特許 6530846 免疫賦活剤及び感染予防方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6530846

(24)【登録日】2019年5月24日

(45)【発行日】2019年6月12日

(54)【発明の名称】免疫賦活剤及び感染予防方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/716 20060101AFI20190531BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20190531BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20190531BHJP

   A61K 31/215 20060101ALI20190531BHJP

   A61K 31/736 20060101ALI20190531BHJP

   A61K 36/064 20060101ALI20190531BHJP

   A23L 33/145 20160101ALI20190531BHJP

   A23K 10/16 20160101ALI20190531BHJP

   A23K 20/163 20160101ALI20190531BHJP

   A23K 50/80 20160101ALI20190531BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/716

   A61P37/04

   A61P31/00 171

   A61K31/215

   A61K31/736

   A61K36/064

   A23L33/145

   A23K10/16

   A23K20/163

   A23K50/80

【請求項の数】9

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2018-191154(P2018-191154)

(22)【出願日】2018年10月9日

【審査請求日】2018年10月10日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000000055

【氏名又は名称】アサヒグループホールディングス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122297

【弁理士】

【氏名又は名称】西下 正石

(74)【代理人】

【識別番号】100145104

【弁理士】

【氏名又は名称】膝舘 祥治

(72)【発明者】

【氏名】白井 建史

(72)【発明者】

【氏名】吉田 淳平

【審査官】 渡部 正博

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００３−１８３１７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５４０１０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５４１７００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５３２２７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０２−２８３２８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平４−２５３７０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Fish & Shellfish Immunol，２０１６年，Vol.48，p.94-104

【文献】 養殖，２００３年，Vol.40, No.7，p.20-23

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３１／８０

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

Ａ２３Ｌ ３３／００−３３／２９

Ａ２３Ｋ １０／００−５０／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サッカロマイセス属に属するビール酵母に由来するグルカンと脂質とを含み、グルカンと脂質の総含有率が８０質量％以上であり、グルカンに対する脂質の含有比が、０．１以上０．２５以下であり、水不溶性である免疫賦活剤。

【請求項2】

グルカンに対する脂質の含有比が、０．１以上０．２以下である請求項１に記載の免疫賦活剤。

【請求項3】

β−グルカンに対するα−グルカンの含有比が、０．２以上０．８５以下である請求項１または２に記載の免疫賦活剤。

【請求項4】

マンナンを含み、マンナンの含有率が５質量％以下である請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。

【請求項5】

魚類に対して用いられる請求項１から４のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。

【請求項6】

脂質の総含有率が３質量％以上２０質量％以下である請求項１から５のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。

【請求項7】

請求項１から６のいずれか１項に記載の免疫賦活剤を含む免疫賦活用飲食品又は飼料。

【請求項8】

サッカロマイセス属に属するビール酵母に由来するグルカンと脂質とを含み、グルカンと脂質の総含有率が８０質量％以上であり、グルカンに対する脂質の含有比が、０．１以上０．２５以下であり、水不溶性である、魚類に対する感染予防剤。

【請求項9】

請求項１から６のいずれか１項に記載の免疫賦活剤を、対象（ヒトを除く）に投与することを含む感染予防方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫賦活剤及び感染予防方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、薬剤耐性菌の世界的な広まりが懸念されている。世界保健機関（ＷＨＯ）は、原因の１つとして家畜用抗生物質の乱用を指摘しており、畜産業界からは抗生物質の代替、すなわち感染症に対する解決策が求められている。生体がもともと持つ免疫機能の向上は感染症対策として有効であり、免疫賦活効果を持つ資材として認知度の高いβ−グルカンが期待されている。

【0003】

上記に関連して、特許文献１には、酵母細胞壁を処理してジメチルスルホキシドに可溶なβ−グルカンを得る方法が記載されている。特許文献２には、セレン強化イーストとβ−グルカンとを含む組成物が記載され、免疫刺激作用を有するとされている。特許文献３には、酵母菌体を自己消化処理して調製される免疫増強組成物が記載されている。特許文献４には、酵母を自己消化処理して得られる酵母分解組成物を添加した魚介類の飼育用飼料が記載され、免疫活性が向上するとされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特表２０１７−５１１１２２号公報

【特許文献2】特開２００９−２６３３３３号公報

【特許文献3】特開２００４−０９９５８０号公報

【特許文献4】特開２００３−１６９６０７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

β−グルカンを含む資材は市場に多数流通しているが、製品による品質のばらつきが大きい、機能性が担保されていない製品も多く存在するなどの課題がある。そこで本発明の一態様は、グルカンを含有し、免疫賦活効果を有する免疫賦活剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の第１態様は、グルカンと脂質とを含み、グルカンと脂質の総含有率が８０質量％以上である免疫賦活剤である。ある一形態において、免疫賦活剤を構成するグルカンと脂質は、酵母細胞壁に由来してもよい。ある一形態において、グルカンに対する脂質の含有比が０．１以上０．４以下であってもよい。ある一形態において、β−グルカンに対するα−グルカンの含有比が０．２以上０．８５以下であってもよい。ある一形態において、免疫賦活剤は、マンナンを含み、マンナンの含有率が５質量％以下であってもよい。ある一形態において、免疫賦活剤は、魚類に対して用いられてもよい。

【0007】

第２態様は、前記免疫賦活剤を含む飲食品又は飼料である。第３態様は、グルカンと脂質とを含み、グルカンと脂質の総含有率が８０質量％以上である魚類に対する感染予防剤である。第４態様は、前記免疫賦活剤を対象に投与することを含む感染予防方法である。

【発明の効果】

【0008】

本発明の一態様によれば、グルカンを含有し、免疫賦活効果を有する免疫賦活剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】ブタ白血球に対する活性酸素種の産生促進能を示すグラフである。

【図2】ヒト好中球様細胞に対する活性酸素種の産生促進能を示すグラフである。

【図3】ニジマスに対するビブリオ病感染試験の生存率を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また、組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。更に、各成分の含有量は、免疫賦活剤の乾物換算の値であり、平均値であってもよい。ここで含有量を平均値とするのは、製造ロット間のばらつきを考慮するものであり、例えば、任意に選択される６個以上の試料についての算術平均値である。平均値を算出する試料数の上限としては例えば２０個以下である。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、免疫賦活剤等を例示するものであって、本発明は、以下に示す免疫賦活剤等に限定されない。

【0011】

免疫賦活剤
免疫賦活剤は、グルカンと脂質とを含み、グルカンと脂質の総含有率が８０質量％以上である。本実施形態に係る免疫賦活剤は、良好な品質安定性と明確な免疫賦活効果を有する。これにより、家畜、ヒト、養殖魚等における感染症の罹患、進行を抑制することが期待されるだけでなく、薬剤耐性菌発生の脅威を軽減する手段を提供しうる。免疫賦活剤を構成するグルカンと脂質は、例えば、酵母細胞壁に由来し、酵母細胞壁を加水分解処理して得られるものであることが好ましい。加水分解処理にはアルカリ加水分解、酸加水分解が含まれる。

【0012】

免疫賦活剤を構成するグルカンは、Ｄ−グルコースがグリコシド結合で連結したポリマーであり、β−グルカン及びα−グルカンが含まれる。β−グルカンは、例えば、β−１，３結合の直鎖の主鎖骨格及びβ−１，６結合して分岐する側鎖を有する。また、α−グルカンは、例えば、α−１，４結合の直鎖の主鎖骨格及びα−１，６結合して分岐する側鎖を有する。

【0013】

免疫賦活剤におけるグルカンの総含有率は、例えば、６０質量％以上であり、好ましくは６５質量％以上、より好ましくは７０質量％以上であり、また例えば、９０質量％以下であり、好ましくは８５質量％以下、より好ましくは８０質量％以下である。

【0014】

免疫賦活剤におけるβ−グルカンの含有率は、例えば、３０質量％以上であり、好ましくは３５質量％以上、又は４０質量％以上であり、また例えば、６５質量％以下であり、好ましくは６０質量％以下、又は５０質量％以下である。また、α−グルカンの含有率は、例えば、１０質量％以上であり、好ましくは１５質量％以上、又は２０質量％以上であり、また例えば、４０質量％以下であり、好ましくは３５質量％以下、又は３０質量％以下である。

【0015】

免疫賦活剤におけるβ−グルカン含有量に対するα−グルカン含有量の比は、例えば、０．２以上０．８５以下であり、好ましくは０．２５以上、０．３以上、０．４以上、０．４５以上、又は０．５以上であり、また好ましくは０．８以下、０．７以下、又は０．６以下である。β−グルカンに対するα−グルカンの含有比が前記範囲であると、免疫賦活活性がより増強される傾向がある。

【0016】

免疫賦活剤における脂質には、アルコールと脂肪酸とがエステル結合して形成する単純脂質、分子中にリン酸、糖、タンパク質などを含む脂質である複合脂質、及び単純脂質又は複合脂質から加水分解によって誘導される誘導脂質が含まれる。免疫賦活剤における脂質の総含有率は、例えば、３質量％以上であり、好ましくは５質量％以上、又は１０質量％以上であり、また例えば、２０質量％以下であり、好ましくは１６質量％以下、又は１４質量％以下である。脂質の含有率が前記範囲内であると、免疫賦活活性がより増強される傾向がある。

【0017】

免疫賦活剤におけるグルカンと脂質の総含有率は、８０質量％以上であり、好ましくは８２質量％以上である。また例えば９５質量％以下であり、好ましくは９０質量％以下、又は８８質量％以下である。グルカンと脂質の総含有率が前記範囲内であると、免疫賦活活性がより増強される傾向がある。

【0018】

免疫賦活剤におけるグルカンの総含有量に対する脂質の総含有量の比は、例えば、０．１以上０．４以下であり、好ましくは０．１２以上、又は０．１５以上であり、また例えば、０．３以下であり、好ましくは０．２５以下、又は０．２以下である。グルカンに対する脂質の含有比が前記範囲であると、免疫賦活活性がより増強される傾向がある。

【0019】

免疫賦活剤は、グルカンと脂質に加えてマンナンを更に含んでいてもよい。マンナンはＤ−マンノースを主な構成単位とする多糖類である。免疫賦活剤がマンナンを含む場合、マンナンの含有率は、例えば、５質量％以下であり、好ましくは３質量％以下、又は１．２質量％以下であり、また例えば、０．１質量％以上であり、好ましくは０．２質量％以上、又は０．３質量％以上である。マンナンの含有率が前記範囲であると、免疫賦活活性がより増強される傾向がある。免疫賦活剤におけるグルカンの総含有量に対するマンナンの総含有量の比は、例えば、０．００４以上０．０５以下であり、好ましくは０．００５以上、又は０．００８以上であり、また好ましくは０．０２以下、又は０．０１８以下である。

【0020】

免疫賦活剤は、グルカンと脂質に加えてタンパク質を更に含んでいてもよい。免疫賦活剤がタンパク質を含む場合、タンパク質の含有率は、例えば、１０質量％以下であり、好ましくは８質量％以下、又は６質量％以下であり、また例えば、１質量％以上であり、好ましくは２質量％以上、又は３質量％以上である。タンパク質の含有率が前記範囲であると、免疫賦活活性がより増強される傾向がある。

【0021】

免疫賦活剤におけるグルカンの総含有量に対するマンナンとタンパク質の総含有量の比は、例えば、０．０１以上０．２以下であり、好ましくは０．０２以上、又は０．０５以上であり、また好ましくは０．１以下、又は０．０９以下である。

【0022】

免疫賦活剤は、灰分を更に含んでいてもよい。免疫賦活剤が灰分を含む場合、灰分の含有率は、例えば、１０質量％以下であり、好ましくは６質量％以下、又は４質量％以下であり、また例えば、１質量％以上であり、好ましくは１．５質量％以上、又は２質量％以上である。灰分の含有率が前記範囲であると、免疫賦活活性がより増強される傾向がある。

【0023】

免疫賦活剤の各成分の含有量は、常法により測定することができる。例えば、グルカンの含有量は、グルカンを加水分解して生成するグルコースを定量することで測定することができる。また、脂質の含有量は、酸分解法で定量することができる。

【0024】

免疫賦活剤は、品質安定性に優れる。免疫賦活剤の品質の安定性は、例えば、製造ロットの相違に起因する各成分の含有率のばらつきで評価できる。具体的には、各成分の含有率の変動係数（％）で評価される。変動係数（％）は、免疫賦活剤の各成分の含有率を、任意に選択される６個以上の試料について測定して、含有率の算術平均値と標準偏差を算出し、標準偏差を算術平均値で除した値の百分率として算出される。免疫賦活剤におけるグルカンの総含有率の変動係数（％）は、例えば、１０％以下であり、好ましくは８％以下、又は５％未満である。また、脂質の含有率の変動係数（％）は、例えば、２０％以下であり、好ましくは１５％以下、又は８％以下である。更に、グルカンと脂質の総含有率の変動係数（％）は、例えば、６％以下であり、好ましくは５％以下、又は５％未満である。なお、変動係数の下限値は０％であるが、実質的には０％より大きい値となる。

【0025】

免疫賦活剤は、主要成分であるグルカンと脂質に加えて、免疫調整作用を有する公知の成分を更に含んでいてもよい。免疫調整作用を有する成分としては、例えば、甜茶抽出物、フコイダン、アラビノキシラン、ラクトフェリン、カテキン、キトサン、キトサンオリゴ糖、キチンオリゴ糖、Ｌ−アスコルビン酸、コエンザイムＱ_１０（還元型を含む）等を挙げることができる。

【0026】

免疫賦活剤には、必要に応じて通常、医薬品、食品、飼料等に用いられ得ることが知られている任意の成分、例えば、水、油脂、糖類、ビタミン類、甘味料、調味料、酸味料、保存料、香料、着色料、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、安定剤、乳化剤、ｐＨ調整剤等を配合することができる。

【0027】

免疫賦活剤の形態は、粉末、顆粒等の固体、液体、ペースト等のいずれであってもよい。また、免疫賦活剤の剤型は、投与方法、投与対象等に応じて適宜選択することができる。剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、トローチ剤、散剤、液剤等の経口投与用製剤が挙げられる。これらの製剤は、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤等の添加剤を用いて公知の方法に従って製造することができる。また、免疫賦活剤を含有させて、健康食品、健康補助食品等の食品組成物、飲料組成物、飼料等を構成することもできる。

【0028】

免疫賦活剤は、脊椎動物等の投与対象に投与されると、対象において免疫賦活作用を発現する。これにより、対象における感染症の発症を抑制することができる。すなわち、免疫賦活剤は対象の感染症の予防方法に適用することができる。投与の対象となる脊椎動物としては、哺乳動物、鳥類、魚類等が挙げられる。哺乳動物は、ヒトを含んでいてもよく、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。ヒト以外の哺乳動物としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サルの他イヌ、ネコ等の愛玩動物等が挙げられる。鳥類としては、肉鶏、産卵鶏、七面鳥、アヒル、ハト等が挙げられる。また、魚類としては、サケ、マス、ヤマメ、イワナ、イトウ等のサケ科魚類、コイ、フナ、ティラピア、ナマズ、スズキ、ブリ、カンパチ、ハマチ、ヒラメ、タイ、マグロ、ウナギ等が挙げられる。

【0029】

免疫賦活剤を医薬品又は飲食品として投与する場合、例えば、１回あたり１ｍｇから５００ｍｇ（乾燥重量）／ｋｇ体重の量を、１日に１回から数回の経口投与とすることができる。また、飲食品、飼料等として使用する場合、飲食品、飼料等の１００ｇあたり０．１ｇから１ｇを添加することができる。

【0030】

免疫賦活剤を飼料として投与する場合、例えば、哺乳動物、鳥類、魚類に対しては投与する餌に対して０．００１質量％以上１質量％以下で混合したものを一日に１回から数回投与することができる。

【0031】

免疫賦活剤の製造方法
免疫賦活剤は、例えば、酵母細胞壁を原料とする以下のような製造方法で製造することができる。免疫賦活剤の製造方法は、例えば、酵母細胞壁を酸水溶液又はアルカリ水溶液で加水分解処理して加水分解物を得る加水分解工程と、加水分解物からグルカン含有組成物を回収する回収工程とを含む。

【0032】

ここで加水分解工程に供される酵母細胞壁は、前処理工程で前処理されていてもよい。前処理工程には、原料となる酵母を自己消化して自己消化物を得る自己消化工程、原料となる酵母を熱水抽出して熱水抽出物得る熱水抽出工程、原料となる酵母を酵素処理して酵素処理物を得る酵素処理工程等の予備分解工程、自己消化物、熱水抽出物、酵素処理物等の予備分解物を遠心分離して酵母細胞壁を得る第１遠心分離工程等が含まれる。

【0033】

原料となる酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロマイセス属、カンジダ属、ピキア属、トルロプシス属等の酵母が挙げられ、これらからなる群から選択される少なくとも１種が好ましく、サッカロマイセス属の酵母がより好ましい。サッカロマイセス属の酵母には、ビール酵母、パン酵母等の食品用酵母が含まれる。

【0034】

自己消化工程では、酵母自体のプロテアーゼ等により酵母のタンパク質等を分解して自己消化物を得る。自己消化工程は、例えば、ｐＨを２から７に、温度を４０℃以上６５℃以下に調整して、１時間以上４８時間以下で行われる。第１遠心分離工程では、自己消化物を遠心分離して重液として酵母細胞壁を含む画分を得る。遠心分離には、例えば、工業生産においてはノズル型遠心機、間欠排出型遠心機、シャープレス型遠心機等を用いることができ、自己消化物中の不溶性成分を回収できる限り、遠心分離の条件は適宜調整することができる。

【0035】

加水分解工程では、酵母細胞壁を、例えば、アルカリ水溶液を用いて加水分解処理して加水分解物を得る。アルカリ水溶液としては、例えば、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物を含む水溶液が用いられる。アルカリ水溶液の濃度は、例えば、０．０１質量％以上１０質量％以下であり、好ましくは０．１質量％以上５質量％以下、より好ましくは１質量％以上３質量％以下である。加水分解処理の温度は、例えば７０℃以上１００℃以下であり、好ましくは８５℃以上９５℃以下である。加水分解処理の時間は、例えば１時間以上４８時間以下であり、好ましくは４時間以上２４時間以下である。

【0036】

回収工程は、例えば、必要な場合には加水分解物を中和して中和物を得る中和工程と、中和物又は加水分解物を遠心分離してグルカン含有組成物を得る第２遠心分離工程と、グルカン含有組成物を乾燥する乾燥工程とを含む。酵母の自己消化物等から得られる酵母細胞壁を、アルカリ加水分解処理することで、グルカン及び脂質を含む免疫賦活剤を安定した品質で製造することができる。

【0037】

中和工程では、アルカリ加水分解物に酸性化合物を加えてｐＨを６．５から７．５に調整して中和物を得る。酸性化合物としては、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸、ギ酸、酢酸等の有機酸が用いられる。第２遠心分離工程では中和物を遠心分離して重液としてグルカン含有組成物を得る。遠心分離には、例えば、工業生産においてはノズル型遠心機、間欠排出型遠心機、シャープレス型遠心機等を用いることができ、中和物又は加水分解物中の不溶性成分を回収できる限り、遠心分離の条件は適宜調整することができる。乾燥工程ではグルカン含有組成物を乾燥処理して、免疫賦活剤を得る。乾燥条件としては、工業生産においては噴霧乾燥機、凍結乾燥機又はドラム乾燥機等を用いることができ、条件は適宜調整することができる。乾燥工程の前に、グルカン含有組成物を殺菌処理する殺菌工程を設けてもよい。殺菌工程は、例えば、ＵＨＴ殺菌機を用いて１２０℃以上で１０秒から６０秒間熱処理して行うことができるが、目的の品質に合致するよう適宜調整することができる。

【実施例】

【0038】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0039】

免疫賦活剤の製造方法１
アサヒグループ食品（株）栃木小金井工場にて製造したサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属するビール酵母に由来する酵母細胞壁（固形分１５％；酵母の自己消化物由来）を準備し、これを加水分解処理に供した。具体的には、酵母細胞壁を含むスラリーに、最終濃度が約１．５質量％、又は約２．０質量％となるように水酸化ナトリウムを添加し、９０℃に加熱して４時間加水分解処理した。処理後の酵母細胞壁スラリーを塩酸でｐＨ７．０に調整後、高速冷却遠心機（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製 Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２６Ｓ ＸＰ）を用い、８，０００ｇ×１０分間のバッチ式遠心分離を行った。沈殿に１．５Ｌの蒸留水を添加し、懸濁した後に上述の条件で遠心分離を行った。本操作を４回繰り返し、沈殿を凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ社製ＦＤＵ−２１００）にて２晩以上乾燥して免疫賦活剤を得た。

【0040】

免疫賦活剤の製造方法２
アサヒグループ食品（株）栃木小金井工場にて製造したサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属するビール酵母に由来する酵母細胞壁（固形分１５％；酵母の自己消化物由来）を準備し、これを加水分解処理に供した。具体的には、酵母細胞壁を含むスラリーに、最終濃度が約１．５質量％、又は約２．０質量％となるように水酸化ナトリウムを添加し、９０℃に加熱して４時間加水分解処理した。処理後の酵母細胞壁スラリーを塩酸でｐＨ７．０に調整後、ノズル式連続遠心分離機（アルファラバル社製ＦＥＵＸ５１２Ｔ−３１Ｃ−５０およびＦＥＵＸ４１２Ｕ−３１Ｃ−５０）により加水しながら固液分離し、得られた重液を１３０℃４０秒の条件で殺菌し、次いでドラム乾燥機にて乾燥して免疫賦活剤を得た。

【0041】

グルカンの分析方法１
試料を約０．６ｇ秤量し、７２（ｗ／ｗ）％硫酸を４ｍＬ添加後、室温にて１時間撹拌した。その後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水を用いて硫酸濃度を４（ｗ／ｗ）％に調整し、１２１℃で１時間反応させた。冷却後に水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和した。定容後にろ過を行い、ろ液をＨＰＬＣに供した。カラムはＷａｋｏｐａｋ（登録商標）Ｗａｋｏｓｉｌ（登録商標）５ＮＨ_２（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、富士フイルム和光純薬工業株式会社）、カラム温度は室温、移動相はアセトニトリル：水＝７５：２５、流量１．０ｍＬ／分、注入量は２μＬとした。反応液として１（ｗ／ｖ）％アルギニンおよび３（ｗ／ｖ）％ホウ酸混合溶液を０．７ｍＬ／ｍｉｎ．で流し、１５０℃で反応させ、蛍光検出器を用いてグルコースを検出した（励起波長３２０ｎｍ、測定波長４３０ｎｍ）。得られたグルコース含有率に０．９を乗じてグルカンの総含有率を算出した。

【0042】

グルカンの分析方法２
試料を約０．５ｇ秤量し、０．０８ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２５ｍｌ添加し、ターマミル１２０Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）を０．１ｍｌ添加し、沸騰水浴中で３０分間反応させた。放冷後、０．２７５ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．５±０．１に調整し、プロテアーゼ（シグマアルドリッチ社、Ｐ−５３８０）を６０℃で３０分間作用させた。放冷後、０．３２５ｍｏｌ／ｌの塩酸を用いてｐＨを４．３±０．１に調整し、アミログルコシダーゼ（シグマアルドリッチ社、Ａ−９９１３）を６０℃で３０分間作用させた。酵素処理後の液に４倍量の９５％エタノールを添加し、１時以上放置した。珪藻土を入れたろ過器に、液を流し入れ、吸引濾過を行った。残渣をエタノール、アセトンで洗浄した。残渣を回収し、７２（ｗ／ｗ）％硫酸を５ｍｌ添加し、２０℃で４時間分解した。４（ｗ／ｗ）％になるよう水を添加し、沸騰水浴中で２時間分解した。放冷後に中和、定容、ろ過を行った。ろ液中のグルコースをグルコースオキシダーゼ法により定量し、グルコース濃度を求め、０．９を乗じ、β−グルカンの含有率を算出した。

【0043】

α−グルカンの含有率は、分析方法１で求めたグルカンの総含有率から、β−グルカンの含有率を差し引いて算出した。

【0044】

脂質の分析方法
酸分解法により定量した。採取した試料に２ｍｌのエタノールと１０ｍｌの濃塩酸を添加し、７０℃から８０℃の恒温槽で３０分間から４０分間分解処理した。その後、試料をマジョニア管に移し、エタノールとジエチルエーテルを混合し、さらに石油エーテルを混合した。エーテル層を回収し、水層にさらにジエチルエーテル・石油エーテルの混合液を添加して分配を行った。エーテル層を回収し、水層は再度ジエチルエーテルと石油エーテルを用いて分配を行ってエーテル層を回収した。ジエチルエーテル・石油エーテルを留去後、１０５℃で１時間乾燥させて、乾燥前後の重量差を脂質量とし、試料採取量から脂質の含有率を算出した。

【0045】

マンナンの分析方法
試料を約０．６ｇ秤量し、７２（ｗ／ｗ）％硫酸を４ｍｌ添加し、室温で１時間撹拌した。その後、硫酸濃度が４（ｗ／ｗ）％になるようＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水を添加し、１２１℃で１時間加水分解を行った。放冷後に中和、定容し、ろ液中のマンノースの含有量を、上述したグルカンの分析方法と同様にして定量した。試料中のマンノース濃度を算出し、０．９を乗じて、マンナン含有率を算出した。

【0046】

タンパク質の分析方法
試料中のタンパク質の含有率は、燃焼法にて定量した。分析には全窒素測定装置（住化分析センター）を用いた。試料を石英ボートに採取し、反応炉の温度を８７０℃以上、還元炉の温度を６００℃、検出器の温度を１００℃、カラムの温度を７０℃に設定し、分析を行った。検出された窒素ガスを定量し、窒素・タンパク質換算係数６．２５を乗じ、タンパク質含有率を算出した。

【0047】

灰分の分析方法
試料中の灰分の含有率は、直接灰化法により定量した。磁製るつぼに試料を採取し、予備灰化を行った。その後、５５０℃にて灰化を行った。シリカゲルデシケーター内で放冷後、秤量した。灰化前後の重量差を灰分量とし、試料採取量から灰分含有率を算出した。

【0048】

上記の製造方法で得られた１４サンプルの免疫賦活剤について、成分分析を行った結果を表１に示す。なお、表１に示す各成分の含有率は、質量基準で算出された免疫賦活剤の乾物換算値である。また、表１中のグルカンの含有率は、α−グルカンとβ−グルカンの総含有率であり、以下同様である。

【0049】

【表1】

【0050】

参考例として、β−１，３／１，６−グルカンを主成分とする市販の免疫賦活剤（以下、「市販品Ａ」ともいう）を製造ロットが異なる９サンプルを入手して、同様にして成分分析を行った。各成分の含有率の平均値、標準偏差及び変動係数（％）を表２に示す。表２に示す各成分の含有率は、質量基準の乾物換算値である。

【0051】

【表2】

【0052】

表１に示すように、免疫賦活剤は、脂質とグルカンの総含有率の平均値が８０質量％以上であり、また、サンプル間の含有率のばらつきが小さかった。一方、表２に示すように、市販品Ａの脂質とグルカンの総含有率の平均値は８０質量％未満であり、サンプル間のばらつきが大きかった。

【0053】

次に上記で得られた免疫賦活剤と市販品Ａについて、白血球に対する活性酸素種（ＲＯＳ）産生促進能を評価した。

【0054】

ブタ白血球に対するＲＯＳ産生促進能
１０週齢の離乳子豚より採取した末梢血から単球を分取した。具体的には、１０％ウシ胎児血清入りＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁させた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を２×１０^６個／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種した後、２時間の培養によりウェル内に単球を付着固定した。培養上清を除去し、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄してリンパ球を除去した後、免疫賦活剤（＃５、＃６）又は市販品Ａを最終濃度が１００μｇ／ｍＬから４００μｇ／ｍＬとなるように発光試薬（ルミノール）とＨＢＳＳとともに各ウェルに添加した。その後、ルミノメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で１２０分間の積算発光量を測定した。陰性対照には発光試薬（ルミノール）とＨＢＳＳのみを添加し、相対発光単位（ＲＬＵ）をＲＯＳ産生量として評価した。陽性対照にはホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を５０μｇ／ｍＬとなるように発光試薬（ルミノール）とＨＢＳＳとともに添加した。結果を図１に示す。

【0055】

図１に示すように、２つの異なる製造ロットの免疫賦活剤＃５、＃６は、１００μｇ／ｍＬから４００μｇ／ｍＬの全て添加濃度において、市販品ＡよりもＲＯＳ産生量が多かった。なお、免疫賦活剤＃５のグルカンと脂質の総含有率は８５．４質量％、免疫賦活剤＃６のグルカンと脂質の総含有率は８３．９質量％であった。

【0056】

ヒト白血球に対するＲＯＳ産生促進能
Ｃｏｌｌｉｎｓらの方法（Ｃｏｌｌｉｎｓ ＳＪ，Ｒｕｓｃｅｔｔｉ ＦＷ，Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ＲＥ，Ｇａｌｌｏ ＲＣ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，２４５８−２４６２，１９７８）に従い、ヒト白血病細胞株ＨＬ−６０を１．２５体積％のジメチルスルホキシドと１０％ウシ胎児血清入りＲＰＭＩ１６４０培地で６日間培養して好中球様に分化誘導した。前述の培地で懸濁させた好中球様ＨＬ−６０を４×１０^５個／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種した後、１時間の培養によりウェル内に付着固定し、免疫賦活剤＃１４又は市販品Ａを最終濃度が１００μｇ／ｍＬから８００μｇ／ｍＬとなるように発光試薬（ルミノール、ナカライテスク社製）とＨＢＳＳとともに各ウェルに添加した。その後、ルミノメーターで１２０分間の積算発光量を測定した。陰性対照には発光試薬（ルミノール）とＨＢＳＳのみを添加し、相対発光単位（ＲＬＵ）をＲＯＳ産生量として評価した。結果を図２に示す。

【0057】

図２に示すように、本発明の免疫賦活剤＃１４は、１００μｇ／ｍＬから８００μｇ／ｍＬの全て添加濃度において、市販品ＡよりもＲＯＳ産生量が多かった。このとき使用した免疫賦活剤＃１４のグルカンと脂質の総含有率は８３．８質量％であった。

【0058】

ニジマスのビブリオ病感染試験
平均体重２ｇのニジマス２５匹を、免疫賦活剤＃４又は市販品Ａの最終濃度が０．２質量％となるように展着した飼料でそれぞれ飼育した。飼育開始から７日後にＰＢＳにより９×１０^４ｃｆｕ／ｍＬに希釈したＶｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ菌をニジマス腹腔内に０．０５ｍＬ注射して感染処理した。その後、１０日間にわたって飼育を継続し、１日毎に生存率を算出した。結果を図３に示す。図３において縦軸は生存率（％）、横軸は感染処理後の経過日数を示す。

【0059】

注射後７日目の生存率は、陰性コントロール（無処理）が６４％、免疫賦活剤投与区が７６％、市販品Ａ投与区が６８％であった。このとき使用した免疫賦活剤＃４のグルカンと脂質の総含有率は８１．３質量％であった。

【0060】

図３に示すように、本発明の免疫賦活剤は、市販の免疫賦活剤に比べて高い生存率を示した。

【要約】

【課題】グルカンを含有し、免疫賦活効果を有する免疫賦活剤を提供する。
【解決手段】免疫賦活剤は、酵母細胞壁に由来するグルカンと脂質とを含み、グルカンと脂質の総含有率が８０質量％以上である。
【選択図】図１

【図1】

【図2】

【図3】