特許 6538071 非天然発生のブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）及び使用する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6538071

(24)【登録日】2019年6月14日

(45)【発行日】2019年7月3日

(54)【発明の名称】非天然発生のブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）及び使用する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/40 20060101AFI20190625BHJP

   C12N 7/04 20060101ALI20190625BHJP

   C07K 14/08 20060101ALI20190625BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20190625BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20190625BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/40ZNA

   C12N7/04

   C07K14/08

   A61K39/12

   A61P31/12 171

【請求項の数】11

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2016-559325(P2016-559325)

(86)(22)【出願日】2015年3月25日

(65)【公表番号】特表2017-510276(P2017-510276A)

(43)【公表日】2017年4月13日

(86)【国際出願番号】IB2015052214

(87)【国際公開番号】WO2015140774

(87)【国際公開日】20150924

【審査請求日】2018年2月22日

(73)【特許権者】

【識別番号】512259123

【氏名又は名称】ニューテック・ベンチャーズ

(73)【特許権者】

【識別番号】513016884

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ イリノイ

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＴＲＵＳＴＥＥＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＩＬＬＩＮＯＩＳ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ヒープ・ライ・シュアン・ヴ

(72)【発明者】

【氏名】フェルナンド・オソリオ

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアム・ダブリュー・レイグリード

(72)【発明者】

【氏名】アシット・ケー・パトナイク

(72)【発明者】

【氏名】ファンルイ・マ

【審査官】 堂畑 厚志

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５０６１２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１５−５０９７０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５００７２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５２３７２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５２０６０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５０４３１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Vaccine，２００８年，vol. 26, no. 40，p. 5128-5134

【文献】 Virus Genes，２００５年，vol. 31, no. 1，p. 81-87

【文献】 Journal of Virology，２０１５年，vol. 89, no. 23，p. 12070-12083

【文献】 Veterinary Microbiology，２０１１年，vol. 154，p. 58-68

【文献】 Can. J. Vet. Res.，１９９８年，vol. 62，p. 170-177

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ／ＵｎｉＰｒｏｔ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号1と少なくとも98%の配列同一性を有する、PRRSV-CON核酸。

【請求項2】

配列番号1と少なくとも99%の配列同一性を有する、請求項1に記載の核酸。

【請求項3】

配列番号1に示された配列を有する、請求項1に記載の核酸。

【請求項4】

請求項1から3のいずれか一項に記載のPRRSV-CON核酸を含むウイルス粒子。

【請求項5】

請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸及び薬学的に許容される担体を含む組成物。

【請求項6】

請求項4に記載のウイルス粒子及び薬学的に許容される担体を含む組成物。

【請求項7】

アジュバントを更に含む、請求項5又は6に記載の組成物。

【請求項8】

ブタにおいてPRRSVに対する免疫応答を誘発するための方法であって、
(i)請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸の有効量;
(ii)請求項4に記載のウイルス粒子の有効量;又は
(iii)請求項5から7のいずれか一項に記載の組成物の有効量
をブタに投与する工程を含む方法。

【請求項9】

投与が筋肉内、腹腔内、及び経口投与からなる群から選択される、請求項8に記載の方法。

【請求項10】

ブタにおいてPRRSを処置又は予防するための方法であって、
(i)請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸の有効量;
(ii)請求項4に記載のウイルス粒子の有効量;又は
(iii)請求項5から7のいずれか一項に記載の組成物の有効量
をブタに投与する工程を含む方法。

【請求項11】

投与が筋肉内、腹腔内、及び経口投与からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、2014年3月21日に出願された米国出願第61/968,465号への合衆国法典第35条第119条(e)に基づく優先権の利益を主張する。

【0002】

本開示は、一般に、非天然発生のブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)及び使用する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

現在のブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)ワクチンは、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRS)の制御及び根絶に十分に効果的ではない。現在のPRRSVワクチンの主な限定は、多岐にわたるPRRSV株に対するそれらの最適以下の適用範囲である。今までのところ、全ての市販のPRRSVワクチンは、天然PRRSV株を使用して製剤化されているが、PRRSV株間の実質的な遺伝的変異は、広く防御的なPRRSVワクチンの開発の最も大きい障壁である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】米国特許第4,683,195号

【特許文献2】米国特許第4,683,202号

【特許文献3】米国特許第4,800,159号

【特許文献4】米国特許第4,965,188号

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Chennaら2003、Nucleic Acids Res.、31(13):3497〜500

【非特許文献2】Dayhoffら(1978、in Atlas of Protein Sequence and Structure、5(Suppl. 3):345〜352)

【非特許文献3】PCR Primer: A Laboratory Manual、Dieffenbach及びDveksler編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1995

【非特許文献4】PCR Primer: A Laboratory Manual、1995、Dieffenbach及びDveksler編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY

【非特許文献5】Sambrookら(1989、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY;7.37〜7.57章、9.47〜9.57、11.7〜11.8、及び11.45〜11.57)

【非特許文献6】Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol編、Mack Publishing Co.、Easton、Pa. (1980)

【非特許文献7】Remington's Pharmaceutical Sciences、第19版、Gennaro編、Mack Publishing Co.、Easton、Pa. (1995)

【非特許文献8】Edgar RC、2004、BMC Bioinform.、5: 113

【非特許文献9】Truongら、2004、Virology、325:308〜19

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、非天然発生のブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)並びに非天然発生のPRRSVを作製及び使用する方法を提供する。

【0007】

PRRSV-CON核酸が提供され、ここで、核酸は、配列番号1と少なくとも50%の配列同一性(例えば、少なくとも75%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性)を有する。一部の実施形態では、核酸は、配列番号1に示された配列を有する。本明細書に記載されたPRRSV-CON核酸を含むウイルス粒子。本明細書に記載されたPRRSV-CON核酸及び薬学的に許容される担体を含む組成物。本明細書に記載されたウイルス粒子及び薬学的に許容される担体を含む組成物。アジュバントを更に含む、本明細書に記載された組成物。

【0008】

また、PRRSV-CON核酸が提供され、ここで、核酸は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、及び42からなる群から選択される配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも99%)の配列同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、及び42からなる群から選択される配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、それぞれ、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41及び43からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。本明細書に記載されたPRRSV-CON核酸を含むウイルス粒子。本明細書に記載された核酸及び薬学的に許容される担体を含む組成物。本明細書に記載されたウイルス粒子及び薬学的に許容される担体を含む組成物。アジュバントを更に含む、本明細書に記載された組成物。

【0009】

PRRSV-CONポリペプチドが提供され、ここで、ポリペプチドは、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41及び43からなる群から選択される配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも99%)の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41及び43からなる群から選択される配列を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、又は42からなる群から選択される配列をそれぞれ有する核酸によってコードされる。本明細書に記載されたPRRSV-CONポリペプチドを含むウイルス粒子。本明細書に記載されたポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む組成物。本明細書に記載されたウイルス粒子及び薬学的に許容される担体を含む組成物。アジュバントを更に含む、本明細書に記載された組成物。

【0010】

ブタにおいてPRRSVに対する免疫応答を誘発するための方法が提供される。かかる方法は、(i)本明細書に記載された核酸のいずれかの有効量;(ii)本明細書に記載されたポリペプチドのいずれかの有効量;(iii)本明細書に記載されたウイルス粒子のいずれかの有効量;又は(iv)本明細書に記載された組成物のいずれかの有効量をブタに投与することを典型的に含む。投与の代表的な経路は、これらに限定されないが、筋肉内、腹腔内、及び経口が挙げられる。

【0011】

ブタにおいてPRRSを処置又は予防するための方法が提供される。かかる方法は、(i)本明細書に記載された核酸のいずれかの有効量;(ii)本明細書に記載されたポリペプチドのいずれかの有効量;(iii)本明細書に記載されたウイルス粒子のいずれかの有効量;又は(iv)本明細書に記載された組成物のいずれかの有効量をブタに投与することを典型的に含む。投与の代表的な経路は、これらに限定されないが、筋肉内、腹腔内、及び経口が挙げられる。

【0012】

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、方法及び物質の組成物が属する技術の当業者によって通例理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似した又は同等の方法及び材料が方法及び物質の組成物の実行又は試験において使用され得るが、適した方法及び材料が以下に記載される。更に、材料、方法、及び例は単なる例示であり、限定することは意図されていない。本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれている。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】パネル(A)は、60種のPRRSVの全ゲノム配列のセットから構築された系統樹である。これらの60種のPRRSVのゲノムは、4つの亜群に分類される。交差防御実験に関与するウイルスの位置が矢印によって示されている。パネル(B)は、天然PRRSV株間の遺伝的距離及び本明細書に記載されたPRRSV-CONから天然PRRSV株への遺伝的距離を示すグラフである。ボックスの下方及び上方境界線は、それぞれ、25及び75パーセンタイルを示す。ボックス内の実線は、中央値を表す。ボックスの上及び下のひげは、データの最小値及び最大値を示す。

【図2】PRRSV-CONウイルスの産出及び特徴付けを示す図である。パネル(A)は、PRRSV-CON全ゲノムcDNAクローンを構築するための戦略を示す概略図である。パネル(A)の上半分は、クローニング目的で使用される固有の制限酵素部位と一緒に、ウイルスゲノムの概略図を示す。上部に文字A〜Dを有する水平の黒線は、合成されたDNA断片を表す。線の下の括弧内の数は、各相当する断片の長さ(ヌクレオチドでの)を示す。ΦT7は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターを表す。ゲノムの個々のDNA断片を断片Aから断片Dの順でシャトルベクター(パネル(A)の下半分に示された)中に順次挿入した。パネル(B)は、種々のPRRSV特異的モノクローナル抗体との示されたウイルスの反応性を示す写真である。MARC-145細胞をモック感染させた又はPRRSV-CON若しくはPRRSV野生型株、FL12に感染させた。感染後48時間で、細胞を、ウイルスヌクレオカプシドタンパク質(Nタンパク質;写真の下の段)に又はウイルス非構造タンパク質1ベータ(nsplb;写真の上の段)に特異的な抗体で染色した。パネル(C)は、複数ステップ増殖曲線を示す。MARC-145細胞を0.01の感染多重度(MOI)で示されたウイルスに感染させた。感染後(p.i.)の種々の時点で、培養上清を回収し、ウイルス力価をMARC-145細胞上での滴定によって決定した。パネル(D)は、MARC-145細胞におけるウイルスのプラーク形態を示す。

【図3】豚におけるPRRSV-CONの複製を実証するデータである。パネル(A)は、感染前1日から感染後13日(p.i.の日数)まで毎日測定された直腸温度を示す。パネル(B)は、接種後14日以内の1日当たりの平均体重増加(ADWG)を示す。パネル(C)は、市販のユニバーサルRT-qPCR(Tatracore社、Rockville、MD)によって決定されるウイルス血症レベルを示す。パネル(D)は、IDEXX ELISAによって決定される接種後の抗体応答のレベルを示す;水平の点線は、アッセイのカットオフを示す。

【図4】PRRSV-株、MN-184に対する本明細書に記載されたPRRSV-CONによって提供された交差防御を実証するデータである。パネル(A)は、負荷-感染後15日以内の1日当たりの平均体重増加(ADWG)を示す。パネル(B)は、市販のユニバーサルRT-qPCR(Tetracore社、Rockville、MD)によって決定される負荷後のウイルス血症レベルを示す。パネル(C)は、市販のユニバーサルRT-qPCR(Tetracore社、Rockville、MD)によって決定される負荷後15日に回収された種々の組織における全ウイルスRNAレベルを示す。パネル(D)は、社内で開発されたディファレンシャルRT-qPCRによって決定されるMN-184特異的RNAレベルを示す。

【図5】PRRSV株、16244Bに対する交差防御を実証するデータである。パネル(A)は、負荷-感染後15日以内の1日当たりの平均体重増加(ADWG)を示す。パネル(B)は、市販のユニバーサルRT-qPCR(Tetracore社、Rockville、MD)によって決定される負荷感染後のウイルス血症レベルを示す。パネル(C)は、市販のユニバーサルRT-qPCR(Tetracore社、Rockville、MD)によって決定される負荷後15日に回収された種々の組織における全ウイルスRNAレベルを示す。パネル(D)は、社内で開発されたディファレンシャルRT-qPCRによって決定される16244B特異的RNAレベルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

非天然発生のブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)ゲノムを、米国養豚業者において流通しているPRRSV株の最も広い遺伝的多様性を表すPRRSV単離物のゲノム配列の大きいセットを使用して設計した。非天然発生のPRRSVゲノムを、任意の単一、天然発生のPRRSV株と比較した場合、それが研究されたPRRSV分野単離物との高度の遺伝的類似性を有するように設計した。

【0015】

ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRS)は、ブタにおいて最も経済的に重要な疾患の1つである。疾患の臨床徴候は、妊娠中の雌ブタにおける生殖不全及び若い豚における呼吸障害を含む。疾患は、動物が他の病原体に同時感染している場合、より重症である。米国ブタ産業への年間損失は、2005年に約5億6千万ドル及び2011年に約6億4千万ドルであると推定された。

【0016】

PRRSの原因物質は、PRRSウイルス(PRRSV)と命名されたRNAウイルスである。PRRSVは、2つの主要な遺伝子型:ヨーロッパ(1型)及び北アメリカ(2型)に分類される。これら2つの遺伝子型間に限定された交差防御がある。考慮すべき遺伝的変異がこれらの遺伝子型のそれぞれ内のPRRSV単離物間に存在する。重要なことに、遺伝的分岐は、PRRSV株が豚から豚へ連続的に伝えられた場合に生じることが示された。これは、1つの群れ内の又はそれどころかPRRSVに持続的に感染している1つの動物内の複数のPRRSV変異体の同時循環につながる。

【0017】

PRRSVワクチンは、1994年から使用されている。2つの型の市場で現在入手可能なPRRSVワクチン;改変生及び不活化ワクチンがある。更に、PRRSVに対するいくつかのサブユニットワクチンが世界的に種々の研究室において試験されているが、臨床適用を許可されたものはない。現在、PRRSVワクチンは、ワクチン免疫原として天然発生のPRRSV株を使用して調製される。現在のPRRSVワクチンは、PRRSの制御及び根絶に十分に効果的ではない;それらは、相同防御の容認できるレベルを提供するが、それらは、一貫した異種交差防御を提供できない。PRRSV単離物間の広範な遺伝的多様性は、現在のPRRSVワクチンの最適以下の異種防御の主要な理由である。

【0018】

本明細書に記載された非天然発生のPRRSV-CONは、PRRSV野生型株FL12と比較して、種々の異種PRRSV株に対するより優れた交差防御を与える。したがって、本明細書に記載されたPRRSV-CONは、普遍的PRRSVワクチンを製剤化するために使用され得る。更に、本明細書に記載されたPRRSV-CONは、多岐にわたるPRRSV株に対する異種防御の機構を研究するための重要なツールを提供する。

【0019】

核酸及びポリペプチド
PRRSVゲノムは、少なくとも22のタンパク質;14の非構造タンパク質及び8の構造タンパク質をコードする。非天然発生のPRRSVをコードする核酸が本明細書で提供される。PRRSV-CONのゲノム配列に関して配列番号1を参照されたい。本明細書に記載された非天然発生のPRRSVは、天然発生のPRRSV単離物との最高度の遺伝的同一性を有する。本明細書で提供されたPRRSV-CONゲノム核酸(すなわち、配列番号1)は、いくつかの異なるポリペプチドをコードする。例えば、配列番号2に示された核酸配列は、配列番号3に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号4に示された核酸配列は、配列番号5に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号6に示された核酸配列は、配列番号7に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号8に示された核酸配列は、配列番号9に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号10に示された核酸配列は、配列番号11に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号12に示された核酸配列は、配列番号13に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号14に示された核酸配列は、配列番号15に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号16に示された核酸配列は、配列番号17に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号18に示された核酸配列は、配列番号19に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号20に示された核酸配列は、配列番号21に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号22に示された核酸配列は、配列番号23に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号24に示された核酸配列は、配列番号25に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号26に示された核酸配列は、配列番号27に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号28に示された核酸配列は、配列番号29に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号30に示された核酸配列は、配列番号31に示されたアミノ酸配
列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号32に示された核酸配列は、配列番号33に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号34に示された核酸配列は、配列番号35に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号36に示された核酸配列は、配列番号37に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号38に示された核酸配列は、配列番号39に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;配列番号40に示された核酸配列は、配列番号41に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする;及び配列番号42に示された核酸配列は、配列番号43に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列をコードする。

【0020】

本明細書では、核酸は、DNA及びRNAを含み得、1つ又は複数のヌクレオチド類似体又は主鎖修飾を含有する核酸を含む。核酸は、一本鎖又は二本鎖とすることができ、これは、その意図された使用に通常依存する。配列番号1〜43とは異なる核酸及びポリペプチドも提供される。配列において配列番号1又は配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、若しくは42のいずれとも異なる核酸は、配列番号1又は配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、若しくは42のいずれかと少なくとも80%の配列同一性(例えば、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性)を有し得る。配列において配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41又は43のいずれとも異なるポリペプチドは、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41又は43のいずれかと少なくとも80%の配列同一性(例えば、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性)を有し得る。

【0021】

パーセント配列同一性を計算することにおいて、2つの配列が整列され、2つの配列間のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一マッチの数が決定される。同一マッチの数を整列した領域の長さ(すなわち、整列したヌクレオチド又はアミノ酸残基の数)で割り、100を掛けることにより、パーセント配列同一性値が得られる。整列した領域の長さは、一方又は両方の配列の部分から最も短い配列の全長サイズまでとすることができることが理解されよう。単一配列を1つより多くの他の配列と整列させてもよく、したがって、整列した領域それぞれにわたって種々のパーセント配列同一性値を有し得ることも理解されよう。

【0022】

パーセント配列同一性を決定するための2つ以上の配列の整列が、核酸又はポリペプチド配列の整列がそれらの全長にわたって行われること(包括的整列)を可能にするコンピュータープログラムClustalW及びデフォルトパラメーターを使用して、行われ得る。Chennaら、2003、Nucleic Acids Res.、31(13):3497〜500。ClustalWは、問い合わせと1つ又は複数の対象配列間のベストマッチを計算し、同一性、類似性及び差異が決定され得るようにそれらを整列させる。1つ又は複数の残基のギャップが問い合わせ配列、対象配列、又は両方に挿入されて、配列アラインメントを最大にし得る。核酸配列の速い対での整列に関して、デフォルトパラメーターが使用され得る(すなわち、ワードサイズ:2;ウインドウサイズ:4;スコアリング法:百分率;トップダイアゴナル(top diagonal)の数:4;及びギャップペナルティ:5);複数の核酸配列の整列に関して、以下のパラメーターが使用され得る:ギャップ開始ペナルティ:10.0;ギャップ伸長ペナルティ:5.0;及び質量移行:yes。ポリペプチド配列の速い対での整列に関して、以下のパラメーターが使用され得る:ワードサイズ:1;ウインドウサイズ:5;スコアリング法:百分率;トップダイアゴナルの数:5;及びギャップペナルティ:3。ポリペプチド配列の複数の整列に関して、以下のパラメーターが使用され得る:質量マトリックス:blosum;ギャップ開始ペナルティ:10.0;ギャップ伸長ペナルティ:0.05;親水性ギャップ:on;親水性残基:Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、及びLys;及び残基特異的ギャップペナルティ:on。ClustalWは、例えば、ワールドワイドウェブ上のBaylor College of Medicine Search Launcherウェブサイトで又はEuropean Bioinformatics Instituteウェブサイトで実行することができる。

【0023】

変化が核酸分子(例えば、配列番号1又は配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、若しくは42のいずれか)中に導入され得、それによって、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列(例えば、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41又は43)の変化につながる。例えば、変化が突然変異誘発(例えば、部位特異的変異誘発、PCR媒介突然変異誘発)を使用して又はかかる変化を有する核酸分子を化学的に合成することによって、核酸コード配列中に導入され得る。かかる核酸変化は、1つ又は複数のアミノ酸残基における保存的及び/又は非保存的アミノ酸置換につながり得る。「保存的アミノ酸置換」は、1つのアミノ酸残基が類似した側鎖を有する異なるアミノ酸残基と置き換えられるものであり(例えば、Dayhoffら(1978、in Atlas of Protein Sequence and Structure、5(Suppl. 3):345〜352)を参照されたく、これは、アミノ酸置換に関する度数分布表を提供している)、非保存的置換は、アミノ酸残基が類似した側鎖を有さないアミノ酸残基と置き換えられるものである。

【0024】

本明細書では、「単離」核酸分子は、単離核酸分子が由来する生物のゲノムにおける核酸の1つ又は両方の末端に天然に隣接する配列を含まない核酸分子である(例えば、PCR又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって作製されたcDNA又はゲノムDNA断片)。かかる単離核酸分子は、以下でより詳細に考察される、操作の便利さのために又は融合核酸分子を産出するために、一般に、ベクター(例えば、クローニングベクター、又は発現ベクター)中に導入される。更に、単離核酸分子は、組換え又は合成核酸分子等の操作された核酸分子を含み得る。

【0025】

本明細書では、「精製された」ポリペプチドは、それに天然に伴う細胞成分から分離された又は精製されたポリペプチドである。典型的に、ポリペプチドは、それが乾燥質量で少なくとも70%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、又は99%)であり、それが天然に結合しているポリペプチド及び天然発生の分子を含まない場合、「精製された」と考えられる。化学的に合成されたポリペプチドは、本来、それに天然に伴う成分から分離されているので、合成ポリペプチドは、「精製されている」。

【0026】

核酸は、当技術分野で通例の技法を使用して単離され得る。例えば、核酸は、これらに限定されないが、組換え核酸技術、及び/又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含めた任意の方法を使用して単離され得る。一般的なPCR技法は、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual、Dieffenbach及びDveksler編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1995に報告されている。組換え核酸技法は、例えば、制限酵素消化及びライゲーションを含み、これらは、核酸を単離するために使用され得る。単離核酸はまた、単一核酸分子として又は一連のオリゴヌクレオチドとして化学的に合成され得る。

【0027】

ポリペプチドは、DEAEイオン交換、ゲルろ過、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の公知の方法によって天然供給源(例えば、生物学的試料)から精製され得る。ポリペプチドは、例えば、発現ベクター中の核酸を発現させることによっても精製され得る。更に、精製ポリペプチドは、化学的合成によって得られ得る。ポリペプチドの純度の程度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はHPLC分析を使用して、測定され得る。

【0028】

核酸(例えば、ポリペプチドをコードする核酸)を含有するベクターも提供される。発現ベクターを含めたベクターは、市販されている又は当技術分野で通例の組換えDNA技法によって作製され得る。核酸を含有するベクターは、かかる核酸に作動可能に連結している発現エレメントを有し得、選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)をコードするもの等の配列を更に含み得る。核酸を含有するベクターは、キメラ又は融合ポリペプチド(すなわち、ポリペプチドのN-末端又はC-末端にあってもよい異種ポリペプチドに作動可能に連結しているポリペプチド)をコードし得る。代表的な異種ポリペプチドは、コードされたポリペプチドの精製に使用され得るものである(例えば、6×Hisタグ、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST))。

【0029】

発現エレメントは、核酸コード配列の発現を方向付ける且つ調節する核酸配列を含む。発現エレメントの一例は、プロモーター配列である。発現エレメントは、イントロン、エンハンサー配列、応答エレメント、又は核酸の発現を調節する誘導エレメントも含み得る。発現エレメントは、細菌、酵母、昆虫、哺乳類、又はウイルス起源のものとすることができ、ベクターは、種々の起源からのエレメントの組合せを含有し得る。本明細書では、作動可能に連結しているは、プロモーター又は他の発現エレメントが、核酸(例えば、インフレームの)の発現を方向付ける又は調節するような様式で核酸に対してベクターに配置されていることを意味する。in vivoとin vitroの両方で核酸を宿主細胞中に導入するための多くの方法が当業者に既知であり、これらに限定されないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール(PEG)形質転換、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、及びウイルス媒介核酸移入が挙げられる。

【0030】

本明細書に記載のベクターは、宿主細胞中に導入され得る。本明細書では、「宿主細胞」は、核酸が導入される特定の細胞を表し、ベクターを保有するかかる細胞の子孫も含む。宿主細胞は、任意の原核又は真核細胞とすることができる。例えば、核酸は、大腸菌(E. coli)等の細菌細胞において、又は昆虫細胞、酵母若しくは哺乳類細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)又はCOS細胞等の)において発現され得る。他の適した宿主細胞は、当業者に既知である。

【0031】

核酸は、オリゴヌクレオチドの適切な対(例えば、プライマー)を用いて任意の数の増幅技法(例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual、1995、Dieffenbach及びDveksler編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY;並びに米国特許第4,683,195号;第4,683,202号;第4,800,159号;及び第4,965,188号を参照されたい)を使用して検出され得る。本来のPCRへのいくつかの改変が開発され、核酸を検出するために使用され得る。

【0032】

核酸は、ハイブリダイゼーションを使用しても検出され得る。核酸間のハイブリダイゼーションは、Sambrookら(1989、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY;7.37〜7.57章、9.47〜9.57、11.7〜11.8、及び11.45〜11.57)において詳細に考察されている。Sambrookらは、約100ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドプローブに関する適したサザンブロット条件を開示している(11.45〜11.46章)。長さが100ヌクレオチド未満である配列と第2の配列間のTmは、11.46章に記載の式を使用して計算され得る。Sambrookらは、約100ヌクレオチドを超えるオリゴヌクレオチドプローブに関するサザンブロット条件を更に開示している(9.47〜9.54章を参照されたい)。長さが100ヌクレオチドを超える配列と第2の配列間のTmは、Sambrookらの9.50〜9.51章に記載の式を使用して計算され得る。

【0033】

核酸を含有する膜がプレハイブリダイズされる且つハイブリダイズされる条件、並びに核酸を含有する膜が過剰な及び非特異的に結合したプローブを除去するために洗浄される条件は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにおける重要な役割を果たし得る。かかるハイブリダイゼーション及び洗浄は、適切な場合、中程度又は高ストリンジェンシー条件下で行われ得る。例えば、洗浄条件は、洗浄液の塩濃度を減少させることによって及び/又は洗浄が行われる温度を上げることによってよりストリンジェントにすることができる。単に例として、高ストリンジェンシー条件は、65℃で0.2×SSCでの膜の洗浄を典型的に含む。

【0034】

更に、ハイブリダイゼーションの量の解釈は、例えば、標識オリゴヌクレオチドプローブの比活性によって、プローブがハイブリダイズした鋳型核酸上のプローブ結合部位の数によって、及びオートラジオグラフ又は他の検出媒体の曝露の量によって影響され得る。任意の数のハイブリダイゼーション及び洗浄条件が固定化標的核酸へのプローブ核酸分子のハイブリダイゼーションを調べるために使用され得るが、同一ハイブリダイゼーション、洗浄、及び曝露条件下での標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを調べることがより重要であることが当業者には容易に理解されよう。好ましくは、標的核酸は、同じ膜上にある。

【0035】

核酸分子は、ある核酸へのハイブリダイゼーションが別の核酸へのハイブリダイゼーションよりも少なくとも5倍(例えば、少なくとも6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、又は100倍)大きい場合、ある核酸にハイブリダイズするが、別の核酸にはハイブリダイズしないとみなされる。ハイブリダイゼーションの量は、膜上で直接的に又は例えば、Phosphorlmager又はDensitometer(Molecular Dynamics社、Sunnyvale、CA)を使用して、オートラジオグラフから定量化され得る。

【0036】

ポリペプチドは、抗体を使用して検出され得る。抗体を使用してポリペプチドを検出するための技法は、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ウエスタンブロット、免疫沈降及び免疫蛍光を含む。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルとすることができる。ポリペプチドへの特異的結合親和性を有する抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して産出され得る。抗体は、当技術分野で既知の方法を使用してマイクロタイタープレート等の固体支持体に付着され得る。ポリペプチドの存在下で、抗体-ポリペプチド複合体が形成される。

【0037】

(例えば、増幅産物、ハイブリダイゼーション複合体、又はポリペプチドの)検出は、検出可能な標識を使用して通常達成される。「標識」という用語は、直接的標識及び間接的標識の使用を包含することが意図されている。検出可能な標識は、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質を含む。

【0038】

PRRSV-CONウイルス粒子を作製及び使用する方法
PRRSV-CON核酸からウイルス粒子を構築する方法が当技術分野で既知であり、本明細書で記載される。本明細書で実証されたように、本明細書に記載されたPRRSV-CONは、適切に発現された場合、自己集合して粒子を構築する。PRRSV-CONは、例えば、宿主細胞においてin vitro又はin vivoで発現され得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、PRRSV-CON核酸をトランスフェクトされ得る、又は宿主細胞は、PRRSV-CONウイルス粒子に感染させられ得る。宿主細胞は、これらに限定されないが、ブタ細胞(例えば、ブタ肺胞マクロファージ)又はアフリカミドリザル腎臓由来細胞(例えば、MARC-145)とすることができる。ウイルス粒子は、例えば、超遠心分離法によって単離され得る。

【0039】

本明細書に記載されたPRRSV-CON核酸、ポリペプチド又はウイルス粒子は、ブタの免疫応答を産出する、増強する又は調節するために使用され得る。かかる方法は、本明細書に記載されたPRRSV-CON核酸、ポリペプチド又はウイルス粒子を免疫応答を産出するのに十分な量でブタに投与することを典型的に含む。本明細書では、「免疫応答」は、本明細書に記載のPRRSV-CON核酸、ポリペプチド又はウイルス粒子の投与後に個体において誘発された反応を表す。免疫応答は、例えば、抗体応答又は細胞応答(例えば、細胞傷害性T-細胞応答)を含み得る。PRRSV-CON核酸、ポリペプチド又はウイルス粒子は、例えば、予防的ワクチンとして、ブタにおいてPRRSを予防するために、又はPRRSの曝露又は収縮の前に健常な個体におけるPRRSに対する免疫を樹立する又は増強し、したがって、疾患を予防する若しくは疾患症状の重症度を減少させるために使用され得る。

【0040】

ブタにPRRSV-CON核酸、ポリペプチド又はウイルス粒子を投与するための方法は、これらに限定されないが、筋肉内(i.m.)、皮下(s.c)、又は肺内経路が挙げられる。ブタにPRRSV-CON核酸、ポリペプチド又はウイルス粒子を投与するための方法は、これらに限定されないが、気管内、経皮、眼内、鼻腔内、吸入、腔内、及び静脈内(i.v.)投与も挙げられる。

【0041】

PRRSV-CON核酸、ポリペプチド又はウイルス粒子の有効量を決定することは、例えば、抗原が直接発現されている又は投与されるかどうか、対象の年齢及び体重、処置を必要とする詳細な状態及びその重症度、並びに投与の経路を含めたいくつかの因子に依存する。上記の因子に基づいて、量及び投薬(例えば、投薬の回数及び投薬のタイミング)を決定することは、当業者のレベル内である。

【0042】

組成物は、本明細書に記載のPRRSV-CON核酸、ポリペプチド又はウイルス粒子及び薬学的に許容される担体を含み得る。薬学的に許容される担体は、当技術分野で既知であり、例えば、緩衝液(例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、通常生理食塩水、トリス緩衝液、及びリン酸ナトリウム)又は賦形剤を含む。本明細書に記載された組成物は、水溶液として、又はエマルション、ゲル、溶液、懸濁液、若しくは粉末として製剤化され得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol編、Mack Publishing Co.、Easton、Pa. (1980)、及びRemington's Pharmaceutical Sciences、第19版、Gennaro編、Mack Publishing Co.、Easton、Pa. (1995)を参照されたい。薬学的に許容される担体に加えて、本明細書に記載された組成物は、結合剤、安定剤、保存剤、塩、添加剤、送達ビヒクル及び/又は助剤も含み得る。

【0043】

本発明に従って、当技術分野の技術内の従来の分子生物学、微生物学、生化学的、及び組換えDNA技法が用いられ得る。かかる技法は、文献において完全に説明されている。本発明は、特許請求の範囲において記載された方法及び物質の組成物の範囲を限定しない以下の例において更に記載されることになる。

【実施例】

【0044】

(実施例1)
人工PRRSV-CONゲノムのコンピューターによる設計
米国の中西部州(アイオワ州、ネブラスカ州及びイリノイ州)起源の64種のPRRSV単離物の全ゲノム配列をRoche社の454-GS-FLX配列決定技術を使用して配列決定した。更に、米国起源のPRRSV単離物の20を超える全ゲノム配列をGenBankから回収した。重複する配列を除去した後、PRRSVの60全ゲノム配列の最終セットを得た。60種のPRRSV全ゲノム配列をMUSCLEプログラム(Edgar RC、2004、BMC Bioinform.、5: 113)を使用して整列した。その後、コンセンサスゲノム配列(PRRSV-CON)を、Jalviewプログラムを使用してウイルスゲノムの各位置で見出された最も共通のヌクレオチドを選択することによって産出した。系統発生解析は、PRRSV-CONゲノムが系統樹の中央にまさに位置することを示している。図1Aを参照されたい。したがって、PRRSV-CONから天然発生のPRRSV株までの対での遺伝的距離は、任意の1つの天然発生のPRRSV株から互いまでの距離よりも有意に短い(p<0.0001)。図1Bを参照されたい。

【0045】

(実施例2)
感染性PRRSV-CONウイルスの産出
ウイルスゲノムの5'及び3'末端にある配列を正確に決定することは一般に困難である。したがって、本発明者らは、実施例1において解析された天然発生のPRRSVゲノムの5'及び3'非翻訳領域(UTR)にある配列が正確ではない可能性があると認めた。回復感染性ウイルスの変化を増加させるために、本発明者らは、PRRSV-CONゲノムの5'及び3'UTRを感染性cDNAクローンFL12の5'及び3'UTRで置き換えた(Truongら、2004、Virology、325:308〜19)。PRRSV-CONゲノム全体を包含するA〜Dと命名された4つのDNA断片をGenscript(Piscataway、NJ)によって化学的に合成した。各DNA断片を、クローニング目的を促進するために制限酵素部位の対に隣接させた。T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を、ウイルスゲノムのin vitro転写を促進するために、ウイルス5'末端より先に断片D中に組み込んだ。図2Aを参照されたい。個々のDNA断片を、断片Aから断片Dの順に従って、相当する制限酵素部位を保有するシャトルベクター中に順次クローニングした。全長PRRSV-CON cDNAクローンがいったん産出されると、標準的逆遺伝学技法を適用して、生PRRSV-CONウイルスを回復した。

【0046】

簡潔に述べると、PRRSV-CONの全長cDNAゲノムを含有するプラスミドを直鎖化のためにAclIで消化した。精製直鎖状DNA断片を、完全なゲノムウイルスRNA転写物を産出するためにmMESSAGEmMA CHINE Ultra T7キット(Ambion社、Austin、TX)を使用して、in vitro転写反応のための鋳型として使用した。その後、約5μgの全ゲノムRNA転写物を、TransIT(登録商標)-mRNA Transfection Kit(Minis Bio社、Madison、WI)を使用して、6ウェルプレートにおいて培養されたMARC-145細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を最大6日間、37℃、5%CO2で10%FBSを含有するDMEMにおいて培養した。典型的に、細胞変性効果(CPE)がトランスフェクション後第4日から第6日に観察された。明瞭なCPEが観察された場合、救出されたウイルスを含有する培養上清を回収し、-80℃フリーザー中で0.5mLアリコートで保存した。Truongら(2004、上記)を参照されたい。

【0047】

(実施例3)
PRRSV-CONウイルスのin vitro特徴付け
種々のPRRSV特異的モノクローナル抗体との反応性を研究するために、MARC-145細胞をモック感染させた又はPRRSV-CONウイルス又はPRRSV株FL12に感染させた。感染後(p.i.)48時間で、細胞をウイルスヌクレオカプシド(N)タンパク質又はウイルス非構造タンパク質1ベータ(nsplb)に特異的な抗体で免疫染色した。細胞培養におけるウイルスの増殖動態を研究するために、MARC-145細胞を0.01の感染多重度(MOI)でPRRSV-CON又はFL12に感染させた。p.i.の種々の時点で、培養上清を回収し、ウイルス力価をMARC-145細胞における滴定によって決定した。

【0048】

PRRSV-CONウイルスは、天然発生のPRRSV株の典型的in vitro特徴付けを示す。それは、nspl-betta及びNタンパク質に対する抗体を含めた種々のPRRSV特異的モノクローナル抗体と反応する(図2B)。それは、細胞培養において効率的に複製し(図2C)、明瞭で別個のプラーク形態を形成することができる(図3D)。

【0049】

(実施例4)
PRRSV-CONウイルスは、天然PRRSV株と同じくらい効率的に豚に感染し得る
合計18頭のPRRSV-血清陰性、3週齢の豚をUniversity of Nebraska研究農場から購入した。豚を3つの実験群にランダムに割り当てた;各群を、Institutional Animal Care and Use Committeeによって樹立された規制に従って、UNLでバイオセキュリティーレベル-2の動物実験施設において別々の部屋に収容した。群1のブタにPBSを注入して対照として利用した。群2及び3のブタに、それぞれ、PRRSV-CON及びPRRSV株FL12の10^5.0 TCID₅₀を筋肉内に接種した。野生型PRRSV株、FL12を比較目的でこの研究に含んだ。結果を図3に示す。感染後、PRRSV-CONとFL12接種群の両方は、PBS群よりも有意に高い温度を示した(図3A)が、PRRSV-CON接種群とFL12接種群間の温度に差はなかった。1日当たりの平均体重増加(ADWG)を感染後14日の期間中に個々の豚に関して測定した。統計的有意差は、3つの処置群間に観察されなかったが、PRRSV-CON接種群及びFL12接種群の豚は、PBS群よりも低いADWGを有する傾向があった(図3B)。PRRSV-CON-及びFL12-接種群のウイルス血症レベルは、ほぼ同一であった(図3C)。PRRSV-CON-及びFL12-接種群の全ての豚は、p.i 11日までに血清転換した。PRRSV-CON-接種群における抗体応答のレベルは、FL12-接種群のものよりもわずかに低かった(図3D)。これらの結果は、PRRSV-CONがPRRSV株、FL12と同じくらい効果的に天然宿主(すなわち、豚)に感染し得ることを実証している。

【0050】

(実施例5)
PRRSV株MN-184に対する交差防御のレベルの評価
材料及び方法
合計18頭のPRRSV-血清陰性、3週齢の豚をUniversity of Nebraska研究農場から購入した。豚を3つの実験群にランダムに割り当てた;各群を、Institutional Animal Care and Use Committeeによって樹立された規制に従って、UNLでバイオセキュリティーレベル-2の動物実験施設において別々の部屋に収容した。群1にPBSを注入し、非免疫化対照として働かせた。群2を豚1頭当たり10^4.0 TCID₅₀の用量でのPRRSV-CONの筋肉内感染によって免疫化した。群3を豚1頭当たり10^4.0 TCID₅₀の用量での野生型PRRSV株、FL12の筋肉内感染によって免疫化した。Table 1(表1)を参照されたい。感染後(p.i.)53日で、全ての対照及び免疫化豚に、10^5.0 TCID₅₀の用量でPRRSV株MN-184を筋肉内に負荷した。PRRSV-CONウイルスでの免疫化による防御を評価するために使用されたパラメーターは、いくつかの異なる組織におけるウイルス血症及びウイルス量並びに成長能力を含んだ。

【0051】

【表1】

【0052】

成長能力を測定するために、各豚を負荷感染直前及び負荷後15日に秤量した。体重をポンドで記録した。1日当たりの平均体重増加(ADWG)を負荷後15日の期間計算した。

【0053】

負荷感染後のウイルス血症のレベルを定量化するために、血液試料を負荷前並びに負荷後第1、4、7、10、及び15日に採取した。血清試料を個々の血液試料から抽出し、-80℃フリーザー中で保存した。ウイルス血症レベルをユニバーサルRT-qPCRキット(Tetracore社、Rockville、MD)を使用して、Animal Disease Research and Diagnostic Laboratory、South Dakota State Universityによって定量化した。結果をlog10コピー/mLとして報告した。統計的目的のために、ウイルスRNAのレベルを検出しなかった試料に0log10コピー/mLの値を割り当てた。

【0054】

組織におけるウイルス量のレベルを定量化するために、豚を負荷後第15日に人道的に屠殺し、剖検した。扁桃腺、肺、縦隔リンパ節及び鼠径リンパ節の試料を得、Whirl-pak(登録商標)バッグにおいて個々に保管した。試料を採取直後に液体窒素において急速凍結した。その後、それらを-80℃フリーザー中で保存した。RNAを抽出するために、組織試料を3mL Trizol試薬における300mg組織の比でTrizol試薬(Life Technologies社、Carlsbad、CA)においてホモジナイズした。全RNAを、製造者の説明書に従って、RNeasy Mini Kit(Qiagen社、Valencia、CA)を使用して抽出した。RNA濃度をNanoDrop(登録商標)ND-1000 (NanoDrop Technologies社、Wilmington、DE)によって定量化し、200ng/Lの最終濃度に調整した。

【0055】

PRRSVが感染後最大150日、感染豚のリンパ組織においてコロニー形成且つ存続し得ることは、よく特徴付けられている。これらの実験では、組織ウイルス量を、一次感染後67日に相当する負荷後15日に評価した。その時、PRRSV-CON及びFL12群の豚が一次感染の残留ウイルスをなお含有した可能性がある。したがって、本発明者らは、組織におけるウイルスRNA量を定量化するための2つの異なるRT-PCRキット:(i)一次感染と負荷感染の両方に起因する全ウイルスRNAを検出する市販のRT-qPCRキット(Tetracore社、Rockville、MD)、及び(ii)負荷感染からのウイルスRNAのみを選択的に検出する、社内で開発されたディファレンシャルRT-PCRを使用した。5μLの各RNA試料(1μg RNAに等しい)を各RT-qPCR反応に使用した。結果を全RNA1μg当たりのlog10コピーとして報告した。統計的目的のために、ウイルスRNAレベルを検出しなかった試料に全RNA1μg当たり0logのRNAコピーの値を割り当てた。

【0056】

結果
成長能力の結果を図4Aに示す。PBS-、PRRSV-CON-及びFL12-免疫化群の平均ADWGは、それぞれ、0.3lb(SD+/-0.3),0.9lb(SD+/-0.6),及び1.2lb(SD+/-0.4)であった。PRRSV-CON及びFL12-免疫化群は、PBS-免疫化群よりも大きいADWGを有した。PRRSV-CON-とFL12-免疫化群間に統計的有意差はなかった。

【0057】

負荷感染後のウイルス血症レベルを図4B及びTable 2(表2)に示す。PBS-免疫化群の全ての豚は、試験された全ての時点でウイルス血症であった。PRRSV-CON-免疫化群は、3頭のウイルス血症豚のみを有し、その内、1頭の豚が2つの時点でウイルス血症であり(4 DPC及び7 DPCでの豚番号494)、2頭の豚が1つの時点でのみウイルス血症であった(15 DPCでの豚番号394及び495)。この群における残りの3頭の豚(豚番号345、410及び459)は、負荷感染後にウイルス血症ではなかった。対照的に、ウイルス血症が負荷感染後に2つ以上の時点でFL12-免疫化群における6頭のうち5頭の豚において検出された。この群における1頭の豚(豚番号440)のみが試験されたいずれの時点においてもウイルス血症ではなかった。全体的に見て、PRRSV-CON-免疫化豚のウイルス血症レベルは、FL12-免疫化群(p<0.05)及びPBS-免疫化群におけるものよりも有意に低かった(p<0.0001)。

【0058】

ユニバーサルRT-qPCRキットによって定量化された全ウイルスRNAの結果を図4Cに示す。PRRSV-CON-及びFL12-免疫化群は、試験された組織型にかかわらず、PBS-免疫化群よりも全ウイルスRNAの有意に低いレベルを含有した。しかしながら、全ウイルスRNAの点でPRRSV-CON-とFL12-免疫化群間に差はなかった。

【0059】

ディファレンシャルRT-qPCRによって定量化されたMN-184特異的RNAの結果を図4Dに示す。PBS-免疫化群の全ての豚は、それらの組織中にMN-184 RNAを保有した。FL12-免疫化群の4頭の豚は、それらの扁桃腺及び縦隔リンパ節中にMN-184 RNAを有した一方、この群における5頭の豚は、それらの鼠径リンパ節中にMN-184 RNAを有した。注目すべきことに、PRRSV-CON-免疫化群の豚のいずれも、試験された組織試料のいずれにおいても検出可能なレベルのMN-184 RNAを有さなかった。

【0060】

まとめると、これらの結果は、非天然発生のPRRSV-CONの感染による離乳豚の免疫化が、PRRSV株、FL12での免疫化がもたらした免疫化よりもPRRSV株、MN-184での負荷に対して著しく良い交差防御をもたらしたことを明確に実証している。

【0061】

【表2】

【0062】

(実施例6)
PRRSV株16244Bに対する交差防御のレベルの評価
材料及び方法
実験デザインは、実施例5において上で記載のものと同じであった。UNL研究農場から購入された合計18頭のPRRSV-血清陰性、3週齢の豚を3つの実験群にランダムに割り当てた。各群を、Institutional Animal Care and Use Committeeによって樹立された規制に従って、UNLでバイオセキュリティーレベル-2の動物実験施設において別々の部屋に収容した。群1にPBSを注入し、対照として働かせた。群2を豚1頭当たり10^4.0 TCID₅₀の用量でのPRRSV-CONの感染により筋肉内に免疫化した。群3を豚1頭当たり10^4.0 TCID₅₀の用量での野生型PRRSV、FL12の感染により筋肉内に免疫化した。Table 3(表3)を参照されたい。群3の1頭の豚(豚番号543)及び群2の1頭の豚(豚番号435)を、それらの脚における跛行により、それぞれ、一次感染後14及び23日にこの研究から排除した。感染後(p.i.)第52日に、全ての豚を10^5.0 TCID₅₀の負荷用量でPRRSV株16244Bで筋肉内に負荷した。様々な組織におけるウイルス血症及びウイルス量並びに成長能力を含めたPRRSV-CONウイルスでの免疫化による防御を評価するために使用されたパラメーターを実施例5において上で記載されたように測定した。

【0063】

【表3】

【0064】

結果
成長能力の結果を図5Aに示す。PBS-、PRRSV-CON-、及びFL12-免疫化群の平均ADWGは、それぞれ、1.1lb(SD+/-0.3)、1.6lb(SD+/-0.1)、及び0.8lb(SD+/-0.3)であった。PRRSV-CON-免疫化群は、PBS-免疫化群及びFL12-免疫化群よりも大きいADWGを有した一方;FL12-免疫化群は、PBS-免疫化群と統計的に異ならなかった。

【0065】

負荷感染後のウイルス血症レベルの結果を図5B及びTable 4(表4)に示す。PBS-免疫化群の全ての豚は、試験された全ての時点でウイルス血症であった。PRRSV-CON-免疫化群の5頭のうち2頭の豚(豚番号442及び445)は、ウイルスRNAがこの時点で回収されたそれらの血清試料においてなお検出されたので、一次感染後52日でウイルス血症を軽減しなかった。負荷感染後、PRRSV-CON-免疫化群の3頭の豚は、1時点でのみウイルス血症であった。この群の残りの2頭の豚(豚番号436及び438)は、負荷後15日の期間中ずっとウイルス血症ではなかった。対照的に、FL12-免疫化群の全ての豚は、一次感染後52日までにウイルス血症を軽減した。負荷感染後、この群の全ての豚は、ウイルス血症になった。全体的に見て、PRRSV-CON-免疫化群のウイルス血症レベルは、FL12-免疫化群(p<0.0001)又はPBS-免疫化群(p<0.0001)のものよりも有意に低かった。

【0066】

市販のRT-qPCRキット(Tetracore社、Rockville、MD)によって定量化された全ウイルスRNAの結果を図5Cに示す。PRRSV-CON-とFL12-免疫化群の両方は、試験された組織型にかかわらず、PBS-免疫化群よりも有意に低い全ウイルスRNAのレベルを含有した。しかしながら、全ウイルスRNAの点でPRRSV-CON-免疫化群とFL12-免疫化群間に統計的有意差はなかった。

【0067】

ディファレンシャルRT-qPCRによって定量化された16244B特異的RNAの結果を図5Dに示す。PBS-及びFL12-免疫化群の全ての豚は、それらの組織中に16244B特異的RNAを保有したが、FL12-免疫化群の16244B RNAのレベルは、PBS-免疫化群におけるものよりも低かった。対照的に、PRRSV-CON-免疫化群の1頭の豚のみがその鼠径リンパ節中に16244B特異的RNAを保有した一方、この群の残りの4頭の豚は、16244B特異的RNAを保有しなかった。

【0068】

まとめると、これらの結果は、非天然発生のPRRSV-CONの感染による離乳豚の免疫化が、PRRSV株FL12での免疫化がもたらした免疫化よりもPRRSV株、16244Bでの負荷に対して著しく良い交差防御をもたらしたことを明確に実証している。

【0069】

【表4】

【0070】

方法及び物質の組成物がいくつかの異なる態様と関連して本明細書に記載されたが、様々な態様の前述の記載は、例示することが意図されており、方法及び物質の組成物の範囲を限定することは意図されていないことが理解されよう。他の態様、利点、及び変更形態が以下の特許請求の範囲内である。

【0071】

開示された方法及び組成物に使用され得る、これに関連して使用され得る、この調製に使用され得る、又はこれの生成物である方法及び組成物が開示される。これら及び他の材料が本明細書で開示され、これらの方法及び組成物の組合せ、サブセット、相互作用、群等が開示されることが理解されよう。つまり、各様々な個々の及び集団的組合せへの特定の参照並びにこれらの組成物及び方法の入れ替えが明示的に開示され得ないが、それぞれは、明確に企図され、且つ本明細書に記載されている。例えば、物質の特定の組成物又は特定の方法が開示され、考察され、いくつかの組成物又は方法が考察される場合、組成物及び方法の各及び全ての組合せ並びに入れ替えは、逆に明確に示されない限り、明確に企図されている。同様に、これらの任意のサブセット又は組合せも明確に企図され、開示されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]