特許 6533077 発色試薬溶液のバックグラウンド上昇抑制方法、発色試薬溶液、試薬キット、および測定装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6533077

(24)【登録日】2019年5月31日

(45)【発行日】2019年6月19日

(54)【発明の名称】発色試薬溶液のバックグラウンド上昇抑制方法、発色試薬溶液、試薬キット、および測定装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/78 20060101AFI20190610BHJP

   G01N 33/52 20060101ALI20190610BHJP

【ＦＩ】

   G01N21/78 Z

   G01N33/52 A

【請求項の数】11

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2015-56099(P2015-56099)

(22)【出願日】2015年3月19日

(65)【公開番号】特開2015-194493(P2015-194493A)

(43)【公開日】2015年11月5日

【審査請求日】2017年12月7日

(31)【優先権主張番号】特願2014-62845(P2014-62845)

(32)【優先日】2014年3月26日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000141897

【氏名又は名称】アークレイ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100079049

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100084995

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 和詳

(74)【代理人】

【識別番号】100099025

【弁理士】

【氏名又は名称】福田 浩志

(72)【発明者】

【氏名】大宮 一紘

(72)【発明者】

【氏名】今井 敏博

【審査官】 吉田 将志

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００５−２７４５６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０６３５５４８９（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 特開２００９−２５７９０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／０１３８９５９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００３−２８７５４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０９−１３３６７１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２１／７５−８３

Ｇ０１Ｎ ３３／５２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中の成分の測定に使用され、酸化発色試薬が溶解されている発色試薬溶液を保管する際に生じる前記発色試薬溶液のバックグラウンド上昇を抑制するための方法であって、
前記発色試薬溶液の水素イオン指数を強酸性に調整する調整工程、を有し、
前記酸化発色試薬は、下記の一般式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩から選択されている、方法。

【化1】

［一般式（Ｉ）中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４は、各々独立に、水素原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、フェニル基、またはハロゲン基を表す。ただし、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうち、少なくとも一つは、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を表す。］

【請求項2】

請求項１に記載の方法であって、
前記調整工程において、前記発色試薬溶液の水素イオン指数は、２．９以下に調整される、方法。

【請求項3】

請求項１または２に記載の方法であって、
前記発色試薬溶液は、酸化ストレス度を測定するのに使用される、方法。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれかに記載の方法であって、
前記酸化発色試薬は、下記の式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、下記の式（ＩＶ）で表わされる化合物またはそれら塩から選択されている、方法。

【化2】

【請求項5】

試料中の成分の測定に使用され、酸化発色試薬が溶解されている発色試薬溶液であって、
水素イオン指数が強酸性に調整されており、
前記酸化発色試薬は、下記の一般式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩から選択されている、発色試薬溶液。

【化3】

［一般式（Ｉ）中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４は、各々独立に、水素原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、フェニル基、またはハロゲン基を表す。ただし、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうち、少なくとも一つは、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を表す。］

【請求項6】

請求項５に記載の発色試薬溶液であって、
水素イオン指数が、２．９以下に調整されている、発色試薬溶液。

【請求項7】

請求項５または６に記載の発色試薬溶液であって、
酸化ストレス度を測定するのに使用される、発色試薬溶液。

【請求項8】

請求項５〜７のいずれかに記載の発色試薬溶液であって、
前記酸化発色試薬は、下記の式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、下記の式（ＩＶ）で表わされる化合物またはそれら塩から選択されている、発色試薬溶液。

【化4】

【請求項9】

試料中の成分の測定に使用される試薬キットであって、
請求項５〜８のいずれかに記載の発色試薬溶液を含む、試薬キット。

【請求項10】

請求項９に記載の試薬キットであって、
前記発色試薬溶液を希釈するための希釈液を更に含んでおり、
前記希釈液は、緩衝剤により呈色反応に適した所定の水素イオン指数に調整されており、前記発色試薬溶液の水素イオン指数は、前記希釈液によって希釈されることにより、前記希釈液の前記所定の水素イオン指数に変化するように構成されている、試薬キット。

【請求項11】

試料中の成分の測定に使用される測定装置であって、
請求項９または１０に記載の試薬キットを使用して測定を行う、測定装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料中の成分を測定するのに使用され、酸化発色試薬が溶解された発色試薬溶液のバックグラウンド上昇抑制方法、発色試薬溶液、試薬キット、および測定装置に関する。

【背景技術】

【0002】

一般的に、生体内で消費される酸素の２％程度が活性酸素・フリーラジカルに変わるとされている。「活性酸素・フリーラジカル」は、活性酸素でありかつフリーラジカルである物質である。この活性酸素・フリーラジカルは、抗酸化物質や抗酸化酵素の働きにより大半が消去されるが、消去されない活性酸素・フリーラジカルは、ＤＮＡ、脂質、酵素、タンパク質などの生体成分を酸化する。これらの生体成分の酸化損傷が、老化現象の亢進だけでなく、糖尿病、高血圧、動脈硬化などの疾患の発症に関連していることが、明らかにされつつある。

【0003】

ここで、活性酸素・フリーラジカルと抗酸化物質や抗酸化酵素とのバランスは、酸化ストレスとして定義されている。酸化ストレスの度合いを酸化ストレス度という。「酸化ストレス度が高い」とは、生体内において活性酸素・フリーラジカルによる酸化作用と、抗酸化物質などの抗酸化作用とのバランスが崩れ、酸化反応が亢進する状況のことをいう。酸化ストレス度が高い状況は、生体にとって好ましくない状況である。

【0004】

特許文献１〜３に、酸化ストレス度を測定するための測定方法が紹介されている。生体内の脂質、蛋白質、アミノ酸、核酸などは、活性酸素・フリーラジカルにより酸化反応を受け、ヒドロペルオキシド（Ｒ−ＯＯＨ）となる。従って、このヒドロペルオキシドは、酸化ストレス度のマーカーとなり得る。特許文献１〜３に記載された測定方法においては、生体内に生じた活性酸素・フリーラジカルが直接計測されるのではなく、それらにより生じた血中のヒドロペルオキシドの濃度が呈色反応を用いて測定され、生体内の酸化ストレス度が総合的に評価される。

【0005】

ところで、特許文献１〜３において、上記呈色反応のための発色試薬として、酸化発色試薬であるｐ−フェニレンジアミン誘導体が使用されている。このｐ−フェニレンジアミン誘導体は、感度が高い点に特徴があり、前記ヒドロペルオキシド濃度測定に使用する発色試薬として有用なものである。

【0006】

しかしながら、前記従来技術においては、次に述べるように、未だ改善すべき余地があった。

【0007】

すなわち、ｐ−フェニレンジアミン誘導体のような酸化発色試薬は、溶液状態で比較的不安定で、溶液中の酸素と反応しやすいため、誤発色を起こしやすい。これに起因して、溶液状態で保管すると、バックグラウンドが上昇するという問題があった。一つの対応策として、酸化発色試薬を凍結乾燥などにより乾燥試薬として保管する方法が行われている。この乾燥試薬は、使用時に溶解液により溶解して使用される。使用時にこのような前処理作業をしなければならないことは、測定作業者にとって負担となる。よって、酸化発色試薬は、溶液状態で保管できることが望ましい。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】欧州特許第０７８３６９２Ｂ１号明細書

【特許文献2】米国特許第６，３５５，４８９Ｂ１号明細書

【特許文献3】特開２００９−２５７９０９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、前記したような事情のもとで考え出されたものであって、試料中の成分の測定に使用され、酸化発色試薬が溶解されている発色試薬溶液を保管するに際し、その発色試薬溶液のバックグラウンド上昇を抑制するための方法、バックグラウンド上昇が抑制された発色試薬溶液、その発色試薬溶液を含む試薬キット、およびその試薬キットを使用して試料中の成分を測定するための測定装置を提供することをその課題としている。

【課題を解決するための手段】

【0010】

上記の課題を解決するため、本発明では、次の技術的手段を講じている。

【0011】

本発明の第１の側面により提供される発色試薬溶液のバックグラウンド上昇を抑制するための方法は、試料中の成分の測定に使用され、酸化発色試薬が溶解されている発色試薬溶液を保管する際に生じるバックグラウンド上昇を抑制するための方法であって、前記発色試薬溶液の水素イオン指数を強酸性に調整する調整工程、を有していることを特徴としている。

【0012】

好ましくは、前記調整工程において、前記発色試薬溶液の水素イオン指数は、２．９以下または２．１以下に調整される構成とされている。

【0013】

好ましくは、前記発色試薬溶液は、酸化ストレス度を測定するのに使用される構成とされている。

【0014】

好ましくは、前記酸化発色試薬は、フェニレンジアミン誘導体である構成とされている。

【0015】

好ましくは、前記フェニレンジアミン誘導体は、ｐ−フェニレンジアミン誘導体である構成とされている。

【0016】

好ましくは、前記ｐ−フェニレンジアミン誘導体は、下記の一般式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩から選択される構成とされている。

【化1】

［一般式（Ｉ）中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４は、各々独立に、水素原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、フェニル基、またはハロゲン基を表す。］

【0017】

本発明の第２の側面により提供される発色試薬溶液は、試料中の成分の測定に使用され、酸化発色試薬が溶解されている発色試薬溶液であって、水素イオン指数が強酸性に調整されていることを特徴としている。

【0018】

好ましくは、前記発色試薬溶液は、水素イオン指数が、２．９以下または２．１以下に調整される構成とされている。

【0019】

好ましくは、前記発色試薬溶液は、酸化ストレス度を測定するのに使用される構成とされている。

【0020】

好ましくは、前記酸化発色試薬は、フェニレンジアミン誘導体である構成とされている。

【0021】

好ましくは、前記フェニレンジアミン誘導体は、ｐ−フェニレンジアミン誘導体である構成とされている。

【0022】

好ましくは、前記ｐ−フェニレンジアミン誘導体は、下記の一般式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩から選択される構成とされている。

【化1】

［一般式（Ｉ）中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４は、各々独立に、水素原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、フェニル基、またはハロゲン基を表す。］

【0023】

本発明の第３の側面により提供される試薬キットは、試料中の成分の測定に使用される試薬キットであって、本発明の第２の側面により提供される発色試薬溶液を含むことを特徴としている。

【0024】

好ましくは、前記試薬キットは、前記発色試薬溶液を希釈するための希釈液を更に含んでおり、前記希釈液は、緩衝剤により呈色反応に適した所定の水素イオン指数に調整されており、前記発色試薬溶液の水素イオン指数は、前記希釈液によって希釈されることにより、前記希釈液の前記所定の水素イオン指数に変化する構成とされている。

【0025】

本発明の第４の側面により提供される測定装置は、試料中の成分の測定に使用される測定装置であって、第３の側面により提供される試薬キットを使用して測定を行うように構成されていることを特徴としている。

【発明の効果】

【0026】

本発明の一態様を採用することによれば、試料中の成分を測定するのに使用され、酸化発色試薬が溶解された発色試薬溶液のバックグラウンドの上昇を抑制することができる。その結果、酸化発色試薬を溶液状態で保管することが可能となる。これにより、試料中の成分の測定を行う際に、酸化発色試薬を溶解する手間が省けるので、測定作業者にとって便利である。

【0027】

本発明のその他の特徴および利点は、添付図面を参照して以下に行なう発明の実施の形態の説明から、明らかとすることができる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】本発明に係る発色試薬溶液を含むカートリッジおよびこのカートリッジを測定するための測定装置を備えた測定システムの一例の構成を模式的に示す斜視図である。

【図2】図１に示す測定システムのII−II線に沿う断面図である。

【図3】図１に示す測定システムのカートリッジに充填された発色試薬溶液に溶解されている酸化発色試薬の具体例を示す図である。

【図4】図１に示す測定システムの動作の一例を説明するフロー図である。

【図5】実施例１の処方を示す表である。

【図6】実施例１の確認結果を示す表である。

【図7】実施例２の処方を示す表である。

【図8】実施例２の発色試薬溶液（３）の確認結果を示すグラフである。

【図9】実施例２の発色試薬溶液（４）の確認結果を示すグラフである。

【図10】実施例２の発色試薬溶液（５）の確認結果を示すグラフである。

【図11】実施例２の発色試薬溶液（６）の確認結果を示すグラフである。

【図12】実施例２の発色試薬溶液（７）の確認結果を示すグラフである。

【図13】実施例２の発色試薬溶液（８）の確認結果を示すグラフである。

【図14】実施例３の処方を示す表である。

【図15】実施例３の確認結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0029】

以下、本発明の好ましい実施の形態について、図面を参照して具体的に説明する。なお、本発明において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。また、以降の説明において、上下方向などの方向は、図面の記載にしたがったものとする。

【0030】

［測定システム］
図１は、本発明が適用された発色試薬溶液、その発色試薬溶液を含むカートリッジ、およびそのカートリッジを用いて生体中の酸化ストレス度を測定するための測定装置を具備する測定システムの一例を示している。測定システムＡは、カートリッジ１および測定装置２を具備している。カートリッジ１は、例えば、診療所や、病院の病棟に設置されている小型の測定装置２にセットして、試料Ｓに含まれる成分の量を測定するのに使用される。試料Ｓ中の成分としては、具体的には、例えば、ヒドロペルオキシド（Ｒ−ＯＯＨ）が挙げられる。このヒドロペルオキシドは、生体内の脂質、蛋白質、アミノ酸、核酸などが、活性酸素・フリーラジカルにより酸化を受けて生じたものである。測定によって得られたヒドロペルオキシド濃度は、生体内の酸化ストレス度を総合的に評価するのに用いられる。試料Ｓとしては、具体的には、例えば、全血、血漿、血清、尿、唾、間質液などの生体試料が挙げられる。これらの試料Ｓは、そのまま適用してもよいし、希釈液ＲＳ４で希釈して適用してもよい。

【0031】

［カートリッジ］
図１および図２に示すように、カートリッジ１は、複数の槽、測光セル、チップ装填箇所などが一体化されたものである。カートリッジ１は、本発明でいう試薬キットの一例に相当するものである。カートリッジ１は、例えば、ポリスチレンを材料として、射出成型により製造される。カートリッジ１は、測光セル１２において、可視光線または紫外線を透過させる。これより、カートリッジ１の材料として、ポリスチレンの他に、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネートなどが使用される。カートリッジ１は、ヒドロペルオキシド濃度を測定するのに必要な試薬を全て含んでいる。このカートリッジ１は、製造後、冷蔵して輸送・保管される。冷蔵条件として、例えば、４℃以下が挙げられる。

【0032】

カートリッジ１は、試料槽１０、発色試薬溶液槽１１、測光セル１２、希釈槽１３、希釈液槽１４、洗浄液槽１５、およびチップ装填箇所１６を有している。カートリッジ１の上面１８には、シール（図示略）が貼り付けられている。このシールは、アルミシール、アルミ箔を備えた多層フィルム、または合成樹脂フィルム製であり、少なくとも、発色試薬溶液槽１１、希釈液槽１４、および洗浄液槽１５を覆っている。

【0033】

試料槽１０は、試料Ｓを分注するための槽である。測定作業者は、測定時、ピペットなどを用いて、試料Ｓを試料槽１０に分注する。試料Ｓは、例えば、５０μＬ分注される。発色試薬溶液槽１１は、酸化発色試薬が溶解された発色試薬溶液ＲＳ１を充填し、保管するための槽である。発色試薬溶液槽１１には、例えば、２００μＬの発色試薬溶液ＲＳ１が充填されている。測光セル１２は、発色試薬溶液ＲＳ１と試料Ｓとが混合された測定液ＲＳ２を収容し、酸化発色試薬が酸化される反応によって生じる呈色を測定するための部分である。希釈槽１３は、試料Ｓを希釈液ＲＳ４により希釈し、希釈試料ＲＳ３を生成するための槽である。希釈液槽１４は、試料Ｓを希釈するために使用する希釈液ＲＳ４を充填するための槽である。希釈液槽１４は、希釈液ＲＳ４を保管するための容器として機能する。希釈液槽１４には、希釈液ＲＳ４が、例えば、４００μＬ充填されている。洗浄液槽１５は、チップ１７を洗浄するための洗浄液ＲＳ５を充填するための槽である。洗浄液槽１５には、洗浄液ＲＳ５が、例えば、４００μＬ充填されている。チップ１７は、試料Ｓ、発色試薬溶液ＲＳ１、希釈液ＲＳ４を、充填された槽から他の槽に移し替えたり、これらの液を混合する際に撹拌したりするのに用いられる。チップ装填箇所１６は、チップ１７を装填し、保持するための箇所である。チップ装填箇所１６は、廃液槽としても使用され、不要になった液が廃棄される。

【0034】

［発色試薬溶液］
発色試薬溶液槽１１に充填された発色試薬溶液ＲＳ１は、酸化発色試薬が溶媒に溶解された液状試薬である。溶媒としては、例えば、水が使用される。発色試薬溶液ＲＳ１において、酸化発色試薬の濃度は、測定液ＲＳ２中で最終的に、０．２〜８ｍＭまたは０．４〜６．４ｍＭになるように調整される。酸化発色試薬は、酸化されると分子内に発色団を生じることにより呈色する。そのため、酸化発色試薬の濃度は、発色試薬溶液ＲＳ１において、例えば、０．２４ｍＭ〜９．６ｍＭまたは０．４８ｍＭ〜７．６８ｍＭに調整される。酸化発色試薬は、酸化されることによりセミキノン色素やキノン色素となって発色する。酸化発色試薬として、フェニレンジアミン誘導体が使用される。特に、ｐ−フェニレンジアミン誘導体が、好ましく使用される。ｐ−フェニレンジアミン誘導体は、特に、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩である。

【0035】

【化1】

【0036】

一般式（Ｉ）において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４は、各々独立に、水素原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、フェニル基、またはハロゲン基である。炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基として、例えば、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基が挙げられる。ヒドロキシエチル基の例として、２−ヒドロキシエチル基が挙げられる。

【0037】

特に、一般式（Ｉ）において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうち少なくとも１つは、メチル基、エチル基、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、フェニル基、またはハロゲン基である。

【0038】

または、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうち２つ以上は、各々独立に、メチル基、エチル基、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、フェニル基、またはハロゲン基である。特に、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうち２つ以上が、各々独立に、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、またはフェニル基を表す場合、同一の基が２つ以上であってもよいし、各々異なる２つ以上の基であってもよい。

【0039】

または、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうち少なくとも１つは、フェニル基であり、かつＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうち少なくとも１つが炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基である。この場合、一般式（Ｉ）で表される化合物において、フェニル基が結合する窒素原子と、前記ヒドロキシアルキル基が結合する窒素原子とは、同一であっても、異なっていてもよい。

【0040】

または、一般式（Ｉ）で示すｐ−フェニレンジアミン誘導体は、上述した置換基Ｒ^１〜Ｒ^４のうちフェニル基以外の置換基をＲ^１〜Ｒ^４として有する化合物である場合には、一般式（Ｉ）で表される化合物の塩であってもよい。この塩の例としては、塩酸塩、硫酸塩、シュウ酸塩、または酢酸塩などが挙げられる。

【0041】

または、ｐ−フェニレンジアミン誘導体は、一般式（Ｉ）において、Ｒ^１が水素原子であり、Ｒ^２が水素原子またはイソプロピル基であり、Ｒ^３が水素原子、エチル基、または炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基であり、Ｒ^４が炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基またはフェニル基である化合物である。この場合、一般式（Ｉ）において、Ｒ^１が水素原子であり、Ｒ^２が水素原子であり、Ｒ^３がエチル基または炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基であり、Ｒ^４が炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基である化合物の塩酸塩、硫酸塩、シュウ酸塩、または酢酸塩などが含まれる。

【0042】

上記したように、ｐ−フェニレンジアミン誘導体には、一般式（Ｉ）において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうち少なくとも１つが炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基である化合物が含まれる。Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうち少なくとも１つが炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基であるｐ−フェニレンジアミン誘導体は、酸化ストレス度測定用試薬として、高感度でシャープな吸収を示す。よって、このｐ−フェニレンジアミン誘導体により、より高精度な酸化ストレス度測定を行なうことが可能となる。

【0043】

また、上記したように、ｐ−フェニレンジアミン誘導体には、一般式（Ｉ）において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうち少なくとも１つがフェニル基である化合物が含まれる。ｐ−フェニレンジアミン誘導体のＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうち少なくとも１つがフェニル基である場合、その分子構造によって異同はあるが、酸化により呈色した色素は、４２０ｎｍ〜８００ｎｍの広範囲な波長領域に吸収波長を有する。

【0044】

このため、例えば、酸化ストレス度測定の生体試料として血液を用いる場合、ヘモグロビンなどの血液成分の存在に起因する干渉による影響を受けない長波長側の波長領域（例えば、６００ｎｍ以上の領域）にも吸収波長を有する上記のｐ−フェニレンジアミン誘導体を選択することにより、高精度の酸化ストレス度測定が可能になる。

【0045】

また、測定感度は測定装置２の種類などにより変動が生じる場合があるが、このｐ−フェニレンジアミン誘導体は広範囲な波長領域に吸収波長を有することから、測定装置２に起因する感度変動を受けにくいという利点がある。特に、測定の光源としてＬＥＤが用いられる場合、ＬＥＤのロット間差に起因して測定感度が変動する場合があるが、このような場合でも、このｐ−フェニレンジアミン誘導体を用いることにより、より精度の高い酸化ストレス度測定が可能になる。

【0046】

本発明における酸化発色試薬として、一般式（Ｉ）で表される化合物の塩を使用した場合は、発色試薬溶液を調製する際における溶媒への溶解性が向上するので、製造上便利である。

【0047】

図３に、酸化発色試薬であるｐ−フェニレンジアミン誘導体の具体例を示す。化学式（ＩＩ）〜（Ｘ）は、それぞれ、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，４−フェニレンジアミン（ＩＩ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−１，４−フェニレンジアミン（ＩＩＩ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−１，４−フェニレンジアミン（ＩＶ）、Ｎ−イソプロピル−Ｎ’−フェニル−１，４−フェニレンジアミン（Ｖ）、Ｎ−フェニル−１，４−フェニレンジアミン（ＶＩ）、Ｎ−イソプロピル−Ｎ−フェニル−１，４−フェニレンジアミン（ＶＩＩ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−１，４−フェニレンジアミン硫酸塩（ＶＩＩＩ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−１，４−フェニレンジアミン硫酸塩（ＩＸ）、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，４−フェニレンジアミン硫酸塩（Ｘ）を示す。但し、本発明における酸化発色試薬は、これらに限定されるものではない。

【0048】

発色試薬溶液ＲＳ１は、水素イオン指数（ｐＨ）条件が強酸性になるように調整されている。発色試薬溶液ＲＳ１は、強酸を添加して水素イオン指数を調整することにより、強酸性とされる。強酸としては、無機強酸および有機強酸のいずれかが使用される。無機強酸としては、例えば、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。有機強酸としては、例えば、乳酸、酢酸、プロピオン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、グリシン、フタル酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、シュウ酸、酒石酸などが挙げられる。また、これらを混合して使用してもよい。

【0049】

発色試薬溶液ＲＳ１において、水素イオン指数は、強酸性に調整される。本発明において、強酸性とは、例えば、ｐＨ３．０未満である。具体的には、発色試薬溶液ＲＳ１において、水素イオン指数は、ｐＨ２．９以下（ｐＨ０〜ｐＨ２．９）、ｐＨ２．５以下（ｐＨ０〜ｐＨ２．５）、ｐＨ２．１以下（ｐＨ０〜ｐＨ２．１）、ｐＨ２．０以下（ｐＨ０〜ｐＨ２．０）、ｐＨ１．０〜ｐＨ２．９、ｐＨ１．０〜ｐＨ２．５、ｐＨ１．０〜ｐＨ２．１、ｐＨ１．０〜ｐＨ２．０、またはｐＨ１．０未満になるように調整される。発色試薬溶液ＲＳ１は、水素イオン指数をチェックしながら、強酸を添加して調整される。本発明において、発色試薬溶液ＲＳ１の調整にあたり、水素イオン指数条件を強酸性としてから酸化発色試薬を溶解させてもよいし、水などの溶媒に酸化発色試薬を溶解させてから水素イオン指数条件を強酸性に調整してもよい。

【0050】

発色試薬溶液ＲＳ１は、強酸濃度を所定の濃度にすることにより、強酸性に調整してもよい。この場合、無機酸または有機酸の濃度は、例えば、０．１Ｍ以上、０．０００１ｍＭ〜１．０Ｍ、０．０１ｍＭ〜１．０Ｍ、および０．１Ｍ〜１．０Ｍのいずれかになるように添加される。

【0051】

調整が完了した発色試薬溶液ＲＳ１は、図１および図２に示すカートリッジ１の発色試薬溶液槽１１に、例えば、２００μＬずつ充填される。

【0052】

［希釈液］
希釈液ＲＳ４は、試料Ｓを希釈するためのものである。また、希釈液ＲＳ４は、発色試薬溶液ＲＳ１を希釈するためのものである。試料Ｓが希釈液ＲＳ４によって希釈されると、希釈試料ＲＳ３が生成する。希釈試料ＲＳ３は発色試薬溶液ＲＳ１と混合され、測定液ＲＳ２が生成する。よって、結果的に、希釈液ＲＳ４は、発色試薬溶液ＲＳ１を希釈することになる。

【0053】

この希釈液ＲＳ４として、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝液、およびＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液などから選択して使用される。これらの緩衝液の内、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、またはＴｒｉｓ−マレイン酸緩衝液が好ましく、酢酸緩衝液が更に好ましい。

【0054】

前記希釈液ＲＳ４の水素イオン指数は、ｐＨ３．６〜ｐＨ５．６またはｐＨ４．６〜ｐＨ５．４の範囲に調整される。希釈液ＲＳ４に含まれる緩衝剤の濃度は、測定液ＲＳ２中で最終的に、１００ｍＭ〜４００ｍＭまたは２００ｍＭ〜４００ｍＭになるように調整される。そのため、緩衝剤の濃度は、希釈液ＲＳ４において、例えば、６６７ｍＭ〜２６６７ｍＭまたは１３３３ｍＭ〜２６６７ｍＭに調整される。発色試薬溶液ＲＳ１の水素イオン指数は、希釈液ＲＳ４により希釈される際に、前記緩衝剤の緩衝作用により、希釈液ＲＳ４の水素イオン指数に変化する。

【0055】

調整が完了した希釈液ＲＳ４は、図１および図２に示すカートリッジ１の希釈液槽１４に、例えば、４００μＬずつ充填される。

【0056】

なお、発色試薬溶液ＲＳ１または希釈液ＲＳ４は、遷移金属塩を含んでいる。この遷移金属塩は、試料Ｓに含まれるヒドロペルオキシド群（Ｒ−ＯＯＨ）から、アルコキシラジカル（Ｒ−Ｏ）およびペルオキシラジカル（Ｒ−ＯＯ）からなるフリーラジカルを生成させるために添加される。前記遷移金属塩として、例えば、硫酸鉄（ＩＩ）（化学式ＦｅＳＯ_４）、硫酸銅（Ｉ）（化学式Ｃｕ_２ＳＯ_４）などが挙げられる。この内、硫酸鉄（ＩＩ）がより好ましい。発色試薬溶液ＲＳ１または希釈液ＲＳ４中の遷移金属塩の濃度は、測定液ＲＳ２中で最終的に、０．０００５ｍＭ〜０．０６ｍＭまたは０．００１ｍＭ〜０．０３ｍＭの範囲になるように調整される。そのため、前記遷移金属塩は、発色試薬溶液ＲＳ１に含まれる場合は、例えば、０．０００６ｍＭ〜０．０７２ｍＭまたは０．００１２ｍＭ〜０．０３６ｍＭの範囲になるように調整される。一方で、前記遷移金属塩は、希釈液ＲＳ４に含まれる場合は、例えば、０．００３ｍＭ〜０．４ｍＭまたは０．００７ｍＭ〜０．２ｍＭの範囲になるように調整される。

【0057】

［チップ］
チップ１７は、図１および図２に示すように、酸化ストレス度を測定するための準備の際に、測定装置２のノズル２１（後述）の先端に装着され、チップ装填箇所１６から取り外される。チップ１７は、測定装置２のサンプリングポンプユニット２１ａの動作により、試料Ｓや発色試薬溶液ＲＳ１などを吸引し、排出する機能を有している。これにより、チップ１７は、カートリッジ１内における各液の移し替えや吸引・排出による撹拌に用いられる。チップ１７は、ポリプロピレンやポリエチレンなどの合成樹脂を用いて製造される。

【0058】

［測定装置］
測定装置２は、カートリッジ１を用いて生体内の酸化ストレス度を測定するためのものである。図１および図２に示すように、測定装置２は、制御部２０、ノズル２１、測光ユニット２２、および温調ブロック２３を具備している。

【0059】

制御部２０は、測定装置２の動作処理を制御するためのものである。図１に示すように、制御部２０は、制御線２４を介して、サンプリングポンプユニット２１ａ、ノズル駆動ユニット２１ｂ、測光ユニット２２、温調ブロック２３などと接続されている。制御部２０は、ＣＰＵとメモリとを有している。上記のサンプリングポンプユニット２１ａなどの構成要素と前記ＣＰＵとの間には、必要に応じてインターフェース回路が配置される。前記ＣＰＵは、前記メモリに記憶されているプログラムを実行することにより、測定装置２の動作処理を制御する。前記メモリは、ＲＯＭ領域とＲＡＭ領域とを備えている。前記ＲＯＭ領域は、測定装置２の動作処理プログラム、パラメータ、検量線等を格納している。前記ＲＡＭ領域は、動作処理プログラム等の他、測光ユニット２２によって取得されたデータを一時的に記憶する。制御部２０は、このデータに基づいて、吸光度を算出する。制御部２０は、前記ＲＯＭ領域に記憶された検量線を用いて、前記吸光度から試料Ｓ中のヒドロペルオキシド濃度を算出し、更には酸化ストレス度を算出する。また、制御部２０は、前記吸光度を直接表示することもできるように構成されている。

【0060】

図１に示すように、ノズル２１は、サンプリングポンプユニット２１ａおよびノズル駆動ユニット２１ｂにより、動作を行うように構成されている。制御部２０は、サンプリングポンプユニット２１ａおよびノズル駆動ユニット２１ｂの動作を制御することにより、ノズル２１の動作を制御する。

【0061】

ノズル２１は、先端にチップ１７を装着し、カートリッジ１内の槽から吸引した液を他の槽に分注したり、混合した液を吸引・排出により混和したりするためのものである。ノズル２１は、測定装置２にセットされたカートリッジ１の上面１８に貼り付けられたシール（図示略）を開封する機能をも有する。ノズル２１は、例えばステンレスなどで形成されており、前記シールを突き破って孔を開けるように構成されている。

【0062】

酸化ストレス度測定に必要な槽や測光セルなどの開口部に孔を開けた後、ノズル２１は、その先端部をチップ装填箇所１６に装填されているチップ１７に挿入し、チップ装填箇所１６からチップ１７を引き抜く。このことにより、ノズル２１にチップ１７が装着される。ノズル２１は、ノズル駆動ユニット２１ｂにより、カートリッジ１の上面１８上を矢印Ｎ１で示す方向に目的の位置まで水平移動し、更に矢印Ｎ２で示す方向に上下動するように構成されている。チップ１７が装着されたノズル２１は、目的の槽の位置まで移動し、下降することにより、チップ１７の先端部を前記槽内の液面に到達させる。ノズル１７は、サンプリングポンプユニット２１ａの動作により、槽または測光セル内の液をチップ１７内に吸引する。その後、ノズル２１は、目的とする別の槽または測光セルまで移動し、チップ１７中に吸引された前記液をそれらに分注して、移し替える。

【0063】

測光ユニット２２は、測光セル１２中の測定液ＲＳ２の呈色を測定するために使用される。図１に示すように、測光ユニット２２は、発光部２２ａおよび受光部２２ｂを有している。発光部２２ａと受光部２２ｂとは、カートリッジ１が測定装置２内にセットされたときに、測光セル１２を挟むように、対向して配置されている。発光部２２ａは、ＬＥＤ（図示略）を有しており、例えば５１０ｎｍの光を矢印Ｎ３で示す方向に照射する。一方、受光部２２ｂは、フォトダイオード（図示略）を有しており、発光部２２ａから発せられ、測光セル１２を通過した光を受光する。測光ユニット２２におけるこのような発光、受光の制御は、制御部２０によって行われる。

【0064】

温調ブロック２３は、カートリッジ１を酸化ストレス度の測定に適した温度に調節するためのものである。温調ブロック２３には、ヒータ（図示略）が組み込まれている。制御部２０は、前記ヒータのオン・オフを制御することにより、カートリッジ１の温度が所定の範囲になるように制御する。制御部２０は、カートリッジ１を、例えば３７℃になるように制御する。

【0065】

［酸化ストレス度の測定］
ここで、図４に示すフロー図により、カートリッジ１および測定装置２を使用して、酸化ストレス度の測定を行なう手順の一例を説明する。測定装置２の動作は、制御部２０によって制御される。酸化ストレス度を測定するｄ−ＲＯＭｓテスト（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）においては、生体の活性酸素・フリーラジカルが直接計測されるのではない。それらにより生じたヒドロペルオキシド（Ｒ−ＯＯＨ）濃度が呈色反応を用いて測定され、生体内の酸化ストレス度が総合的に評価される。なぜなら、ヒドロペルオキシド（Ｒ−ＯＯＨ）は、活性酸素・フリーラジカルによって酸化反応を受けた脂質、蛋白質、アミノ酸、核酸などの総称であり、酸化ストレス度のマーカーとなるからである。

【0066】

図２に示すように、カートリッジ１の発色試薬溶液槽１１、希釈液槽１４、洗浄液槽１５には、それぞれ規定量の発色試薬溶液ＲＳ１、希釈液ＲＳ４、洗浄液ＲＳ５が充填されている。測定作業者は、ピペットなどを用いて試料槽１０に、例えば、試料５０μＬを分注する。この例では、試料Ｓとして例えば血漿が用いられる。次に、測定作業者は、測定装置２へカートリッジ１をセットする。次に、測定作業者は、測定装置２の蓋（図示略）を閉めて、スタートボタン（図示略）を押す。これ以降、測定装置２が、自動的に動作し、酸化ストレス度を測定する。

【0067】

ノズル２１が、図２において矢印で示すように下降して、チップ装填箇所１６に装填されているチップ１７を先端に装着する（Ｓ１）。チップ１７を装着したノズル２１は、矢印Ｎ１で示すように各槽間を移動し、各槽において矢印Ｎ２で示すように上下動する。チップ１７を装着したノズル２１は、カートリッジ１上を希釈液槽１４まで移動し、希釈液ＲＳ４を吸引する。その後、ノズル２１は、希釈槽１３に移動し、１２６μＬの希釈液ＲＳ４を希釈槽１３に分注する（Ｓ２）。その後、ノズル２１は、試料槽１０に移動し、試料Ｓを吸引した後、希釈槽１３へ移動し、１４μＬの試料を希釈槽１３へ分注する（Ｓ３）。その後、ノズル２１は、洗浄液槽１５へ移動し、洗浄液ＲＳ５を吸引・排出してチップ１７の先端および内部を洗浄する（Ｓ４）。

【0068】

希釈液ＲＳ４は、酢酸緩衝液であり、水素イオン指数がｐＨ５．０に調整されている。これにより、試料の水素イオン濃度が安定化される。更に、希釈液ＲＳ４中には、遷移金属塩として、硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ_４）が、測定液ＲＳ２中で最終的に、０．０３ｍＭになるように含まれている。そのため、希釈液ＲＳ４中の遷移金属塩の濃度は、例えば、０．２ｍＭに調整されている。遷移金属塩の働きにより、生体中での酸化の過程で形成されたヒドロペルオキシド群（Ｒ−ＯＯＨ）から、アルコキシラジカル（Ｒ−Ｏ）およびペルオキシラジカル（Ｒ−ＯＯ）からなるフリーラジカルが生成する。

【0069】

次に、ノズル２１は、発色試薬溶液槽１１の位置まで移動し、発色試薬溶液ＲＳ１を吸引した後、１５０μＬの発色試薬溶液ＲＳ１を測光セル１２へ分注する（Ｓ５）。次に、ノズル２１は、希釈槽１３に移動し、希釈試料ＲＳ３を吸引した後、測光セル１２の位置に移動し、３０μＬの希釈試料ＲＳ３を測光セル１２へ分注する（Ｓ６）。これにより、測定液ＲＳ２の液量は、１８０μｌとなる。ノズル２１は、測光セル１２中の発色試薬溶液ＲＳ１と希釈試料ＲＳ３とが混合した測定液ＲＳ２を吸引・排出することにより、撹拌する（Ｓ７）。温調ブロック２３は、測光セル１２を５分間３７℃で保温する。その後、測光ユニット２２が、５１０ｎｍの吸光度を測定する（Ｓ８）。制御部２０は、前もって設定された検量線を用いて、前記吸光度からヒドロペルオキシド濃度を算出する（Ｓ９）。制御部２０は、最終的に、前記ヒドロペルオキシド濃度から酸化ストレス度を算出する。

【0070】

発色試薬溶液ＲＳ１には、酸化発色試薬としてＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−１，４−フェニレンジアミン硫酸塩が溶解されており、例えば、硫酸を添加することにより、強酸性とされている。酢酸緩衝液を含む希釈試料ＲＳ３が添加された時点で、測定液ＲＳ２の水素イオン指数は、呈色反応に適したｐＨ５．０に変化する。この酸化発色試薬は、測光セル１２中で、フリーラジカルに触れると酸化され、フリーラジカルの量に応じてラジカル陽イオンに変化し、赤紫色に呈色する。赤紫色の呈色の強さは血中にあるヒドロペルオキシドの濃度を反映し、活性酸素・フリーラジカルの影響を受けた細胞、分子の副産物である活性酸素代謝物（ＲＯＭｓ）の量と直接的に比例する。

【0071】

なお、試料Ｓとして、全血を測定する場合には、酸化発色試薬として、一般式（Ｉ）のＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうち少なくとも１つがフェニル基である化合物を使用することができる。上記したように、この構造を有する酸化発色試薬が酸化により呈色した場合、４２０ｎｍ〜８００ｎｍの広範囲な波長領域に吸収波長を有する色素が生じる。これにより、ヘモグロビンの吸収を避けた測定波長で、測定ができる。その測定波長として、例えば６００ｎｍ以上の波長が採用される。

【0072】

以上のように、本実施形態によれば、発色試薬溶液ＲＳ１は、強酸性とされている。これにより、溶解されているｐ−フェニレンジアミン誘導体などの酸化発色試薬が安定化されるため、酸化発色試薬が溶解された発色試薬溶液ＲＳ１のバックグラウンドの上昇を抑制することができる。この際、酸化発色試薬の反応性は、劣化することなく、維持される。よって、酸化発色試薬を液状試薬として調整・輸送・保管することが可能となる。このことにより、酸化ストレス度を測定する直前に、酸化発色試薬を溶媒に溶解する手間が省けるので、測定作業者にとって便利である。また、迅速に、精度の良い測定データを得ることが可能となる。

【0073】

測定に自動測定装置を使用する場合、酸化ストレス度を測定する直前に乾燥酸化発色試薬を水などの溶媒に溶解する動作を、前記自動測定装置が実行する仕様とされている場合がある。このような自動測定装置においては、前記乾燥酸化発色試薬の再溶解を十分に行うことが、測定精度を確保する上で重要な要因となる。しかしながら、前記乾燥酸化発色試薬の溶解が前記自動測定装置によって十分に行われないため、測定精度が悪化する場合がある。これに対し、本実施形態によれば、測定装置２による乾燥酸化発色試薬の溶解が必要ないので、測定装置２に対する負担が少なくなる。測定装置２の製造コストの削減に寄与することもできる。また、酸化発色試薬が完全溶解した発色試薬溶液ＲＳ１をそのまま使用できるので、測定精度を良い状態に保つことができる。よって、本実施形態の発色試薬溶液ＲＳ１は、自動的に酸化ストレス度の測定を行う測定装置２に使用するのに適している。

【0074】

凍結乾燥試薬などの乾燥試薬を製造するには、酸化発色試薬を溶解した溶解液を精度よく分注する分注設備が必要であったり、凍結乾燥設備が必要であったりする。本実施形態によれば、酸化発色試薬を液状試薬として調整・輸送・保管できるので、酸化ストレス度測定用カートリッジ１を製造するに際し、特別な分注設備や乾燥設備が必要ない。このことにより、酸化ストレス度測定用カートリッジ１の製造コストの低減を図ることができる。

【0075】

カートリッジ１は、発色試薬溶液ＲＳ１を希釈するための希釈液ＲＳ４を更に含んでおり、希釈液ＲＳ４は、緩衝剤により呈色反応に適した所定の水素イオン指数に調整されている。これにより、強酸性に調整された発色試薬溶液ＲＳ１の水素イオン指数は、希釈液ＲＳ４によって希釈されることにより、希釈液ＲＳ４の水素イオン指数に変化するようにされている。これにより、酸化ストレス度を精度良く測定することが可能である。

【0076】

本発明は、上述した実施形態の内容に限定されない。本発明に係る発色試薬溶液のバックグラウンドの上昇抑制方法の工程の具体的な構成は、種々に変更自在である。同様に、本発明に係る発色試薬溶液、試薬キット、およびその試薬キットを使用する測定装置の具体的な構成は、種々に設計変更自在である。

【0077】

本発明において、試薬キットは、複数の槽や測光セルを有するカートリッジ１に限らない。試薬キットには、酸化発色試薬が溶解された強酸性の発色試薬溶液を充填した容器と、遷移金属塩が溶解された、試料Ｓを希釈するための希釈液ＲＳ４を充填した容器とをセットにしたものも含まれる。

【0078】

また、本発明において、測定装置は、カートリッジ１を測定する測定装置２に限らない。ボトルから試薬を吸引し、その試薬をボトルとは別体として準備した測光セルに分注し、呈色の変化を測定する測定装置も含まれる。

【0079】

また、本発明において、酸化発色試薬は、フェニレンジアミン誘導体に限らない。酸化発色試薬は、テトラメチルベンチジンやオルトトリジンなどのベンチジン誘導体も含まれる。また、酸化発色試薬には、トリンダー試薬やフェノチアジン誘導体も含まれる。

【実施例】

【0080】

以下、実施例に基づいて、本発明の効果を具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

【0081】

［実施例１］
図５に示す処方に従い、比較発色試薬溶液（１）、（２）、発色試薬溶液（１）、（２）を調製した。発色試薬溶液（１）、（２）は、硫酸を添加することにより強酸性としたものである。酸化発色試薬として、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−１，４−フェニレンジアミン硫酸塩またはＮ−エチル−Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)−１，４−フェニレンジアミン硫酸塩を使用した。発色試薬溶液（１）、（２）における硫酸濃度は、０．１Ｍとした。なお、比較発色試薬溶液（１）、（２）は、硫酸を添加しないことを除き、発色試薬溶液（１）、（２）と同一の組成とした。
各試薬溶液の調整直後の着色を確認した後、４０℃、１４日間保管し、バックグラウンド着色の程度を目視にて比較した。着色が強いほど、バックグラウンド上昇が大きいことを示す。

【0082】

図６に示すように、調整直後においては、比較発色試薬溶液（１）、（２）、発色試薬溶液（１）、（２）とも透明であり、相違はなかった。４０℃、１４日間保管した後は、比較発色試薬溶液（１）、（２）はどちらも紫色に強く着色した。一方で、発色試薬溶液（１）、（２）は、それぞれ、わずかにピンクまたは透明であった。これにより、強酸性下で保管した方が、バックグラウンドの上昇が抑制されることが分かった。

【0083】

［実施例２］
図７に示す処方に従い、比較発色試薬溶液（３）および発色試薬溶液（３）〜（８）を調整した。酸化発色試薬として、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−１，４−フェニレンジアミン硫酸塩を使用した。酸化発色試薬の濃度は、３．２ｍＭとした。強酸としては、硫酸、塩酸、乳酸、酢酸、プロピオン酸、ｐ−トルエンスルホン酸を使用した。それぞれの強酸を添加することにより、各発色試薬溶液の水素イオン指数を図７に示すように調整した。各発色試薬溶液を４０℃の条件で保管し、調整直後、３日目、７日目に、バックグラウンドの着色を測定した。測定は、発色試薬溶液（３）〜（８）を、個別に、カートリッジ１の測光セル１２に分注し、測定装置２を５１０ｎｍの吸光度を表示できるように設定して行った。なお、比較発色試薬溶液（３）の測定は、強酸を添加しないことを除き、発色試薬溶液（３）〜（８）と同一条件で行った。

【0084】

結果を図８〜図１３に示す。図８〜図１３は、それぞれ発色試薬溶液（３）〜（８）と比較発色試薬溶液（３）との比較結果である。各グラフにおいて、縦軸は５１０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は４０℃での保管日数を示す。吸光度の変化が大きいほど、バックグラウンド上昇が大きいことを示す。各発色試薬溶液のグラフは、強酸の種類にかかわらず同様の傾向を示した。すなわち、強酸の種類というよりも、水素イオン指数が低い保管条件ほど、バックグラウンド上昇の程度が小さくなる傾向がみられた。

【0085】

本発明のカートリッジは、冷蔵条件（４℃以下）での保存を前提としている。冷蔵による保存においては、４０℃での保存よりも圧倒的に良好な保存安定性が見込まれる。冷蔵保存を想定した場合、比較発色試薬溶液（３）との比較から、比較的短期間であれば、ｐＨ２．９以下の条件で、バックグラウンドの着色が抑制され得ることが確認された。また、ｐＨ２．１以下の条件とすれば、長期間の保存でも、バックグラウンド上昇が、抑制され得ることが確認された。

【0086】

［実施例３］
図１４に示す処方に従い、比較発色試薬溶液（４）および発色試薬溶液（９）を調整した。酸化発色試薬として、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−１，４−フェニレンジアミン硫酸塩を使用した。発色試薬溶液（９）において、酸化発色試薬の濃度は、３．２ｍＭとした。強酸としては、ｐ−トルエンスルホン酸を使用した。発色試薬溶液（９）におけるｐ−トルエンスルホン酸の濃度は、０．１Ｍになるように調整した。なお、比較発色試薬溶液（４）は、強酸を添加しないことを除き、発色試薬溶液（９）と同一条件とした。

【0087】

比較発色試薬溶液（４）および発色試薬溶液（９）を、４０℃、１４日間保管し、調整直後と保管後との反応性を比較した。

【0088】

測定に際し、試料Ｓとして、ｔ−ブチルペルオキシド（ｔ−ＢｕＯＯＨ）の水溶液を使用した。ｔ−ブチルペルオキシドは、ヒドロペルオキシド（Ｒ−ＯＯＨ）の標準物質として用いられる。ｔ−ブチルペルオキシド溶液は、最終的な測定液ＲＳ２における濃度（質量％）が、０％、０．０２５％、０．２５％になるように調整した。
希釈液ＲＳ４は、最終的な測定液ＲＳ２において、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の濃度が３００ｍＭ、ＦｅＳＯ_４の濃度が０．０３ｍＭとなるように調整した。そのため、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の濃度を、２０００ｍＭに調整した。また、ＦｅＳＯ_４の濃度を、前記酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）において０．２ｍＭになるように調整した。

【0089】

測定は、測定システムＡを用いて、図４に示す測定フローに従って行った。その際、測定装置２を５１０ｎｍの吸光度を表示できるように設定した。
すなわち、カートリッジ１の発色試薬溶液槽１１、希釈液槽１４に、それぞれ規定量の発色試薬溶液（９）および前記酢酸緩衝液を充填した。また、試料槽１０に前記ｔ−ブチルペルオキシド溶液５０μＬを分注した。次に、カートリッジ１を測定装置２にセットし、測定をスタートさせた。測定装置２のノズル２１は、チップ１７を先端に装着し、希釈液槽１４の前記酢酸緩衝液１２６μＬを希釈槽１３に分注した。次に、ノズル２１は、試料槽１０の前記ｔ−ブチルペルオキシド溶液を吸引し、その１４μＬを希釈槽１３へ分注した。

【0090】

その後、ノズル２１は、発色試薬溶液槽１１の発色試薬溶液（９）を吸引し、その１５０μＬを測光セル１２へ分注した。次に、ノズル２１は、希釈槽１３から前記ｔ−ブチルペルオキシド溶液と前記酢酸緩衝液とからなる希釈試料ＲＳ３を吸引し、３０μＬの希釈試料ＲＳ３を測光セル１２へ分注した。ノズル２１は、吸引・排出により測光セル１２中の液を撹拌し、混合液を測定液ＲＳ２とした。その後、温調ブロック２３が測光セル１２を５分間３７℃で保温し、測光ユニット２２が、５１０ｎｍの吸光度を測定した。
比較発色試薬溶液（４）についても、同様に測定を行った。

【0091】

測定結果を図１５に示す。グラフにおいて、縦軸は５１０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸はｔ−ブチルペルオキシドの濃度を示す。発色試薬溶液ＲＳ１にｐ−トルエンスルホン酸を添加し、強酸性とした方が、吸光度が高く、保管後も良好な反応性を有していた。すなわち、強酸性条件とした発色試薬溶液（９）は、強酸性としていない比較発色試薬溶液（４）と比較して、バックグラウンド着色が抑制されると共に、酸化発色試薬の反応性も保持されていることが分かった。

【0092】

以上の通り、本発明によれば、酸化発色試薬が溶解された発色試薬溶液ＲＳ１をバックグラウンドの上昇を抑制して輸送・保管することができることが明らかとなった。

【符号の説明】

【0093】

Ａ 測定システム
１ カートリッジ
２ 測定装置
Ｓ 試料
１０ 試料槽
１１ 発色試薬溶液槽
１２ 測光セル
１３ 希釈槽
１４ 希釈液槽
１５ 洗浄液槽
１６ チップ装填箇所
１７ チップ
２１ ノズル
２２ 測光ユニット
２３ 温調ブロック
ＲＳ１ 発色試薬溶液
ＲＳ２ 測定液
ＲＳ３ 希釈試料
ＲＳ４ 希釈液
ＲＳ５ 洗浄液

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】