特許 6543253 ゲノムの完全性及び／又は確定的制限酵素部位全ゲノム増幅によって得られたＤＮＡ配列のライブラリの質を判定する方法及びキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6543253

(24)【登録日】2019年6月21日

(45)【発行日】2019年7月10日

(54)【発明の名称】ゲノムの完全性及び／又は確定的制限酵素部位全ゲノム増幅によって得られたＤＮＡ配列のライブラリの質を判定する方法及びキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20190628BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20190628BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20190628BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/686 ZZNA

   C12N15/11 Z

   G01N33/50 P

【請求項の数】15

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2016-536851(P2016-536851)

(86)(22)【出願日】2014年12月4日

(65)【公表番号】特表2016-538872(P2016-538872A)

(43)【公表日】2016年12月15日

(86)【国際出願番号】IB2014066602

(87)【国際公開番号】WO2015083121

(87)【国際公開日】20150611

【審査請求日】2017年10月24日

(31)【優先権主張番号】13195770.6

(32)【優先日】2013年12月4日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】516164519

【氏名又は名称】メナリーニ シリコン バイオシステムズ エッセ．ピー．アー．

(73)【特許権者】

【識別番号】513002566

【氏名又は名称】フラウンホーファー−ゲゼルシャフト ツア フェーアデルング デア アンゲヴァンテン フォルシュング エー．ファオ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】クライン クリストフ アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】ポルツァー ベルンハルト ミヒャエル

(72)【発明者】

【氏名】マナレージ ニコロ

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００２−５２６０８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０９３４６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 British J. Cancer, 2006年，Vol.94，p.333-337

【文献】 Cellular Oncology, 2007年，Vol.29，p.351-359

【文献】 TAIWANESE JOURNAL OF OBSTETRICS AND GYNECOLOGY，２００８年 ３月 １日，VOL:47 NR:1，P.32-41，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1016/S1028-4559(08)60052-2

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｇ０１Ｎ ３３／５０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料のゲノムの完全性及び／又は試料のゲノムの確定的制限酵素部位全ゲノム増幅（ＤＲＳ−ＷＧＡ）によって得られたＤＮＡ配列ライブラリの質を判定する方法であって、
（ａ）前記ＤＮＡ配列ライブラリを提供する工程と、
（ｂ）前記ＤＮＡ配列のライブラリを、
１０００ｂｐ〜５０００ｂｐの長さを有し、染色体５ｑのＤ５Ｓ２１１７領域を包含する前記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第１のプライマー対、
１０００ｂｐ〜５０００ｂｐの長さを有し、ＴＲＰ５３遺伝子のエクソン２及びエクソン３を包含する前記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第２のプライマー対、及び、
１０００ｂｐ〜５０００ｂｐの長さを有し、ＫＲＴ１９偽遺伝子１を包含する前記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第３のプライマー対、
を使用するＰＣＲによって増幅する工程であって、
該増幅工程が、５０ｂｐ〜１０００ｂｐの第１のＰＣＲ産物、前記第１のＰＣＲ産物以外のサイズを有する５０ｂｐ〜１０００ｂｐの第２のＰＣＲ産物、並びに前記第１のＰＣＲ産物及び第２のＰＣＲ産物以外のサイズを有する５０ｂｐ〜１０００ｂｐの第３のＰＣＲ産物をもたらす工程と、
（ｃ）前記第１のＰＣＲ産物、前記第２のＰＣＲ産物、及び前記第３のＰＣＲ産物を検出する工程と、
（ｄ）前記第１のＰＣＲ産物、前記第２のＰＣＲ産物、及び前記第３のＰＣＲ産物の存在を、前記試料のゲノムの完全性及び／又はＤＮＡ配列のライブラリの質と関連付ける工程と、
を含む、方法。

【請求項2】

前記少なくとも１つの第１のプライマー対のフォワードプライマーが配列番号４であり、前記少なくとも１つの第１のプライマー対のリバースプライマーが配列番号３である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記少なくとも１つの第２のプライマー対のフォワードプライマーが配列番号６であり、前記少なくとも１つの第２のプライマー対のリバースプライマーが配列番号５である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記少なくとも１つの第３のプライマー対のフォワードプライマーが配列番号８であり、前記少なくとも１つの第３のプライマー対のリバースプライマーが配列番号７である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

工程（ｂ）にて、８０ｂｐ〜３００ｂｐの長さを有する、前記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第４のプライマー対を更に使用し、前記増幅工程が前記第１のＰＣＲ産物、前記第２のＰＣＲ産物、及び前記第３のＰＣＲ産物以外のサイズを有する５０ｂｐ〜２００ｂｐの第４のＰＣＲ産物をもたらし、
工程（ｃ）が前記第４のＰＣＲ産物を検出することを更に含み、
工程（ｄ）が前記第４のＰＣＲ産物の存在を前記試料のゲノムの完全性及び／又は前記ＤＮＡ配列のライブラリの質と関連付けることを更に含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記少なくとも１つの第４のプライマー対がハイブリダイズする前記ライブラリのＤＮＡ配列がＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及び１３を包含する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記少なくとも１つの第４のプライマー対のフォワードプライマーが配列番号１７であり、前記少なくとも１つの第１のプライマー対のリバースプライマーが配列番号１８である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

試料のゲノムの完全性及び／又は試料のゲノムの確定的制限酵素部位全ゲノム増幅（ＤＲＳ−ＷＧＡ）によって得られたＤＮＡ配列ライブラリの質の判定のために用いられるキットであって、
１０００ｂｐ〜５０００ｂｐの長さを有し、染色体５ｑのＤ５Ｓ２１１７領域を包含する前記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第１のプライマー対と、
１０００ｂｐ〜５０００ｂｐの長さを有し、ＴＲＰ５３遺伝子のエクソン２及びエクソン３を包含する前記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第２のプライマー対と、
１０００ｂｐ〜５０００ｂｐの長さを有し、ＫＲＴ１９偽遺伝子１を包含する前記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第３のプライマー対と、
を備え、前記第１のプライマー対、前記第２のプライマー対、及び前記第３のプライマー対が、ＰＣＲによって増幅された場合に、互いに異なるサイズのＰＣＲ産物をもたらす、キット。

【請求項9】

前記キットは、８０ｂｐ〜３００ｂｐの長さを有する、前記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第４のプライマー対を更に備え、
前記第１のプライマー対、前記第２のプライマー対、前記第３のプライマー対、及び前記第４のプライマー対が、ＰＣＲによって増幅された場合に、互いに異なるサイズを有するＰＣＲ産物をもたらす、請求項８に記載のキット。

【請求項10】

ＤＲＳ−ＷＧＡによる単一細胞のゲノムＤＮＡの増幅後の遺伝子解析アッセイの成功の予測における請求項８又は９に記載のキットの使用。

【請求項11】

前記遺伝子解析アッセイが、突然変異解析に対するサンガーシークエンシング、特定のコピー数の変化の判断、遺伝子増幅に対する定量的ＰＣＲ、分裂中期比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、及びアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。

【請求項12】

試料のゲノムの完全性の判定のために用いられる請求項８又は９に記載のキット。

【請求項13】

前記試料が５個以下の細胞からなる、請求項１２に記載のキット。

【請求項14】

前記試料が単一の細胞である、請求項１３に記載のキット。

【請求項15】

前記試料のゲノムの完全性の判定が、前記試料の細胞（単数／複数）の生物学的状態を判定することを可能とする、請求項１３又は１４に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料、特に単一の細胞のゲノムの完全性及び／又は試料のゲノムの確定的制限酵素部位全ゲノム増幅（ＤＲＳ−ＷＧＡ）によって得られたＤＮＡ配列ライブラリの質を判定する方法及びキットに関する。

【背景技術】

【0002】

全ゲノム増幅（ＷＧＡ）は、癌患者の単一の末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の場合、又は着床前診断等の限られた開始材料のＤＮＡにおける体細胞突然変異及びコピー数の変化の検出を可能とする。

【0003】

単一細胞解析に対するＷＧＡの診断的使用について、目的の単一細胞試料のゲノムＤＮＡの質（すなわち、ゲノムの完全性）は、ＷＧＡ後の分子解析の成功に主な役割を果たす。

【0004】

特に、ＣＴＣは高い頻度でアポトーシス性であると記載されている（非特許文献１）

【0005】

さらに、カスパーゼ媒介アポトーシスの間、ゲノムＤＮＡは１８０ｂｐ〜２００ｂｐの長さの小片へと断片化される（非特許文献２）。

【0006】

したがって、細胞自体の生物学的状態に関連する場合があり、また癌患者の全身状態について臨床上関連する情報を与え得ることから、単一細胞のゲノムの完全性の状態を判断することが重要であり、これは単にＣＴＣを計数することによって提供される情報をしのぎ、それらＣＴＣの分子の特性評価を補足する。

【0007】

また、ＤＮＡ架橋及び／又は断片化は、生検後に必要な試料保存のため患者に由来する細胞及び組織に行われた化学処理（例えば、固定）によって生じる。

【0008】

単一細胞解析に対する分子アッセイ及びかかる試料に由来して得られたデータ評価の性能を予測するため、単一細胞のゲノムの完全性を判断することは特に重要である。

【0009】

利用可能な単一細胞のＷＧＡキットは、ＷＧＡ産物のみの濃度の測定によって全ゲノム増幅の質を判断する。これらの方法に関するプロトコルは、単一細胞ＤＮＡ増幅の手順の間に少なくとも１つの無作為の工程を含むことから、アポトーシス性若しくは非アポトーシス性の状態等の入力試料（通常、単一細胞）のゲノム完全性、又は更なる遺伝子解析に対する適合性等のＷＧＡ産物の出力の質を評価する特異的なアッセイは困難である。

【0010】

特定の種類のＷＧＡは、確定的制限酵素部位全ゲノム増幅（以下、ＤＲＳ−ＷＧＡと呼ぶ）である。特許文献１により既知であり、Silicon Biosystems SpaによってＡｍｐｌｉ１（商標）として市販されているＤＲＳ−ＷＧＡは、ＭｓｅＩ部位（ＴＴＡＡ）における二本鎖ＤＮＡの特異的制限酵素消化及び増幅に対するユニバーサルアダプタのライゲーションに基づく。

【0011】

ＤＲＳ−ＷＧＡは単一細胞の増幅により良好で（例えば、非特許文献３を参照されたい）、固定処理によるＤＮＡ分解に対してより耐性でもある（例えば、非特許文献４、非特許文献５を参照されたい）ことが示されている。

【0012】

今日まで、ＤＲＳ−ＷＧＡ産物に由来する入力試料のゲノム完全性又は得られたＤＲＳ−ＷＧＡ産物の質を評価する具体的なアッセイはない。

【0013】

したがって、入力試料のゲノム完全性及び／又は得られたＤＲＳ−ＷＧＡ産物の質の判定を可能にし、単一細胞解析及び得られたデータの評価に対するＤＲＳ−ＷＧＡの下流の分子アッセイの性能を予測することを可能にする方法及びキットの開発が必要とされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0014】

【特許文献1】欧州特許第１１０９９３８号

【非特許文献】

【0015】

【非特許文献1】Mehes, G., et al., Circulating breast cancer cells are frequently apoptotic. Am J Pathol, 2001. 159(1): p.17-20

【非特許文献2】Wyllie, AH., Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature, 1980. 284(5756): p.555-6

【非特許文献3】Lee YS, et al: Comparison of whole genome amplification methods for further quantitative analysis with microarray-based comparative genomic hybridization. Taiwan J Obstet Gynecol. 2008, 47(1):32-41

【非特許文献4】Stoecklein N.H. et al: SCOMP is Superior to Degenerated Oligonucleotide Primed-PCR for Global Amplification of Minute Amounts of DNA from Microdissected Archival Samples. American Journal of Pathology 2002, Vol. 161, No. 1

【非特許文献5】Arneson N. et al.: Comparison of Whole Genome Amplification methods for analysis of DNA extracted from microdissected early breast lesions in formalin-fixed paraffin-embedded tissue. ISRN Oncol. 2012; 2012;710692

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

したがって、本発明の目的は、強固で信頼性のある結果を提供し、特に試料の細胞（単数／複数）の生物学的状態を判断すること及び／又はＤＲＳ−ＷＧＡの下流の分子アッセイの性能を予測することを可能とする、試料のゲノムの完全性及び／又はＤＲＳ−ＷＧＡによって得られたＤＮＡ配列のライブラリの質を判定する方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0017】

この目的は、請求項１に記載の方法に関するように本発明により達成される。

【0018】

本発明の更なる目的は、請求項８に記載のようなキットを提供することである。

【0019】

定義
他に特に規定がなければ、本明細書に用いられる技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0020】

「試料」という用語は、生物学的実体の少なくとも１つの粒子を含む試料を意図するものであり、上記試料は少なくともその生物学的実体のゲノム又はゲノムの実質的なサブセットを表すＤＮＡ配列を含む。非限定的な例として、上記実体は人であってもよく、上記少なくとも１つの粒子は５個以下の細胞のセット、単一細胞、若しくは単一細胞核、又は一倍体生殖細胞、又は染色体であってもよい。

【0021】

「ゲノム」という用語は、ゲノム全体又は上記ゲノムの実質的なサブセットを意図するものである。

【0022】

ゲノムの「完全性」という用語は、ゲノムの複製又はその正常な機能性を妨げる可能性のある二本鎖切断、又はニック若しくは同様の状態等のＤＮＡ損傷の不在を意図するものである。

【0023】

ＤＮＡ配列のライブラリの「質」という用語は、非限定的な例として、点突然変異、欠失、挿入、コピー数多型の存在等の幾つかの特徴の遺伝学的特性評価に使用されるＤＮＡ配列のライブラリの適合性を意図するものである。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】本発明の好ましい実施形態による単一マーカーＰＣＲ、並びに４−マルチプレックスアッセイ及び３−マルチプレックスアッセイのアガロースゲル写真を示す図である。

【図2】ＰＩＫ３ＣＡのホットスポット１及びホットスポット２に対するＰＣＲのアガロースゲル写真を示す図である（Ｍ＝サイズマーカー、０１＝乳房１３、０２＝乳房１５、０３＝乳房１７、０４＝乳房２０、０５＝前立腺１４、０６＝前立腺１６、０７＝前立腺２４、０８＝黒色腫１３、０９＝黒色腫１４、１０＝黒色腫１６）。

【図3】図１の好ましい４−マルチプレックスアッセイによって試験した８つの試料のアガロースゲル写真を示す図である。

【図4】乳癌患者に由来する単一の末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）と単一の白血球（ＷＢＣ）との間のゲノムの完全性指標の分布のヒストグラムを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

試料のゲノムの完全性及び／又は試料のゲノムの確定的制限酵素部位全ゲノム増幅（ＤＲＳ−ＷＧＡ）によって得られたＤＮＡ配列のライブラリの質を判定する本発明による方法は、工程（ａ）〜（ｄ）を含む。

【0026】

また、試料のゲノムの完全性及び／又は試料のゲノムのＤＲＳ−ＷＧＡによって得られたＤＮＡ配列のライブラリの質の判定を可能とすることにより、上記方法は、試料の細胞（単数／複数）の生物学的状態の判断を可能とし、及び／又はＤＮＡ配列のライブラリに対する遺伝子解析アッセイの成功率の予測を可能とする。

【0027】

上記試料は５個以下の細胞からなるのが好ましく、上記試料は単一の細胞であるのがより好ましい。単一の細胞は、末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、末梢循環胎児細胞、末梢循環内皮細胞（ＣＥＣ）、卵母細胞、卵丘細胞、精子、卵割球、又は栄養外胚葉細胞であることが好ましい。

【0028】

工程（ａ）では、ＤＮＡ配列のライブラリが提供される。

【0029】

工程（ｂ）では、１０００ｂｐ〜５０００ｂｐ、好ましくは１０００ｂｐ〜２０００ｂｐの長さを有し、第１の染色体腕に位置するゲノムの配列に対応する上記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第１のプライマー対を使用するＰＣＲによってＤＮＡ配列のライブラリを増幅し、該増幅工程は５０ｂｐ〜１０００ｂｐの第１のＰＣＲ産物をもたらす。

【0030】

上記第１のプライマー対がハイブリダイズするライブラリのＤＮＡ配列は、染色体５ｑのＤ５Ｓ２１１７領域を包含することが好ましい。

【0031】

上記第１のプライマー対のフォワードプライマーは配列番号４であり、上記第１のプライマー対のリバースプライマーは配列番号３であることがより好ましい。

【0032】

工程（ｃ）では、第１のＰＣＲ産物を検出する。アガロースゲル電気泳動を使用して該ＰＣＲ産物を分離及び検出してもよく、同様に、当該技術分野で既知の他の方法を使用してもよい。

【0033】

工程（ｄ）では、第１のＰＣＲ産物の存在を上記試料のゲノムの完全性及び／又はＤＮＡ配列のライブラリの質と関連付ける。

【0034】

有利には、工程（ｂ）では、１０００ｂｐ〜５０００ｂｐ、より好ましくは１０００ｂｐ〜２０００ｂｐの長さを有し、第１の染色体腕以外の第２の染色体腕に位置するゲノムの配列に対応するライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第２のプライマー対を使用し、該増幅工程は第１のＰＣＲ産物以外のサイズを有する５０ｂｐ〜１０００ｂｐの第２のＰＣＲ産物をもたらす。

【0035】

また、上記第２のＰＣＲ産物は工程（ｃ）で検出され、また工程（ｄ）では、該第２のＰＣＲ産物の存在を試料のゲノムの完全性及び／又はＤＮＡ配列のライブラリの質と関連付ける。

【0036】

上記第２のプライマー対がハイブリダイズする上記ライブラリのＤＮＡ配列はＴＲＰ５３遺伝子のエクソン２及びエクソン３を包含することが好ましい。

【0037】

上記第２のプライマー対のフォワードプライマーは配列番号６であり、上記第２のプライマー対のリバースプライマーは配列番号５であることがより好ましい。

【0038】

有利には、工程（ｂ）では、１０００ｂｐ〜５０００ｂｐ、より好ましくは１０００ｂｐ〜２０００ｂｐの長さを有し、上記第１の染色体腕及び第２の染色体腕以外の第３の染色体腕に位置するゲノムの配列に対応する上記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第３のプライマー対を使用し、該増幅工程は、上記第１のＰＣＲ産物及び第２のＰＣＲ産物以外のサイズを有する５０ｂｐ〜１０００ｂｐの第３のＰＣＲ産物をもたらす。

【0039】

また、上記第３のＰＣＲ産物は工程（ｃ）で検出され、また工程（ｄ）では、該第３のＰＣＲ産物の存在を試料のゲノムの完全性及び／又はＤＮＡ配列のライブラリの質と関連付ける。

【0040】

上記第３のプライマー対がハイブリダイズする上記ライブラリのＤＮＡ配列はＫＲＴ１９偽遺伝子１（ＣＫ１９と略記される）を包含することが好ましい。

【0041】

上記第３のプライマー対のフォワードプライマーは配列番号８であり、上記第３のプライマー対のリバースプライマーは配列番号７であることがより好ましい。

【0042】

工程（ｂ）では、８０ｂｐ〜３００ｂｐの長さを有する、上記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第４のプライマー対を使用し、該増幅工程は、上記第１のＰＣＲ産物、上記第２のＰＣＲ産物、及び上記第３のＰＣＲ産物以外のサイズを有する５０ｂｐ〜２００ｂｐの第４のＰＣＲ産物をもたらすことが更により好ましい。

【0043】

工程（ｂ）が少なくとも１つの第４のプライマー対を使用する場合、第４のＰＣＲ産物もまた工程（ｃ）で検出され、該第４のＰＣＲ産物の存在もまた工程（ｄ）において、試料のゲノムの完全性及び／又はＤＮＡ配列のライブラリの質と関連付けられる。

【0044】

第４のプライマー対がハイブリダイズする上記ライブラリのＤＮＡ配列はＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３を包含することが好ましい。

【0045】

上記第４のプライマー対のフォワードプライマーは配列番号１７であり、上記第４のプライマー対のリバースプライマーは配列番号１８であることが更により好ましい。

【0046】

また、本発明によれば、試料のゲノムの完全性及び／又は試料のゲノムの確定的制限酵素部位全ゲノム増幅（ＤＲＳ−ＷＧＡ）によって得られたＤＮＡ配列ライブラリの質の判定のために用いられるキットであって、
１０００ｂｐ〜５０００ｂｐの長さを有し、第１の染色体腕に位置する上記ゲノムの配列に対応する上記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第１のプライマー対と、
１０００ｂｐ〜５０００ｂｐの長さを有し、上記第１の染色体腕以外の第２の染色体腕に位置する上記ゲノムの配列に対応する上記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第２のプライマー対と、
１０００ｂｐ〜５０００ｂｐの長さを有し、上記第１の染色体腕及び上記第２の染色体腕以外の第３の染色体腕に位置する上記ゲノムの配列に対応する上記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第３のプライマー対と、
を備え、上記第１のプライマー対、上記第２のプライマー対、及び上記第３のプライマー対が、ＰＣＲによって増幅された場合に、互いに異なるサイズのＰＣＲ産物をもたらす、キットが提供される。

【0047】

上記キットは、８０ｂｐ〜３００ｂｐの長さを有する、上記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも１つの第４のプライマー対を更に備え、上記第１のプライマー対、上記第２のプライマー対、上記第３のプライマー対、及び上記第４のプライマー対が、ＰＣＲによって増幅された場合に、互いに異なるサイズを有するＰＣＲ産物をもたらすことが好ましい。

【0048】

上記キットは、第１のプライマー対、第２のプライマー対、第３のプライマー対、及び第４のプライマー対を備えることがより好ましい。

【0049】

上記キットを使用してＤＲＳ−ＷＧＡによる単一細胞のゲノムＤＮＡの増幅後の遺伝子解析アッセイの成功を予測することができる。上記遺伝子解析アッセイは、突然変異解析に対するサンガーシークエンシング、特定のコピー数の変化の判断、遺伝子増幅に対する定量的ＰＣＲ、分裂中期比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、又はアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）であることが好ましい。

【0050】

突然変異解析に対するサンガーシークエンシング等の遺伝子特異的アッセイについては、４つのＰＣＲ産物のうちの少なくとも１つ〜２つを含む試料を使用することができる。４つのＰＣＲ産物のうちの少なくとも３つに対する陽性は、分裂中期ＣＧＨによるゲノムワイド解析の成功の予測である。アレイＣＧＨについては、４つの陽性ＰＣＲ産物のうち４つを含む試料を使用することが得策である。

【0051】

また、上記キットを使用して試料のゲノムの完全性を判定し、そのようにして試料の細胞（単数／複数）の生物学的状態を判定することができる。上記試料は５個以下の細胞からなることが好ましく、上記試料は単一の細胞であることがより好ましい。

【0052】

実際のところ、試料の細胞のＤＮＡが非常に断片化されていても、試料中に多数の細胞が存在すれば、第１のＰＣＲ産物、第２のＰＣＲ産物、第３のＰＣＲ産物（及び任意に第４のＰＣＲ産物）をそれぞれ増幅するための第１のプライマー対、第２のプライマー対、第３のプライマー対（及び任意に第４のプライマー対）に対する全体的に十分なテンプレートコピーが存在することになる。その結果は、上記方法の識別力の不足である。

【0053】

一方、非常に損傷されたＤＮＡ細胞試料の場合であっても、５つの細胞が上記方法による信頼性のある結果を可能とする量、すなわち、過剰なテンプレートコピーの結果を伴わずに、工程（ｄ）のＰＣＲ産物を得ることを可能とする量であることが実験的に特定されている。

【0054】

さらに、非常に損傷されたＤＮＡ細胞試料（単一細胞が増幅されていないＰＣＲ産物をもたらす可能性がある）の解析について、２以上、すなわち２〜５の数の細胞の使用が、ゲノム完全性を数量化して上記方法の解析力を増すことを可能とする。

【実施例】

【0055】

要するに、異なる染色体位置に位置するＭｓｅＩフラグメントに対して設計された、様々なフラグメント長を有する幾つかのプライマー対を試験した。高い特異性及び感度で単一細胞産物の全ゲノム解析の成功を予測する３つのプライマー対を選択した（実施例１）。低品質の細胞、例えばアポトーシス性ＣＴＣのＤＲＳ−ＷＧＡの成功を示すため、より短いＭｓｅＩフラグメントの第４のプライマー対を追加した（実施例２）。また、実施例ではＰＣＲ産物を「マーカー」とも呼び、また幾つかのプライマー対を含むＰＣＲ増幅反応を「マルチプレックスアッセイ」と呼ぶ。特に、試料のゲノムの完全性及び／又は試料のゲノムの確定的制限酵素部位全ゲノム増幅（ＤＲＳ−ＷＧＡ）によって得られたＤＮＡ配列のライブラリの質を判定するため設計された幾つかのプライマー対を含むＰＣＲ増幅反応を「品質管理アッセイ」又は「ＱＣアッセイ」とも呼ぶ。

【0056】

実施例１
２つの選択的マーカー（alternative marker）の組合せは、癌細胞試料及び正常な核型を有する二倍体細胞の試料の両方に対するＤＲＳ−ＷＧＡ（解析能（Resolution）１０Ｍｂ〜２０Ｍｂ）による単一細胞ゲノムＤＮＡの増幅後の分裂中期比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）の成功を予測することを示した。

【0057】

Ａ．試験した８個のＰＣＲマーカーの特性
２３９ｂｐ〜１９３６ｂｐのＭｓｅＩフラグメント長に亘る８個の異なるＭｓｅＩフラグメントに対するＰＣＲを試験した（表１）。単一癌細胞におけるゲノムＤＮＡ喪失による陰性のアッセイ結果の可能性を最小化するため、７個の異なる染色体腕に位置する配列を選択した。

【0058】

ピペッティングスキーム（１回） １．０μｌ バッファー＋ｄＮＴＰ
（１０ｍＭ ＭｇＣｌ、
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
（ｐＨ８．５）、５００ｍＭ
ＫＣｌ、１ｍＭ ｄＮＴＰ）
０．５μｌ プライマー３’（８μＭ）
０．５μｌ プライマー５’（８μＭ）
０．２５μｌ ＢＳＡ（分子生物学用）
７．２５μｌ ＰＣＲ−Ｈ_２Ｏ
０．１μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）
０．５μｌ Ａｍｐｌｉ１産物（試験試料）

【0059】

熱プロファイル
工程１ ９４．０℃ ２分
工程２ アニーリング温度 ３０秒
工程３ ７２．０℃ ２分
工程４ ９４．０℃ １５秒
工程５ アニーリング温度 ３０秒
工程６ ７２．０℃ ２０秒
１４の追加サイクル（工程４〜６）
工程７ ９４．０℃ １５秒
工程８ アニーリング温度 ３０秒
工程９ ７２．０℃ ３０秒
２４の追加サイクル（工程７〜９）
工程１０ ７２．０℃ ２分
工程１１ ４℃ 常時

【0060】

【表1】

【0061】

Ｂ．ＱＣアッセイに対するＰＣＲマーカーの選択
ＰＣＲマーカーの実現し得る最良の組合せを選択するため、異なる種類のヒト癌に由来する７２の単一細胞ゲノム（２４の乳房の播種性癌細胞（ＤＣＣ）、２４の前立腺ＤＣＣ、２４の黒色腫ＤＣＣ）を再度増幅した。上記３群の各々に対して、先のＣＧＨ実験において分裂中期ハイブリダイゼーションに成功した１２の細胞、及び先のＣＧＨ実験において分裂中期ハイブリダイゼーションに失敗した１２の細胞を含めた。選択した全てのマーカーに対して特異的ＰＣＲを行い、分裂中期ＣＧＨの結果の予測における精度について上記アッセイを評価した。

【0062】

単一マーカーとして、長いＭｓｅフラグメントであるＤ５Ｓ２１１７、ＴＲＰ５３−Ｅｘ２／３及びＫＲＴ１９偽遺伝子１（以下、ＣＫ１９とも呼ぶ）に対するＰＣＲは、分裂中期ＣＧＨの成功と失敗とによる増幅されたゲノムの最も良好な分離を提供した。これらの３つのフラグメントのアッセイは、分裂中期ＣＧＨの成功の予測において高いアッセイ精度を示した。最も短いＭｓｅフラグメントであるＰＨＡＣＴＲ２に対するＰＣＲの追加は、７２のＤＣＣゲノムの集合におけるアッセイ精度をわずかに高めた。

【0063】

要約すると、Ａｍｐｌｉ１用ＱＣキットに対する２つの選択ＱＣアッセイが開発された（表２）。
選択１：３つのマーカー（Ｄ５Ｓ２１１７、ＴＲＰ５３−Ｅｘ２／３、及びＣＫ１９）によるＱＣアッセイ
選択２：４つのマーカー（Ｄ５Ｓ２１１７、ＴＲＰ５３−Ｅｘ２／３、ＣＫ１９、及びＰＨＡＣＴＲ２）によるＱＣアッセイ

【0064】

【表2】

【0065】

可能な場合には、最高品質であり、選択した全てのマーカーに対して陽性（両方の選択的アッセイに対して１００％の特異性）の試料のみを使用するべきである。しかしながら、この高水準の品質管理を適用することに対するトレードオフは、高率の偽陰性である（７／３６＝１９．４％）。最高品質水準を有する試験試料の数が制限される場合であっても、２／３又は３／４の陽性ＰＣＲを有するＤＲＳ−ＷＧＡ増幅ゲノムは分裂中期ＣＧＨに対して高い成功率を予測する（それぞれ、３つのマーカーによるアッセイに対して０．９４、４つのマーカーによるアッセイに対して０．９７の特異性）。

【0066】

Ｃ．正常な核型を有する１００の二倍体細胞セットに対するＰＣＲマーカーの試験
ＱＣアッセイに対するＰＣＲマーカーセットを更に試験するため、正常な核型を有する二倍体細胞に由来する１００の単一細胞ゲノムを再度増幅した。全ての試料を８つの異なるＰＣＲマーカーについて試験した。さらに、予測された質の良好な２２のゲノム、及び予測された質の良くない１０のゲノムについて分裂中期ＣＧＨの成功を確認した。アッセイ精度の統計学的評価の結果を表３に示す。

【0067】

【表3】

【0068】

Ｄ．ＤＲＳ−ＷＧＡ増幅試料に対する選択したＱＣマーカーの更なる検証
Ｂ及びＣで試験した試料は既存の単一細胞ゲノムの既存のバイオバンクから採取されたことから、それらの試料を関連する研究室のＤＲＳ−ＷＧＡに合わせた試薬（異なる供給元によって提供される）によって増幅した。Ａｍｐｌｉ１キット（Silicon Biosystemsによって供給される）によって増幅された試料を用いて提案されたＱＣアッセイの性能を確認するため、健康なドナーの単一の単核ＰＢＬ及び細胞プール、並びに乳癌細胞株ＳＫＢＲ３の単一の細胞及び細胞プールを単離した。ＱＣアッセイに対してＢ及びＣで提案されたマーカーを使用して増幅したゲノムの質を予測した。その後、二倍体血液細胞、またＳＫＢＲ３細胞について、一組の試料（５つの単一細胞、１つの細胞プール及び１つのＡｍｐｌｉ１陰性対照）に対し分裂中期ＣＧＨ実験を行い、ＱＣアッセイの予測精度を確認した。
ＳＫＢＲ：１０／１１の単一細胞及び両細胞プールは４／４の陽性バンドマーカーＰＣＲを示した。
１／１１の細胞は試験した全てのマーカーについて陰性であった。
陰性対照は全ての試験したＰＣＲにおいてクリーン（clean）。
ＰＢＬ：１１／１１の単一細胞及び両細胞プールは４／４の陽性バンドマーカーＰＣＲを示した。
陰性対照は全ての試験したＰＣＲにおいてクリーン。

【0069】

実施例２
他の下流の解析、例えば特定のフラグメントに対するサンガーシークエンシングは単一細胞のＤＮＡの定量的及び定性的に非常に高い増幅に依存しないため、第４のフラグメントを含めた。この配列の増幅の成功だけで同等のＭｓｅフラグメント（ここでは、ＰＩＫ３ＣＡのホットスポット１及びホットスポット２）のサンガーシークエンシングの成功を予測するのに十分であるかどうかを試験するため実験を行った。

【0070】

Ａ．４マルチプレックスアッセイに対するプロトコル
既に確立された３マルチプレックスアッセイとの適合性を備えるため、コドン１２及びコドン１３をコードする頻繁に変異が導入されるヌクレオチドを包含するＫＲＡＳ Ｍｓｅフラグメントに対して新たなプライマーを設計した。これらのプライマーは、他の３つのバンド（Ｄ５Ｓ２１１７、ＣＫ１９及びＴＰ５３−Ｅｘｏｎ２／３、図１を参照されたい）と明確に区別することができる９１ｂｐ長のＰＣＲフラグメントを増幅する。

【0071】

下記ＫＲＡＳのプライマーを４μＭの濃度で上記プライマーミックスに加えて、以下のピペッティングスキーム及び熱プロファイルを使用した。
KRAS91bp-F ATAAGGCCTGCTGAAAATGAC（配列番号１７）
KRAS91bp-R CTGAATTAGCTGTATCGTCAAGG（配列番号１８）

【0072】

ピペッティングスキーム（１回） １．０μｌ Ａｍｐｌｉ１（商標）ＰＣＲ反応バッファー
（２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む）
０．２μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
１．０μｌ プライマーミックス
（８つのプライマー、各々４μＭ）
０．２μｌ ＢＳＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）
６．５μｌ ＰＣＲ−Ｈ_２Ｏ
０．１μｌ Ａｍｐｌｉ１（商標）Ｔａｑポリメラーゼ
（５Ｕ／μｌ）
１．０μｌ Ａｍｐｌｉ１（商標）産物（試験試料）

【0073】

熱プロファイル
工程１ ９５．０℃ ４分
工程２ ９５．０℃ ３０秒
工程３ ５８．０℃ ３０秒
工程４ ７２．０℃ ９０秒
３２のサイクル（工程２〜４）
工程５ ７２．０℃ ７分
工程６ ４．０℃ 常時

【0074】

各ＰＣＲ産物５μｌを１．２％アガロースゲルに充填した。表４に示されるように、得られたアンプリコンのｂｐ長を予想されるアンプリコンのｂｐ長と比較することにより結果を確認した。

【0075】

【表4】

【0076】

上述の通り、マーカーＢは多形部位にマッピングするため、ＰＣＲ産物は、
ホモ接合の場合があり、記載される範囲（１０８〜１６６）に含まれるｂｐの１つのバンドを示し、
ヘテロ接合の場合があり、記載される範囲（１０８〜１６６）に含まれる異なるｂｐの２つのバンドを示す。

【0077】

図３は、上に開示される４マルチプレックスアッセイを使用して異なる試料から得られたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の例を示す。

【0078】

例えば、図３の試料１は、３／４の陽性マーカーを示す。マーカーＢのヘテロ接合性又はホモ接合性（１又は２のバンド）を、マーカーＢに対する陽性の評価においては１として数えなければならない。例えば、試料２及び８は、４／４の陽性マーカーを示す。

【0079】

Ｂ．単一フラグメントＰＣＲ反応の結果を有する４マルチプレックスアッセイと確立された３マルチプレックスとの比較
実施例１の３マルチプレックスアッセイによって既に試験された乳房、前立腺、及び黒色腫のＤＣＣの７２のＤＲＳ−ＷＧＡライブラリを選択した。残念ながら、乳房０１の試料は反応チューブの亀裂により失われた。他の７１のＤＲＳ−ＷＧＡ産物を全てＫＲＡＳ ９１ｂｐの単一ＰＣＲ及び新たな４マルチプレックスアッセイにより更に試験した。要約すると、５３／７１の試料が単一マーカーＰＣＲにおいて９１ｂｐに予想されたバンドを示し、１つ（乳房２４）以外の全ての試料が４マルチプレックスアッセイにおいて同じバンドを示した。Ｄ５Ｓ２１１７、ＣＫ１９、及びＴＰ５３−Ｅｘｏｎ２／３に対する他の全てのバンドが３マルチプレックスアッセイによるものと同じ試料において検出された。さらに、ここで使用された３マルチプレックスで１又は複数のバンドを示した３８の全ての試料において、ＫＲＡＳ ９１ｂｐアンプリコンを検出した。さらに、１５の試料が、Ｄ５Ｓ２１１７、ＣＫ１９、及びＴＰ５３−Ｅｘｏｎ２／３に対して陰性であったが、ＫＲＡＳ ９１ｂｐのみに対して陽性であったと同定された。最後に、１８の試料は試験した４つ全てのアンプリコンに対して陰性であった。

【0080】

Ｃ．選択した１０の試料のＰＩＫ３ＣＡシークエンシング
ＫＲＡＳ ９１ｂｐアンプリコンのみを示した１５の試料のうち１０の試料をＰＩＫ３ＣＡシークエンシング解析に選択した（４の乳房ＤＣＣ試料、３の前立腺ＤＣＣ試料、及び３の黒色腫ＤＣＣ試料）。Ａｍｐｌｉ１（商標） ＰＩＫ３ＣＡ Ｓｅｑキット（イタリアのSilicon Biosystems SpA）を使用し、製造業者の指示書に従ってＨＳ１及びＨＳ２のフラグメントに対してＰＩＫ３ＣＡのＰＣＲを行った。ＰＣＲの後、全ての試料を１．５％アガロースゲルに充填し、電気泳動の後アンプリコンを可視化した。４つのＤＣＣ試料（前立腺ＤＣＣ１６、黒色腫ＤＣＣ１３、１４及び１６）においてＨＳ１に対してのみ、５つのＤＣＣ試料（前立腺ＤＣＣ１４及び１６、黒色腫ＤＣＣ１３、１４及び１６）においてＨＳ２に対してのみ強いバンドが得られた。また、更に２つの試料（乳房ＤＣＣ１３、前立腺ＤＣＣ２４）及び３つの試料（乳房ＤＣＣ１３及び１５、前立腺ＤＣＣ２４）に対して、それぞれ弱いものの明らかなバンドが検出された（図２）。１つの試料（黒色腫ＤＣＣ１６）は、この試料の先の全てのゲルでも明らかであった１ｋｂ以上のＤＮＡフラグメントに対する強いスメアを示した。しかしながら、全ての試料に対してＰＣＲアンプリコンを精製し、配列決定をした。

【0081】

ＰＩＫ３ＣＡ突然変異ホットスポットに対するサンガーシークエンシングは、黒色腫ＤＣＣ１６の試料を含むゲル電気泳動において強い増幅を示す試料（図２を参照されたい）に対して非常に強く明確な配列を生じた。より低濃度のアンプリコンを含む他のほとんどの試料は高いバックグラウンドノイズを示したが、ＨＳ１に対する２つの追加試料（乳房ＤＣＣ１３、前立腺ＤＣＣ２４）及びＨＳ２に対する４つの追加試料（乳房ＤＣＣ１３、１５及び２０、前立腺ＤＣＣ２４）について配列を容易に編集することができた。残りの試料については、完全配列の確実な編集にはバックグラウンドシグナルが高すぎた（ＨＳ１に対して乳房ＤＣＣ１５、１７及び２０、前立腺ＤＣＣ１４；ＨＳ２に対して乳房ＤＣＣ１５）。

【0082】

ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（商標）（Jannsen Diagnostics LLC）で富化された乳癌患者末梢血からＤＥＰＡｒｒａｙ（商標）（Silicon Biosystems SpA）を用いて採取したＣＴＣ及び白血球（ＷＢＣ）の集合に対し、本発明によるＡｍｐｌｉ１（商標）ＷＧＡ産物の質を分析することによってゲノム完全性を判断した。マルチプレックスＰＣＲ反応（ゲノム完全性指標（Genome Integrity Index）、すなわちＧＩＩ）に従って検出されて得られたＰＣＲ産物の数は、同じ富化ソーティング処理及びＡｍｐｌｉ１（商標）ＷＧＡを経た同じ患者から収集された正常なＷＢＣに関して、ＣＴＣにおいてより低い値のＧＩＩに対し、図４に示されるように、著しく歪んでいることがわかった。

【0083】

説明として、０の値のＧＩＩは第１のＰＣＲ産物、第２のＰＣＲ産物、第３のＰＣＲ産物又は第４のＰＣＲ産物がいずれも増幅されない状況に対応し、１の値のＧＩＩは第４のＰＣＲ産物のみが増幅される状況に対応し、２の値のＧＩＩは第１のＰＣＲ産物、第２のＰＣＲ産物、及び第３のＰＣＲ産物のうち１つと第４のＰＣＲ産物とが増幅される状況に対応し、３の値のＧＩＩは第１のＰＣＲ産物、第２のＰＣＲ産物、及び第３のＰＣＲ産物のうち２つと第４のＰＣＲ産物とが増幅される状況に対応し、４の値のＧＩＩは第１のＰＣＲ産物、第２のＰＣＲ産物、第３のＰＣＲ産物、及び第４のＰＣＲ産物が増幅される状況に対応する。

【0084】

ＰＩＫ３ＣＡのエクソン９及びエクソン２０の突然変異ホットスポットに対して標的化したサンガーシークエンシング、ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅を特定する慣例のｑＰＣＲアッセイ、並びにアレイＣＧＨの成功率を判断するため、ＧＩＩを更に使用した。表５は結果の一覧を示す。

【0085】

【表5】

【0086】

上の実施例は、本発明による方法が、強固で信頼性のある結果による試料のゲノムの完全性及び試料のゲノムのＤＲＳ−ＷＧＡによって得られたＤＮＡ配列のライブラリの質の判定を可能とし、特に、ＤＲＳ−ＷＧＡの下流である分裂中期及びアレイの比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、サンガーシークエンシング、及びｑＰＣＲ等の分子アッセイの性能を予測することを可能とすることを示す。

【0087】

本発明の方法及びキットの特徴の解析より、得られる利益が明らかである。

【0088】

特に、ＤＲＳ−ＷＧＡがＭｓｅＩ部位（ＴＴＡＡ）における二本鎖ＤＮＡの特異的制限酵素消化及び増幅に対する１つのユニバーサルアダプタのライゲーションに基づくという事実により、原則としては、増幅中に生成されたＷＧＡライブラリを表す全てのフラグメントが既知である。そのため、単一細胞ＷＧＡライブラリにおいて１０００ｂｐ超の長さを有する具体的なＭｓｅＩフラグメントの同定により、単離された細胞のＤＮＡのゲノム完全性を測定することができ、したがって、異なる種類の成功する分子解析について試料の質を判定することができる。

【0089】

第１のプライマー対、第２のプライマー対、及び第３のプライマー対が、ＤＮＡ断片化の場合には増幅がより困難なＤＲＳ−ＷＧＡのＤＮＡ消化酵素であるＭｓｅＩの長いアンプリコンに対応するゲノムの標的領域において特異的に選択されたことから、それらの増幅は所与の試料に対するＤＲＳ−ＷＧＡの良好な全体的成功の指標である。

【0090】

さらに、第１のプライマー対、第２のプライマー対、及び第３のプライマー対が異なる染色体腕に対して設計されるという事実により、上記方法は、試料のゲノムの完全性及び／又はゲノムの最も幅広い領域に亘って得られるＤＮＡ配列のライブラリの質を判断することを可能とする。

【0091】

さらに、第１のＰＣＲ産物、第２のＰＣＲ産物、第３のＰＣＲ産物、及び第４のＰＣＲ産物が異なるサイズを有するという事実により、第１のプライマー対、第２のプライマー対、第３のプライマー対、及び第４のプライマー対をマルチプレックス反応において共に使用することができる。

【0092】

さらに、第４のプライマー対が８０ｂｐ〜３００ｂｐの長さを有する上記ライブラリのＤＮＡ配列にハイブリダイズするという事実により、低品質の細胞、例えばアポトーシス性ＣＴＣに対してもＤＲＳ−ＷＧＡの下流の分子アッセイの性能を予測することができる。例えば、ＰＩＫ３ＣＡエクソン９（３０％）及びエクソン２０（３４％）の標的化サンガーシークエンシングにおける成功率、又はＨｅｒ２ ＣＮＶ解析に対するｑＰＣＲにおける成功率（２５％）についてはこの第４のＰＣＲ産物が増幅されることのない細胞と少なくとも第４のＰＣＲ産物が増幅可能である細胞との間に実際、性能に有意な差が存在し、その成功率はおおよそ２倍になる（それぞれ、５６％、７２％、５０％）。上記２集団は、ＤＲＳ−ＷＧＡの長いアンプリコンにハイブリダイズする３つのプライマー対のみを使用する場合には区別がつかない。

【0093】

最後に、添付の特許請求の範囲の保護の範囲から逸脱することなく、開示され、示される方法及びキットに対する変更及び変形を行ってもよいことが明らかである。

【0094】

特に、上記方法は、第１のプライマー、第２のプライマー、第３のプライマー、及び場合によっては第４のプライマーを用いるＰＣＲ増幅を干渉しない更なるプライマー対を使用することにより多重化されてもよい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]