特許 6550008 誘導体化超分岐ポリグリセロール類

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6550008

(24)【登録日】2019年7月5日

(45)【発行日】2019年7月24日

(54)【発明の名称】誘導体化超分岐ポリグリセロール類

(51)【国際特許分類】

   C08G 65/325 20060101AFI20190711BHJP

   A61K 47/50 20170101ALI20190711BHJP

   A61K 31/337 20060101ALI20190711BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20190711BHJP

   A61K 31/475 20060101ALI20190711BHJP

   A61K 33/24 20190101ALI20190711BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20190711BHJP

   A61K 31/7068 20060101ALI20190711BHJP

   A61K 31/436 20060101ALI20190711BHJP

   A61K 31/255 20060101ALI20190711BHJP

   A61K 31/407 20060101ALI20190711BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20190711BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190711BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190711BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20190711BHJP

   C08G 65/28 20060101ALI20190711BHJP

【ＦＩ】

   C08G65/325

   A61K47/50

   A61K31/337

   A61K31/704

   A61K31/475

   A61K33/24

   A61K31/519

   A61K31/7068

   A61K31/436

   A61K31/255

   A61K31/407

   A61P13/10

   A61P35/00

   A61P43/00 121

   A61K47/10

   C08G65/28

【請求項の数】36

【外国語出願】

【全頁数】92

(21)【出願番号】特願2016-75237(P2016-75237)

(22)【出願日】2016年4月4日

(62)【分割の表示】特願2012-555264(P2012-555264)の分割

【原出願日】2011年3月1日

(65)【公開番号】特開2016-196636(P2016-196636A)

(43)【公開日】2016年11月24日

【審査請求日】2016年4月28日

(31)【優先権主張番号】61/309,304

(32)【優先日】2010年3月1日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】503384225

【氏名又は名称】ザ ユニヴァーシティ オヴ ブリティッシュ コロンビア

(73)【特許権者】

【識別番号】511197040

【氏名又は名称】センター フォー ドラッグ リサーチ アンド デベロップメント

【氏名又は名称原語表記】Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100117743

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 美由紀

(74)【代理人】

【識別番号】100163658

【弁理士】

【氏名又は名称】小池 順造

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(72)【発明者】

【氏名】バート、ヘレン

(72)【発明者】

【氏名】ブルックス、ドナルド

(72)【発明者】

【氏名】キズハッケダス、ジャヤチャンドラン

(72)【発明者】

【氏名】リギンズ、リチャード

(72)【発明者】

【氏名】グアン、デヒ

(72)【発明者】

【氏名】イェー、ルー

(72)【発明者】

【氏名】ムガベ、クレメント

(72)【発明者】

【氏名】ソ、アラン

(72)【発明者】

【氏名】グリーヴ、マーティン

(72)【発明者】

【氏名】ジャクソン、ジョン、ケイ．

(72)【発明者】

【氏名】カインサン、ラジェシ クマール

【審査官】 三原 健治

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５２１３４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５１１７４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５０３５１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００８／０２９２５７９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 MUGABE,Clement.et al.，In vivo Evaluation of Mucoadhesive Nanoparticulate Docetaxel for Intravesical Treatment of Non-Muscle-Invasive Bladder Cancer，Clinical Cancer Research，２０１１年 ２月２８日，Vol.17，pages 2788-2798，Supplementary materialを含む

【文献】 BJU INTERNATIONAL，２００８年，103，976-986

【文献】 Synthesis and evaluation of functional hyperbranched polyether polyols as prospected gene carriers，International Journal of Pharmaceutics，２００８年，356，Pages 314-324

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｇ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

超分岐ポリグリセロールであって：
Ｃ_８アルキル鎖、Ｃ_１０アルキル鎖、又はその組合せで誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含むコア；及び
コアのヒドロキシル基に結合した少なくとも１の親水性置換基を含むシェルであって、少なくとも１の親水性置換基が−ＮＨ_２または−ＮＨ_３^＋を含む少なくとも１の官能基を含み、かつ少なくとも１の親水性置換基がメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ）を含む、シェル
を含み、超分岐ポリグリセロールが、−ＮＨ_２または−ＮＨ_３^＋を、超分岐ポリグリセロール１モル当たり１モル〜１００モル含む、超分岐ポリグリセロール。

【請求項2】

ＭｅＰＥＧが、コアのヒドロキシル基の１％〜４０％に結合している、請求項１に記載の超分岐ポリグリセロール。

【請求項3】

コアが、Ｃ_８及びＣ_１０アルキル鎖の組合せで誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含む、請求項１または２に記載の超分岐ポリグリセロール。

【請求項4】

コアが、Ｃ_８アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含む、請求項１または２に記載の超分岐ポリグリセロール。

【請求項5】

コアが、Ｃ_１０アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含む、請求項１または２に記載の超分岐ポリグリセロール。

【請求項6】

生物学的に活性のある薬剤を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の超分岐ポリグリセロール。

【請求項7】

生物学的に活性のある薬剤が疎水性薬物である、請求項６に記載の超分岐ポリグリセロール。

【請求項8】

生物学的に活性のある薬剤がタキサンである、請求項６に記載の超分岐ポリグリセロール。

【請求項9】

生物学的に活性のある薬剤がパクリタキセルである、請求項６に記載の超分岐ポリグリセロール。

【請求項10】

生物学的に活性のある薬剤がドセタキセルである、請求項６に記載の超分岐ポリグリセロール。

【請求項11】

生物学的に活性のある薬剤がシスプラチンである、請求項６に記載の超分岐ポリグリセロール。

【請求項12】

生物学的に活性のある薬剤が、生物学的に活性のある薬剤の組合せである、請求項６に記載の超分岐ポリグリセロール。

【請求項13】

請求項１〜１２のいずれか１項で定義された超分岐ポリグリセロール及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項14】

生物学的に活性のある薬剤を生物の組織へ送達するための薬剤を調製するための、請求項６〜１２のいずれか１項で定義された超分岐ポリグリセロールの使用。

【請求項15】

生物学的に活性のある薬剤を生物の組織へ送達するための薬剤を調製するための、請求項１〜５のいずれか１項で定義された超分岐ポリグリセロール、及び生物学的に活性のある薬剤の使用。

【請求項16】

生物学的に活性のある薬剤が疎水性薬物である、請求項１５に記載の使用。

【請求項17】

生物学的に活性のある薬剤がタキサンである、請求項１５に記載の使用。

【請求項18】

生物学的に活性のある薬剤がパクリタキセルである、請求項１５に記載の使用。

【請求項19】

生物学的に活性のある薬剤がドセタキセルである、請求項１５に記載の使用。

【請求項20】

生物学的に活性のある薬剤がシスプラチンである、請求項１５に記載の使用。

【請求項21】

生物学的に活性のある薬剤が、生物学的に活性のある薬剤の組合せである、請求項１５に記載の使用。

【請求項22】

生物の組織が細胞である、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の使用。

【請求項23】

生物の組織が膀胱の尿路上皮表面である、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の使用。

【請求項24】

被験体における癌を治療するための薬剤を調製するための、請求項６〜１２いずれか１項で定義された超分岐ポリグリセロールの使用。

【請求項25】

被験体における癌を治療するための薬剤を調製するための、請求項１〜５のいずれか１項で定義された超分岐ポリグリセロール及び生物学的に活性のある薬剤の使用。

【請求項26】

生物学的に活性のある薬剤が疎水性薬物である、請求項２５に記載の使用。

【請求項27】

生物学的に活性のある薬剤がタキサンである、請求項２５に記載の使用。

【請求項28】

生物学的に活性のある薬剤がパクリタキセルである、請求項２５に記載の使用。

【請求項29】

生物学的に活性のある薬剤がドセタキセルである、請求項２５に記載の使用。

【請求項30】

生物学的に活性のある薬剤がシスプラチンである、請求項２５に記載の使用。

【請求項31】

生物学的に活性のある薬剤が、生物学的に活性のある薬剤の組合せである、請求項２５に記載の使用。

【請求項32】

癌を治療するための薬剤を調製するための、請求項１３で定義された医薬組成物の使用。

【請求項33】

癌が膀胱癌である、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の使用。

【請求項34】

癌が筋層非浸潤性膀胱癌である、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の使用。

【請求項35】

超分岐ポリグリセロールが膀胱内投与のためのものである、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項36】

被験体がヒトである、請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１０年３月１に出願され、本明細書中に参照により全体が組み込まれる、「生体接着性誘導体化超分岐ポリグリセロール類」と題する米国特許仮出願番号第６１／３０９，３０４号の利益を主張する。

【0002】

技術分野
本発明は、治療学、その使用及び薬物又は他の生物学的に活性のある部分の、生物の組織への送達方法に関する。具体的には、本発明は誘導体化超分岐ポリグリセロール類（ｄＨＰＧ類）ベースのポリマー類並びに癌、感染症及び炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療方法に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
膀胱癌は、二番目に頻度が高い泌尿生殖器悪性腫瘍である。初期診断では、おおよそ７０％の症例が筋層非浸潤性である。現在のところ、表在性疾患のための治療選択肢としては、化学療法剤をカテーテルで膀胱に膀胱内注入することによる、膀胱癌の局所治療が挙げられる。しかし、当該治療選択肢の効果は限られている。膀胱内での化学療法及び／又は免疫療法にもかかわらず、筋層非浸潤性膀胱癌の患者の最大８０％が再発腫瘍を発症し、そのうち２０％〜３０％がより悪性の、致死性となり得る腫瘍に発達する（Ｄａｌｂａｇｎｉ，Ｇ．（２００７）Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｕｒｏｌ．４：２５４−２６０）。

【0004】

治療の失敗は、膀胱癌細胞に対して活性のある薬剤が、膀胱中での滞留時間が短いことに一部起因すると考えられる。例えば、タキサン類は、膀胱における現在の製剤のバイオアベイラビリティが乏しいことから、一般的には膀胱内注入に用いられない。パクリタキセルは、マイトマイシンＣ等の水溶性薬物よりも２０倍速く膀胱組織に浸透し、注入溶液の除去後でさえ、治療用量の滞留を長引かせるので、膀胱癌の全身療法において抗腫瘍活性が確認されている。しかし、市販製剤（タキソール（商標））中にＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標）−ＥＬが存在することにより、その膀胱への使用が妨げられる。当該薬剤を水性環境内に封入し、膀胱壁へのパクリタキセルの浸透を減少させるからである（Ｍｕｇａｂｅ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ Ｉｎｔ．１０２（７）：９７８−９８６）。

【0005】

多くの活性薬剤が疎水性であるか、そうでなければ水不溶性であるが、癌（腸、肺、膀胱及び泌尿生殖器系の癌等）、感染症（消化管及び気道のもの等）及び炎症性疾患又は自己免疫疾患（膀胱刺激症状、炎症性大腸炎、並びに慢性及び急性の炎症等）を含む無数の適応疾患を効果的に治療するため、多くの場合、水ベースの環境さもなくば水性環境においてそれらが必要とされる。そのため、複数のシステムが、当該薬剤のための送達用ビヒクルとして開発された。当該システムの１つとしては、ポリマー性ミセルの使用が挙げられる。

【0006】

ポリマー性ミセルは両親媒性であり、疎水性コア及び親水性のシェルを有し、そのため疎水性相互作用によって、コア中に疎水性分子を封入することができる。親水性のシェルは、当該システムを水中で可溶性に保つ。しかし、当該システムは、希釈効果又は環境要因のために膀胱中では不安定であり得る。

【0007】

超分岐ポリグリセロール類（「ＨＰＧ類」）は、制御された態様で、所定の分子量かつ限定的な多分散性を伴って合成し得る少数の超分岐ポリマー類のうちの１つである（Ｋａｉｎｔｈａｎ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ９：８８６−８９５）。疎水性分子は、ＨＰＧの疎水性コア中に封入され得る（ＷＯ２００６／１３０９７８）。

【発明の概要】

【0008】

要旨
本発明は、本明細書中に記載の誘導体化超分岐ポリグリセロール類（「ｄＨＰＧ類」）が、癌（例えば、膀胱癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉頭癌、口腔癌、副鼻腔癌、膣癌又は子宮頸癌）、感染（例えば、消化管又は気道の感染）及び炎症性疾患又は自己免疫疾患（例えば、膀胱刺激症状、炎症性大腸炎、或いは慢性又は急性の炎症）並びに、薬剤又は他の生物学的に活性のある部分を組織又は細胞に送達することが望まれる他の適応疾患等の適応疾患を治療するために、薬剤又は他の生物学的に活性のある部分を尿路（例えば、尿道及び膀胱）、消化管（例えば、口、食道及び結腸）、気道（例えば、鼻及び肺）、膣腔及び頸部並びに腹膜腔に送達するための薬剤として用いられ得るという発見に一部基づく。例えば、本明細書中で特定されたポリマー類は、筋層非浸潤性膀胱癌の注入療法において有用であり得る。本明細書中で特定されたポリマー類は、筋層非浸潤性膀胱癌の注入療法において有用であり得る粘膜付着特性を示し得る。

【0009】

本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、薬物又は他の生物学的に活性のある部分のための担体として、及び当該薬物又は部分を標的組織又は標的細胞へ送達するための治療用薬剤の調製用に用いられ得る。特に、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、筋層非浸潤性膀胱癌治療用の、タキサンの担体として用いられ得る。

【0010】

本明細書中に記載の凝集コアｄＨＰＧ類は、薬物を標的組織に送達するのに、特に望ましい、驚くべき特性を有する。特に、本明細書中に示す通り、凝集コアｄＨＰＧ類は毒性が非常に少なく、寛容特性が非常に大きい。

【0011】

１つの実施形態によれば、超分岐ポリグリセロールであって、当該超分岐ポリグリセロールが：Ｃ_１−Ｃ_２０アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含むコアであって、グリセロール単位に対するＣ_１−Ｃ_２０アルキル鎖の比が、コアの周縁部と比較して、コアの中心部でより大きいコア；及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも１の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約２００モルの、少なくとも１の親水性置換基を含む超分岐ポリグリセロールが提供される。

【0012】

他の実施形態によれば、生物学的に活性のある部分の、生物の組織への送達方法であって、当該方法は：生物学的に活性のある部分をロードした超分岐ポリグリセロールを生物の組織に投与することを含み、当該超分岐ポリグリセロールは：Ｃ_１−Ｃ_２０アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含むコアであって、グリセロール単位に対するＣ_１−Ｃ_２０アルキル鎖の比が、コアの周縁部と比較して、コアの中心部でより大きいコア；及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも１の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約２００モルの、少なくとも１の親水性置換基を含む、方法が提供される。当該方法は、生物学的に活性のある部分を超分岐ポリグリセロールに組み込むことを更に含み得る。

【0013】

更なる実施形態によれば、生物学的に活性のある部分を生物の組織へ送達するための、超分岐ポリグリセロールの使用であって、当該超分岐ポリグリセロールは：Ｃ_１−Ｃ_２０アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含むコアであって、グリセロール
単位に対するＣ_１−Ｃ_２０アルキル鎖の比が、コアの周縁部と比較して、コアの中心部でより大きいコア；及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも１の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約２００モルの、少なくとも１の官能基を含む、使用が提供される。

【0014】

他の実施形態によれば、生物学的に活性のある部分を生物の組織へ送達するための薬剤を調製するための、超分岐ポリグリセロールの使用であって、当該超分岐ポリグリセロールは：Ｃ_１−Ｃ_２０アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含むコアであって、グリセロール単位に対するＣ_１−Ｃ_２０アルキル鎖の比が、コアの周縁部と比較して、コアの中心部でより大きいコア；及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも１の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約２００モルの、少なくとも１の官能基を含む、使用が提供される。

【0015】

更なる実施形態によれば、超分岐ポリグリセロール及び生物学的に活性のある部分を含む医薬組成物であって、当該超分岐ポリグリセロールは：Ｃ_１−Ｃ_２０アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含むコアであって、グリセロール単位に対するＣ_１−Ｃ_２０アルキル鎖の比が、コアの周縁部と比較して、コアの中心部でより大きいコア；及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも１の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約２００モルの、少なくとも１の官能基を含む、医薬組成物が提供される。

【0016】

１つの実施形態によれば、超分岐ポリグリセロールであって：Ｃ_１−Ｃ_２０アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含むコア；及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも１の親水性置換基を含むシェルであって、少なくとも１の親水性置換基が以下：−ＮＨ_２、＝ＮＨ_２^＋、−ＮＨ_３^＋及び−ＮＲ_３^＋（式中、各Ｒは、Ｒ_３が窒素と第４級アミンを形成するよう、独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル基であるか、又は１つのＲが独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル基で、且つ２つのＲが一緒になってＣ_３−Ｃ_１２環状アルキル基を形成する）の１以上から選択される少なくとも１の官能基を含むシェルを含み、超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約２００モルの、少なくとも１の官能基を含む、超分岐ポリグリセロールが提供される。

【0017】

更なる実施形態によれば、組織における薬物取り込みを増加させるための前処理又は共処理としての使用のための、超分岐ポリグリセロールの使用であって、当該超分岐ポリグリセロールが：超分岐ポリグリセロールを含むコア；及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも１の親水性置換基を含むシェルであって、少なくとも１の親水性置換基が以下：−ＮＨ_２、＝ＮＨ_２^＋、−ＮＨ_３^＋及び−ＮＲ_３^＋（式中、各Ｒは、Ｒ_３が窒素と第４級アミンを形成するよう、独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル基であるか、又は１つのＲが独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル基で、且つ２つのＲが一緒になってＣ_３−Ｃ_１２環状アルキル基を形成する）の１以上から選択される少なくとも１の官能基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約２００モルの、少なくとも１の官能基を含む、使用が提供される。１つの実施形態においては、コアは、Ｃ_１−Ｃ_２０アルキル鎖で更に誘導体化され得る。

【0018】

他の実施形態によれば、組織における薬物取り込みを増加させるための前処理又は共処理として使用するための超分岐ポリグリセロールであって、超分岐ポリグリセロールを含むコア；及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも１の親水性置換基を含むシェルであって、少なくとも１の親水性置換基が以下：−ＮＨ_２、＝ＮＨ_２^＋、−ＮＨ_３^＋及び−ＮＲ_３^＋（式中、各Ｒは、Ｒ_３が窒素と第４級アミンを形成するよう、独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル基であるか、又は１つのＲが独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル基で、且つ２つ
のＲが一緒になってＣ_３−Ｃ_１２環状アルキル基を形成する）の１以上から選択される少なくとも１の官能基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約２００モルの、少なくとも１の官能基を含む、超分岐ポリグリセロールが提供される。コアはＣ_１−Ｃ_２０アルキル鎖で更に誘導体化され得る。１つの実施形態においては、組織における薬物取り込みの増加は、組織のアンブレラ細胞喪失を惹起し得る。１つの実施形態においては、組織における薬物取り込みの増加は、組織の壊死及び／又は炎症の惹起を伴わない。

【0019】

他の実施形態によれば、超分岐ポリグリセロールであって、当該超分岐ポリグリセロールは：グリセロールエポキシド及びＣ_１−Ｃ_２０アルキルエポキシド又はＣ_１−Ｃ_２０アルキルグリシジルエーテルから重合された超分岐ポリグリセロールを含むコアであって、すべての、又は実質的にすべてのＣ_１−Ｃ_２０アルキルエポキシド又はＣ_１−Ｃ_２０アルキルグリシジルエーテルが、すべての、又は実質的にすべてのグリセロールエポキシドが重合される前に重合されるコア；及びコアのヒドロキシル基に共有結合的に結合した、少なくとも１の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約２００モルの、少なくとも１の官能基を含む、超分岐ポリグリセロールが提供される。更なる実施形態によれば、超分岐ポリグリセロールの合成方法であって、当該方法は：グリセロールエポキシド及びＣ_１−Ｃ_２０アルキルエポキシド又はＣ_１−Ｃ_２０アルキルグリシジルエーテルを、すべての、又は実質的にすべてのＣ_１−Ｃ_２０アルキルエポキシド又はＣ_１−Ｃ_２０アルキルグリシジルエーテルが、すべての、又は実質的にすべてのグリセロールエポキシドが重合されて超分岐ポリグリセロールを形成する前に重合されるように重合すること；及び超分岐ポリグリセロールのヒドロキシル基を、少なくとも１の親水性置換基で誘導体化することを含み、、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約２００モルの、少なくとも１の官能基を含む、方法が提供される。グリセロールエポキシドはグリシドールであり得る。Ｃ_１−Ｃ_２０アルキルエポキシドは１，２−エポキシオクタデカンであり得る。Ｃ_１−Ｃ_２０アルキルグリシジルエーテルはＣ_８−Ｃ_１０アルキルグリシジルエーテルであり得る。

【0020】

他の実施形態によれば、超分岐ポリグリセロールであって、当該超分岐ポリグリセロールは：Ｃ_１−Ｃ_２０アルキル鎖で誘導体化し、ドセタキセルをロードした超分岐ポリグリセロールを含むコア；及びコアのヒドロキシル基に結合した少なくとも１の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約２００モルの、少なくとも１の官能基を含む、超分岐ポリグリセロールが提供される。

【0021】

更なる実施形態によれば、ドセタキセルを生物の組織へ送達するための、超分岐ポリグリセロールの使用であって、当該超分岐ポリグリセロールは：Ｃ_１−Ｃ_２０アルキル鎖で誘導体化し、ドセタキセルをロードした超分岐ポリグリセロールを含むコア；及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも１の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約２００モルの、少なくとも１の官能基を含む、使用が提供される。

【0022】

超分岐ポリグリセロールは、生物学的に活性のある部分を更に含み得る。超分岐ポリグリセロールは、生物学的に活性のある部分（薬物）の取り込みを増加させるための前処理又は共処理として用いられ得る。生物学的に活性のある部分は、１以上の疎水性薬物であり得る。生物学的に活性のある部分は、バルルビシン、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセルの１以上から選択され得る。生物学的に活性のある部分は、タキサン又はその類似体であり得る。タキサンはパクリタキセル又はその類似体であり得る。タキサンはドセタキセル又はその類似体であり得る。生物学的に活性のある部分は、マイトマイシン
又はその類似体であり得る。マイトマイシンとしては、すべてのマイトマイシン類似体が挙げられ得る。マイトマイシン及びその類似体としては、例えば、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＢ、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＤ、マイトマイシンＦ、マイトマイシンＧ、マイトマイシンＨ、マイトマイシンＫ及びそれらの類似体が挙げられる。生物学的に活性のある部分は、マイトマイシンＣであり得る。生物学的に活性のある部分は、マイトマイシンＦであり得る。生物学的に活性のある部分は、バルルビシンであり得る。生物学的に活性のある部分は、ビンブラスチンであり得る。生物学的に活性のある部分は、シスプラチンであり得る。生物学的に活性のある部分は、メトトレキセートであり得る。生物学的に活性のある部分は、ドキソルビシン又はその類似体であり得る。生物学的に活性のある部分は、エピルビシンであり得る。生物学的に活性のある部分は、ゲムシタビンであり得る。生物学的に活性のある部分は、エベロリムスであり得る。生物学的に活性のある部分は、スラミンであり得る。生物学的に活性のある部分は、部分の組合せであり得る。部分の組合せは、メトトレキセート、ビンブラスチン、及びドキソルビシン（Ｍ−ＶＡＣ）であり得る。部分の組合せは、Ｍ−ＶＡＣ及びシスプラチンであり得る。

【0023】

親水性置換基は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（２００〜４５０ｇ／ｍｌ）、又はメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）（２００〜４５０ｇ／ｍｌ）あるいはそれらの組合せであり得る。少なくとも１の親水性置換基がＭｅＰＥＧ又はＰＥＧであり得る。少なくとも１の親水性置換基がＭｅＰＥＧであり得る。少なくとも１の親水性置換基がＰＥＧであり得る。少なくとも１の親水性置換基が−ＯＨ，−ＣＯＯＨ，−ＮＨＳ，−ＳＨ，−ＮＨ_２，−ＮＨ_３^＋又は−ＮＲ_３＋（式中、各Ｒは、Ｒ_３が窒素と第４級アミンを形成するよう、独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル基であり得るか、又は１つのＲは独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル基であり得、且つ２つのＲが一緒になってＣ_３−Ｃ_１２環状アルキル基を形成し得る）である少なくとも１の官能基を含み得る。

【0024】

少なくとも１の官能基は、−ＮＨ_２，−ＮＨ_３^＋又は−ＮＲ_３＋（式中、各Ｒは、Ｒ_３が窒素と第４級アミンを形成するよう、独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル基であり得るか、又は１つのＲが独立してＣ_１−Ｃ_６アルキル基であり得、且つ２つのＲが一緒になってＣ_３−Ｃ_１２環状アルキル基を形成し得る）であり得る。少なくとも１の官能基は、−ＮＨ_２又は−ＮＨ_３^＋であり得る。少なくとも１の官能基は、アミンであり得る。或いは、少なくとも１の官能基は−ＮＨ_２であり得る。

【0025】

超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約２００モルの、少なくとも１の親水性置換基を含み得る。超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約１００モルの、少なくとも１の親水性置換基を含み得る。超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約４０モルの、少なくとも１の親水性置換基を含み得る。超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約５〜約４０モルの、少なくとも１の親水性置換基を含み得る。超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１０〜約４０モルの、少なくとも１の親水性置換基を含み得る。超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１０〜約３０モルの、少なくとも１の親水性置換基を含み得る。超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約３０〜約４０モルの、少なくとも１の親水性置換基を含み得る。超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約５〜約１５モルの、少なくとも１の親水性置換基を含み得る。少なくとも１の親水性置換基は、約１％〜約４０％のヒドロキシル基に結合し得る。少なくとも１の親水性置換基は、約５％〜約３０％のヒドロキシル基に結合し得る。少なくとも１の親水性置換基は、約２０％のヒドロキシル基に結合し得る。

【0026】

超分岐ポリグリセロール１モル当たりの親水性置換基の量は、超分岐ポリグリセロールの分子量を測定すること及び超分岐ポリグリセロールの量中に存在する親水性置換基の量
を測定することによって決定され得る。当業者は、超分岐ポリグリセロールの分子量は、種々の方法、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィーを用いて測定され得ることを理解するであろう。超分岐ポリグリセロールの分子量は、例えば、多角度レーザー光散乱検出によるゲル浸透クロマトグラフィーを用いて測定され得る。超分岐ポリグリセロールの量中に存在する親水性置換基の量は、例えば、滴定法によって測定され得る。滴定法は、正滴定法であり得る。滴定法は、逆滴定法であり得る。例えば、親水性置換基が、−ＮＨ_２であり得る少なくとも１の官能基を含む場合、ＨＰＧの量中に存在する親水性置換基の量の測定に、ＨＣｌ等の酸に対する正滴定法が用いられ得る。親水性置換基が、−ＮＨ_２であり得る少なくとも１の官能基を含む場合、既知の量のＨＣｌ等の酸を用い、ＮａＯＨ等の塩基に対して滴定する逆滴定法が用いられ得る。超分岐ポリグリセロールの量中に存在する親水性置換基の量は、例えば、比色法によって測定され得る。超分岐ポリグリセロールの量中に存在する親水性置換基の量は、例えば、蛍光法によって測定され得る。親水性置換基が、−ＮＨ_２であり得る少なくとも１の官能基を含む場合、フルオレスカミンアッセイが用いられ得る。超分岐ポリグリセロールの量中に存在する親水性置換基の量は、１以上の方法によって測定され、１以上の方法により測定された親水性置換基の量の平均値が、超分岐ポリグリセロール１モル当たりの親水性置換基のモル数を算出するために用いられ得る。親水性置換基が、−ＮＨ_２であり得る少なくとも１の官能基を含む場合、超分岐ポリグリセロールの量中に存在する親水性置換基の量を決定するためには、フルオレスカミンアッセイが好ましい方法であり得る。

【0027】

超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約２００モルの、少なくとも１の官能基を含み得る。超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約１００モルの、少なくとも１の官能基を含み得る。超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約４０モルの、少なくとも１の官能基を含み得る。超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約５〜約４０モルの、少なくとも１の官能基を含み得る。超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１０〜約４０モルの、少なくとも１の官能基を含み得る。超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１０〜約３０モルの、少なくとも１の官能基を含み得る。超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約３０〜約４０モルの、少なくとも１の官能基を含み得る。超分岐ポリグリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約５〜約１５モルの、少なくとも１の官能基を含み得る。

【0028】

超分岐ポリグリセロール１モル当たりの官能基の量は、超分岐ポリグリセロールの分子量を測定すること及び超分岐ポリグリセロールの量中に存在する官能基の量を測定することによって決定され得る。当業者は、超分岐ポリグリセロールの分子量は、種々の方法、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィーを用いて測定され得ることを理解するであろう。超分岐ポリグリセロールの分子量は、例えば、多角度レーザー光散乱検出によるゲル浸透クロマトグラフィーを用いて測定され得る。超分岐ポリグリセロールの量中に存在する官能基の量は、例えば、滴定法によって測定され得る。滴定法は、正滴定法であり得る。滴定法は、逆滴定法であり得る。例えば、少なくとも１の官能基が−ＮＨ_２であり得る場合、ＨＰＧの量中に存在する−ＮＨ_２の量の測定に、ＨＣｌ等の酸に対する正滴定法が用いられ得る。少なくとも１の官能基が、−ＮＨ_２であり得る場合、既知の量のＨＣｌ等の酸を用い、ＮａＯＨ等の塩基に対して滴定する逆滴定法が用いられ得る。超分岐ポリグリセロールの量中に存在する官能基の量は、例えば、比色法によって測定され得る。超分岐ポリグリセロールの量中に存在する官能基の量は、例えば、蛍光法によって測定され得る。少なくとも１の官能基が−ＮＨ_２であり得る場合、フルオレスカミンアッセイが用いられ得る。超分岐ポリグリセロールの量中に存在する官能基の量は、１以上の方法によって測定され得、１以上の方法により測定された官能基の量の平均値が、超分岐ポリグリセロール１モル当たりの官能基のモル数を算出するために用いられ得る。少なくとも１の官能基が
−ＮＨ_２であり得る場合、超分岐ポリグリセロールの量中に存在する官能基の量を決定するためには、フルオレスカミンアッセイが好ましい方法であり得る。

【0029】

Ｃ_１−Ｃ_２０アルキル鎖は、Ｃ_５−Ｃ_２０アルキル鎖であり得る。Ｃ_１−Ｃ_２０アルキル鎖は、Ｃ_８−Ｃ_１８アルキル鎖であり得る。Ｃ_１−Ｃ_２０アルキル鎖は、Ｃ_８−Ｃ_１０アルキル鎖であり得る。

【0030】

少なくとも１の親水性置換基の１部は、コア中に位置し得る。

【0031】

生物の組織は粘膜であり得る。生物の組織は細胞であり得る。生物の組織は膀胱の尿路上皮表面であり得る。

【0032】

本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、基本的超分岐構造、コア特性及び表面特性を以下の通り特定する、共通の命名法を通して記載され得る。

【0033】

【化1】

【0034】

当該式は超分岐ポリグリセロールから構成されるポリマーであって、直鎖状又は分枝鎖状のいずれか、或いはアリール置換基を含有するＣ_８、Ｃ_１０、Ｃ_１２又はＣ_１８アルキル基等の疎水基から選択される置換基で誘導体化されたコアを含み、コア置換基の量が、モル数で、又はパーセンテージとして表されるｘであるポリマーを指定する。本明細書中に記載の通り、ポリマーはまた、ｎ個の置換基（ＰＥＧ又はＭｅＰＥＧ等か、或いはカルボキシル基（ＣＯＯＨ）、ヒドロキシル基、アミン（ＮＲ_２）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、帯電アミン（ＮＲ_３^＋）、チオール（ＳＨ）等を有する置換基）をシェル上に有する。各シェルの置換基は、ある量ｙ１，ｙ２又はｙｎで存在するとして指定され得、モル数で、又はパーセンテージとして表され得る。ある種の表記法においては、同様の態様で一般的な分類が指定されるが、各々の量を明示的して特定することはしない。更に、シェルの置換基がＰＥＧ又はＭｅＰＥＧである場合、当該ポリマー性成分の鎖長により、例えばＭｅＰＥＧ３５０、ＰＥＧ２００等と更に規定され得る。しかし、一般的な分類のためには、分子量は省略され得る。

【0035】

例えば、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＮＨ_２は各々、コア（ｘ）をＣ_８／１０と指定する。用語「ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ」等は、本明細書中どこでも、用語「ＨＰＧ−Ｃ１０−ＭｅＰＥＧ」と相互に交換可能に用いられ得る。ある種の状況では、コア（ｘ）は特定されず、Ｃ_８／１０と仮定され得る。それでも、Ｃ_１−Ｃ_２０を有する他のアルキルが用いられ得る。更なる実施形態によれば、本明細書中に記載のｄＨＰＧの、標的組織への薬物送達のための使用が提供される。更なる実施形態によれば、本明細書中に記載のｄＨＰＧの、標的組織へ薬物を送達するための薬剤の調製における使用が提供される。更なる実施形態によれば、本明細書中に記載のｄＨＰＧの、組織における薬物取り込みを増加させるための前処理又は共処理としての使用が提供される。更なる実施形態によれば、本明細書中に記載のｄＨＰＧの、筋層非浸潤性膀胱癌の治療のための使用が提供される。更なる実施形態によれば、本明細書中に記載のｄＨＰＧの、筋層非浸潤性膀胱癌の治療のために、組織における薬物取り込みを増加させるための前処理又は共処理としての使用が提供される。更なる実施形態によれば、本明細書中に記載のｄＨＰＧの、筋層非浸潤性膀胱癌治療用薬剤の調製における使用が提供される。筋層非浸潤性膀胱癌の治療は、哺乳動物におけるものであり得る。哺乳動物は、ヒトであり得る。他の実施形態によれば、本明細書中に提示のｄＨＰＧ及び医薬上許容可能な賦形剤を
含む医薬組成物が提供される。更なる実施形態によれば、標的組織への薬物送達のための、本明細書中に記載の１以上のｄＨＰＧ類が提供される。更なる実施形態によれば、本明細書中に記載のｄＨＰＧの調製方法が提供される。

【0036】

本明細書中に記載のポリマー類により、特にＨＰＧ構造内の分岐パターンによって規定されたか、又は、表面置換基の、ＨＰＧへの物理的結合の観点から規定された全てのラセミ混合物及び全ての個々の構造異性体又は変異体を含むことを意味する。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】図１に、ドセタキセル（ＤＴＸ）のＵＰＬＣクロマトグラフのサンプルを示す。

【図2】図２に、ＤＴＸを組み込んだ、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類の安定性を決定するための、ＤＴＸ及びそのエピマー（７−ｅｐｉ−ＤＴＸ）の溶出液のピーク領域を、時間に応じて示す。

【図3】図３Ａに、ＤＴＸを組み込んだＨＰＧ−Ｃ_８／１０中のＤＴＸ及び７−ｅｐｉ−ＤＴＸイオン（＋Ｈ^＋）ｍ／ｚ ８０８．５のシングルイオンレコーディング（ＳＩＲ）を示す。図３Ｂに、ＤＴＸを組み込んだＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２中のＤＴＸ及び７−ｅｐｉ−ＤＴＸイオン（＋Ｈ^＋）ｍ／ｚ ８０８．５のＳＩＲを示す。

【図4】図４に、ＤＴＸを組み込んだＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２についての全イオン電流（ＴＩＣ）を示す。

【図5】図５に、ＤＴＸについて提唱された、公知技術のフラグメント化パターンを示す。

【図6】図６に、ｐＨ７．４及びｐＨ６．０でＤＴＸを組み込んだ、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２についての、ＤＴＸ（及び ７−ｅｐｉ−ＤＴＸ）の溶出液のピーク領域を、時間に応じて示す。

【図7】図７Ａに、通常コア（ＮＣ）製剤及び凝集コア（ＣＣ）製剤に関して、ＫＵ７細胞の増殖をＨＰＧ−Ｃ_８／１０濃度に応じて、パーセントで示す。図７Ｂに、通常コア（ＮＣ）製剤及び凝集コア（ＣＣ）製剤について、ＫＵ７細胞の増殖をＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ濃度に応じて、パーセントで示す。

【図8】図８に、様々なｄＨＰＧ類の生体適合性を決定するためのＫＵ７細胞の増殖を、ポリマー濃度に応じて、パーセントで示す。

【図9】図９に、Ｄ_６−ＤＭＳＯ中のＨＰＧ−Ｃ_８／１０の４００ＭＨｚプロトンスペクトル（頂部）及びＨＳＱＣスペクトルを示す。Ｄ、Ｌ_１３、及びＬ_１４は、それぞれデンドリティックユニット、リニア（１−３）ユニット及びリニア（１−４）ユニットを示す。

【図10】図１０に、（Ａ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５の４００ＭＨｚ ＨＳＱＣプロトンスペクトル（頂部）及びＨＳＱＣスペクトルを、並びに（Ｂ）ＭｅＰＥＧ ３５０エポキシド、Ｏ／ＤＧＥ及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３ポリマーの４００ＭＨｚ ＨＳＱＣスペクトルの重ね合わせを示す。

【図11】図１１に、（Ａ）バッカチンＩＩＩ及びその側鎖エチルエステル（Ｎ−ベンゾイル−３−フェニルイソセリンエチルエステル）を生じる、塩基性触媒によるＰＴＸエステル結合のエタノリシス並びに（Ｂ）未精製ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧを用いて調製された製剤における、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイによるＰＴＸ分解物の同定を説明した代表的クロマトグラムを示す。

【図12】図１２に、ＵＰＬＣ ＵＶ分析によって測定された、ＰＴＸ（保持時間２．１分）の化学的安定性に対する、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３の精製の効果を説明する代表的クロマトグラムを示す。（Ａ）ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で新たに構成された未精製ＨＰＧに製剤化されたＰＴＸのクロマトグラム、（Ｂ）４８時間を経た（Ａ）と同一の製剤のクロマトグラム及び（Ｃ）ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で新たに構成された精製ＨＰＧに製剤化されたＰＴＸのクロマトグラム。

【図13】図１３に、３７℃の人口尿中における、ＰＴＸ及びＤＴＸのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧからの放出を示す。（Ａ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ（６ｍｏｌ及び１３ｍｏｌ）からのＤＴＸ放出（累積）。（Ｂ）人口尿（ｐＨ４．６及び６．５）中における、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧからのＰＴＸ放出（累積）。

【図14】図１４に、１時間の曝露後にＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３−ＴＭＲＣＡナノ粒子を完全に取り込んだことを示すＫＵ７細胞の共焦点蛍光イメージングを示す。（Ａ）核を青色（画像中は白色で示す）で可視化することを可能にするＤＡＰＩ染色を伴う未処理ＫＵ７細胞。（Ｂ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３−ＴＭＲＣＡナノ粒子と１時間インキュべーションしたＫＵ７細胞。

【図15】図１５に、ＫＵ７−ｌｕｃ細胞株並びに低悪性度（ＲＴ４、ＭＧＨＵ３）及び高悪性度（ＵＭＵＣ３）の両方のヒト尿路上皮腫瘍細胞株に対する、市販製剤タキソール（登録商標）及びタキソテレ（登録商標）並びにＰＴＸ及び／又はＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧナノ粒子の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性効果を示す。

【図16】図１６に、同所性膀胱癌異種移植片に対する膀胱内タキサン製剤の治療効果を示す。ビヒクルコントロール（ＰＢＳ及び空のＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ）、タキソール（登録商標）（１ｍｇ／ｍｌ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ）、タキソテレ（登録商標）（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧにロードしたパクリタキセル（ＰＴＸ、１ｍｇ／ｍｌ）及びドセタキセル（ＤＴＸ、０．５ｍｇ／ｍｌ）。

【図17】図１７に、１８日目及び３３日目の、無作為化した日に撮影した種々の処理群由来のマウスの、一連の代表的な生物発光画像を示す。右は、ＰＢＳコントロール、タキソテレ（登録商標）及びＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧの処理群における、同じマウスの代表的な膀胱横断切片。

【図18】図１８に、終了時に採取した、様々な処理：Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）タキソール（登録商標）（１ｍｇ／ｍｌ）、Ｃ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ／ＰＴＸ（１ｍｇ／ｍｌ）、Ｄ）タキソテレ（登録商標）（０．５ｍｇ／ｍｌ）、Ｅ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ／ＤＴＸ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、Ｆ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ（薬物無し）、を受けたマウス由来の、代表的な膀胱の組織学的切片を示す。

【図19】図１９に、磁場強度９．４Ｔで取得した、（Ａ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧの一次元プロトンスペクトル（頂部トレース）及びＨＳＱＣスペクトル並びに（Ｂ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}の一次元プロトンスペクトル（頂部トレース）及びＨＳＱＣスペクトルを示す。

【図20】図２０に、ムチン粒子法によってアッセイした、ＨＰＧ類の粘膜付着特性を示す。

【図21】図２１に、（Ａ）ローダミン標識ＨＰＧ類の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＫＵ７−ｌｕｃへの結合及び（Ｂ）ＨＰＧ溶液に曝露したＫＵ７−ｌｕｃ細胞の細胞生存率を示す。

【図22】図２２に、ｐＨ６．５の人口尿中、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧナノ粒子及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２ナノ粒子からのＤＴＸ放出（累積）を示す。

【図23】図２３に、（Ａ）腫瘍接種後２、８及び１２日目に撮影した、ＰＢＳコントロールを除く各処理群由来のマウスの生物発光画像及び（Ｂ）同所性膀胱癌異種移植片に対する膀胱内ＤＴＸ製剤（１回）の治療効果を示す。右パネルはＰＢＳ群及びタキソテレ（登録商標）（０．５ｍｇ／ｍｌ）群を除く処理群の詳細な像。

【図24】図２４に、ＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}０．２ｍｇ／ｍｌで１回膀胱内処理した後のマウスの生物発光画像を示す。

【図25】図２５に、ＫＵ７−ｌｕｃ細胞株並びに低悪性度（ＲＴ４、ＭＧＨＵ３）及び高悪性度（ＵＭＵＣ３）の両方のヒト尿路上皮癌細胞株に対する、ＤＴＸ製剤の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性を示す。

【図26】図２６に、同所性膀胱癌異種移植片に対する、膀胱内ＤＴＸ製剤の１回の処理効果を示す。左パネルにマウスの生物発光イメージングを示す。

【図27】図２７に、実験終了時に採取した、０．２ｍｇ／ｍｌＤＴＸの様々な製剤：Ａ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２、Ｂ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ、Ｃ）タキソテレ（登録商標）、を受容したマウス由来の膀胱の、代表的な組織学的切片を示す。処理群Ａ、Ｂ及びＣ内で、番号１〜３は異なる倍率を指定する。

【図28】図２８に、ＤＴＸ又はパクリタキセル（ＰＴＸ）を組み込んだＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧについて、時間に応じた腫瘍の生物発光を、ＤＴＸ及びＰＴＸの市販製剤（タキソテレ（商標）及びタキソール（商標））と比較して示す。

【図29】図２９に、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ中又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２中のＤＴＸ ５０μｇを注入して２時間後の、膀胱中のＤＴＸの保持を示す。

【図30】図３０に、ＰＢＳ；遊離型ローダミン（ＴＭＲＣＡ）；ローダミン標識ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ（ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＴＭＲＣＡ）；ローダミン標識ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２−ＴＭＲＣＡ）で注入した同所性膀胱腫瘍を示す。（Ｂ）膀胱腫瘍内部の蛍光量。（Ｃ）膀胱内腔からの距離に応じて観察された腫瘍組織内のローダミン蛍光。

【図31】図３１に、メタノール−ｄ_４中での、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＣＯＯＨの（Ａ）^１Ｈ ＮＭＲスペクトル及び（Ｂ）^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。

【図32】図３２に、ＨＰＧポリマー類の構造ユニットを示す。デンドリティック（Ｄ）ユニット、ターミナル（Ｔ）ユニット及びリニア（Ｌ_１３）ユニット又はリニア（Ｌ_１４）ユニットの各々は、一次ユニットｐ及び二次ユニットｓとして存在する。未修飾ポリマー類に関しては、Ｒ）はＨＰＧ；修飾ポリマー類に関しては、Ｒ）はＨＰＧ、Ｃ_８／１０、ＭｅＰＥＧ又はＣＯＯＨ。Ｄｐユニットについて、番号付けの体系を表示する。

【図33】図３３に、（Ａ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＯＨ、（Ｂ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＣＯＯＨ（高ＣＯＯＨ）及び（Ｃ）ＨＰＧＣ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５の代表的な多重度編集ＨＳＱＣスペクトルを示す。スペクトル中に代表的なアサインメントを示す。

【図34】図３４に、（Ａ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＯＨ及び（Ｂ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＣＯＯＨのＨＳＱＣスペクトルの、拡張した領域を示す。代表的なアサインメントを示す。

【図35】図３５に、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５（頂部）、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３（中部）及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８（底部）のＦＴ−ＩＲスペクトルを示す。

【図36】図３６に、シスプラチンに結合したＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＣＯＯＨの代表的な構造を示す。

【図37】図３７に、ｐＨ６．０に調整した蒸留水中での、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３（白三角）又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８（黒四角）へのシスプラチンの結合を示す。

【図38】図３８に、薬物濃度１ｍｇ／ｍＬ及びポリマー濃度１０ｍｇ／ｍＬで、遊離型シスプラチン（白菱形）或いは（Ａ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３又は（Ｂ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８に結合したシスプラチンのｉｎ ｖｉｔｒｏでの放出を示す。放出媒体は３７℃の、ｐＨ４．５（黒四角）、６．０（白三角）、７．４（逆三角）の１ｍＭ ＰＢＳ又は人口尿（白四角）であった。

【図39】図３９に、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＯＨ（黒四角）、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５（白三角）、ＨＰＧＣ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３（黒丸）及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８（白菱形）と（Ａ）２時間及び（Ｂ）７２時間インキュベーションした後のＫＵ−７−ｌｕｃ細胞の生存率を示す。

【図40】図４０に、遊離型シスプラチン（黒丸）、シスプラチンをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３（白三角）、及びシスプラチンをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８（黒四角）と（Ａ）２時間及び（Ｂ）７２時間インキュベーションした後のＫＵ−７−ｌｕｃ細胞の生存率を示す。

【図41】図４１に、Ｔｗｅｅｎ ８０中０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＴＸ（黒丸）、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２中０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＴＸ（３７モル アミン／モル ポリマー）（白四角）、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２中０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＴＸ（１０モル アミン／モル ポリマー）（白三角）、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ中０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＴＸ（黒逆三角）に曝露後のブタ膀胱組織中ＤＴＸの、組織レベルでの深さプロファイルを示す。４製剤について、繰り返したランの平均値（ＨＰＧポリマーを用いた浸透（Ｔｗｅｅｎ ８０（例、タキソテレ製剤）と比較）とアミン含量増大とを比較する）。各ラン内で、５〜６のレプリケートをランした。

【図42】図４２に、１時間の前処理を伴って、及び伴わないで、種々ＤＴＸの製剤に曝露した後のブタ膀胱組織中ＤＴＸの、組織レベルでの深さプロファイルを示す。キトサン前処理を伴うＴｗｅｅｎ ８０中０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＴＸ（白丸）、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２前処理を伴うＴｗｅｅｎ ８０中０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＴＸ（白菱形）、前処理無しのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２中０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＴＸ（白三角）、キトサン前処理を伴うＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２中０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＴＸ（白逆三角）及びキトサン前処理を伴うＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ中０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＴＸ。

【図43】図４３に、種々のＤＴＸ製剤について、１時間の前処理あり及び無しの、ＤＴＸのＡＵＣを示す。キトサン前処理を伴うＴｗｅｅｎ ８０中０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＴＸ、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２前処理を伴うＴｗｅｅｎ ８０中０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＴＸ、前処理無しのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２中０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＴＸ、キトサン前処理を伴うＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２中０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＴＸ及びキトサン前処理を伴うＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ中０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＴＸ。直線により、有意な一元配置分散分析の結果（ｐ＝０．０００７）後の事後テューキー分析において、異群間に有意差（ｐ＞０．０５）が無いことを示す。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍを示す。

【図44】図４４に、１時間の前処理を伴う、マイトマイシン製剤への曝露後のブタ膀胱組織におけるマイトマイシンＦの組織レベルでの深さプロファイルを示す。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（１０ｍｏｌアミン／ｍｏｌ ＨＰＧ）前処理（白四角）を伴うマイトマイシンＦ及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（３７ｍｏｌアミン／ｍｏｌ ＨＰＧ）前処理（黒菱形）を伴う（ｍｇ／ｍｌ）マイトマイシンＦ。

【図45】図４５に、ｅｘ ｖｉｖｏでＨＰＧ送達ビヒクル：コントロール（タイロード緩衝液、キトサン及び０ｍｏｌアミン／ｍｏｌポリマーでのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ）、で処理したブタ膀胱のＳＥＭ画像を示す。

【図46】図４６に、ｅｘ ｖｉｖｏでＨＰＧ送達ビヒクル：ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２、１０ｍｏｌアミン／ｍｏｌポリマー及び３７ｍｏｌアミン／ｍｏｌポリマー、０．１％ｗ／ｖ、１％ｗ／ｖ及び１０％ｗ／ｖ溶液、で処理したブタ膀胱のＳＥＭ画像を示す。

【図47】図４７に、ＰＢＳで２時間注入処理したマウス膀胱表面のＳＥＭ画像を示す。２時間の注入時間直後で採取した膀胱の画像を撮影した。

【図48】図４８に、１０％ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ溶液で２時間注入処理したマウス膀胱表面のＳＥＭ画像を示す。Ａ）２時間の注入時間直後、注入後Ｂ）６時間及びＣ）２４時間で採取した膀胱の画像を撮影した。

【図49】図４９に、１０％ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（１０ｍｏｌ／ｍｏｌ）溶液で２時間注入処理したマウス膀胱表面のＳＥＭ画像を示す。Ａ）２時間の注入時間直後、注入後Ｂ）６時間及びＣ）２４時間で採取した膀胱の画像を撮影した。矢印は単細胞性アンブレラ細胞の喪失を示す（上皮下層を露光）。

【図50】図５０に、１％ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（３７ｍｏｌ／ｍｏｌ）溶液で２時間注入処理したマウス膀胱表面のＳＥＭ画像を示す。Ａ）２時間の注入時間直後、注入後Ｂ）６時間及びＣ）２４時間で採取した膀胱の画像を撮影した。

【図51】図５１に、１０％ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（３７ｍｏｌ／ｍｏｌ）溶液で２時間注入処理したマウス膀胱表面のＳＥＭ画像を示す。Ａ）２時間の注入時間直後、注入後Ｂ）６時間及びＣ）２４時間で採取した膀胱の画像を撮影した。

【図52】図５２に、注入カテーテルを除去した時点（２時間、全群についてＮ＝６）及び膀胱採取時（２、６、２４時間、６時間及び２４時間のサンプル時間について、ｎ＝１〜３）にマウスから採取した尿中の細胞の計数を示す。

【図53】図５３に、Ａ）ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ１０％溶液、Ｂ）ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（低）１０％溶液、Ｃ）ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（高）１％溶液、Ｄ）ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（高）１０％溶液、ＣＮ）ＰＢＳ緩衝液（コントロール）を注入後２、６及び２４時間でのマウス血液中の循環ＴＮＦαレベル及びＵ）未処理動物における血液中の循環ＴＮＦαレベルを示す。標準曲線構築に用いた標準液と共に結果を示す。点線は最低標準液（標準濃度０．６ｐｇ／ｍＬ）のシグナルを表す。

【発明を実施するための形態】

【0038】

本明細書中に記載された新規ポリマー類としては、式Ｉに示されるものが挙げられ、すべてＨＰＧに関連すると考えられる。ＨＰＧの合成は、両親媒性コポリマー類及び両親媒性ブロックコポリマー類の製造、様々な官能基での誘導体化並びに／或いはコポリマー類及びブロックコポリマー類の製造（エステル結合を通したアルキル基の付加及びポリアルキレングリコール基の付加等）を含め、以前に記載されている。ＨＰＧの調製を記載した刊行物としては、米国特許第５，１１２，８７６号；米国特許６，４６９，２１８号；米国特許第６，７６５，０８２号；米国特許第６，８２２，０６８号；国際公開第２０００／７７０７０号；Ｓｕｎｄｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：４２４０−４６，（２０００）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３３：３０９−１４，（２０００）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３３：１３３０−３７，および（２０００）Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ １２：２３５−２３９；Ｋｎｉｓｃｈａｋａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３３：３１５−２０；Ｈａａｇ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３３：８１５８−６６，および（２００２）Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．４：１１２−１９；Ｋａｕｔｚ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．１６３：６７−７３；Ｋａｒｇｅｒ−Ｋｏｃｓｉｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｏｌｙｍｅｒ，４５：１１８５−９５；Ｇａｏ，Ｃ．＆ Ｙａｎ，Ｄ．（２００４）Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２９：１８３−２７５；及びＴｚｉｖｅｌｅｋａ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：１６１−１６９）が挙げられる。Ｓｕｎｄｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３８：３５５２−５５には、両親媒性修飾されたＨＰＧの調製及び様々な置換基及び官能基による誘導体化を含め、当該ポリマー類の誘導体化の記載が含まれている。

【0039】

本明細書中に記載のｄＨＰＧ類としては、Ｃ_１−Ｃ_３０アルキル鎖又は他の類似したアルキル鎖が挙げられ得る。しかし、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類としては、Ｃ_１−Ｃ_２０アルキル鎖又は他の類似したアルキル鎖も挙げられ得る。用語「アルキル」は、当業者に通常理解されているように用いられ、他に定義されない限り、多くの場合、１〜２０個の炭素原子を有する１価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。炭化水素は直鎖又は分枝鎖のいずれかであり得、環状脂肪族置換基又はアリ−ル置換基を含有し得る。アルキル鎖は、１以上のＣ_１−Ｃ_２０アルキル鎖から選択され得る。或いは、アルキル鎖は１以上のＣ_２−Ｃ_１９又はＣ_３−Ｃ_１８又はＣ_４−Ｃ_１７アルキル鎖から選択され得る。或いは、アルキル鎖は１以上のＣ_５−Ｃ_１６又はＣ_６−Ｃ_１５又はＣ_７−Ｃ_１４アルキル鎖から選
択され得る。或いは、アルキル鎖は１以上のＣ_８−Ｃ_１３又はＣ_９−Ｃ_１２又はＣ_１０−Ｃ_１５アルキル鎖から選択され得る。或いは、アルキル鎖は１以上のＣ_５−Ｃ_１５又はＣ_５−Ｃ_１０又はＣ_５−Ｃ_２０アルキル鎖から選択され得る。コア用に選択されるアルキル鎖又はアルキル鎖（複数）は、意図されるｄＨＰＧの使用に左右され得る。例えば、パクリタキセルのロードにとっては、Ｃ_１８アルキルはＣ_８／１０アルキルほどよく功を奏さなかった。

【0040】

本明細書中に記載のＨＰＧ類としては、誘導体化されたＨＰＧ類（「ｄＨＰＧ類」）が粘膜付着性、より一般的には、生物付着性であるように、官能基を有する置換基で誘導体化されたＨＰＧ類が挙げられ得る。本用語の最も一般的な意味においては、ｄＨＰＧ類は生物の組織と結合を形成するか、又は相互作用し、当該組織は細胞又は細胞外マトリクスであり得る。結合又は相互作用は、任意のタイプのものであり得、ファンデルワールス相互作用、水素結合、静電的相互作用、イオン結合又は共有結合が挙げられる。

【0041】

用語「粘膜付着」又は「粘膜付着性」は、当業者に通常理解されているように用いられ、多くの場合、ポリマー物質と、細胞表面、細胞表面の粘膜又は粘膜を覆う粘膜−ゲル層が挙げられ得る、生物の組織との間に生じる付着現象を指す。膀胱の尿路上皮表面にはムチンが存在するので、粘膜付着性官能基を含有するｄＨＰＧ類は、膀胱表面及び他の粘膜へ向けた薬物送達に用いられ得る。

【0042】

一般的に、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は「コア」を有し、当該コアは（ａｎｄ）開始剤（例えば、トリメチロイルプロパン（ＴＭＰ））及び超分岐ポリグリセロールを含む。１つの実施形態においては、超分岐ポリグリセロールのコアはＣ_１−Ｃ_２０アルキル鎖で誘導体化され得る。１つの実施形態においては、「コア」は「シェル」中に内包され得、当該シェルは、コアのヒドロキシル基に結合した少なくとも１の親水性置換基を含み、且つ当該超分岐グリセロールは、超分岐ポリグリセロール１モル当たり約１〜約２００モルの、少なくとも１の親水性置換基を含む。

【0043】

本明細書中で用いる場合、「開始剤」は、アルキル成分及び、１以上であるが、好ましくは２以上のヒドロキシル基を含む小分子として定義される。しかし、開始剤は３以上又は４以上のヒドロキシル基を有し得る。開始剤の例はトリメチロイルプロパン（ＴＭＰ）である。

【0044】

本明細書中で用いる場合、「凝集コア」は、グリセロール単位に対するＣ_１−Ｃ_２０アルキル鎖の比率が、コアの周縁部と比較して、コアの中心部で高いコアとして定義される。例えば、Ｃ_１０アルキル鎖は、超分岐構造全体の至る所で、グリセロールに対して一様に分布せず、むしろシェル置換基にじかに隣接するその周縁部付近よりも、超分岐コア構造の中心部（例えば、開始剤隣接部）で濃縮されるように分布するように、当該構造に組み込まれ得る。コア構造が「凝集される」程度は、試薬の添加により制御され得る。用語「中心部」は、体積点が０である正確な中心部であるとして定義され得る。或いは、ｄＨＰＧは半径「ｒ」を有し得、グリセロールに対するアルキルの比率が、半径「ｒｃ」を有する中心部体積（ｒｃ＜ｒである）中で、当該ｄＨＰＧ全体中の全般的な、グリセロールに対するアルキルの比率よりも高い。

【0045】

「標準（ｒｅｇｕｌａｒ）」コア又は「通常（ｎｏｒｍａｌ）」コアに関しては、グリセロールエポキシド（超分岐成分のモノマー）及びアルキルエポキシド（コアに疎水特性を与える）が、反応の間中一定の比率で加えられ得る。凝集コアに関しては、反応の最初期段階で加えられるアルキルエポキシドの割合が高く、反応のより後の段階では低い割合（ゼロと同じ位低い割合）に低減される。当該低減は、継続してなされてもよく、又は別の段階でなされてもよい（最低で２つの段階がある）。

【0046】

コアの構造は成分の付加速度の観点から定義することができる。例えば、凝集コアのポリマーは、複数の段階で合成することができ、各段階が所定の比率のコアモノマー（１つがグリセロールエポキシドで、他が疎水性のアルキルエポキシドである）類を有する。凝集コア分子は、より前の段階において加えられるアルキルエポキシドの比率を、より後か、又は最後の段階にわたって加えられる当該成分の比率と比較してより高くすることにより、作製することができる。或いは、比率は、反応の最初（又はより前）の時間に、加えるグリセロールエポキシドに対する、アルキルエポキシドの比率を、より後の時間にわたって加えるよりも高くするように、タイムコースにわたって改変することができる。当該アプローチにおいては、反応の間中、グラジエントとして、絶えず比率を変化させることができる。

【0047】

ポリマーの残りのヒドロキシル基は、ＭｅＰＥＧ又はＰＥＧ等の他の親水性置換基で「誘導体化」されて、ヒドロキシル、カルボキシル、アミン（第１級アミン、第２級アミン及び第３級アミンを含む）、ＮＨＳ、エーテル、チオール、ハロ、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミド、スクシンイミド及び同様の他の官能基を有する置換基を含む、親水性のシェルを形成し得る。シェルの形成の間に、シェルの置換基の一部を、ポリマーの中心方向に位置するヒドロキシル基と反応させることが可能であり得る。たとえ当該反応が起こっても、コアは、その疎水的特徴を維持する。

【0048】

本明細書中で用いる場合、用語「両親媒性」又は「両親媒性ポリマー」は、当業者に通常理解されているように用いられ、多くの場合、１つの分子中に疎水性部分及び親水性部分の両方が存在していることを指す。疎水性は任意の物質又はその部分が極性溶媒中よりも非極性溶媒中で可溶であることを指す。疎水性は、長鎖の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素基及び１以上の芳香族基、環状脂肪族基又は複素環基で置換された当該基が挙げられるが、これらに限定されない無極性基を分子中に含有することによって付与され得る。親水性は任意の物質又はその部分が非極性溶媒中よりも極性溶媒中で可溶であることを指す。親水特性は、炭化水素、リン酸、カルボキシル、硫酸、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシル及び同様の他の基等の、極性基又は帯電基の存在に由来する。親水性部分はＭｅＰＥＧ、アミン、カルボン酸又はＮＨＳを含み得る。

【0049】

用語「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」は、当業者に通常理解されているように用いられ、多くの場合、ポリマー鎖中のエチレンオキシド単位数に依存して、分子量が約２００〜約２０，０００であるような化合物等を指す。好ましい分子量は約２００〜約４００、約２００〜約１０００及び約２００〜約２０００であるが、分子量約２０００〜約８０００のものも用いられ得る。

【0050】

用語「メトキシポリ（エチレンオキシド）」又は「ＭｅＰＥＧ」は、当業者に通常理解されているように用いられ、多くの場合、ポリマー鎖中のエチレンオキシド単位数に依存して、分子量が約３５０〜約１０，０００であるような化合物等を指す。好ましい分子量は約３５０〜約５５０、約３５０〜約７５０及び約３５０〜約２０００であるが、分子量約２０００〜約５０００のものも用いられ得る。

【0051】

句「局所送達又は標的送達」は、当業者に通常理解されているように用いられ、多くの場合、生物内の標的部位に、化合物を直接送達することを指す。

【0052】

いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、尿路（例えば、尿道及び膀胱）、消化管（例えば、口、食道及び結腸）、気道（例えば、鼻及び肺）、膣腔及び頸部並びに腹膜腔の適応症の局所治療又は標的治療に用いられ得、癌（例えば、膀胱癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉頭癌、口腔癌、副鼻腔癌、膣癌又は子宮頸癌）、感染（例え
ば、消化管又は気道の感染）及び炎症性疾患又は自己免疫疾患（例えば、膀胱刺激症状、炎症性大腸炎、或いは慢性又は急性の炎症）並びに、薬剤又は他の生物学的に活性のある部分を組織又は細胞に送達することが望まれる他の適応疾患等の適応疾患を治療する。例えば、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、筋層非浸潤性の膀胱癌の局所治療又は標的治療に用いられ得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のポリマー類は、本明細書中に列挙される１以上の適応疾患（例えば、筋層非浸潤性の膀胱癌）の局所治療又は標的治療のための薬剤又は組成物の調製に用いられ得る。本発明のいくつかの態様により、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類及び医薬上許容される賦形剤又は担体を含む組成物が使用される。本明細書中に列挙される１以上の適応疾患（例えば、筋層非浸潤性の膀胱癌）の治療方法も提供される。当該方法は、本明細書中に記載のｄＨＰＧ又は本明細書中に記載のｄＨＰＧの組成物、或いは有効量の本明細書中に記載のｄＨＰＧ又は本明細書中に記載のｄＨＰＧの組成物（ｄＨＰＧには生物学的に活性のある剤が組み込まれる）を、それらを必要とする被験体に投与することを含み得る。

【0053】

いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載されたｄＨＰＧ類は、組織における薬物の取り込みを増加させるための前処理又は共処理として用いられ得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、尿路（例えば、尿道及び膀胱）、消化管（例えば、口、食道及び結腸）、気道（例えば、鼻及び肺）、膣腔及び頸部並びに腹膜腔の適応症の局所治療又は標的治療に用いられ得、癌（例えば、膀胱癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉頭癌、口腔癌、副鼻腔癌、膣癌又は子宮頸癌）、感染（例えば、消化管又は気道の感染）及び炎症性疾患又は自己免疫疾患（例えば、膀胱刺激症状、炎症性大腸炎、或いは慢性又は急性の炎症）並びに、薬剤又は他の生物学的に活性のある部分を組織又は細胞に送達することが望まれる他の適応疾患等の適応疾患の局所治療又は標的治療のための薬物の取り込みを増加させるための前処理又は共処理として用いられ得る。例えば、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、筋層非浸潤性の膀胱癌の局所治療又は標的治療のための薬物の取り込みを増加させるための前処理又は共処理として用いられ得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、組織における薬物取り込みを増加させるための前処理として用いられ得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、組織における薬物取り込みを増加させるための共処理として用いられ得る。１つの実施形態においては、共処理としてのｄＨＰＧ類の使用としては、薬物又は生物学的に活性のある部分による処理の間、薬物又は生物学的に活性のある部分が、ｄＨＰＧにロードされない場合が挙げられ得る。１つの実施形態においては、共処理としてのｄＨＰＧ類の使用としては、薬物又は生物学的に活性のある部分による処理の間、薬物又は生物学的に活性のある部分の一部又は全部が、ｄＨＰＧにロードされる場合が挙げられ得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、組織における薬物取り込みを増加させるための前処理及び共処理として用いられ得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、前処理又は共処理無しの組織における薬物取り込みに比較して、組織において薬物取り込みを増加させるための前処理又は共処理として用いられ得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、組織の壊死及び／又は炎症を惹起することなく、組織において薬物取り込みを増加させるための前処理及び共処理として用いられ得る。いくつかの実施形態においては、組織における薬物取り込みを増加させることには、アンブレラ細胞喪失を惹起することが含まれ得る。いくつかの実施形態においては、組織における薬物取り込みを増加させることには、組織の壊死及び／又は炎症を惹起することなく、アンブレラ細胞喪失を惹起することを含み得る。いくつかの実施形態においては、アンブレラ細胞は、膀胱の尿路上皮表面のアンブレラ細胞であり得る。表現「薬物取り込みの増加」は、当業者に通常理解されているように用いられ、多くの場合、細胞内又は組織内において、薬物の濃度又は蓄積を増加させることを指す。

【0054】

いくつかの実施形態においては、薬物取り込みの増加は、ｄＨＰＧ類を前処理又は共処
理として用い、薬物取り込みのＣａｖｇの増加を、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのＣａｖｇと比較する観点から、測定し得る。当業者は、Ｃａｖｇは組織の深度の、種々の範囲又は種々のポイントで測定し得ると理解するであろう。例えば、Ｃａｖｇは０＞３３５０、０＞１５００、２００＞３３５０又は２００＞１５００μｍの範囲の組織深度について測定し得る。１つの実施形態においては、ｄＨＰＧ類を前処理又は共処理として用いる、薬物取り込みのＣａｖｇは、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのＣａｖｇと比較して、１．３〜４．０、１．８〜２．８、１．３〜２．４、２．０〜２．６、１．５、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８又は４．０倍だけ増加し得る。いくつかの実施形態においては、薬物取り込みの増加は、ｄＨＰＧ類を前処理又は共処理として用い、薬物取り込みのＣｍａｘの増加を、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのＣｍａｘと比較する観点から、測定し得る。１つの実施形態においては、ｄＨＰＧ類を前処理又は共処理として用いる、薬物取り込みのＣｍａｘは、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのＣｍａｘと比較して、１．３〜４．０、１．８〜２．８、１．３〜２．４、２．０〜２．６、１．５、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８又は４．０倍だけ増加し得る。いくつかの実施形態においては、薬物取り込みの増加は、ｄＨＰＧ類を前処理又は共処理として用い、薬物取り込みのＡＵＣ（ｘ−ｙ）の増加を、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのＡＵＣ（ｘ−ｙ）と比較する観点から、測定し得る。当業者は、ＡＵＣ（ｘ−ｙ）は組織の深度の、種々の範囲又は種々のポイントで測定し得ると理解するであろう。例えば、ＡＵＣ（ｘ−ｙ）は０＞無限、０＞３３５０、０＞１５００、２００＞無限、２００＞３３５０又は２００＞１５００μｍの範囲の組織深度について測定し得る。１つの実施形態においては、ｄＨＰＧ類を前処理又は共処理として用いる、薬物取り込みのＡＵＣ（ｘ−ｙ）は、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのＡＵＣ（ｘ−ｙ）と比較して、１．３〜４．０、１．８〜２．８、１．３〜２．４、２．０〜２．６、１．５、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８又は４．０倍だけ増加し得る。当業者は、薬物取り込み増加の測定に関しては、例えば、Ｇｒａｂｎａｒ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２５６（２００３）１６７−１７３）中で報告された通り、前処理又は共処理の存在下又は非存在下で、透過性の比として算出される透過性亢進比率Ｒが、代替法に用いられ得ると理解するであろう。

【0055】

いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は溶媒付加型であり得る。ｄＨＰＧ類は、典型的には重量パーセント又は体積パーセントで表された非化学量論的な量の溶媒、水及び／又は緩衝液と結合し得る。溶媒は、例えば、エタノール、ＤＭＳＯ、プロピレングリコール、グリセロール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、トランスクトール又はソルトールを含む、医薬的に許容可能な溶媒又は他の生体適合性を有する溶媒であり得るが、これらに限定されない。

【0056】

当該実施形態では、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、本明細書中に説明又は記載されたものを含む、ありえる全ての立体化学的な代替物を含む。

【0057】

いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、種々の分岐パターンを有する幾何異性体等の異性体を含む。本明細書中に開示した方法により合成されたｄＨＰＧ類は、ランダムに分岐したＨＰＧ類であり、完全に反応した（例、３方向に連結した）グリセロールモノマー類又は部分的に反応した、他のモノマーに１又は２方向で連結したグリセロールモノマー類を含有する。各分岐構造の存在は、分析的技術（例えば、２Ｄ ＮＭＲ ＨＳＱＣ実験）により、確認され得る。

【0058】

本明細書中に記載した、いくつかの実施形態による組成物又はｄＨＰＧ類は、任意の、様々な公知の経路で投与し得る。ｄＨＰＧ類は、膀胱内投与用溶液として、又は洗い流し
液（経口洗い流し液、腹膜内洗浄液或いは鼻腔又は膣腔の洗浄液を含む）、点眼液、嚥下される経口液、エアロゾル、又はスプレーとして吸入するための溶液、又は粘膜表面等の、生物の組織の近接部に挿入される半固体として機能するよう作り出された、他の組成物中において投与され得る。

【0059】

本明細書中に記載の、薬物又は他の生物学的に活性のある薬剤を組み込んだｄＨＰＧ類の送達を、薬物送達が望まれる標的組織又は標的細胞に限定することには、恩恵があり得ると理解される。例えば、本明細書中に記載の、生物学的に活性のある薬剤を組み込んだｄＨＰＧ類の、筋層非浸潤性の膀胱癌に罹患しているか、又は罹患が疑われる被験者中の膀胱尿路上皮表面への選択的送達により、体内の他の組織において深刻な副作用をもたらすことなく、治療効果を提供し得ることが期待される。本明細書中に記載の、タキサンを組み込んだｄＨＰＧの投与に好適であり得る方法の例は、膀胱内注入である。膀胱内注入は、本明細書中に記載のｄＨＰＧの投与の、組織における薬物取り込みの増加のための前処理又は共処理としての使用のために好適であり得る方法の例でもある。膀胱内注入は、膀胱等の嚢に、溶液を挿入する薬物送達手段である。膀胱への送達においては、典型的には、尿道を通して膀胱へ挿入されたカテーテルによって、溶液が投与される。溶液は注入され、典型的には約１又は約２時間等の時間、膀胱中に保持される。典型的な注入量は、約１０〜約５０ｍＬの範囲である。滞留時間後、当該量の溶液及び溶液を希釈して蓄積したあらゆる尿が排出されて手順が終了する。薬物の大部分は排出段階の間に除去されるので、滞留時間は、膀胱内治療の間の、薬物への最長暴露時間を表す。組織への局所送達を促進する組成物又は方法の他の例は、当業者にとっては明らかである。例えば、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、ｄＨＰＧがタキサン又は他の疎水性薬物を、ＨＰＧ中へ製剤化することもできる別の薬物とともにｄＨＰＧのコア中に含有する医薬組成物中で用いられ得る（ｍａｙ ｂｅ ｕｓｅｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ）し、又は当該別の薬物は、送達用の溶液中でｄＨＰＧと併用され得る。更に、ｄＨＰＧ類は標的化剤（例えば、上皮細胞増殖因子受容体（膀胱腫瘍において過剰発現する）に対する抗体、ハーセプチン、又はＶＥＧＦ）と併用し得る。

【0060】

好適な医薬組成物が、当該技術分野において公知の手段により調製され得、それらの投与態様及び投与量が、技能を持つ実践者により決定され得る。膀胱内注入については、生物学的に活性のある剤を組み込んだｄＨＰＧは、水、水を含有する共溶媒システム、通常の生理食塩水又は水中５％デキストロース等の等張水溶液又はｐＨをｐＨ約６〜８等の好ましいレベル（或いは他の好的な範囲（例、ｐＨ約４〜６又はｐＨ８超）に制御するために緩衝化されたシステム等の、注入ビヒクル中に溶解され得る。ｐＨは、薬物放出動態、薬物安定性、最大粘膜付着性、最大溶解度又はそれらの組合せ、の最適化に恩恵を供与するよう、特定の範囲で制御され得る。水溶性薬物の送達システムの投与用に用いられる、他の医薬的に許容可能なビヒクルも検討され得る。当業者に公知の、多くの技術がＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｂｙ Ａｌｆｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏ，２０^ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ
Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２０００）中に記載されている。

【0061】

本明細書中で用いる場合、医薬組成物の「有効量」は、治療有効量又は予防有効量を含む。「治療有効量」は、必要な投与量及び時間で、癌細胞増殖の低下、寿命の増加又は平均余命の増加等の、望まれる治療結果を達成するのに有効な量を指す。生物学的に活性のある薬剤を組み込んだｄＨＰＧの治療有効量は、被験者の疾患状態、年齢、性別及び体重並びに生物学的に活性のある薬剤が、被験者において望まれる反応を引き出す能力等の要因によって異なり得る。投薬計画は、最適な治療反応を提供するために調整され得る。治療有効量は、治療の恩恵的効果が、製剤の任意の有毒な又は有害な影響を上回るものでもある。「予防有効量は」、必要な投与量及び時間で、適応疾患の予防又は適応疾患の進行の予防等の、望まれる予防結果を達成するのに有効な量を指す。典型的には、予防投与量
は、被験者において疾患に先立つか、又は疾患の初期段階で用いられる。

【0062】

投与量値は、緩和されるべき疾患の重篤度によって変わり得ることに留意すべきである。任意の個々の被験者については、個々のニーズ及び組成物を投与する人又は投与を監督する人の専門的な判断により、経時的に、特定の投薬計画が調整され得る。組成物の量は、被験者の疾患状態、年齢、性別及び体重等の要因により変わり得る。投薬計画は最適な治療反応を提供するように調整され得る。例えば、１回のボーラス投与であり得るか、経時的に数回に分けて投与され得るか、又は示された危急の治療状況に応じて、投与量を減少又は増大し得る。投与の容易さ及び投与量の均一性のために、組成物を単位投与形態に製剤化することが好都合であり得る。

【0063】

いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、例えば、他の治療方法と組合せて用いられ得るが、これに限定されない。例えば、生物学的に活性のある部分を組み込んだ、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、当業者に公知の他の治療法と組合せて、ネオアジュバント療法（他の治療前）、補助療法（他の治療時）及び／又はアジュバント療法（他の治療後）として用いられ得る。

【0064】

一般的には、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、毒性を低減するために用いられ得る。本明細書中に記載のｄＨＰＧ類の毒性は、標準的な技法、例えば、細胞培養液又は実験動物を試験し、治療の指標（例、ＬＤ５０（集団の５０％の致死量）とＬＤ１００（集団の１００％の致死量）との比）を決定することにより、決定され得る。しかし、深刻な疾患状況等のある種の状況下では、組成物をかなりの過剰量投与することが必要であり得る。本発明のある種のｄＨＰＧ類は、ある濃度では有毒であり得る。有毒な濃度及び無毒な濃度を決定するために、滴定実験が用いられ得る。毒性は、個々のｄＨＰＧ類（ｄＨＰＧ’ｓ）又は組成物の特異性を細胞株ごとに検証することにより、評価され得る。ポリマーにより他の組織に何らかの影響がある場合、指標を提供するために動物実験も用いられ得る。

【0065】

本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、被験者に投与され得る。本明細書中で用いる場合、「被験者」は、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ等であり得る。被験者は、癌又は粘膜表面を有する組織と関連する他の疾患への罹患が疑われていてもよいし、又はそのリスクがあってもよい。当該適応疾患は尿路（例えば、尿道及び膀胱）、消化管（例えば、口、食道及び結腸）、気道（例えば、鼻及び肺）、膣腔及び頸部並びに腹膜腔の適応疾患であり得る。癌（例えば、膀胱癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉頭癌、口腔癌、副鼻腔癌、膣癌又は子宮頸癌）、感染（例えば、消化管又は気道の感染）或いは炎症性疾患又は自己免疫疾患（例えば、膀胱刺激症状、炎症性大腸炎、或いは慢性又は急性の炎症）並びに他の適応疾患が、薬剤又は他の生物学的に活性のある部分の送達のための、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類の望まれる標的であり得る。癌、感染症及び炎症性疾患又は自己免疫疾患のための診断方法が、当業者に公知である。

【0066】

例えば、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は筋層非浸潤性の膀胱癌の治療に用いられ得る。本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は筋層非浸潤性膀胱癌治療用の薬剤の調製に用いられ得る。本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は筋層非浸潤性の膀胱癌を治療する方法において用いられ得る。当該方法は、本明細書中に記載の、生物学的に活性のある部分（例えば、タキサン）を組み込んだｄＨＰＧの有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含み得る。例えば、本明細書中に記載のｄＨＰＧ類は、筋層非浸潤性膀胱癌治療用薬物の取り込みを増加させるための前処理又は共処理として用いられ得る。

【0067】

本明細書中に記載のｄＨＰＧ類の調製方法又は合成方法は、公知の化学合成の法則との関係を有する当業者に理解されるであろう。例えば、ＷＯ２００６／１３０９７８には、
本明細書中に記載のポリマー類の調製のために検討され、好適に適合され得る、好適な合成手順が記載されている。

【0068】

ｄＨＰＧを化学的に調製するための一般的方法論は、以下の、限定的でない例示的スキーム中に記載されている：

【0069】

【化2】

【0070】

段階２、モノマー類の添加は、２２時間〜２４時間にわたるモノマー類添加の速度によって更に規定される。凝集コアのポリマー類については、アルキルエポキシドの添加速度は反応時間の初期段階で速く、グリセロールエポキシド添加速度は、初期段階でより遅いことがあり得る。しかし、成分比が、後期段階に比べて反応の初期段階でアルキル成分を添加することが好都合である限り、添加速度の調整は必要無い。

【0071】

様々な代替の実施形態及び実施例を本明細書に記載する。当該実施形態及び実施例は例示的であり、本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。

【実施例】

【0072】

実施例１：誘導体化ＨＰＧ類の合成及び特性解析
化学物質はすべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，Ｃａｎａｄａ）から購入し、更なる精製はせずに用いた。溶媒はすべてＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）からのＨＰＬＣグレードのものであり、更なる精製はせずに用いた。

【0073】

重合は、攪拌機を備えた三つ口丸底フラスコ中で行った。第２口をデュアルマニホールドのシュレンクラインに接続し、第３口をゴム隔壁で閉じてそこから試薬を加えた。ＨＰ
Ｇ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ用の典型的な重合化反応手順は以下の通りである。開始剤のトリメチロイルプロパン（ＴＭＰ）をアルゴン雰囲気下フラスコに加え、カリウムメチラートのメタノール溶液（２０ｗｔ％）を続けて加えた。マグネティックスターバーを用いて１５分間混合物を攪拌し、その後真空中で過剰なメタノールを除去した。フラスコは油浴中で９５℃に保ち、シリンジポンプを用いて１２時間にわたりグリシドールを滴下して加えた。モノマーの添加完了後、混合物を更に５時間攪拌した。次いでオクチル／デシルグリシジルエーテルを加え、混合物を２４時間攪拌してＨＰＧ−Ｃ_８／１０を形成した。当該混合物に、１２時間にわたってＭｅＰＥＧ３５０を滴下して加え、次いで更に５時間攪拌した。ＭｅＰＥＧのメチル基が、モノマーの一端を当該モノマーが２価にならないように（ｄＨＰＧ分子間を架橋することになる）保護するので、ＭｅＰＥＧはＰＥＧよりも好ましい。合成後に除去し得るものも含め、他の保護基も検討される。このように、ＨＰＧは、ペプチド、グリコペプチド及びタンパク質等を含む、他の化学基又は生体分子を加えることにより更に修飾され得る表面上でＰＥＧ鎖と共に調製し得る。当該手順は、種々のＨＰＧの合成に変更し得、例えば、グリシドール添加後に１，２−エポキシデカンを混合物に加えてＨＰＧ−Ｃ_１８を形成し得る。

【0074】

次いで、生成物をメタノール中に溶解し、それを陽イオン交換カラム（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標） ＩＲＣ−１５０）に３回通すことにより中和する。未反応のオクチル／デシルグリシジルエーテルはヘキサンによる抽出によって除去する。メタノールを除去し、酢酸セルロース透析管（ＭＷＣＯ：１０００ｇ／ｍｏｌ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて、１日あたり３回の水交換によりポリマーを３日間、水に対して透析する。次いで、凍結乾燥及び加熱乾燥により、乾燥ポリマーを取得する。

【0075】

当該手順は、アルキル鎖がポリマーの至る所に不規則に位置する標準コアのｄＨＰＧではなく、アルキル鎖がポリマーの中心の方へ集中する凝集コアのｄＨＰＧ類を合成するために変更し得る。ポリマーのコアは、グリセロールエポキシド及びアルキルモノマーを種々の速度及び／又は種々の割合で反応混合物に加えることにより、修飾される。凝集コアｄＨＰＧを形成するためには、超分岐構造の外側部分がアルキル成分を全く含有しないように、アルキルモノマー類はすべてグリセロールエポキシド添加の前に加える。アルキル成分は、代わりにＨＰＧのコアの方に配置する。

【0076】

まずＨＰＧ−Ｃ_８／１０を上記の通り調製することにより、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＣＯＯＨを形成する。カルボン酸官能基のＨＰＧ−Ｃ_８／１０への付加のための反応をスキームＩＩに示す：

【0077】

【化3】

【0078】

ＨＰＧ−Ｃ_８／１０（０．５ｇ）にピリジン（５０ｍＬ）を加え、急速に攪拌してポリマーを溶解した。ジメチルアミノピリジン（０．２ｇ，０．００１６モル）を加え、続けて無水コハク酸（１２ｇ，０．１２モル）をゆっくりと加えた。室温（約２２℃）で一晩、反応物を攪拌した。水（１００ｍＬ）を加え、混合物を３０分間攪拌した。共沸蒸留によってピリジンの蒸発をよりよくすることを可能にするために周期的に水を加え、回転蒸発によって溶媒を除去した。残渣をメタノール中に溶解し、Ｓｐｅｃｔｒａ／ＰｏｒＤｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＭＷＣＯ：３５００ｇ／ｍｏｌ）を用いて、蒸留水に対して１６時間透析した。透析媒体を４度交換し、各度にメタノール濃度を高めた。透析媒体の最終組成は蒸留水中、７０％メタノールであった。回転蒸発により溶媒を除去し、真空オーブンで一晩、ポリマーを乾燥した。

【0079】

ＨＰＧ−Ｃ_８／１０へのスクシンイミジルカーボネート添加のために試行した初期反応スキームをスキームＩＩＩに示す。簡単に述べると、真空の下１１０℃でＨＰＧ−Ｃ_８／１０を乾燥し、次いで室温で冷却した。アセトニトリル及びＤＣＭを加えてポリマーを溶解した。次いでフラスコにＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）を加えた。フラスコを真空にし、次いでアルゴンでパージし、ピリジンを加えた後、室温で一晩、反応を進行させた。反応後、回転蒸発によりほとんどのアセトニトリルを除去した。メチル ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を加えポリマーを沈殿させた。上清を移し、ＤＣＭを加えてポリマーを溶解した。１０〜１５mｍのブフナー漏斗を通して物質を濾
過し、透明な溶液を得、それを回転蒸発してＤＣＭを除去した。ＭＴＢＥを加えてポリマーを沈殿させた。真空の下、室温で最終生成物ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＮＨＳを乾燥した。

【0080】

【化4】

【0081】

第１の試行により、−２０℃で保存した場合でも不安定で、マトリクスを架橋してしまうほど反応性に富むＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＮＨＳが生成されたことが示された後、第二の合成経路を試行した。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＮＨＳの生成のために試行した第二の反応のスキームを、スキームＩＶに示す。合成には、中間体として上記したＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＣＯＯＨを生成すること、それに次ぐ、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＣＯＯＨ−ＮＨＳを生成するためにＮＨＳと更に反応させることが含まれる。

【0082】

【化5】

【0083】

ＨＰＧ−Ｃ_８／１０及び無水コハク酸をピリジン中に溶解し、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を触媒として室温で２４時間反応させた。等量の水を加えて反応を終結させ、溶液を回転蒸発することによりピリジンを除去した。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＣＯＯＨ水溶液を７２時間透析（ＭＷＣＯ：３５００ｇ／ｍｏｌ）し、残存溶媒を除去して凍結乾燥した。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＣＯＯＨを、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を触媒として、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉａｍｉｄｅ；ＮＨＳ）と２４時間、室温で更に反応させた。反応終了時に、回転蒸発によりＤＭＦを除去した。生成物を上記の通り単離した。ＭＴＢＥで沈殿させ、アセトニトリル中で濾過し、回転蒸発して、乾燥に先立ちＭＴＢＥで沈殿させた。

【0084】

スキームＶ中に要約される以下の手順を用いて、様々なアミン密度を有するＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２のバッチを生成した。各バッチに関しては、表１中に記載する、様々な化学量論の試薬を用いた。

【0085】

【化6】

【0086】

ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ（４ｇ）を１５ｍｌの無水１，４−ジオキサン中に溶解した。水素化カリウム（０．４５ｇ）をヘキサンで３回リンスし、真空の下乾燥した。ポリマー溶液をＫＨと混合し、透明溶液を形成するまで室温で攪拌し、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ上のおおよそ２０％のＯＨ基を脱プロトン化した。一晩攪拌（Ｎａ_２ＳＯ_４又はＭｇＳＯ_４）しながらジクロロメタン中に溶解することにより、Ｎ−（２，３−エポキシプロピル）フタルイミド）（ＥＰＰ）（１．１８４ｇ）を乾燥した。溶液を濾過し、真空の下乾燥してジクロロメタンを除去した。乾燥したＥＰＰを無水１，４−ジオキサン中に溶解し、約８５〜９０℃で一晩攪拌しながらポリマーに加えた。陽イオン交換樹脂カラム（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＣ−１５０）に３回通すことにより生成物を中和し、次いでエーテルから３回沈殿させて未反応のＥＰＰを除去した。ＮＭＲによれば、１５．５％のフタルイミド基がＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧに結合した。ヒドラジン分解（ヒドラジン一水和物による還流）により、フタルイミド官能基の開裂を達成した。ポリマーのメタノール溶液に過剰のヒドラジン一水和物溶液（２ｍＬ）を加え、混合物を４８時間還流した。還流後、メタノールを蒸発させ、ＭＷＣＯ：１００００ｇ／ｍｏｌ膜を用いて、ポリマーを水に対して４８時間透析し、凍結乾燥した。

【0087】

【表1】

【0088】

取得したポリマー類を、ＮＭＲ、ＦＴＩＲ、ＤＳＣ及びＴＧＡにより特性解析した。ＮＭＲは、分岐構造及びポリマーのシェルに付加された表面基の存在の確認に特に有用である。ある種の表面化学に関しては、ＦＴＩＲ解析は、ヒドロキシル基の消費及びヒドロキシル基と他の基との置換であって、当該基の化学がＨＰＧ構造の残りとは異なるＩＲスペクトルを与える置換（例えば、Ｃ＝Ｏ結合の付加）の確認にも有用である。例えば、ＦＴＩＲは、表面への−ＣＯＯＨ基の付加又はエステル結合を通した基の付加の確認に用いられ得る。

【0089】

実施例２：ｄＨＰＧ類へのパクリタキセル又はドセタキセルの封入
パクリタキセル又はドセタキセルは、ｄＨＰＧと共に少量のアセトニトリル中に溶解し得、オーブン中６０℃で１時間乾燥し得る。次いで窒素気流でフラッシュして微量の有機溶媒を除去し得る。結果生じるｄＨＰＧ／パクリタキセル又はｄＨＰＧ／ドセタキセルの
マトリクスは１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で水和し、２分間ボルテックスしてオーブン中６０℃で１時間インキュベーションし得る。結果生じる溶液は、一般的には透明である。白色沈殿が観察される場合、溶液を遠心（１８０００ｇ、１０分間）し、上清を新たな容器に移し、使用するまで冷所に保持し得る。

【0090】

実施例３：ｄＨＰＧ類中でのドセタキセル及びパクリタキセルの安定性
ｄＨＰＧ類に組み込まれたドセタキセル（「ＤＴＸ」）の安定性を、ＤＴＸの不活性な分解産物への分解、及び生物活性を有するそのエピマー（「７−ｅｐｉ−ＤＴＸ」）への相互変換の観点から、特性解析する。パクリタキセル及びドセタキセルのエピマー形成は、平衡として起こることが知られるが、不活性な分解産物への分解は不可逆的である。安定性は、様々なｄＨＰＧ類において記載された通り、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）を用いて解析した。主要な分解ピークを分離するために、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ_１８カラム（２．１ｘ５０ｍｍ，１．７μｍ）を用いた。注入体積は３μＬであった。移動相は、０．３８５ｇの塩を秤量し、それを５００ｍＬのＨＰＬＣグレードの水に溶解することにより調製した１０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液であった。ｐＨは酢酸を用いてｐＨ４．０に調整した。ＤＴＸのストック溶液（２ｍｇ／ｍＬ）はメタノール中に調製し、−２０℃の冷凍庫中に保存した。ＤＴＸを含有する標準液一式は、０．５〜１００μｇ／ｍＬの範囲にわたり、５０／５０のメタノール／水中に調製した。検出限界（ＬＯＤ）及び定量限界（ＬＯＱ）は両方とも１μｇ／ｍＬであった。１〜１００μｇ／ｍＬからの較正曲線は、ＤＴＸに関しては、Ｒ^２が０．９９９８の直線であった。１／ｘの重み付けを適用した。方法の精度（ａｃｃｕｒａｃｙ）及び精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）は、ＬＯＱ（１μｇ／ｍＬ）及び中間域（１０μｇ／ｍＬ）で確認した。各ケースにおいて、注入を５回反復した。表２に、当該濃度のＤＴＸについて得られた精度（ａｃｃｕｒａｃｙ）及び精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）を集約する。

【0091】

【表2】

【0092】

ＤＴＸの強制分解を行って、方法の特異性評価のためのサンプルを生成した。３００μＬのメタノール、１５０μＬの５％水酸化アンモニウム及び５０μＬ（５０°μＬ）の、アルカリのｐＨで数分内にＤＴＸに分解するＤＴＸプロドラッグのストックを含有する溶液を調製することにより、ＤＴＸの分解を達成した。ＤＴＸプロドラッグのＤＴＸへの変換及びＤＴＸの分解は２時間超えでモニターした。トレー上２．２時間（室温）の後、プロドラッグはすべて有効にＤＴＸ及び他の成分へと分解した。上記方法を用いて分解サンプルを分析し、ＤＴＸプロドラッグの分解、ＤＴＸ及び関連する分解物を確認した。

【0093】

上記のＵＰＬＣの方法を用いると、ＤＴＸは２．９９分の溶離液であり、７−ｅｐｉ−ＤＴＸは３．１５分の溶離液である。クロマトグラフのサンプルを図１中に示す。１．４分と２．０分との間のピークは、ＤＴＸ及び７−ｅｐｉ−ＤＴＸの分解産物である。ＤＴＸ及び７−ｅｐｉ−ＤＴＸのピーク領域は時間の関数として算出し、次いでｄＨＰＧ中に残存するＤＴＸ又は７−ｅｐｉ−ＤＴＸのパーセンテージを決定するために用いた。結果を図２中に示す。図２から理解できるように、ＤＴＸを含む当該製剤は、ＨＰＧポリマーがＨＰＧ−Ｃ_８／１０及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧの場合に安定であり、それら
はｐＨ７．３に緩衝化したＰＢＳ中、７２時間にわたり、組み込んだＤＴＸの９０％超をＤＴＸ及び７−ｅｐｉ−ＤＴＸとして保持した。残りの量の薬物は不活性成分に分解しており、サンプル全体の２％を超えて寄与したものは各々、質量分析ＭＲＭの実験によって同定した。当該実験は、公知のＤＴＸ分解産物に関連したイオンフラグメントを同定するために行った。

【0094】

ＨＰＧ−Ｃ_８／１０製剤及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２製剤中のＤＴＸイオン及び７−ｅｐｉ−ＤＴＸイオン（＋Ｈ^＋）ｍ／ｚ ８０８．５のシングルイオンレコーディング（ＳＩＲ）を、図３Ａ及び図３Ｂにおいて比較する。両方のクロマトグラムにより、７−ｅｐｉ分解物の存在が示されるが、それはＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２のサンプル中により多くの割合で存在する。図３Ａ及び図３Ｂに関しては、最大ピークがＤＴＸであり、より低いピークが７−ｅｐｉ−ＤＴＸである。全イオンクロマトグラムにより、製剤中のポリマー構成成分に起因する、総体的な非常に高いシグナル（図４）が示されるが、ＤＴＸ分解物フラグメントに一致することが知られる付加質量（Ｋｕｍａｒ ｅｔ
ａｌ ２００７ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ｄｒｕｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ １２ Ｍａｒｃｈ ２００７ ４３（４）：１２２８−１２３５）が、最大の分解物ピーク（図５）に符合して同定された。ＤＴＸ側鎖からのフラグメントに対応し得る２２６及び２８２のｍ／ｚが１．５分に観察された。しかし、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ＋Ｋ^＋に対応する５８３のｍ／ｚが存在した。このことにより、タキサンがコア及び側鎖の両方を含有することが示される。３２０及び５６２のＭ／ｚも観察された。２分のピークは、それぞれ１０−オキソ−１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ＋Ｋ^＋及び１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ＋Ｋ^＋に対応し得る、ｍ／ｚ＝５８１及び５８３を有した。当該ピーク位置は、クロマトグラムのバッカチン分解物が観察されると期待される領域内でもある。

【0095】

いくつかの製剤の安定性は、製剤のｐＨを調製することにより、更に増加し得る。例えば、５．５〜６．５のｐＨを得るための割合で緩衝塩を有する水性媒体中に溶解した、ＤＴＸを組み込んだＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２を含む組成物は、緩衝塩を除いた同一の組成物又は緩衝塩組成を改変した組成物（例、７．４のｐＨをもたらすＰＢＳ緩衝液）よりも安定である（図６）。適切な緩衝塩としては、リン酸緩衝塩が挙げられる。或いは、組成物のｐＨは、組成物にＨＣｌ等の酸を加えることにより、低下させ得る。その上、組成物のｐＨを改変することにより、ＤＴＸの分解は有意に減速する。

【0096】

実施例４：ｄＨＰＧ類のＩｎ ｖｉｔｒｏでの生体適合性
種々のｄＨＰＧ製剤がＫＵ７癌細胞を殺傷できるか否かを決定することにより、ｄＨＰＧ類の毒性を測定した。当該実験は、薬剤又は生物学的に活性のある部分を何ら組み込んでいないｄＨＰＧ類を用いて行った。結果を図７Ａ及び７Ｂ中に示す。標準コア製剤及び凝集コア製剤の両方について、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０濃度に応じたＫＵ７細胞の増殖（パーセント）を図７Ａに示す。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０の安定性は、コア構造の変化によっては有意に影響されなかった。標準コア製剤及び凝集コア製剤の両方について、ＫＵ７細胞の生存率をＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ濃度に応じて図７Ｂに示す。凝集コアを有するポリマー類は、標準コアのポリマーに比べて、細胞生存率について１０倍高いＩＣ５０を示す。凝集コアを有するｄＨＰＧ類は、標準コアを有するｄＨＰＧ類よりも、より細胞に寛容される。両方の製剤とも、１モルのＨＰＧ当たり６．５モルのＭｅＰＥＧを含有した。凝集コアの製剤は、標準コアの製剤よりも、ＫＵ−７細胞に対する細胞毒性が低かった。図７Ａ及び図７Ｂ中に示す製剤を調製するために使用したモノマー類の体積比率を表３に示す。

【0097】

【表3】

【0098】

ＭｅＰＥＧ外部シェルが無いＨＰＧ−Ｃ_８／１０ポリマー類が中でも最も寛容されず、ＭｅＰＥＧシェルが無ければ、標準コア構造から凝集コア構造へとコアを改変することにより、細胞生存率の向上の観点からは全く恩恵が無いことを図８に示す。ＨＰＧ−ＯＨは、表面にＭｅＰＥＧが無いＨＰＧであることを表す。しかし、ＭｅＰＥＧを加えると、恩恵が顕著となる。Ｔｈｅ ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５の記号（ＨＰＧ当たり６．５ｍｏｌ ＭｅＰＥＧを有する）で、通常コア型で比較した場合、寛容性はＨＰＧ−Ｃ_８／１０に似ていることが示されるが、凝集コア構造を用いると、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５の寛容性は、シェル内に２倍量のＭｅＰＥＧを有する標準コアＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ１３のレベルに改善する。以前に開示されたＨＰＧ−ＭｅＰＥＧポリマー類（Ｍｕｇａｂｅ Ｃ．ｅｔ ａｌ．２００８ ＢＪＵＩ １０３：９７８−９８６）も、定量されなかったもののＭＥＰＥＧ量はより多く、＞１５ｍｏｌ％と推定され、十分に寛容されていた。

【0099】

実施例５：ｄＨＰＧ類が細胞に運びこまれることを示すｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞取り込みアッセイ
フルオレセインで標識されたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＣＯＯＨ−ＮＨＳ及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＣＯＯＨのＫＵ７細胞への取り込みを検証した。ｄＨＰＧを１ｍｇ／ｍＬでＦＢＳ−フリーの培地中に溶解した。１２ウェルの各プレート中、２５０μＬのｄＨＰＧをカバーガラス上で細胞に曝露した。ＰＢＳでプレートを２回洗浄し、続けてＰＢＳ中３．７％ホルムアルデヒドで１０分固定した。再びＰＢＳでプレートを２回洗浄した。Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ（商標）を用いてＤＡＰＩとともにカバーガラスをマウントした。

【0100】

実際にポリマーがＫＵ−７細胞に取り込まれて、単に細胞表面上に留まっているのではないことを確認するために、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＣＯＯＨのＺ−スタックも観察した。見渡したすべての角度で蛍光を観察したので、ｄＨＰＧ類が細胞の内側にあることがわかった。当該結果により、ｄＨＰＧ類は細胞に取り込まれ、細胞内で何ら悪影響を引き起こさないことが示される。Ｉｎ ｖｉｔｒｏのデータにより、ＨＰＧ類を細胞に曝露すると
、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＣＯＯＨ−ＮＨＳ及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＣＯＯＨの両方が１時間で取り込まれることが示される。しかし体内では、接触がｉｎ ｖｉｔｒｏでの状況ほど完全ではなく、当該取り込みを促進するためには、曝露を延長することが必要である。

【0101】

実施例６：凝集コアｄＨＧＰ類及び標準コアｄＨＧＰへのタキサンのローディング
凝集コアＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ及び標準コアＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧの最大薬物ローディングを調査した。薬物濃度０．５、１．０、２．０及び３．０ｍｇ／ｍＬを目標にしてＤＴＸ及びＰＴＸをＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧにロードした。ＴＨＦ中１００ｍｇ／ｍＬのポリマー溶液を調製し、ＤＴＸ又はＰＴＸを加えた。Ｎ_２気流の下ＴＨＦを約２時間乾燥し、次いでフードオーブン中で一晩乾燥した。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ／ＰＴＸ及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ／ＤＴＸマトリクスをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で水和した。結果生じる溶液を１４０００ｒｐｍで約１５分間スピンダウンした。上清の液体をＨＰＬＣで試験し、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ中に内包された薬物の濃度を入手した。結果を表４中に示す。

【0102】

【表4】

【0103】

ＰＴＸについてのローディングより、ＤＴＸについてのローディングの方が優れていることがわかった。

【0104】

実施例７：ＨＰＧ−Ｃ_８／１０及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧの合成及び特性解析
報告されたプロトコール（Ｋａｉｎｔｈａｎ，Ｒ．Ｋ．，Ｍｕｇａｂｅ，Ｃ．，Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．，Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．，２００８．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ９，８８６−８９５）に従い、エポキシドの開環重合を基礎とするシングルポットの合成手順でコア修飾ＨＰＧ類のオクチル／デシルグリセリルエーテル（Ｏ／ＤＧＥ，Ｃ_８／１０）重合を実施した。

【0105】

化学物質はすべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）から購入し、溶媒はすべてＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ （Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ）からのＨＰＬＣグレードのものとした。ＭｅＰＥＧ ３５０、水酸化ナトリウム及びエピクロロヒドリンの反応からα−エポキシ，ω−メトキシ ポリエチレングリコール３５０（ＭｅＰ
ＥＧ ３５０エポキシド）を合成した。オクチル／デシルグリシジルエーテル、カリウムメチラート及びトリメチルプロパン（ＴＭＰ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、更なる精製はせずに用いた。

【0106】

１２０ｍｇの開始剤（ＴＭＰ）を１．５ｍｌのカリウムメチラートのメタノール溶液（２５％，ｗ／ｖ）と混合し、アルゴン雰囲気下、三つ口丸底フラスコに加えた。混合物を１０５℃で１時間攪拌し、その後過剰メタノールを真空の下で除去し、次いでシリンジポンプを用い、１３ｍｌのグリシドール及び９ｍｌのＯ／ＤＧＥの混合物を１．４ｍｌ／ｈの速度で開始剤に注入した。デジタルオーバーヘッド攪拌システム（ＢＤＣ２００２）を用い、攪拌速度を６８ｒｐｍに固定した。モノマー添加の完了後、混合物を更に６時間攪拌した。ヘキサンによる抽出で精製ポリマー類を取得し、未反応のオクチル／デシルグリシジルエーテルを除去した。次いで生成物をメタノール中に溶解し、陽イオン交換カラム（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＣ−１５０，Ｒｏｈｍａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）に３回通すことにより中和した。真空の下、メタノールを除去し、次いで酢酸セルロース透析管（ＭＷＣＯ：１０００ｇ／ｍｏｌ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて、１日あたり３回の水交換により、ポリマー水溶液を３日間、水に対して透析した。

【0107】

¹H NMR (400 MHz, D₆-DMSO) δ_H: 0.75−0.82 (−CH₃, TMP); 0.82−0.91 (O/DGE上の−CH₃−アルキル); 1.16−1.53 (−CH₂−, O/DGE上のアルキル); 2.46 (溶媒, D₆-DMSO); 3.16−3.80 (−CH及び−CH₂−, HPGコアから); 4.8 (−OH)。

【0108】

種々の量のＭｅＰＥＧを含有するＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧを調製し、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３と命名して供給口に加えたＭｅＰＥＧ量（１モルのＭｅＰＥＧ当たりそれぞれ６．５ｍｏｌ及び１３ｍｏｌ）を表示した。合成の最終段階において、異なる量のＭｅＰＥＧ ３５０エポキシドを反応混合物に加えたこと以外はＨＰＧ−Ｃ_８／１０の反応と同様に合成を行った。アルキル（Ｒ）で誘導体化したＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧのワンポット合成のための反応スキームをスキームＶＩ中に要約する。

【0109】

【化7】

【0110】

１２０ｍｇの開始剤（ＴＭＰ）を１．５ｍｌのカリウムメチラートのメタノール溶液（２５％，ｗ／ｖ）と混合し、アルゴン雰囲気下、三つ口丸底フラスコに加えた。混合物を１０５℃で１時間攪拌し、その後過剰メタノールを真空の下で除去し、次いでシリンジポンプを用い、１３ｍｌのグリシドール及び９ｍｌのＯ／ＤＧＥの混合物を１．４ｍｌ／ｈの速度で開始剤に注入した。グリシドール及びＯ／ＤＧＥの混合物をすべて注入した後、反応を約６時間継続した。次いで、フラスコに０．１ｍｌの水素化カリウム（ＫＨ）を加えた。混合物を１時間攪拌し、その後、シリンジポンプを１．４ｍｌ／ｈの速度で用い、
「ワンポット」合成の最終段階として１０ｍｌ又は２０ｍｌのＭｅＰＥＧ ３５０エポキシドを加えた。ＨＰＧに対する、目標とする密度に応じてＭｅＰＥＧ ３５０の量（つまり、目標とする６．５ｍｏｌのＭｅＰＥＧについては、１モルのＨＰＧに対し、１０ｍｌのＭｅＰＥＧ３５０）を加えた。次いで、攪拌速度を９０ｒｐｍに増大させ、反応を１０５℃で一晩、継続して行った。ヘキサンで抽出することにより、微量の未反応オクチル／デシルグリシジルエーテルをいずれも除去した。生成物をメタノール中に溶解し、陽イオン交換カラム（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＣ−１５０，Ｒｏｈｍａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）に３回通すことにより中和した。真空の下、メタノールを除去し、次いで酢酸セルロース透析管（ＭＷＣＯ １０，０００ｇ／ｍｏｌ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、１日あたり３回の水交換により、ポリマー水溶液を３日間、水に対して透析し、未反応ＭｅＰＥＧエポキシドを除去した。次いで、凍結乾燥により乾燥ポリマーを取得した。

【0111】

¹H NMR (400 MHz, D₆-DMSO) δ_H: 0.75−0.82 (−CH₃, TMP); 0.82−0.92 (O/DGE上の−CH₃−アルキル); 1.15−1.55 (−CH₂−, O/DGE上のアルキル); 2.50 (溶媒, D₆-DMSO); 3.15−3.80 (−CH及び−CH₂−,HPGコアから); 3.23 (−OCH₃− MePEGから), 3.32 (残存水); 4.8 (−OH)。

【0112】

カリウムメチラートを用い、一部脱プロトン化したトリメチルプロパン（ＴＭＰ）から、グリシドールの陰イオン性開環多分岐重合によってＨＰＧ−Ｃ_８／１０（ＭｅＰＥＧ鎖無しのＨＰＧ）を調製した。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０は無数の末端ヒドロキシル基を有しており、１分子当たりの数はおおよそ重合化度に等しい。Ｃ_８／１０アルキル鎖でＨＰＧ−Ｃ_８／１０コアを誘導体化して疎水性コアを創り出し、薬物、（例えばタキサン）のローディングを可能にした。ＭｅＰＥＧ鎖をＨＰＧ類のヒドロキシル基に連結した。他の成分反応後に、重合化反応物にＭｅＰＥＧ ３５０エポキシドを加えたので、親水性のシェルが形成され、ＨＰＧ類の水溶性が増加する。

【0113】

ＮＭＲ実験を行い、ＨＰＧポリマー類の構造特性を解析した。ＭｅＰＥＧとＨＰＧ類上のアルキル鎖との比は、重水素化溶媒（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，９９．８％Ｄ）を用いて、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計に記録した異核種単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）ＮＭＲ実験から推定した。化学シフトは残存溶媒のピークを基準にした。Ｓｐａｒｋｙ （Ｔ．Ｄ．Ｇｏｄｄａｒｄ ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｋｎｅｌｌｅｒ，Ｓｐａｒｋｙ ３，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）を用いてＨＳＱＣスペクトルを解析した。図９及び図１０にＨＰＧ−Ｃ_８／１０ポリマー類及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧポリマー類の代表的なプロトンスペクトル及び２Ｄ ＨＳＱＣスペクトルを示す。原料スペクトルを開始用参照として用い、ピークをすべてＨＰＧ類の構造成分にアサインメントした（図１０Ｂ）。プロトンＮＭＲスペクトルは報告されたもの（Ｋａｉｎｔｈａｎ，Ｒ．Ｋ．，Ｊａｎｚｅｎ，Ｊ．，Ｋｉｚｈａｋｋｅｄａｔｈｕ，Ｊ．Ｎ．，Ｄｅｖｉｎｅ，Ｄ．Ｖ．，Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．，２００８．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２９，１６９３−１７０４；Ｋａｉｎｔｈａｎ，Ｒ．Ｋ．，Ｍｕｇａｂｅ，Ｃ．，Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．，Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．，２００８．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ９，８８６−８９５）と同様だった。ＨＳＱＣ ＮＭＲのデータにより、スペクトルにおいて分岐構造は明らかであり（図９及び図１０）、超分岐ポリマー類としてのＨＰＧ類の構造が確認された。各置換基の比は、ＨＳＱＣ実験における体積積分から算出した。ＭｅＰＥＧのメトキシ基及びＯ／ＤＧＥのメチル基の積分とＴＭＰのＣＨ_３基の積分とを比較することにより、各ＨＰＧポリマーについてＯ／ＤＧＥ及びＭｅＰＥＧ（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の比を算出した。ＨＳＱＣのデータにより、未反応のエポキシドモノマー類が無いこと（Ｆｉｇ．１０）が示される。このことにより、未反応モノマー類によるポリマーのコンタミネーションが無いことが示される。

【0114】

多角度レーザー光散乱検出によるゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ）によってｄＨＰＧポリマー類の分子量及び多分散性を決定した。分子量は約８０，０００ｇ／ｍｏｌであった（表５）。

【0115】

ｄＨＰＧ類の物理化学的特性を表５中に集約する。

【0116】

【表5】

【0117】

実施例８：ｄＨＰＧ類の熱特性並びにＰＴＸ及びＤＴＸをロードしたｄＨＰＧ類の物理的安定性及び化学的安定性に対する精製過程の影響
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）及び熱重量分析（ＴＧＡ）により、ｄＨＰＧ類の熱特性及び分解特性に対する精製過程の影響を評価した。精製ｄＨＰＧ類とは、例えば、未反応Ｃ_８／１０アルキル鎖を除去するための、ヘキサンによる抽出、続く陽イオン交換カラムを通した中和、次いで透析といった様々な精製段階を経たポリマー類を指す。

【0118】

ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＳＣ Ｑ１００及びＴＧＡ Ｑ５０を用いて熱解析を行った。密封したアルミニウム製パン中、秤量したサンプルを、温度範囲−９０℃〜８５℃にわたる、１０℃／分での「加熱−冷却−加熱」の循環でサイクルにかけることによりＤＳＣのランを取得した。４０ｍｌ／ｍｉｎの気流（窒素）を伴うコンスタント ランピング（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒａｍｐｉｎｇ）温度プログラム（２０．０oＣ／ｍｉｎ
ｔｏ ５００oＣ）でＴＧＡのランを行った。重量パーセンテージ及びＴＧＡチャンバー
の温度をリアルタイムで記録した。ＴＡ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ２０００ソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．２Ｅ，ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてデータの解析を行い、開始点を見出した。ＡＢ１０４−Ｓバランスを備えたＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＬ３９ Ｋａｒｌ Ｆｉｓｈｅｒ電量計を用いた滴定により、ｄ
ＨＰＧ類の水分量を決定した。既知の量のｄＨＰＧ類を無水メタノール中に溶解し、ＨＹＤＲＡＮＡＬ（登録商標）−Ｃｏｕｌｏｍａｔ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）によって滴定した。無水メタノールからのバックグラウンドの読みを差し引いて最終結果を取得した。

【0119】

ＭｅＰＥＧ含有量が０（ＨＰＧ−Ｃ_８／１０）〜４．６ｍｏｌ ＭｅＰＥＧ／ＨＰＧに増加するにつれ、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧは−３８℃〜−５５℃に低下した温度でガラス転移を示した（表５）。精製過程によっては、ｄＨＰＧ類のＴｇ値には全く影響が観察されず、熱安定性には有意な影響が観察されなかった。精製ｄＨＰＧ類及び未精製ｄＨＰＧ類とも最大３００℃の温度まで安定であり、熱分解の徴候はなかった（表６）。

【0120】

ＰＴＸ及びＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧの物理的安定性及び化学的安定性に対する精製過程の影響も評価した。ＰＴＸ及びＤＴＸを、ともに精製ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ又は未精製ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧにロードし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）からの薬物の沈殿開始を観察することによって、物理的安定性を評価した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより化学的安定性を評価し、ＰＴＸ及びＤＴＸの量並びにそれらの分解産物量を決定した。

【0121】

ＰＴＸ及びＤＴＸをロードしたｄＨＰＧ類の物理的安定性及び化学的安定性は精製過程により影響を受けた。達成可能なＰＴＸ及びＤＴＸの最大ロードは未精製ポリマー類の方が多く、当該製剤は精製ｄＨＰＧ類で作製された製剤よりも物理的に安定であることがわかった（表６）。５％（ｗ／ｗ）のタキサンをロードした未精製ポリマーで調製したサンプルは数日間（＞３日）沈殿しなかったが、５％（ｗ／ｗ）タキサンロードの精製ポリマーで調整したものは、ＰＢＳ中での構成に際して数時間以内又は即座に沈殿した（表６）。しかし、未精製ｄＨＰＧ類中では、ＰＴＸ及びＤＴＸは化学的に不安定であり、大部分のタキサンは製剤調製中に分解することが観察された。約７５〜８０％のＰＴＸは、未精製ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧにおけるロードに続いて、それが乾燥（バルク）マトリクスであるか、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で再構成された後であるかに関わらず、即座に分解した（表６）。しかし、ひとたび緩衝液中に入れると、更なるＰＴＸ分解は全く起きないが、乾燥マトリクス中のＰＴＸは２４時間にわたって分解し続けた。図１１Ｂに、ＰＴＸに対応するピーク及びいくつかの分解産物の形成に起因する他のピークを伴う、未精製ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ中のＰＴＸの製剤由来のクロマトグラムを示す。クロマトグラムは、アセトニトリル中に溶解した製剤から、溶媒乾燥直後に取得した（例、バルク状態で、ＰＢＳ中での構成に先立って）。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより、５８７及び８５４のｍ／ｚ値を有する、２つの主要な分解物をそれぞれ同定した。当該質量及び当該ピークの相対保持時間に基づき、それらの正体はそれぞれバッカチンＩＩＩ（ｍ／ｚ ５８７，図１１Ａ）及び７−ｅｐｉ−タキソール（ｍ／ｚ ８５４）と仮定した。未精製製剤においては、他の分解産物（ピークＡ及びＢ，図１１Ｂ）も観察された。それらの相対保持時間、ピーク域及びタキサンの既知の分解機構に基づき、ピークＢ（図１１Ｂ）は７−エピ−バッカチンＩＩＩであるバッカチンＶであると思われ、ピークＡは１０−デアセチルバッカチンＩＩＩであると思われた。しかし、精製ポリマー類中にロードしたタキサンは異なった挙動を示した。バルク中及び溶液中の両方で、ＰＴＸは数日間化学的に安定であることがわかり、製剤調製中に主な分解物は観察されなかった（表６及び図１２Ｃ）。未精製ＨＰＧ類中のＰＴＸ及びＤＴＸは迅速に分解することが観察された。これは未精製ポリマー類における塩基性不純物の存在に起因すると思われる。塩基性不純物は、ＨＰＧ類合成の間に加えた過剰なカリウムメチラート及び水素化カリウムに由来する可能性が最も高い。カリウムメチラート及び水素化カリウムは、ともに強塩基であり、ポリマー中の残存水分と結びついてＰＴＸのＣ７位におけるエピマー化及びＰＴＸのエステル切断に好都合な環境を創り出し、バッカチンＩＩＩ（又はＤＴＸに関しては１０−デアセチルバッカ
チンＩＩＩ）を生成するであろう（図１１Ａ）。蒸留水中のｄＨＰＧポリマー類のｐＨ測定により、未精製ポリマー類は塩基性のｐＨであるが、精製ポリマー類は、（陽イオン交換樹脂のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＣ−１５０による処理に起因して）タキサンにとってより安定的な環境である酸性ｐＨであることが示された。タキサンは３〜５のｐＨ域で安定性が最大であると報告されている（Ｄｏｒｄｕｎｏｏ，Ｓ．Ｋ．，Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．，１９９６．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１３３，１９１−２０１；Ｔｉａｎ，Ｊ．，Ｓｔｅｌｌａ，Ｖ．Ｊ．，２０１０．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９９，１２８８−１２９８）。精製ポリマー類は当該ｐＨ域内であるので（表６）、ロードしたタキサンの化学的安定性を向上させた。未精製ｄＨＰＧポリマー類中にロードしたタキサンの、見かけ上のより高い薬物ローディング及びより高い物理的安定性は、ロードした薬物の大部分が、親のタキサンよりも低分子量且つ親水性の分子（バッカチンＩＩＩ及びバッカチンＶ）に分解したという事実により説明され得る。このことにより、分解された当該分子は、より効率的にｄＨＰＧ類にロードされたことが示唆される。

【0122】

【表6】

【0123】

実施例９：ｄＨＰＧ類の熱特性、表面電荷及び粒子サイズに対するＭｅＰＥＧ誘導体化の影響
粒子サイズ及びゼータ電位の解析は、各解析についてＤＴＳ００１２ ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ ｓｉｚｉｎｇ ｃｕｖｅｔｔｅを用いたＭａｌｖｅｒｎ ＮａｎｏＺＳ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行った。濃度１５ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を１ｍＭ ＮａＣｌ中に調製し、０．２２μｍのシリンジフィルター（ＰＡＬＬ Ａｃｒｏｄｉｓｃ １３ｍｍ ｗｉｔｈ ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）で濾過した。サンプルの取得パラメータは：角度１７３°の後方散乱（自動減衰）；ラン回数１１（１０秒／ラン）；分散剤は２５℃の水（粘度０．８８７２ｃＰ及びＲＩ １．３３０）；Ｍａｒｋ−ＨｏｕｗｉｎｋパラメータはＡ＝０．４２８及びＫ＝７．６７ｅ^−０５（ｃｍ^２
／ｓ）とした。ｄＨＰＧ類は、屈折率がポリエチレングリコールと同様（ＲＩ＝１．４６０及び吸収０．０１）であると仮定した。最終データはすべてのランの平均を表す。

【0124】

ｄＨＰＧ粒子サイズは一貫して直径１０ｎｍ未満であり、ＰＴＸ及びＤＴＸのロードによりＨＰＧ−ＭｅＰＥＧのサイズに影響は無かった（データ示さず）。薬物をロードしたＨＰＧ類は、１０ｎｍ未満の極端に小さなナノ粒子を形成する。

【0125】

以下のゼータポテンシャルの測定：ＨＰＧ−Ｃ_８／１０＝−１．２９±０．９７ｍＶ；ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５＝−０．９２±１．６８ｍＶ；ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３＝０．１８±０．１６ｍＶの通り、当該ナノ粒子上の総体的表面電荷は、ＨＰＧ類表面上でのＭｅＰＥＧ鎖の存在によって有意に影響されなかった。

【0126】

ＭｅＰＥＧ密度増大に伴う、ガラス転移温度に対する影響を観察した。Ｔｇは、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０ポリマーについての−３７．５℃からＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３についての−４５．２及び−５５．４℃にそれぞれ低下した（表５）。ＰＴＸ又はＤＴＸによるローディングもＴｇを減少させた（表５）。

【0127】

実施例１０：ｄＨＰＧ類中のＰＴＸ及びＤＴＸのロード、定量及び安定性並びにｄＨＰＧ類からのＰＴＸ及びＤＴＸの放出
ＰＴＸ又はＤＴＸ及びｄＨＰＧ類を４ｍｌバイアル中１ｍｌアセトニトリル溶液中に溶解し、オーブン中６０℃で１時間乾燥し、窒素でフラッシュして微量の有機溶媒を除去した。結果生じるｄＨＰＧ／タキサンマトリクスを、５０℃、１ｍｌの１０ｍＭ加温リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）で水和し、２分間ボルテックスした。結果生じる溶液は一般的に透明であるが、白色粒子が観察される場合は、溶液を遠心（１８０００ｇ、１０分間）し、上清を新たなバイアルに移した。

【0128】

ＨＰＧ類に組み込まれたＰＴＸ量及びＤＴＸ量は、以前に記載（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．，Ｌｅｔｃｈｆｏｒｄ，Ｋ．，Ｂａｂｉｕｋ，Ｋ．Ａ．，Ｍａｃｈａｎ，Ｌ．，Ｓｉｇｎｏｒｅ，Ｐ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｗ．Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｋ．，Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．，２００４．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．２８３，９７−１０９）の通り、逆相ＨＰＬＣにより決定した。１００μｌのｄＨＰＧ／ＰＴＸ溶液又はｄＨＰＧ／ＤＴＸ溶液を９００μｌのアセトニトリル／水（６０：４０，ｖ／ｖ）で溶解し、ＨＰＬＣのバイアル（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＯＮ）に移した。アセトニトリル、水及びメタノールの混合物（５８：３７：５，ｖ／ｖ／ｖ）を含有する移動相を有する対称Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａ−Ｐａｋ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用い、流速１ｍｌ／ｍｉｎで薬物含有量の解析を行った。注入サンプルの体積は２０μｌであり、検出はＵＶ検出器を用いて波長２３２ｎｍで行った。

【0129】

ＨＰＧ−Ｃ_８／１０の水溶性は限定的であり、タキサンの薬物ローディングは少なくなった（データは示さない）。疎水性薬物のロードにとっては、ｄＨＰＧ類におけるアルキル（Ｃ_８／１０）鎖の存在が重要であるが、それによってｄＨＰＧ類の水溶性が有意に低下する。ＨＰＧ類の水溶性を増大させるために、当該分子の合成時の反応終期に、ＭｅＰＥＧ ３５０鎖を加えた。ｄＨＰＧ類中のＭｅＰＥＧ量が比較的少量増加することにより、ＰＴＸ及びＤＴＸの両方について、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３の薬物ロードの増加がもたらされた。ＨＰＧ類中のＤＴＸローディングは、ＰＴＸに関してよりも多かった。ＤＴＸをロードしたｄＨＰＧ類は、ＰＴＸ製剤よりも物理的安定性が高いことが示された。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３（２％，ｗ／ｗ）において、ＤＴＸ（５％，ｗ／ｗ）の最大ローディングはＰＴＸに関してよりも高かった。

【0130】

タキサンをロードしたｄＨＰＧ類の物理的安定性及び化学的安定性を評価した。目視による製剤の透明性の観察によって物理的安定性を評価し、２４時間未満で沈殿する場合は物理的に不安定な製剤とみなした。室温でＰＢＳ中での再水和直後（ｔ＝０）又は１、３、６、２４、４８及び７２時間にサンプルを観察した。上記の通りのＨＰＬＣ法により、ＰＴＸ及びＤＴＸの化学的安定性をモニターした。Ｗａｔｅｒｓ ＴＱＤ質量分析計を用いた質量分析法の解析によって分解産物を同定した。電子スプレーイオン源ブロックの温度１５０℃、脱溶媒和温度３５０℃、コーン電圧４５ｋＶ、キャピラリー電圧０．７０ｋＶ、引出電圧３ｋＶ、ＲＦ電圧０．１ｋＶ、コーンガス流２５ｌ／ｈ、脱溶媒和ガス流６００ｌ／ｈ及び衝突ガス流０．２ｍｌ／ｍｉｎでシステムを作動させた。陽イオンモードにおいて、分子を電子スプレーでイオン化した。

【0131】

透析法によりｄＨＰＧ類からのＰＴＸ及びＤＴＸ放出を決定した。１００ｍｇのｄＨＰＧ類（ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３）を秤量して１ｍｌアセトニトリル溶液中で１ｍｇのＰＴＸ又はＤＴＸと混合し、１５ｕＣｉの^３Ｈ−ＤＴＸ又は^３Ｈ−ＰＴＸ（１５ｕｌ）でスパイクし、窒素気流下で乾燥して溶媒を除去した。放射性薬物（^３Ｈ−ＤＴＸ又は^３Ｈ−ＰＴＸ）はＭｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ及びＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｂｒｅａ，ＣＡ）から入手した。ｄＨＰＧ類／タキサンマトリクスを２ｍｌのＰＢＳで水和し、透析バッグに移して１００ｒｐｍで震盪しながら５００ｍｌの人口尿（ｐＨ４．５又は６．５）に対して透析した。透析膜管はＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡ）から購入した。人口尿はＢｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌの方法（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｔ．，Ｋｅｅｖｉｌ，Ｃ．Ｗ．，１９９７．Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２４，２０３−２０６）に従い、ぺプトン又はイーストエキストラクトを加えずに調製した。０．１Ｍ ＨＣｌを用いて溶液のｐＨをｐＨ４．５及び／又は（ａｎｄ ｏｒ）６．５に調整した。種々の時点で、透析バッグの体積を測定し、透析バッグ中の残存放射活性の測定用にサンプル１０μｌを採取し、外部放出媒体全体を新鮮媒体と交換してシンクの状態を維持した。ベータシンチレーションカウンティング（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃａｎａｄａ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｇｕａ，ＯＮ）により、各時点において透析バッグ中に残存する^３Ｈ−ＤＴＸ又は^３Ｈ−ＰＴＸの濃度を決定した。実験開始時の初期薬物量から各時点で残存する薬物の量を差し引くことにより、放出された薬物（累積）をパーセントで算出した。データは時間に応じた放出薬物のパーセンテージ（累積）として表した。データは３回の独立した実験の平均（ＳＤ）を表す。

【0132】

尿のｐＨは通常酸性であるが、広範囲（ｐＨ４．５〜８）にわたって変動することが知られているので、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ中にロードしたＰＴＸ及びＤＴＸの放出プロファイルに対するｐＨの影響を評価した。ＨＰＧ類からのタキサン類放出プロファイルの特徴は、放出が継続的に制御され、且つ放出のバースト期がほとんど無いか、又は無く、その後より緩やかな持続放出期となるということであった。ＤＴＸは、ＰＴＸよりも迅速にＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧから放出され（２日後、７５％対５０％の薬物放出）、ほぼすべてのＤＴＸが６〜７日で放出されるのに対して、ＰＴＸは１２〜１４日であった。これは、ＤＴＸの疎水性が非常に大きいためと考えられたが、更に疎水的なＰＴＸは相容性が非常に高くて、ＨＰＧコアのアルキル鎖（Ｃ_８／Ｃ_１０）との相互作用が非常に強く、薬物放出はより減速される可能性がある。ＨＰＧ類におけるＭｅＰＥＧ密度の増大によっては、薬物放出に影響が無いことを観察した（図１３Ａ）。放出媒体のｐＨ変化（ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５）によっては、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧナノ粒子からの薬物放出に影響が無いことを観察した（図１３Ｂ）。様々な動態モデル（一次モデル、ｈｉｇｕｃｈｉのモデル及びｋｏｒｓｍｅｙｅｒのモデルを含む）を用いた、ＰＴＸ及びＤＴＸの、ＨＰＧナノ粒子からの放出プロファイルの評価により、一次及びｈｉｇｕｃｈｉの動態が、両方ともｒ^２＝０．９８〜０．９９で最もフィットすることが示された（データ示さず）。薬物放出速度の観点からは、製剤間で統計学的な差異は無かった（デ
ータ示さず）。

【0133】

実施例１１：ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３のローダミン標識及びローダミン標識ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３の細胞取り込み
Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．の方法（Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｎ．，Ｐｈｅｌｐｓ，Ｍ．Ａ．，Ｓｗａａｎ，Ｐ．Ｗ．，２００３．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０６，６８１−６８７）に従い、わずかな変更を伴って、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３をテトラメチルローダミン−５−カルボニルアジド（ＴＭＲＣＡ）で共有結合的に標識した。５００ｍｇのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３を５ｍｌの無水１，４−ジオキサン中に溶解した。適量のＴＭＲＣＡを無水１，４−ジオキサン中に溶解し、最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。当該蛍光プローブのアリコート６７５μｌ（おおよそ２０ｍｏｌ％のＨＰＧに相当）をＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３溶液に加え、窒素気流の下５時間攪拌し、油浴中で８０℃に加熱した。透析液が無色になるまで溶液をＤＭＦ（ＭＷＣＯ
１２，０００〜１４，０００）に対して透析し、次いで蒸留水に対して２４時間透析した。蛍光標識ポリマー（ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３−ＴＭＲＣＡ）を凍結乾燥し、アンバーバイアル中、−８０℃で保存した。

【0134】

ＫＵ７細胞を、細胞数おおよそ７×１０^４細胞に相当する〜７５％のコンフルエンスに達するまで、１０ｃｍシャーレの底において、何枚かの１ｃｍ×１ｃｍ顕微鏡カバーガラス上で増殖させた。細胞を含有する当該カバーガラスを加温ＰＢＳで３回洗浄し、次いでパラフィンで裏打ちしたシャーレ上に細胞側を上にして静置した。２５０μｌのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３−ＴＭＲＣＡ溶液（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に１ｍｇ／ｍｌで溶解）をカバーガラスに加えた。細胞をＨＰＧ−Ｃ_８／１０ＭｅＰＥＧ_１３−ＴＭＲＣＡと１、４、８及び２４時間インキュベーションした。コントロール用に、ＫＵ７細胞を何ら補充の無いＤＭＥＭ中でインキュベーションした。次いで、カバーガラスをＰＢＳ緩衝液で４回激しく洗浄し、過剰ＰＢＳを穏やかにふき取り、２５０μｌの３．７％のパラホルムアルデヒドを加え細胞を１０分間固定した。カバーガラスをＰＢＳで更に３回洗浄し、水中に浸漬した。過剰な液体を拭き取った後、細胞をＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴うＰｒｏｌｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ退色防止剤で染色し、カバーグラスを細胞側を下にして顕微鏡スライドガラス上にマウントした。乾燥防止のため、カバーガラスのへりを透明なマニキュア液で封入した。サンプルを暗黒下一晩インキュベーションし、適切な細胞染色を確実に行った。サンプルを、ＤＡＰＩフィルター（λ_ｅｘ３４０〜３８０ｎｍ；λ_ｅｍ，４３５〜４８５ｎｍ；ダイクロイックスプリッター，４００ｎｍ）及びローダミンフィルター（λ_ｅｘ５３０〜５６０ｎｍ；λ_ｅｍ，５９０〜６５０ｎｍ；ダイクロイックスプリッター，５７０ｎｍ）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ−１０００倒立共焦点顕微鏡下で観察した。直接コントラスト（ＤＩＣ）も行って細胞膜を可視化し、４０５ｎｍレーザーで励起した。標識ポリマーが細胞内側にあったことを明確に示すため、画像を蛍光及びＤＩＣで解析した。

【0135】

ローダミン標識ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３（ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３−ＴＭＲＣＡ）の細胞取り込みを、共焦点顕微鏡法によりＫＵ７細胞で可視化した。１時間インキュベーション後、ＫＵ７細胞へのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３−ＴＭＲＣＡの取り込みが明らかとなった。１時間でのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３−ＴＭＲＣＡの取り込みの代表的な画像を図１４中に示す。パネルＡにＤＡＰＩ染色した未処理ＫＵ７細胞（核を青色（画像中は白色として示す）に可視化することを可能とする）を示す。画像は直接コントラストのシグナル（細胞の輪郭を示す）並びに核を（白色で）示す蛍光シグナル及び存在しない他の蛍光のオーバーレイである。パネルＢは、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３−ＴＭＲＣＡナノ粒子で１時間インキュベーションしたＫＵ７細胞を示す。核（ＤＡＰＩにより青色に染色）周辺のポリマーの赤色蛍光（画像中
、赤色蛍光は白色部分として示す。画像中、核を囲む赤色蛍光は暗い部分として示す。）により、細胞質中にＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３−ＴＭＲＣＡが存在することが示される。パネルＢと同一の細胞集団のｚ−スタックにより（ｚ−スタックの画像は示さず）、赤色蛍光ナノ粒子は、単に細胞膜に接着しているか、又は細胞膜中に存在しているというよりもむしろ、細胞質の至る所に存在することが証明された。いくつかの点状の構造が観察され、それはＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３−ＴＭＲＣＡナノ粒子が細胞輸送用小胞にパッケージされたことを示すのであるが、当該ナノ粒子は、細胞質中に一様に分布するように見えた。ＫＵ７細胞の核コンパートメント中に検出されたポリマー由来の蛍光は無かった。コントロールの細胞と比較すると、全時点で、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３−ＴＭＲＣＡナノ粒子は、ＫＵ７細胞の生存率及び有病率に影響しない。このことは、当該細胞株と当該ナノ粒子は生体適合性が非常に高いことを示す。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_１３−ＴＭＲＣＡナノ粒子は、１時間のインキュベーションによりＫＵ７細胞に取り込まれ、１、４、８又は２４時間の時点で取得した画像間で全く差異は無かった。

【0136】

実施例１２：ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧのＩｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性実験
上記の通り、既報のプロトコール（Ｋａｉｎｔｈａｎ ＲＫ，Ｍｕｇａｂｅ Ｃ，Ｂｕｒｔ ＨＭ，Ｂｒｏｏｋｓ ＤＥ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，９（３），８８６−８９５（２００８））に従ってＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧを調製した。¹H NMR (400 MHz, D₆-DMSO) δH: 0.75-0.82 (-CH₃, TMP); 0.82-0.92 (O/DGE上の-CH₃-アル
キル); 1.15-1.55 (-CH₂-, O/DGE上のアルキル); 2.50 (溶媒, D₆-DMSO); 3.15-3.80 (-CH及び-CH₂-, HPGコアから); 3.23 (-OCH₃- MePEGから), 3.32 (残存水); 4.8 (-OH).

【0137】

ＭｅＰＥＧとＨＰＧ類上のアルキル鎖との比は、異核種単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）ＮＭＲ実験から推定した。化学シフトは残存溶媒のピークを基準にした。多角度レーザー光散乱検出によるゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ）によってポリマー類の分子量及び多分散性を決定した：
分子量＝８３，０００ｇ／ｍｏｌ（１．２２の多分散性）（データ示さず）。

【0138】

Ｍａｌｖｅｒｎ ＮａｎｏＺＳ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ ａｎａｌｙｚｅｒを用いて粒子サイズ解析を行った。薬物をロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧにより、１０ｎｍ未満（７．５±３．４〜７．８±２．７ｎｍ，データ示さず）のナノ粒子が形成された。

【0139】

ＰＴＸ又はＤＴＸをロードしたｄＨＰＧ類は、４ｍｌバイアル中１ｍｌアセトニトリル溶液にＰＴＸ（１ｍｇ）又はＤＴＸ（０．５ｍｇ）及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ（１００ｍｇ）を溶解することによって調製し、オーブン中６０℃で１時間乾燥し、窒素気流でフラッシュして微量の有機溶媒を除去した。パクリタキセル（ＰＴＸ）粉末はＰｏｌｙｍｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から入手した。ドセタキセル（ＤＴＸ）粉末はＮａｔｕｒａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手した。結果生じるＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ／タキサンマトリクスを、１ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ６）で水和し、２分間ボルテックスした。逆相ＨＰＬＣにより、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ中に組み込まれたＰＴＸ及びＤＴＸの量を決定した。溶媒蒸発法により、高い薬物ローディング（それぞれ、２及び５％ｗ／ｗの最大ローディング）でＰＴＸ及びＤＴＸをロードできる。

【0140】

市販製剤のタキソール（登録商標）及びタキソテレ（登録商標）並びにＰＴＸ及び／又はＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ製剤の、ＫＵ７−ｌｕｃ細胞株、並びに低悪性度（ＲＴ４，ＭＧＨＵ３）及び高悪性度（ＵＭＵＣ３）の両方のヒト尿路上
皮癌細胞株に対する細胞傷害効果を評価した。タキソール（登録商標）はＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）からのものであった。タキソテレ（登録商標）はＳａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．（Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ）から購入した。ヒト膀胱癌細胞株のＲＴ４及びＵＭＵＣ３は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入した。１０％の熱非働化ウシ胎児血清を含有するマッコイ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）中で細胞を維持し、加湿５％ＣＯ_２雰囲気中、３７℃で保持した。ＭＧＨＵ３細胞はＹ．Ｆｒａｄｅｔ博士（Ｌ’Ｈｏｔｅｌ−Ｄｉｅｕ ｄｅ Ｑｕｅｂｅｃ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から、ご好意により寄贈していただき、１０％ウシ胎児血清及び２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＭＥＭ中で維持した。ＫＵ７はＣ．Ｄｉｎｎｅｙ博士（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）より提供していただき、５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で維持した。可視化目的のため、ＫＵ７細胞を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するレンチウイルス（Ｇｒａｉｇ Ｌｏｇｓｄｏｎ博士（Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）による）に感染させ、当該サブクローンを以前報告（Ｈａｄａｓｃｈｉｋ ＢＡ，Ｂｌａｃｋ ＰＣ，Ｓｅａ ＪＣ ｅｔ ａｌ．ＢＪＵ
Ｉｎｔ，１００（６），１３７７−１３８４（２００７））した通りＫＵ７−ｌｕｃと命名した。９６−ウェルプレート中、体積１００μｌの１０％ ＦＢＳを添加したマッコイ培地中に５，０００細胞／ウェルで細胞をプレーティングし、新たに調製したタキソール（登録商標）；タキソテレ（登録商標）；ＰＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ；又はＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧの溶液を加える前に、２４時間平衡化させた。細胞を薬物製剤に２時間曝露し、注入療法についての現行の臨床基準を模倣して、以前報告（Ｈａｄａｓｃｈｉｋ ＢＡ，ｔｅｒ Ｂｏｒｇ ＭＧ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．ＢＪＵ Ｉｎｔ，１０１（１１），１３４７−１３５５（２００８））した通り、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ （ＭＴＳ）ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、７２時間後に細胞の生存率を決定した。各実験を３回繰り返し、すべての細胞株について、ＭＴＳ値が直線の吸収帯内に収まった。

【0141】

すべての製剤により、試験した細胞株すべての増殖が濃度依存的に阻害された（図１５）。群間で有意差は無かったが、ＤＴＸ製剤はＰＴＸ製剤よりも細胞傷害性が強かった（Ｐ＞０．０５，一元配置分散分析）。タキソテレ（登録商標）のＩＣ_５０はタキソール（登録商標）のＩＣ_５０より約２〜５倍低かった。ＰＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧナノ粒子及びＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧナノ粒子は、それぞれ市販製剤のタキソール（登録商標）及びタキソテレ（登録商標）と同様の細胞傷害性を有することがわかった（図１５）。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ＥＬ（登録商標）及びＴｗｅｅｎ ８０は低濃度であっても細胞毒性を有することが示された（Ｉｗａｓｅ Ｋ，Ｏｙａｍａ Ｙ，Ｔａｔｓｕｉｓｈｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｌｅｔｔ，１５４（１−２），１４３−１４８（２００４）；Ｈｅｎｎｉ−Ｓｉｌｈａｄｉ Ｗ，Ｄｅｙｍｅ Ｍ，Ｂｏｉｓｓｏｎｎａｄｅ ＭＭ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，２４（１２），２３１７−２３２６（２００７））が、コントロールのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧナノ粒子（薬物なし）は、１５−１，５００ｎＭの濃度域にわたって細胞傷害性を示さなかった（データ示さず）。

【0142】

実施例１３：同所性膀胱癌モデルにおける膀胱内ＰＴＸ製剤及びＤＴＸ製剤の有効性
マウスの膀胱癌異種移植モデルにおいて、全部で６０匹のヌードマウスでｉｎ ｖｉｖｏの実験を行い、膀胱内タキソール（登録商標）（１ｍｇ／ｍｌ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ）；タキソテレ（登録商標）（０．５ｍｇ／ｍｌ，Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）；ＰＴＸ（１ｍｇ／ｍｌ）をロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥ
Ｇ；及びＤＴＸ（０．５ｍｇ／ｍｌ）をロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧの有効性を評価した。当該同所性マウスモデルは、Ｍｕｇａｂｅ Ｃ，Ｈａｄａｓｃｈｉｋ ＢＡ，Ｋａｉｎｔｈａｎ ＲＫ ｅｔ ａｌ．ＢＪＵ Ｉｎｔ，１０３（７），９７８−９８６（２００９）；Ｈａｄａｓｃｈｉｋ ＢＡ，Ｂｌａｃｋ ＰＣ，Ｓｅａ ＪＣ ｅｔ ａｌ．ＢＪＵ Ｉｎｔ，１００（６），１３７７−１３８４（２００７）；Ｈａｄａｓｃｈｉｋ ＢＡ，ｔｅｒ Ｂｏｒｇ ＭＧ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．ＢＪＵ
Ｉｎｔ，１０１（１１），１３４７−１３５５（２００８）に報告されている。動物実験はカナダ動物管理協会に従って行った。１１週齢の雌性ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）をイソフルランで麻酔した。潤滑化２４ Ｇ Ｊｅｌｃｏ血管カテーテル（Ｍｅｄｅｘ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｔｄ．，Ｌａｎｃａｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を尿道を経て膀胱へ通す前に、６−０ポリプロピレンの巾着縫合を尿道口付近の表層に施した。ＰＢＳで膀胱を１回灌注した後、２百万のＫＵ７−ｌｕｃ細胞を、５０μｌの単一細胞懸濁液として注入し、巾着縫合を２．５時間結紮した。ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍負荷を定量するために、４、１１、１８、２５及び３３日目に１５０ｍｇ／ｋｇルシフェリンを腹膜内注射し、１５分後に、ＩＶＩＳ２００イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ／Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）により動物を仰臥位でイメージングした。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いてデータを取得し、解析した。腫瘍接種後５日目に、無作為に、マウスの膀胱を５０μｌのＰＢＳ（コントロール）；ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ（薬物無し）；タキソール（登録商標）（１ｍｇ／ｍｌ）；ＰＴＸ（１ｍｇ／ｍｌ）をロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ；タキソテレ（登録商標）（０．５ｍｇ／ｍｌ）；ＤＴＸ（０．５ｍｇ／ｍｌ）をロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧで処理した。腫瘍接種後５日目及び１９日目に膀胱内治療を行った。生物発光レベルは群間で同等であった；しかし、腫瘍はマウス個体間でばらつきがあるので、統計学的解析のため、処理後の腫瘍の生物発光を、４日目の各マウスにおける初期フラックスに対して正規化した。腫瘍接種後３３日目に剖検を行った。膀胱全体を取り出し、１０％緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋した。５μｍの切片を作製し、標準法を用いてＨ＆Ｅで染色した。スライドは、すべて調査し、ＢＬＩＳＳ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｂａｃｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｌｏｍｂａｒｄ，ＩＬ）上で走査した。ＫＵ７−ｌｕｃ癌細胞の膀胱内接種後、マウスはすべて膀胱腫瘍を発症した。しかし、マウス２匹が麻酔から回復せず、腫瘍接種日と同日に死亡した。タキソテレ（登録商標）群のマウス１匹が、イメージングの最終日（腫瘍接種後３３日目）に死亡したことがわかった。当該マウスは以前の測定において、腫瘍が当該群中最大であった。別に、ＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧのマウス１匹を、不可逆的な体重減少（１５％体重減少）のため、屠殺した。統計解析のために、当該マウスを実験から排除した。全体的に、膀胱内のＰＴＸ及びＤＴＸ、市販のタキソール（登録商標）及びタキソテレ（登録商標）、又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧとも、マウスによって十分寛容され、深刻な毒性又は体重減少は観察されなかった。腫瘍接種後５日及び１９日に膀胱内療法を行った。コントロールマウス（ＰＢＳ及び空のＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ）と比較すると、ＰＴＸ及びＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧにより腫瘍成長が有意に阻害された（Ｐ＜０．００１，二元配置分散分析、ボンフェローニ事後検定）（図１６）。タキソテレ（登録商標）とは異なり、タキソール（登録商標）（１ｍｇ／ｍｌ）により、コントロール群（ＰＢＳ及び空のＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ）と比較して、腫瘍成長が有意に低下した（Ｐ＜０．０１，二元配置分散分析，ボンフェローニ事後検定）。しかし、タキソール（登録商標）及びタキソテレ（登録商標）の処理群間で有意差は観察されなかった。ＰＴＸ（１ｍｇ／ｍｌ）及びＤＴＸ（０．５ｍｇ／ｍｌ）の膀胱内注入投与量は、ＰＴＸを用いた以前の報告（Ｍｕｇａｂｅ Ｃ，Ｈａｄａｓｃｈｉｋ ＢＡ，Ｋａｉｎｔｈａｎ ＲＫ ｅｔ ａｌ．ＢＪＵ Ｉｎｔ，１０３（７），９７８−９８６（２００９））及びＤＴＸがＰＴＸよりも強力であることを証明するｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞傷害性データ（Ｆｉｇ．１５）に基づいて選んだ。実
験の最後で、ＰＴＸ及びＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧナノ粒子両方における腫瘍成長は、ＰＢＳコントロール群と比較して、それぞれ８７％及び９７％阻害された。タキソテレ（登録商標）及びタキソール（登録商標）により、それぞれ４３％及び６５％の腫瘍成長阻害が示された。各処理群における、マウスの代表的な生物発光の画像を経時的に図１７中に示す。膀胱組織の組織学的な検証により、ＫＵ７−ｌｕｃの腫瘍は悪性の成長パターン及び高頻度の多病巣性を示したが、腫瘍接種から３３日後には、当該処理群における腫瘍の大半が、大抵は固有層に限局し、且つ高悪性度のｐＴ１ステージの疾患と相関したことが示される（図１８）。

【0143】

ＨＰＧ類のほんの数ナノメートルサイズ域により、当該ナノ粒子の、癌組織を含む膀胱壁へのエンドサイトーシス亢進をもたらす、ムチン鎖間の透過及び尿路上皮のアンブレラ細胞との接触が可能になり得ると考察された。ＨＰＧ類表面のＭｅＰＥＧ鎖は、糖タンパク質ムチンと、鎖の絡み合いを通して相互作用し得、このことにより、当該ナノ粒子がムチン層中に封入されることになって、薬物をロードしたナノ粒子が、膀胱中に滞留する時間の延長がもたらされる可能性もある。ＰＴＸ及びＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧナノ粒子は、市販製剤のタキソール（登録商標）又はタキソテレ（登録商標）よりも２〜３倍高い膀胱組織への蓄積を示したことを表７に示す。

【0144】

実施例１４：薬物動態
膀胱内のＰＴＸ製剤及びＤＴＸ製剤の薬物動態特性を評価するため、マウスにタキソール（登録商標）（１ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝３）；タキソテレ（登録商標）（０．５ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝４）；ＰＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ（１ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝４）；及び／又はＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ（０．５ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝４）のいずれかを注入した。膀胱内注入後０、３０及び６０分で尾部血液サンプルを採取した。当該時間、マウスは依然、イソフルランで麻酔していた。２時間後、ＣＯ_２を用いてマウスを窒息させて殺し、心穿刺により血液を更に除去した。血液サンプルをｍｉｃｒｏ−ｈａｅｍａｔｏｃｒｉｔ ｔｕｂｅｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）中又はｓｅｒｕｍ−ｓｅｐａｒａｔｏｒ ｔｕｂｅｓ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｎｓｏｎ）中で遠心し、血清を液体窒素中でさっと凍結した。各マウスの尿及び膀胱も回収し、膀胱は、凍結前に切開して内腔を露出させ、１０ｍｌＰＢＳで５回連続で激しく洗浄した。サンプルはすべて−８０℃で保存した。解析に用いたＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムは、Ｗａｔｅｒｓ ＴＱＤ質量分析計を用いた質量分析と共役した、統合化Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ分離システムで構成した。電子スプレーイオン源ブロックの温度１５０℃、脱溶媒和温度３５０℃、コーン電圧１４Ｖ、キャピラリー電圧０．７０ｋＶ、引出電圧３ｋＶ、ＲＦ電圧０．１ｋＶ、コーンガス流２５ｌ／ｈ、脱溶媒和ガス流６００ｌ／ｈ及び衝突ガス流０．２ｍｌ／ｍｉｎでシステムを作動させた。陽イオンモードにおいて、分子を電子スプレーでイオン化した。溶媒／溶媒抽出法によって、マウス血清からＤＴＸを抽出した。９６−ウェルプレートにおいて、マウス血漿及び標準液の５０μｌアリコートをアセトニトリル中の０．１％ギ酸１５０μｌと混合し、室温で１分間ボルテックスした。サンプルを４℃、１０分間、５，５００ｒｐｍで遠心した（Ａｌｌｅｇｒａ（商標）２５ Ｒ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）。次いで上清１００μｌと蒸留水５０μｌとを混合し、混合して３０秒間ボルテックスした。膀胱組織を計量し、ジルコニアビーズ（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）及びミクロバイアルホルダーを備えたｍｉｎｉ−ｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて０．１％ギ酸／メタノール中で６０秒間ホモジェナイズした。サンプルを４℃で２分間、１４，０００ｒｐｍで遠心した（Ａｌｌｅｇｒａ（商標）２５ Ｒ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ， Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）。メタノール中０．１％トリフルオロ酢酸１５０μｌをサンプルに加え、混合及び４℃で１５分間、１４，０００ｒｐｍでボルテックスした（Ａｌｌｅｇｒａ（商標）２５ Ｒ
ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）。サンプルの解析は、すべ
てＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて行った。スパイクしたコントロールサンプルからの回収率は９７％で、ＤＴＸの検出限界は１０ｎｇ／ｍｌであった。

【0145】

いくつかの血清サンプルでは定量不能か、又は検出不能なレベルであった。一般的に、膀胱内注入後のＰＴＸ及びＤＴＸの血清中レベルは、両方低かった（５〜２０ｎｇ／ｍｌ）。異群間及び／又は異なる時点の間で、血清レベルには有意差が無かった（Ｐ＞０．０５）（表７）。しかし、膀胱組織中のレベルは血清中レベルよりも約１００〜５００倍高かった。ＰＴＸ及びＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧナノ粒子により、市販の製剤よりも２〜３倍高い膀胱組織蓄積が示されたが、その差は統計的に有意では無かった（Ｐ＞０．０５，一元配置分散分析，ボンフェローニの多重比較検定）。尿中の最終薬物濃度は初期の投与溶液よりも約３〜５倍低かった。これは、２時間の膀胱内注入の間の尿希釈に起因した。しかし、ＰＴＸ及びＤＴＸの尿中最終濃度において、異なる処理群間で有意差は無かった（Ｐ＞０．０５，一元配置分散分析）。一般的に、膀胱内注入後のＰＴＸ及びＤＴＸの血清中レベルは、両方低かった（５〜２０ｎｇ／ｍｌ）。異群間及び／又は異なる時点の間で、血清中レベルには有意差（Ｐ＞０．０５）が無かった（表７）。

【0146】

【表7】

【0147】

実施例１５：ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２の合成
実施例７に記載したプロトコールに従ってＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧを合成した。¹H NMR (400 MHz, D₆-DMSO) δH: 0.75-0.82 (-CH₃, TMP); 0.82-0.92 (O/DGE上の-CH₃-アルキル); 1.15-1.55 (-CH₂-, O/DGE上のアルキル); 2.50 (溶媒, D₆-DMSO); 3.15-3.80 (-CH及び-CH₂-, HPGコアから); 3.23 (-OCH₃- MePEGから), 3.32 (残存水); 4.8 (-OH). HPG-C_8/10-MePEG-NH₂（以下の手順を用いて、様々な目標量でアミン置換を行いＨＰＧ
−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２を合成した。）使用した試薬の量を表８中に集約する。目標のアミン置換は、ＨＰＧ１モル当たりのＮＨ_２の目標モル数を表し、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（Ｘ）（式中、ｘはＨＰＧ１モル当たりのＮＨ_２６１、１２
１及び１６１モルである）により表示する。１５ｍｌの無水１，４−ジオキサン中にＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧを溶解した。水素化カリウム（ＫＨ）を無水へキサンで３回リンスし、ミネラルオイルを除去して真空下乾燥した。ポリマー溶液をＫＨと混合し、透明な溶液が形成されるまで室温で攪拌した。一晩攪拌（Ｎａ_２ＳＯ_４又はＭｇＳＯ_４）しながらジクロロメタン中に溶解することにより、Ｎ−（２，３−エポキシプロピル）フタルイミド）（ＥＰＰ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を乾燥した。溶液を濾過し、真空の下乾燥してジクロロメタンを除去した。乾燥したＥＰＰを無水１，４−ジオキサン中に溶解し、約８５〜９０℃で一晩攪拌しながらポリマーに加えた。陽イオン樹脂交換カラム（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＣ−１５０）に３回通すことにより生成物を中和し、次いでエーテルから３回沈殿させて未反応のＥＰＰを除去した。ヒドラジン一水和物によるヒドラジン分解により、フタルイミド官能基の開裂を達成した。ポリマーのメタノール溶液に過剰のヒドラジン一水和物溶液（２ｍＬ）を加え、混合物を７２時間還流した。還流後、メタノールを蒸発させ、１０，０００ ＭＷＣＯ膜を用いて、ポリマーを水に対して４８時間透析し、凍結乾燥した。¹H NMR (400 MHz, D₆-DMSO) δH: 0.75-0.82 (-CH₃, TMP); 0.82-0.92 (O/DGE上の-CH₃-アルキル); 1.15-1.55 (-CH₂-, O/DGE 上のアルキル); 2.50 (溶媒, D₆-DMSO); 2.60-2.80 (-CH₂-NH₂) 3.15-3.80 (-CH及び-CH₂-, HPG コアから); 3.23 (-OCH₃- MePEGから)。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２製造のための、Ｎ−
（２，３−エポキシプロピル）フタルイミド）（ＥＰＰ）による、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧポリマー上のいくつかのヒドロキシル基（１０〜２０％）の表面修飾と、続くヒドラジン分解による、フタルイミド官能基の開裂用の反応スキームをスキームＶＩＩ中に要約する（Ｒ，アルキル（Ｃ_８／Ｃ_１０）鎖の混合物ベースの疎水性コアを表す。（）７，ＭｅＰＥＧ ３５０ベースの親水性シェルを表す。）。

【0148】

【化8】

【0149】

薬物ローディング及び動物実験における更なる評価のために、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}を選択した。

【0150】

ＮＭＲ及びＧＰＣ
ＭｅＰＥＧとＨＰＧ類上のアルキル鎖との比は、重水素化溶媒（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，９９．８％Ｄ）を用いて、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ 質量分析計（磁場強度９．４Ｔ）に記録した異核種単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）ＮＭＲ実験から推定した。多角度レーザー光散乱検出によるゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ）によってポリマー類の分子量及び多分散性を決定した。

【0151】

図１９ＡにＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧの代表的な２Ｄ ＨＳＱＣスペクトルを示す。Ｎ−（２，３−エポキシプロピル）フタルイミド）によるＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧの表面修飾は、２Ｄ ＨＳＱＣ実験によって確認し、芳香族のフタルイミドＣＨ基を同定した（^１Ｈ化学シフト７．２〜７．８ｐｐｍ及び^１３Ｃ化学シフト１２５〜１３５ｐｐｍ）。遊離アミン基を生成するための、ヒドラジン分解による、フタルイミド基開裂の成功を１Ｄ ＮＭＲ実験及び２Ｄ ＨＳＱＣ実験の両方でモニターした。一級アミン基（２．６０〜２．８０ｐｐｍ及び^１３Ｃ化学シフト４５ｐｐｍ，図１９Ｂ）を生成するためのフタルイミド保護基開裂の成功を示す、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}の代表的な２Ｄ ＨＳＱＣスペクトルを図１９Ｂに示す。ＨＳＱＣ ＮＭＲのデータにより、スペクトルにおいて分岐構造は明らかであり（図１９）、超分岐ポリマー類としてのｄＨＰＧ類の構造が確認された。Ｃ_８／１０アルキル鎖とｄＨＰＧ類上のＭｅＰＥＧとのモル比は、ＨＳＱＣ実験におけるシグナルの積分から算出し得る。ＭｅＰＥＧのメトキシ基及びオクチル／デシルグリシジルエーテル（Ｏ／ＤＧＥ）のメチル基の積分とＴＭＰのＣＨ_３基の積分とを比較することにより、各ｄＨＰＧポリマーについてＭｅＰＥＧ及びＯ／ＤＧＥ（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の比を算出した（表１０）。

【0152】

電気伝導度滴定及びフルオレスカミンアッセイ
ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧポリマー類上で誘導体化されたアミン基のモル比を、ＨＣｌ及びＮａＯＨを用いて電気伝導度滴定により測定した。電気伝導度滴定は、ＹＳＩ
ｍｏｄｅｌ ３５コンダクタンスメーター及び白金電極を備えた３４０３セルで、２５℃で行った。シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、一定流速０．０１０２ｍｌ／ｍｉｎで希釈ＮａＯＨ溶液を注入した。典型的な滴定に関しては、おおよそ１０ｍｇのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２を蒸留水中に溶解し、まず０．０５Ｎ ＨＣｌで滴定し、続けて０．０５Ｎ ＮａＯＨで逆滴定した。３０秒ごとに溶液の電気伝導度を測定した。水酸化ナトリウム溶液の標準化用にフタル酸水素カリウム溶液（０．０５Ｎ）を用いた。電気伝導度滴定及び分子量測定に基づいて、ＨＰＧ１分子当たりのアミン基のモル数を算出した。得られた値は５０〜１１９ｍｏｌ／ｍｏｌの範囲であり、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２１モル当たりのＮＨ_２の目標モル比と一致していた（表８及び１０）
。

【0153】

【表8】

【0154】

ＨＰＧ１分子当たりのアミン基のモル数も、蛍光測定及び重量測定を用いて算出され得る。例えば、ＮＨ_２についての蛍光アッセイが用いられ得る（表９）。＞５ｍｇのＨＰＧ−ＮＨ_２を２ｍＬのＬＣ／ＭＳガラスバイアル中に測り取り、適量の脱イオン化Ｈ_２Ｏを加えて濃縮ストックを作製することによりＨＰＧ−ＮＨ_２のサンプルを調製し、次いで混合物を、ＨＰＧ−ＮＨ_２が溶解するまでソニケーションした。ストック溶液を、脱イオン化Ｈ_２Ｏで１ｍｇのＨＰＧ−ＮＨ_２当たり１ｍｇ／ｍＬに希釈した。

【0155】

おおよそ１ｍｇのフェニルアラニンを、アルミ製のマイクロ秤量皿に計り取って２０ｍＬガラスバイアルに移し、次いで１ｍｇのフェニルアラニン当たり５ｍＬの脱イオン化Ｈ_２Ｏを加え、混合物を、フェニルアラニンが溶解するまでソニケーションした（0.2ｍｇ
／ｍＬフェニルアラニンストック）。６０μＬの０．２ｍｇ／ｍＬフェニルアラニンストックをガラスのＬＣ／ＭＳバイアルに移した。９０μＬ（９０°μＬ）の脱イオン化Ｈ_２Ｏを加え、ボルテックスして溶液を混合した（８０ｎｇ／ｍＬフェニルアラニン作業標準液）。

【0156】

４０μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＨＰＧ−ＮＨ_２ストックを９６−ウェルプレートに移し、１０μＬ（１０°μＬ）の脱イオン化Ｈ_２Ｏを加え（或いは、５０μＬ（５０°μＬ）、４０μＬ、３０μＬ（３０°μＬ）、２０μＬ（２０°μＬ）、１０μＬ（１０°μＬ）又は０μＬ（０°μＬ）の８０ｎｇ／ｍＬフェニルアラニン作業標準液を加え、必要な場合は脱イオン化Ｈ_２Ｏをつぎ足して５０μＬ（５０°μＬ）にし）；サンプルをピペッティングして混合した。ウェルに１２．５μＬのホウ酸ナトリウム緩衝液を加え、ピペッティングして混合した。ピペットのチップを０．０３％フルオレスカミン溶液で２回リンスし、チップをコーティングして水漏れを防止した。１２．５μＬの０．０３％フルオレスカミン溶液をサンプルのウェルに加えた。サンプルをピペッティングして混合し、次いでプレート震盪器上に置き、覆いをして１分間震盪した。１７５μＬの脱イオン化Ｈ_２Ｏを加え、過剰のフルオレスカミンを反応させてピペッティングして混合し、短時間プレート震盪器上に置いた。サンプルを蛍光プレートリーダー（励起波長３９０ｎｍ、蛍光波長４７
５ｎｍ並びに励起波長及び蛍光波長の両方についての５ｎｍのバンド幅）によって解析した。

【0157】

【表9】

【0158】

熱解析
ＤＳＣ及びＴＧＡを用いてｄＨＰＧ類の熱特性及び分解特性を評価した。ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＳＣ Ｑ１００及びＴＧＡ Ｑ５０を用いて熱解析を行った。密封したアルミニウム製パン中、秤量したサンプルを、温度範囲−９０℃〜８５℃にわたる、１０℃／分での「加熱−冷却−加熱」の循環でサイクルにかけることによりＤＳＣのランを取得した。分解過程において、各期の重量減少を等温状態下で観察し、主に、ＨＰＧ類を５００℃で、重量減少１００％近くまで熱を通す「段階的等温」モードで、ＴＧＡのランを行った。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧサンプル及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２サンプルの熱的なイベントを表１０示す。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧサンプル及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２サンプルは同様のＤＳＣ／ＴＧＡプロファイルを示した。ＨＰＧ類は、−４５〜−５８℃のガラス転移温度を示した。アミン基の存在により、ＨＰＧ類のＴｇが少し上昇した。主な分解的イベントは３００℃を超える温度で観察されたが、このことはＨＰＧ類の良好な熱安定特性を示す。おそらくは、ＨＰＧ類中のいくらかの残存溶媒又は残存水に起因して、１００℃以下の温度でおおよそ３〜５％の重量喪失が生じた。想定される熱滅菌法の使用を可能とするために、医薬への適用にとっては、ＨＰＧ類の良好な熱安定性は望ましい。

【0159】

粒子サイズ決定及びゼータ電位
粒子サイズ及びゼータ電位の解析は、各解析についてＤＴＳ００１２ ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ ｓｉｚｉｎｇ ｃｕｖｅｔｔｅを用いたＭａｌｖｅｒｎ ＮａｎｏＺＳ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行った。サンプルを０．２μｍのインラインシリンジフィルター（ＰＡＬＬ Ａｃｒｏｄｉｓｃ １３ｍｍ（ナイロン膜付））で濾過した。サンプルの取得パラメータは：角度１７３°の後方散乱（自動減衰）；ラン回数１１（１０秒／ラン）；分散剤は２５℃の水（粘度０．８８７２ｃＰ及びＲＩ １．３３０）；Ｍａｒｋ−ＨｏｕｗｉｎｋパラメータはＡ＝０．４２８及びＫ＝７．６７ｅ^−
０５（ｃｍ^２／ｓ）。ＨＰＧ類の屈折率は、ポリエチレングリコールの屈折率（ＲＩ＝１．４６０及び吸収０．０１）と同様であると仮定した。最終データはすべてのランの平均を表す。ＨＰＧ類は、＜１０ｎｍの流体力学半径を有する小さなナノ粒子である。ＨＰＧ類は、１０ｎｍ未満の極端に小さなナノ粒子を形成する。ＨＰＧ類の粒子サイズ及びゼータ電位の特徴を表１０に示す。アミン基でのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ表面の誘導体化によっては、粒子サイズは影響されなかったが、ゼータ電位に対しては、有意な影響を観察した。アミンが末端にくるＨＰＧポリマー類のゼータ電位は、低ｐＨで正に高く、塩基性条件においてはやや負の値に変化した。表面電荷における、ｐＨ滴定可能な当該変化は、アミン基のプロトン化／脱プロトン化から生じる。生理学的なｐＨ７．４では、ＨＰＧ類のいくらかのアミン基がイオン化し、従って正のゼータ電位が予想される（表１０）。しかし、８を上回るｐＨ値では実質的にすべてのアミン基が帯電しておらず、従ってｐＨ１１ではわずかに負の電荷観察される（おそらく、当該ＨＰＧ類上に存在する、陰性物質のヒドロキシル基に起因した）。ＨＰＧ類の薬物ローディングによっては、その粒子サイズは有意に影響されず、ＨＰＧ類は溶液中で単分子ミセルとして十分に分散したままであった。ＤＴＸをロードしたＨＰＧ類のナノ粒子は物理的に安定であり、室温で１週間の保存中には薬物沈殿又は凝集を観察しなかった。

【0160】

【表10】

【0161】

実施例１６：粘膜付着特性の評価
ＨＰＧ類の粘膜付着特性を評価するため、Ｔｈｏｎｇｂｏｒｉｓｕｔｅ ａｎｄ Ｔａｋｅｕｃｈｉによって開発されたムチン粒子法（Ｔｈｏｎｇｂｏｒｉｓｕｔｅ，Ｊ．；Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｈ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２００８，３５４，２０４−２０９）を用いた。当該方法は、サブミクロンサイズのムチンが粘着性ポリマーとムチンとの相互作用の結果として凝集することに起因する、粒子サイズ変化に基づく。サブミクロンサイズのムチンの溶液を、等体積の１００ｍＭ酢酸緩衝液中ＨＰＧ類（１０％ｗ／ｖ）と混合し、ボルテックスし、３７℃で３０分間インキュベーションした。３０００ ＨＳ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ （Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｏ，ＣＡ）を用いて、光散乱測定により粒子サイズ変化をモニターした。各試験はトリプリケートで実施し、陽性コントロールとしてキトサン溶液（１％ｗ／ｖ）を用いた。ム
チンの粒子サイズは、キトサン溶液（１％ｗ／ｖ）又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}溶液（１０％ｗ／ｖ）のいずれかとのインキュベーション後、有意に増大した（図２０）。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ（１０％ｗ／ｖ）によっては、ムチン粒子のサイズは影響されなかった。サブミクロンサイズのムチン粒子サイズの増大は、ムチン粒子及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２ナノ粒子の凝集に起因していて、ムチンと、アミンで置換したＨＰＧ類との粘膜付着力が原因であった。広く知られている粘膜付着ポリマーのキトサンを陽性コントロールとして用いた。しかし、高分子量と水溶液における低溶解度のために、キトサンの希釈液（１％ｗ／ｖ）を用いた。当該希釈液ですら、共インキュベーション後に、ムチン粒子サイズの有意な変化を示した。キトサン及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２の両方の粘膜付着性は、正に帯電したアミン基と、負に帯電したムチン粒子との静電相互作用に起因するが、水素結合、疎水性効果及び鎖の絡み合い等の他の寄与もまた、影響をもたらし得ると考えられている。しかし、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧの粘膜付着性の欠如からみて、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２の粘膜付着特性には、主に静電引力が寄与するらしいことが示唆される。

【0162】

実施例１７：細胞増殖／結合実験及び取り込み実験
細胞増殖
９６−ウェルプレート中、１０％ ＦＢＳを添加した体積１００μｌのマッコイ培地に５，０００細胞／ウェルでＫＵ７−ｌｕｃ細胞をプレーティングし、新たに調製したＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ及び／又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（ＰＢＳ，ｐＨ７．４に溶解，０〜１５０μｇ／ｍｌ）溶液を加える前に、２４時間平衡化させた。細胞をＨＰＧ溶液に２時間曝露し、以前記載（Ｍｕｇａｂｅ，Ｃ．；Ｈａｄａｓｃｈｉｋ，Ｂ．Ａ．；Ｋａｉｎｔｈａｎ，Ｒ．Ｋ．；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．；Ｓｏ，Ａ．Ｉ．；Ｇｌｅａｖｅ，Ｍ．Ｅ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．ＢＪＵ Ｉｎｔ．２００９，１０３，９７８−９８６）した通り、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、７２時間後に細胞の生存率を決定した。

【0163】

ＨＰＧ類のローダミン標識
ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧポリマー類及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}ポリマー類を、以前報告（Ｓａｖｉｃ，Ｒ．；Ｌｕｏ，Ｌ．；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．；Ｍａｙｓｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，３００，６１５−６１８）した通り、テトラメチル−ローダミン−カルボニル−アジド（ＴＭＲＣＡ）で共有結合的に標識した。テトラメチル−ローダミン−カルボニル−アジド（ＴＭＲＣＡ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）から購入した。簡単に述べると、５００ｍｇのＨＰＧ類（ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}）を５ｍｌの無水１，４−ジオキサン中に溶解した。適量のテトラメチルローダミン−５−カルボニル−アジド（ＴＭＲＣＡ，ＭＷ ４５５．４７）を２ｍｌの無水１，４−ジオキサン中に溶解し、最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。当該蛍光プローブのアリコート６７５μｌ（おおよそ２０ｍｏｌ％のＨＰＧ類に相当）をＨＰＧ類溶液に加え、窒素気流の下５時間攪拌し、油浴中で８０℃に加熱した。透析液が無色になるまで、ＤＭＦ（ＭＷＣＯ １２，０００〜１４，０００）に対して透析し、次いで蒸留水に対して２４時間透析することにより、未反応プローブを除去した。蛍光標識ポリマー類（ＨＰＧ類−ＴＭＲＣＡ）を凍結乾燥し、アンバーバイアル中、−８０℃で保存した。

【0164】

細胞結合及び取り込み
ＫＵ７−ｌｕｃ細胞を用いて、ローダミン標識ＨＰＧ類の結合及び取り込みを評価した。９６−ウェルプレート中、１０％ ＦＢＳを添加した体積１００μｌのマッコイ培地に
１０，０００細胞／ウェルで細胞をプレーティングし、２４時間平衡化させた。培地を除去し、細胞をローダミン標識ＨＰＧ類（ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＴＭＲＣＡ又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}−ＴＭＲＣＡ，１．５６〜２００μｇ／ｍｌ）と２時間インキュベーションした。インキュベーション時間に続いて細胞をＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌの０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＰＢＳ中ｐＨ８）で溶解して細胞の蛍光結合量を蛍光分光光度計（Ｓｙｎｅｒｇｙ ４．０）により、５４５／５７８の励起／蛍光で測定した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＰＢＳ（ｐＨ８）中のローダミン標識ＨＰＧ類（０．７８１〜６．２５μｇ／ｍｌ）から標準液を調製した。細胞に取り込まれたか、又は表面に結合したローダミン標識ＨＰＧ類量を、各ウェルに加えたポリマー全量のパーセンテージとして表した。

【0165】

細胞取り込みの共焦点蛍光解析
ＫＵ７−ｌｕｃ細胞を、細胞数７×１０^４細胞に相当する〜７５％のコンフルエンスに達するまで細胞増殖させ続けるために、１０ｃｍシャーレ中、シャーレの底において、１ｃｍ×１ｃｍカバーガラス上で増殖させた。次いで、細胞を含有するカバーガラスを取り出し、加温ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、カバーガラスを、パラフィルムで裏打ちしたシャーレ中に細胞側を上にして、取り込みアッセイの継続時間中静置した。ローダミン標識ＨＰＧポリマー類（２５０μｌのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＴＭＲＣＡ又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}−ＴＭＲＣＡ）を、１ｍｇ／ｍｌの濃度でカバーガラス上の細胞に加えた。細胞を１、４、８及び２４時間インキュベーションした。各時点の後、カバーガラスをＰＢＳ中で４回激しく洗浄した。過剰ＰＢＳを穏やかにふき取った後、２５０μｌの３．７％のパラホルムアルデヒドを用い、細胞を室温で１０分間固定した。次いで、カバーガラスをＰＢＳ中で更に３回洗浄し、水中に浸漬し、過剰な液体をふき取り、最後に細胞側を下にしてスライドガラス上に４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を伴うＰｒｏｌｏｎｇ ｇｏｌｄと共にマウントした。サンプルの乾燥を停止するため、透明なマニキュア液を慎重にカバーガラスのへり周辺に用いた。１晩のインキュベーションによりサンプルの適切な硬化を確実にし、次いでイメージングの準備が整った。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ−１０００倒立共焦点顕微鏡で顕微鏡実験を行った。用いたレーザー波長は、ローダミン及びＤＡＰＩのイメージングについて、それぞれ５６８ｎｍ及び４０５ｎｍであった。直接コントラスト（ＤＩＣ）も行って細胞膜を可視化し、その上で４０５ｎｍレーザーで励起した。一貫した比較を可能にするため、各ポリマー群内で、レーザー出力及び高電圧利得を比較的一定に保持した。標識ポリマーが細胞内側にあることを明確に示すため、画像を蛍光及びＤＩＣで解析した。

【0166】

細胞増殖／結合及び取り込み実験
ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}−ＴＭＲＣＡナノ粒子は、低濃度で大々的にＫＵ７−ｌｕｃ細胞に結合し、内在化されたが、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＴＭＲＣＡナノ粒子に関しては、１２．５μｇ／ｍｌ以下の濃度では、細胞結合又は細胞取り込みの証拠は観察されなかった（図２１Ａ）。当該ポリマーの強力な結合プロファイルは、おそらくは正に帯電したＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}ポリマーと負に帯電したＫＵ７−ｌｕｃ細胞膜との静電引力に起因する。しかし、ＨＰＧ類濃度が上昇するにつれ、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}−ＴＭＲＣＡナノ粒子の細胞への結合及び細胞取り込みは（２５μｇ／ｍｌで）飽和点に達した。その一方、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＴＭＲＣＡナノ粒子のＫＵ７−ｌｕｃへの細胞結合及び細胞取り込みは、濃度１２．５μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌの間で観察された直線的関係を伴って濃度依存的であり、続いてポリマー濃度がより高くなると結合及び取り込みがあまり顕著でなくなることがわかった（図２１Ａ）。飽和したＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}−ＴＭＲＣＡナノ粒子の挙動が、その細胞傷害効果に起因したか否かを評価するために、発明者らは、ＫＵ７−ｌｕｃ細胞の増殖に対するＨＰＧの影響を評価した。細胞を、空の（薬物をロードしていない）ＨＰＧ−Ｃ_{８／１
０}−ＭｅＰＥＧナノ粒子及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２ナノ粒子（０〜１５０μｇ／ｍｌ）に２時間曝露し、ＭＴＳアッセイにより細胞生存率を決定した。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧナノ粒子及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２ナノ粒子は、共に増殖に同様の影響を示し、試験した濃度ではＫＵ７−ｌｕｃ細胞株に生体適合性があった（図２１Ｂ）。従って、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＴＭＲＣＡナノ粒子及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}−ＴＭＲＣＡナノ粒子について観察された、細胞結合及び取り込みの差異は、ＫＵ７−ｌｕｃ細胞株に対するそれらの細胞傷害効果には起因しないようである。

【0167】

ローダミン標識ＨＰＧ類内在化の共焦点蛍光解析
共焦点顕微鏡を用い、細胞によりナノ粒子が内在化されたのか、又は単にＫＵ７−ｌｕｃの細胞膜に結合しただけなのかどうかをモニターした。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＴＭＲＣＡナノ粒子及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}−ＴＭＲＣＡナノ粒子は、両方とも迅速にＫＵ７−ｌｕｃ細胞によって内在化され、１時間のインキュベーションで完全な取り込みが達成された（データ示さず）。蛍光解析により、細胞質中のローダミン標識ＨＰＧ類の存在を観察した。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＴＭＲＣＡナノ粒子及び／又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}−ＴＭＲＣＡナノ粒子は、細胞質の至る所に存在することが観察され、単に細胞膜に接着しているか、又は細胞膜中に存在しているのとは対照的だった。ＫＵ７−ｌｕｃ細胞の核コンパートメント中に検出されたポリマー類由来の蛍光は無かった。核コンパートメント中にＨＰＧナノ粒子が無いことは、比較的大きなその分子量（＜８０ｋＤａ）に起因している可能性がある。全時点で、コントロールの細胞と比較すると、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＴＭＲＣＡナノ粒子及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}−ＴＭＲＣＡナノ粒子は、ＫＵ７−ｌｕｃ細胞の生存率及び有病率に影響しない。全体として、ローダミン標識ＨＰＧナノ粒子は、１時間のインキュベーションによりＫＵ７−ｌｕｃ細胞に取り込まれ、１、４、８又は２４時間の時点で取得した画像間で全く差異は無かった。

【0168】

実施例１８：ＨＰＧ類におけるＤＴＸのローディング及び定量並びにＨＰＧ類からのＤＴＸ放出
ＨＰＧ類におけるＤＴＸのローディング及び定量
薬物及びポリマーを共通の有機溶媒中に溶解し、溶媒を除去する溶媒蒸発法により、ＤＴＸをＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧＮＨ_{２（１２１）}にロードした。結果生じるポリマー／薬物マトリクスを、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で再構成した。結果生じる溶液は一般的に透明であったが、白色粒子が観察された場合は、溶液を遠心（１８０００ｇ、１０分間）し、上清を新たな容器に移した。

【0169】

ＨＰＧ類に組み込まれたＤＴＸ量は逆相ＨＰＬＣにより決定した。アセトニトリル、水及びメタノールの混合物（５８：３７：５，ｖ／ｖ／ｖ）を含有する移動相を有する対称Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａ−Ｐａｋ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用い、流速１ｍｌ／ｍｉｎで薬物含有量の分析を行った。注入サンプルの体積は２０μｌであり、検出はＵＶ検出器を用いて波長２３２ｎｍで行った。全ラン時間を５分に設定した。ＤＴＸの保持時間は２．９分であった。最大で、ＨＰＧ１分子当たり約５〜６のＤＴＸ分子に相当する５％（ｗ／ｗ）の薬物ロードが当該方法により達成された。ＤＴＸの水溶解度は７μｇ／ｍｌ程度であるが（Ｄｕ，Ｗ．；Ｈｏｎｇ，Ｌ．；Ｙａｏ，Ｔ．；Ｙａｎｇ，Ｘ．；Ｈｅ，Ｑ．；Ｙａｎｇ，Ｂ．；Ｈｕ，Ｙ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００７，１５，６３２３−６３３０；Ｌｉｇｇｉｎｓ，Ｒ．Ｔ．；Ｈｕｎｔｅｒ，Ｗ．Ｌ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９９７，８６，１４５８−１４６３）、ＤＴＸのＨＰＧ類への組み込みにより、当該薬物の水への溶解度がおおよそ１，０００倍増加した。

【0170】

ＨＰＧ類からのＤＴＸ放出
透析法により、ＨＰＧナノ粒子（ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}）からのＤＴＸ放出を決定した。簡単に述べると、１００ｍｇのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}を秤量して１ｍｌアセトニトリル溶液中で１ｍｇのＤＴＸと混合し、１５μＣｉの^３Ｈ−ＤＴＸでスパイクし、次いで窒素気流下で乾燥して溶媒を除去した。ＨＰＧ／ＤＴＸマトリクスを２ｍｌのＰＢＳで水和し、透析バッグに移して１００ｒｐｍで震盪しながら５００ｍｌの人口尿（ｐＨ６．５）に対して透析した。０．１Ｍ ＨＣｌを用いて溶液のｐＨを６．５に調整した。ヒト尿の生理学的ｐＨの範囲は、広範囲にわたってばらつき得る（ｐＨ４．５〜ｐＨ８）が、中央値は６．５なので、それを選択した（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｔ．；Ｋｅｅｖｉｌ，Ｃ．Ｗ．Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７，２４，２０３−２０６．）。種々の時点で、透析バッグの体積を測定し、透析バッグ中の残存放射活性の測定用にサンプル１０μｌを採取し、外部放出媒体全体を新鮮媒体と交換してシンクの状態を維持した。ベータシンチレーションカウンティング（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃａｎａｄａ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｇｕａ，ＯＮ）により、各時点において透析バッグ中に残存する^３Ｈ−ＤＴＸの濃度を決定した。実験開始時の初期薬物量から各時点で残存する薬物の量を差し引くことにより、放出された薬物（累積）のパーセントを算出した。データは時間に応じた放出薬物（累積）のパーセンテージとして表した。ＨＰＧ類からのＤＴＸ放出プロファイルでは、放出のバースト期がほぼ無いか、又は全く無い、継続的な放出制御が特徴であった（図２２）。おおよそ５５％の初期封入薬物が、インキュベーションの最初の２４時間以内に放出された。ＨＰＧ類表面上でのアミン基の存在によっては、薬物放出は影響されなかった（図２２）。

【0171】

実施例１９：同所性膀胱癌モデルにおける膀胱内ＤＴＸ製剤の評価
同所性膀胱異種移植片を有するマウスにおいて、膀胱内の、ＤＴＸをロードしたＨＰＧ製剤の寛容度及び有効性を評価した。用いた同所性マウスモデルは、Ｍｕｇａｂｅ，Ｃ．；Ｈａｄａｓｃｈｉｋ，Ｂ．Ａ．；Ｋａｉｎｔｈａｎ，Ｒ．Ｋ．；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．；Ｓｏ，Ａ．Ｉ．；Ｇｌｅａｖｅ，Ｍ．Ｅ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．ＢＪＵ Ｉｎｔ．２００９，１０３，９７８−９８６；Ｈａｄａｓｃｈｉｋ，Ｂ．Ａ．；Ｂｌａｃｋ，Ｐ．Ｃ．；Ｓｅａ，Ｊ．Ｃ．；Ｍｅｔｗａｌｌｉ，Ａ．Ｒ．；Ｆａｚｌｉ，Ｌ．；Ｄｉｎｎｅｙ，Ｃ．Ｐ．；Ｇｌｅａｖｅ，Ｍ．Ｅ．；Ｓｏ，Ａ．Ｉ．ＢＪＵ Ｉｎｔ ２００７，１００，１３７７−１３８４；Ｈａｄａｓｃｈｉｋ，Ｂ．Ａ．；ｔｅｒ Ｂｏｒｇ，Ｍ．Ｇ．；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．；Ｓｏｗｅｒｙ，Ｒ．Ｄ．；Ｓｏ，Ａ．Ｉ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．；Ｇｌｅａｖｅ，Ｍ．Ｅ．ＢＪＵ Ｉｎｔ．２００８，１０１，１３４７−１３５５に報告されている。動物実験は、すべてカナダ動物管理協会に従って行われて、動物管理プロトコールは、本発明者らの研究所（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）の動物管理委員会に承認されている。当該モデルにおいては、ルシフェラーゼを発現するＫＵ７−ｌｕｃ癌細胞を用いた。腫瘍接種用に、８週齢の雌性ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）をイソフルランで麻酔した。潤滑化２４ Ｇ Ｊｅｌｃｏ血管カテーテル（Ｍｅｄｅｘ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｔｄ．，Ｌａｎｃａｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を尿道を経て膀胱へ通す前に、巾着縫合を尿道口付近の表層に施した。１００μｌ ＰＢＳで膀胱を１回灌注した後、２百万のＫＵ７−ｌｕｃ細胞を、５０μｌの単一細胞懸濁液として注入し、巾着縫合を２．５時間結紮した。その間、マウスの麻酔を維持した。縫合糸を除去した後、マウスをケージ中に留置し、意識を取り戻して通常に排尿するまでモニターした。腫瘍接種後５日目に、以下の処理群：ＰＢＳ（コントロール）；タキソテレ（登録商標）（０．５ｍｇ／ｍｌ及び１．０ｍｇ／ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ ８０中ＤＴＸ）；ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ中ＤＴＸ（０．５ｍｇ／ｍｌ及び１．０ｍｇ／ｍｌ）；ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}中ＤＴＸ（１．０ｍｇ／ｍｌ）に従って、マウス２６匹を無作為に膀胱内注入処理（５０
μｌ及び滞留時間２時間）した。処理日にマウスを数時間モニターし、その後は日ごとにモニターした。毒性のいかなる兆候（特に、体重減少、食物及び水の摂取における変化、不活発状態、猫背の姿勢及び／又はストレスの巨視的兆候）も記録した。２４時間以内に回復しなかった疼痛又は疾病の徴候を示したマウスは屠殺した。ＩＶＩＳ ２００イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）によるマウスの非侵襲的なイメージングによって、２、８、１２及び１９日目に腫瘍負荷をモニターした。簡単に述べると、１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンをマウスに腹膜内注射し、イソフルランで麻酔し、ルシフェリン注射後ちょうど１５分で背臥位をイメージングした。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア バージョン２．５０（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いてデータを取得し解析した。

【0172】

腫瘍接種後２日目には、すべてのマウスに膀胱腫瘍が発症したが、生物発光イメージングにより証明された通り、２匹のマウスには腎臓腫瘍も発症した（図２３Ａ）。全体として、市販のタキソテレ（登録商標）製剤又はＨＰＧ類製剤のいずれかによる膀胱内ＤＴＸは、マウスにより十分に寛容された。深刻な毒性は観察されず、マウスは、すべて実験期間の終わりまで生存した。しかし、腫瘍接種後８日目に、何匹かのマウスが体重を約５％減少させたが、その後の週に回復した。体重減少は膀胱治療の、及び／又は治療後の日々の食料摂取及び水摂取が非常に少ないことの結果であり得る。しかし、体重減少には、異群間で有意差（ｐ＞０．０５）が無かった。

【0173】

０．５及び１．０ｍｇ／ｍｌを投与量に選択し、膀胱癌異種移植片を有するマウスにおいて、適切な膀胱内ＤＴＸの投薬計画を確立した。１．０ｍｇ／ｍｌ タキソテレ（登録商標）、０．５ｍｇ／ｍｌのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ中ＤＴＸ、１ｍｇ／ｍｌのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ及び／又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}のいずれかの１回投与で処理したマウスでは、腫瘍成長が強力に阻害された。腫瘍接種後１９日目には、タキソテレ（登録商標）（０．５ｍｇ／ｍｌ）処理群を除くすべての処理群で、ＰＢＳのコントロールに比較して統計的に有意な腫瘍抑制（ｐ＜０．００１，二元配置分散分析後、事後ボンフェローニ解析）が示された。すべての処理群で、タキソテレ（登録商標）（０．５ｍｇ／ｍｌ）処理群に比較して、統計的有意差があった（図２３Ｂ，ｐ＜０．０５，二元配置分散分析後、事後ボンフェローニ解析）。

【0174】

当該ナノ粒子の粘膜付着特性により、おそらくは、密着結合の変化又は尿路上皮の落屑に起因する、膀胱壁への薬物透過性亢進及び取り込み亢進をもたらす尿路上皮との密接な接触が増加すると考えられる。それらの非常に小さなサイズ（Ｒｈ＜１０ｎｍ）のために、ＨＰＧ類はムチン糖タンパク質を通して拡散し、膀胱壁又は腫瘍組織への、当該ナノ粒子のエンドサイトーシス亢進をもたらす、尿路上皮のアンブレラ細胞と直接相互作用すると思われる。

【0175】

低めのＨＰＧ類中ＤＴＸ注入投与量の有効性を評価するため、別の実験を行った。当該実験のため、１９日目に、ＩＶＩＳ ２００イメージングシステムによって決定された、見かけ上膀胱癌を有しないか、又は低レベルの生物発光を伴うマウスを用いた。全体で、１２匹のマウスが、別の上記腫瘍再接種に好適なことがわかった。以前の実験の１００％と比較して、腫瘍取り込みは約７５％であり、マウスに以前に同一細胞株を接種しているため、免疫応答に起因していると思われた（使用したのは無胸腺の免疫不全マウスであるが、当該マウスは依然、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞が特徴的である固有の局所免疫システムを有する）。再接種後膀胱腫瘍を発達させたマウス９匹から、２匹のマウスが更により大きい膀胱腫瘍（１０〜１００倍）を発達させた。腫瘍再接種後５日目に、膀胱腫瘍を発達させたマウスを無作為に２群に分け、ＤＴＸ（０．２ｍｇ／ｍｌ）をロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ（ｎ＝５）又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}（ｎ＝４）５０μｌを膀胱内に１回受容させた。腫瘍再接種後５、
１１及び１９日目に、マウスをイメージングした。膀胱内の、ＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}により、マウス腫瘍の成長は阻害されたが、ＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧでは、同じ濃度でそうはならなかった。腫瘍再接種後１１及び１９日目で、４匹のうち３匹のマウスには、ＤＴＸ（０．２ｍｇ／ｍｌ）をロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_{２（１２１）}ナノ粒子による１回の膀胱内処理の後、腫瘍成長の証拠は示されなかったが、ＤＴＸ（０．２ｍｇ／ｍｌ）をロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧナノ粒子で処理された５匹のうちの４匹のマウスには、膀胱腫瘍成長の証拠が示され、１匹のマウスには、更に腎臓腫瘍が発症していた（図２４）。再度述べるが、当該製剤はマウスに十分寛容され、これらの実験の間、深刻な毒性又は体重減少は生じなかった。

【0176】

実施例２０：ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞傷害性実験
ＫＵ７−ｌｕｃ細胞株、並びに低悪性度（ＲＴ４，ＭＧＨＵ３）及び抗悪性度（ＵＭＵＣ３）の両方のヒト尿路上皮癌細胞株に対する、市販製剤タキソテレ（登録商標）及びＤＴＸをロードしたＨＰＧ製剤の細胞傷害性効果を評価した。

【0177】

タキソテレ（登録商標）（Ｔｗｅｅｎ ８０中ＤＴＸ）はＳａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．（Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ）から購入した。ヒト膀胱癌細胞株のＲＴ４及びＵＭＵＣ３は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入した。１０％の熱非働化ウシ胎児血清を含有するマッコイ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）中で細胞を維持し、加湿５％ＣＯ_２雰囲気中、３７℃で保持した。ＭＧＨＵ３細胞はＹ．Ｆｒａｄｅｔ博士（Ｌ’Ｈｏｔｅｌ−Ｄｉｅｕ ｄｅ Ｑｕｅｂｅｃ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から、ご好意により寄贈していただいた。１０％ウシ胎児血清及び２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＭＥＭ中で維持した。ＫＵ７はＣ．Ｄｉｎｎｅｙ博士（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）より提供していただき、５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で維持した。可視化目的のため、ＫＵ７細胞を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するレンチウイルス（Ｇｒａｉｇ Ｌｏｇｓｄｏｎ博士（Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）による）に感染させ、当該サブクローンを以前記載（Ｈａｄａｓｃｈｉｋ ＢＡ，Ｂｌａｃｋ ＰＣ，Ｓｅａ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．ＢＪＵ Ｉｎｔ２００７；１００：１３７７−８４）した通りＫＵ７−ｌｕｃと命名した。

【0178】

９６−ウェルプレート中、体積１００μｌの１０％ＦＢＳを添加したマッコイ培地に５，０００細胞／ウェルで細胞をプレーティングし、新たに調製したタキソテレ（登録商標）溶液或いはＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ中及び／又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（ＰＢＳ，ｐＨ７．４中に溶解）中のＤＴＸを加える前に、２４時間平衡化させた。細胞を薬物製剤に２時間曝露し、注入療法についての現行の臨床基準を模倣して、以前報告（Ｍｕｇａｂｅ Ｃ，Ｈａｄａｓｃｈｉｋ ＢＡ，Ｋａｉｎｔｈａｎ ＲＫ，ｅｔ ａｌ．ＢＪＵ Ｉｎｔ ２００９；１０３：９７８−８６）した通り、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（ＭＴＳ）ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、７２時間後に細胞の生存率を決定した。各実験を３回繰り返し、すべての細胞株について、ＭＴＳ値が直線の吸収域内に収まった。

【0179】

すべてのＤＴＸ製剤により、試験した細胞株すべての増殖が濃度依存的に阻害された。より活発且つ迅速に増殖するＫＵ７−ｌｕｃ細胞株が、ＤＴＸ製剤に最も感受性であった。ＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２の細胞傷害性は、市販製剤タキソテレ（登録商標）と同様であることがわかった（図２５）。ＤＴＸ製剤のＩＣ_５０は、試験した細胞株すべてについて、ほんの数ナ
ノモラー（４〜１２ｎＭ）の範囲であった。コントロールのＨＰＧ類ナノ粒子（薬物なし）では、試験した濃度範囲にわたって細胞傷害性が示されなかった（１５〜１，５００ｎＭ，データ示さず）。ＨＰＧ類へのＤＴＸロードによっては、その細胞傷害性は影響されなかった。

【0180】

実施例２１：ｉｎ ｖｉｖｏ実験
マウス同所性膀胱癌モデルにおける膀胱内ＤＴＸの有効性
全部で４２匹のヌードマウスでｉｎ ｖｉｖｏの実験を行い、タキソテレ（登録商標）（０．２ｍｇ／ｍｌ）並びにＤＴＸ（０．２ｍｇ／ｍｌ）をロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ及び／又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２による１回の膀胱内処理の有効性を評価した。用いた同所性マウスモデルは、Ｈａｄａｓｃｈｉｋ ＢＡ，Ｂｌａｃｋ ＰＣ，Ｓｅａ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．ＢＪＵ Ｉｎｔ ２００７；１００：１３７７−８４；Ｍｕｇａｂｅ Ｃ，Ｈａｄａｓｃｈｉｋ ＢＡ，Ｋａｉｎｔｈａｎ ＲＫ，ｅｔ ａｌ．ＢＪＵ Ｉｎｔ ２００９；１０３：９７８−８６；Ｈａｄａｓｃｈｉｋ ＢＡ，ｔｅｒ Ｂｏｒｇ ＭＧ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．ＢＪＵ Ｉｎｔ ２００８；１０１：１３４７−５５；Ｈａｄａｓｃｈｉｋ ＢＡ，Ａｄｏｍａｔ Ｈ，Ｆａｚｌｉ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８；１４：１５１０−８；Ｈａｄａｓｃｈｉｋ ＢＡ，Ｚｈａｎｇ Ｋ，Ｓｏ ＡＩ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８；６８：４５０６−１０に報告されている。動物実験はカナダ動物管理協会に従って行った。１１週齢の雌性ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）をイソフルランで麻酔した。潤滑化２４ Ｇ Ｊｅｌｃｏ血管カテーテル（Ｍｅｄｅｘ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｔｄ．，Ｌａｎｃａｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を尿道を経て膀胱へ通す前に、６−０ポリプロピレンの巾着縫合を尿道口付近の表層に施した。ＰＢＳで膀胱を１回灌注した後、２百万のＫＵ７−ｌｕｃ細胞を、５０μｌの単一細胞懸濁液として注入し、巾着縫合を２．５時間結紮した。ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍負荷を定量するために、４、１１、１８及び２５日目に１５０ｍｇ／ｋｇルシフェリンを腹膜内注射し、１５分後に、ＩＶＩＳ２００イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ／Ｃａｌｉｐｅｒ
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）により動物を仰臥位でイメージングした。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いてデータを取得し、解析した。腫瘍接種後５日目に、無作為に、マウスの膀胱を５０μｌのＰＢＳ（コントロール）；タキソテレ（登録商標）（０．２ｍｇ／ｍｌ）；ＤＴＸ（０．２ｍｇ／ｍｌ）をロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ；及びＤＴＸ（０．２ｍｇ／ｍｌ）をロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２で１回処理した。生物発光レベルは群間で同等であったが、マウス個体間で腫瘍にばらつきがあるため、各マウスにおいて、統計解析のために処理後腫瘍の生物発光を４日目の初期フラックスに対して正規化した。腫瘍接種後２５日目に剖検を行った。膀胱全体を取り出し、１０％緩衝化ホルマリン中で固定してパラフィン中に包埋した。５μｍの切片を作製し、標準法を用いてＨ＆Ｅで染色した。スライドは、すべて調査し、ＢＬＩＳＳ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｂａｃｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｌｏｍｂａｒｄ，ＩＬ）上で走査した。

【0181】

ＫＵ７−ｌｕｃ癌細胞の膀胱内接種後、マウスはすべて膀胱腫瘍を発症した。しかし、ＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２群中のマウス１匹が、処理後４日目に予期せず死亡した。市販のタキソテレ（登録商標）製剤又はＨＰＧ類の製剤のいずれかで膀胱内に投与したＤＴＸは、全体的に、マウスによって十分寛容され、深刻な毒性は観察されなかった。

【0182】

コントロールマウスと比較して、ＤＴＸをロードしたＨＰＧ類では腫瘍成長が阻害された。しかし、ＫＵ７−ｌｕｃの同所性膀胱癌異種移植片においては、ＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２が、腫瘍成長を阻害する最も有効な製剤であり
、ＰＢＳコントロール群又はタキソテレ（登録商標）群のいずれかと比較すると、統計的に有意となった（図２６，Ｐ＜０．０１，二元配置分散分析後、事後ボンフェローニ解析）。実験の最後では、ＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２ナノ粒子の膀胱内注入（１回）により、ＰＢＳコントロール群と比較して、腫瘍成長は８８％阻害された。当該処理群においてＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧナノ粒子により、５４％の腫瘍阻害が示された。有効性の当該増大は、ＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２ナノ粒子で処理したマウスの膀胱及び腫瘍組織における薬物取り込み亢進に起因すると思われた。

【0183】

市販製剤タキソテレ（登録商標）は、当該同所性異種移植モデルにおいて、腫瘍成長を阻害しなかった。各処理群におけるマウスの代表的な生物発光の経時的画像を図２６中に示す。膀胱組織の組織学的な検証により、ＫＵ７−ｌｕｃの腫瘍は悪性の成長パターン及び高頻度の多病巣性を示したが、腫瘍接種から２５日後には、それらは全般的に固有層に限局し、且つ高悪性度のＴ１ステージの疾患と相関したことが示される（図２７）。ＤＴＸ（０．２ｍｇ／ｍｌ）では、ＰＢＳ処理と比較して、ＫＵ７−ｌｕｃ異種移植片において何ら顕著な組織学的変化が引き起こされなかったが、ＤＴＸ（０．２ｍｇ／ｍｌ）をロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ及び／又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２により、腫瘍成長が阻害された。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２にロードしたＤＴＸにより処理された腫瘍は、有意にサイズが減少し、細胞サイズ、核形状及び浸潤する炎症細胞が不均一であった。

【0184】

ＨＰＬＣにより、生物学的に活性のある部分をｄＨＰＧにロードするために用いる技法によって、送達システム中、薬物の目標量の±２０％を有すると評価され得る製剤を製造できるとも、決定された（表１１を参照）。

【0185】

【表11】

【0186】

図２８中に示す通り、パクリタキセル（ＰＴＸ）を組み込んだ製剤とＤＴＸを組み込んだ製剤とで比較を行った。両方の薬物に関して、それらをＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ等のｄＨＰＧに組み込むことにより、腫瘍の発光減少がもたらされるが、ＤＴＸを取り込んだｄＨＰＧの方が、パクリタキセルを取り込んだｄＨＰＧよりも効果的であった。

【0187】

健康な動物を用い、２つの時点を採用して同様の実験を繰り返した。図２９中に示した当該データにより、健康なマウスにおいては、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２を用いると、同量の薬物を送達するためにＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ又はタキソテレ（商標）を用いる場合よりも、膀胱中、経時的に見て、保持されるドセタキセルが多いことが証明される。アッセイの定量上限を超えるため、ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２についての結果は半定量的である。タキソテレ（商標）群及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥ
Ｇ群についての結果は定量的である。マウスには各々、体積５０μＬ中５０μｇの薬物を投与し、５０ｍｇのｄＨＰＧを用いた（１群あたりｎ＝３）。

【0188】

実施例２２：薬物取り込み実験
膀胱内ＤＴＸ製剤を受けて、膀胱組織中及び血清中の取り込みを評価するために、同所性膀胱腫瘍を有するマウスを、タキソテレ（登録商標）（０．２ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝３）又はＤＴＸ（０．２ｍｇ／ｍｌ）をロードした、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ（ｎ＝４）及び／又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（ｎ＝４）のいずれかで注入した。注入後２時間に、尿、膀胱組織及び血清中のＤＴＸ量を測定した。薬物取り込み実験は、樹立したＫＵ７−ｌｕｃの腫瘍を有する１５週齢の雌性ヌードマウス（腫瘍接種後３３日目）で行った。膀胱内注入後０、３０及び６０分で尾部血液サンプルを採取した。当該時間、マウスは依然、イソフルランで麻酔していた。２時間後、すべてのマウスをＣＯ_２を用いて窒息させて殺し、心穿刺により血液を更に除去した。血液サンプルをｍｉｃｒｏ−ｈａｅｍａｔｏｃｒｉｔ ｔｕｂｅｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）中又はｓｅｒｕｍ−ｓｅｐａｒａｔｏｒ ｔｕｂｅｓ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｎｓｏｎ）中で遠心し、血清を液体窒素中でさっと凍結した。各マウスの尿及び膀胱も回収し、膀胱は、凍結前に切開して内腔を露出させ、１０ｍｌＰＢＳで５回連続で激しく洗浄した。サンプルはすべて−８０℃で保存した。解析に用いたＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムは、Ｗａｔｅｒｓ ＴＱＤ質量分析計を用いた質量分析と共役した、統合化Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ分離システム（Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８，１．７μｍ，２．１ Ｘ ５０ｍｍカラム）から構成した。電子スプレーイオン源ブロックの温度１５０℃、脱溶媒和温度３５０℃、コーン電圧１４Ｖ、キャピラリー電圧０．７０ｋＶ、引出電圧３ｋＶ、ＲＦ電圧０．１ｋＶ、コーンガス流２５ｌ／ｈ、脱溶媒和ガス流６００ｌ／ｈ及び衝突ガス流量０．２ｍｌ／ｍｉｎでシステムを作動させた。陽イオンモードにおいて、分子を電子スプレーでイオン化した。以前確立したとおり（Ｍｕｇａｂｅ Ｃ，Ｌｉｇｇｉｎｓ ＲＴ，Ｇｕａｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ２０１１；４０４：２３８−４９）、ｍ／ｚ ８０８．５→５２７．２の遷移をモニターする複合反応において、ＤＴＸを定量した。溶媒／溶媒抽出法によって、マウス血清からＤＴＸを抽出した。９６−ウェルプレートにおいて、マウス血漿及び標準液の５０μｌアリコートをアセトニトリル中の０．１％ギ酸１５０μｌと混合し、室温で１分間ボルテックスした。サンプルを４℃１０分間、５，５００ｒｐｍで遠心した（Ａｌｌｅｇｒａ（商標）２５ Ｒ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）。上清１００μｌと蒸留水５０μｌとを混合し、混合して３０秒間ボルテックスした。膀胱組織を計量し、ジルコニアビーズ（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）及びミクロバイアルホルダーを備えたｍｉｎｉ−ｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて０．１％ギ酸／メタノール中で６０秒間ホモジェナイズした。サンプルを４℃で２分間、１４，０００ｒｐｍで遠心した（Ａｌｌｅｇｒａ（商標）２５ Ｒ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）。メタノール中０．１％トリフルオロ酢酸１５０μｌをサンプルに加え、混合及び４℃で１５分間、１４，０００ｒｐｍでボルテックスした（Ａｌｌｅｇｒａ（商標）２５ Ｒ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）。サンプルの解析は、すべてＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて行った。スパイクしたコントロールサンプルからの回収率は９７％で、ＤＴＸの検出限界は１０ｎｇ／ｍｌであった。すべての場合において、ランの精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）（％ＲＳＤ）は１５％未満の範囲内であった。

【0189】

タキソテレ（登録商標）で注入したマウスでは、すべての時点で、血清中ＤＴＸが検出不能であった。ＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２は、２時間の時点で、血清中最高レベルを示した（１５０．８７±３４．９８対２３．９７±１６．７１ｎｇ／ｍｌ，Ｐ＜０．０１，二元配置分散分析，ボンフェローニ事後検定）。しかし、ＤＴＸの血清中濃度は、尿及び膀胱組織中の濃度よりも数桁程度低かった（表１２）。
ＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２は、タキソテレ（登録商標）又はＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧと比較して、膀胱組織内蓄積が有意に高くなっていた（Ｐ＜０．００１，一元配置分散分析，ボンフェローニの多重比較検定）。タキソテレ（登録商標）処理群とＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ処理群とでは、胱組織蓄積において統計的な有意差は無かった（Ｐ＞０．０５，一元配置分散分析）。尿中の最終濃度は初期の投与溶液よりも約５〜７倍低かった。これは、２時間の膀胱内注入の間の尿希釈に起因した。しかし、ＤＴＸの尿中最終濃度において、異なる処理群の間に有意差は無かった（Ｐ＞０．０５，一元配置分散分析）。各群とも、局所的又は全身的毒性は観察されなかった。

【0190】

【表12】

【0191】

実施例２３：腫瘍微環境及びローダミン標識ＨＰＧ類取り込みの評価
膀胱腫瘍微環境及び腫瘍組織へのローダミン標識ＨＰＧ類分布を評価した。

【0192】

ＨＰＧ類のローダミン標識
ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧポリマー類及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２ポリマー類を、以前報告（Ｓａｖｉｃ Ｒ，Ｌｕｏ Ｌ，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ Ａ，Ｍａｙｓｉｎｇｅｒ Ｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３；３００：６１５−８；Ｍｕｇａｂｅ Ｃ，Ｌｉｇｇｉｎｓ ＲＴ，Ｇｕａｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ２０１１；４０４：２３８−４９）した通り、テトラメチル−ローダミン−カルボニル−アジド（ＴＭＲＣＡ）で共有結合的に標識した。同所性膀胱腫瘍（腫瘍接種後３３日目）を有する１５週齢の雌性ヌードマウスをイソフルランで麻酔した。６／０ポリプロピレンの巾着縫合を尿道口付近の表層に施し、膀胱を手で圧縮して空にした。ゲージ２４の潤滑化Ｊｅｌｃｏ血管カテーテルを尿道を経て膀胱へ通し、次いで５０μｌのＰＢＳ、遊離型ローダミン（ＴＭＲＣＡ）、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＴＭＲＣＡ及び／又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２−ＴＭＲＣＡのいずれかを注入し、巾着縫合を２
時間結紮し、その間、マウスの麻酔を維持した。２時間後、巾着縫合を除去し、膀胱を用手圧迫により空にし、１５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ６．０）で２回洗浄した。マウスを安楽死させ、膀胱を切除してアルミブロック上で凍結し、次いで凍結切片作製のためＯＣＴ中に包埋した。膀胱の境界から１、２及び３ｍｍの距離で１０μｍの凍結切片を切った。切片を室温で乾燥し、１０ｘの対物レンズ（０．７５μｍ／ピクセルの解像度）を用いて、ローダミン蛍光についてイメージングした。スライドを１：１のアセトン：メタノール溶液中で１０分間固定し、特注の毛管現象染色器を用いてＣＤ３１（１：５０のハムスター抗ＣＤ３１（抗ハムスターＡｌｅｘａ ６４７（二次）を伴う）及びＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（核染色色素）について染色した。ＣＤ３１及びＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２の蛍光イメージング後、切片をヘマトキシリンで軽くカウンター染色し、マウントして明視野でイメージングした。

【0193】

画像解析：Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアにおいて扱いやすさを向上させるため、イメージの画像解像度を１．５μｍ／ピクセルに減少させた。次いで、ユーザー指定のアルゴリズムにより、画像スタックを作り出し、配列させ、腫瘍境界でトリミングしてアーティファクトを除去した。ヘマトキシリン像に基づいて、更に壊死をトリミングした。膀胱内腔を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２像上の腫瘍組織境界に沿って、人為的にトレースした。ユーザー指定の解析マクロを実行し、以下のタイプのデータ：ａ）閾値：陽性の染色を含むが、壊死領域の外側のバックグラウンドを取らないよう、手動で決定した；マクロは、当該閾値を満たすか、又は超える陽性ピクセル数を決定する。腫瘍切片全体についての平均として報告された。ｂ）強度：腫瘍組織全体についての平均染色強度或いは二次染色（即ち、ＣＤ３１）又は人為的にトレースした境界（膀胱内腔）からの距離に基づいて選別したピクセルの平均強度として報告された。平均±標準誤差を決定するために算出を行い、マイクロソフトエクセルを用いてグラフ表示を作り出した。Ｐｒｉｓｍ ｖ５ ｆｏｒ
Ｍａｃｓソフトウェアを用いて統計解析（分散のノンパラメトリック解析（クラスカル−ウォリス検定））を行った。

【0194】

膀胱腫瘍微環境及び腫瘍組織内のローダミン標識ＨＰＧ類の分布を評価した。膀胱腫瘍組織には血管が高度に発達しており、直近の血管までの平均距離が４０〜６０μｍであった（図３０Ａ）。異群間で有意差（Ｐ＝０．８）は見られ無かった。膀胱腫瘍全体の内側の蛍光量を測定した。他の群と比較して、ローダミン標識ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２−ＴＭＲＣＡ）が最も高い腫瘍取り込みを示した（Ｐ＝０．０３７）。遊離型ローダミン（ＴＭＲＣＡ）を注入した膀胱とローダミン標識ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧを注入した膀胱とでは、腫瘍の取り込みに有意差（Ｐ＞０．０５）は無かった（図３０Ｂ）。腫瘍組織へのローダミン取り込みの深さプロファイルを、膀胱内腔からの距離に応じて評価した。内腔からのすべての距離において、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２−ＴＭＲＣＡナノ粒子の腫瘍取り込み亢進が証明され、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＴＭＲＣＡナノ粒子よりも５〜６倍増加していることが示された（図３０Ｃ）。

【0195】

実施例２４：ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＣＯＯＨの合成及び特性解析
本発明者らの報告（Ｋａｉｎｔｈａｎ，Ｒ．Ｋ．；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００８，１９，２２３１−２２３８）に記載したプロトコール従い、Ｏ／ＤＧＥコアを修飾したＨＰＧ類の重合を実施した。以前報告したプロトコール（Ｈａｘｔｏｎ，Ｋ．Ｊ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．２００８，５８７２−５８７５）に従い、カルボン酸基によるＣ_８／１０コア修飾ＨＰＧ類の機能化を行った。典型的な反応については、５．０ｇのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＯＨ又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５を１００ｍＬのピリジン中に溶解し、溶液を窒素雰囲気下に保持し、続けて、ＨＰＧ類上カルボン酸基の標的量に応じて調整したジメチルアミ
ノピリジン及び無水コハク酸を加えた。最高量のＣＯＯＨ基でＨＰＧを合成するため、利用可能なすべての遊離ヒドロキシル基を、カルボン酸塩への修飾の標的とした。従って、過剰量のジメチルアミノピリジン（０．０７５ｇ，０．６１ｍｍｏｌ）及び無水コハク酸（４．５ｇ，４５ｍｍｏｌ）を反応液に加えた。遊離ヒドロキシル基の理論モル数を算出することにより、ＨＰＧ１モル当たり３４８モルの遊離ヒドロキシル基があり、理論的にＨＰＧ１モル当たり同数のカルボキシル基があると決定した。従って、結果生じるＨＰＧをＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８と表示した。少量のジメチルアミノピリジン（０．０１５ｇ，０．１２ｍｍｏｌ）と、無水コハク酸（０．９ｇ，９ｍｍｏｌ）を用いることにより、遊離ヒドロキシル基がすべて修飾の標的とされるわけではないＨＰＧ類を生成した。反応混合物に加えた無水コハク酸のモル数を算出することにより、ＨＰＧに加えたカルボキシレート基の理論数を決定した。従って、当該カルボン酸塩含量が低いＨＰＧをＨＰＧＣ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３と表示した。ジメチルアミノピリジン及び無水コハク酸を加えた後、マグネティックスターバーを用いて、溶液を室温で１晩攪拌した。脱イオン水（１００ｍＬ）をフラスコに加え、混合物を３０分間攪拌したままにした。共沸蒸留によってピリジンの蒸発をよりよくできるようにするために周期的に水を加え、回転蒸発によって溶媒を除去した。最終生成物をメタノール中に溶解し、酢酸セルロース透析管（ＭＷＣＯ １００００ｇ／ｍｏｌ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｕｎｇｕｅｚ，ＣＡ）を用いて、３日間、８０：２０のメタノール／脱イオン水混合物に対して透析した。８時間ごとに透析媒体を変え、透析媒体が水１００％である最後の３段階時まで、各回でメタノール濃度を低下させた。凍結乾燥により、ポリマー類を取得した。

【0196】

HPG-C_8/10-MePEG-COOHの¹³C NMR (400 MHz, methanol-d₄) δ_C: 0 (テトラメチルシラン, 内部基準), 14.73 (CH₃, O/DGE上のalkyl), 23.92-33.24 (C(O)CH₂CH₂COOH), 48.51-49.86 (溶媒, メタノール-d₄), 59.29 (CH₃O-MePEG), 64.19-65.36 (-CH₂OH, ポリマー中
の未反応一級アルコール基), 69.98-73.74 (-CH₂-O-, ポリマー中-CH-O), 78.93-80.14 (ポリマー中のCH), 173.84-174.16 (C(O)CH₂CH₂COOH), 175.92 (C(O)CH₂CH₂COOH).

【0197】

官能基を有するＨＰＧ類の調製においては、すべて、ＭｅＰＥＧ及びＣＯＯＨ基の目標量を反応混合物に加えた。様々な官能基を有するＨＰＧ類のＭｅＰＥＧ及びＣＯＯＨの目標量を表１３中に集約する。多くのカルボン酸塩で官能基化したＨＰＧ類及び少ないカルボン酸塩で官能基化したＨＰＧ類の反応収率は、それぞれ８４％及び７４％であった。ＨＰＧポリマー類は、以下の命名法：ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧＡ−ＣＯＯＨＢ（式中、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０はアルキルで置換したＨＰＧを表し、Ａは、試薬の化学量論（ＭｅＰＥＧのモル／ＴＭＰ開始剤のモル）に基づく、ポリマーにコンジュゲートされたＭｅＰＥＧの目標含量であり、そしてＢは、ＧＰＣのデータから算出したポリマーの分子量に基づく、ＨＰＧポリマー１モル当たりの予想ＣＯＯＨのモル含量である）によって記載する。

【0198】

【表13】

【0199】

ＮＭＲ解析
精製後、ＨＰＧ類は、すべてＮＭＲにより特性解析した。４００ ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩ＋ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｔｏｎ，ＯＮ）を用いてＨＰＧポリマー類のＮＭＲスペクトルを取得した。ポリマー類をＤＭＳＯ−ｄ_６又はメタノール−ｄ_４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）中に溶解した。一次元のプロトンスペクトル及び炭素スペクトルを取得し、二次元の、多重度編集異核種単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）ＮＭＲ実験、異核間多結合相関（ＨＭＢＣ）ＮＭＲ実験、及びＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ（全相関分光）ＮＭＲ実験も同様にした。化学シフトは残存溶媒のピークを基準にした。Ｓｐａｒｋｙ（Ｔ．Ｄ．Ｇｏｄｄａｒｄ ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｋｎｅｌｌｅｒ，Ｓｐａｒｋｙ ３，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）を用いて二次元スペクトルを解析した。ＨＳＱＣのデータから、ＨＰＧ類上のＣＯＯＨのモル比を、以下の通り推定した：各修飾について、メチレンのプロトン４つに対応するピークを積分し、その積分をプロトン数に関して補正した。当該値を、ＴＭＰメチル基の積分（プロトン多重度に関して補正）で除し、ＣＯＯＨのモル比を得た。

【0200】

図３１から、官能基を有するＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨポリマー類のピークすべてが、ＨＰＧ類の構造成分にアサインされたことが理解できる（Ｋａｉｎｔｈａｎ，Ｒ．Ｋ．；Ｍｕｇａｂｅ，Ｃ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００８，９，８８６−８９５；Ｋａｉｎｔ
ｈａｎ，Ｒ．Ｋ．；Ｊａｎｚｅｎ，Ｊ．；Ｋｉｚｈａｋｋｅｄａｔｈｕ，Ｊ．Ｎ．；Ｄｅｖｉｎｅ，Ｄ．Ｖ．；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００８，２９，１６９３−１７０４；Ｈａｘｔｏｎ，Ｋ．Ｊ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．２００８，５８７２−５８７５）。ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ及びＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹを用い、ピーク体積の積分を用いてＨＰＧ類上の置換基、Ｃ_８／１０アルキル鎖、ＭｅＰＥＧ及びＣＯＯＨの比を推定した。

【0201】

分岐の程度及び重合化の程度
超分岐ポリマー類は、典型的に、以下の方程式：

【0202】

【数1】

【0203】

（式中、ＤＢは分岐の程度、Ｄ、Ｌ_１３及びＬ_１４はデンドリティックユニット、リニア１−３ユニット、リニア１−４ユニットの比を表す）を用いて、分岐の程度（ＤＢ）及び重合化の程度（ＤＰｎ）により特性解析される（Ｈｏ¨ｌｔｅｒ，Ｄ．；Ｂｕｒｇａｔｈ，Ａ．；Ｆｒｅｙ，Ｈ．Ａｃｔａ Ｐｏｌｙｍ．１９９７，４８，３０−３５）。超分岐構造中に存在するグリシドールのデンドリティックなリピートユニット及びリニアなリピートユニットの構造を図３２中に集約する。更に、当該ポリマー類についての、重合化の程度（ＤＰｎ）は、以下：

【0204】

【数2】

【0205】

（式中、Ｄ、Ｌ_１３及びＬ_１４は上記の通り定義され、Ｔはターミナルユニットの比を表し、ｆｃはコア分子の官能基化（ＴＭＰについては、３である）のように計算する（Ｓｕｎｄｅｒ，Ａ．；Ｈａｎｓｅｌｍａｎｎ，Ｒ．；Ｆｒｅｙ，Ｈ．；Ｍｕ¨ｌｈａｕｐｔ，Ｒ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９９９，３２，４２４０−４２４６）。Ｄは一次ユニット及び二次ユニットの和によって得られ、Ｄｐ及びＤｓ（図３２を参照）、並びにＬ_１３、Ｌ_１４及びＴは同様に定義される。

【0206】

２Ｄ ＨＭＢＣ実験及びＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ実験の組合せを用いる場合は、一次及び二次のＬ_１３、Ｌ_１４、Ｔ及びＤのユニットを未修飾ＨＰＧポリマー（基準物質として合成されて、Ｃ_８／１０アルキル成分を含有せず、ＭｅＰＥＧの添加又はカルボキシル修飾が無い、データ示さず）に関してアサインし、多重度−編集ＨＳＱＣからのピーク体積を用いてＤＢ及びＤＰｎを算出した。未修飾ＨＰＧについて得られた本発明者らの結果は、ＤＢ）０．５１及びＤＰｎ）１４．８３であり、構造ユニットについての相対存在量は、リニアユニットについて３９％、デンドリティックユニットについて２０％、そしてターミナルユニットについて４１％である。当該値は、文献の値（Ｓｕｎｄｅｒ，Ａ．；Ｈａｎｓｅｌｍａｎｎ，Ｒ．；Ｆｒｅｙ，Ｈ．；Ｍｕ¨ｌｈａｕｐｔ，Ｒ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９９９，３２，４２４０−４２４６；Ｈｏ¨ｌｔｅｒ，Ｄ．；Ｂｕｒｇａｔｈ，Ａ．；Ｆｒｅｙ，Ｈ．Ａｃｔａ Ｐｏｌｙｍ．１９９７，４８，３０−３５）とよく一致している。Ｃ_８／１０アルキル鎖で修飾したＨＰＧ（ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＯＨ）のＨＳＱＣスペクトルを未修飾ＨＰＧのＨＳＱＣスペクトルと比較すると、前者のポリマーコアのスペクトル領域中、２つの新たなピークが見える（図３３）。１つのピークは
脂肪族鎖のＲ−メチレン基にアサインされるが、もう１つのピークは明確にアサインすることができなかった。化学シフトに基づき、当該ピークは、２級ヒドロキシル基に結合した１本のアルキル鎖を伴うＴユニットに対応し得るが、この考察は確認できない。ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ_６．５についても、同様の状況が観察された。ＭｅＰＥＧのＲ−メチレン基からのピークはアサインできたが、未知のピークは明確にアサインできなかった。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＯＨと同様に、新たなピークの化学シフトは、Ｌ_１４様のユニットに類似している。まとめると、ＤＢ及びＤＰｎは、シグナルの明確なアサインメントが無いために、ＮＭＲデータから算出できなかった。ＮＭＲデータにより、リニアユニット又はターミナルユニットの観察を通して遊離ヒドロキシル基を直接的に特性解析すること、並びに予想された分岐パターン及び修飾（アルキル、ＭｅＰＥＧ及びカルボキシル）が存在することを、すべて確認することが可能となる。図３３でＮＭＲスペクトル中のアサインされた様々なピークを説明し、予想された分岐パターン、ＭｅＰＥＧ、アルキル鎖及びＣＯＯＨ基の存在を示す。

【0207】

ＣＯＯＨのモル比
ＣＯＯＨで修飾されたすべてのＨＰＧポリマー類について、ＨＳＱＣ ＮＭＲスペクトルからＣＯＯＨのモル比を推定した。当該方法による、ＨＰＧポリマー中のＣＯＯＨ数は、サンプル中に存在するＴＭＰのメチル基に対して相対的に表現されるため、絶対数ではない。各ＨＰＧ分子は、ＴＭＰを１つだけ含有すると仮定するが、様々なポリマーバッチ中での、ＨＰＧ１モル当たりのＴＭＰ量を、独立して定量してはいない。従って、当該数は、どのくらい多くのヒドロキシル基がＣＯＯＨで覆われているかの定性的指標としての役割を果たす。更に、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨポリマー類は、両方同一のＨＰＧＣ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５のバッチから合成するため、ＴＭＰ含量は同一と予想し、２つのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨポリマー類における相対的ＣＯＯＨ量を決定するために、ＮＭＲスペクトルを比較し得る。モル比は、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３と比較して、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８中では２．８倍多くのＣＯＯＨ含量であることを示す。これは２つのポリマー類における目標ＣＯＯＨ含量の比の３．１倍とよく一致する。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＣＯＯＨポリマー類及び高カルボニル密度のＨＰＧＣ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８ポリマー類については、リニアユニット又はターミナルユニットに対応するピークは観察されないが、このことは当該ポリマー中にはヒドロキシル基が存在しないことを示す（代表的なＮＭＲスペクトルについては、図３４を参照）。低密度ＣＯＯＨポリマー、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３については、リニア基及びターミナル基のピークが、新たなピークに加えて観察されるが、このことは、カルボン酸によって、一部のみのヒドロキシル基が飽和しているこを示している（データ示さず）。

【0208】

ＦＴ−ＩＲ
汎用ＡＴＲサンプリング装備品を伴うＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＦＴＩＲ分光計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｏｏｄｂｒｉｄｇｅ，ＯＮ）を用いて、ＨＰＧ類のＦＴ−ＩＲスペクトルを取得した。走査範囲は４０００〜６５０ｃｍ^−１で、分解能は４ｃｍ^−１であった。

【0209】

ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３のＦＴ−ＩＲスペクトルを図３５中に示す。２８００〜３０００ｃｍ^−１でのピークは、Ｃ−Ｈ振動と一致しており、すべてのＨＰＧ類で生じた。１６８０〜１７８０ｃｍ^−１でのピークはＣｄＯバンドから生じたが、このことは、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＣＯＯＨポリマー類においてＣＯＯＨ基が存在することを示す。１２００〜１４００ｃｍ^−１及び１０００〜１１８０ｃｍ^−１でのピークは、それぞれＣ−Ｈ屈曲及びＣ−Ｏ振動から生じてお
り、従ってそれらは、当該ポリマー類すべてにおいて見出され得る。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−Ｍｅ−ＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８のＦＴ−ＩＲスペクトルを比較することにより、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＣＯＯＨにおけるＯＨピーク（３３００〜３５００ｃｍ^−１）が減少し、ＣｄＯピーク（１６８０〜１７８０ｃｍ^−１）が現れることが理解できるが、このことにより、ＯＨ基が消費され、ＣＯＯＨに変換されたことが示される。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８のスペクトルにより、ＯＨピークがほぼ除かれていることが示されたが、このことにより、ＯＨ基は大体消費されてＣＯＯＨに変換されたことが示される。一方、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３についてのＯＨピークは、減少はするが依然明らかであり、ＮＭＲの結果と一致した。更に、後者のＨＰＧも小さなＣｄＯピークを示すが、このことにより、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８と比較してＣＯＯＨのモル比が低いことが示される。ＦＴ−ＩＲのデータにより、ＨＰＧ類の官能基化における変化を裏付けるよい証拠が示され、また、精製手順により未反応試薬が除かれたことが確認された。

【0210】

分子量
ＤＡＷＮ−ＥＯＳ多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器を備えたゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）（ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ）及びＯｐｔｉｌａｂ ＲＩ検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）によってＨＰＧ類の重量平均分子量（Ｍｗ）及び多分散性を決定した。流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで、０．１Ｎの硝酸ナトリウム水溶液を移動相として用いた。詳細は以前の報告（Ｋａｉｎｔｈａｎ，Ｒ．Ｋ．；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００８，１９，２２３１−２２３８；Ｋｕｍａｒ，Ｋ．Ｒ．；Ｋｉｚｈａｋｋｅｄａｔｈｕ，Ｊ．Ｎ．；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００４，２０５，５６７−５７３）中に記載している。様々なＨＰＧ類に関してのｄｎ／ｄｃ値は、０．１Ｎ ＮａＮＯ_３水溶液中、ＨＰＧＣ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３について、それぞれ０．１４６、０．１６５及び０．１３８と決定し、ポリマー類の分子量の算出に用いた。Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．により提供されたＡｓｔｒａソフトウェアを用いてデータを処理した。ＭｗをＰＤＩで除することにより、ポリマー類の数平均分子量を算出した。

【0211】

当該ＨＰＧ類の分子量及び多分散性を表１３中に示す。官能基化ＨＰＧ類（ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ）の分子量は、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５と比較して増大していることが示された。更に、表面官能基化後には、ポリマー類の多分散性は大きく改変しないことがわかったが、このことにより、表面修飾が比較的一様なことが示される。分子量値は、以前報告したＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧのもの（Ｋａｉｎｔｈａｎ，Ｒ．Ｋ．；Ｍｕｇａｂｅ，Ｃ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００８，９，８８６−８９５；Ｋａｉｎｔｈａｎ，Ｒ．Ｋ．；Ｊａｎｚｅｎ，Ｊ．；Ｋｉｚｈａｋｋｅｄａｔｈｕ，Ｊ．Ｎ．；Ｄｅｖｉｎｅ，Ｄ．Ｖ．；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００８，２９，１６９３−１７０４；Ｍｕｇａｂｅ，Ｃ．；Ｈａｄａｓｃｈｉｋ，Ｂ．Ａ．；Ｋａｉｎｔｈａｎ，Ｒ．Ｋ．；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．；Ｓｏ，Ａ．Ｉ．；Ｇｌｅａｖｅ，Ｍ．Ｅ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．ＢＪＵ Ｉｎｔ．２００９，１０３，９７８−９８６；Ｋａｉｎｔｈａｎ，Ｒ．Ｋ．；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００８，１９，２２３１−２２３８）に類似していた。

【0212】

ＣＯＯＨ基の滴定
Ｔ−５０ Ｍ ｔｉｔｒａｔｏｒ（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ，Ｍｉｓｓｉｓｓａ
ｕｇａ，ＯＮ）において、ＣＯＯＨを表面移植したＨＰＧ類の全濃度を定量するため、電位差／ｐＨ滴定を行った。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８のサンプル及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３のサンプルを、１０ｍＬの１０ｍＭ ＮａＯＨ中に０．２ｍｇ／ｍＬで溶解した。各溶液のｐＨを、０．１Ｍ
ＮａＯＨを加えることにより、手操作で最大おおよそ１１に増大させた。次いで、０．０１Ｍ ＨＣｌによりサンプルを滴定した。ダイナミックレンジ１０〜５０μＬ及び注入間の時間間隔３０〜６０秒で注入を設定し、確実に平衡状態を確立した。ｐＨが一旦３．０に到達すると、滴定を終了した。標準的な補外／交差法を用いて、滴定のエンドポイントを決定した。報告したＣＯＯＨ滴定値は、３回の測定の平均を表す。

【0213】

電位差／ｐＨ滴定（表１３）によりＨＰＧ類にコンジュゲートしたＣＯＯＨ基のモル比を測定した。目標モル比及び測定分子量とよく一致していることが示された。例えば、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５の数平均分子量（６．３×１０^４）を、ＣＯＯＨ基に帰する分子量（カルボン酸塩の分子量（１０１ｇ／ｍｏｌ）を乗じた、ＨＰＧ１分子当たりのカルボン酸塩数（滴定データから８７）に等しい）と足すことによってもＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３の分子量を算出できる。当該計算に基づくと、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３の数平均分子量は７．２×１０^４ｇ／ｍｏｌであり、測定値（７．０×１０^４ｇ／ｍｏｌ）とよく一致する。

【0214】

溶解度
ＨＰＧポリマー類の溶解度特性は、既知の重量のポリマーを様々な水性緩衝液又は蒸留水に溶解することにより評価した。サンプルを穏やかにボルテックスして溶解速度を上げた。濁りの徴候について、ポリマー溶液の５５０ｎｍの吸光度を、数日間定期的に測定し、ポリマーが溶液中に残存しているか否かを評価した。カルボン酸で誘導体化したＨＰＧポリマー類のいくつかについては、溶液のｐＨを調整して溶解を促進した。

【0215】

ナノ薬物輸送体の能力が潜在的にあるため、当該ポリマー類の水性媒体中の溶解度特性は重要である。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧポリマーの水溶性は、蒸留水、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）及び合成尿中で良好である（１００ｍｇ／ｍＬを上回る）ことがわかった。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＣＯＯＨは、中性ｐＨでのイオン化減少のため、水性媒体又はＰＢＳ（ｐＨ７．４）中では実質的に不溶性であり、０．１Ｍ ＮａＯＨ等のアルカリ溶液中でのみ可溶性であることがわかった。ＨＰＧコアの疎水性成分（アルキル鎖）が、溶解度特性を支配するようであった。カルボン酸塩で誘導体化し、ＭｅＰＥＧ基ともコンジュゲートしたＨＰＧ類は、水溶性の増大を示した。従って、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３は、加熱無しで、１００ｍｇ／ｍＬの濃度で１０ｍＭ ＰＢＳに完全に溶解し得るが、溶液のｐＨは７．４から４．５に低下することがわかった。より多量のカルボン酸塩を伴うＨＰＧ（ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８）は、水又はＰＢＳ緩衝液における溶解が不十分で、ＰＢＳ緩衝液の緩衝能を超えて酸性化をもたらし、ｐＨを７．４からおおよそ３．８に低下させた。５５０ｎｍでの吸光度測定の通り、溶液は有意な濁度を示した（データ示さず）。このことにより、ポリマーの不溶性残渣画分が実証される。１００ｍｇ／ｍＬの濃度及びｐＨ４．２５での溶液の透明化を達成するためには、水酸化ナトリウムを加える必要があった。

【0216】

粒子サイズ及びゼータ電位
粒子サイズ及びゼータ電位の解析は、ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ ｓｉｚｉｎｇ ｃｕｖｅｔｔｅを用いたＭａｌｖｅｒｎ ＮａｎｏＺＳ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｕ．Ｋ．）を用いて行った。濃度１５ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を１ｍＭ ＮａＣｌ中にｐＨ６．０で調製し、測定前に０．２２μｍのシリンジフィルター（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）で濾過した。

【0217】

末端がカルボキシルのＨＰＧポリマー類は、粒子サイズが５〜１０ｎｍの範囲であった（表１３）。ナノ粒子のゼータ電位は、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８について、それぞれ−４１．２±３．２ｍＶ及び−６０．３±２．１ｍＶであり、強い負であった。ゼータ電位の低下は、ＨＰＧ類表面にコンジュゲートしたカルボキシル基数に起因する。

【0218】

実施例２５：ＨＰＧ類へのシスプラチンの結合
０．０１Ｍ ＮａＯＨ中１０ｍｇ／ｍＬのポリマー類溶液を調製することにより、カルボン酸塩で修飾したＨＰＧ類へのシスプラチンの結合を評価した。薬物の最終濃度が０．５〜４ｍｇ／ｍＬの範囲となるように、当該溶液へシスプラチンを加えた。少量の５Ｍ ＮａＯＨにより、各溶液のｐＨを６．０に調製した。溶液を５０ｒｐｍで震盪しつつ、３７℃で一晩インキュベーションした。溶液をＮａｎｏｓｅｐ ３Ｋ Ｏｍｅｇａ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅｓ （Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）に移し、５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。少量の濾液（１０〜４０μＬ）を０．０１Ｍ ＮａＯＨで４００μＬに希釈し、以前に記載のｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤＡ）ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ
ａｓｓａｙ （Ｈａｘｔｏｎ，Ｋ．Ｊ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．２００８，５８７２−５８７５）により、濾液中の未結合シスプラチン濃度をアッセイした。ＨＰＧに結合したシスプラチンの濃度を、ＨＰＧに最初に加えた薬物の濃度から濾液中で見出した未結合シスプラチンの濃度を差し引くことにより決定した。

【0219】

シスプラチンのＨＰＧ類への結合は、ポリマー上の末端カルボキシレート基への薬物の配位結合により達成した（図３６）。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３に関しては、シスプラチンは、ほぼ１００％の効率で、最大１ｍｇ／ｍＬ（１０％ｗ／ｗ；図３７）でポリマーに結合した。当該濃度を上回ると、濾液中に遊離型薬物を検出するが、このことにより、カルボン酸塩の結合部位が飽和し、媒体中に未結合薬物が存在することが示される。濾液中に遊離型薬物が検出される前には、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８は、１００％の効率で最大２ｍｇ／ｍＬに結合した。当該結合薬物の増加は、カルボキシレート基数の増加、従って、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３と比較したＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８上のシスプラチン結合部位数の増加に帰するものである。

【0220】

実施例２６：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのシスプラチン放出
上記した通り、シスプラチンは、ポリマー及びシスプラチンの最終濃度がそれぞれ１０ｍｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬで、カルボン酸塩で修飾したＨＰＧ類に結合した。２０μＬのシスプラチン結合ポリマー溶液又は１ｍｇ／ｍＬの遊離型シスプラチン溶液を、７０００ ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ ｍｉｎｉ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｕｎｉｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に加え、サンプルを攪拌しつつ、ｐＨ４．５、６．０及び７．４に調整した１ｍＭ ＰＢＳ又はｐＨ７．０の合成尿４Ｌに対し、３７℃で透析した。合成尿（Ｓｕｒｉｎｅ）はＤｙｎａ−Ｔｅｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）から購入した。所定の時点で、放出媒体から３つの透析ユニットを取り出し、透析ユニットを３回洗浄し、続けて新鮮な放出媒体で１ｍＬに希釈することにより内容物全体を除去した。ＯＰＤＡ比色アッセイにより、透析ユニット内容物のシスプラチン濃度を決定した。透析バッグ中の実験開始時の初期薬物量から残存する薬物の量を差し引くことにより、放出された薬物のパーセント（累積）を算出した。データは時間に応じた放出薬物のパーセンテージ（累積）として表した。

【0221】

ＰＢＳ中での遊離型シスプラチン放出は迅速であり、７時間以内で１００％完了したが、このことにより、遊離型薬物の任意の大量放出が膜によって妨げられなかったことが証
明される（図３８）。シスプラチン結合ＨＰＧのサンプルすべてについて、薬物は制御された態様で、遊離型薬物よりも相当に遅く放出されことがわかった。ＰＢＳ中では、ｐＨに関係なく、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３に結合したシスプラチンは、ＰＢＳ中でほぼ同一の速度（最初の２時間で約５％放出、１日後に４０％放出、７日後に最大９０％放出）で放出された。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８に結合したシスプラチンにより、ＰＢＳ中、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４で、同様の速度（２ｈで約３％の結合シスプラチン放出、１日で２０％放出、７日超で最大７０％）で、ほぼ直線的な態様で薬物が放出された。ｐＨ４．５での、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８に結合したシスプラチンについての放出速度は、より高いｐＨカウンターパートよりも迅速で、放出プロファイルはＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３のものに類似した。シスプラチンの放出速度は、尿存在下では相当速く、放出は２時間で投与量の１０％を少し上回り、そしてＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３については２日、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８については３日で、薬物放出が完了した。ＰＢＳ中での放出と同様に、２つのＨＰＧ類間でのシスプラチン放出の違いは、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８上に存在するカルボキシレート基数が多いことに起因し得る。尿は、いくつかの成分から構成される複雑な混合物なので、ＨＰＧ類からのシスプラチンの放出増加の原因がどの化合物なのかは不明であるが、当該放出速度増加は、尿による希釈に際して、薬物放出が増加するメカニズムを提供し、好都合であり得る。ＨＰＧからのシスプラチンの移動に際し、尿素、尿酸及びクレアチニン等の、尿中の窒素含有化合物が結合し、シスプラチンを不活性化し得る。シスプラチンはある程度、当該化合物と複合体を形成することが示されているが、ＩＶ投与後の尿中に存在するシスプラチンの大部分は、元々投与された形態であり、高活性のモノアクア加水分解産物であると決定された（Ｔａｎｇ，Ｘ．；Ｈａｙｅｓ Ｉｉ，Ｊ．Ｗ．；Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｌ．；Ｃａｃｉｎｉ，Ｗ．；Ｄｏｒｓｅｙ，Ｊ．；Ｅｌｄｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｔｅｐｐｅｒｍａｎ，Ｋ．Ｍｅｔ．Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇｓ １９９７，４，９７−１０９）。当該知見を踏まえると、尿中でＨＰＧ類から放出されたシスプラチンの大部分は、薬理学的に活性のある形態だと思われる。

【0222】

実施例２７：細胞傷害性評価
ＭＴＳ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて細胞傷害性の実験を行った。当該アッセイでは、薬剤の即時の細胞溶解効果は測定されないが、長期間にわたる細胞増殖に対する、ポリマーの影響が測定される。本実験においては、ＫＵ−７−ｌｕｃ膀胱癌細胞がＭ．Ｔａｃｈｉｂａｎａ博士（Ｋｅｉｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の好意により提供された。９６−ウェルプレート中、１０％子ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｎａｄａ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、及び１％Ｌ−グルタミンを添加したダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｎａｄａ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）１８０μＬに５，０００細胞／ウェルで細胞をプレーティングし、細胞傷害性アッセイ用に、５％ＣＯ_２中、３７℃で２４時間増殖させ、おおよそ８０％のコンフルエントに到達させた。次いで、細胞を０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲のＨＰＧ類単独、或いは０．０１〜１００μｇ／ｍＬの範囲の薬物濃度で、遊離型シスプラチン又はシスプラチンをロードしたＨＰＧ類と２時間又は７２時間インキュベーションした。処理後、細胞をハンクの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、１８０μＬの新鮮な培養培地を各ウェルに加え、細胞を７２時間増殖させた。当該細胞の増殖を、以前記載した（Ｍｕｇａｂｅ，Ｃ．；Ｈａｄａｓｃｈｉｋ，Ｂ．Ａ．；Ｋａｉｎｔｈａｎ，Ｒ．Ｋ．；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．；Ｓｏ，Ａ．Ｉ．；Ｇｌｅａｖｅ，Ｍ．Ｅ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．ＢＪＵ Ｉｎｔ．２００９，１０３，９７８−９８６）通り、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ａｑｕｅｏｕｓ ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて測定した。簡単に述べると、１８０μＬのＨＢＳＳ中３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシルメトニフェノール）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム１０％ｖ／ｖ溶液と細胞とを２時間インキュベーションした。マイクロプレートリーダーを用い、６２０ｎｍを基準にして４９０ｎｍで吸光度を測定した。

【0223】

ＫＵ−７−ｌｕｃ膀胱癌細胞に対する、薬物をロードしていないＨＰＧ類及びシスプラチンをロードしたＨＰＧ類の阻害効果を、２時間及び７２時間のインキュベーション時間について調査した（図３９）。当該インキュベーション時間は、典型的な膀胱内注入時間の模倣を可能にするため及びシスプラチンについて以前決定した阻害濃度と比較するために選択した。２時間のインキュベーションに関して、５０％の阻害濃度（ＩＣ_５０）は、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＯＨ、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５、ＨＰＧＣ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_３４８及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨ_１１３について、それぞれ１．３、４５．７、４７．０及び６３．０ｍｇ／ｍＬであると決定された。７２時間のインキュベーション時間を採用した場合、２時間のインキュベーションで見出されたよりも、ポリマー類の細胞増殖阻害の程度が強かった。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＯＨ及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５は、ＩＣ_５０がそれぞれ０．１ｍｇ／ｍＬ及び０．２ｍｇ／ｍＬであった。カルボン酸塩で修飾したＨＰＧ類のＩＣ_５０は、おおよそ１０倍減少したが、当該ポリマー類では、依然、おおよそ５ｍｇ／ｍＬのＩＣ_５０値で高度の細胞親和性が示された。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＣＯＯＨの、全般的に優秀な生体適合性は、恐らく、既知の細胞の原形質膜との相互作用が、確実にほとんど無いことが既に知られている、ＭｅＰＥＧ表面の細胞親和性から生じる。カルボキシル化によって加えられた恩恵は、７．４のｐＨで、当該部分の正味の負電荷から生じ得、細胞表面負電荷との反発力がわずかに成立する。７２時間のインキュベーションの後、遊離型シスプラチンは、１μｇ／ｍＬのＩＣ_５０でＫＵ−７−ｌｕｃ細胞の増殖を阻害した（図４０Ａ）が、このことは、当該薬物と細胞の組合せについての以前の報告（Ｈａｄａｓｃｈｉｋ，Ｂ．Ａ．；ｔｅｒ Ｂｏｒｇ，Ｍ．Ｇ．；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．；Ｓｏｗｅｒｙ，Ｒ．Ｄ．；Ｓｏ，Ａ．Ｉ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｍ．；Ｇｌｅａｖｅ，Ｍ．Ｅ．ＢＪＵ Ｉｎｔ．２００８，１０１，１３４７−１３５５）と一致した。２時間のインキュベーションでは、当該ＩＣ_５０値はおおよそ１０μｇ／ｍＬへと増加した（図４０Ｂ）。ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ_６．５−ＣＯＯＨポリマー類に結合した場合、やはり複合体型シスプラチンによってＫＵ−７−ｌｕｃの増殖が阻害されたが、２時間のインキュベーションについて、７２時間のインキュベーションの値（おおよそ５μｇ／ｍＬ）と比較して高いＩＣ_５０値（おおよそ５０μｇ／ｍＬ）が観察された。明らかに、２時間及び７２時間の両方のインキュベーションに関して、複合体型シスプラチンによる細胞増殖阻害は、遊離型薬物よりもほぼ５倍弱かった。ＨＰＧ類と複合体化した薬物について、こうしてＩＣ_５０が増大するのは、ポリマーからの薬物放出速度が遅いためだと思われる。

【0224】

実施例２８：前処理無しでの、種々の製剤からのブタ膀胱組織へのＤＴＸ及びマイトマイシンＦの浸透
ブタ膀胱組織への、ＤＴＸ製剤からのＤＴＸの浸透及びマイトマイシンＦ製剤からのマイトマイシンＦの浸透を評価した。新たに切除したブタ膀胱の切片を、フランツ型拡散セル装置上にマウントし、Ｔｗｅｅｎ ８０、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２中に調製した抗癌剤ＤＴＸで２時間処理した。いくつかの実験においては、ブタ膀胱組織をＴｗｅｅｎ ８０、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２中に調製したＤＴＸで処理する前に、キトサン溶液（薬物なし）又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２溶液（薬物なし）で１時間前処理した。マイトマイシンＦ製剤については、新たに切除したブタ膀胱の組織切片を、フランツ型拡散セル装置上にマウントし、抗癌剤のマイトマイシンＦ製剤で２時
間処理した。マイトマイシンＦ製剤で処理する前に、ブタ膀胱組織をＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２溶液（薬物なし）で１時間前処理した。組織内濃度対組織内深さプロファイルを取得し、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）の算出から、薬物曝露度を取得した。

【0225】

ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル及びジクロロメタンをＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒｌａｗｎ，ＮＪ）から入手した。液体シンチレーション液のＣｙｔｏＳｃｉｎｔ（商標）ＥＳをＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）から購入した。タイロード塩（タイロードは以下：ＮａＣｌ：８．０、ＫＣｌ：０．３、ＮａＨ_２ＰＯ４．５Ｈ_２Ｏ：０．０９３、ＫＨ_２ＰＯ_４：０．０２５、ＮａＨＣＯ_３：１．０、Ｇｌｕｃｏｓｅ：２．０をｇ／Ｌで含有する）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ドセタキセルはＮａｔｕｒａｌ Ｐｈａｒｍａ（Ｌａｎｇｌｅｙ ＢＣ．Ｃａｎａｄａ）から入手した。市販のタキソテレ（登録商標）２０ｍｇ／０．５ｍＬ（Ｓａｎｏｆｉ Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｌａｖａｌ，ＱＣ）はバンクーバー総合病院のＢＣ Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｃｙから購入した。比活性２３．２Ｃｉ／ｍｍｏｌのエタノール中トリチウム標識ＤＴＸをＭｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｂｒｅａ，ＣＡ）から購入した。実施例１０に記載のプロトコールを適合させることにより、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧを調製し、実施例１８に記載のプロトコールを適合させることにより、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２を調製した。キトサンはＮｏｖａｍａｔｒｉｘ ＦＭＣが提供した。ブタ膀胱はＢｒｉｔｃｏ Ｉｎｃ．（Ｌａｎｇｌｅｙ，ＢＣ）から購入した。施設内で、体重９０〜１１３ｋｇの６〜１０月齢の雄性ブタから、膀胱を新たに切除し、取り出した。

【0226】

ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２ポリマー類について、ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２１モル当たりのアミンのモル数を、正滴定法、逆滴定法及びフルオレスカミンアッセイを含む種々の方法を用いて測定した（表１４）。

【0227】

【表14】

【0228】

ＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ製剤、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２製剤及びＴｗｅｅｎ ８０製剤の調製
溶媒蒸発法を用い、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ及びＤＴＸをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２を調製した。ＤＴＸ及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２をアセトニトリル中に溶解し、オーブン中６０℃で１時間乾燥し、窒素でフラッシュして微量の有機溶媒を除去した。乾燥前に、ポリマー／薬物溶液を少量アリコートの^３Ｈ ＤＴＸでスパイクした。結果生じるポリマー／薬物マトリクスを、６０℃のタイロード緩衝液（ｐＨ７．４）で再構成し、２分間ボルテックスした。薬物の最終濃度は０．５ｍｇ／ｍＬであり、３７℃で用いた。タキソテレ（登録商標）濃縮液（１ｍＬ当たり４０ｍｇのＤＴＸ及び１０４０ｍｇのＴｗｅｅｎ ８０を含有）をタイロード緩衝液で希釈することにより、ＤＴＸをＴｗｅｅｎ ８０中に
調製し、ＤＴＸの最終濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとした。希釈前に、少量の^３Ｈ ＤＴＸを溶液に添加した。

【0229】

マイトマイシンＦ製剤の調製
タイロード緩衝液中でマイトマイシンＦ（分子量＝３６３．４）を調製した。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）Ｃａｔ ＃ ＡＲＴ−１６８９よりそれを受領した。活性は１〜１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、エタノール中１ｍＣｉ／ｍＬであった。５０μＬのエタノールストックを３ｍＬの緩衝液中に溶解（３００ｘ希釈）することにより、溶液を調製した。

【0230】

前処理として使用するためのキトサン溶液及びＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２溶液の調製
キトサン溶液を調製するために用いるキトサンは、ＰＲＯＴＡＳＡＮ（商標）ＵＰ ＣＬ ２１３（製品番号：４２１０１０６）であり、７５〜９０％のアセチル基を除去したキトサンがベースである。当該陽イオンポリマーは高度に精製され、十分に特性解析された水溶性塩化物塩である。典型的に、ＰＲＯＴＡＳＡＮ（商標）ＵＰ ＣＬ ２１３の分子量は１５００００〜４０００００ｇ／ｍｏｌ（キトサン酢酸塩として測定）の範囲である。キトサン溶液は、それを水中に溶解することによって調製し、０．５％（ｗ／ｖ）の溶液濃度とした。

【0231】

前処理として用いるためのＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２溶液は、ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２をアセトニトリル中に溶解することにより調製した。結果生じる溶液をオーブン中６０℃で１時間乾燥し、窒素でフラッシュして微量の有機溶媒を除去した。結果生じるポリマーを、６０℃のタイロード緩衝液（ｐＨ７．４）で再構成し、２分間ボルテックスした。

【0232】

組織の調製
新たに切除したブタの膀胱から、外壁上の過剰脂肪組織を除去し、縦方向に切って左右両側へと広げ、底浅の、炭素源（９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２）で泡立てた３７℃タイロード緩衝液槽中、おおよそ２ｃｍｘ２ｃｍに細かく切断した。実験はすべて、屠殺後５時間以内に行った。膀胱の小片を、膀胱内腔側の壁を薬物溶液に曝露するように、フランツ型拡散セル装置上にマウントした。当該組織切片は引き伸ばされておらず、厚さはおおよそ２〜３ｍｍであった。レセプターチャンバーに１０ｍＬの３７℃タイロード緩衝液（ｐＨ７．４）を充填した。余分な組織は拡散セルの周囲周辺でトリミングした。拡散セルのドナーチャンバーに１ｍＬの０．５ｍｇ／ｍｌ薬物溶液を充填した。組織の曝露面積は０．６４ｃｍ^２であった。各拡散セルを底浅の水層に設置し、３７℃で２時間インキュベーションした。いくつかの実験用には、組織サンプルをＤＴＸやマイトマイシンＦをロードした製剤で処理する前に、キトサン溶液（薬物無し）又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２溶液（薬物無し）で１時間前処理した。組織サンプルをタイロード緩衝液で３回洗浄し、未結合の薬物をすべて除去した。組織サンプルをトリミングし、金属プレート上で、ドライアイスベッド上の液体窒素により急速凍結した。

【0233】

組織のクリオトーム切片作製
Ｓｈａｎｄｏｎ Ｃｒｙｏｍａｔｒｉｘ（商標）（Ｔｈｅｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）と共に、凍結した膀胱組織をクリオトームの対物ホルダー上にマウントした。Ｒ４０４Ａ冷却システムを伴うＳｈａｎｄｏｎ Ｃｒｙｏｔｏｍｅ
Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）上で、Ｓｈａｎｄｏｎ ＭＢ３５ Ｐｒｅｍｉｅｒ
Ｌｏｗ Ｇｒａｄｅ Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ Ｂｌａｄｅｓ （Ｔｈｅｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）により、−２０℃で膀胱組織を切片にした。
組織を切片にした。組織切片を、予め計量した１．５ｍＬエッペンドルフチューブ中に入れ、凍結して−２０℃で保存した。

【0234】

組織中の薬物の定量
薬物抽出のため、計量した組織切片に２００μＬのアセトニトリルを加えた。サンプルを、すべての組織切片が抵抗無くアセトニトリル中に浸漬するまでボルテックスし、室温で２４時間放置して薬物の完全抽出を確実にした。組織切片をすべて含む抽出サンプルを、シンチレーションバイアルに移し、５ｍＬのシンチレーション液を加えた。液体シンチレーション計測により、^３Ｈ ＤＴＸ又は^３ＨマイトマイシンＦのカウントを測定し、元のストック液からの較正グラフを用いて定量化した。

【0235】

組織レベルの深さプロファイル解析
膀胱壁のすべての層から筋肉にかけて（例えば、尿路上皮、固有層及び筋層）における平均ＤＴＸ濃度又はマイトマイシンＦ濃度について、組織レベルの深さプロファイルを解析した。平均組織レベルは、組織層中で見出した薬物総量を、当該層の組織総重量で除したものとして決定した。組織レベルの深さプロファイル下面積（ＡＵＣ）を、直線台形公式を用いて、以下：

【0236】

【数3】

【0237】

（式中、ｔはμｍでの組織深度、Ｃはμｇ／ｇでの濃度である）の通り算出した。
ＡＵＣ算出のためには、補外法による、０μｍでの薬物濃度（μｇ／ｇ）の推定が必要であった。

【0238】

前処理無しでの、ＤＴＸ製剤からブタ膀胱組織へのＤＴＸ浸透に関するデータを、図４１中に示す。両方のｄＨＰＧ類により、約１５００μｍの深さまでは、アミンの含有によって、アミン無しの製剤（Ｔｗｅｅｎ ８０製剤（タキソテレ（登録商標））及びアミン官能基を含有しないｄＨＰＧを含む）と比較して薬物濃度が高くなると評価された。アミン付加の効果は、濃度依存的であることを観察した。図４１により、組織、特に約１５００μｍの深さにおける最高濃度は、最大のアミン含量（３７ｍｏｌ／ｍｏｌ）を含有するｄＨＰＧ製剤を用いて得られたことが示される。表示した組織深度範囲でのＡＵＣを算出した（表１５ａ及び１５ｂ）が、これにより、ｄＨＰＧ製剤では、タキソテレよりも１．３〜２．４倍の範囲で向上することが示された。表示した組織深度範囲でのＣａｖｇ値及びＣｍａｘ値を算出した（表１５ｃ）。

【0239】

【表15】

【0240】

【表16】

【0241】

【表17】

【0242】

キトサン前処理又はＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２前処理を伴う、ＤＴＸ製剤からブタ膀胱組織へのＤＴＸ浸透に関するデータを、図４２及び図４３中に示す。当該実験の目的は、ｄＨＰＧポリマーの機能を、やはりアミン官能基を含有するポリマーであるキトサンから区別することである。膀胱内送達において使用するためのポリマーとして、キトサンを検討したが、組織への薬物取り込みを促進するための前処理との関連で、ある組成のｄＨＰＧ類が優ることが証明された。データにより、キトサン前処理を伴うＴｗｅｅｎ ８０製剤（タキソテレ（登録商標））によって、すべての組織深度で、膀胱中ドセタキセルの組織中濃度が最低であり、組織浸透が相対的にほとんどもたらされないことが示された。同様に、薬物をＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ（アミン無し）ビヒクルで投与した場合は、キトサンによる前処理によって、ドセタキセルの組織浸透がやや回復することになるが、これはタキソテレ処理（キトサン前処理）群にのみ優るだけであった。ｄＨＰＧ類がアミンを含有する（３７ ｍｏｌアミン／ｍｏｌ ポリマー）場合（図４２及び４３においてＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２と名付けた）に、ドセタキセルの組織浸透において優れた効果を観察した。その上、ドセタキセルをロードしたＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２製剤のために、キトサンを前処理として用いた場合は、キトサンにより送達への恩恵はもたらされなかった。組織の深さにわたる組織内濃度（図４２）の濃度曲線下面積（ＡＵＣ，図４３）（全薬物曝露の測定値）を測定することにより、各々の成績を比較した。結果により、前処理又は処理で、アミン含有ｄＨＰＧが利用された場合に、最大曝露度を観察したことが示される。様々な前処理計画後の、様々な製剤からのドセタキセル浸透に関して、組織深度の範囲１８０〜３３６０（ｕｍ）につい
て算出されたＡＵＣ値並びに組織深度の範囲１８０〜１５６０（ｕｍ）及び１８０〜３３６０（ｕｍ）について算出されたＣａｖｇ値及びＣｍａｘ値を、表１５ｄ及び１５ｅ中に示す。

【0243】

【表18】

【0244】

【表19】

【0245】

ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２前処理を伴うマイトマイシンＦのブタ膀胱組織への浸透についてのデータを、図４４中に示す。

【0246】

ブタ膀胱のｅｘ ｖｉｖｏ浸透実験のＳＥＭ画像
上記実施例２８中で観察した薬物浸透効果は、様々な処理への曝露後の膀胱組織の外見と相関した。当該実験に関して、薬物は用いず、膀胱１つ当たり１ビヒクルに１回のみ曝露した。２時間の曝露時間後、膀胱組織を採取し、緩衝液でリンスして４％パラホルムアルデヒド及び２％グルタルアルデヒドで一晩固定し、１％ＯｓＯ_４で後固定し、エタノールで脱水して臨界点乾燥した。膀胱全体を２つに分割し、金蒸着した。全表面をＳＥＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ４７００，３−５ｋＶ）で検査し、代表的な画像を記録した（１サンプル当たり最低３視野）。代表的な画像を示す（幅約１３０μｍｘ高さ約１００μｍ）。

【0247】

ＳＥＭ画像により、緩衝液のみで処理した膀胱の尿路上皮で、そしてＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ（アミン無し）で処理した膀胱の尿路上皮でも、尿路上皮が無傷か、又はほぼ無傷であること（例、アンブレラ細胞の喪失無し）が示されることが明らかになった。対照的に、キトサン前処理ビヒクルへの曝露後は、膀胱表面の外見は全く異なっており、尿路上皮の表層アンブレラ細胞が喪失していた（図４５）。溶液中濃度１％ｗ／ｖ及び１０％ｗ／ｖで１０ ｍｏｌアミン／ｍｏｌ ＨＰＧであるＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２への曝露後は、尿路上皮からのアンブレラ細胞の一部喪失を観察した（図４６）。対照的に、アミン含量がより多い（３７ｍｏｌ／ｍｏｌ）ＨＰＧ−Ｃ_８／１０−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２を用いると、より多くのアンブレラ細胞の喪失が観察できた。当該影響は濃度依存的であることを観察した。溶液中濃度０．１％ｗ／ｖでは、膀胱表面の外見上の変化はほとんど無かったか、無かったが、濃度が１％ｗ／ｖ及び１０％ｗ／ｖの溶液で処理した後は、それぞれアンブレラ細胞の一部及び全部の喪失を観察した（図４６）。理論に縛られないが、アミンの効果は膀胱表面を改変し、その薬物透過性の変化をもたらすことであり得ると考えられる。当該効果は、アミン含量及びポリマー濃度に依存することが示された。

【0248】

実施例２９：マウス膀胱のｉｎ ｖｉｖｏ浸透実験
マウス膀胱に対する種々の製剤（薬物無し）の曝露効果を評価した。８〜１１週例の雌性無胸腺ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、４％イソフルラン及び２Ｌ／ｍｉｎ Ｏ_２を用いてディープ プレーン（ｄｅｅｐ ｐｌａｎｅ）に麻酔した。膀胱を十分に圧搾し、外科手術で埋め込んだカテーテルを介して製剤を注入した。ゲージ２４の潤滑化Ｊｅｌｃｏ血管カテーテル（ＢＤｉｃｋｅｎｓｏｎ）を尿道を経て膀胱へ通す前に、ポリプロピレンの巾着縫合を尿道口付近に施した。５０μＬ量注入し、動物（の頭側を）をわずかに反転させて巾着縫合を結紮する一方、１回の素早い動作でカテーテルを取り出した。２時間の注入が完了するまで、マウスを（１．５〜２％イソフルラン、２Ｌ／ｍｉｎ Ｏ_２で）麻酔のままにした。巾着縫合を除去し、動物を回復させた。

【0249】

調製した投与用溶液は無色透明からわずかに琥珀色の溶液であった。ポリマー溶液の濃度は１％ｗ／ｖ又は１０％ｗ／ｖのいずれかであった。アミン含量の無いＨＰＧ−ＭｅＰＥＧポリマー、及びＨＰＧ１モル当たり８〜１０ｍｏｌ（低）及び３７ｍｏｌ（高）のアミンを伴う２種のＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２ポリマー類を用いた（ＨＰＧの名目上の分子量、６５ｋｇ／ｍｏｌに基づく）。投与用濃度の結果を表１６中に集約する。

【0250】

【表20】

【0251】

ＳＥＭ用及び組織学用に、各マウスから膀胱を切除した。動物はすべて、投与後２時間目及び各組織回収前に、死亡及び病的状態に関して観察した。注入部位でのいくらか少量の血液を除いて、死亡又は病的状態の徴候を何ら認めなかった。

【0252】

ＳＥＭ解析
ＰＢＳで組織を３回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、次いで０．１Ｍカコジル酸緩衝液に移した。組織を、１％四酸化オスミウム中で１時間、室温で後固定し、次いで水を混合したエタノール中（混合物中のエタノールのパーセンテージを増大させていき、３０％から始めて１００％に増大させる）で脱水した。臨界点での脱水によりサンプルを乾燥し、次いで２回金−白金蒸着した（９０度で１回及び４５度でもう１回）。バイオイメージング施設において、サンプルをＨｉｔａｃｈｉ Ｓ４７００走査型電子顕微鏡で検証した。各膀胱は低倍率で観察し、次いで全表面を再び、高倍率で検証した。様々な倍率で複数枚（９〜１０画像）撮影した。

【0253】

【表21】

【0254】

ＰＢＳを２時間注入処理したマウス膀胱表面では、図４７中のマウス膀胱表面のＳＥＭ像で見られる通り、アンブレラ細胞層は無傷で、褶曲した外見を呈していた。１０％（ｗ／ｖ）ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ溶液を２時間注入して処理したマウス膀胱の表面では、２時間の注入時間直後は、アンブレラ細胞層は無傷であった。無傷アンブレラ細胞層はＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ溶液注入後６時間及び２４時間でも観察された（図４８）。図４８中に示す通り、細胞表面の外見は平面状であった。１０％（ｗ／ｖ）ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（１０ｍｏｌ／ｍｏｌ）溶液を２時間注入して処理したマウス膀胱の表面では、２時間の注入時間直後は、アンブレラ細胞層は無傷であった（図４９）。１０％（ｗ／ｖ）ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（１０ｍｏｌ／ｍｏｌ）溶液注入後６時間では、マウス膀胱表面で単一アンブレラ細胞の喪失が示され、上皮層下部が露出していた。同一の注入後２４時間では、マウス膀胱表面でアンブレラ表層は無傷であった（図４９）。図５０中に示す通り、２時間の１％（ｗ／ｖ）ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（３７ｍｏｌ／ｍｏｌ）溶液注入処理したマウス膀胱表面では、２時間の注入時間直後は、アンブレラ細胞の完全喪失が示され、上皮層下部が露出していた。１％（ｗ／ｖ）ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（３７ｍｏｌ／ｍｏｌ）溶液注入後６時間では、依然として、マウス膀胱表面でかなりのアンブレラ細胞の喪失が示された。１％（ｗ／ｖ）ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（３７ｍｏｌ／ｍｏｌ）溶液注入後２４時間では、マウス膀胱表面で表面の一部が無傷であった（図５０Ｃ上部）が、アンブレラ細胞は相当喪失していた（図５０Ｃ左下）。図５１中に示す通り、２時間の１０％ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（３７ｍｏｌ／ｍｏｌ）溶液注入処理されたマウス膀胱表面では、２時間の注入時間直後は、アンブレラ細胞の完全喪失が示され、上皮層下部が露出していた。１０％ＨＰＧ−ＭｅＰＥＧ−ＮＨ_２（３７ｍｏｌ／ｍｏｌ）溶液注入後６時間では、マウス膀胱表面でやはりアンブレラ細胞の完全喪失が示された。注入後２４時間では、マウス膀胱表面でアンブレラ細胞層は無傷であったが、他で観察される
無傷層よりも表面細胞が小さく見え、外見があまり平面状でなかった（図５１）。アンブレラ細胞喪失に対する製剤の影響は、ｄＨＰＧのアミン含量及びｄＨＰＧの濃度に依存することが観察された。

【0255】

組織学
密着結合、細胞剥離及び炎症細胞の浸潤における変化について、組織を評価した。組織学的解析結果を表１８中に集約する。組織学的解析結果から理解できるように、ｄＨＰＧ製剤への曝露後、マウスの膀胱表面に炎症及び壊死の徴候を観察しなかった。

【0256】

【表22】

【0257】

尿の分析
動物を安楽死させた後、膀胱を露出させ、膀胱穿刺及び２５Ｇニードルを通した回収によりその内容物を取り出した。尿を氷上に保存（しかし、凍結させない）し、評価のために輸送した。細胞の存在に関して、尿を分析した。数滴の尿を顕微鏡スライドガラス上に静置し、細胞の存在に関して、顕微鏡により観察した。存在するあらゆる細胞を血球計スライドにより計数した。２時間の注入直後、及び膀胱採取時（２、６、２４時間）にマウスから採取した尿中の細胞数を図５２中に示す。

【0258】

血液分析
ＣＯ_２吸入の終了時に、臨終の際心穿刺により血液を採取し、おおよそ５００〜７００μＬをＥＤＴＡ ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒチューブに入れた。各チューブを数回転倒させ、血液とＥＤＴＡとを確実に一様に混合して凝集を防止した。血液サンプルは、各時点についてすべてのサンプルを回収するまで氷上に保存し、次いで、処理して血漿を生成した。サンプルを２５００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心することにより血漿を生成した（ｒｐｍはＢｅｃｋｍａｎ ＧＨ ３．８Ａ ｒｏｔｏｒ，ＲＣＦ_ａｖｇ ２００ｘｇに基づく）。血漿上清をピペットで吸い、ラベルしたバイアル中に入れ、−８０℃で保存した。Ｍ
ｅｓｏＳｃａｌｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ａｎｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ａｓｓａｙキットを用い、ＴＮＦαレベルに関して血液を分析した。マウス血液中、様々な製剤による注入後２、６及び２４時間での循環ＴＮＦαレベルを図５３中に示す。あらゆるサンプルでＴＮＦαを検出しなかった。

【0259】

本発明の様々な実施形態を本明細書中に開示するが、当業者に共通する一般知識によって、本発明の範囲内で多くの適合化及び変更がなされ得る。当該変更としては、実質同一の方法で同一の結果を達成すべく、本発明の任意の態様を公知の同等物で置き換えることが挙げられる。数値範囲には、範囲を規定する数値が含まれる。単語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、本明細書では任意のオープンエンドの用語として使用され、句「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ」と実質的に同等であり、また単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」は同様の意味を有する。本明細書で使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈により明らかに別途指示されない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「ａ ｔｈｉｎｇ」への言及は１以上の当該物を含む。

【0260】

本明細書において文献を引用することによって、当該文献が本発明の先行技術であると承認することはないし、当該文書の内容又は日付に関し、何ら承認を構成することもない。本明細書において引用された、任意の優先権文書及びすべての刊行物（特許及び特許出願が挙げられるが、限定されない）は、参照により、個々の刊行物が具体的に且つ個々に、本明細書中に参照により組み込まれたと、また全体が本明細書中に提示されたかのように、表示されたかのように本明細書中に組み込まれる。本発明は、本明細書中に前記した通りのもの、並びに実施例及び図面を参照したものと実質同一の実施形態及び変更をすべて含む。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】