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特許6525212ＡＴＰ１１ＣまたはＣＤＣ５０Ａの阻害物質のスクリーニング方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6525212
(24)【登録日】2019年5月17日
(45)【発行日】2019年6月5日
(54)【発明の名称】ＡＴＰ１１ＣまたはＣＤＣ５０Ａの阻害物質のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20190527BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20190527BHJP
G01N 33/92 20060101ALI20190527BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20190527BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20190527BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20190527BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20190527BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 ZZNA
G01N33/15 Z
G01N33/92 C
C12Q1/02
A61K45/00
A61P43/00 105
A61P35/00
【請求項の数】7
【全頁数】31
(21)【出願番号】特願2016-512739(P2016-512739)
(86)(22)【出願日】2015年4月7日
(86)【国際出願番号】JP2015060817
(87)【国際公開番号】WO2015156275
(87)【国際公開日】20151015
【審査請求日】2017年10月24日
(31)【優先権主張番号】61/976,651
(32)【優先日】2014年4月8日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】61/978,415
(32)【優先日】2014年4月11日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(74)【代理人】
【識別番号】100101454
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 卓二
(74)【代理人】
【識別番号】100062144
【弁理士】
【氏名又は名称】青山 葆
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】長田 重一
(72)【発明者】
【氏名】瀬川 勝盛
【審査官】
赤坂 祐樹
(56)【参考文献】
【文献】
特開２００３−１５５２５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１２／０２９８５５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
Folmer DE et al.，P4 ATPases - lipid flippases and their role in disease，Biochim Biophys Acta，２００９年 ７月，1791(7)，628-635
【文献】
Yabas M et al.，ATP11c is critical for phosphatidylserine internalization and B lymphocyte differentiation，Nat Immunol，２０１１年 ５月，12(5)，441-449
【文献】
Sebastian TT et al.，Phospholipid flippases: Building asymmetric membranes and transport vesicles，Biochimica et Biophysica Acta，２０１１年１２月３１日，1821，1068-1077
【文献】
VERHOVEN, BB et al.，J. Exp. Med.，１９９５年１１月，Vol. 182，1597-1601
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ATP11CまたはCDC50Aの阻害物質をスクリーニングする方法であって、
（１）ATP11Cを発現する細胞またはその膜画分と、該阻害物質の候補物質とを接触させる工程、および、
（２）ATP11Cのカスパーゼによる切断を調べる工程、
を含み、対照と比較してATP11Cの切断を増加させる候補物質がATP11Cの阻害物質として選択される、方法。
（１）ATP11Cを発現する細胞またはその膜画分と、該阻害物質の候補物質とを接触させる工程、および、
（２）ATP11Cのカスパーゼによる切断を調べる工程、
を含み、対照と比較してATP11Cの切断を増加させる候補物質がATP11Cの阻害物質として選択される、方法。
【請求項2】
がんまたはアポトーシス関連疾患を治療または予防するための薬剤のスクリーニングのための、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
アポトーシス関連疾患が自己免疫疾患である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
マクロファージによる細胞の貪食を誘導する方法であって、ATP11CまたはCDC50Aを阻害することを含む方法。
【請求項5】
細胞ががん細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
がんまたはアポトーシス関連疾患を治療または予防するための、請求項４または５に記載の方法。
【請求項7】
ATP11CまたはCDC50Aの阻害物質を対象に投与することを含む、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ATP11CまたはCDC50Aの阻害物質をスクリーニングする方法に関する。本発明はまた、マクロファージによる細胞の貪食を誘導する方法に関する。【背景技術】
【0002】
真核生物の細胞膜はリン脂質二重膜から構成され，リン脂質が非対称に分布している。アミノ基を含んだホスファチジルセリンは細胞質側（細胞膜内葉）に存在し、細胞外側（細胞膜外葉）には存在しない。このホスファチジルセリンの非対称的な分布には、フリッパーゼとよばれるアミノリン脂質を細胞質側に輸送する酵素が関与していると考えられている。一方、アポトーシスを起こした細胞ではホスファチジルセリンの非対称的な分布が崩壊し、本来は細胞質側に存在するホスファチジルセリンが細胞の表面に露出する。このホスファチジルセリンを認識することにより、食細胞は生きた細胞を貪食せず、アポトーシスを起こした細胞を特異的に貪食すると考えられている。しかしながら，ホスファチジルセリンが生きた細胞の細胞膜においてどのように非対称的に維持され、アポトーシスを起こした細胞ではどのように露出するのか、その分子機構は不明である。さらに。ホスファチジルセリンの露出のみで食細胞による貪食を誘導できるのかは、いまだ明らかでない。【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際公開第２０１２／０２９８５５号公報（引用により本明細書に含まれる）
【特許文献2】国際公開第２０１３／１５７６５２号公報（引用により本明細書に含まれる）
【特許文献3】国際公開第２０１４／０７７２７９号公報（引用により本明細書に含まれる）
【発明の概要】
【0004】
本発明者らは、生きた細胞あるいはアポトーシスを起こした細胞の細胞膜におけるホスファチジルセリンの分布を制御する機構、および、その制御機構が貪食に及ぼす影響について解析した。その結果、ATP11CおよびCDC50Aがアポトーシスを起こした細胞のホスファチジルセリンの露出に関与すること、および、ATP11Cがカスパーゼに切断され不活性化されることによりホスファチジルセリンが露出することを見出した。【0005】
本発明は、ATP11CまたはCDC50Aの阻害物質をスクリーニングする方法であって、（ａ）細胞表面におけるホスファチジルセリンの露出、（ｂ）細胞のマクロファージによる貪食、または（ｃ）ATP11Cのカスパーゼによる切断を調べることを含む方法を提供する。【0006】
本発明は、マクロファージによる細胞の貪食を誘導する方法であって、ATP11CまたはCDC50Aを阻害することを含む方法を提供する。【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1A】ハプロイド細胞を用いた遺伝子スクリーニング（Ａ）。レトロウイルスを感染させることにより網羅的に変異を導入したKBM7をNBD-PSと共にインキュベートし、FACSにより解析した。NBD-PSを取り込む能力が減少した約1.0%の細胞を集め、増殖させ、再度選別して、低フリッピング(LF)細胞を得た。
【図1B】ハプロイド細胞を用いた遺伝子スクリーニング（Ｂ）。遺伝子の機能を低下させるレトロウイルスの挿入部位をマス・シークエンシングによって同定し、各ヒト染色体について近接インデックスをプロットした。変異遺伝子(CDC50AおよびATP11C)をレトロウイルスの挿入された数(N)とともに示す。CDC50A全体のイントロン−エクソン構造およびATP11Cのエクソン1-5におけるレトロウイルスの挿入位置を矢印で示す(黒, センス方向；白, アンチセンス方向)。
【図1C】ハプロイド細胞を用いた遺伝子スクリーニング（Ｃ）。hATP11Cおよび hCDC50Aの構造を、番号を付した膜貫通セグメントとともに示す。hATP11Cにおいて、SERCA2a (40)との類似性によって予測される３個の細胞質ドメイン(Ａ：アクチュエーター、Ｐ：リン酸化、およびＮ：ヌクレオチド結合)を円で示す。
【図1D】ハプロイド細胞を用いた遺伝子スクリーニング（Ｄ）。図中に示すマウス組織におけるATP11CおよびCDC50AのmRNAレベルをリアルタイムRT-PCRによって測定し、1.0 ng の全RNAに対するコピー数として表した。
【図1E】ハプロイド細胞を用いた遺伝子スクリーニング（Ｅ）。hATP11C-GFPをヒトHEK293T細胞で発現させ、共焦点蛍光顕微鏡によって観察した。DIC＝微分干渉。スケール・バー＝10μm。
【0008】
【図2A】フリッパーゼ活性におけるATP11CおよびCDC50Aの必要性（Ａ）。KBM7、ATP11CGT、およびCDC50AGTにおける、ATP11C mRNAおよびCDC50A mRNA量をリアルタイムRT-PCRで測定し、β−アクチン mRNAに対する相対値として示した。
【図2B】フリッパーゼ活性におけるATP11CおよびCDC50Aの必要性（Ｂ）。KBM7を、1.5μM NBD-PS (PtdSer)、NBD-PE (PtdEtn)、またはNBD-PC (PtdCho)と共にインキュベートし、脂肪酸不含BSAで処理し、フローサイトメトリーによって解析した。平均蛍光強度(MFI)をプロットした。
【図2C】フリッパーゼ活性におけるATP11CおよびCDC50Aの必要性（Ｃ）。KBM7、ATP11CGT、CDC50AGT、およびhATP11CまたはhCDC50Aを発現するそれらの形質転換体を、図中に示すNBD標識リン脂質と共に20分間インキュベートし、フローサイトメトリーにより解析した。MFIをプロットした(n=3)。
【図2D】フリッパーゼ活性におけるATP11CおよびCDC50Aの必要性（Ｄ）。KBM7、ATP11CGT、およびCDC50AGTを、NBD-PSと共に、ATPase の阻害化合物バナデートの存在下または非存在下で、20分間インキュベートし、フローサイトメトリーにより解析した。MFIをプロットした(n=3)。
【図2E】フリッパーゼ活性におけるATP11CおよびCDC50Aの必要性（Ｅ）。KBM7における図中に示すP4-ATPアーゼまたはCDC50ファミリーメンバーのmRNAを、RT-PCRにより解析した。
【図2F】フリッパーゼ活性におけるATP11CおよびCDC50Aの必要性（Ｆ）。KBM7、ATP11CGT、CDC50AGT、および hCDC50Aを発現するCDC50AGT形質転換体を、Cy5-Annexin VおよびSytox Blueで染色した。Sytox Blue陰性集団のAnnexin V 染色プロファイル、および Annexin V陽性細胞の割合を示す。
【0009】
【図3A】カスパーゼによるATP11Cの切断（Ａ）。W3細胞において、mATP11C遺伝子をCRISPR-Casを用いて変異させた。プロトスペーサー配列をハイライトし、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に下線を引き、切断部位を矢印で示した。ATP11CED22およびATP11CED23 細胞株ではATP11C遺伝子の両アレルに、“GT”または“A”残基が挿入され(二重下線で示す)、遺伝子の機能を喪失させていた。
【図3B】カスパーゼによるATP11Cの切断（Ｂ）。W3細胞、ATP11CED22、およびATP11CED23、並びにそれらのhATP11C形質転換体をNBD-PSと共に15分間インキュベートした。取り込まれたNBD-PSをMFIによって表した(n=3)。
【図3C】カスパーゼによるATP11Cの切断（Ｃ）。カスパーゼ認識部位およびα−ヘリックスを有するhATP11C-GFPの構造を示す。6種の脊椎動物のATP11Cに存在するカスパーゼ認識部位付近のアミノ酸配列を並べた。全てのメンバーで保存されている残基に＊を付した。
【図3D】カスパーゼによるATP11Cの切断（Ｄ）。W3細胞およびATP11CED22を、20μMのQVD-OPhの存在下または非存在下で、FasLと共に1時間インキュベートした。膜画分を抗 mATP11Cまたは抗 mFasでウェスタンブロッティングにより解析した。上および中央のパネルは抗 mATP11Cによるブロットであり、中央のパネルでは露出時間を延長した。
【図3E】カスパーゼによるATP11Cの切断（Ｅ）。ATP11CED22、および野生型または変異型 hATP11C-GFPを発現するその形質転換体を、FasLと共に45分間インキュベートし、抗 GFPを用いたウェスタンブロッティングにより解析した。
【図3F】カスパーゼによるATP11Cの切断（Ｆ）。野生型または変異型 ATP11C-GFPを発現するATP11CED22形質転換体の可溶化膜画分を、種々のカスパーゼとインキュベートし(C1〜C10, カスパーゼ-1-10)、または処理せずに(-)、抗 GFPを用いたウェスタンブロッティングにより解析した。
【0010】
【図4A】アポトーシス時のPtdSer露出におけるカスパーゼによるATP11C切断の必要性（Ａ）。W3細胞、ATP11CED22、および野生型またはカスパーゼ耐性hATP11Cを発現するATP11CED22形質転換体(ATP11CED22-hATP11CまたはATP11CED22-CasR)をNBD-PSと共に25℃でインキュベートし、BSAで処理し、FACSにより解析した。実験を3度行ない、平均MFIをプロットした(n=3)。
【図4B】アポトーシス時のPtdSer露出におけるカスパーゼによるATP11C切断の必要性（Ｂ）。W3細胞、ATP11CED22、ATP11CED22-hATP11C、およびATP11CED22-CasRを、未処理、またはFasLで2時間処理した。Sytox Blue陰性集団のAnnexin Vプロファイルを示す。
【図4C】アポトーシス時のPtdSer露出におけるカスパーゼによるATP11C切断の必要性（Ｃ）。W3細胞、ATP11CED22、ATP11CED22-hATP11C、およびATP11CED22-CasRを1時間 FasLで処理した。処理前後の細胞溶解物を、活性型カスパーゼ-3を認識する抗体または抗α−チューブリン抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析した。
【図4D】アポトーシス時のPtdSer露出におけるカスパーゼによるATP11C切断の必要性（Ｄ）。W3細胞、ATP11CED22、および野生型hATP11CまたはCasRを発現するATP11CED22形質転換体を、未処理とするか、またはFasLで1時間または2時間処理した。細胞を0.5μM NBD-PCと共に25℃で4分間インキュベートし、FACSにより解析した。平均MFIをプロットした(n=3)。各カラムは、左から、W3、ATP11CED22、ATP11CED22-hATP11C、およびATP11CED22-CasRの結果を示す。
【図4E】アポトーシス時のPtdSer露出におけるカスパーゼによるATP11C切断の必要性（Ｅ）。W3-IldmおよびJurkat細胞をhATP11CまたはCasRで形質転換し、W3-hATP11C、W3-CasR、Jurkat-hATP11CおよびJurkat-CasRを樹立した。これらの細胞をFasLで処理し、Annexin Vで染色して、FACSにより解析した。下の写真は、細胞溶解物を抗活性型カスパーゼ-3抗体を用いてウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す。
【図4F】アポトーシス時のPtdSer露出におけるカスパーゼによるATP11C切断の必要性（Ｆ）。FasLで処理したW3-Ildm、W3Ildm-hATP11CおよびW3Ildm-CasRをpHrodoで標識し、チオグリコレートで処理することにより、腹腔に浸潤してきたマクロファージ（thio-pMacs）と1時間インキュベートし、フローサイトメトリーにより解析した。
【0011】
【図5A】CDC50A-/-生細胞におけるPtdSerの構成的露出（Ａ）。W3-Ildm細胞におけるmCDC50メンバー(50A、50Bおよび50C)のmRNA レベルをリアルタイムRT-PCRを用いて測定した結果を示す。
【図5B】CDC50A-/-生細胞におけるPtdSerの構成的露出（Ｂ）。Crisp-Casのための mCDC50A 標的配列。プロトスペーサー配列を網掛けで、プロトスペーサー配列隣接モチーフ(PAM)を下線で、切断部位を矢印で示す。２種の変異細胞クローン(CDC50AED29およびCDC50AED62)は両アレルで異なるインデル(二重下線で示す)を有し、それぞれ76番目と99番目、および76番目と77番目でタンパク質が終結（truncation）する。
【図5C】CDC50A-/-生細胞におけるPtdSerの構成的露出（Ｃ）。W3-Ildm、CDC50AED29およびCDC50AED62、hCDC50Aを発現するそれらの形質転換体、ならびにW3-D430G-LをNBD-PSと共に15分間インキュベートした。取り込まれたNBD-PSをFACSによって定量化し、MFIとして表した(n=3)。
【図5D】CDC50A-/-生細胞におけるPtdSerの構成的露出（Ｄ）。W3-Ildm、CDC50AED29およびCDC50AED62をAnnexin Vバッファー中でCy5-Annexin VまたはFITC-MFG-E8により染色し、FACSにより解析した。CDC50AED29およびCDC50AED62の染色プロファイル（黒）を、そのhCDC50A形質転換体の染色プロファイル（白）と共に示す。
【図5E】CDC50A-/-生細胞におけるPtdSerの構成的露出（Ｅ）。W3-Ildm、CDC50AED29およびW3-D430G-Lを、Annexin VバッファーまたはIMDM-10% FCS中で、FITC-MFG-E8と共に室温で5分間インキュベートし、FACSにより解析した。MFIを示す(n=3)。
【図5F】CDC50A-/-生細胞におけるPtdSerの構成的露出（Ｆ）。W3-Ildm、CDC50AED29またはCDC50AED62を、IMDM-10% FCS中でFITC-MFG-E8により染色し、共焦点蛍光顕微鏡で観察した。MFG-E8およびDICについての画像を示す。スケール・バー＝10μm。
【0012】
【図6A】PtdSer露出生細胞の貪食（Ａ）。Thio-pMacsを、pHrodoで標識したW3-Ildm、CDC50AED29、そのhCDC50A形質転換体(CDC50AED29-hCDC50A)またはW3-D430G-Lと共に、4μg/mlのMFG-E8 D89E存在下または非存在下で2時間インキュベートし、FACSにより解析した。
【図6B】PtdSer露出生細胞の貪食（Ｂ）。野生型またはMerTK-/- thio-pMacsを、pHrodo標識CDC50AED29と共に2時間インキュベートし、FACSにより解析した。
【図6C】PtdSer露出生細胞の貪食（Ｃ）。pHrodo標識 CDC50AED29をthio-pMacsと共にCellEvent(商標) Caspase 3/7 Green (Cas/green)の存在下でインキュベートした。pHrodo、CellEvent(商標)、およびDICの画像を1.5分毎に保存した。3回独立に実験し、30個の異なる領域の少なくとも130の事象について、その貪食が Cas/Green陰性細胞(生細胞)の貪食か陽性細胞(死細胞)の貪食か追跡し、貪食全体における死細胞または生細胞の貪食の割合として右に示す。スケール・バー＝10μm。
【図6D】PtdSer露出生細胞の貪食（Ｄ）。Thio-pMacsをCDC50AED29細胞と共にインキュベートした。貪食された細胞のマクロファージからの解放(矢印)をモニターした。スケール・バー＝10μm。
【図6E】PtdSer露出生細胞の貪食（Ｅ）。Thio-pMacsをCDC50AED29またはFasLで処理したW3-Ildmと共にインキュベートし、透過電子顕微鏡により観察した。スケール・バー＝2μm。N＝マクロファージの核。L＝貪食された生細胞。A＝貪食されたアポトーシス細胞。
【図6F】PtdSer露出生細胞の貪食（Ｆ）。W3-Ildm、CDC50AED29およびCDC50AED29-hCDC50A (1×106細胞)を、ヌードマウスに皮下移植した(N=6-11)。４週後、腫瘍を切り出し、その重量をプロットした。
【0013】
【図7A】5’-RACE-PCRにより決定されたhATP11Cの転写開始部位（Ａ）。hATP11C mRNAの5’領域を含むcDNAを、エクソン２の塩基配列を持つリン酸化プライマーを用いてmRNAを逆転写することにより調製した。次いで、このcDNAをライゲーションし、ネステッドPCR用のテンプレートとして用いた。ネステッドPCR (1st および 2nd PCR)に用いたプライマーを、矢印で示す。
【図7B】5’-RACE-PCRにより決定されたhATP11Cの転写開始部位（Ｂ）。5’-RACE-PCR 産物を示す。
【図7C】5’-RACE-PCRにより決定されたhATP11Cの転写開始部位（Ｃ）。5’-RACE-PCRにより決定されたhATP11Cの5’末端配列。図７Ｂの400bpのDNAフラグメントを、pGEM-T easy ベクター中にクローニングし、DNA配列を決定した。推定転写開始部位を矢印で示す。エクソン２および開始コドンをボックスにより示す。
【0014】
【図8A】ATP11C 遺伝子欠損がリン脂質取り込みへ及ぼす効果（Ａ）。W3細胞、ATP11CED 変異体(ATP11CED22 および ATP11CED23)、およびhATP11Cを発現するATP11CED22細胞を、1.5μMのNBD-PE (PtdEtn) または NBD-PC (PtdCho)と共に、室温にて１５分間インキュベートした。細胞を脂肪酸不含BSAで処理し、フローサイトメトリーにより解析した。取り込まれたNBD標識脂質のMFIを決定し、平均+標準偏差としてプロットした(n=3)。
【図8B】ATP11C 遺伝子欠損がリン脂質取り込みへ及ぼす効果（Ｂ）。ヒトATP11Cのカスパーゼ認識部位変異体。hATP11Cの膜貫通セグメント4と5の間の細胞内第2ループに存在する3つのカスパーゼ認識部位を図示する。各変異体において、カスパーゼ認識部位(部位1-3)中のアスパラギン酸残基を、アラニン残基に変異させた。Mut 1+2、1+3、および2+3 変異体では、2つのカスパーゼ認識部位が異なる組み合わせで変異しており、一方、Mut 1+2+3 変異体(CasR)では、3つ全ての認識部位が変異している。
【0015】
【図9A】カスパーゼ耐性 hATP11Cは、FasL誘導性細胞死、DNA断片化、または細胞収縮に影響を与えない（Ａ）。W3細胞、ATP11CED22、またはhATP11Cもしくはそのカスパーゼ耐性型 (CasR)を発現するATP11CED22 形質転換体を、FasLと共に２時間インキュベートした。FasL誘導性細胞死をWST-1 アッセイにより解析した結果を示す。
【図9B】カスパーゼ耐性 hATP11Cは、FasL誘導性細胞死、DNA断片化、または細胞収縮に影響を与えない（Ｂ）。未処理の細胞またはFasL処理した細胞から染色体DNAを調製し、1.5％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロミドで染色した。
【図9C】カスパーゼ耐性 hATP11Cは、FasL誘導性細胞死、DNA断片化、または細胞収縮に影響を与えない（Ｃ）。未処理の細胞またはFasL処理した細胞を、フローサイトメトリーにより解析した。前方散乱(FSC)プロファイルは細胞のサイズを示す。
【0016】
【図10A】CDC50A欠損生細胞のPtdSer露出（Ａ）。W3-Ildm、CDC50AED29、またはCDC50AED62細胞を、FasL存在下または非存在下で２時間処理し、Cy5標識したAnnexin V および Sytox Blueで染色し、フローサイトメトリーにより解析した。
【図10B】CDC50A欠損生細胞のPtdSer露出（Ｂ）。W3-Ildm、CDC50AED29、CDC50AED62、またはhCDC50Aを発現するそれらの形質転換体を、10％ FCSを含むRPMI中に104細胞/ml で播種し、培養した。細胞を３日毎に継代し、104細胞/mlで再び播種し、それらの増殖を９日間観察した。
【図10C】CDC50A欠損生細胞のPtdSer露出（Ｃ）。W3-Ildm、CDC50AED29、CDC50AED62、またはhCDC50Aを発現するそれらの形質転換体を、図中に示す濃度のFasLを用いて、３７℃にて４時間インキュベートした。細胞生存率をWST-1 アッセイにより決定し、FasL非存在下での細胞生存率に対する割合として示した。
【0017】
【図11】PtdSerを露出するヒトKBM7細胞のthio-pMacによる貪食。Thio-pMacsを、CellEvent(商標) Caspase 3/7 Greenの存在下、pHrodoで標識したKBM7と共にインキュベートした。マクロファージによるKBM7細胞の貪食を共焦点顕微鏡で追跡した。
【発明を実施するための形態】
【0018】
ATP11Cは、P4型ATPaseファミリーのメンバーの一つであり、CDC50Aは、P4型ATPaseファミリーのメンバーのβサブユニットである。ATP11Cは、細胞膜におけるホスファチジルセリン（PtdSer）の分布を制御し、PtdSerを細胞膜内葉に輸送する。CDC50Aは、ATP11CのサブユニットとしてATP11Cのフリッパーゼ活性に関与する。ATP11CおよびCDC50Aの塩基配列およびアミノ酸配列は公知である。例えば、ヒトのATP11CおよびCDC50AのcDNA配列は、NCBIのデータベースにそれぞれNM_018247.3およびXM_005262405.1にて開示されている。【0019】
ATP11CまたはCDC50Aの阻害物質の候補物質は、天然物質であっても合成物質であってもよく、低分子化合物、タンパク質、核酸分子、ペプチド、抗体、または微生物、植物、もしくは動物の細胞抽出物もしくは培養上清などが挙げられる。候補物質は、低分子化合物、ペプチド、または抗体のライブラリーなどの、ライブラリーの形態で提供されてもよい。候補物質は、典型的には、細胞、細胞の膜画分、または人工脂質二重膜を含む溶液（例えば、細胞の培養培地）に添加される。【0020】
本明細書において、ATP11Cを発現する細胞には、ATP11Cを本来発現する細胞、および細胞にATP11Cをコードする遺伝子を導入することによりATP11Cを強制的に発現させた細胞が含まれる。同様に、CDC50A発現細胞は、本来CDC50Aを発現する細胞であっても、CDC50Aをコードする遺伝子を細胞に導入することによりCDC50Aを強制的に発現させた細胞であってもよい。細胞は、ヒト、サル、マウス、またはウサギ由来の細胞であってよく、またこれらに限定はされない。本発明においては、例えば、KBM7、Jurkat、W3、Ba/F3などを使用することができる。ATP11Cおよび／またはCDC50Aをコードする遺伝子を細胞に導入し、ATP11CおよびCDC50Aを発現する細胞を作製する方法は、当業界にて周知である（Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press）。【0021】
本明細書において、ATP11CまたはCDC50Aの阻害物質は、細胞または動物におけるATP11Cのフリッパーゼ活性を阻害する。阻害物質はATP11CまたはCDC50Aの機能に直接的または間接的に影響する物質であっても、ATP11CまたはCDC50Aの発現を減少させる物質であってもよい。ATP11CまたはCDC50Aの発現を減少させる物質には、ATP11CまたはCDC50Aをコードする遺伝子からのmRNAの発現を減少させる物質、およびATP11CまたはCDC50Aのタンパク質発現を減少させる物質が含まれる。それゆえ、ATP11CまたはCDC50Aの阻害物質には、ATP11CまたはCDC50Aをコードする遺伝子の、プロモーターまたはエンハンサーなどの調節配列に作用する物質、およびATP11CまたはCDC50Aをコードする遺伝子の配列に基づき調製されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（DNAまたはRNA）、siRNA、miRNA、およびリボザイム並びにこれらを発現するベクターなどが含まれる。また、ATP11CまたはCDC50Aの阻害物質は、ATP11CまたはCDC50Aをコードする遺伝子の配列を標的としたCrispr/Cas システムであってもよい。さらに、ATP11Cはカスパーゼにより切断され不活性化されることから、ATP11Cの阻害物質には、ATP11Cのカスパーゼによる切断を増加させる物質が含まれる。【0022】
ある態様にて、本発明の方法は、ATP11Cのフリッパーゼ活性を測定する。ATP11Cは細胞膜におけるPtdSerの分布を制御し、PtdSerを細胞膜内葉に輸送する。それゆえ、ATP11Cのフリッパーゼ活性は、細胞膜におけるPtdSerの分布を調べることにより、測定することができる。【0023】
候補物質が対照と比較してPtdSerの細胞膜外葉における分布を増加させる（PtdSerの露出を増加させる）場合、その候補物質はATP11Cの阻害物質として選択される。「対照」とは、候補物質の非存在下での細胞膜外葉におけるPtdSerの分布を意味する。【0024】
細胞膜におけるPtdSerの分布は、細胞表面に露出するPtdSerと、PtdSerに対する結合性を有する物質（例えば、AnnexinVまたはMFG-E8 (ラクトアドヘリンともいう)）との間の結合を検出することにより、調べることができる。例えば、細胞を蛍光標識したAnnexinVで処理し、細胞表面に結合したAnnexinVの量を測定する。【0025】
細胞膜におけるPtdSerの分布は、血液凝固反応に基づき調べることもできる。例えば、細胞を候補物質および血液凝固に必要とされる物質（例えば、Xa因子、Va因子、またはプロトロンビン）と混合し、そしてトロンビンの生成を測定する。 あるいは、フィブリノーゲンをさらに培地に添加して、フィブリンの生成を測定してもよい。【0026】
細胞膜におけるPtdSerの分布は、蛍光標識したPtdSerにより測定することもできる。蛍光標識としては、NBDおよびTopFluorなどを使用することができる。例えば、蛍光標識したPtdSerをATP11C発現細胞の培養培地に添加すると、このPtdSerは細胞の細胞膜外葉に取り込まれ、ATP11Cがフリッパーゼとして機能することにより、細胞膜内葉に輸送される。それゆえ、候補物質がATP11Cを阻害する場合、候補物質の存在下では、候補物質の非存在下と比較して細胞表面に露出するPtdSerが増加する。よって、蛍光標識したPtdSerの存在下、ATP11C発現細胞を候補物質で処理し、次いで、細胞をBSAで処理して細胞表面に露出する蛍光標識PtdSerを除去した後、細胞に取り込まれたPtdSerをフローサイトメトリーにより測定すればよい。【0027】
細胞表面に露出するPtdSerは、マクロファージによる細胞の貪食を誘導する。それゆえ、ATP11Cのフリッパーゼ活性は、マクロファージによる細胞の貪食を調べることによっても、測定することができる。【0028】
マクロファージによる細胞の貧食は、例えば、チオグリコール酸塩を注射することにより、マウス腹腔に浸潤したマクロファージをプレート上で培養し、pHrodo（商標）色素で標識したW3細胞等の培養細胞を添加し、数十分から数時間培養後にフローサイトメトリーで解析することにより、調べることができる。また、フローサイトメトリーを使用せずとも顕微鏡で直接細胞を観察して調べることも可能である。【0029】
ある態様において、本発明の方法は、ATP11Cのカスパーゼによる切断を調べる。ATP11Cのカスパーゼによる切断は、ウェスタンブロッティングにより調べることができる。例えば、細胞またはその膜画分の溶解物をSDS-PAGEで分離してメンブレンに転写し、ATP11Cに対する抗体を用いてATP11Cのサイズを確認すればよい。【0030】
ATP11Cのカスパーゼによる切断は、細胞を用いずに調べることも可能である。例えば、カスパーゼの存在下、ATP11Cが組み込まれた人工脂質二重膜とATP11Cの阻害物質の候補物質とを接触させ、ATP11Cのカスパーゼによる切断を調べればよい。【0031】
ATP11CおよびCDC50Aは、アポトーシスを起こした細胞におけるPtdSerの露出に関与する。それゆえ、本発明の方法は、がんまたはアポトーシス関連疾患の治療または予防薬の開発に有用である。アポトーシス関連疾患としては、自己免疫疾患が例示される。【0032】
PtdSerが細胞表面に露出すると、マクロファージによる細胞の貪食が誘導される。よって、ATP11CまたはCDC50Aを阻害することにより、マクロファージによる細胞の貪食を誘導することができる。ATP11CまたはCDC50Aは、例えば本発明のスクリーニング方法により得られたATP11CまたはCDC50Aの阻害物質により、阻害することができる。また、ATP11CまたはCDC50Aは、実施例に記載されるように、ATP11CまたはCDC50Aをコードする遺伝子の配列を標的としたCrispr/Cas システムによって阻害することもできる。【0033】
マクロファージによる細胞の貪食を誘導することにより、細胞の異常増殖を特徴とするがんまたはアポトーシス関連疾患を治療または予防することができる。すなわち、ある実施態様において、マクロファージに貪食される細胞は、がん細胞である。ある実施態様において、ATP11CまたはCDC50Aの阻害物質は、対象に投与される。【0034】
本発明はまた、マクロファージによる細胞の貪食を誘導するための、ATP11CまたはCDC50Aの阻害物質を含む医薬組成物、および、マクロファージによる細胞の貪食を誘導するための医薬の製造のための、ATP11CまたはCDC50Aの阻害物質の使用を提供する。【0035】
本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。【実施例1】
【0036】
１．材料および方法マウス、細胞株、プラスミド、組換えタンパク質、抗体および試薬
C57BL/6J および BALB/c ヌードマウスは、Japan Cleaより購入した。MerTK−/− マウス(41)は、Jackson Laboratoryより購入した。全てのマウス実験は、京都大学医学研究科・医学部動物実験委員会により承認を受けた。
【0037】
ヒトKBM7細胞株 (16)は、Brent H. Cochran 博士(Tufts University School of Medicine) より提供され、10％ FCSを含有するイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)中で維持した。W3は、マウスＴ細胞リンパ腫細胞株(WR19L)にマウス(m)Fasを発現させた形質転換体であり(42)、W3-Ildmは、Fasと、カスパーゼ活性化DNA分解酵素の阻害分子(ICAD)のカスパーゼ耐性型とを発現するWR19L細胞誘導体である(43)。W3、W3-Ildm、およびヒトJurkat細胞は、10％ FCS含有RPMI1640中で培養した。mTMEM16Fの構成的活性型を発現するW3-Ildm 形質転換体 (W3-D430G-L) は、既報である(20)。HEK293T細胞は、10％ FCS含有DMEM中で培養した。一部の実験、特にホスファチジルセリン（PtdSer）露出の解析では、細胞培養用のFCSを100,000×gにて4℃で一晩遠心し、次いで、0.22-mm メンブレン (Millipore)を用いて濾過して、微小胞または細胞残屑を取り除いた。【0038】
ジーントラップ用のベクター(pGT-GFP、pGT-GFP+1、およびpGT-GFP+2)は、既報である(17)。レトロウイルスベクター pMXs-puro (44) およびパッケージングプラスミドpGag-pol-IRESbsrは、北村俊雄博士(東京大学医科学研究所)より提供された。プラスミドpCMV-VSV-Gは、三好浩之博士(理化学研究所バイオリソースセンター)より提供された。pAdVAntage(商標)、pX260、およびpX330 (19)は、それぞれ Life Technologies (Invitrogen) および Addgeneより購入した。組換えロイシンジッパー型ヒト FasL (FasL) (45)およびmMFG-E8のD89E変異体(21)を、COS7およびHEK293T細胞においてそれぞれ産生し、精製した。Cy5標識したAnnexin V およびFITC標識したウシ MFG-E8 (BLAC-FITC)は、それぞれBiovisionおよびHematologic Technologiesより購入した。pHrodo(商標) スクシンイミジルエステル(pHrodo)および CellEvent(商標) Caspase 3/7 Greenは、Life Technologiesより購入した。1−オレオイル−2−{6−[(7−ニトロ−2−1,3−ベンゾオキサジアゾール−4−イル)アミノ]ヘキサノイル}−sn−グリセロ−3−ホスホセリン (NBD-PS)、1−オレオイル−2−{6−[(7−ニトロ−2−1,3−ベンゾオキサジアゾール−4−イル)アミノ]ヘキサノイル}−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン (NBD-PE)、および1−オレオイル−2−{6−[(7−ニトロ−2−1,3−ベンゾオキサジアゾール−4−イル)アミノ]ヘキサノイル}−sn−グリセロ−3−ホスホコリン (NBD-PC) は、Avanti Polar Lipidsより購入した。【0039】
mATP11Cに対するウサギ抗体は、Protein Purity Coに製造を委託した。簡単に説明すると、PYNDEPWYNQKTQKERET (アミノ酸317−334) （配列番号１）のN末端にシステイン残基1つを追加したペプチドを、m−マレイミド安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含むキーホールリンペットヘモシニアン(Pierce)に結合させ、それを用いてウサギを免疫した。抗体は、前記ペプチドを結合させたAF Amino-Toyopearl(登録商標) ビーズ (AF-Amino-650, Tosoh Co) を用いて血清からアフィニティー精製した。マウスMac−1に対するAPC結合ラットmAb (クローン M1/70)は、BD PharMingenより得た。ラット抗マウスFas mAb (クローン OB−22)は、本発明者らの実験室にて標準プロトコールにより製造した。【0040】
ハプロイド遺伝子スクリーニングハプロイド遺伝子スクリーニングは、実質的に既報のとおりに行った (17, 46)。簡単に説明すると、ジーントラップウイルスを製造するため、HEK293T細胞(2.4×107 細胞)に、Fugene6 (Promega)を用いて、pGT-GFP、pGT-GFP+1、およびpGT-GFP+2の混合物(36μg)を、pAdvantage（8.4μg）、pCMV-VSV-G（9.0μg）、およびpGag-pol-IRES-bsr（9.6μg）と組み合わせてトランスフェクトし、48時間インキュベートした。上清中のウイルスを、6,000×g にて16時間遠心して濃縮した。KBM7細胞(1×108)を24ウェルディッシュ(Corning)に１ウェル当たり1.5×106細胞で播種し、8μg/mlポリブレンの存在下、スピン感染法により、700×g、45分間にて、濃縮したウイルスを感染させた。感染は約80％の導入効率であって、4日間増殖させ、スクリーニングに使用した。
【0041】
細胞膜中のアミノリン脂質の輸送能を欠失する細胞を、FACSソートを2回繰り返すことにより濃縮した。簡単に説明すると、6×107個の変異KBM7細胞をPBSで洗浄し、室温にて40分間、2 mM CaCl2 および 1 mM MgCl2を含むHank’s balanced salt solution (HBSS)中にて、1.5μM NBD-PSとインキュベートした。細胞を遠心により回収し、脂肪酸不含有BSA (Sigma-Aldrich)（5 mg/ml）を含むHBSS中に懸濁し、細胞表面上のNBD-PSを取り除いた。細胞を、FACSAria II システム (BD Biosciences)を用いて4℃でフローサイトメトリーに供し、NBD-PSの取り込み効率のよくない1％程度の細胞を回収した。回収した細胞を10％ FCS含有IMDM中で1-2週間増殖させ、上記と同様に二度目のソーティングにかけた。得られた細胞は、NBD-PSの取り込みが減少しており、これを低フリッピング（Low-Flipping、LF）細胞と命名した。【0042】
ジーントラップ挿入部位のマッピングプロウイルス挿入部位に隣接する宿主配列を同定するため、インバースPCRを行い、その後、既報のとおりディープシークエンシング（deep sequencing）した(17, 46)。簡単に説明すると、ゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)を用いて2×106 のLF細胞から単離し、DNA（4μg）をNlaIIIで消化した。消化したDNAを、Wizard SV GelおよびPCR clean-up column (Promega)を用いて精製し、DNA（1.0μg）を、300μlの容量でT4 DNA リガーゼ (Takara Bio)を用いてライゲーションした。このDNAを上記のとおり精製し、ジーントラップベクターの内部配列に相補的な外向き（outward−facing）プライマー (5’−AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATCTGATGGTTCTCTAGCTTGCC−3’（配列番号２）および5’−CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCCAGGTTAAGATCAAGGTC−3’ （配列番号３）; ディープシークエンシングのためのアダプター配列を下線で示す)を用いてPCRした。PCR産物を、Wizard SV GelおよびPCR clean-up columnにより精製し、MiSeq シークエンサー (Illumina)にてプライマー (5’− CTAGCTTGCCAAACCTACAGGTGGGGTCTTTCA−3’ （配列番号４）) を用いて配列決定した。
【0043】
FASTQ データファイルにおける45塩基対の配列を、Burrows-Wheeler Aligner ソフトウェアを用いてヒトゲノム (UCSC human genome 19; hg19)にマッピングした。Carette ら(17)に用いられる基準を用いて、特異的挿入部位を同定した。すなわち、45塩基対の配列中にミスマッチを含む配列を除き、また、いくつかの挿入が1または2塩基対離れてアラインされたときは、1つのみを保持した。所定の挿入についての近接インデックスは、この所定の挿入と上流および下流の2つの近傍の挿入との平均距離から計算される逆数と定義した。【0044】
ジーントラップ変異を含むKBM7クローンの単離ジーントラップ挿入を有する細胞株を得るため、LF細胞を限界希釈した。ゲノムDNAを各クローンからQIAamp DNA Mini Kitを用いて単離し、NlaIIIで消化し、Wizard SV GelおよびPCR clean-up columnを用いて精製した。このDNAをT4 DNAリガーゼを用いてライゲーションし、上記のとおり精製し、ジーントラップベクターの内部配列に相補的な外向きプライマー(5’− CTGCAGCATCGTTCTGTGTT−3’ （配列番号５）および 5’− TCTCCAAATCTCGGTGGAAC−3’ （配列番号６）) を用いてPCRした。増幅したPCR産物を、プライマー(5’−CTCGGTGGAACCTCCAAAT−3’ （配列番号７）)を用いて、DNAシークエンサー (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Life Technologies)により直接配列決定した。ATP11CまたはCDC50Aに変異を有するクローンを、それぞれATP11CGT および CDC50AGTと命名した。
【0045】
遺伝子編集CRISPR−Cas システム (19)を用いて、W3およびW3-Ildm細胞におけるmCDC50AおよびATP11C遺伝子の編集を行った。mCDC50A (TMEM30A) (ID: MGI 106402) および mATP11C (ID: MGI 1859661) 遺伝子における好適な標的配列を、UCSC のZhangの研究室でのCRISPR デザインツール (http://www.genome−engineering.org/crispr/?page_id=41) を用いて設計した。相補的オリゴヌクレオチド(CDC50A: 5’− AAACCATCGGCCTCATCTTCATCCCCATCGGCATGT−3’ （配列番号８）および 5’− TAAAACATGCCGATGGGGATGAAGATGAGGCCGATG−3’ （配列番号９）; ならびにATP11C: 5’− CACCGTCACCAAACGGTTGAGGGTC−3’ （配列番号１０）およびd 5’−AAACGACCCTCAACCGTTTGGTGAC− 3’ （配列番号１１）、CDC50AおよびATP11Cについて標的配列を下線で示す)を、T4 ポリヌクレオチドキナーゼ (Takara Bio)でリン酸化し、95℃で5分間加熱し、室温で放置してアニーリングさせ、BbsIで消化したpX260ベクター (CDC50A)またはpX330ベクター (ATP11C)にライゲートし、大腸菌の形質転換に用いた。この標的化配列を有するpX プラスミド DNAを、Super Electroporator NEPA21 type II (NepaGene)を用いたエレクトロポレーションにより、W3またはW3-Ildm細胞中に導入した。10％ FCS含有RPMI中で3日間培養後、細胞にpXベクターを再びトランスフェクトした。
【0046】
変異を有するクローンを同定するため、細胞を、2回目のトランスフェクションの3日後に限界希釈し、QIAamp DNA Mini Kitを用いて個々のクローンからゲノムDNAを調製した。CRISPR標的部位に隣接するDNAフラグメントを、プライマー (CDC50A: 5’−CGTCTCCTAAAGACGCCCG−3’ （配列番号１２）および5’− TCCACCCGACATTCTAGCTG−3’ （配列番号１３）; ならびにATP11C: 5’− GCAGTGTGTTTTGTGGACGG−3’ （配列番号１４）および5’− CCGGGTTTCCGCTAAAACGC−3’ （配列番号１５）)を用いてPCRにより増幅し、DNA シークエンサー(ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer)を用いてその配列を決定した。CDC50A 遺伝子領域における遺伝子編集は、96クローンのうち6クローンで観察され、そのうち2つ(CDC50AED29 および CDC50AED62)が、フレームシフトインデルをもたらす変異を両アレルで有していた。ATP11C遺伝子領域における遺伝子編集は、34クローンのうち9クローンで観察され、そのうち4つが、両アレルインデルを有するATP11C欠失クローンであった。そのうち2クローン (ATP11CED22 および ATP11CED23)を、本実験に用いた。【0047】
5’-RACE-PCR5’-cDNA末端の増幅を、キット(5’-Full RACE Core Set; Takara Bio) を用いて製造者の指示書にしたがい行った。簡単に説明すると、RNAを、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いてKBM7細胞から調製した。5’-リン酸化プライマー (5’− CTTAGATGAGAC−3’ （配列番号１６）)を用いて、AMV (Avian Myeloblastosis Virus) 逆転写酵素によりファーストストランドcDNAを合成した。RNase HでRNAを消化後、合成したファーストストランドcDNAを、T4 RNA リガーゼを用いてライゲートし、ネステッド (nested) PCR用のテンプレートとして用いた。ネステッドPCRは、以下のプライマーを用いて行った (1st PCR: 5’−TGGCAATCATCCAGTTTCGG−3’ （配列番号１７）および 5’− ACACTGTGCGTGTGCCAAC−3’ （配列番号１８）、2nd PCR: 5’−CGGAAACAGAAGCTTACATTGC−3’ （配列番号１９）および 5’−TCGTTTCTCTTCTCCAGCAC−3’ （配列番号２０）)。PCR産物を、pGEM-T easy vector中にクローニングし、DNA配列をDNAシークエンサー(ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer)を用いて決定した。
【0048】
ヒトおよびマウス細胞株の形質転換ヒトCDC50A cDNA (NCBI: NM_018247.3)を、KBM7細胞からのRNAを用いてRT-PCRにより調製した。天然の塩基配列を持つhATP11C cDNA (NCBI:XM_005262405.1) (47)は、哺乳動物細胞におけるタンパク質レベルが低かったことから、mRNAの安定性および翻訳効率が増強された配列を、GENEART (Regensburg, Germany)にて特注で製造した。Mut1+2、1+3、2+3、または1+2+3 変異体を作製するため、変異ヌクレオチドを含む以下のプライマー（配列中、制限酵素部位を下線で示す）を用いた組み換えPCR (48)により、hATP11C cDNA に変異を導入した。cDNAの真正性は、DNA配列決定により確認した。
hATP11C , 5’− CATTTAATTAAGCCACCATGTTCAG−3’ （配列番号２１） および 5’−CCAGGAATTCCAGCACGTTGGACTC− 3’ （配列番号２２）;
Mut1, 5’−CTGTCTGGCTCAGGCCGGCCACTTCCTGGGTCACG−3’ （配列番号２３）および 5’− CGTGACCCAGGAAGTGGCCGGCCTGAGCCAGACAG−3’ （配列番号２４）;
Mut2, 5’−GAAGTAGGTCAGTGTGCCAGCTGTCTGGCTCAGGC−3’ （配列番号２５） および 5’−GCCTGAGCCAGACAGCTGGCACACTGACCTACTTC−3’ （配列番号２６）;
Mut3, 5’−CTCTGTGGCGCCGGCCACGGCGGCGTTGGTCTTGA−3’ （配列番号２７）および 5’−TCAAGACCAACGCCGCCGTGGCCGGCGCCACAGAG−3’ （配列番号２８）。
【0049】
KBM7、W3、W3-Ildm、Jurkat、およびそれら由来の細胞を、VSV-Gエンベロープ遺伝子を含むレトロウイルスベクターで形質転換した。上記のcDNAをC末端にてFlagまたはGFP標識し、pMXs-puroベクターに挿入し、Fugene 6 (Promega)を用いて、pGag-pol-IRES-bsr、pCMV-VSV-G、およびpAdVAntage（商標)と共にHEK293T細胞に導入した。産生されたレトロウイルスを遠心により濃縮し、KBM7、W3、W3-Ildm、またはJurkat細胞への感染に用いた。感染細胞を、0.8μg/ml (KBM7細胞) または 1μg/ml (W3、W3-Ildm または Jurkat細胞)のピューロマイシンの存在下で培養した。【0050】
アポトーシスの誘導およびホスファチジルセリンの検出アポトーシスを誘導するため、W3-Ildm細胞（1×106）をFasL（33 ユニット/ml）にて37℃で1-2時間処理し、細胞生存率を、2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム, モノナトリウム塩(WST-1; Dojin Laboratories) および1−メトキシ−5−メチルフェナジニウムメチルスルファートを用いるWST-1アッセイにより、既報(20)のとおり測定した。
【0051】
細胞表面上のPtdSer(ホスファチジルセリン)を検出するため、細胞を Annexin Vバッファー(10 mM Hepes-KOH (pH 7.4)、140 mM NaCl、および2.5 mM CaCl2)または10％ FCS添加IMDM中で、1-2,000倍希釈したCy5-Annexin V またはFITC-MFG-E8（800 ng/ml）と25℃にて5分間インキュベートし、次いで、200 nM SYTOX(登録商標) Blue (Life Technologies Molecular Probes)とインキュベートし、FACSAria II または FACSCanto IIにより解析した。顕微鏡観察のため、8ウェルのLab-Tek IIチェンバースライド(Nalge Nunc)上で、2×105細胞をFITC結合MFG-E8（4μg/ml）と染色バッファー中にて氷上で15分間インキュベートし、共焦点蛍光顕微鏡(FV1000-D; Olympus)により観察した。【0052】
カスパーゼ処理膜画分を、hATP11C-GFPを発現する細胞またはその変異体より既報 (49)のとおり調製し、20 mM Tris-HCl (pH 7.4)、140 mM NaCl、１％ Triton X−100、10％ グリセロールおよび1 mM (p−アミノフェニル)メタンスルホニルフルオリド(APMSF)中に溶解した。不溶性物質を遠心により除去後、膜タンパク質 (10μg)を、100μl の 50 mM Hepes-NaOH (pH 7.4)、5％ グリセロール、5 mM DTT、10 mM EDTA、0.1 mM APMSF および0.1％ CHAPS中、3ユニットの各種ヒト組み換えカスパーゼ (Biovision)と共に37℃にて1時間インキュベートし、ウエスタンブロットにより解析した。
【0053】
ウェスタンブロッティング細胞または膜画分を、RIPA バッファー (50 mM HEPES-NaOH (pH 8.0)、１％ NP-40、0.1％ SDS、0.5％ デオキシコール酸ナトリウム、150 mM NaCl、およびプロテアーゼインヒビターカクテル [cOmplete, Mini, EDTA−free, Roche Diagnostics])中に溶解した。不溶性物質を遠心により除去後、溶解物を、3×SDSサンプルバッファー(200 mM Tris−HCl [pH 6.8]、10％ SDS、25％ グリセロール、15％ β−メルカプトエタノール、および0.05％ ブロモフェノールブルー)と3:1の比率で混合し、室温で20分間インキュベートした。タンパク質を7.5％または10-20％勾配ゲル(Bio Craft)のSDS−PAGEにより分離し、PVDFメンブレン (Millipore)に転写した。膜を、マウス抗 GFP mAb、ウサギ抗活性型カスパーゼ−3 mAb、ウサギ抗 hATP11C Ab、ウサギ抗α−チューブリンmAb、またはラット抗 mFas mAbとインキュベートし、次いで、HRP結合ヤギ抗マウスIg、ヤギ抗ウサギIgまたはウサギ抗ラットIg (Dako)と共にインキュベートした。ペルオキシダーゼ活性は、Western Lightning-ECL システム(PerkinElmer)により検出した。
【0054】
インビトロ貪食アッセイチオグリコール酸誘発腹腔マクロファージ(thoglycollate-elicited peritoneal macrophages, thio-pMacs)を調製するために、7-12週齢のメスのC57BL/6J マウスに、60 mgのチオグリコール酸(Sigma-Aldrich)を腹腔内注入し、4日後に腹腔マクロファージを集めた。貪食は、pHrodoで染色した獲物（prey）のマクロファージリソソームへの輸送により解析した (50, 51)。簡単に説明すると、thio-pMacs（5×105）を、12ウェルプレート(Corning)中で一晩増殖させた。増殖中の細胞またはアポトーシスを起こした細胞(2.0×107)をPBSで洗浄し、pHrodo（40 ng/ml）と共に室温にて10分間インキュベートし、標識した。FCS（2 ml）で反応を停止させた後、細胞を10％ FCSを含むIMDMで洗浄し、1％ メチルセルロース(Sigma-Aldrich)を含む培地中にてマクロファージに添加し、スインギングローターを用いて500×gで室温にて4分間スピンし、37℃でインキュベートした。マクロファージを0.25％トリプシンで処理してプレートから剥がし、APC結合ラット抗マウスMac1で染色した後、150 mM NaCl、2％ FCS、および200 nM Sytox Blueを含む20 mM CHES-NaOH バッファー (pH 9.0) 中に懸濁し、FACSCanto IIを用いてフローサイトメトリーにより解析した。貪食作用は、Mac-1+ Sytox Blue- 集団におけるpHrodo陽性細胞の割合と定義した。
【0055】
経時的観察のために、thio-pMacs (5×104)を、フィブロネクチンでコーティングした8ウェル Lab-Tek II チャンバー中で一晩増殖させた。pHrodo標識細胞 (2×105)（10％ FCS、1％メチルセルロース、および5μM CellEvent（商標） Caspase-3/7 Green を含むIMDM中）をマクロファージに添加し、この混合物を室温にて500×gで4分間スピンした。この細胞培養物を共焦点顕微鏡(FV1000-D)を用いてリアルタイムで3-4時間追跡し、画像を1-2分毎に撮影した。【0056】
電子顕微鏡法マウスthio-pMacsを、上記のとおり、10％ FCSおよび1％ メチルセルロースを含むIMDM中で2時間獲物と共にインキュベートした。その後、マクロファージをプレートから擦過により剥がし、4％パラホルムアルデヒドおよび2％グルタルアルデヒド(Nacalai Tesque)を含むPBS中で4℃で一晩インキュベートして固定化した。細胞を 0.1 M リン酸バッファーで3回洗浄後、0.1M リン酸バッファー中の1％ OsO4を用いて4℃で2時間固定化（post-fixed）し、段階的に希釈したエタノール(50、60、70、80、90、および99％エタノール) 中で各20分間連続してインキュベートすることにより脱水し、次いで、100％エタノール中での30分間の浸漬を2回行った。次いで、このサンプルを、プロピレン酸化物中で1時間、プロピレン酸化物とエポキシドの1:1混合物(Luveak 812, Nacalai Tesque)中で1.5時間、プロピレン酸化物とエポキシドの1:3混合物中で1.5時間、そしてエポキシド中で12時間インキュベートすることを2回行った。その後、これらを60℃にて3日間インキュベートしてエポキシド内に取り込ませた。超薄切片(60-80 nm) を、Ultramicrotome EM UC6 (Leica)を用いて切り出し、ウラニル酢酸塩およびクエン酸鉛で染色し、電子顕微鏡 H-7650 (Hitachi)で観察した。
【0057】
NBD標識脂質の取り込み細胞(2×106)を、1.5 μMのNBD-PS、NBD-PE、またはNBD-PCと共に、25℃にて15-20分間、600μlの HBSS（1 mM MgCl2 および 2.5 mM CaCl2を含有）中でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心により回収し、脂肪酸不含有BSA（5 mg/ml）を含むHBSS中に再懸濁し、FACSAria IIにより解析した。スクランブラーゼ活性の測定のため、1.5×106の細胞を0.5 μMのNBD-PCとともに25℃にて4分間インキュベートした。
【0058】
腫瘍発生腫瘍発生を誘導するために、1×106の細胞を、7週齢のメスBALB/c無胸腺ヌードマウスに皮下注射した。4週間後、腫瘍を切り出し、計量した。
【0059】
リアルタイムRT−PCRおよびPCRRNAを、Isogen (Nippon Gene)とRNeasy Mini Kit（Qiagen）とを用いて調製し、High Capacity RNA-to-cDNA(商標) Kit (Life Technologies, Applied Biosystems)を用いて逆転写した。このcDNAを、LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics)を用いて増幅させた。リアルタイム RT−PCRのためのプライマーは、以下のとおりである。
hCDC50A, 5’− CGATGGCGATGAACTATAACGC−3’ （配列番号２９）および 5’−CGGTATAATCAATCTCGATCTC−3’ （配列番号３０）;
hATP11C, 5’−GGAACGTAATGCAATGGATGGG−3’ （配列番号３１）および 5’− GGTTAGTTCTAAGAGCTCAGTG−3’ （配列番号３２）;
hβ−アクチン, 5’−GCATCCTCACCCTGAAGTAC−3’ （配列番号３３）および 5’−CTTAATGTCACGCACGATTTC−3’ （配列番号３４）;
mCDC50A, 5’−TGCCAACAGCATGTTTAATGA−3’ （配列番号３５）および 5’− TTCGAGGCTCTCTTTTCCAG−3’ （配列番号３６）;
mCDC50B, 5’−AACGACTCCTTCTCGCTCTG−3’ （配列番号３７）および 5’−CACGAAGTCCTGGTTGATGA−3’ （配列番号３８）;
mCDC50C, 5’−TTTCGGAATCCAAGATCCAG−3’ （配列番号３９）および 5’−CAGTCGGCGGTACAGTTTTT−3’ （配列番号４０）;
mATP11C, 5’−TTACAGTTGGGGCCCTTCTT− 3’ （配列番号４１）および 5’−TATCCAAGGCGAGCTTCAGA−3’ （配列番号４２）;
mβ−アクチン, 5’− TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG−3’ （配列番号４３）および 5’−TTTGATGTCACGCACGATTTCC−3’ （配列番号４４）。
KBM7細胞におけるP4−ATPase および CDC50 ファミリーメンバーのPCR解析は、Takatsu ら(52)に記載される特異的プライマーを用いて行った。
【0060】
統計分析データはいずれも、平均標準偏差で示す。グループ間の相違の統計的有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定した。
【0061】
２．結果リン脂質フリッパーゼのハプロイド遺伝子スクリーニング
フリッパーゼをコードする遺伝子を同定するため、第8染色体を除きハプロイドの染色体からなるヒト白血病KBM7を用いたハプロイド遺伝子スクリーニングをおこなった(16)。KBM7は、NBD-PSを取り込んだ。これは、KBM7がフリッパーゼを発現していることを示す。KBM7細胞にレトロウイルスジーントラップベクターに感染させることによって、変異を誘発し、NBD-PSと共にインキュベートし、フローサイトメトリーを行った。NBD-PSの取り込みが障害された約1.0%の細胞を回収して増殖させ、2回目のソーティングを行い(図１Ａ)、フリッパーゼの活性が低下した細胞集団を得た(LF, 低フリッピング細胞)。ジーントラップ挿入部位をLF由来のDNAを用いたインバースPCRにより増幅し、マス・シークエンシングによって同定した(17)。近接する複数のジーントラップ挿入を含む遺伝子領域における近接インデックス解析により、2種の遺伝子が同定された（図１Ｂ）。CDC50A(細胞周期制御タンパク質50A またはTMEM30A)に41個の挿入が存在し、ATP11Cに86個の挿入が存在した。ヒトゲノムデータベースの情報(UCSC Genome Browser, http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?org=human)および5'-RACE分析(図７)に基づいて解析したところ、大部分の挿入がイントロン1に割り当てられ、挿入されたレトロウイルスは転写と同じ方向であった(図１Ｂ)。逆方向の挿入はエクソン1またはプロポーター領域に存在し、遺伝子を不活性化すると考えられた。
【0062】
10回膜貫通領域を有するATP11C(図１Ｃ)は、P4-ATPアーゼファミリーのメンバーであり、2回膜貫通領域を有するCDC50Aは、P4-ATPアーゼのβ−サブユニットである(12, 18)。これらは様々な組織で発現していた(図１Ｄ)。ATP11C-GFPをヒトHEK293Tで発現させると、このタンパク質は主に細胞膜に局在した(図１Ｅ)。ATP11CまたはCDC50A遺伝子の第1イントロンに挿入を有する細胞(ATP11CGTおよびCDC50AGT)を、限界希釈によって単離した(図２Ａ)。KBM7は高レベルのNBD-PSを取り込み(図２Ｂ)、この取り込みはATP11CGTでは著しく減少した。NBD-PCの取り込みは減少しなかったが、NBD-PEの取り込みはATP11CGTにおいて減少した。ヒト(h)ATP11Cによる形質転換により、フリッパーゼ活性は完全に回復した(図２Ｃ)。ATP11CGTにおけるリン脂質の取り込みは、ATPアーゼ阻害剤であるオルトバナデートによって阻害された(図２Ｄ)。これは、ATP11CGTに残存するフリッパーゼ活性がKBM7で発現する他のATPアーゼによるものであることを示唆している(図２Ｅ)。CDC50ファミリーの3種のメンバーのうち、CDC50AのみがKBM7で発現していた(図２Ｅ)。CDC50AGTでは、NBD-PSおよびNBD-PEの取り込みが完全に障害されており、これはhCDC50Aによる形質転換により回復した(図２Ｃ)。CDC50AGTにおけるPtdSerフリッパーゼの欠失は、細胞表面の構成的なPdtSer露出をもたらした(図２Ｆ)。これは、PtdSerを露出しないATP11CGTと対照的であり、ATP11CGTに残存するPtdSerフリッパーゼが非対称的なPtdSer分布を維持するのに十分であることが示唆された。また、CDC50AGTではNBD-PCを取り込む能力も低下しており(図２Ｃ)、KBM7で発現するいずれかのP4-ATPアーゼがPtdChoのフリッピングを促進している可能性が示唆された。【0063】
アポトーシスの際のカスパーゼによるATP11Cの切断マウス(m)ATP11Cを、W3細胞において、CRISPR/Cas (clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/cas)システムを用いて変異させた(19)。この操作により、ATP11Cの切断・不活化をもたらす挿入を有する4種のクローンを同定した。そして、そのうちの2種(ATP11CED22およびATP11CED23)を用いて更なる解析をおこなった(図３Ａ)。ATP11CED22およびATP11CED23ではNBD-PSおよびNBD-PEの取り込みがかなり減少したが、NBD-PCは減少しなかった(図３Ｂおよび図８Ａ)。
【0064】
アポトーシス性のPtdSer露出は、フリッパーゼ活性の消失を伴う(14, 15)。W3細胞をhFasリガンド(FasL)で処理すると、SDS-電気泳動法でのATP11Cの移動度がシフトし(120 kDaから50kDa)(図３Ｄ)、このシフトはカスパーゼ阻害剤(Q-VD-OPh)によって阻止された。Cascleave (http://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/〜sjn/Cascleave/)を用いてhATP11Cにおけるカスパーゼ認識配列を調べ、ヌクレオチド結合ドメイン、すなわちNドメインに３つの部位（部位1-3）(それぞれQEVDG（配列番号４５）、SQTDG（配列番号４６）およびDAVDG（配列番号４７）)が明らかになった(図３Ｃ)。α−ヘリックスに隣接するこれらの部位は進化的に保存されていた。部位1-3の配列をQEVAG (Mut1) （配列番号４８）、SQTAG (Mut2) （配列番号４９）およびAAVAG (Mut3) （配列番号５０）に変更した。これらの変異を二重または三重にもつ変異体(図８Ｂ)を作製し、C末端にGFPを付加して、ATP11CED22で発現させた。このATP11CED22形質転換体をFasLで処理し、ウェスタンブロッティングによって抗 GFPを用いて解析した(図３Ｅ)。FasL処理により、野生型および二重変異hATP11C-GFPキメラ(Mut1+2、Mut1+3およびMut2+3)は140 kDaから約80 kDaへシフトした。一方、三重変異hATP11C-GFP (Mut1+2+3)ではほとんど切断が観察されなかった。hATP11C-GFP発現細胞の可溶化膜画分をカスパーゼと共にインキュベーションすることにより、hATP11Cがカスパーゼ-3、カスパーゼ-6およびカスパーゼ-7によって切断されることが明らかとなった (図３Ｆ)。特に、カスパーゼ-3はhATP11Cを3カ所全てで切断した。mATP11Cのアミノ酸配列は、これらのカスパーゼ認識部位を含め、hATP11Cと相同性が高い(94.8%同一)ため、mATP11Cもアポトーシスの際にカスパーゼ-3によって切断されると考えられる。【0065】
PtdSer露出におけるカスパーゼによるATP11C切断の必要性3カ所のカスパーゼ認識部位を全て変異させたカスパーゼ耐性ATP11C（CasR)を発現するATP11CED22変異体は、野生型ATP11Cを発現する細胞と同程度に効率よくNBD-PSを取り込んだ(図４Ａ)。このことは、この変異体がフリッパーゼ活性を保持していることを示している。一方、CasRは、アポトーシス時におこるPtdSerの露出を阻害した。FasLを用いて細胞を処理すると、W3細胞、ATP11CED22、および野生型ATP11Cを発現するATP11CED22形質転換体はPtdSerを露出したが、CasRを発現するATP11CED22形質転換体ではPtdSerの露出は認められなかった(図４Ｂ)。一方、カスパーゼ-3は、これらの各種細胞のいずれにおいても活性化された(図４Ｃ)。CasR ATP11Cは、NBD-PCの取り込みによって測定されるFasL誘導性のスクランブル活性には影響しなかった (図４Ｄ)。これらの結果は、CasR形質転換体におけるFasL誘導性のPtdSer露出の欠失が、ATP11Cがカスパーゼによって不活性化されないためであることを示す。
【0066】
PtdSer露出と対照的に、FasL誘導性の細胞死、細胞収縮、およびDNAフラグメンテーションは、親細胞とCasR発現細胞とで同等であった(図９Ａ−Ｃ)。CasRは、野生型細胞でも同様にアポトーシス性PtdSer露出を阻害した。すなわち、W3-IldmおよびJurkat、並びにそれらのhATP11C形質転換体(W3Ildm-hATP11CおよびJurkat-hATP11C)は、FasL処理によってPtdSerを露出した(図４Ｅ)。しかしながら、そのCasR発現形質転換体(W3Ildm-CasRおよびJurkat-CasR)は、FasL処理をしてもほとんどPtdSerを露出しなかった。FasL処理した親株およびhATP11C形質転換体は、チオグリコレート誘導腹腔マクロファージ(thio-pMacs)によって効率よく貪食されるが、CasR形質転換体は貪食されなかった(図４Ｆ)。これは、アポトーシス細胞のマクロファージによる貪食には、フリッパーゼがカスパーゼによって不活性化されなければならないことを示唆している。【0067】
CDC50A欠損生細胞における構成的PtdSer露出次いで、CDC50ファミリーメンバーのうちCDC50Aのみを発現するマウスW3-Ildm細胞(図５Ａ)を用いて、CDC50A遺伝子をCrispr/Casシステムを用いて変異させた。2種のクローン(CDC50AED29およびCDC50AED62)において、CDC50A遺伝子の両アレルに変異が導入されていた(図５Ｂ)。これらの変異体ではNBD-PSの取り込みが障害されており(図５Ｃ)、PtdSerを構成的にアポトーシス細胞と同レベルで露出した(図５Ｄおよび図１０Ａ)。hCDC50A cDNAを用いてCDC50AEDを形質転換すると、フリッパーゼが完全に回復し(図５Ｃ)、PtdSerは露出されなくなった(図５Ｄ)。
【0068】
TMEM16Fの構成的活性型(D430G-L)を発現するW3細胞は、高レベルのPtdSerを露出する(5, 20)。しかしながら、この細胞のPtdSer結合タンパク質であるMFG-E8 (21)を結合する能力は、アッセイ条件に依存した。例えば、この細胞は、2.5 mM CaCl2を含むHEPES緩衝食塩水中ではMFG-E8と結合するが、この結合は10% FCSを含むIMDM中では抑制された(図５Ｅ)。これに対して、CDC50AEDは、10% FCSを含むIMDM中でもMFG-E8と結合した。共焦点顕微鏡での観察により、MFG-E8のCDC50AEDへの均一な結合が確認された(図５Ｆ)。W3-D430G-LはPtdSerを取り込むことから(図５Ｃ)、W3-D430G-LにおけるPtdSer露出はスクランブラーゼのみではなくフリッパーゼによっても制御されていることが示唆された。CDC50AED29細胞のdoubling time は、野生型およびCDC50A発現CDC50AED29形質転換体と比べて僅かに長かった(それぞれ12.2±0.39, 13.7±0.14および12.4±0.13 h)(図１０Ｂ)。一方、CDC50AEDのFasL誘導性アポトーシスの用量依存性は、W3-Ildmで観察されるものと同様であった(図１０Ｃ)。【0069】
生細胞のPtdSer依存性貪食pHrodoで標識された CDC50AED生細胞を1.0% メチルセルロースを含む培地でthio-pMacsと培養すると、20%を越えるマクロファージがCDC50AED細胞を貪食した(図６Ａ)。Thio-pMacsは、W3-Ildm、W3-D430G-L、またはhCDC50Aを発現するCDC50AED形質転換体を貪食しなかった。CDC50AED29の貪食は、PtdSerをマスクするMFG-E8のD89E変異体(21)によって阻害されたことから、この工程がPtdSer依存性であることが確認された。チロシンキナーゼ受容体であるMERは、thio-pMacsによるアポトーシス細胞の貪食に必須である(22)。同様に、CDC50AED生細胞は、MerTK-/- thio-pMacsによって貪食されなかった(図６Ｂ)。アポトーシス細胞をマークするために、CellEvent(商標) Caspase 3/7 Greenを培養物に加え、貪食を低速度撮影顕微鏡によってモニターした(図６Ｃ)。リソソームが強いpHrodo陽性を示すことからわかるように、CellEvent(商標)で染色されていない生細胞であってもマクロファージに高い頻度で貪食され、リソソームに移動した。また、CellEvent(商標)により染色されるアポトーシスを起こした細胞は、全体の細胞の10%未満であり、これらはマクロファージによって貪食された。132回の貪食事象をモニターすることによって、貪食された細胞のうち約80％が生存している細胞を貪食したもの、20%がアポトーシス細胞を貪食したものであることが分かった。上皮細胞のアノイキス誘導エントーシスについて報告された通り(23)、CDC50AED生細胞の貪食は、特定の時点までは可逆であるようである。すなわち、貪食された細胞の約3%が、pHrodoのシグナルが強くなる前にマクロファージから解放された(図６Ｄ)。貪食された細胞の解放は、カスパーゼ陽性細胞では観察されなかった。電子顕微鏡で調べると、貪食された生細胞は膨張した形態を有し(図６Ｅ)、凝縮した形態を示すFasL処理アポトーシス細胞とは異なっていた。同様に、CDC50A欠損KBM7細胞においても、PtdSer露出生細胞のthio-pMacsによる貪食が観察された(図１１)。
【0070】
W3-Ildm細胞をヌードマウスの皮下に移植すると、11匹のレシピエントのうち8匹で腫瘍が誘導され、腫瘍サイズは4週後で平均 約4.3 gであった(図６Ｆ)。これに対して、CDC50AED細胞を移植すると、6匹のマウスのうち1匹のみで腫瘍が形成され、4週間後に測定したその大きさも非常に小さかった(0.25 g)。CDC50AED細胞にhCDC50Aを発現させた後ヌードマウスに移植すると、6匹のレシピエントのうち5匹で平均サイズ2.5 gの腫瘍が形成された。この結果は、PtdSerを露出するCDC50AEDがマウス体内で除去されることを示唆する。【0071】
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【配列表フリーテキスト】
【0072】
配列番号１：mATP11Cのアミノ酸317−334の配列配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：相補的オリゴヌクレオチド
配列番号９：相補的オリゴヌクレオチド
配列番号１０：相補的オリゴヌクレオチド
配列番号１１：相補的オリゴヌクレオチド
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１５：プライマー
配列番号１６：プライマー
配列番号１７：プライマー
配列番号１８：プライマー
配列番号１９：プライマー
配列番号２０：プライマー
配列番号２１：プライマー
配列番号２２：プライマー
配列番号２３：プライマー
配列番号２４：プライマー
配列番号２５：プライマー
配列番号２６：プライマー
配列番号２７：プライマー
配列番号２８：プライマー
配列番号２９：プライマー
配列番号３０：プライマー
配列番号３１：プライマー
配列番号３２：プライマー
配列番号３３：プライマー
配列番号３４：プライマー
配列番号３５：プライマー
配列番号３６：プライマー
配列番号３７：プライマー
配列番号３８：プライマー
配列番号３９：プライマー
配列番号４０：プライマー
配列番号４１：プライマー
配列番号４２：プライマー
配列番号４３：プライマー
配列番号４４：プライマー
配列番号４５：カスパーゼ認識配列
配列番号４６：カスパーゼ認識配列
配列番号４７：カスパーゼ認識配列
配列番号４８：変異させたカスパーゼ認識配列
配列番号４９：変異させたカスパーゼ認識配列
配列番号５０：変異させたカスパーゼ認識配列
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]