特許 6546296 低分子ポリペプチドＺＹ４及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6546296

(24)【登録日】2019年6月28日

(45)【発行日】2019年7月17日

(54)【発明の名称】低分子ポリペプチドＺＹ４及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/08 20060101AFI20190705BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20190705BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190705BHJP

   A61P 31/04 20060101ALN20190705BHJP

   A61P 31/10 20060101ALN20190705BHJP

   A61P 31/12 20060101ALN20190705BHJP

   A61P 33/00 20060101ALN20190705BHJP

   A61P 17/10 20060101ALN20190705BHJP

   A61P 17/00 20060101ALN20190705BHJP

   A61K 8/64 20060101ALN20190705BHJP

   A61Q 17/00 20060101ALN20190705BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALN20190705BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/08ZNA

   A61K38/10

   A61P35/00

   !A61P31/04

   !A61P31/10

   !A61P31/12

   !A61P33/00

   !A61P17/10

   !A61P17/00 101

   !A61K8/64

   !A61Q17/00

   !A61Q19/00

【請求項の数】1

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2017-565996(P2017-565996)

(86)(22)【出願日】2016年1月12日

(65)【公表番号】特表2018-521041(P2018-521041A)

(43)【公表日】2018年8月2日

(86)【国際出願番号】CN2016070739

(87)【国際公開番号】WO2016201972

(87)【国際公開日】20161222

【審査請求日】2017年12月14日

(31)【優先権主張番号】201510331263.5

(32)【優先日】2015年6月15日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】517439030

【氏名又は名称】四川合泰新光生物科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＩＣＨＵＡＮ ＨＥＴＡＩ ＳＹＮＬＩＧＨＴ ＢＩＯＴＥＣＨ ＬＴＤ

(73)【特許権者】

【識別番号】510030331

【氏名又は名称】中国科学院昆明▲動▼物研究所

【氏名又は名称原語表記】ＫＵＮＭＩＮＧ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＺＯＯＬＯＧＹ ．ＣＡＳ（ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ）

(74)【代理人】

【識別番号】100146374

【弁理士】

【氏名又は名称】有馬 百子

(72)【発明者】

【氏名】頼 仞

(72)【発明者】

【氏名】容 明強

(72)【発明者】

【氏名】杜 彦軍

【審査官】 藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０２９２４５７４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１８７０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５１５１４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５００８３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０３２７５１９０（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０４６２３６２８（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ ７／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

低分子ポリペプチドＺＹ４の使用であって、
前記低分子ポリペプチドは、１７個のアミノ酸残基を含み、分子量が２３７４．０Ｄａであり、等電点が１０．７４であり、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ：１で示されるように、バリン−システイン−リジン−アルギニン−トリプトファン−リジン−リジン−トリプトファン−リジン−アルギニン−リジン−トリプトファン−リジン−リジン−トリプトファン−システイン−バリンアミドであり、前記アミノ酸配列中の２つのシステインが１つの分子内ジスルフィド結合を形成する、
肺がん、乳がん、メラノーマ、肝がん及び胃がんから選択される腫瘍の治療用抗腫瘍薬を調製するための低分子ポリペプチドＺＹ４の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は生物医学の分野に属し、具体的には、ざ瘡治療薬、抗感染抗腫瘍薬又は化粧品の調製における低分子ポリペプチドＺＹ４の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ざ瘡は、毛包性皮脂腺の慢性炎症で、青少年期の一般的な炎症性皮膚疾患であり、頬、額、頬及び鼻唇溝で発生しやすく、次は胸部、背部及び肩部で発生しやすい。ざ瘡の発病には、主に、性ホルモンのレベル、皮脂腺の大量分泌、プロピオニバクテリウム・アクネスの増殖、毛包皮脂腺管の異常な角質化及び炎症などの要素が関連する。思春期に皮膚表面の脂質成分が変化し、男性ホルモンが増加することによって、皮脂毛包管が過度に角化する。毛包壁から脱落した上皮細胞と皮脂とは混合し毛包口を閉塞して、にきびを形成する。さらにプロピオニバクテリウムなどの作用に加えて細菌感染することにより、炎症が引き起こされ、皮膚に瘡が生じ、これを患った後は非常に苦痛となる。

【0003】

腫瘍は、有機体の局部組織の細胞が、様々な発癌性因子の作用下で、遺伝子レベルでその増殖に対する正常な調節機能を失い、クローン性異常増殖をもたらして形成される新生物である。人体への危害の大きさと増殖特性に応じて、良性腫瘍と悪性腫瘍という二種類に分けられている。悪性腫瘍は急速に増殖し、増殖の際に周囲の組織に浸潤し、その表面に膜がほとんどなく、全身に転移することが多い。悪性腫瘍の発病率は年々増加する傾向があり、様々な疾病の死亡原因において、悪性腫瘍は上位を占めており、重点的に予防・治療が必要な疾病である。

【0004】

抗菌ペプチドは、生物体内で誘導されて生じる生物活性を有する低分子ポリペプチドであり、約１０００〜７０００の分子量を有し、１０〜６０個のアミノ酸残基からなる。抗菌ペプチドは、生物に微生物が侵入したとき、有機体の免疫反応に関与し、有機体が迅速に生成する効率的で広範囲の抗菌ペプチド類の分子である。抗菌ペプチドは、有機体の効果的な防御分子として広く存在している。現在、微生物、植物、昆虫、節足動物、両生動物、哺乳動物、さらには人体内で、数千種類の抗菌ペプチドが同定されている。
抗菌ペプチドの抗菌メカニズムは複雑であるが、抗菌ペプチドのカチオン性及び疎水性と負帯電性微生物被膜との作用に関連するという説が多い。細菌の細胞膜と接触した後、抗菌ペプチドは、膜の透過性に変化を引き起こすか、又は細菌の細胞膜に膜貫通孔を形成することによって、最終的には細菌の内容物を漏出させ細菌を死滅させる。そのため、抗菌ペプチドは、従来の抗生物質より殺菌速度が遥かに早い。また、低濃度で細菌の増殖を抑制する抗生物質とは異なり、抗菌ペプチドの細菌に対する作用は致命的である。
従来の抗生物質と比較して、抗菌ペプチドは、薬剤耐性株の生成を誘導しにくく、広範な抗菌スペクトルを有し、細菌、真菌、ウイルス、原虫及び癌細胞のいずれもにも影響を与えることが研究により明らかになった。家禽では、３つのファミリーに属する抗菌ペプチドが見つかっており、カテリシジン、肝臓由来アンチマイクロバイアルペプチド（ｌｉｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＬＥＡＰ）、及びβ−ディフェンシンが含まれる。これらの抗菌ペプチドは、家禽の細菌性やウイルス性の疾病に対して極めて重要な作用を有し、これらに関連する遺伝子の突然変異又は欠失は、家禽の微生物感染に対する抵抗能力に顕著な影響を及ぼす。これらの抗菌ペプチドは、広域抗菌活性を有するとともに、効率的な抗真菌、抗ウイルス、抗原虫及び（又は）抗腫瘍活性を有する。例えば、Ｂａｔ５及びＩＭｃ７は、レプトスピラを殺滅することができ、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス、エンベロープウイルス及び寄生虫に対して比較的優れた殺滅作用を有する。幾つかの抗菌ペプチドは、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、エンベロープウイルスに対して明らかな殺傷力を有する。さらに、幾つかの抗菌ペプチドは同時に、多種の他の調節機能を有し、例えば、カテリシジンは創傷治癒、組織損傷修復、化学走化作用、血管新生促進及び抗寄生虫などの機能を有し、動物の体内免疫を調節するのに対して重要な生物学的活性を有する。

【発明の概要】

【0005】

本発明の目的は、従来技術の欠点を克服した低分子ポリペプチドＺＹ４を提供することである。
本発明では、さらに、ざ瘡治療用、抗感染用、抗腫瘍用の薬及び化粧品の調製において低分子ポリペプチドＺＹ４を使用する。

【0006】

本発明の目的は、以下の技術的解決案によって実現される。すなわち、１７個のアミノ酸残基を含み、分子量が２３７４．０Ｄａで、等電点が１０．７４であり、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ： １で示されるように、バリン−システイン−リジン−アルギニン−トリプトファン−リジン−リジン−トリプトファン−リジン−アルギニン−リジン−トリプトファン−リジン−リジン−トリプトファン−システイン−バリンアミドであり、前記アミノ酸配列中の２つのシステインが１つの分子内ジスルフィド結合を形成し、Ｃ−末端のＶａｌがアミド化された低分子ポリペプチドＺＹ４を提供する。

【0007】

本発明の低分子ポリペプチドＺＹ４は、ざ瘡治療用、抗感染用、抗腫瘍用の薬又は化粧品の調製において使用される。

【0008】

本発明の有益な効果は以下の通りである。本発明のポリペプチドＺＹ４は、人工的に合成されたものであり、分子量が小さく、人工的な合成が容易であるという利点を有する。実験により、本発明のポリペプチドＺＹ４が明らかな抗菌効果を有し、ざ瘡に対して顕著な治療効果を有することが確認された。このポリペプチドは、さらに、腫瘍細胞の増殖を抑制することができ、腫瘍細胞に対して殺傷効果を有する。低分子ペプチドＺＹ４は、抗感染用、抗腫瘍用、ざ瘡治療用の薬又は化粧品の調製に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】マウスの耳のざ瘡モデルに対する低分子ポリペプチドＺＹ４の治療効果を示す図である。

【図2】マウスの耳のざ瘡モデル炎症に対する低分子ポリペプチドＺＹ４の治療効果を示す図である。

【図3】低分子ポリペプチドＺＹ４の抗肺癌細胞Ａ５４９に対する活性を示す図である。

【図4】低分子ポリペプチドＺＹ４の抗乳癌細胞ＭＤＡ−４３５に対する活性を示す図である。

【図5】低分子ポリペプチドＺＹ４の抗メラノーマ細胞Ａ３５７に対する活性を示す図である。

【図6】低分子ポリペプチドＺＹ４の抗肝癌細胞ＨｅｐＧ２に対する活性を示す図である。

【図7】低分子ポリペプチドＺＹ４の抗胃癌細胞ＳＧＣ７９０１に対する活性示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、添付の図面を参照して実施例により本発明をさらに説明するが、本発明の技術的範囲は以下の説明に限定されるものではない。

【0011】

〈実施例１〉低分子ポリペプチドＺＹ４の調製
（１）樹脂を０．２ｇ秤量して、乾燥した清浄な反応管に入れ、適量のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を添加し、３０分間活性化させた。１ｍｍｏｌの第１のアミノ酸残基、１５０ｍｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を秤量して反応管に入れ、ＤＭＦを溶媒として３時間反応させた。反応が完了した後、ＤＭＦで３〜６回洗浄して、適量の体積比が１：１のピリディンと無水酢酸の混合液を入れ、３０分間反応させた。反応が完了した後、ＤＭＦで３〜６回洗浄した。その後、アミノ酸保護基Ｆｍｏｃをピペリジンで毎回１５分間、２回溶離した。次いでＤＭＦで４回、メタノールで２回洗浄した。

【0012】

（２）３ｍｍｏｌの第２のアミノ酸、３ｍｍｏｌのＨＢＴＵを秤量して反応管に入れ、０．５ｍｌのＤＩＥＡを添加し、４０分間反応させた。その後、ＤＭＦで３〜６回洗浄し、アミノ酸保護基Ｆｍｏｃをピペリジン溶液で毎回１０分間、２回溶離し、次いでＤＭＦで４回、メタノールで２回洗浄した。

【0013】

（３）最後のアミノ酸残基まで、（２）のステップを繰り返した。

【0014】

（４）最後のアミノ酸の反応が完了した後、トリフルオロ酢酸で２時間切断し、反応物を吸引濾過し、ポリペプチドのトリフルオロ酢酸溶液を得た。これをエーテルで沈殿させて遠心分離した後、エーテルで３〜５回洗浄して白色固体を取得し、ＨＰＬＣで脱塩し凍結乾燥してポリペプチドサンプルを得た。

【0015】

〈実施例２〉低分子ポリペプチドＺＹ４の抗菌実験
（１）大腸菌、カンジダアルビカンス、黄色ブドウ球菌、枯草菌、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス‐コーニイの菌液をそれぞれ調製し、３７℃で１８ｈ恒温培養し、使用のために備えた。

【0016】

（２）濃度が０．８〜２０μｇ／ｍｌである低分子ポリペプチドＺＹ４の溶液を調製し、直径が５〜７ｍｍである円形のろ過紙を消毒して乾燥した後、上記異なる濃度の低分子ポリペプチドＺＹ４の溶液に浸漬した。

【0017】

（３）LB培地を調製し滅菌して、使用のために備えた。

【0018】

（４）LB培地を溶解し、５０℃まで冷却し、大腸菌、カンジダアルビカンス、黄色ブドウ球菌、枯草菌、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス‐コーニイの菌液をそれぞれ１ｍｌ添加し、均一に軽く振り、無菌平皿に注入し、培地が平皿に均一に平らになるように軽く振った。

【0019】

（５）消毒した鉗子によりろ過紙を冷却した平皿内に順番に入れ、クレイタイルの蓋で覆い、マーカーを付け、３７℃の恒温培養箱内に置いて２４時間培養した。

【0020】

（６）阻止円のサイズをノギスで測定し、異なる濃度の低分子ポリペプチドＺＹ４の異なる細菌に対する感受性の強度を比較した。結果を表１及び表２に示す。

【0021】

【表1】

********
表１に示されるように、大腸菌、カンジダアルビカンス、黄色ブドウ球菌及び枯草菌に対する低分子ポリペプチドＺＹ４の最小阻止濃度は、それぞれ１２．１５μｇ／ｍｌ、２．１２μｇ／ｍｌ、２．１４μｇ／ｍｌ、１．１０μｇ／ｍｌであった。

【0022】

【表2】

*******
表２に示されるように、ざ瘡に関与する黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス‐コーニイに対する低分子ポリペプチドＺＹ４の最小阻止濃度は、それぞれ２．２５μｇ／ｍｌ、２．１７μｇ／ｍｌ、２．４５μｇ／ｍｌ、１．１０μｇ／ｍｌである。
実験結果により、低分子ポリペプチドＺＹ４は顕著な抑菌作用を有することがわかった。

【0023】

〈実施例３〉マウスの耳のざ瘡モデルに対する低分子ポリペプチドＺＹ４の治療効果
（１）プロピオニバクテリウム・アクネスＡＴＣＣ１１８１７を脳心臓浸出物培地、対数期まで培養し、生理食塩水で２回洗浄し、生理食塩水で５×１０^８ＣＦＵ／ｍｌに再懸濁した。

【0024】

（２）重量１８ｇの昆明種雄マウスを選択し、治療群、陽性対照群及び陰性対照群の３群にランダムに分けた。各群は、６匹として、麻酔のために１２０μｌの１％のペントバルビタールナトリウムを各マウスの腹腔内に注射した。その後、一匹につき２０μｌの再懸濁した菌液をマウスの左耳皮内に注射した。

【0025】

（３）ポリエチレングリコール、グリセリンを用いて、低分子ポリペプチドＺＹ４、クリンダマイシンをそれぞれ２ｍｇ／ｍｌ含む軟膏に調製した。ここで、ポリエチレングリコールとグリセリンの重量比率は５：１として、得られた軟膏をマウスの左耳の皮膚表面に塗った。治療群には、低分子ポリペプチドＺＹ４含有軟膏を塗り、陽性対照群には、クリンダマイシン含有軟膏を塗り、陰性対照群には、ポリエチレングリコールのみを塗った。８時間毎に１回、合計３回投与し、２４時間後にマウスを殺した。

【0026】

（４）清浄な酒精綿を用いてマウスの左耳を消毒し、左耳を切り粉砕し、ホモジナイザー内に移して十分に均質化した。１つの耳に対して、１ｍｌの生理食塩水を添加して均質化した。

【0027】

（５）ホモジネートを１０００倍に希釈し、５０μｌの希釈液を取り、脳心臓浸出物培地プレートに塗布し、３７℃で７２時間嫌気培養し、コロニーを数えた。結果を図１に示す。２ｍｇ／ｍｌの低分子ポリペプチドＺＹ４を投与して治療を行った場合、プロピオニバクテリウム・アクネスのコロニー数は２．１×１０^５になった。２ｍｇ／ｍｌのクリンダマイシンを投与して治療を行った場合、プロピオニバクテリウム・アクネスのコロニー数は５．６×１０^５になった。ポリエチレングリコールを投与して治療を行った場合、プロピオニバクテリウム・アクネスのコロニー数は９．４４×１０^５になった。これらの結果より、マウスの耳のざ瘡に対するＺＹ４の治療効果は明らかにクリンダマイシンより良好であることが認められた。

【0028】

〈実施例４〉マウスの耳のざ瘡モデル炎症に対する低分子ポリペプチドＺＹ４の治療効果
（１）プロピオニバクテリウム・アクネスＡＴＣＣ６９１９を脳心臓浸出物培地で対数期まで培養し、生理食塩水で２回洗浄し、生理食塩水で５×１０^８ＣＦＵ／ｍｌに再懸濁した。

【0029】

（２）重量１８ｇの昆明種雄マウスを選択し、治療群、陽性対照群及び陰性対照群の３群にランダムに分けた。各群は９匹として、麻酔のために５０μｌのケタミンを各マウスの腹腔内に注射した。その後、一匹につき２０μｌの再懸濁した菌液をマウスの左耳皮内に注射した。

【0030】

（３）ポリエチレングリコールとグリセリンを用いて、低分子ポリペプチドＺＹ４、クリンダマイシンをそれぞれ２ｍｇ／ｍｌ含む軟膏として調製した。ここで、ポリエチレングリコールとグリセリンの重量比率は５：１とし、マウスの左耳の皮膚表面に塗った。治療群には、低分子ポリペプチドＺＹ４含有軟膏を塗り、陽性対照群には、クリンダマイシン含有軟膏を塗り、陰性対照群には、ポリエチレングリコールのみを塗り、８時間毎に１回、合計３回投与し、２４時間後マウスを殺した。

【0031】

（４）清浄な酒精綿を用いてマウスの左耳を消毒し、マウスの耳の厚さを測定した。結果を図２に示す。治療前のマウスの耳の厚さはいずれも０．２０ｍｍであった。２ｍｇ／ｍｌの低分子ポリペプチドＺＹ４を投与して治療を１日行った場合、マウスの耳の厚さは０．２５ｍｍになった。２ｍｇ／ｍｌのクリンダマイシンを投与して治療を１日行った場合、マウスの耳の厚さは０．３４ｍｍになった。ポリエチレングリコールを投与して治療を１日行った場合、マウスの耳の厚さは０．４３ｍｍになった。これらの結果より、ＺＹ４の消炎効果は、明らかにクリンダマイシンより良好であることが示された。

【0032】

〈実施例５〉低分子ポリペプチドＺＹ４による抗肺癌腫瘍細胞Ａ５４９活性化の実験
（１）対数期の肺癌腫瘍細胞Ａ５４９を収集し、細胞懸濁液を調製した。ここで、濃度が、５×１０^６〜１０×１０^６個／ｍｌとなるように調節し、各ウェルに１００μｌ加え、測定される細胞の密度が１０００〜１００００ウェルとなるようにプレートに播種した。辺縁部のウェルを無菌ＰＢＳで充填した。

【0033】

（２）５％のＣＯ_２、３７℃で、９６ウェル平底プレートのウェル底に細胞単層が覆われるまでインキュベートし、細胞を壁に２〜１２時間付着した後、それぞれ濃度が１００μｇ／ｍｌと２００μｇ／ｍｌである低分子ポリペプチドＺＹ４、及びそれぞれ濃度が１０μｇ／ｍｌと５μｇ／ｍｌであるタクソールを加え、５％のＣＯ_２、３７℃で１６〜４８時間インキュベートし、倒立顕微鏡で観察した。

【0034】

（３）各ウェルに５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液を２０μｌ加え、培養を４時間継続し、ウェル内の培養液を吸い取った。

【0035】

（４）各ウェルに１５０μｌのジメチルスルホキシドを加え、シェーカーに置いて低速で１０ｍｉｎ振動して、結晶物を十分に溶解させた。酵素結合免疫検出器により４９０ｎｍで各ウェルの吸光度を測定し、同時にゼロウェル、対照ウェルを設置した。結果を図３に示す。２００μｇ／ｍｌのＺＹ４を肺癌細胞Ａ５４９に作用させた後のＯＤ値は０．３であり、１００μｇ／ｍｌのＺＹ４を肺癌細胞Ａ５４９に作用させた後のＯＤ値は０．５であった。１０μｇ／ｍｌのタクソールを癌細胞の肺癌細胞Ａ５４９に作用した後のＯＤ値は０．５であり、１０μｇ／ｍｌのタクソールを癌細胞の肺癌細胞Ａ５４９に作用した後のＯＤ値は０．７であった。これらの結果より、ＺＹ４が肺癌腫瘍細胞Ａ５４９に対して明らかな抑制作用を有することが示された。

【0036】

〈実施例６〉低分子ポリペプチドＺＹ４による抗乳癌細胞ＭＤＡ−４３５活性化の実験
（１）対数期の乳癌細胞ＭＤＡ−４３５を収集し、細胞懸濁液を調製し、その濃度を５×１０^６〜１０×１０^６個／ｍｌに調節し、各ウェルに１００μｌ加え、測定される細胞の密度が１０００〜１００００ウェルとなるようにプレートに播種した。辺縁部のウェルを無菌ＰＢＳで充填した。

【0037】

（２）５％のＣＯ_２、３７℃で、９６ウェル平底プレートのウェル底に細胞単層が覆われるまでインキュベートし、細胞を壁に２〜１２時間付着した後、濃度が５０〜３００μｇ／ｍｌである低分子ポリペプチドＺＹ４を加え、同体積の生理食塩水を対照として、５％のＣＯ_２、３７℃で１６〜４８ｈインキュベートし、倒立顕微鏡で観察した。

【0038】

（３）各ウェルに５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液を２０μｌ加え、培養を４時間継続し、ウェル内の培養液を吸い取った。

【0039】

（４）各ウェルに１５０μｌのジメチルスルホキシドを加え、シェーカーに置いて低速で１０ｍｉｎ振動して、結晶物を十分に溶解させた。酵素結合免疫検出器により４９０ｎｍで各ウェルの吸光度を測定し、同時にゼロウェル、対照ウェルを設置した。結果を図４に示す。３００μｇ／ｍｌのＺＹ４を乳癌細胞ＭＤＡ−４３５に作用させた後のＯＤ値は０．１７であり、２００μｇ／ｍｌのＺＹ４を乳癌細胞ＭＤＡ−４３５に作用させた後のＯＤ値は０．２０であり、１００μｇ／ｍｌのＺＹ４を乳癌細胞ＭＤＡ−４３５に作用させた後のＯＤ値は０．６１であり、５０μｇ／ｍｌのＺＹ４を乳癌細胞ＭＤＡ−４３５に作用させた後のＯＤ値は０．７であった。これらの結果より、ＺＹ４の乳癌細胞ＭＤＡ−４３５に対する抑制効果に濃度依存性があることが示される。

【0040】

〈実施例７〉低分子ポリペプチドＺＹ４による抗抗メラノーマ細胞Ａ３５７活性化の実験
（１）対数期のメラノーマ細胞Ａ３５７を収集し、細胞懸濁液を調製し、その濃度を５×１０^６〜１０×１０^６個／ｍｌに調節し、各ウェルに１００μｌ加え、測定される細胞の密度を１０００〜１００００ウェルになるようにプレートに播種した。辺縁部のウェルを無菌ＰＢＳで充填した。

【0041】

（２）５％のＣＯ_２、３７℃で、９６ウェル平底プレートのウェル底に細胞単層が覆われるまでインキュベートし、細胞を壁に２〜１２時間付着した後、濃度が１００、２００μｇ／ｍｌである低分子ポリペプチドＺＹ４を加え、同体積の生理食塩水を対照として、５％のＣＯ_２、３７℃で１６〜４８ｈインキュベートし、倒立顕微鏡で観察した。

【0042】

（３）各ウェルに５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液を２０μｌ加え、培養を４時間継続し、ウェル内の培養液を吸い取った。

【0043】

（４）各ウェルに１５０μｌのジメチルスルホキシドを加え、シェーカーに置いて低速で１０ｍｉｎ振動して、結晶物を十分に溶解させた。酵素結合免疫検出器により４９０ｎｍで各ウェルの吸光度を測定し、同時にゼロウェル、対照ウェルを設置した。結果を図５に示す。１００μｇ／ｍｌのＺＹ４をメラノーマ細胞Ａ３５７に作用させた後のＯＤ値は１．０であり、２００μｇ／ｍｌのＺＹ４をメラノーマ細胞に作用させた後のＯＤ値は０．７２であり、生理食塩水をメラノーマ細胞に作用させた後のＯＤ値は１．０であった。これらの結果により、２００μｇ／ｍｌのＺＹ４がメラノーマに対して明らかな抑制作用を有することが示された。

【0044】

〈実施例８〉低分子ポリペプチドＺＹ４による抗肝癌細胞ＨｅｐＧ２活性化の実験
（１）対数期の肝癌細胞ＨｅｐＧ２を収集し、細胞懸濁液を調製し、その濃度を５×１０^６〜１０×１０^６個／ｍｌに調節し、各ウェルに１００μｌ加え、測定される細胞の密度を１０００〜１００００ウェルにするようにプレートに播種した。辺縁部のウェルを無菌ＰＢＳで充填した。

【0045】

（２）５％のＣＯ_２、３７℃で、９６ウェル平底プレートのウェル底に細胞単層が覆われるまでインキュベートし、細胞が壁に２〜１２ｈ付着した後、濃度が１００、２００μｇ／ｍｌである低分子ポリペプチドＺＹ４を加え、同体積の生理食塩水を対照として、５％のＣＯ_２、３７℃で１６〜４８ｈインキュベートし、倒立顕微鏡で観察した。

【0046】

（３）各ウェルに５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液を２０μｌ加え、培養を４時間継続し、ウェル内の培養液を吸い取った。

【0047】

（４）各ウェルに１５０μｌのジメチルスルホキシドを加え、シェーカーに置いて低速で１０ｍｉｎ振動して、結晶物を十分に溶解させた。酵素結合免疫検出器により４９０ｎｍで各ウェルの吸光度を測定し、同時にゼロウェル、対照ウェルを設置した。結果を図６に示す。１００μｇ／ｍｌのＺＹ４を肝癌細胞ＨｅｐＧ２に作用させた後のＯＤ値は０．８９であり、２００μｇ／ｍｌのＺＹ４を肝癌細胞ＨｅｐＧ２に作用させた後のＯＤ値は０．６であり、生理食塩水を肝癌細胞ＨｅｐＧ２に作用させた後のＯＤ値は１．０であった。これらの結果により、２００μｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌのＺＹ４が肝癌細胞ＨｅｐＧ２に対して明らかな抑制作用を有することが示された。
〈実施例８〉低分子ポリペプチドＺＹ４による抗胃癌細胞ＳＧＣ７９０１活性化の実験

【0048】

（１）対数期の胃癌細胞ＳＧＣ７９０１を収集し、細胞懸濁液を調製し、その濃度を５×１０^６〜１０×１０^６個／ｍｌに調節し、各ウェルに１００μｌ加え、測定される細胞の密度を１０００〜１００００ウェルにするようにプレートに播種した。辺縁部のウェルを無菌ＰＢＳで充填した。
（２）５％のＣＯ_２、３７℃で、９６ウェル平底プレートのウェル底に細胞単層が覆われるまでインキュベートし、細胞を壁に２〜１２時間付着した後、濃度が５０〜３００μｇ／ｍｌである低分子ポリペプチドＺＹ４を加え、同体積の生理食塩水を対照として、５％のＣＯ_２、３７℃で１６〜４８ｈインキュベートし、倒立顕微鏡で観察した。

【0049】

（３）各ウェルに５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液を２０μｌ加え、培養を４時間継続し、ウェル内の培養液を吸い取った。

【0050】

（４）各ウェルに１５０μｌのジメチルスルホキシドを加え、シェーカーに置いて低速で１０ｍｉｎ振動して、結晶物を十分に溶解させた。酵素結合免疫検出器により４９０ｎｍで各ウェルの吸光度を測定した。同時にゼロウェル、対照ウェルを設置した。結果を図７に示す。５０μｇ／ｍｌのＺＹ４を胃癌細胞ＳＧＣ７９０１に作用させた後のＯＤ値は０．６５であり、１００μｇ／ｍｌのＺＹ４を胃癌細胞ＳＧＣ７９０１に作用させた後のＯＤ値は０．５７であり、２００μｇ／ｍｌのＺＹ４を胃癌細胞ＳＧＣ７９０１に作用させた後のＯＤ値は０．２であり、３００μｇ／ｍｌのＺＹ４を胃癌細胞ＳＧＣ７９０１に作用した後のＯＤ値は０．０９であった。これらの結果により、ＺＹ４が肝癌細胞胃癌細胞ＳＧＣ７９０１に対して明らかな抑制作用を有することが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]