特許 6543381 オリゴヌクレオチドの送達のための新規な低分子量カチオン性脂質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6543381

(24)【登録日】2019年6月21日

(45)【発行日】2019年7月10日

(54)【発明の名称】オリゴヌクレオチドの送達のための新規な低分子量カチオン性脂質

(51)【国際特許分類】

   C07C 211/17 20060101AFI20190628BHJP

   C07C 209/28 20060101ALI20190628BHJP

   C07C 211/21 20060101ALI20190628BHJP

   C07C 209/50 20060101ALI20190628BHJP

   C07B 61/00 20060101ALN20190628BHJP

【ＦＩ】

   C07C211/17

   C07C209/28

   C07C211/21

   C07C209/50

   !C07B61/00 300

【請求項の数】9

【全頁数】51

(21)【出願番号】特願2018-93315(P2018-93315)

(22)【出願日】2018年5月14日

(62)【分割の表示】特願2015-235135(P2015-235135)の分割

【原出願日】2011年9月20日

(65)【公開番号】特開2018-150338(P2018-150338A)

(43)【公開日】2018年9月27日

【審査請求日】2018年5月14日

(31)【優先権主張番号】61/514,270

(32)【優先日】2011年8月2日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/384,486

(32)【優先日】2010年9月20日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500203684

【氏名又は名称】サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｓｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】スタントン，マシユー・ジー

(72)【発明者】

【氏名】バドズイク，ブライアン・ダブリユー

(72)【発明者】

【氏名】ブートナー，グレゴリー・エル

(72)【発明者】

【氏名】リヤオ，ホンビヤオ

【審査官】 神谷 昌克

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００６−５０２２２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 MARCH'S ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，２００７年，SIXTH EDITION，pp.1288-1292,1841-1842

【文献】 人名反応に学ぶ有機合成戦略，２００６年，第１版第１刷，pp.344-345,412-413,478-479

【文献】 Bulletin of the Korean Chemistry Society，２００７年，Vol.28, No.12，pp.2162-2190

【文献】 Beilstein Journal of Organic Chemistry，２００６年，Vol.2, No.16，pp.1-10，doi:10.1186/1860-5397-2-16

【文献】 Organic Letters，２００３年，Vol.5, No.14，pp.2417-2420

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｃ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（化合物３３）の製法であって、
ワインレブアミドｘ

【化1】

を、ノニルグリニャール試薬と反応させ、続いて、還元的アミノ化を行い、化合物３３を得るステップを含む、方法。

【請求項2】

還元的アミノ化が、Ｔｉ（ＯｉＰｒ）_４及び水素化ホウ素ナトリウムを用いて行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ワインレブアミドｘが、ワインレブアミドｉｉ

【化2】

を、Ｚｎ（Ｅｔ）_２の存在下で、ジヨードメタンと反応させることにより得られる、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ワインレブアミドｉｉが、カルボニルジイミダゾール及びトリエチルアミンの存在下、オレイン酸をジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩と反応させることにより得られる、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン（化合物３２）の製法であって、
アミドｖｉｉｉ

【化3】

を、水素化リチウムアルミニウムで還元することにより化合物３２を得るステップを含む、方法。

【請求項6】

アミドｖｉｉｉが、アミドｖｉｉ

【化4】

を、ＬＳ−セレクトリドにより還元することにより得られる、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

アミドｖｉｉｉが、アミドｖｉｉを、銅触媒及びｔ−アミルアルコールの存在下、ポリメチルヒドロシロキサンにより還元することにより得られる、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

アミドｖｉｉが、ケトンｉｉｉ

【化5】

を、塩基の存在下、

【化6】

と反応させることにより得られる、請求項６又は請求項７に記載の方法。

【請求項9】

塩基が、ｎ−ＢｕＬｉである、請求項８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞内取込みおよびエンドソームからの脱出を助長するため、ならびにイン
ビトロおよびインビボの両方において標的ｍＲＮＡをノックダウンするための、オリゴヌ
クレオチドを有する脂質ナノ粒子を形成するためのコレステロールおよびＰＥＧ−脂質な
どの他の脂質成分と組み合わせて使用され得る新規なカチオン性脂質に関する。

【背景技術】

【0002】

カチオン性脂質、ならびにオリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送
達のための脂質ナノ粒子におけるカチオン性脂質の使用は、これまでにも開示されている
。脂質ナノ粒子、ならびにオリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達
のための脂質ナノ粒子の使用は、これまでにも開示されている。オリゴヌクレオチド（例
えば、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）ならびにオリゴヌクレオチドの合成は、これまでに
も開示されている（米国特許出願：特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４お
よび特許文献５ならびにＰＣＴ特許出願：特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文
献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２および特許文献１３参照）。また、非
特許文献１も参照のこと。

【0003】

他のカチオン性脂質は、米国特許出願：特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、
特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０および特許文献２１に開示さ
れている。

【0004】

ＣＬｉｎＤＭＡおよびＤＬｉｎＤＭＡなどの従来からのカチオン性脂質は肝臓へのｓｉ
ＲＮＡ送達に使用されているが、送達効率が最適でないとともに、高用量では肝臓毒性と
いう欠点を有する。本発明の目的は、肝臓内低脂質レベルの結果、向上した有効性ととも
に低肝臓毒性を示すカチオン性脂質骨格を提供することである。本発明では、ｓｉＲＮＡ
のインビボ送達の効率および耐容性を向上させるために、１つの短い脂質鎖を有する低分
子量カチオン性脂質を使用する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号明細書

【特許文献2】米国特許出願公開第２００６／０２４０５５４号明細書

【特許文献3】米国特許出願公開第２００８／００２００５８号明細書

【特許文献4】米国特許出願公開第２００９／０２６３４０７号明細書

【特許文献5】米国特許出願公開第２００９／０２８５８８１号明細書

【特許文献6】国際公開第２００９／０８６５５８号パンフレット

【特許文献7】国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット

【特許文献8】国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレット

【特許文献9】国際公開第２０１０／０４２８７７号パンフレット

【特許文献10】国際公開第２０１０／０５４３８４号パンフレット

【特許文献11】国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレット

【特許文献12】国際公開第２０１０／０５４４０５号パンフレット

【特許文献13】国際公開第２０１０／０５４４０６号パンフレット

【特許文献14】米国特許出願公開第２００９／０２６３４０７号明細書

【特許文献15】米国特許出願公開第２００９／０２８５８８１号明細書

【特許文献16】米国特許出願公開第２０１０／００５５１６８号明細書

【特許文献17】米国特許出願公開第２０１０／００５５１６９号明細書

【特許文献18】米国特許出願公開第２０１０／００６３１３５号明細書

【特許文献19】米国特許出願公開第２０１０／００７６０５５号明細書

【特許文献20】米国特許出願公開第２０１０／００９９７３８号明細書

【特許文献21】米国特許出願公開第２０１０／０１０４６２９号明細書

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｓｅｍｐｌｅ Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，２８，１７２−１７６

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、オリゴヌクレオチドを有する脂質ナノ粒子を形成するためのコレステロール
およびＰＥＧ−脂質などの他の脂質成分と組み合わせて使用され得る新規なカチオン性脂
質を提供する。本発明の目的は、肝臓内低脂質レベルの結果、向上した有効性とともに低
肝臓毒性を示すカチオン性脂質骨格を提供することである。本発明では、ｓｉＲＮＡのイ
ンビボ送達の効率および耐容性を向上させるために、１つの短い脂質鎖を有する低分子量
カチオン性脂質を使用する。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】マウスにおけるＬＮＰ（化合物１）の有効性の図である。

【図2】ラットにおけるＬＮＰ（化合物３２および３３）の有効性の図である（ＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡ）。

【図3】ラット肝臓におけるカチオン性脂質（化合物３２および３３）レベルの図である。

【図4】ＮＨＰにおけるＬＮＰ（化合物３２および３３，ＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡ）の有効性の図である。

【図5】ＮＨＰにおけるＬＮＰ（化合物３２および３３，β−カテニンｓｉＲＮＡ）の有効性の図である。

【図6】ＬＮＰ投与後のＮＨＰにおけるピークＡＬＴレベルの図である（化合物３２および３３）。

【図7】ＮＨＰ肝臓におけるカチオン性脂質（化合物３２および３３）レベルの図である。

【図8】ＴＲＥ−Ｍｅｔマウスにおける肝臓β−カテニンｍＲＮＡ ＫＤの図である（化合物３３）。

【図9】ＴＲＥ−Ｍｅｔマウスにおける腫瘍β−カテニンｍＲＮＡ ＫＤの図である（化合物３３）。

【図10】ＴＲＥ−ｍｅｔマウスにおける腫瘍増殖阻害の図である（化合物３３）。

【図11】マウスにおけるＬＮＰ（化合物３２および３３）の有効性の図である。

【図12】ＴＲＥ−Ｍｅｔマウスにおける肝臓β−カテニンｍＲＮＡ ＫＤの図である（化合物３２）。

【図13】ＴＲＥ−Ｍｅｔマウスにおける腫瘍β−カテニンｍＲＮＡ ＫＤの図である（化合物３２）。

【図14】ＴＲＥ−ｍｅｔマウスにおける腫瘍増殖阻害の図である（化合物３２）。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明の種々の態様および実施形態は、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍ
ｉＲＮＡを任意の標的遺伝子に送達するための脂質ナノ粒子に有用な新規なカチオン性脂
質の実用性に関するものである（米国特許出願：米国特許出願公開第２００６／００８３
７８０号明細書、同第２００６／０２４０５５４号明細書、同第２００８／００２００５
８号明細書、同第２００９／０２６３４０７号明細書および同第２００９／０２８５８８
１号明細書ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号パンフレット
、同第２００９／１２７０６０号パンフレット、同第２００９／１３２１３１号パンフレ
ット、同第２０１０／０４２８７７号パンフレット、同第２０１０／０５４３８４号パン
フレット、同第２０１０／０５４４０１号パンフレット、同第２０１０／０５４４０５号
パンフレットおよび同第２０１０／０５４４０６号パンフレット参照）。また、Ｓｅｍｐ
ｌｅ Ｓ．Ｃ．ら，Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐ
ｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，２０１０，２８，１７２−１７６も参照のこと。

【0010】

本発明のカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチド、具体的にはｓｉＲＮＡおよびｍｉＲ
ＮＡの送達のための脂質ナノ粒子に有用な成分である。

【0011】

本発明の第１の実施形態において、カチオン性脂質は、式Ａ：

【0012】

【化1】

（式中：
Ｒ^１およびＲ^２は、独立して、Ｈ、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル、ヘテロシクリルおよびポ
リアミンから選択され、ここで、前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、Ｒ
’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、あるいはＲ^１およびＲ^２は
、これらが結合している窒素と一体となって、該窒素に加えてＮ、ＯおよびＳから選択さ
れる１個または２個のさらなるヘテロ原子を含むものであってもよい４〜７員の単環式複
素環を形成していてもよく、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基
で置換されていてもよく；
Ｒ^３は、独立してＨおよび（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルから選択され、前記アルキルは、Ｒ
’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ’は、独立して、ハロゲン、Ｒ”、ＯＲ”、ＳＲ”、ＣＮ、ＣＯ_２Ｒ”またはＣＯＮ
（Ｒ”）_２から選択され；
Ｒ”は、独立して、Ｈおよび（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルから選択され、ここで、前記アル
キルはハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよく；
ｎは、０、１、２、３、４または５であり；
Ｌ_１はＣ_４〜Ｃ_２４アルキルおよびＣ_４〜Ｃ_２４アルケニルから選択され、前記アルキ
ルおよびアルケニルは、Ｒ’から選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよく；
Ｌ_２は、Ｃ_３〜Ｃ_９アルキルおよびＣ_３〜Ｃ_９アルケニルから選択され、前記アルキル
およびアルケニルは、Ｒ’から選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよい）
で示されるもの、またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体である。

【0013】

第２の実施形態において、本発明は、
Ｒ^１およびＲ^２が各々メチルであり；
Ｒ^３がＨであり；
ｎが０であり；
Ｌ_１が、Ｃ_４〜Ｃ_２４アルキルおよびＣ_４〜Ｃ_２４アルケニルから選択され；
Ｌ_２が、Ｃ_３〜Ｃ_９アルキルおよびＣ_３〜Ｃ_９アルケニルから選択される、
式Ａを有する化合物またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体を特色
とする。

【0014】

第３の実施形態において、本発明は、
Ｒ^１およびＲ^２が各々メチルであり；
Ｒ^３がＨであり；
ｎが２であり；
Ｌ_１が、Ｃ_４〜Ｃ_２４アルキルおよびＣ_４〜Ｃ_２４アルケニルから選択され；
Ｌ_２が、Ｃ_３〜Ｃ_９アルキルおよびＣ_３〜Ｃ_９アルケニルから選択される、
式Ａを有する化合物またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体を特色
とする。

【0015】

具体的なカチオン性脂質は、
（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン
（化合物１）；
（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−９−アミン
（化合物２）；
（１６Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−８−アミン
（化合物３）；
（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルドコサ−１３，１６−ジエン−５−アミン（化
合物４）；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘニコサ−１２，１５−ジエン−４−アミン（
化合物５）；
（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−６−アミン（
化合物６）；
（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−７−アミン
（化合物７）；
（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−１０−アミ
ン（化合物８）；
（１５Ζ，１８Ζ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−５−アミン
（化合物９）；
（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−４−アミン（
化合物１０）；
（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−９−アミン
（化合物１１）；
（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−８−アミン
（化合物１２）；
（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−７−アミン
（化合物１３）；
（１６Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−６−アミン
（化合物１４）；
（２２Ｚ，２５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２，２５−ジエン−１０
−アミン（化合物１５）；
（２１Ｚ，２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリアコンタ−２１，２４−ジエン−９−アミ
ン（化合物１６）；
（１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコス−１８−エン−１０−アミン（化合物１７）
；
（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコス−１７−エン−９−アミン（化合物１８）；
（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−７−アミン
（化合物１９）；および
Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサン−１０−アミン（化合物２０）；
（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−
アミン（化合物２１）；
１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−１−ノニリコサ−１１，１４−ジエン−１−イル］ピロリ
ジン（化合物２２）；
（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコス−２０−エン−１０−アミン（化合物２３）
；
（１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコス−１５−エン−１０−アミン（化合物２４）
；
（１４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコス−１４−エン−１０−アミン（化合物２５）；
（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコス−１７−エン−１０−アミン（化合物２６）；
（２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリトリアコント−２４−エン−１０−アミン（化合物
２７）；
（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコス−２０−エン−１０−アミン（化合物２８）；
（２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコント−２２−エン−１０−アミン（化合物
２９）；
（１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコス−１６−エン−８−アミン（化合物３０）；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ−１２，１５−ジエン−
１−アミン（化合物３１）；
（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１
−アミン（化合物３２）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカ
ン−８−アミン（化合物３３）；
１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヘキシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナデカン
−１０−アミン（化合物３４）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ノナデカン
−１０−アミン（化合物３５）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−２１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘニコサ
ン−１０−アミン（化合物３６）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシ
クロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン（化合物３７）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘキサデカ
ン−８−アミン（化合物３８）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ウンデシルシクロプロピル］テトラデ
カン−５−アミン（化合物３９）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛７−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプ
チル｝ドデカン−１−アミン（化合物４０）
１−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヘプチルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデカ
ン−９−アミン（化合物４１）；
１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−デシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタデカン
−６−アミン（化合物４２）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ペンタデカ
ン−８−アミン（化合物４３）；ならびに
（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２３−トリエ
ン−１０−アミン（化合物４４）
またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体である。

【0016】

別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は脂質ナノ粒子の調製に有用である。

【0017】

別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドの送達のため
の脂質ナノ粒子に有用な成分である。

【0018】

別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送
達のための脂質ナノ粒子に有用な成分である。

【0019】

別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は、ｓｉＲＮＡの送達のための脂質ナ
ノ粒子に有用な成分である。

【0020】

本発明のカチオン性脂質は、不斉中心、キラル軸およびキラル面（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ
およびＳ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃ
ｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４
，第１１１９〜１１９０頁に記載）を有するものであってもよく、ラセミ化合物、ラセミ
混合物として、および個々のジアステレオマーとして存在し、可能なすべての異性体およ
びその混合物（例えば、光学異性体）は、本発明に含まれる。また、本明細書に開示した
カチオン性脂質は互変異性体として存在するものであってもよく、たとえ一方の互変異性
体構造しか図示していない場合であっても、両方の互変異性形態が本発明の範囲に包含さ
れることを意図する。

【0021】

本発明のカチオン性脂質における置換基および置換パターンは、当業者により、容易に
入手可能な出発物質から当該技術分野で知られた手法ならびに以下に示す方法によって容
易に合成され得る化学的に安定なカチオン性脂質が得られるように選択され得ることは理
解されよう。置換基それ自体が１つより多くの基で置換されている場合、安定な構造がも
たらされる限り、このような多数の基は同じ炭素上にあっても異なる炭素上にあってもよ
いことは理解されよう。

【0022】

当業者により、容易に入手可能な出発物質から当該技術分野で知られた手法によって容
易に合成され得る化学的に安定なカチオン性脂質が得られるように、１個以上のＳｉ原子
が本発明のカチオン性脂質に組み込まれることがあり得ることは理解されよう。

【0023】

式Ａの化合物において、原子は天然状態の同位体存在度を示すものであってもよく、１
個以上の原子において、同じ原子番号を有するが原子量または質量数は自然界に主として
見られる原子量または質量数と異なる特定の同位体を人為的に富化したものであってもよ
い。本発明は、式Ａの化合物の適当なあらゆる同位体異型形態を含むことを意図する。例
えば、水素（Ｈ）の異なる同位体形態としては、プロチウム（^１Ｈ）およびジューテリウ
ム（^２Ｈ）が挙げられる。プロチウムは、自然界に主として見られる水素の同位体である
。ジューテリウムの富化により、特定の治療上の利点（インビボ半減期の増大もしくは必
要投薬量の低減など）がもたらされ得るか、または生物学的試料の特性評価のための標準
として有用な化合物が得られ得る。式Ａに含まれる同位体富化された化合物は、必要以上
に実験を行うことなく、当業者によく知られた慣用的な手法によって、または本明細書の
スキームおよび実施例に記載のものと同様のプロセスによって、適切な同位体富化試薬お
よび／または中間体を用いて調製され得る。

【0024】

本明細書で用いる場合、「アルキル」は、指定された数の炭素原子を有する直鎖、環状
または分枝型の飽和脂肪族炭化水素を意図する。

【0025】

本明細書で用いる場合、「アルケニル」は、指定された数の炭素原子を有する直鎖、環
状または分枝型の不飽和脂肪族炭化水素を意味し、限定されないが、ジエン、トリエンお
よびテトラエン不飽和脂肪族炭化水素が挙げられる。

【0026】

環状「アルキル」または「アルケニルの例としては、

【0027】

【化2】

が挙げられる。

【0028】

本明細書で用いる場合、「ヘテロシクリル」または「複素環」は、Ｏ、ＮおよびＳから
なる群より選択される１〜４個のヘテロ原子を含む４〜１０員の芳香族または非芳香族複
素環を意味し、二環式基を包含する。したがって、「ヘテロシクリル」としては、以下の
もの：ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベ
ンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリ
ニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジ
ニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾ
リル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサ
ゾリン、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダ
ジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリ
ニル、キノリル、キノオキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラゾリル、テトラゾロ
ピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、１，
４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニ
ル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフ
ラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル
、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイ
ソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル
、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル
、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチア
ゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジ
オキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニル、ならびにその
Ｎ−オキシドが挙げられ、これらはすべて、Ｒ”から選択される１〜３個の置換基で置換
されていてもよい。

【0029】

本明細書で用いる場合、「ポリアミン」は、２つ以上のアミノ基を有する化合物を意味
する。例としては、プトレシン、カダベリン、スペルミジン、およびスペルミンが挙げら
れる。

【0030】

本明細書で用いる場合、「ハロゲン」はＢｒ、Ｃｌ、ＦおよびＩを意味する。

【0031】

式Ａの一実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２は、独立して、Ｈおよび（Ｃ_１〜Ｃ_６）ア
ルキルから選択され、ここで、前記アルキルはＲ’から選択される１〜３個の置換基で置
換されていてもよく、あるいはＲ^１およびＲ^２は、これらが結合している窒素と一体とな
って、該窒素に加えてＮ、ＯおよびＳから選択される１個または２個のさらなるヘテロ原
子を含むものであってもよい４〜７員の単環式複素環を形成していてもよく、前記単環式
複素環はＲ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい。

【0032】

式Ａの一実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２は、独立して、Ｈ、メチル、エチルおよび
プロピルから選択され、ここで、前記メチル、エチルおよびプロピルは、Ｒ’から選択さ
れる１〜３個の置換基で置換されていてもよく、あるいはＲ^１およびＲ^２は、これらが結
合している窒素と一体となって、該窒素に加えてＮ、ＯおよびＳから選択される１個また
は２個のさらなるヘテロ原子を含むものであってもよい４〜７員の単環式複素環を形成し
ていてもよく、前記単環式複素環はＲ’から選択される１〜３個の置換基で置換されてい
てもよい。

【0033】

式Ａの一実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２は、独立して、Ｈ、メチル、エチルおよび
プロピルから選択される。

【0034】

式Ａの一実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２は各々、メチルである。

【0035】

式Ａの一実施形態において、Ｒ^３は、独立して、Ｈおよびメチルから選択される。

【0036】

式Ａの一実施形態において、Ｒ^３はＨである。

【0037】

式Ａの一実施形態において、Ｒ’はＲ”である。

【0038】

式Ａの一実施形態において、Ｒ”は、独立して、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルか
ら選択され、ここで、前記メチル、エチルおよびプロピルは、１つ以上のハロゲンおよび
ＯＨで置換されていてもよい。

【0039】

式Ａの一実施形態において、Ｒ”は、独立して、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルか
ら選択される。

【0040】

式Ａの一実施形態において、ｎは０、１、２または３である。

【0041】

式Ａの一実施形態において、ｎは０、１または２である。

【0042】

式Ａの一実施形態において、ｎは０、１または２である。

【0043】

式Ａの一実施形態において、ｎは０である。

【0044】

式Ａの一実施形態において、ｎは２である。

【0045】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_１は、Ｃ_４〜Ｃ_２４アルキルおよびＣ_４〜Ｃ_２４アルケ
ニル（これらはハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい）から選択される。

【0046】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_１は、Ｃ_４〜Ｃ_２４アルキルおよびＣ_４〜Ｃ_２４アルケ
ニルから選択される。

【0047】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_１は、Ｃ_４〜Ｃ_２４アルケニルから選択される。

【0048】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_１は、Ｃ_１２〜Ｃ_２４アルケニルから選択される。

【0049】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_１はＣ_１９アルケニルである。

【0050】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_１は：

【0051】

【化3】

である。

【0052】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_１は：

【0053】

【化4】

である。

【0054】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_２は、Ｃ_３〜Ｃ_９アルキルおよびＣ_３〜Ｃ_９アルケニル
（これらはハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい）から選択される。

【0055】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_２は、Ｃ_５〜Ｃ_９アルキルおよびＣ_５〜Ｃ_９アルケニル
（これらはハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい）から選択される。

【0056】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_２は、Ｃ_７〜Ｃ_９アルキルおよびＣ_７〜Ｃ_９アルケニル
（これらはハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい）から選択される。

【0057】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_２は、Ｃ_３〜Ｃ_９アルキルおよびＣ_３〜Ｃ_９アルケニル
から選択される。

【0058】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_２は、Ｃ_５〜Ｃ_９アルキルおよびＣ_５〜Ｃ_９アルケニル
から選択される。

【0059】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_２は、Ｃ_７〜Ｃ_９アルキルおよびＣ_７〜Ｃ_９アルケニル
から選択される。

【0060】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_２はＣ_３〜Ｃ_９アルキルである。

【0061】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_２はＣ_５〜Ｃ_９アルキルである。

【0062】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_２はＣ_７〜Ｃ_９アルキルである。

【0063】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_２はＣ_９アルキルである。

【0064】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_１は、Ｃ_４〜Ｃ_２４アルキルおよびＣ_４〜Ｃ_２４アルケ
ニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’から選択される１つ以上の置
換基で置換されていてもよく；Ｌ_２は、Ｃ_３〜Ｃ_９アルキルおよびＣ_３〜Ｃ_９アルケニル
から選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’から選択される１つ以上の置換基
で置換されていてもよい。

【0065】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_１はＣ_１２〜Ｃ_２４アルケニルから選択され、前記アル
ケニルは、Ｒ’から選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよく；Ｌ_２はＣ_５〜
Ｃ_９アルキルから選択され、前記アルキルは、Ｒ’から選択される１つ以上の置換基で置
換されていてもよい。

【0066】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_１はＣ_１９アルケニルから選択され、前記アルケニルは
、Ｒ’から選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよく；Ｌ_２はＣ_７〜Ｃ_９アル
キルから選択され、前記アルキルは、Ｒ’から選択される１つ以上の置換基で置換されて
いてもよい。

【0067】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_１はＣ_１９アルケニルから選択され、前記アルケニルは
、Ｒ’から選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよく；Ｌ_２はＣ_９アルキルか
ら選択され、前記アルキルは、Ｒ’から選択される１つ以上の置換基で置換されていても
よい。

【0068】

式Ａの一実施形態において、Ｌ_１は直鎖Ｃ_１９アルケニルから選択され、前記アルケニ
ルは、Ｒ’から選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよく；Ｌ_２は直鎖Ｃ_９ア
ルキルから選択され、前記アルキルは、Ｒ’から選択される１つ以上の置換基で置換され
ていてもよい。

【0069】

式Ａの一実施形態において、「ヘテロシクリル」は、ピロリジン、ピペリジン、モルホ
リン、イミダゾールまたはピペラジンである。

【0070】

式Ａの一実施形態において、「単環式ヘテロシクリル」は、ピロリジン、ピペリジン、
モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。

【0071】

式Ａの一実施形態において、「ポリアミン」は、プトレシン、カダベリン、スペルミジ
ンまたはスペルミンである。

【0072】

一実施形態において、「アルキル」は、指定された数の炭素原子を有する直鎖飽和脂肪
族炭化水素である。

【0073】

一実施形態において、「アルケニル」は、指定された数の炭素原子を有する直鎖不飽和
脂肪族炭化水素である。

【0074】

本発明は、遊離形態の式Ａのカチオン性脂質、ならびにその薬学的に許容され得る塩お
よび立体異性体を含む。本明細書において例示した具体的な単離されたカチオン性脂質の
いくつかは、アミンであるカチオン性脂質のプロトン化された塩である。用語「遊離形態
」は非塩形態のアミンであるカチオン性脂質をいう。包含される薬学的に許容され得る塩
には、本明細書に記載した具体的なカチオン性脂質について例示した単離された塩だけで
なく、遊離形態の式Ａのカチオン性脂質の典型的なあらゆる薬学的に許容され得る塩も包
含される。記載した具体的な塩であるカチオン性脂質の遊離形態は、当該技術分野で知ら
れた手法を用いて単離され得る。例えば、遊離形態は、その塩を、希釈した適当な塩基水
溶液（希釈した水性ＮａＯＨ、炭酸カリウム、アンモニアおよび重炭酸ナトリウムなど）
で処理することにより再生させたものであり得る。遊離形態は、そのそれぞれの塩形態と
特定の物性（極性溶媒中への溶解性など）が幾分異なり得るが、その酸と塩基の塩は、そ
の他の点では、本発明の解釈上、そのそれぞれの遊離形態と薬学的に等価である。

【0075】

本発明のカチオン性脂質の薬学的に許容され得る塩は、塩基性または酸性の部分を含む
本発明のカチオン性脂質から、慣用的な化学的方法によって合成され得る。一般的に、塩
基性のカチオン性脂質の塩は、イオン交換クロマトグラフィー、または遊離塩基を化学量
論量もしくは過剰の所望の塩形成無機酸もしくは有機酸と適当な溶媒中もしくは種々の溶
媒の組合せ中で反応させることのいずれかによって調製される。同様に、酸性化合物の塩
は、適切な無機塩基または有機塩基との反応によって形成される。

【0076】

したがって、本発明のカチオン性脂質の薬学的に許容され得る塩は、塩基性の本発明の
カチオン性脂質を無機酸または有機酸と反応させることにより形成される本発明のカチオ
ン性脂質の慣用的な無毒性の塩を包含する。例えば、慣用的な無毒性の塩としては、無機
酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸など）から得られ
るもの、ならびに有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステ
アリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、
ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファ
ニル酸、２−アセトキシ−安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸
、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）など）か
ら調製される塩が挙げられる。

【0077】

本発明のカチオン性脂質が酸性である場合、好適な「薬学的に許容され得る塩」は、薬
学的に許容され得る無毒性の塩基（例えば、無機塩基および有機塩基）から（ｆｏｒｍ）
調製される塩をいう。無機塩基から得られる塩としては、アルミニウム、アンモニウム、
カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩、第一マン
ガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などが挙げられる。特に好ましいのは、アンモニウム
、カルシウム、マグネシウム、カリウムおよびナトリウムの塩である。薬学的に許容され
得る無毒性の有機塩基から得られる塩としては、第１級、第２級および第３級アミン、置
換アミン（天然に存在する置換アミンを含む）、環状アミン、および塩基性イオン交換樹
脂、例えば、アルギニン、ベタイン カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ^１−ジベンジルエチレ
ンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタ
ノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペ
リジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、
リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プ
ロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン トリプロピル
アミン、トロメタミンなどの塩が挙げられる。

【0078】

上記の薬学的に許容され得る塩および他の典型的な薬学的に許容され得る塩の調製は、
Ｂｅｒｇら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ
．，１９７７：６６：１−１９により充分に記載されている。

【0079】

また、生理学的条件下では本化合物内の脱プロトン化された酸性部分（カルボキシル基
など）がアニオン性となることがあり得、そのため、この電子電荷によって分子内で、プ
ロトン化またはアルキルされた塩基性部分（第４級窒素原子など）のカチオン電荷に対す
るバランスが崩れることがあり得るため、本発明のカチオン性脂質は、分子内（ｉｎｔｅ
ｒｎａｌ）塩または両性イオンとなる可能性があることに注意されたい。

【実施例】

【0080】

ここに示す実施例は、本発明のさらなる理解の補助を意図するものである。具体的な使
用材料、種および条件は、さらなる実例を意図するものであって、本発明の妥当な範囲を
限定するものではない。カチオン性脂質の合成に使用した試薬は、市販のもの、または当
業者によって容易に調製されるもののいずれかである。

【0081】

新規な本カチオン性脂質の合成は、脂質酸（Ｉ）を出発物質とする線形プロセスである
。Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンにカップリングさせると、ワインレブアミドＩＩ
が得られる。グリニャール付加によりケトンＩＩＩが生成される。チタン媒介性還元的ア
ミノ化によりＩＶの型の最終生成物が得られる。

【0082】

一般スキーム１

【0083】

【化5】

単一炭素ホモログ化カチオン性脂質Ｖの合成は、脂質ケトン（ＩＩＩ）を出発物質とす
る線形プロセスである。該ケトンのニトリル（Ｖ）への変換は、ＴＯＳＭＩＣおよびカリ
ウムｔｅｒｔ−ブトキシドでの処理によって行われる。該ニトリルを第１級アミンに還元
した後、還元的アミノ化を行うと最終のカチオン性脂質ＶＩが得られる。

【0084】

一般スキーム２

【0085】

【化6】

二炭素ホモログ化カチオン性脂質ＩＸの合成は、脂質ケトン（ＩＩＩ）を出発物質とす
る線形プロセスである。該ケトンのα，β−不飽和アミドＶＩＩへの変換は、ピーターソ
ン条件下で行われる。該α，β−不飽和の共役還元は、ＬＳ−セレクトリドを用いて行わ
れ、アミドＶＩＩＩが得られる。該アミドを水素化アルミニウムリチウムで還元すると、
最終のカチオン性脂質ＩＸが得られる。

【0086】

一般スキーム３

【0087】

【化7】

シクロプロピル含有脂質は一般スキーム４に従って調製される。不飽和ワインレブアミ
ドＩＩをシモンズ・スミスシクロプロパン化条件に供すると、シクロプロピル含有ワイン
レブアミドＸが得られる。これを、一般スキーム１〜３に概略を示したようにして最終生
成物にする。

【0088】

一般スキーム４

【0089】

【化8】

アリル型アミンカチオン性脂質ＸＶＩの合成は、アルデヒドＸＩを出発物質とする線形
プロセスである。酢酸ｔ−ブチルを付加すると、β−ヒドロキシエステルＸＩＩが生成さ
れる。該ヒドロキシル官能部をフルオロ基に変換させた後、酸処理を行うと、β−フルオ
ロ酸ＸＩＩＩが生成される。この酸をワインレブアミドに変換させた後、グリニャール付
加を行うと、β−フルオロケトンＸＶが得られる。還元的アミノ化によって同時に脱離が
もたらされ、所望のアリル型アミンＸＶＩが生成される。

【0090】

一般スキーム５

【0091】

【化9】

２０，２３−ノナコサジエン−１０−アミン，Ｎ，Ｎ−ジメチル−，（２０Ｚ，２３Ｚ）
（化合物１）

【0092】

【化10】

１１，１４−エイコサジエン酸，（１１Ｚ，１４Ｚ）−（５０ｇ，１６２ｍｍｏｌ）、
Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（３１．６ｇ，３２４ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ
（４４．１ｇ，３２４ｍｍｏｌ）、Ｅｔ_３Ｎ（４５．２ｍＬ，３２４ｍｍｏｌ）、および
ＥＤＣ（６２．１ｇ，３２４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（８１０ｍＬ）中で混合し、周囲温度で
一晩撹拌した。次いで、反応液を５×７００ｍＬの水で洗浄し、次いで１×６００ｍＬの
１Ｍ ＮａＯＨ洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、セライトに通して濾過し、エバポレ
ートし、５３．０６ｇ（９３％）の１１，１４−エイコサジエンアミド，Ｎ−メトキシ−
Ｎ−メチル−，（１１Ｚ，１４Ｚ）を透明な金色の油状物として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４
００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ ５．３５（ｍ，４Ｈ）、３．６８（ｓ，３Ｈ）、３．１８
（ｓ，３Ｈ）、２．７７（ｍ，２Ｈ）、２．４１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ）、２．０５（
ｍ，４Ｈ）、１．６３（ｍ，２Ｈ）、１．４０−１．２６（ｍ，１８Ｈ）、０．８９（ｔ
，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ）。

【0093】

【化11】

１１，１４−エイコサジエンアミド，Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−，（１１Ｚ，１４Ｚ
）−１（４ｇ，１１．３８ｍｍｏｌ）を、２５０ｍＬ容フラスコ内の乾燥ＴＨＦ（５０．
０ｍｌ）に溶解させ、次いで、１Ｍのノニルマグネシウムブロミド（２２．７６ｍｌ，２
２．７６ｍｍｏｌ）を窒素下、周囲温度で添加した。１０分後、過剰の飽和水性ＮＨ_４Ｃ
ｌで反応液をゆっくりクエンチした。反応液を分液漏斗内でヘキサンと水にて洗浄し、振
り、下側の水層を廃棄し、上側の層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、エバポレート
し、粗製ケトンを金色の油状物として得た。上記の粗製ケトンに、ジメチルアミン（ＴＨ
Ｆ中２Ｍ）（１４．２２ｍｌ，２８．４ｍｍｏｌ）を添加した後、Ｔｉ（Ｏ−ｉ−Ｐｒ）
_４（６．６７ｍｌ，２２．７６ｍｍｏｌ）を添加し、一晩撹拌状態にした。翌日、ＥｔＯ
Ｈ（５０ｍｌ）を添加した後、ＮａＢＨ_４（０．６４６ｇ，１７．０７ｍｍｏｌ）を添加
した。５分間の撹拌後、全反応液を、３３０ｇシリカカラムとインラインの４０ｇシリカ
カラムに直接注入した。１０分間は１００％ＤＣＭで、次の３０分間は０から１５％のＭ
ｅＯＨ／ＤＣＭで溶出させると、２０，２３−ノナコサジエン−１０−アミン，Ｎ，Ｎ−
ジメチル−，（２０Ｚ，２３Ｚ）（１）（２．４５ｇ，５．４７ｍｍｏｌ，４８．１％収
率）がかすかに金色の油状物として収集された。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ
_３）δ ５．３５（ｍ，４Ｈ）、２．７８（ｍ，２Ｈ）、２．２３（ｍ，１Ｈ）、２．２
１（ｓ，６Ｈ）、２．０５（ｍ，４Ｈ）、１．４５−１．１６（ｍ，３８Ｈ）、０．８９
（ｍ，６Ｈ）．ＨＲＭＳ Ｃ３１Ｈ６１Ｎの計算値４４８．４８７７，実測値４４８．４
８７２。

【0094】

化合物２〜３０は新規なカチオン性脂質であり、上記の一般スキーム１に従って調製し
た。

【0095】

【表1】

（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ−１２，１５−ジエン−１
−アミン（化合物３１）

【0096】

【化12】

ケトンｉｉｉ（４．０ｇ，９．５５ｍｍｏｌ）、ＴＯＳＭＩＣ（２．４ｇ，１２．４ｍ
ｍｏｌ）を含むジメトキシエタン（４５ｍＬ）の溶液を０℃まで冷却し、カリウムｔｅｒ
ｔ−ブトキシド（１９．１ｍｍｏｌ，１９．１ｍＬの１ＭのｔＢｕＯＨ溶液）で処理した
。９０分後、反応液をヘキサンと水間に分配した。有機部分を水で洗浄し、硫酸ナトリウ
ム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。この物質をフラッシュクロマトグ
ラフィーによって精製し（０から５％までのＥｔＯＡｃ／ヘキサン）、所望の生成物を得
た（約２０％の出発物質（ｓ．ｍ．）を含有）。この混合物を、そのままの状態で次の工
程に持ち越した。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝４３０．６。

【0097】

【化13】

水素化アルミニウムリチウム（２３．９ｍｍｏｌ，２３．９ｍＬの１ＭのＴＨＦ溶液）
をニトリルｖ（３．４２ｇ，８ｍｍｏｌ）に直接、周囲温度で添加し、反応液を２０分間
撹拌した。反応液を１００ｍＬのＴＨＦで希釈し、０℃まで冷却し、硫酸ナトリウム十水
和物溶液を用いて注意深くクエンチした。固形物を濾別し、ＴＨＦで洗浄した。濾液を真
空にてエバポレートし、直接、次の反応に粗製状態で持ち越した。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）
＝４３４．６。

【0098】

【化14】

第１級アミン（３．４５ｇ，６．２ｍｍｏｌ）のジクロロエタン（１００ｍＬ）溶液を
ホルムアルデヒド（１．６ｍＬ，２１．７ｍｍｏｌ）で処理した後、トリアセトキシ水素
化ホウ素ナトリウム（６．６ｇ，３１ｍｍｏｌ）で処理した。５分後、反応液をジクロロ
メタンと１Ｎ ＮａＯＨ間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し
、真空にてエバポレートした。粗製混合物を分取用逆相クロマトグラフィー（Ｃ８カラム
）によって精製し、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ−１２
，１５−ジエン−１−アミンを得た。ＨＲＭＳ 計算値４６２．５０３３，実測値４６２
．５０２６。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ ５．３５（ｍ，４Ｈ）、２
．７８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ）、２．１８（ｓ，６Ｈ）、２．０５（ｍ，６Ｈ）、
１．３（ｍ，３９Ｈ）、０．８９（ｍ，６Ｈ）。
（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−
アミン（化合物３２）

【0099】

【化15】

シリルアミドのピーターソン試薬（３．１ｇ，１６．７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３５ｍＬ
）に溶解させ、−６３℃まで冷却した。この溶液にｎＢｕＬｉ（１６．７ｍｍｏｌ，６．
７ｍＬの２．５Ｍ溶液）を添加した。反応液を周囲温度まで３０分間昇温させた。ケトン
（５．０ｇ，１１．９ｍｍｏｌ）を第２のフラスコ内のＴＨＦ（２５ｍＬ）に溶解させた
。このケトン溶液をピーターソン試薬に、温度を−６０℃〜−４０℃に維持しながら３０
分間にわたって移した。反応液を−４０℃まで１時間昇温させ、次いで、０℃まで３０分
間昇温させた。重炭酸ナトリウムを用いて反応液をクエンチし、さらに水で希釈し、水／
ヘキサン間に分配した。有機部分をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾
過し、真空にてエバポレートした。フラッシュクロマトグラフィーによって精製し（０か
ら４０％までのＭＴＢＥ／ヘキサン）、α，β−不飽和アミドｖｉｉを得た。^１Ｈ ＮＭ
Ｒ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ ５．７５（ｓ，１Ｈ）、５．３６（ｍ，４Ｈ）、３
．０１（ｓ，３Ｈ）、２．９９（ｓ，３Ｈ）、２．７８（ｔ，２Ｈ）、２．２８（ｔ，２
Ｈ）、２．０５（ｍ，６Ｈ）、１．３５（ｍ，３４Ｈ）、０．８９（ｍ，６Ｈ）。

【0100】

【化16】

α，β−不飽和アミドｖｉｉ（１ｇ，２．１ｍｍｏｌ）とＬＳ−セレクトリド（４．１
ｍｍｏｌ，４．１ｍＬの１Ｍ溶液）を密封チューブ内で合わせ、６０℃まで２４時間加熱
した。反応液を周囲温度まで冷却し、塩化アンモニウム溶液とヘプタン間に分配した。有
機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートし、アミドｖｉｉ
ｉを得た。この中間体を直接、次の反応に粗製状態で持ち越した。α，β−不飽和アミド
ｖｉｉの択一的な共役還元は、水素化銅での還元の使用を伴うものである。

【0101】

【化17】

５Ｌ容ＲＢ内で、銅触媒（９．７７ｇ，１７．１３ｍｍｏｌ）を窒素下でトルエン（１
７１３ｍｌ）に溶解させた。これに、ＰＭＨＳ（Ａｌｄｒｉｃｈ製）（３０４ｍｌ，１３
７１ｍｍｏｌ）を一気に添加した。反応液を５分間熟成させた。この溶液に、α，β−不
飽和アミドｖｉｉ（１６７．１６ｇ、３４３ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、この混合物
にｔ−アミルアルコール（１１３ｍｌ，１０２８ｍｍｏｌ）をシリンジポンプによって３
時間にわたって添加した。添加終了後、この溶液に約１７００ｍＬの２０％ＮＨ４０Ｈを
少量に分けて添加して反応（ｒｘｎ）させた。注意：クエンチの初めに激しい発泡および
起泡が見られ、これは、しっかりとモニタリングしなければならず、水酸化アンモニウム
は少量に分けてゆっくり添加しなければならない。反応液を水とヘキサン間に分配した。
有機部分をセライトに通して濾過し、真空にてエバポレートした。得られたゴム状固形物
質を、機械的撹拌器を用いてヘキサン中で粉砕し、小さな粒状物を得、次いで、これを濾
過し、ヘキサンで洗浄した。次いで、有機部分を真空にてエバポレートし、フラッシュク
ロマトグラフィーによって精製し（シリカ，０から１５％までの酢酸エチル／ヘキサン）
、所望のアミドｖｉｉｉを得た。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝４９０．７。

【0102】

【化18】

アミドｖｉｉｉ（２．８５ｇ，５．８ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化アルミニウムリチウ
ム（８．７ｍｍｏｌ，８．７ｍＬの１Ｍ溶液）を添加した。反応液を周囲温度で１０分間
撹拌し、次いで、硫酸ナトリウム十水和物溶液をゆっくり添加することによってクエンチ
した。固形物を濾過し、ＴＨＦで洗浄し、濾液を真空にてエバポレートした。粗製混合物
を分取用逆相クロマトグラフィー（Ｃ８カラム）によって精製し、（１３Ｚ，１６Ｚ）−
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン（化合物３２）
を油状物として得た。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）計算値４７６．５１９０，実測値４７６．５１
８９。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ ５．３７（ｍ，４Ｈ）、２．７８
（ｔ，２Ｈ）、２．４２（ｍ，８Ｈ）、２．０５（ｑ，４Ｈ）、１．２８（ｍ，４１Ｈ）
、０．８９（ｍ，６Ｈ）。
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−アミン（化
合物３３）

【0103】

【化19】

０℃まで冷却したオレイン酸（１ｇ，３．５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５００ｍＬ）溶液に
、ＣＤＩ（０．６３ｇ，３．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を周囲温度まで３０分間昇
温させた後、０℃まで冷却し、まずトリエチルアミン（０．３９ｇ，３．９ｍｍｏｌ）で
、次いでジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（０．３８ｇ，３．９ｍｍｏｌ）で処理した
。１時間後、反応液を水とヘプタン間に分配した。有機部分を硫酸マグネシウム上で乾燥
させ、濾過し、真空にてエバポレートし、粗製ワインレブアミドｉｉを得、これを直接、
次の反応に持ち越した。

【0104】

【化20】

ジエチル亜鉛（７０．３ｍｍｏｌ，７０．３ｍＬの１Ｍ溶液）のジクロロメタン（１３
０ｍＬ）溶液を−１℃まで冷却し、ＴＦＡ（８．０ｇ，７０．３ｍｍｏｌ）の滴下にて処
理した。３０分後、ジヨードメタン（１８．８ｇ，７０．３ｍｍｏｌ）を添加し、これを
氷浴内で３０分間熟成させた。この溶液に、ワインレブアミドｉｉ（７．６ｇ，２３．４
ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を周囲温度まで昇温させ、１時間撹拌した。塩化アンモニ
ウム溶液（１００ｍＬ）を用いて反応液をクエンチし、有機層を分配して取り出し、１０
％チオ硫酸ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバ
ポレートした。精製はフラッシュクロマトグラフィーとし（０から３０％までのＭＴＢＥ
／ヘプタン）、所望の生成物ｘを得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ
３．７２（ｓ，３Ｈ）、３．２２（ｓ，３Ｈ）、２．４８（ｔ，２Ｈ）、１．６５（ｍ，
２Ｈ）、１．３９（ｍ，２２Ｈ）、１．１８（ｍ，２Ｈ）、０．９１（ｔ，３Ｈ）、０．
６８（ｍ，２Ｈ）、０．５９（ｍ，１Ｈ）、−０．３２（ｍ，１Ｈ）。

【0105】

【化21】

ワインレブアミドｘの化合物３３への変換は、上記の化合物１について記載のものと同
様の様式で行った（ノニルグリニャール付加の後、還元的アミノ化）。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋
Ｈ）＝４３６．６．^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ ２．２５（ｓ，６Ｈ
）、１．３０（ｍ，４５Ｈ）、０．９１（ｍ，６Ｈ）、０．６８（ｍ，２Ｈ）、０．５９
（ｍ，１Ｈ）、−０．３１（ｍ，１Ｈ）。

【0106】

化合物３４〜４３は新規なカチオン性脂質であり、上記の一般スキーム１〜４に従って
調製した。

【0107】

【表2】

（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２３−トリエン
−１０−アミン（化合物４４）

【0108】

【化22】

−７８℃まで冷却したＬＤＡ（９５ｍｍｏｌ，４７．５ｍＬの２Ｍ溶液）のＴＨＦ（１
２７ｍＬ）溶液に、酢酸ｔ−ブチルを添加した。反応液を１５分間撹拌した後、アルデヒ
ドｘｉを添加した。直ちに塩化アンモニウム溶液を用いて反応液をクエンチし、周囲温度
まで昇温させ、水／ペンタン間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾
過し、真空にてエバポレートした。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ）＝３２５．４。

【0109】

【化23】

ヒドロキシケトンｘｉｉ（７ｇ，１８．４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５０ｍＬ）
に溶解させ、０℃まで冷却し、デオキソフルオル（７．３ｇ，３３．１ｍｍｏｌ）で処理
した。反応液を撹拌しながら１６時間、周囲温度まで昇温させた後、重炭酸ナトリウム溶
液を用いてクエンチした。反応液を分配し、有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾
過し、真空にてエバポレートした。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍｏ
ｔａｇｒａｐｈｙ）（０から５％までの酢酸エチル／ヘキサン）により、β−フルオロエ
ステルを得た。

【0110】

フルオロエステル中間体（６ｇ，１５．６ｍｍｏｌ）（ジクロロメタン中）を塩化水素
（１５７ｍｍｏｌ，３９．２ｍＬの４Ｍのジオキサン溶液）で処理し、反応液を周囲温度
で１６時間撹拌した。反応液を真空にてエバポレートし、所望のβ−フルオロ酸ｘｉｉｉ
を得た。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝３２７．３。

【0111】

【化24】

フルオロカルボン酸ｘｉｉｉ（５．１ｇ，１５．７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（６．０ｇ，３
１．４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（３．１ｇ，３１．４ｍ
ｍｏｌ）、トリメチルアミン（４．０ｇ，３９．２ｍｍｏｌ）、およびＨＯＡｔ（４．３
ｇ，３１．４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７８ｍＬ）中で合わせ、周囲温度で１６時間撹拌した
。反応液を水／ＤＣＭ間に分配し、有機部分を水（３×）とＮａＯＨ溶液（１×）で洗浄
し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。粗製物質を分取
用逆相クロマトグラフィーによって精製し、所望のワインレブアミドｘｉｖを得た。ＬＣ
／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝３７０．４。

【0112】

【化25】

ワインレブアミドｘｉｖ（４．３ｇ，１１．７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液を
、ノニルマグネシウムブロミド（２３．４ｍｍｏｌ，２３．４ｍＬの１Ｍ溶液）で周囲温
度にて処理した。１時間後に塩化アンモニウム溶液を用いて反応液をクエンチし、水とペ
ンタン間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポ
レートした。この物質を次の工程に粗製状態で持ち越した。

【0113】

【化26】

ケトンｘｖ（５．１ｇ，１１．７ｍｍｏｌ）をジメチルアミン（２９．３ｍｍｏｌ，１
４．７ｍＬの２ＭのＴＨＦ溶液）とチタン（ＩＶ）イソプロポキシド（６．７ｇ，２３．
５ｍｍｏｌ）で処理し、反応液を周囲温度で１６時間撹拌した。反応混合物にエタノール
（５０ｍＬ）を添加した後、水素化ホウ素ナトリウム（０．６７ｇ，１７．６ｍｍｏｌ）
を添加した。反応液を直接シリカカラムに負荷し、フラッシュクロマトグラフィーによっ
て精製した（０から１５％までのＭｅＯＨ／ＤＣＭ）。この物質は、（１１Ｅ，２０Ｚ，
２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２３−トリエン−１０−アミンを得
るために分取用逆相クロマトグラフィーによる２回目の精製が必要であった。ＨＲＭＳ
計算値４４６．４７２０，実測値４４６．４７２４。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ
Ｃｌ_３）δ ５．４８（ｍ，１Ｈ）、５．３７（ｍ，４Ｈ）、５．２３（ｍ，１Ｈ）、２
．７８（ｔ，２Ｈ）、２．５８（ｍ，１Ｈ）、２．２２（ｓ，６Ｈ）、２．０４（ｍ，６
Ｈ）、１．５６（ｍ，１Ｈ）、１．３０（ｍ，３１Ｈ）、０．８９（ｍ，６Ｈ）。

【0114】

化合物４５は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，２８，１７２
−１７６、国際公開第２０１０／０４２８７７号パンフレット、同第２０１０／０４８５
３６号パンフレット、同第２０１０／０８８５３７号パンフレット、および同第２００９
／１２７０６０号パンフレットに記載のＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡである。

【0115】

【化27】

化合物４６は、国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレット、および同第２０１
０／１４４７４０号パンフレットに記載のＭＣ３である。

【0116】

【化28】

ＬＮＰ組成物
以下の本発明の脂質ナノ粒子組成物（ＬＮＰ）：
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ ５６．６／３８／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ ６０／３８／２；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ ６７．３／２９／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ ４９．３／４７／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ ５０．３／４４．３／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ ４０／４８／２／
１０；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ ４０／４８／２／１０
；および
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ ５８／３０／２／１０
は、オリゴヌクレオチド、具体的にはｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達に有用である。
ＬＮＰプロセスの説明：
脂質ナノ粒子（Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏ−Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＬＮＰ））は、衝突噴流
プロセスによって調製される。この粒子は、アルコールに溶解させた脂質を、クエン酸バ
ッファーに溶解させたｓｉＲＮＡと混合することにより形成される。ｓｉＲＮＡに対する
脂質の混合比は、脂質が４５〜５５％およびｓｉＲＮＡが６５〜４５％を目標にする。脂
質溶液は、本発明の新規なカチオン性脂質、ヘルパー脂質（コレステロール）、ＰＥＧ（
例えば、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ）脂質およびＤＳＰＣを、アルコール（例
えば、エタノール）中に５〜１５ｍｇ／ｍＬ（目標９〜１２ｍｇ／ｍＬ）の濃度で含むも
のにする。脂質の比率は、カチオン性脂質が２５〜９８（目標３５〜６５）のモルパーセ
ント範囲を有し、ヘルパー脂質は０〜７５（目標３０〜５０）のモルパーセント範囲を有
し、ＰＥＧ脂質は１〜１５（目標１〜６）のモルパーセント範囲を有し、ＤＳＰＣは０〜
１５（目標０〜１２）のモルパーセント範囲を有するようにする。ｓｉＲＮＡ溶液は、１
種類以上のｓｉＲＮＡ配列を、クエン酸ナトリウム緩衝塩溶液（３．５〜５の範囲のｐＨ
を有する）中に０．３〜１．０ｍｇ／ｍＬの（目標０．３〜０．９ｍｇ／ｍＬ）の濃度範
囲で含むものにする。この２つの溶液を１５〜４０℃（目標３０〜４０℃）の範囲の温度
まで加熱し、次いで、衝突噴流混合機内で混合すると、即座にＬＮＰが形成される。Ｔ字
部内径（ｔｅｅＩＤ）は０．２５〜１．０ｍｍの範囲であり、総流速は１０〜６００ｍＬ
／分にする。流速とチューブ内径の組合せは、ＬＮＰの粒径を３０〜２００ｎｍに制御す
る効果を有する。次いで、この溶液を緩衝溶液と高ｐＨで、１：１〜１：３（ｖｏｌ：ｖ
ｏｌ）（だが１：２（ｖｏｌ：ｖｏｌ）を目標にする）の範囲の混合比で混合する。この
緩衝溶液を１５〜４０℃（目標３０〜４０℃）の範囲の温度にする。混合ＬＮＰを３０分
間〜２時間保持した後、アニオン交換濾過工程を行う。インキュベーション中の温度は１
５〜４０℃（目標３０〜４０℃）の範囲にする。インキュベーション後、この溶液を０．
８ｕｍフィルターに通して濾過する（アニオン交換分離工程を含む）。このプロセスでは
、１ｍｍ ＩＤ〜５ｍｍ ＩＤの範囲のチューブ内径および１０〜２０００ｍＬ／分の流
速が使用される。ＬＮＰは濃縮され、限外濾過プロセスによってダイアフィルトレーショ
ンされ、このとき、アルコールが除去され、クエン酸バッファーが最終バッファー溶液（
リン酸緩衝生理食塩水など）と交換される。限外濾過プロセスには、タンジェンシャルフ
ロー濾過形式（ＴＦＦ）が使用される。このプロセスでは、３０〜５００ＫＤの公称分子
量カットオフ範囲の膜が使用される。膜形式は、中空繊維であってもフラットシートカセ
ットであってもよい。適正な分子量カットオフを用いたＴＦＦプロセスにより、ＬＮＰが
保持液中に保持され、濾液または透過液中にアルコール；クエン酸バッファー；および最
終バッファー廃物が含有される。ＴＦＦプロセスは、初期濃度からｓｉＲＮＡ濃度１〜３
ｍｇ／ｍＬまでの多工程プロセスである。濃縮後、ＬＮＰ溶液を最終バッファーに対して
１０〜２０容量でダイアフィルトレーションしてアルコールを除去し、バッファー交換を
行う。次いで、この物質をさらに１〜３倍に濃縮する。ＬＮＰプロセスの最終工程は、濃
縮ＬＮＰ溶液の滅菌濾過および生成物のバイアル封入である。
解析手順：
１）ｓｉＲＮＡ濃度
ｓｉＲＮＡ二本鎖の濃度は、強アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＡＸ−Ｈ
ＰＬＣ）により、２９９６ ＰＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ２６９５ Ａｌｌｉａ
ｎｃｅシステム（Ｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ ＭＡ）を用い
て測定される。ＬＮＰ（あるいは、ＲＮＡｉ送達媒体（ＲＤＶ）とも称する）を、０．５
％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理して全ｓｉＲＮＡを遊離させ、ＳＡＸ分離により、Ｄ
ｉｏｎｅｘ ＢｉｏＬＣ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ ２００（４×２５０ｍｍ）カラムを用い
て解析する（２５４ｎｍでＵＶ検出）。移動相は、Ａ：２５ｍＭ ＮａＣｌＯ_４，１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ，２０％ＥｔＯＨ，ｐＨ７．０と、Ｂ：２５０ｍＭ ＮａＣｌＯ_４，１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ，２０％ＥｔＯＨ，ｐＨ７．０を０分から１５分までの線形勾配で構成し、
流速を１ｍｌ／分とする。ｓｉＲＮＡ量は、ｓｉＲＮＡ標準曲線との比較によって求めら
れる。
２）封入速度
蛍光試薬ＳＹＢＲ ＧｏｌｄをＲＮＡ定量に使用し、ＲＤＶの封入速度をモニタリング
する。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００とともに、またはなしでＲＤＶを使用し、遊離ｓｉＲＮ
Ａおよび全ｓｉＲＮＡの量を調べる。アッセイは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅマイク
ロプレート分光測光器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃ
Ａ）製）を用いて行う。試料を４８５ｎｍで励起し、蛍光放射を５３０ｎｍで測定した。
ｓｉＲＮＡ量は、ｓｉＲＮＡ標準曲線との比較によって求められる。

【0117】

封入速度＝（１−遊離ｓｉＲＮＡ／全ｓｉＲＮＡ）×１００％
３）粒径および多分散性
１μｇのｓｉＲＮＡを内包しているＲＤＶを、１×ＰＢＳで最終容量３ｍｌまで希釈す
る。試料の粒径および多分散性を、動的光散乱法によりＺｅｔａＰＡＬＳ機器（Ｂｒｏｏ
ｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌ
ｅ，ＮＹ）を用いて測定する。散乱強度は、Ｈｅ−Ｎｅレーザーを用いて２５℃にて９０
°の散乱角で測定する。
４）ゼータ電位の解析
１μｇのｓｉＲＮＡを内包しているＲＤＶを、１ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７．
４）で最終容量２ｍｌまで希釈する。試料の電気泳動移動度をＺｅｔａＰＡＬＳ機器（Ｂ
ｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖ
ｉｌｌｅ，ＮＹ）（電極および光源としてＨｅ−Ｎｅレーザーを有する）を用いて調べる
。ゼータ電位の計算には、スモルコフスキー限界を想定する。
５）脂質の解析
個々の脂質濃度を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により、コロ
ナ荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）（ＥＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｃｈｅｌｍ
ｓｆｏｒｄ，ＭＡ）を備えたＷａｔｅｒｓ ２６９５ Ａｌｌｉａｎｃｅシステム（Ｗａ
ｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ ＭＡ）を用いて測定する。ＲＤＶ内
の個々の脂質を、ＣＡＤを備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８（５０×
４．６ｍｍ，１．８μｍ粒径）カラムを用いて６０℃で解析する。移動相は、Ａ：０．１
％ＴＦＡ（Ｈ_２Ｏ中）とＢ：０．１％ＴＦＡ（ＩＰＡ中）で構成する。勾配は、６０％の
移動相Ａと４０％の移動相Ｂで時間０から１．００分のとき４０％の移動相Ａと６０％の
移動相Ｂまで；４０％の移動相Ａと６０％の移動相Ｂで１．００から５．００分まで；４
０％の移動相Ａと６０％の移動相Ｂで５．００分から１０．００分のとき２５％の移動相
Ａと７５％の移動相Ｂまで；２５％の移動相Ａと７５％の移動相Ｂで１０．００分から１
５．００分のときに５％の移動相Ａと９５％の移動相Ｂまで；および５％の移動相Ａと９
５％の移動相Ｂで１５．００から２０．００分のときに６０％の移動相Ａと４０％の移動
相Ｂまで変化させ、流速は１ｍｌ／分にする。個々の脂質濃度は、ＲＤＶ内の全脂質成分
での標準曲線と比較して二次曲線フィットにより求める。各脂質のモル百分率を、その分
子量に基づいて計算する。
化合物３２の配合物の一般的なＬＮＰプロセスの説明：
脂質ナノ粒子を衝突噴流プロセスによって調製した。この粒子は、アルコールに溶解さ
せた脂質を、クエン酸バッファーに溶解させたｓｉＲＮＡと混合することにより形成した
。脂質溶液は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質（コレステロール）、ＰＥＧ（例えば、Ｐ
ＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ）脂質およびＤＳＰＣを、アルコール（例えば、エタ
ノール）中に５〜１５ｍｇ／ｍＬ（目標９〜１２ｍｇ／ｍＬ）の濃度で含むものとした。
脂質の比率は、カチオン性脂質が２５〜９８（目標３５〜６５）のモルパーセント範囲を
有し、ヘルパー脂質は０〜７５（目標３０〜５０）のモルパーセント範囲を有し、ＰＥＧ
脂質は１〜１５（目標１〜６）のモルパーセント範囲を有し、ＤＳＰＣは０〜１５（目標
０〜１２）のモルパーセント範囲を有するようにした。ｓｉＲＮＡ溶液は、１種類以上の
ｓｉＲＮＡ配列を、クエン酸ナトリウム緩衝塩溶液（３．５〜５の範囲のｐＨを有する）
中に０．３〜０．６ｍｇ／ｍＬの（目標０．３〜０．９ｍｇ／ｍＬ）の濃度範囲で含むも
のとした。この２つの溶液を１５〜４０℃（目標３０〜４０℃）の範囲の温度まで加熱し
、次いで、衝突噴流混合機内で混合すると、即座にＬＮＰが形成された。Ｔ字部内径（ｔ
ｅｅＩＤ）は０．２５〜１．０ｍｍの範囲とし、総流速は１０〜６００ｍＬ／分とした。
流速とチューブ内径の組合せは、ＬＮＰの粒径を３０〜２００ｎｍに制御する効果を有し
た。次いで、ＬＮＰ懸濁液を緩衝溶液と高ｐＨで、１：１〜１：３（ｖｏｌ：ｖｏｌ）（
だが１：２（ｖｏｌ：ｖｏｌ）を目標にする）の範囲の混合比で混合した。この緩衝溶液
を１５〜４０℃（目標３０〜４０℃）の範囲の温度にした。さらに、このＬＮＰ懸濁液を
緩衝溶液と高ｐＨで、１：１〜１：３（ｖｏｌ：ｖｏｌ）（だが１：２（ｖｏｌ：ｖｏｌ
）を目標にする）の範囲の混合比で混合した。この緩衝溶液を１５〜４０℃（目標３０〜
４０℃）の範囲の温度にした。混合ＬＮＰを３０分間〜２時間保持した後、アニオン交換
濾過工程を行った。インキュベーション中の温度は１５〜４０℃（目標３０〜４０℃）の
範囲にした。インキュベーション後、ＬＮＰ懸濁液を０．８ｕｍフィルターに通して濾過
した（アニオン交換分離工程を含む）。このプロセスでは、１ｍｍ ＩＤ〜５ｍｍ ＩＤ
の範囲のチューブ内径および１０〜２０００ｍＬ／分の流速を使用した。ＬＮＰを濃縮し
、限外濾過プロセスによってダイアフィルトレーションし、このとき、アルコールが除去
され、クエン酸バッファーが最終バッファー溶液（リン酸緩衝生理食塩水など）と交換さ
れた。限外濾過プロセスには、タンジェンシャルフロー濾過形式（ＴＦＦ）を使用した。
このプロセスでは、３０〜５００ＫＤの公称分子量カットオフ範囲の膜を使用した。膜形
式は、中空繊維またはフラットシートカセットとした。適正な分子量カットオフを用いた
ＴＦＦプロセスにより、ＬＮＰが保持液中に保持され、濾液または透過液中にアルコール
；クエン酸バッファー；および最終バッファー廃物が含有された。ＴＦＦプロセスは、初
期濃度からｓｉＲＮＡ濃度１〜３ｍｇ／ｍＬまでの多工程プロセスである。濃縮後、ＬＮ
Ｐ懸濁液を最終バッファーに対して１０〜２０容量でダイアフィルトレーションしてアル
コールを除去し、バッファー交換を行った。次いで、この物質をさらに１〜３倍に濃縮し
た。ＬＮＰプロセスの最終工程は、濃縮ＬＮＰ溶液の滅菌濾過および生成物のバイアル封
入とした。
解析手順：
ｓｉＲＮＡ濃度
ｓｉＲＮＡ二本鎖の濃度を、強アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＡＸ−Ｈ
ＰＬＣ）により、２９９６ ＰＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ２６９５ Ａｌｌｉａ
ｎｃｅシステム（Ｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ ＭＡ）を用い
て測定した。ＬＮＰ（あるいは、ＲＮＡｉ送達媒体（ＲＤＶ）とも称する）を、０．５％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理して全ｓｉＲＮＡを遊離させ、ＳＡＸ分離により、Ｄｉ
ｏｎｅｘ ＢｉｏＬＣ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ ２００（４×２５０ｍｍ）カラムを用いて
解析した（２５４ｎｍでＵＶ検出）。移動相は、Ａ：２５ｍＭ ＮａＣｌＯ_４，１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ，２０％ＥｔＯＨ，ｐＨ７．０と、Ｂ：２５０ｍＭ ＮａＣｌＯ_４，１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ，２０％ＥｔＯＨ，ｐＨ７．０を０分から１５分までの線形勾配で構成し、流
速を１ｍｌ／分とした。ｓｉＲＮＡ量を、ｓｉＲＮＡ標準曲線との比較によって求めた。
封入速度
蛍光試薬ＳＹＢＲ ＧｏｌｄをＲＮＡ定量に使用し、ＲＤＶの封入速度をモニタリング
した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００とともに、またはなしでＲＤＶを使用し、遊離ｓｉＲＮ
Ａおよび全ｓｉＲＮＡの量を調べた。アッセイは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅマイク
ロプレート分光測光器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃ
Ａ）製）を用いて行う。試料を４８５ｎｍで励起し、蛍光放射を５３０ｎｍで測定した。
ｓｉＲＮＡ量は、ｓｉＮＡ標準曲線との比較によって求められる。

【0118】

封入速度＝（１−遊離ｓｉＮＡ／全ｓｉＮＡ）×１００％
粒径および多分散性
１μｇのｓｉＲＮＡを内包しているＲＤＶを、１×ＰＢＳで最終容量３ｍｌまで希釈し
た。試料の粒径および多分散性を、動的光散乱法によりＺｅｔａＰＡＬＳ機器（Ｂｒｏｏ
ｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌ
ｅ，ＮＹ）を用いて測定した。散乱強度は、Ｈｅ−Ｎｅレーザーを用いて２５℃にて９０
°の散乱角で測定した。
ゼータ電位の解析
１μｇのｓｉＲＮＡを内包しているＲＤＶを、１ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７．
４）で最終容量２ｍｌまで希釈した。試料の電気泳動移動度をＺｅｔａＰＡＬＳ機器（Ｂ
ｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖ
ｉｌｌｅ，ＮＹ）（電極および光源としてＨｅ−Ｎｅレーザーを有する）を用いて調べた
。ゼータ電位の計算には、スモルコフスキー限界を想定した。
脂質の解析
個々の脂質濃度を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により、コロ
ナ荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）（ＥＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｃｈｅｌｍ
ｓｆｏｒｄ，ＭＡ）を備えたＷａｔｅｒｓ ２６９５ Ａｌｌｉａｎｃｅシステム（Ｗａ
ｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ ＭＡ）を用いて測定した。ＲＤＶ内
の個々の脂質を、ＣＡＤを備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８（５０×
４．６ｍｍ，１．８μｍ粒径）カラムを用いて６０℃で解析した。移動相は、Ａ：０．１
％ＴＦＡ（Ｈ_２Ｏ中）とＢ：０．１％ＴＦＡ（ＩＰＡ中）で構成した。勾配は、６０％の
移動相Ａと４０％の移動相Ｂで時間０から１．００分のとき４０％の移動相Ａと６０％の
移動相Ｂまで；４０％の移動相Ａと６０％の移動相Ｂで１．００から５．００分まで；４
０％の移動相Ａと６０％の移動相Ｂで５．００分から１０．００分のとき２５％の移動相
Ａと７５％の移動相Ｂまで；２５％の移動相Ａと７５％の移動相Ｂで１０．００分から１
５．００分のときに５％の移動相Ａと９５％の移動相Ｂまで；および５％の移動相Ａと９
５％の移動相Ｂで１５．００から２０．００分のときに６０％の移動相Ａと４０％の移動
相Ｂまで変化させ、流速は１ｍｌ／分とした。個々の脂質濃度は、ＲＤＶ内の全脂質成分
での標準曲線と比較して二次曲線フィットにより求めた。各脂質のモル百分率を、その分
子量に基づいて計算した。
表１の種々の配合物のための一般的なＬＮＰ調製物
表１のｓｉＲＮＡナノ粒子懸濁液は、ｓｉＲＮＡおよび／または担体分子を２０ｍＭク
エン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）に約０．４０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させる
ことにより調製される。脂質溶液は、カチオン性脂質（例えば、３２，表２の構造参照）
、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−ＤＭＧ（表１に示した比率）の混合物を無水
エタノールに、約８ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させることにより調製される。リン酸部に対
する窒素の比率は６：１と概算される。

【0119】

ほぼ等容量のｓｉＲＮＡ／担体溶液と脂質溶液を、２つのＦＰＬＣポンプを同じ流速で
用いて混合Ｔ字コネクタに送達する。背圧弁を使用し、所望の粒径に調整する。得られた
乳状混合物を滅菌ガラスビン内に収集する。次いで、この混合物を等容量のクエン酸バッ
ファーで、続いて等容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、イオン交換膜に通して濾過し
、混合物中の遊離ｓｉＲＮＡ／担体（あれば）を除去する。ＰＢＳ（７．４））に対する
限外濾過を使用し、エタノールを除去してバッファーを交換する。所望の容量まで濃縮し
、０．２μｍフィルターに通して滅菌濾過することにより最終ＬＮＰを得る。得られたＬ
ＮＰを、粒径、ゼータ電位、アルコール含量、総脂質含量、封入核酸および総核酸濃度に
関して特性評価する。
ＬＮＰ製造プロセス
非限定的な例において、ＬＮＰは、バルクで以下のようにして調製される。このプロセ
スは、（１）脂質溶液の調製；（２）ｓｉＲＮＡ／担体溶液の調製；（３）混合／粒子の
形成；（４）インキュベーション；（５）希釈；（６）限外濾過および濃縮からなる。
脂質溶液の調製
２Ｌ容のガラス試薬ビンとメスシリンダーを脱パイロジェン処理する。脂質を室温まで
昇温させる。このガラス試薬ビン内に、８．０ｇの化合物３２をピペットで移し、１．２
ｇのＤＳＰＣ、３．５ｇのコレステロール、０．９ｇのＰＥＧ−ＤＭＧを添加する。この
混合物に１Ｌのエタノールを添加する。試薬ビンを、加熱した水浴（５０℃を超えない温
度）中に入れる。脂質懸濁液を撹拌バーで撹拌する。この懸濁液中に、丸底フラスコの口
の１つから密封アダプターを付けて熱電対プローブを入れる。懸濁液を透明になるまで３
０〜４０℃で加熱する。この溶液を室温まで放冷する。
ｓｉＲＮＡ／担体溶液の調製
滅菌容器内（Ｃｏｒｎｉｎｇ保存ビンなど）に、水補正率（およそ１．２）の０．４倍
のｇ数のｓｉＲＮＡ−１粉末を量り入れる。このｓｉＲＮＡを、脱パイロジェン処理した
２Ｌ容ガラス試薬ビンに移す。この秤量容器をクエン酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ５．
０）で３回すすぎ洗浄し、すすぎ液をこの２Ｌ容ガラスビンに入れ、１Ｌになるまでクエ
ン酸バッファーで分量供給（ＱＳ）する。ｓｉＲＮＡ溶液の濃度は、ＵＶ分光計により以
下の手順を用いて測定される。該溶液から２０μＬを取り出し、５０倍に希釈して１００
０μＬにし、クエン酸バッファーでのブランク測定後にＵＶ読み値をＡ２６０ｎｍで記録
する。これを繰り返す。２つの試料の読み値が整合している場合は、平均をとり、ｓｉＲ
ＮＡの消散係数に基づいて濃度を計算する。最終濃度が０．４０±０．０１ｍｇ／ｍＬの
範囲外である場合、さらにｓｉＲＮＡ／担体粉末を添加すること、またはさらにクエン酸
バッファーを添加することにより濃度を調整する。適用可能な場合は、このプロセスを第
２のｓｉＲＮＡで反復する。

【0120】

あるいはまた、ｓｉＲＮＡ／担体溶液を、２種類以上のｓｉＲＮＡ二本鎖および／また
は担体のカクテルではなく１種類のｓｉＲＮＡ二本鎖および／または担体で構成した場合
、ｓｉＲＮＡ／担体を２０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に溶解させ、終濃度を
０．４ｍｇ／ｍＬにする。

【0121】

次いで、脂質溶液とエタノール溶液をＰａｌｌ Ａｃｒｏｐａｋ ２０ ０．８／０．
２μｍ滅菌フィルターＰＮ １２２０３に通して滅菌濾過し、Ｍａｓｔｅｒ Ｆｌｅｘ
Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ Ｐｕｍｐ Ｍｏｄｅｌ ７５２０−４０を用いて脱パイロジェ
ン処理済ガラス槽内に入れ、封入プロセスのための滅菌出発物質を得る。濾過プロセスは
、２０ｃｍ^２の膜面積で８０ｍＬ規模にて実施する。流速は２８０ｍＬ／分とする。この
プロセスは、チューブ直径と濾過面積を増大させることによりスケールアップ可能である
。
粒子の形成−混合工程
ツーバレルシリンジ駆動型ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ ３３ Ｔｗｉｎ Ｓｙｒｉｎｇｅ
）を使用し、滅菌脂質／エタノール溶液と、滅菌ｓｉＲＮＡ／担体またはｓｉＲＮＡ／担
体カクテル／クエン酸バッファー（２０ｍＭクエン酸バッファー，ｐＨ５．０）溶液を、
０．５ｍｍ ＩＤ Ｔ−混合機（混合ステージＩ）内で、等しいまたはほぼ等しい流速で
混合する。得られた排出ＬＮＰ懸濁液には、４０〜５０ｖｏｌ％のエタノールが含まれて
いた。４５ｖｏｌ％エタノール排出懸濁液が所望される場合、滅菌脂質／エタノールと、
滅菌ｓｉＲＮＡ／担体またはｓｉＲＮＡ／担体カクテル／クエン酸バッファー溶液を、そ
れぞれ、５４ｍＬ／分および６６ｍＬ／分の流速で、排出混合物の総流速が１２０ｍＬ／
分となるように混合する。
希釈
混合ステージＩの排出流は直接、４ｍｍ ＩＤ Ｔ−混合機（混合ステージＩＩ）内に
供給され、ここで、高ｐＨの緩衝溶液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ塩化ナ
トリウム，ｐＨ６．０）により１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ％）の比率で希釈される。この緩
衝溶液は３０〜４０℃の範囲の温度であり、４ｍｍ Ｔ−混合機に蠕動ポンプ（Ｃｏｌｅ
Ｐａｒｍｅｒ ＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ Ｌ／Ｓ ６００ ＲＰＭ）によって１２０ｍＬ
／分の流速で送達される。

【0122】

混合ステージＩＩの排出流は直接、６ｍｍ ＩＤ Ｔ−混合機（混合ステージＩＩＩ）
内に供給され、ここで、高ｐＨ緩衝溶液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）により１：１（ｖｏｌ：
ｖｏｌ％）の比率で希釈される。この緩衝溶液は１５〜２５℃の範囲の温度であり、６ｍ
ｍ Ｔ−混合機に蠕動ポンプ（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ ＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ Ｌ／Ｓ
６００ ＲＰＭ）によって２４０ｍＬ／分の流速で送達される。
インキュベーションおよび遊離ｓｉＲＮＡの除去
混合ステージＩＩＩの排出流は、３０分間のインキュベーションのための混合後、保持
される。インキュベーションは３５〜４０℃の温度で行われ、プロセス内懸濁液を光から
保護した。インキュベーション後、遊離の（封入されていない）ｓｉＲＮＡを、Ｍｕｓｔ
ａｎｇ Ｑクロマトグラフィーフィルター（カプセル）でのアニオン交換によって除去す
る。使用前、クロマトグラフィーフィルターを、逐次、１Ｎ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ
、および最後に１２．５ｖｏｌ％エタノール溶液（ＰＢＳ中）のフラッシュ液で前処理す
る。最後のフラッシュ液のｐＨは、ｐＨ＜８が確実であることを確認する。次いで、イン
キュベーションしたＬＮＰ流を、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑフィルターによって蠕動ポンプ（Ｃ
ｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ ＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ Ｌ／Ｓ ６００ ＲＰＭ）によっておよ
そ１００ｍＬ／分の流速で濾過する。濾過流を、以下の限外濾過および濃縮のために滅菌
ガラス容器内に受容する。
限外濾過、濃縮および滅菌濾過
限外濾過プロセスは時限的プロセスであり、流速は注意深くモニタリングしなければな
らない。これは２工程プロセスであり；最初は、希釈物質を採取し、ｓｉＲＮＡをおよそ
０．３〜０．６ｍｇ／ｍＬの濃度までおよそ８倍に濃縮する濃縮工程である。

【0123】

第１の工程では、限外濾過膜１００ｋＤａ ＰＥＳ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ）を
備えたリングスタンドを蠕動ポンプ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＫｒｏｓＦｌｏＩＩ Ｓｙｓｔ
ｅｍ）に装着する。９．２Ｌの滅菌蒸留水をレザーバに添加し；３Ｌをドレイン排出して
廃棄し、残りを透過液中にドレイン排出して廃棄する。５．３Ｌの０．２５Ｎ水酸化ナト
リウムをレザーバに添加し、１．５Ｌをドレイン排出して廃棄し、３．１Ｌを透過液中に
ドレイン排出して廃棄する。残りの水酸化ナトリウムを、消毒のために系内に保持し（少
なくとも１０分間）、次いでポンプをドレイン排出する。９．２Ｌの７０（ｖ／ｖ）％イ
ソプロピルアルコールをレザーバに添加し、１．５Ｌをドレイン排出して廃棄し、残りを
透過液中にドレイン排出して廃棄する。６Ｌのコンディショニングバッファー（リン酸緩
衝生理食塩水中１２．５％エタノール）を添加し、１．５Ｌをドレイン排出して廃棄し、
残りを、廃液が中性ｐＨ（７〜８）になるまで透過液中にドレイン排出する。膜の流出値
を記録し、次いでポンプをドレイン排出する。

【0124】

希釈ＬＮＰ溶液をレザーバ内に１．１Ｌの印まで入れる。ポンプを２．３Ｌ／分で作動
させる。５分間の再循環後、透過液ポンプを６２．５ｍＬ／分で作動させ、液レベルをレ
ザーバ内で、およそ９５０ｍＬに一定にする。希釈ＬＮＰ溶液を９．８Ｌから１．１Ｌま
で１４０分間で濃縮し、希釈ＬＮＰ溶液がすべてレザーバに移されたらポンプを一時停止
する。

【0125】

第２工程は、エタノール／水性バッファーをリン酸緩衝生理食塩水に交換するダイアフ
ィルトレーション工程である。この工程中、およそ１０〜２０ダイアフィルトレーション
容量のリン酸緩衝生理食塩水を使用する。ダイアフィルトレーション後、２回目の濃縮を
行い、ＬＮＰ懸濁液を、ｓｉＲＮＡがおよそ１〜１．５ｍｇ／ｍＬになるまで３倍に濃縮
する。濃縮された懸濁液は、滅菌プラスチックＰＥＴＧビン内に収集する。次いで、最終
懸濁液を、逐次、Ｐａｌｌ ０．４５ｕｍ ＰＥＳフィルターおよびＰａｌｌ ０．２ｕ
ｍ ＰＥＳフィルターによって最終滅菌のために濾過した後、バイアル充填する。

【0126】

一実施形態において、本発明のＬＮＰ組成物は、式Ａのカチオン性脂質、コレステロー
ル、ＤＳＰＣおよびＰＥＧ−ＤＭＧを含むものである。

【0127】

別の実施形態において、本発明のＬＮＰ組成物は、さらに抗凍結剤を含むものである。

【0128】

別の実施形態において、抗凍結剤は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタ
キオース、ベルバスコース、マンニトール、グルコース、ラクトース、マルトース、マル
トリオース−ヘプタオース、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、インスリン、ソ
ルビトール、グリセロール、アルギニン、ヒスチジン、リシン、プロリン、ジメチルスル
ホキシドまたはその任意の組合せである。

【0129】

別の実施形態において、抗凍結剤はスクロースである。

【0130】

別の実施形態において、抗凍結剤はトレハロースである。

【0131】

別の実施形態において、抗凍結剤はスクロースとトレハロースの組合せである。

【0132】

別の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、カチオン性脂質（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ
−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン（化合物３２）、コレ
ステロール、ＤＳＰＣおよびＰＥＧ−ＤＭＧを含むものである。

【0133】

得られたＬＮＰを、粒径、ゼータ電位、アルコール含量、総脂質含量、封入核酸および
総核酸濃度に関して特性評価する。

【0134】

当業者には、本発明が、課題を遂行するため、ならびに記載の目的および利点ならびに
本発明に固有の目的および利点を得るのに充分適合したものであることが容易に認識され
よう。現時点で代表的な好ましい実施形態である本明細書に記載の方法および組成物は例
示的であり、本発明の範囲に対する限定を意図しない。当業者には、本発明の精神に包含
され、特許請求の範囲によって規定される本発明の変形例および他の使用が思いつくであ
ろう。

【0135】

【表3】

【0136】

【表4】

上記のＬＮＰプロセスを使用し、以下の比率の具体的なＬＮＰを特定した。

【0137】

【化29】

オリゴヌクレオチドの合成は当該技術分野でよく知られている（米国特許出願：米国特
許出願公開第同第２００６／００８３７８０号明細書、同第２００６／０２４０５５４号
明細書、同第２００８／００２００５８号明細書、同第２００９／０２６３４０７号明細
書および同第２００９／０２８５８８１号明細書ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２
００９／０８６５５８号パンフレット、同第２００９／１２７０６０号パンフレット、同
第２００９／１３２１３１号パンフレット、同第２０１０／０４２８７７号パンフレット
、同第２０１０／０５４３８４号パンフレット、同第２０１０／０５４４０１号パンフレ
ット、同第２０１０／０５４４０５号パンフレットおよび同第２０１０／０５４４０６号
パンフレット参照）。本実施例において開示し、使用したｓｉＲＮＡは標準的な固相手順
によって合成した。

【0138】

実施例１
マウスでの有効性のインビボ評価
化合物１〜４４を使用したすぐ上に示した公称組成のＬＮＰを、インビボ有効性につい
て評価した。ｓｉＲＮＡは、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラー
ゼ遺伝子（受託番号Ｍ１５０７７）のｍＲＮＡ転写物を標的化するものである。ルシフェ
ラーゼｓｉＲＮＡの一次配列と化学修飾パターンは上記に示している。インビボルシフェ
ラーゼモデルには、ホタルルシフェラーゼコード配列がすべての細胞内に存在するトラン
スジェニックマウスを使用する。ＲＯＳＡ２６−ＬｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−Ｌｕｃ
（ＬＳＬ−Ｌｕｃ）トランスジェニックマウス（Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから実施許諾を得た）を、最初に組換えＡｄ−Ｃｒｅウイルス（Ｖ
ｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてＬＳＬ配列を除去することにより、ルシフェラー
ゼ遺伝子が発現されるように誘導する。該ウイルスの臓器向性の性質のため、尾静脈注射
によって送達すると、発現は肝臓に限定される。肝臓内ルシフェラーゼ発現レベルを、ル
シフェリン基質（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の投与後にＩＶＩＳ撮
像装置（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて光出力を測定することにより定量する。ＲＤＶの投与
前に投与前発光レベルを測定する。ルシフェリン（ＰＢＳ中（１５ｍｇ／ｍＬ））を１５
０μＬの容量で腹腔内（ＩＰ）注射する。４分間のインキュベーション期間後、マウスを
イソフルランで麻酔し、ＩＶＩＳ撮像装置内に置く。ＲＤＶ（ｓｉＲＮＡを含有）（ＰＢ
Ｓビヒクル中）を０．２ｍＬの容量で尾静脈注射した。最終用量レベルを０．１〜０．５
ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡの範囲とした。対照としてＰＢＳビヒクル単独を投与した。投与
の４８時間後、上記の方法を用いてマウスの画像を撮影した。ルシフェリンの光出力の変
化は、ルシフェラーゼのｍＲＮＡレベルと直接的に相関しており、ルシフェラーゼｓｉＲ
ＮＡ活性の間接的は尺度を表す。インビボ有効性の結果を投与前発光レベルに対する発光
阻害％として示す。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ ＲＤＶを全身投与すると、ルシフェラー
ゼ発現が用量依存的様式で減少した。ＲＤＶを内包している化合物１を投与したマウスで
は、ＲＤＶ含有オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（ＯＣＤ）カチオン性脂質の場合よりも大きな
有効性が観察された（図１）。ＯＣＤは既知であり、国際公開第２０１０／０２１８６５
号パンフレットに記載されている。ＲＤＶを内包している化合物３２および３３を投与し
たマウスでも、ＭＣ３（化合物４６）カチオン性脂質を含有するＲＤＶと比べて同様の有
効性が観察された（図１１）。

【0139】

実施例２
インビトロＡｐｏＥ結合アッセイ
ＬＮＰを、９０％アカゲザル血清中、４ｕｇ／ｍＬの最終ＬＮＰ濃度で３７℃にてイン
キュベートする。インキュベーションは、軌道回転により２０分間とする。インキュベー
ション後、試料をＰＢＳ中で１：２０に希釈し、１００ｕＬの各希釈試料を、抗ＰＥＧ抗
体コート９６ウェルプレート（Ｌｉｆｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号Ｐ−００
０１ＰＬのウェルにアリコートに分ける。室温で１時間のインキュベーション後、プレー
トを３００ｕＬのＰＢＳで５回洗浄する。洗浄後、５０ｕＬの０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１０分間インキュベートした後、プレ
ート振盪機で７５０ｒｐｍにて１分間振盪する。試料のＡｐｏＥ ＥＬＩＳＡおよびステ
ムループＰＣＲ解析を行う前に、試料を凍結させる。

【0140】

ＡｐｏＥ ＥＬＩＳＡアッセイを行い、インキュベーション後、ＬＮＰに結合している
アカゲザル血清中のＡｐｏＥを定量する。抗ＡｐｏＥ抗体（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，カタログ
番号ＡＢ９４７）をＰＢＳ中で１：１０００に希釈し、１００ｕＬの希釈抗体を、ポリス
チレン製の高結合プレートの各ウェルに添加する。抗体を有するこのプレートを４℃で一
晩インキュベートした後、プレートを２００ｕＬのＰＢＳで２回洗浄する。次に、１％Ｂ
ＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０をＰＢＳ中に含む２００ｕＬのバッファー（イン
キュベーションバッファー）を各ウェルに添加した後、室温で１時間インキュベーション
する。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで５回洗浄する。凍結Ｔｒｉｔ
ｏｎ溶解試験試料を解凍し、インキュベーションバッファーで１：６に希釈し、１００ｕ
Ｌの試験試料を、ＡｐｏＥ抗体プレートのウェルにアリコートに分ける。インキュベーシ
ョンを室温で１時間した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで５回洗浄する。洗
浄後、１００ｕＬのビオチン化抗ＡｐｏＥ抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ，カタログＡ番号Ｅ８８
７−ビオチン）（インキュベーションバッファー中で１：５００に希釈）を各ウェルに添
加し、室温で１時間インキュベートした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで５
回洗浄する。次いで、１００ｕＬ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＰＲ（Ｔｈｅｒｍｏ
，カタログ番号ＴＳ−１２５−ＨＲ）を添加し、室温で１時間インキュベートする。０．
０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで５回洗浄後、１００ｕＬのＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍ
ｏ，カタログ番号３４０２８）を各ウェルに添加した後、暗所で室温にて２０分間インキ
ュベーションする。１００ｕＬのＴＭＢ停止溶液（ＫＰＬ，カタログ番号５０−８５−０
４）で比色定量反応を停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。アカゲザル組換
えＡｐｏＥを、０．０３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（１００ｎｇ／ｍＬ〜０．７８ｎｇ
／ｍＬの範囲の濃度）を有するインキュベーションバッファーで希釈することによりＡｐ
ｏＥ標準曲線を作成する。ＡｐｏＥ標準を、ＥＬＩＳＡにおいて試験試料とパラレルで評
価する。ＥＬＩＳＡにおける非ＬＮＰ依存性ＡｐｏＥシグナルのバックグラウンド減算を
得るため、アカゲザル血清のみ（ＬＮＰなし）対照を使用する。
ステムループＲＴ−ＰＣＲプロトコル
抗ＰＥＧ抗体プレートに結合させた量のＬＮＰに結合しているＡｐｏＥに対して標準化
するため、抗ＰＥＧ抗体ウェル内に保持されたｓｉＲＮＡの量をステムループＰＣＲによ
って定量し、ＬＮＰ１つあたりに封入されたｓｉＲＮＡ数と関連付け、ウェル１つあたり
の結合ＬＮＰ粒子の総数の概算測定値を得る。
スパイク標準曲線試料の調製：
標準曲線は、ｓｉＲＮＡの分子量（ＡｐｏＢ １７０６３は１３６９３ｇ／ｍｏｌ）を
用いてコピー数を計算して作成する。高度標準は１０^１１コピー／３μｌを含むものとす
るのがよい。一連のアッセイプレートにおいて、最低標準が１０^２コピー／３μ１を含む
まで１０倍連続希釈を行う。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を水中で１：８０に希釈
し、２０ｕＬの希釈Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を９６ウェルプレートの１０個のウェル内
にピペッティングする。３０ｕＬの連続希釈標準曲線およびミックスをプレートの各ウェ
ルに添加する。１０ｕＬのスパイク標準曲線を逆転写反応に使用する。
ステムループＲＴ−ＰＣＲ−試験試料および標準曲線：
ＰＥＧ抗体プレート捕捉によるＴｒｉｔｏｎライセートをヌクレアーゼ無含有水中で１
対２０００に希釈する。１０μＬの‘ＲＴ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ’（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔカタログ番号４３６６５９６）を９６ウェルＭｉｃｒｏ−Ａ
ｍｐ ＱＰＣＲプレート（ＡＢＩ カタログ番号Ｎ８０１−０５６０）の各ウェルに添加
する。

【0141】

【表5】

１０ｕＬの各試験試料（１対２０００に希釈）またはスパイク標準曲線（上記）を９６
ウェルプレート内にアリコートに分ける。プレートをマット（ＡＢＩ カタログ番号Ｎ８
０１−０５５０）で覆い、蒸発を最小限にする。プレートを８００ｒｐｍで１分間、手短
に遠心分離する。次に、このプレートに対して、サーモサイクラーにおいて以下のサイク
ルパラメータを用いて操作する。

【0142】

【表6】

次に、１０ｕＬの‘ＲＴ Ｍｉｘ’を各ウェル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
’ｓ ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
Ｋｉｔカタログ番号４３６６５９６）に添加する。

【0143】

【表7】

ＲＴサイクル反応液は、１０ｕＬの試験試料、１０ｕＬのＲＴプライマーミックスおよ
び１０ｕＬのＲＴミックス成分で総容量３０ｕＬで構成する。総量３０ｕＬの総ＲＴミッ
クス中のＲＴ−プライマーの終濃度は２００ｎＭとする。次いで、プレートを同じプレー
トマットで封止し、８００ｒｐｍで１分間、手短に遠心分離し、次いで、サーモサイクラ
ーで以下のサイクルパラメータを用いて実施する。

【0144】

【表8】

次に、１５ｕＬの高速酵素／プライマー−プローブミックスを、新たな高速９６ウェル
プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，カタログ番号４３５２０４２）の各ウェ
ルに添加する。

【0145】

【表9】

５ｕＬの各ＲＴ反応液を高速酵素ミックスプレートに添加する。プレートを１０００ｒ
ｐｍで１分間遠心分離し、高速ブロック（Ｆａｓｔ Ｂｌｏｃｋ）を有するＡＢＩ７９０
０でＱＰＣＲ解析を行う。サイクルパラメータは：１サイクル−９５℃で２０秒間、続い
て４０サイクル−９５℃で１秒間、６０℃で２０秒間とする。

【0146】

ＱＰＣＲの結果を使用し、ＰＥＧ抗体捕捉プレートのＴｒｉｔｏｎライセート中のｓｉ
ＲＮＡ濃度を計算する。ＬＮＰ粒子１個あたりｓｉＲＮＡは５００個という推定に基づき
、抗ＰＥＧ抗体プレートの各ウェル内に保持されたＬＮＰの数が算出され得る。ウェル１
つあたりのＡｐｏＥ濃度（ＡｐｏＥ ＥＬＩＳＡおよびウェル１つあたりのＬＮＰ粒子数
によって測定）を使用し、ＬＮＰ粒子１つあたりに結合しているＡｐｏＥ分子の個数の概
算値が算出され得る。
ＬＮＰ１つあたりに結合しているＡｐｏＥ分子の数

【0147】

【表10】

実施例３
ヘパリンセファロースＨＩ−ＴＲＡＰ^ＴＭ結合アッセイ
中性表面電荷を有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ヘパリンセファロース（泳動バッフ
ァーとして１×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を含む）への注入後、保持
されずにカラム空隙容積内に溶出される。血清アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）は、ヘ
パリン硫酸との高親和性結合を示し、ＬＮＰは、精製および／または組換えヒトＡｐｏＥ
または血清試料とのインキュベーション後、ヘパリンセファロースに、ＡｐｏＥに結合す
るその固有の能力（脂質ナノ粒子の組成とＡｐｏＥの濃度の両方に依存）に依存する程度
に結合することが示された。表面にＡｐｏＥが結合している脂質ナノ粒子は、ヘパリンセ
ファロースに高親和性で結合し、高塩度（１Ｍ ＮａＣｌ）でのみ溶出される。

【0148】

ヘパリンセファロース結合アッセイは、ＡｐｏＥ−ＬＮＰ複合体がヘパリンセファロー
スに対して示す高親和性相互作用に基づいて、脂質ナノ粒子に対する血清ＡｐｏＥ結合を
評価するために開発された。
インキュベーション
脂質ナノ粒子を、３７℃で２０分間、５０μｇ／ｍＬの最終ｓｉＲＮＡ濃度で、種々の
濃度の精製もしくは組換えヒトアポリポタンパク質Ｅまたは０．１〜５０％のラット／マ
ウス／アカゲザル／ヒト血清（１×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中）の
いずれかとともにインキュベートした。ＡｐｏＥまたは血清とのインキュベーション後、
ＬＮＰ試料を１×ＤＰＢＳを用いて１０倍に希釈し、ヘパリンセファロースクロマトグラ
フィーによって解析した。保持されたＬＮＰのピーク面積（適切なブランクシグナルの減
算後）をＡｐｏＥおよび／または血清とのインキュベーションなしのＬＮＰ対照の総ピー
ク面積と比較し、ＡｐｏＥ／血清とのインキュベーション後に高親和性ヘパリン相互作用
へのシフトが起こったＬＮＰのパーセンテージを求める。
ヘパリンセファロースＨＩ−ＴＲＡＰ^ＴＭクロマトグラフィー条件
ヘパリンセファロースＨＩ−ＴＲＡＰ^ＴＭクロマトグラフィーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌ
ｔｈｃａｒｅ；１ｍＬの床容量）を１倍または２倍いずれかのダルベッコＰＢＳで平衡化
する；高い方の２倍塩濃度を、ヘパリンセファロース上への固有保持力が高い方（おそら
く、プラスの表面電荷が高いため）のＬＮＰに使用する。
移動相Ａ：１×または２×ＤＰＢＳ
移動相Ｂ：１Ｍ ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）
１００％のＡを定組成的に１０分間送達後、１００％のＢまでの段階的勾配；さらに１０
分間保持；段階的勾配で１００％のＡに戻し、さらに１０分間再平衡化した後、次の試料
のインジェクション
流速：１ｍＬ／分
試料のインジェクション容量：５０μＬ
検出：ＵＶ（２６０ｎｍ）
アカゲザル血清とのインキュベーション（２×ＤＰＢＳ条件）でのＨＩ−ＴＲＡＰ^ＴＭ結
合の結果

【0149】

【表11】

実施例４
ラットでの有効性および毒性のインビボ評価
該化合物を上記の公称組成で用いたＬＮＰを、インビボ有効性ならびにアラニンアミノ
トランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの増大について、Ｓ
ｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）雌ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖ
ｅｒ Ｌａｂｓ）において評価した。ｓｉＲＮＡは、ＡｐｏＢ遺伝子（受託番号ＮＭ０１
９２８７）のｍＲＮＡ転写物を標的化するものである。ＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡの一次配列
と化学修飾パターンは上記に示している。ＲＤＶ（ｓｉＲＮＡを含有）（ＰＢＳビヒクル
中）を１〜１．５ｍＬの容量で尾静脈注射した。注入速度はおよそ３ｍｌ／分にする。各
投与群には５匹のラットを使用した。ＬＮＰ投与後、ラットを、通常の飼料と水を存在さ
せたケージ内に入れる。投与の６時間後、食糧をケージから除く。ＬＮＰ投与の２４時間
後、動物の剖検を行う。ラットをイソフルラン下で５分間麻酔し、次いで、イソフルラン
の送達を継続しながらノーズコーン内に入れることにより、放血が完了するまで麻酔下に
維持する。大静脈からの血液を、２３ゲージのバタフライ型静脈穿刺セットを用いて収集
し、血清化学解析のために血清分離器バキュテイナーにアリコートに分ける。切除した肝
臓の尾状葉の円筒形切片（ｐｕｎｃｈ）を作製し、ｍＲＮＡ解析のためにＲＮＡＬａｔｅ
ｒ（Ａｍｂｉｏｎ）内に入れる。保存した肝臓組織をホモジナイズし、Ｑｉａｇｅｎビー
ズミルおよびＱｉａｇｅｎ ｍｉＲＮＡ−Ｅａｓｙ ＲＮＡ単離キットを製造業者の使用
説明書に従って用いて全ＲＮＡを単離した。肝臓ＡｐｏＢ ｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ
−ＰＣＲによって測定した。メッセージを精製ＲＮＡから、ラットＡｐｏＢの市販のプロ
ーブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＲＮ０１４９９０５４
＿ｍｌ）を用いて増幅した。ＰＣＲ反応は、９６ウェル高速ブロックを有するＡＢＩ ７
５００機器で行った。ＡｐｏＢ ｍＲＮＡレベルをハウスキーピングＰＰＩＢ（ＮＭ０１
１１４９）ｍＲＮＡに対して標準化する。ＰＰＩＢ ｍＲＮＡレベルは、ＲＴ−ＰＣＲに
より、市販のプローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓカタログ番号Ｍｍ０
０４７８２９５＿ｍｌ）を用いて測定した。結果をＡｐｏＢ ｍＲＮＡ／ＰＰＩＢ ｍＲ
ＮＡ比として示す。ｍＲＮＡのデータはすべて、ＰＢＳ投与対照に相対して示したもので
ある。血清ＡＬＴおよびＡＳＴ解析はＳｉｅｍｅｎｓ Ａｄｖｉａ １８００ Ｃｌｉｎ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒで、Ｓｉｅｍｅｎｓアラニンアミノト
ランスフェラーゼ（カタログ番号０３０３９６３１）およびアスパラギン酸アミノトラン
スフェラーゼ（カタログ番号０３０３９６３１）試薬を用いて行った。ＲＤＶを内包して
いる化合物３２または３３を投与したラットにおいて、ＲＤＶを内包しているカチオン性
脂質ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ（化合物４５）またはＭＣ３（化合物４６，図２）の場合より
も、同様の有効性および耐容性の改善が観察された。

【0150】

実施例５
ラット／サルの肝臓内カチオン性脂質レベルの測定
肝臓組織を２０ｍｌ容バイアル内に量り入れ、９ｖ／ｗの水中でＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅ
ｒ ２０００（ＯＰＳ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，１６００ストローク／分，５分間）を
用いてホモジナイズした。各組織ホモジネートの５０μＬアリコートを３００μＬの抽出
／タンパク質析出溶媒（５００ｎＭの内部標準を含有する５０／５０のアセトニトリル／
メタノール）と混合し、プレートを遠心分離して析出し、タンパク質を沈降させた。次い
で、２００μＬ容量の各上清みを９６ウェルプレートの別々のウェルに移し、１０μＬの
試料をＬＣ／ＭＳ−ＭＳによって直接解析した。

【0151】

既知量の該化合物のメタノールストック溶液を未処理のラット肝臓ホモジネート（９容
量の水／肝臓重量）にスパイクすることにより、標準を調製した。各標準／肝臓ホモジネ
ートのアリコート（５０μＬ）を３００μＬの抽出／タンパク質析出溶媒（５００ｎＭの
内部標準を含有する５０／５０のアセトニトリル／メタノール）と混合し、プレートを遠
心分離して析出し、タンパク質を沈降させた。２００μＬ容量の各上清みを９６ウェルプ
レートの別々のウェルに移し、１０μＬの各標準をＬＣ／ＭＳ−ＭＳによって直接解析し
た。

【0152】

肝臓ホモジネートから調製および抽出した標準に対する絶対定量を、ＡＰＩ ４０００
トリプル四重極質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に連結したＡｒｉ
ａ ＬＸ−２ ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行っ
た。各操作では、総量１０μＬの試料をＢＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｃ８ ＨＰＬＣカラ
ム（Ｔｈｅｒｍｏ，５０×２ｍｍ，３μｍ）に周囲温度でインジェクションした。

【0153】

移動相Ａ：９５％Ｈ２Ｏ／５％メタノール／１０ｍＭギ酸アンモニウム／０．１％ギ酸
移動相Ｂ：４０％メタノール／６０％ｎ−プロパノール／１０ｍＭギ酸アンモニウム／
０．１％ギ酸 流速は０．５ｍＬ／分とし、勾配溶出プロフィールは以下のとおり：８０
％Ａで０．２５分間保持、１００％Ｂまで１．６分間にわたって線形漸増、１００％Ｂで
２．５分間保持、次いで、８０％Ａに戻して１．７５分間保持とした。全操作時間は５．
８分間であった。ＡＰＩ ４０００ソースパラメータは、ＣＡＤ：４、ＣＵＲ：１５、Ｇ
Ｓ１：６５、ＧＳ２：３５、ＩＳ：４０００、ＴＥＭ：５５０、ＣＸＰ：１５、ＤＰ：６
０、ＥＰ：１０とした。

【0154】

ＲＤＶを内包している化合物３２または３３を投与したラットでは、肝臓内レベルは、
ＲＤＶを内包しているカチオン性脂質ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ（化合物４５）またはＭＣ３
（化合物４６，図３）と同様であるか、またはより低いかのいずれかであった。ＲＤＶを
内包している化合物３２または３３を投与したサルでは、肝臓内レベルは、ＲＤＶを内包
しているカチオン性脂質ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ（化合物４５）またはＭＣ３（化合物４６
，図７）よりも低かった。

【0155】

実施例６
アカゲザルでのＡｐｏＢ有効性のインビボ評価
化合物を上記の公称組成で用いたＬＮＰを、インビボ有効性について、雄または雌のア
カゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ（ｒｈｅｓｕｓ）ｍｏｎｋｅｙ）において評価
した。ｓｉＲＮＡは、ＡｐｏＢ遺伝子（受託番号ＸＭ ００１０９７４０４）のｍＲＮＡ
転写物を標的化するものである。ＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡの一次配列と化学修飾パターンは
上記に示している。ＲＤＶ（ｓｉＲＮＡを含有）（ＰＢＳビヒクル中）を静脈内注射によ
って伏在静脈に、２０ｍＬ／分の注入速度で０．２５ｍｇ／キログラムｓｉＲＮＡの用量
レベルまで投与した。注射容量は１．９〜２．１ｍＬ／キログラムとし、サルの体重は２
．５〜４．５キログラムの範囲であった。ＲＤＶまたはＰＢＳ対照を３匹のサルに投与し
た。投与後、複数の日に、血清化学検査用解析のために１ｍＬの血液試料を大腿動脈から
採取した。サルは、血液採取の前に一晩絶食させた。有効性の尺度として、ＬＤＬ−Ｃを
、ＡｐｏＢ ｍＲＮＡ減少の下流サロゲートマーカーとしてモニタリングした。ＲＤＶを
内包している化合物３２および３３（０．２５ｍｇ／ｋｇ）の全身投与の４日後、ＬＤＬ
−Ｃの血清レベルは、投与前レベルの３０％未満まで低減された（図４）。

【0156】

実施例７
アカゲザルでのβ−カテニンの有効性のインビボ評価
試験の−７日目、投与前肝臓生検試料（約０．５〜ｌグラム／試料）を雄アカゲザルか
ら、腹腔鏡下での外科的切除によって収集した（サル１匹あたり、無作為に選択した肝葉
の１つの外縁から１例の生検試料を切除）。各投与前生検からの約５０ｍｇの３つの非隣
接試料の標本抽出には、５ｍｍの組織円筒形切片を使用した。試料は、後のＣＴＮＮＢ１
ｍＲＮＡ解析のためにＲＮＡｌａｔｅｒ^ＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ）中に保存した。

【0157】

試験の０日目、サルに、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）試験品のリン酸緩衝生理食塩水懸濁液
（０．０５〜０．１ｍｇ ｓｉＲＮＡ／ｍＬ）を、単回用量静脈内ボーラス注射によって
目標用量０．６７、１．３４または３．３４ｍｇ ｓｉＲＮＡ／ｍ^２で投与した。投与目
的のため、体表面積（ｍ^２）を体重から、以下に示す確立されたアロメトリックスケーリ
ングの関係（１）：
ＢＳＡ（ｍ^２）＝０．１１^＊ＢＷ（単位：ｋｇ）^０．６５
にしたがって推定した。

【0158】

試験の２日目と７日目（ＬＮＰ投与後、４８時間目と１６８時間目）、肝臓生検試料（
約０．５〜１グラム／試料）をサルから、腹腔鏡下での外科的切除によって収集した（サ
ル１匹あたり、無作為に選択した２つの別々の肝葉を切除した）。４８時間目と１６８時
間目の各外科的生検試料について、約５０ｍｇの３つの非隣接試料の標本抽出には、５ｍ
ｍの組織円筒形切片を使用した。試料は、後のＣＴＮＮＢ１ ｍＲＮＡ解析のためにＲＮ
Ａｌａｔｅｒ^ＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ）中に保存した。

【0159】

ＣＴＮＮＢ １ ｍＲＮＡレベルを相対的定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、ＣＴＮＮＢ１
に対して検証済のプライマー／プローブセットを用いて測定し、ペプチジルプロリルイソ
メラーゼＢ（ＰＰＩＢまたはシクロフィリンＢとしても知られている）のｍＲＮＡレベル
、および１８ＳリボソームＲＮＡ（１８Ｓ ｒＲＮＡ）のＲＮＡレベルに対して標準化し
た。ＣＴＮＮＢ１ ｍＲＮＡ肝臓発現の変化を、投与後試料と対応する各投与前サル肝臓
試料とのＰＣＲのサイクル数閾値の差（ΔΔＣｔ）として測定した。

【0160】

ＣＴＮＮＢ１ ｍＲＮＡノックダウン（処置前レベルに対して）の計算値は、ΔΔＣｔ
から以下の関係：
ｍＲＮＡ（ノックダウン％）＝１００−（１００／２^{−ΔΔＣｔ}）
を用いて算出した。

【0161】

ＲＤＶを内包している化合物３２および３３ならびにβ−カテニンｓｉＲＮＡを投与し
たサルでは、０．６７〜３．３４ｍｇ／ｍ^２の範囲の用量でロバストなＫＤが示された（
図５）。
（１）ＦＤＡ指針書：「Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｅｓｔｉｍａｔ
ｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎ
ｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉ
ｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ」２００５年７月，米保健社会
福祉省，食品医薬品局−医薬品評価センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａ
ｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＣＤＥＲ）
実施例８
アカゲザルでのＡＬＴ増加のインビボ評価
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を、サル全血の血餅から遠心分離後に収
集した血清において測定する。Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍ自動化学検査
用解析装置により、該血清中のＡＬＴの酵素活性を、国際臨床化学連合（Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
の標準化された手順および試薬を使用することにより測定する。解析者のコンピュータで
吸光度の測定値を用いて、標準曲線と比較したときの試料中のＡＬＴ活性を算出する。Ａ
ＬＴ活性を１リットルあたりの国際単位（ＩＵ／Ｌ）で報告する。

【0162】

ＲＤＶを内包している化合物３２および３３を投与したサルでは、ＲＤＶを内包してい
るカチオン性脂質ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ（化合物４５）またはＭＣ３（化合物４６，図６
）を投与したサルよりもピークＡＬＴの上昇が低かった。

【0163】

実施例９
肝細胞癌マウスモデルにおける評価
肝細胞癌へのβ−カテニンｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡβ−ｃａｔ）の送達におけるＬＮＰ
活性を、ＴＲＥ−ＭＥＴと命名されたマウス肝細胞癌（ＨＣＣ）モデルにおいて評価した
。ＴＲＥ−ＭＥＴマウスは、ヒトＭＥＴ導入遺伝子が、七量体化上流ｔｅｔ−オペレータ
を有するｈＣＭＶプロモーター下で発現されるＦＶＢ／Ｎ遺伝的背景のトランスジェニッ
クマウスである。ＴＲＥ−ＭＥＴマウスをＬＡＰ−ｔＴＡ系統と交配すると、ダブルトラ
ンスジェニック（ＴＲＥ−ＭＥＴ／ＬＡＰ−ｔＴＡ）マウスは、ＭＥＴを肝臓特異的様式
で発現し、これはドキシサイクリンの投与によって抑制され得る。このマウスは、約３ヶ
月齢のときにＨＣＣを発症し、肝臓表面上に目視で確認可能な腫瘍小結節があり、腫瘍は
、ＨＣＣに典型的な散在性で小柱状の増殖パターンを示し、ＨＣＣ腫瘍マーカーであるα
−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を発現する。また、ＴＲＥ−ＭＥＴマウスの腫瘍における
変異解析によっても、腫瘍のおよそ９５％においてβ−カテニン遺伝子の変異の活性化が
確認されている。このような特徴のため、ＴＲＥ−ＭＥＴ ＨＣＣマウスモデルは、β−
カテニンｓｉＲＮＡのＬＮＰ媒介性送達およびその結果もたらされる腫瘍増殖に対する有
効性の評価に適している。

【0164】

肝臓および腫瘍組織の両方でのβ−カテニンｍＲＮＡのサイレンシングにおけるβ−カ
テニン含有ＬＮＰの効果を、まず、腫瘍を有するＴＲＥ−ＭＥＴマウスでの薬力学的（Ｐ
Ｄ）試験において評価した。種々の用量のＬＮＰまたは高用量のＬＮＰ対照ｓｉＲＮＡを
静脈内投与し、７２時間後、剖検を行い、Ｔａｑｍａｎによるβ−カテニンｍＲＮＡレベ
ルの測定のために肝臓と腫瘍組織を収集した。図８と９に示されるように、化合物３３で
は、ロバストで用量依存性のβ−カテニンｍＲＮＡのノックダウンが肝臓と腫瘍組織の両
方において誘導されたが、対照ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳを受けた動物ではβ−カテニンノ
ックダウンは観察されなかった。０．１ｍｐｋおよび０．０５ｍｐｋのＬＮＰでは、それ
ぞれ、正常肝臓において８８％および６９％のＫＤが誘導された。腫瘍内でのＫＤは７０
％（２ｍｐｋ）〜約４０％（０．１または０．０５ｍｐｋ）の範囲である。図１２と１３
に示されるように、化合物３２では、ロバストで用量依存性のβ−カテニンｍＲＮＡのノ
ックダウンが肝臓と腫瘍組織の両方において誘導されたが、対照ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳ
を受けた動物ではβ−カテニンノックダウンは観察されなかった。０．１ｍｐｋおよび０
．０５ｍｐｋのＬＮＰでは、それぞれ、正常肝臓において７６％および７８％のＫＤが誘
導された。腫瘍内でのＫＤは４７％（０．２５ｍｐｋ）〜約２０ないし３０％（０．１ま
たは０．０５ｍｐｋ）の範囲である。

【0165】

腫瘍増殖に対するＬＮＰの効果を反復用量有効性試験において評価した。ＴＲＥ−ＭＥ
Ｔ ＨＣＣマウスに化合物３３／ｓｉＲＮＡβ−ｃａｔ、化合物３２／ｓｉＲＮＡｂ−ｃ
ａｔ、対照ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳを毎週、３週間投与し（３回投与）、各動物の腫瘍体
積を、１回目の投与の７日前と最終投与の３日後に、マイクロＣＴスキャンによって測定
した（図１０および１４）。また、最終投与の７日後に、β−カテニンｍＲＮＡレベルの
評価のために肝臓および腫瘍組織を収集した。ＰＢＳまたは対照ｓｉＲＮＡを受けたマウ
スでは、全身腫瘍組織量において３６０〜４７０％の増殖が示されたが、化合物３３／ｓ
ｉＲＮＡβ−ｃａｔで処置したマウスでは、用量依存的様式での著しい腫瘍の増殖阻害ま
たは退縮が示された（図１０）。２ｍｐｋおよび０．５ｍｐｋの化合物３３／ｓｉＲＮＡ
β−ｃａｔでは、それぞれ、６０％および４０％の腫瘍退縮が誘導され、０．０５ｍｐｋ
では腫瘍の安定（ｓｔａｓｉｓ）が引き起こされた。ＰＢＳまたは対照ｓｉＲＮＡを受け
たマウスでは、全身腫瘍組織量において約３５０％の増殖が示された、化合物３２／ｓｉ
ＲＮＡβ−ｃａｔで処置したマウスでは、用量依存的様式での著しい腫瘍の増殖阻害また
は退縮が示された（図１４）。０．５、０．２５および０．１ｍｇ／ｋｇの化合物３２／
ｓｉＲＮＡβ−ｃａｔでは、それぞれ、３７、５８および３７％の腫瘍退縮が誘導され、
０．０５ｍｐｋでは腫瘍の安定が引き起こされた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]