ｃｏｌｌｏ−ｃｙｇｎｉ）、リゾクトニア・セレアリス（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、リゾクトニア・フラガリエ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｆｒａｇａｒｉａｅ）、リンコスポリウム・オルトスポルム（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｏｒｔｈｏｓｐｏｒｕｍ）、リンコスポリウム・セカリス（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｅｃａｌｉｓ）、スクレロチニア・ボレアリス（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｂｏｒｅａｌｉｓ）、スクレロチニア・ホメオカルパ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）、スクレロチニア・スクレロチオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、スクレロチニア・トリフォリオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ）、セプトリア・マクロポダ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｍａｃｒｏｐｏｄａ）、セプトリア・トリチシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ）、ステムフィリウム・サルシネフォルメ（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｓａｒｃｉｎａｅｆｏｒｍｅ）、タナテホルス・ククメリス（Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ）、チエラビオプシス・バシコラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｂａｓｉｃｏｌａ）、チエラビオプシス・ポプリ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｐｏｐｕｌｉ）、チレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃａｒｉｅｓ）、チレチア・コントロベルサ（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ）、トリコデルマ・ハマツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｍａｔｕｍ）、チフラ・インカルナテ（Ｔｙｐｈｕｌａ ｉｎｃａｒｎａｔｅ）、チフラ・イシカリエンシス（Ｔｙｐｈｕｌａ ｉｓｈｉｋａｒｉｅｎｓｉｓ）、チフラ・イシカリエンシス（Ｔｙｐｈｕｌａ ｉｓｈｉｋａｒｉｅｎｓｉｓ）、ウロマイセス・ダクチリディス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｄａｃｔｙｌｉｄｉｓ）、ウロマイセス・トリフォリイ−レペンチス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｔｒｉｆｏｌｉｉ−ｒｅｐｅｎｔｉｓ）、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、ウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ）、ウスチラゴ・ストリイフォルミス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）、ウスチラゴ・トリチシ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｔｒｉｔｉｃｉ）、ベルチシリウム・ダーリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）；バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、セラチア・プリムチカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、ストレプトマイセス・アルビドフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ）、ストレプトマイセス・グラミノファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・グリセオビリディス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、ストレプトマイセス・リモスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ）、ストレプトマイセス・スカビエイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ）、キサントモナス・トランスルセンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ）からなる群から選択される、請求項２１記載の方法。

【請求項23】

工程ｂ）において２つのＰＣＲを行い、第１のＰＣＲは真菌ＤＮＡに関するものであり、第２のＰＣＲは細菌ＤＮＡに関するものである、請求項２２記載の真菌及び細菌の全ての検出のための請求項２０記載の方法。

【請求項24】

２つのＰＣＲを単一の反応チューブ内に合体させる、請求項２３記載の方法。

【請求項25】

有益な微生物が植物成長促進性根圏細菌である、請求項２０記載の方法。

【請求項26】

サンプルの使用の前に病原体の非存在に関してサンプルをスクリーニングするための、請求項２０〜２４のいずれか一項記載の方法。

【請求項27】

（ｉ）以下の配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９及び配列番号１００の核酸を含む又はからなる核酸のセット；
（ｉｉ）配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号１９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号２９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号３９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号５９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号６９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号７９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号８９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９３に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９５に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９８に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号９９に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列及び配列番号１００に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む又はからなる核酸のセット；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補的配列の核酸を含む又はからなる核酸のセット
を含む、有機サンプルにおける病原体及び／又は有益な微生物の検出のためのキット。

【請求項28】

ａ）罹患芝草が成長している土壌のサンプル又は罹患芝草のサンプルにおける少なくとも１つの病原性真菌及び／又は細菌からの核酸の非存在又は存在を、請求項１記載の核酸のセットを使用して、ＰＣＲとマイクロアレイ・チップとを組合せた方法により検出し、
ｂ）１以上の病原性真菌及び／又は細菌からの核酸が工程ａ）において検出された場合には、核酸が検出された１以上の病原性真菌及び／又は細菌を標的とする１以上の抗真菌剤及び／又は抗細菌剤を選択し、
ｃ）工程ｂ）において選択された１以上の抗真菌剤及び／又は抗細菌剤を罹患芝草に適用する工程を含む、罹患芝草の治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、病原体および有益な微生物を検出するための核酸および方法に関する。

【背景技術】

【0002】

芝生または芝草の疾患は感受性植物、疾患の発生を促す環境および病原性生物（真菌および細菌）の間の相互作用から生じる。そのような生物は装飾用の草、植物および作物上にも発生しうる。実際、それらはあらゆる適当な有機基質上に出現しうる。したがって、罹患基質、特に芝草の治療（処理）は通常、病原体を殺すまたはその成長を妨げる処理剤を適用することからなる。

【0003】

しかし、疾患の処置、特に芝草の疾患の処置における第１段階は常に、原因となる病原因子の特定を含むべきである。疾患の原因となる病原因子の知見は、最も適当な治療剤（殺真菌剤、殺細菌剤など）を選択するのに重要である。実際、適当な殺真菌剤または殺細菌剤が選択されうるように疾患を正確に特定していることは重要である。不適当な治療は疾患を治癒させず、土壌および他の有益な生物に重篤な影響を及ぼしうる。間違った治療は費用効果的ではなく、疾患を悪化させ他の望ましくない副作用を引き起こすリスクを伴いうる。

【0004】

原因となる病原因子の特定のための古典的な方法は本質的には、個々の植物上および芝群生上で観察されうる症状、ならびに罹患芝草の近くで見出されうる病原体構造に基づくものである。

【0005】

しかし、これらの方法は実施に長期間を要しうる。なぜなら、それらは、しばしば、検査所における病原体の単離および培養を伴うからである。そのうえ、密接に関連した病原体種の識別は困難でありうる。

【0006】

したがって、これらの難題を解決する分子生物学的方法が開発されている。最も一般的な真菌検出方法の１つは、真菌ｒＲＮＡオペロンからの内部転写スペーサー（１，２）および５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（ＩＴＳ１ −５．８Ｓ−ＩＴＳ２）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に基づく（Ｇｏｏｄｗｉｎら（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４４：３８４−３９１；Ｒａｎｊａｒｄら（２００１）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６７：４４７９−４４８７）。

【0007】

細菌の検出のためには、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅および配列決定が用いられる（Ｎａｍ ＨＲ，Ｌｅｅ ＨＭ，Ｌｅｅ Ｙ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕｉｎｕｐｒｉｓｔｉｎ／ｄａｌｆｏｐｒｉｓｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ｆｒｏｍ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ Ｋｏｒｅａｎ ｗｏｍｅｎ．Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８ Ｆｅｂ；４６（１）：１０８−１１．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２２７５−００７−０２１７−１．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１８３３７７０２）。

【0008】

しかし、特異的プライマーペアの領域の配列決定は、しばしば、与えられた病原体種の特定に必要であり、このことは、病原体の正体が不明であり、それが求められている場合、この方法を面倒なものとする。更に、病原体の混合物の配列決定は高い費用および多大な労力を要する。混合物から或る種を特定するための種特異的プライマーは全ての微生物に関して入手可能なわけではない。したがって、これらの方法は、与えられた芝草疾患を治療するのに最も適合した抗病原体物質を決定するためには通常は用いられない。

【0009】

日本国特許出願第２００８００５７６０号は、食物において見出されうるカビを検出するための４５８個のプローブを開示している。これらの４５８個のプローブは、マイクロアレイの使用を含むハイブリダイゼーションに基づく方法によりカビを検出するために設計される。

【0010】

同じ出願人の特許出願ＷＯ ２００９／１４７０１７ Ａ１は、芝草における病原性真菌を検出するための核酸および方法を開示している。この発明は芝草に関するものであるが、特定のための方法としてのＡＦＬＰおよびＴ−ＲＦＬＰに焦点を合わせている。この方法は、病原性および非病原性の多数の異なる真菌種が芝草にしばしば存在するという制約を有する。複雑なサンプルにおける多数の異なる種は、数的に不十分な種を特定することを困難または更には不可能にする。しかし、疾患を引き起こす病原性種は必ずしも最も豊富な種とは限らない。

【0011】

その結果、植物病原体および有益な微生物の検出に選択される現在の方法は長時間を要し、十分な感度を有さず、十分には特異的でなく、および／または微生物のスペクトルの検出に十分には広域性ではない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】特開２００８−００５７６０号公報

【特許文献2】国際公開第２００９／１４７０１７号

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｇｏｏｄｗｉｎら（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４４：３８４−３９１

【非特許文献2】Ｒａｎｊａｒｄら（２００１）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６７：４４７９−４４８７

【非特許文献3】Ｎａｍ ＨＲ，Ｌｅｅ ＨＭ，Ｌｅｅ Ｙ．Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８ Ｆｅｂ；４６（１）：１０８−１１．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２２７５−００７−０２１７−１．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１８３３７７０２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

したがって、サンプル中に存在する病原体および有益な微生物の特定を可能にする特異的核酸を提供することが本発明の目的である。

【0015】

これらの特異的核酸を伴う１００個までのスポットを含有する単一のマイクロアレイ・チップを提供することが本発明の目的である。これらの核酸は例えば９０種の公知真菌および例えば１０種の細菌種に特異的である。

【0016】

本発明のもう１つの目的は、１００個までの異なる種に関して単一サンプルにおいて試験することを可能にする方法である。非常に密接に関連した種のＤＮＡ配列は同一であるため、この方法はまた、それらの微生物の検出を含みうる。したがって、この方法は多数の微生物を非常に迅速にスクリーニングすることを可能にする。更に、該方法はハイスループット用に適合可能である。したがって、本発明の方法は非常に高感度であり、低レベルで存在する病原体の検出を可能にする。

【課題を解決するための手段】

【0017】

発明の概括
本発明は、芝草の健全さだけでなく他の有機基質にも一般に関連した真菌および細菌のｒＲＮＡの遺伝子内の保存領域およびその遺伝子間領域に特異的なヌクレオチド配列の選択物の、本発明者らによる特定から得られたものである。

【0018】

したがって、本発明は、サンプルにおける少なくとも１つの病原体および／または１つの有益な微生物をハイブリダイゼーション技術により検出するための、
（ｉ）

【0019】

【化1】

からなる群から選択される配列；
（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列；または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補的配列
を含むまたはそれらからなる核酸のセットの使用に関する。

【0020】

本発明はまた、サンプルにおける少なくとも１つの病原体および／または１つの有益な微生物をハイブリダイゼーション技術により検出するための方法であって、
（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００からなる群から選択される配列；
（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列；または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補的配列
を含むまたはそれらからなる核酸のセットの使用を含む方法に関する。

【0021】

１つの実施形態においては、本発明はまた、サンプルにおける少なくとも１つの病原体および／または１つの有益な微生物をハイブリダイゼーション技術により検出するための、
（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９もしくは配列番号１００からなる群から選択される配列；
（ｉｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９もしくは配列番号１００に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列；または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補的配列
を含むまたはそれらからなる少なくとも１つの核酸の使用に関する。

【0022】

特定の実施形態においては、本発明はまた、サンプルにおける少なくとも１つの病原体および／または１つの有益な微生物をハイブリダイゼーション技術により検出するための方法であって、
（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９もしくは配列番号１００からなる群から選択される配列；
（ｉｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９もしくは配列番号１００に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列；または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補的配列
を含むまたはそれらからなる少なくとも１つの核酸の使用を含む方法に関する。

【0023】

本発明はまた、
（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００；
（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列；または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補的配列
を含むまたはそれらからなる核酸のセットを含むマイクロアレイ・チップに関する。

【0024】

特定の実施形態においては、本発明はまた、
（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００からなる群から選択される配列；
（ｉｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９もしくは配列番号１００に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列；または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補的配列
を含むまたはそれらからなる少なくとも１つの核酸を含むマイクロアレイ・チップに関する。

【0025】

本発明はまた、
ａ）病原体および／または有益な微生物のＤＮＡを含む標準物からの、およびサンプルからのＤＮＡ単離；
ｂ）ＰＣＲによる工程ａ）の単離ＤＮＡの増幅；
ｃ）得られたＰＣＲ産物の，上記に定義されたマイクロアレイ・チップ上におけるハイブリダイゼーション；
ｄ）結合ＤＮＡの検出；ならびに
ｅ）サンプルが病原体および／または有益な微生物を含有するかどうかのそれからの推定
の工程を含む、有機サンプルにおける病原体および／または有益な微生物の検出方法に関する。

【0026】

本発明はまた、
（ｉ）以下の配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００の核酸；
（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の核酸；または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補的配列の核酸
を含む、有機サンプルにおける病原体および／または有益な微生物の検出のためのキットに関する。

【0027】

本発明はまた、
ａ）罹患芝草が成長している土壌のサンプルまたは罹患芝草のサンプルにおける少なくとも１つの病原性真菌および／または細菌からの核酸の存在または非存在を、上記に定義された少なくとも１つの核酸、特に、上記に定義された核酸のセットを使用して、ＰＣＲとマイクロアレイ・チップとを組合せた方法により検出し、
ｂ）１以上の病原性真菌および／または細菌からの核酸が工程ａ）において検出された場合には、核酸が検出された１以上の病原性真菌および／または細菌を標的とする１以上の抗真菌剤および／または抗細菌剤を選択し、
ｃ）工程ｂ）において選択された１以上の抗真菌剤および／または抗細菌剤を罹患芝草に適用する工程を含む、罹患芝草の治療方法に関する。

【発明を実施するための形態】

【0028】

発明の詳細な説明
本発明において意図される核酸は任意のタイプのものでありうるが、それらはＤＮＡであることが好ましい。

【0029】

以下の表１は、帰属種の特定のために使用されうる核酸配列の詳細を示す。それは参照配列番号、オリゴヌクレオチドの名称、対応種、およびそれらを増幅するために２つのＰＣＲのいずれのタイプが必要であるかを示す（ＩＴＳ：真菌におけるリボソームＲＮＡをコードする遺伝子間領域および遺伝子を含むゲノム領域；１６Ｓ ｒＲＮＡ：細菌における１６ＳリボソームＲＮＡをコードするゲノム領域）。

【0030】

【表1】

【0031】

ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド塩基コード（ＩＵＰＡＣ）（Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ，Ａ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １３，３０２１−３０３０（１９８５））を用いて記載されている。ヌクレオチド配列においては、文字Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃはグアニン、アデニン、チミンおよびシトシンを示し、ＭはＡ、Ｃを示し、ＲはＡおよびＧを示し、ＷはＡおよびＴを示し、ＹはＣおよびＴを示し、ＳはＣおよびＧを示し、ＫはＧおよびＴを示し、ＨはＡおよびＣおよびＴを示し、ＶはＡおよびＣおよびＧを示し、ＤはＡおよびＧおよびＴを示し、ＢはＣおよびＧおよびＴを示し、ＮはＡおよびＣおよびＧおよびＴを示す。

【0032】

本発明において意図される、前述の配列番号１から１００に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むまたはそれらからなる核酸は、配列番号１から１００の核酸配列に対して８０から１００％同一である核酸配列である。特に、これらの核酸配列は配列番号１から１００の核酸配列に対して９０から１００％同一である、より詳細には９５から１００％、最も好ましくは９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一である。

【0033】

本発明のクエリー（問合せ）核酸配列に対して少なくとも例えば９５％の同一性を有する核酸では、該核酸配列は、該配列が該クエリー核酸配列のそれぞれ１００個の核酸当たり５個までの核酸変化を含みうること以外は、該クエリー配列に対して同一であると意図される。換言すれば、クエリー核酸配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有する核酸を得るためには、対象配列における核酸の５％（１００個中５個）までが挿入され、欠失し、または別の核酸で置換されることが可能である。

【0034】

本出願の場合、同一性の百分率は、グローバル・アライメント（すなわち、２つの配列をそれらの全長にわたって比較すること）を用いて計算される。２以上の配列の同一性を比較するための方法は当技術分野でよく知られている。例えば、全長を考慮した場合の２つの配列の最適アライメント（ギャップを含む）を見出すためにニードルマン−ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ）グローバル・アライメント・アルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いる「ニードル（ｎｅｅｄｌｅ）」プログラムが使用されうる。

【0035】

特に、本発明の核酸の最大長は５００ヌクレオチド以下、好ましくは３００以下、より好ましくは２００以下、更に好ましくは１００以下、より一層好ましくは５０以下、最も好ましくは３５以下であり、特定の実施形態においては、ヌクレオチド配列長は１９から３１ヌクレオチドである。

【0036】

本発明の場合、「少なくとも１つの核酸」は、例えば、配列番号１から１００の配列、配列番号１から１００に対して少なくとも８０％同一である配列およびそれらの相補的配列から選択される配列を含むまたはそれらからなる１、２、３、１０、２０、３０、４０、５０個またはそれを超える（１００個までの）核酸を意味する。それは、例えば、前記配列から選択される配列を含むまたはそれらからなる少なくとも４０個の核酸、少なくとも５０、６０、７０、８０または９０個の核酸でありうる。（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に記載されている配列の任意のものが選択可能であり、互いに組合せ可能であることに留意する必要がある。

【0037】

本発明の使用、方法およびマイクロアレイ・チップの特定の実施形態においては、少なくとも４０個の核酸、より詳細には少なくとも５０個の核酸が使用される。

【0038】

「ストリンジェントな条件」は、通常の知識を用いて、当業者により容易に定められうる。必要に応じて、そのような条件を定めるための指針が多数のテキスト、例えばＴｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ − Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２ “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて見出されうる。特に、本発明に従うストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーションバッファーの成分に応じて、ハイブリダイゼーションバッファーとハイブリダイゼーション温度との最適化組合せを要するハイブリダイゼーション反応を用いて構成されうる。ハイブリダイゼーション条件のそのような決定は当業者の通常の実施の範囲内である。

【0039】

本発明を限定するものとみなされるべきではないが、一例を挙げると、ハイブリダイゼーションは、アレレＤＮＡアレイ（ＡＬＥＲＥ ＤＮＡ Ａｒｒａｙ）プロトコールに従い、それにおいて記載されているハイブリダイゼーションバッファーを使用して（Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＡＬＥＲＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ，注文番号２４５２００１００および２４５２０Ｋ１００）、５５℃で行われうる。

【0040】

本発明において意図される「１つの病原体」は、その宿主において疾患を引き起こすいずれかのタイプの微生物である。宿主は動物、植物、または更には別の微生物でありうる。特に、病原体は細菌および／または真菌から選択される。より詳細には、真菌および／または細菌は、以下のものからなる群から選択される：アルミラリア・メレア（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａ）、アスコキタ・フレイナ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｐｈｌｅｉｎａ）、ビポラリス・ソロキニアナ（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、ブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、セルコスポラ・ゼブリン（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｚｅｂｒｉｎｅ）、クラビセプス・プルプレア（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、コレトトリクム・トリフォリイ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、コルチシウム・フシフォルメ（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ ｆｕｃｉｆｏｒｍｅ）、クルブラリア・アフィニス（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ａｆｆｉｎｉｓ）、ドレクスレラ・ジクチオイデス（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｄｉｃｔｙｏｉｄｅｓ）、ドレクスレラ・フレイ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｐｈｌｅｉ）、ドレクスレラ・ポエ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｐｏａｅ）、ドレクスレラ・シカンス（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｓｉｃｃａｎｓ）、ドレクスレラ・トリチシ−レペンチス（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｔｒｉｔｉｃｉ−ｒｅｐｅｎｔｉｓ）、エピクロエ・チフィナ（Ｅｐｉｃｈｌｏｅ ｔｙｐｈｉｎａ）、エクスセロヒルム・ツルシクム（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ ｔｕｒｃｉｃｕｍ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・ポエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｏａｅ）、ゲウマンノマイセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ギベレラ・インテルミディア（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、グリオクラジウム・カテヌラツム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、カバチエラ・カウリボラ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ ｃａｕｌｉｖｏｒａ）、レプトスフェリア・コルレ（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｋｏｒｒａｅ）、レプトスフェルリナ・アウストラリス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、マグナポルテ・ポエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｐｏａｅ）、マラスミウス・オレアデス（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ ｏｒｅａｄｅｓ）、ミクロドキウム・ボレイ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｂｏｌｌｅｙｉ）、ミクロドキウム・ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ）、ミクロスファエラ・トリフォリイ（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、ミロテシウム・ロリデゥム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｒｏｒｉｄｕｍ）、ネオチホジウム属種（Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ ｓｐ．）、オフィオスフェレラ・ヘルポトリチャ（Ｏｐｈｉｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈａ）、オフィオスフェレラ・ナルマリ（Ｏｐｈｉｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｎａｒｍａｒｉ）、ペロノスポラ・トリフォリオルム（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ）、フィラコラ・ブルガタ（Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａ ｖｕｌｇａｔａ）、フィトフトラ・ブラッシケ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、フィトフトラ・カクトルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍ）、フィトフトラ・シトリコラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｔｒｉｃｏｌａ）、フィトフトラ・ドレクスレリ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉ）、フィトフトラ・フラガリ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｆｒａｇａｒｉａｅ）、フィトフトラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）、フィトフトラ・ニコチアネ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、シュードペジザ・メディカギニス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｚｉｚａ ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）、プクキニア・コロナタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｃｏｒｏｎａｔａ）、プクキニア・コロナテ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｃｏｒｏｎａｔｅ）、プクキニア・グラミニス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、プクキニア・ポエ−ネモラリス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｐｏａｅ−ｎｅｍｏｒａｌｉｓ）、プクキニア・ポアルム（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｐｏａｒｕｍ）、プクキニア・レコンディテ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｒｅｃｏｎｄｉｔｅ）、プクキニア・ソルギ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉ）、プクキニア・ストリイフォルミス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）、プクキニア・トリチシナ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）、ピレノチェタ・リコペルシシ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、ピチウム・アファニデルマツマ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍａ）、ピチウム・デバリアヌム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ）、ピチウム・グラミニコラ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、ピチウム・イレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ピチウム・マストホルム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｓｔｏｐｈｏｒｕｍ）、ピチウム・スルカツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｕｌｃａｔｕｍ）、ピチウム・ウルチムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）、ラムラリア・コロ−シグニ（Ｒａｍｕｌａｒｉａ ｃｏｌｌｏ−ｃｙｇｎｉ）、リゾクトニア・セレアリス（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、リゾクトニア・フラガリエ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｆｒａｇａｒｉａｅ）、リンコスポリウム・オルトスポルム（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｏｒｔｈｏｓｐｏｒｕｍ）、リンコスポリウム・セカリス（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｅｃａｌｉｓ）、スクレロチニア・ボレアリス（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｂｏｒｅａｌｉｓ）、スクレロチニア・ホメオカルパ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）、スクレロチニア・スクレロチオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、スクレロチニア・トリフォリオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ）、セプトリア・マクロポダ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｍａｃｒｏｐｏｄａ）、セプトリア・トリチシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ）、ステムフィリウム・サルシネフォルメ（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｓａｒｃｉｎａｅｆｏｒｍｅ）、タナテホルス・ククメリス（Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ）、チエラビオプシス・バシコラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｂａｓｉｃｏｌａ）、チエラビオプシス・ポプリ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｐｏｐｕｌｉ）、チレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃａｒｉｅｓ）、チレチア・コントロベルサ（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ）、トリコデルマ・ハマツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｍａｔｕｍ）、チフラ・インカルナテ（Ｔｙｐｈｕｌａ ｉｎｃａｒｎａｔｅ）、チフラ・イシカリエンシス（Ｔｙｐｈｕｌａ ｉｓｈｉｋａｒｉｅｎｓｉｓ）、チフラ・イシカリエンシス（Ｔｙｐｈｕｌａ ｉｓｈｉｋａｒｉｅｎｓｉｓ）、ウロマイセス・ダクチリディス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｄａｃｔｙｌｉｄｉｓ）、ウロマイセス・トリフォリイ−レペンチス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｔｒｉｆｏｌｉｉ−ｒｅｐｅｎｔｉｓ）、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、ウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ）、ウスチラゴ・ストリイフォルミス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）、ウスチラゴ・トリチシ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｔｒｉｔｉｃｉ）、ベルチシリウム・ダーリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）；バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、セラチア・プリムチカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、ストレプトマイセス・アルビドフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ）、ストレプトマイセス・グラミノファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・グリセオビリディス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、ストレプトマイセス・リモスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ）、ストレプトマイセス・スカビエイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ）、キサントモナス・トランスルセンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ）。

【0041】

前述の一覧の一部であるが、同義名を有しうる、および／または改名された真菌および／細菌も包含される、と理解されなければならない。また、上記記一覧に記載されているものの密接に関連した種も本発明の範囲内である。密接に関連した種は、上記の配列番号１から１００の、１以上のヌクレオチドと、それらの保存領域内で同じ配列を有する種を意味する。

【0042】

特定の実施形態においては、本発明は、上記一覧に記載されている真菌および細菌の全ての検出のための、
（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００；
（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む若しくはそれらからなる配列；または
（ｉｖ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補的配列
を含むまたはそれらからなる核酸のセットの使用に関する。

【0043】

本発明において意図される「１以上の有益な微生物」は、昆虫、クモ類、他の動物、植物、細菌、真菌、ウイルスおよび線虫を含む、成長過程にとって有益となるいずれかの微生物である。特に、有益な微生物は植物成長促進性根圏細菌である。

【0044】

本発明において意図される、核酸が検出されるサンプルは、核酸を含有する傾向にある有機基質の任意のタイプのものでありうる。特に、それは芝草、土壌、自然肥料、種子または作物サンプルでありうる。より詳細には、自然肥料は、動物由来のもの、例えば動物の糞もしくは動物の糞尿、または植物もしくは薬草由来のもの、例えば葉、茎、根、種子、果実体もしくは花でありうる。

【0045】

サンプルが芝草サンプルである場合、それは、芝草の全体から得られたサンプル、または芝草の一部分のサンプル、例えば根、種子もしくは土壌でありうる。特に、サンプルは芝草の根もしくは種子または芝草サンプルの葉でありうる。

【0046】

特に、本発明の範囲内で考慮される芝草は、特に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙにより発行されたＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｔｕｒｆｇｒａｓｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）に記載されている。

【0047】

より詳細には、芝草サンプルは、フェスタセエ連（Ｆｅｓｔａｃｅａｅ）、アベネエ連（Ａｖｅｎｅａｅ）、トリチセエ連（Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ）、クロリデエ連（Ｃｈｌｏｒｉｄｅａｅ）、ゾイシエエ連（Ｚｏｙｓｉｅａｅ）、パニセエ連（Ｐａｎｉｃｅａｅ）およびアンドロポゴネエ連（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｅａｅ）からなる群から選択される。

【0048】

サンプルが土壌サンプルである場合、それは、好ましくは、直接的に罹患領域下で、または罹患領域（好ましくは芝草）に周辺において採取される。

【0049】

サンプルは、芝草、肥料、種子、作物または土壌から直接入手可能であり、あるいは粉砕、凍結乾燥または抽出、特に核酸抽出工程のような処理工程後に入手可能である。

【0050】

特定の実施形態においては、核酸が検出されるべきサンプルはヒト由来ではない。

【0051】

本発明において意図される、上記に定義された少なくとも１つの核酸または上記に定義された核酸のセットは、ハイブリダイゼーション技術、特に、核酸ハイブリダイゼーションに基づく検出方法において使用されることになる。そのような方法の例としては、マイクロアレイ・チップ、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられ、この場合、核酸はハイブリダイゼーションのためのプライマー、プローブまたは鋳型として使用される。選択される方法に応じて、核酸は標識され、または標識されない。そのような標識の例としては、ビオチン、ストレプトアビジン、蛍光化学物質、放射性同位体、ジゴキシゲニン、および結合ＤＮＡの検出を可能にする他の多数のものが挙げられる。

【0052】

核酸ハイブリダイゼーションに基づく検出方法は当業者によく知られている。

【0053】

例えば、マイクロアレイ・チップはＳｔｅｖｅ Ｒｕｓｓｅｌｌによる“Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ”（２００８，ＩＳＢＮ−１０：０１２３７２５１６Ｘ，ＩＳＢＮ−１３：９７８−０１２３７２５１６５）に詳細に記載されており、多数の刊行物（Ｏｈ Ｓら，Ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｖｅｒｓｅ ｈａｂｉｔａｔｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（１０）：ｅ４７００５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４７００５．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｏｃｔ ８）において使用されている。

【0054】

例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サザンブロット分析およびノーザンブロット分析はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２，ＩＳＢＮ−１０：１９３６１１３４２２｜ＩＳＢＮ−１３：９７８−１９３６１１３４２２）に詳細に記載されている。

【0055】

選択される検出方法としてのポリメラーゼ連鎖反応の場合、上記に定義された少なくとも１つの核酸または上記に定義された核酸のセットは、ＰＣＲの特異性を伝達するために使用され、ここで、該核酸は標識されまたは標識されないことが可能であり、プライマーまたはプローブとして使用されうる。

【0056】

選択される検出方法としてのサザンまたはノーザン分析の場合、上記に定義された少なくとも１つの核酸または上記に定義された核酸のセットはハイブリダイゼーション中に使用され、ここで、該核酸は標識されまたは標識されないことが可能である。

【0057】

選択される検出方法としてのマイクロアレイ・チップの場合、上記に定義された少なくとも１つの核酸または上記に定義された核酸のセットはマイクロアレイ・チップ上のプローブとして使用され、ここで、該核酸は標識されまたは標識されないことが可能である。

【0058】

上記のマイクロアレイ・チップハイブリダイゼーション方法は、該アッセイの感度または特異性を増加させるために、一般的なＰＣＲと組合されうる。上記に定義された少なくとも１つの核酸配列または上記に定義された核酸のセットは最終的なＰＣＲ産物の一部となる。ＰＣＲおよびその変法を用いるそのような増幅方法は当業者によく知られている。

【0059】

したがって、本発明の特定の実施形態においては、ハイブリダイゼーション技術は、マイクロアレイ・チップと組合されたＰＣＲを含むことが可能であり、ここで、ＰＣＲは感度を増加させ、バックグラウンドを減少させ、および／またはＰＣＲ産物に検出標識を付加する。

【0060】

真菌からのヌクレオチド配列または真菌からの単離されたＤＮＡをＰＣＲにより増幅しようとする場合には、ＰＣＲは、上記の少なくとも１つの核酸配列を含む１以上の真菌のゲノム内の配列（内部転写スペーサー（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ）（ＩＴＳ））を標的とするプライマーを含む。特に、１つのプライマーは１以上の真菌の１８Ｓ ｒＤＮＡ／ＩＴＳ１領域またはＩＴＳ２／２８Ｓ ｒＤＮＡ領域を標的とする。真菌ｒＲＮＡオペロンは１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、内部転写スペーサー１（ＩＴＳ１）、５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、内部転写スペーサー２（ＩＴＳ２）および２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含む。したがって、１８Ｓ ｒＤＮＡ／ＩＴＳ１およびＩＴＳ２／２８ ｒＤＮＡ領域は、それぞれ、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とＩＴＳ１との接合部ならびにＩＴＳ２と２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子との接合部の付近の１以上の真菌のゲノムの領域に関するものである。当業者には明らかなとおり、フォワードプライマーとしての一方の核酸を設計する場合、１８Ｓ ｒＤＮＡ／ＩＴＳ１領域またはＩＴＳ２／２８Ｓ ｒＤＮＡ領域を標的とするプライマーはリバースプライマーとなり、その逆も言える。１８Ｓ ｒＤＮＡ／ＩＴＳ１およびＩＴＳ２／２８Ｓ ｒＤＮＡ領域の配列は当業者によく知られており、通常、公の配列データベースからアクセス可能である。１８Ｓ ｒＤＮＡ／ＩＴＳ１およびＩＴＳ２／２８Ｓ ｒＤＮＡ領域の配列が個々の真菌種に関して公に入手可能でない場合、それらは常法により配列決定されうる。また、既知配列内のプライマーを選択することは当業者の通常の知識の範囲内である。

【0061】

１８Ｓ ｒＤＮＡ／ＩＴＳ１領域を標的とするプライマーの一例として、配列ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ（配列番号１０１）のいわゆる「ＩＴＳ１プライマー」が挙げられうる。逆に、ＩＴＳ２／２８Ｓ ｒＤＮＡ領域を標的とするプライマーの一例として、配列ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ（配列番号１０２）のいわゆる「ＩＴＳ４プライマー」が挙げられうる。更に他の例はＷＯ ２００９／１４７０１７ Ａ１、Ｗｈｉｔｅら １９９０，Ｇａｒｄｅｓ ＆ Ｂｒｕｎｓ １９９３から入手可能である。

【0062】

細菌からのヌクレオチド配列または細菌からの単離されたＤＮＡをＰＣＲにより増幅しようとする場合には、ＰＣＲは、上記の少なくとも１つの核酸配列を含む１以上の細菌のゲノム内の配列（１６Ｓ ｒＲＮＡ）を標的とするプライマーを含む。しかし、該プライマーは１６Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子を標的とすることが好ましい。当業者に明らかなとおり、フォワードプライマーとしての一方の核酸を設計する場合、他方のプライマーはリバースプライマーとなり、その逆も言える。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列は当業者によく知られており、通常、公の配列データベースからアクセス可能である。１６Ｓ ｒＲＮＡの配列が個々の細菌種に関して公に入手可能でない場合、それらは常法により配列決定されうる。また、既知配列内のプライマーを選択することは当業者の通常の知識の範囲内である。

【0063】

１６Ｓ ｒＲＮＡを標的とするプライマーの一例として、配列ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ（配列番号１０３）のいわゆる「ＥＵＢ８ｍ ｆ プライマー」および配列ＣＴＣＧＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＴＡＡＣＣ（配列番号１０４）の「ＥＵＢ１０８８ ｒプライマー」が挙げられ、ここで、一方のプライマーはフォワードプライマーとして作用し、他方はリバースプライマーとして作用する。

【0064】

本発明において意図される、使用されるプライマーは、修飾されていないまたは修飾された核酸、特にＤＮＡでありうる。プライマーが、修飾された核酸である場合、それらは、とりわけ、標識された核酸、特に、ビオチンで標識された、蛍光標識された、または放射能標識された核酸でありうる。

【0065】

核酸は有機サンプル（例えば、芝草、土壌、作物、植物、肥料、種子など）から単離され精製される必要があるかもしれない。核酸の単離のための方法は当業者によく知られており、検出に用いられる検出方法および有機サンプル源に左右されうる。一例としては、核酸単離のための方法は科学文献（例えば、Ｍｉｃｈｅｌｅ Ｋ．Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ，Ｐｈａｅｄｒａ Ｄｏｕｋａｋｉｓ，Ｍａｒｙ Ｅｇａｎら，“ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｔｏｏｌｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｒｏｂ ＤｅＳａｌｌｅら編（Ｃ）２００２ Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｂａｓｅｌ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されている。更に他の例としては、多数の商業的に入手可能な方法またはキット（例えば、”ＤＮｅａｓｙ（Ｒ）Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ ６９１０４）または“ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ（Ｒ）ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＯ ＢＩＯ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｃａｔ ｎｏ．１２８８８−１００）が挙げられる。

【0066】

前述のとおり、本発明はまた、本発明の少なくとも１つの核酸を含むマイクロアレイ・チップに関する。

【0067】

特に、該マイクロアレイ・チップは本発明のおよび前述の核酸の全セットを含む。

【0068】

本発明の１つの実施形態においては、本発明のマイクロアレイ・チップはサンプルにおける少なくとも１つの病原体および／または有益な微生物の検出のために使用され、該病原体、有益な微生物およびサンプルは上記に定義されたとおりである。

【0069】

特に、本発明のマイクロアレイ・チップは、上記一覧に記載されている真菌および細菌の全ての検出に使用される。

【0070】

前述のとおり、本発明はまた、有機サンプルにおける病原体および／または有益な微生物の検出方法に関する。

【0071】

特に、この方法は、前述の一覧において定められている真菌および細菌の全ての検出のためのものであり、その工程ｂ）において２つのＰＣＲを行い、第１のＰＣＲは真菌ＤＮＡに関するものであり、第２のＰＣＲは細菌ＤＮＡに関するものである。

【0072】

特定の実施形態においては、それらの２つのＰＣＲは１つの単一反応チューブ内に合体される。

【0073】

実験方法
有機サンプル（例えば、芝草、土壌、作物、植物部分など）から、および標準物（単離された細菌、単離された真菌など）から、ＤＮＡを単離する。方法は当業者に公知である。具体例は科学文献（例えば、Ｍｉｃｈｅｌｅ Ｋ．Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ，Ｐｈａｅｄｒａ Ｄｏｕｋａｋｉｓ，Ｍａｒｙ Ｅｇａｎら，“ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｔｏｏｌｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｒｏｂ ＤｅＳａｌｌｅら編（Ｃ）２００２ Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｂａｓｅｌ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されており、多数の商業的な方法も利用可能である（例えば、”ＤＮｅａｓｙ（Ｒ）Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ ６９１０４）または“ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ（Ｒ）ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＯ ＢＩＯ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｃａｔ ｎｏ．１２８８８−１００）。

【0074】

真菌−ＰＣＲ（ＩＴＳ）を行うことが可能である。真菌特異的であるが種非特異的であるＰＣＲを用いて、ｒＤＮＡ内部転写スペーサー配列（ＩＴＳ）を増幅する。そのようなプライマーペアの例としては、他の文献（Ｗｈｉｔｅら，１９９０，Ｇａｒｄｅｓ ＆ Ｂｒｕｎｓ １９９３）に記載されているとおり、１８Ｓ ｒＤＮＡ／ＩＴＳおよびＩＴＳ２／２８Ｓ ｒＤＮＡ領域を標的とするＩＴＳ１（ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ）（配列番号１０１）およびＩＴＳ４（ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ）（配列番号１０２）が挙げられる。同じ領域を増幅する他のプライマーペアもこの方法で適用可能である。当業者は、全ての生物におけるこの領域を標的とするそのようなプライマーを設計および／または使用することが可能であろう。

【0075】

細菌−ＰＣＲ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）を行うことが可能である。細菌特異的であるが種非特異的であるＰＣＲを用いて、細菌１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅する。そのようなプライマーペアの例としては、配列ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ（配列番号１０３）の「ＥＵＢ８ｍ ｆプライマー」および配列ＣＴＣＧＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＴＡＡＣＣ（配列番号１０４）の「ＥＵＢ１０８８ ｒプライマー」が挙げられる。同じ領域または全１６Ｓ ｒＲＮＡを増幅する他のプライマーペアもこの方法で適用可能である。当業者は、全ての生物におけるこの領域を標的とするそのようなプライマーを設計および／または使用することが可能であろう。

【0076】

２つのＰＣＲは単一の反応チューブ内に合体されうる。当業者はこれを行うことが可能であろう。

【0077】

最終的に、ＰＣＲ産物を標識する必要がある。それを行うための多数の方法および色素が存在する（蛍光色素、ビオチン、同位体、ジゴキシゲニン標識）。ＰＣＲ産物はＰＣＲ中に標識されることが可能であり（例えば、標識プライマー）、あるいはＰＣＲ産物は増幅後に標識される。

【0078】

ＰＣＲ産物は標準的な方法（例えば、ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ精製キット）により精製される。

【0079】

個々のまたは組合された精製ＰＣＲ産物を本発明のおよび上記のマイクロアレイ・チップ上のＤＮＡにハイブリダイズさせ、ストリンジェントな様態で洗浄して未結合ＤＮＡを除去する（例えば、Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＡＬＥＲＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ，注文番号２４５２００１００および２４５２０Ｋ１００）。

【0080】

増幅中にＰＣＲ産物に付加された標識に特異的な検出方法により、結合ＤＮＡを検出する。

【0081】

そのような検出方法は当業者によく知られている。例えば、蛍光標識は、発蛍光団を励起しうる、そして蛍光感受性カメラを使用して放出シグナルを測定しうる装置を使用して測定されうる。ビオチン標識は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に連結されたストレプトアビジンを使用して検出されうる。ＨＲＰは変色産物への基質の変換を触媒する。ついで、ＨＲＰの存在、したがってビオチンの存在が、加工された基質の検出により測定される。基質の例としては、３，３’−ジアミノベンジジンまたは３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンが挙げられる。産物の測定のための方法は基質に左右され、化学発光シグナル感受性カメラまたは光学スペクトルを測定する光学カメラ（ヒトの眼を含む）でありうる。そのような装置の具体例として、ＡＴＲ３ ＡｒｒａｙＴｕｂｅ（ＴＭ）Ｒｅａｄｅｒ（Ｉｄｅｎｔｉｂａｃ，Ａｌｅｒｅによる、マイクロアレイ用）またはＣｈｅｍｉＤｏｃ（ＴＭ）ＭＰイメージャー（Ｂｉｏｒａｄによる、サザンおよびノーザンブロット用）およびＲｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ Ｑ（ＱＩＡＧＥＮによる、ＰＣＲ用）が挙げられる。

【0082】

したがって、サンプルが病原体および／または有益な微生物を含有するかどうかをそれから推定すること、ならびにサンプル中に存在する種を特定することが可能である。

【0083】

特に、この方法は、病原体の非存在に関する有機サンプルのスクリーニングのために、その使用の前に使用可能であり、病原体が現れ疾患を引き起こす前に病原体を検出しうる。

【0084】

前述のとおり、本発明はまた、有機サンプルにおける病原体および／または有益な微生物の検出のための検出キットに関する。

【0085】

前述のとおり、本発明はまた、罹患芝草の治療方法に関する。

【0086】

したがって、本発明により、芝草、土壌、自然肥料（例えば、病原体の非存在）、種子および作物の分析、ならびに疾患を示す草における原因となる病原体の検出が可能となる。

【0087】

本発明は以下の実施例により更に詳細に例示される。

【実施例】

【0088】

実施例１
マイクロアレイチューブを本発明の核酸配列（配列番号１から１００）（Ａｌｅｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙにより提供された）に共有結合させた。再現可能な結果を得るために、本発明のおよび上記の核酸配列を該マイクロアレイ上に二重重複してスポットした。各スポットは０．０２μｍｏｌのヌクレオチドを含有し、該ヌクレオチドを３’Ｃ７−アミノ修飾により該アレイ上に固定化した。

【0089】

単離された真菌、芝草または土壌からのＤＮＡを、市販のキットＰｏｗｅｒＳｏｉｌ（Ｒ）ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＯ ＢＩＯ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，注文番号１２８８８−１００）を使用して、製造業者の説明に従い抽出した。芝草からなるサンプルからのＤＮＡを、最大０．３ｇの土壌を使用して単離した。

【0090】

５’末端にビオチン標識を含有するプライマーペアＩＴＳ１およびＩＴＳ４を使用して、真菌ｒＤＮＡゲノム領域（ＩＴＳ）の増幅を行った。プライマーはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。残留プライマー、バッファーおよびヌクレオチドを除去するために、Ｑｉａｇｅｎの「ＰＣＲ精製キット」（＃２８１０４）を使用して、ＰＣＲ産物を精製した。

【0091】

得られた精製ビオチン化ＰＣＲ産物を該マイクロアレイチューブにハイブリダイズさせた。該ハイブリダイゼーション法および試薬はＡｌｅｒｅ（Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＡＬＥＲＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ，注文番号２４５２００１００）から入手した。特異性を増加させるためにハイブリダイゼーション温度を増加させた（５５から６１℃）。ハイブリダイゼーションおよび未結合ＤＮＡの洗浄除去の後、Ａｌｅｒｅ（Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＡＬＥＲＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ，注文番号２４５２０Ｋ１００）のホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンおよびホースラディッシュペルオキシダーゼ基質を使用して、結合ビオチン化ＰＣ産物を検出した。

【0092】

マイクロアレイチューブ上のシグナル強度およびスポット化チップに対する位置をＡＴＲ３（Ａｌｅｒｅチューブリーダーバージョン３）で測定した。強度測定は結合ＰＣＲ産物の半定量値を与えた。Ａｌｅｒｅにより開発された分析ソフトウェア（ＩｃｏｎｏＣｌｕｓｔ，Ｓｔａｎｄａｒｄ ｖｅｒｓｉｏｎ，Ｂｕｉｌｄ：３．６ｒ０）は、ある与えられたスポットから受け取られたバックグラウンドシグナルおよびシグナル強度を処理し、ある与えられたスポットに存在する核酸にシグナル強度を帰属させた。各スポットは、対照スポットおよびシグナル強度から計算される約０と＋１（任意単位）との間のシグナル強度を示した。

【0093】

表２：種々のサンプルにおいて検出されたシグナル強度（Ａ〜Ｅ：個々の芝草サンプル，Ｆ：以下の単離された真菌培養の混合物：ビポラリス・ソロキニアナ（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）株５８３、スクレロチニア・マイナー（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｍｉｎｏｒ）株４５４、ピレノケタ・リコペルシシ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）株４５（プローブＢＩＳＯ、ＳＣＳＣおよびＰＹＬＹに結合すると予想される）。エス・マイナー（Ｓ．ｍｉｎｏｒ）はエス・スクレロチオルム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）に非常に密接に関連しており、該プローブに結合すると予想される。０．０７を超えるシグナル強度は太字で示されている。オリゴＩＤと種との対応は表１に見出されうる。

【0094】

【表2】

【0095】

結論：
本発明は真菌および細菌種の大きな選択物からの微生物の特定を可能にする。本発明の方法は従来の方法より迅速であり、特定可能な微生物の、より広いスペクトルを有し、より特異的である。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]